KR20130090174A - A biosensor using quenching system and a method for detecting using thereof - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A biosensor and a detecting method using the same are provided to easily detect target materials with high sensitivity even when the target materials have a low concentration, thereby effectively detecting low concentration target materials in a sample. CONSTITUTION: A biosensor comprises a reactant (10) uniting with target materials (5), a reactive part (111) in which first fused materials combined with light absorbing materials (30) are arranged and a measuring unit (110) in which second fused materials combined with detection materials (11) and fluorescent materials (31), which are combinable with the target materials or reactants combined with the target materials, are fixed on a supporter. A detecting method of target materials comprises: a step of inserting a sample including target materials into a reactive part in which first fused materials combined with reactants and light absorbing materials are arranged; a step of detecting a fluorescent intensity emitted from fluorescent materials in a measuring unit in which second fused materials combined with fluorescent materials and detection materials are fixed on a supporter; and a step of calculating the decrement of the fluorescent intensity emitted from the measuring unit after the sample is inserted into the measuring unit. [Reference numerals] (AA) Measurement unit; (BB) Fluorescent particle; (CC) Antibody fixation; (DD) Channel; (EE) Sample input

Description

퀀칭 시스템을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용한 측정방법{A biosensor using quenching system and a method for detecting using thereof}Biosensor using quenching system and a method for detecting using

본 발명은 면역측정법에 관한 것으로서, 구체적으로는 퀀칭 시스템을 이용하여 보다 효율적으로 면역측정을 수행하는 시스템 및 이를 이용한 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to an immunoassay, and more particularly, to a system for performing immunoassay more efficiently using a quenching system and a measurement method using the same.

면역크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 특히 샌드위치형 면역분석법은 존재 여부 및 농도 조사의 대상이 되는 표적물질의 제1 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체가 고체 지지체에 고정화 되고, 표적물질의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 이용하는 것으로서 잘 알려져 있다. 이러한 분석을 위한 키트로는 분석 스트립 또는 상기 분석 스트립을 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 분석 키트가 일반적으로 사용된다. 이 때 표적물질을 포함하는 유체를 다공성 스트립 한편에 투입하면 모세관 현상에 의해 유체가 흘러가면서 분석 대상물이 표지체를 포함하는 항체 및 고정화 항체에 결합하여 분석법을 완성한다. Immunochromatography is a method that allows qualitative and quantitative testing of analytes in a short time by utilizing the properties of biological or chemical substances specifically attaching to each other. It is well known that a first antibody capable of specifically binding to a first epitope of a target substance to be immobilized on a solid support and using a second antibody specific for the second epitope of the target substance. As the kit for the analysis, an assay kit or an assay kit in which the assay strip is mounted inside the housing and assembled is generally used. At this time, when the fluid containing the target material is introduced into one of the porous strips, the fluid flows due to capillary action, and the analyte binds to the antibody including the label and the immobilized antibody to complete the assay.

현재 면역측정법을 이용한 정량 바이오 센서의 경우 크게 두 가지 방법으로 측정된다. 하나는 금나노입자를 이용하는 방법이다. 이러한 방법은 항체를 붙인 금나노입자가 항원과 결합 후 측정라인(테스트 라인)의 항체와 결합에 의해 생기는 금 띠의 진한 정도를 CCD 카메라로 픽셀단위로 이미징화하여 수치화하거나 금띠가 생기기 전의 시그널과 생긴 후의 시그널 차이에 의해 수치화하여 정량하는 방법이다. 또 다른 방법은 형광입자를 이용하는 방법이다. 이러한 방법은 항체를 붙인 형광의 성질을 가진 입자가 항원과 결합 후 측정라인(테스트 라인)의 항체와 반응시킨 후, 특정파장 조사 시 나타나는 형광의 양을 측정하여 수치화하여 정량하는 방법이다. 그러나, 상기와 같은 종래의 기술의 경우 측정하고자 하는 항원의 양이 적을 경우 반응하는 금나노입자 또는 형광입자의 양이 적어서 반응을 수치화시 측정이 불가능하여 정확도 및 신뢰성에 영향을 미칠 수 있다. 즉. 검출 한계에 미달되어 측정이 불가한 경우가 생길 수 있다.Currently, quantitative biosensors using immunoassay are largely measured in two ways. One is to use gold nanoparticles. This method uses the CCD camera to quantify the intensity of the gold band produced by the binding of the nanoparticles attached with the antibody to the antibody on the measurement line (test line) after binding to the antigen. It is a method of quantifying by quantifying by the difference in signal after occurrence. Another method is to use fluorescent particles. This method is a method of quantifying by measuring the amount of fluorescence that appears when a particle having a characteristic of fluorescence to which the antibody is attached reacts with an antibody of a measurement line (test line) after binding to an antigen, and then irradiates a specific wavelength. However, in the conventional technology as described above, when the amount of the antigen to be measured is small, the amount of the reacted gold nanoparticles or the fluorescent particles is small, and thus it is impossible to measure the numerical value of the reaction, thereby affecting accuracy and reliability. In other words. Measurements may not be possible because the detection limit is not reached.

이러한 문제점을 해소하기 위하여 1차 항체와 항원이 결합된 후 2차 항체가 추가로 결합하고 이들이 최종적으로 멤브레인에 고정화된 항체에 결합하는 면역크로마토그래피의 신호증폭 방법이 연구되고 있으며, 금 이온을 환원시켜 감도를 개선하는 방법 등이 연구되고 있다(KR 10-2010-0128550A). 그러나, 생물학 분야가 발전함에 따라 낮은 농도의 생체 물질에 대한 검출 및 높은 민감도의 필요성이 증가하게 되었고, 이러한 문제점을 해결하기 위해 연구하던 중, 민감도를 현저히 향상시킬 수 있는 바이오 센서 및 측정 방법을 개발하였다.In order to solve this problem, a method for signal amplification of immunochromatography, in which a primary antibody and an antigen are combined, followed by an additional secondary antibody and finally to an antibody immobilized on a membrane, has been studied. To improve sensitivity, and the like (KR 10-2010-0128550A). However, the development of the biological field has increased the need for detection of low concentrations of biomaterials and high sensitivity, while developing biosensors and measurement methods that can significantly improve the sensitivity while studying to solve these problems. It was.

KR 10-2010-0128550 초록 및 청구항 1항KR 10-2010-0128550 Abstract and Claim 1

일 구체예는 표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 존재하는 반응부, 표적물질 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 검출물질과 흡광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 존재하는 측정부를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.In one embodiment, a reactant capable of binding to a target material and a first fusion material in which a light absorber is bound are present in the reaction unit, a target material or a detection material capable of binding to a target material or a reactant bound to the target material. Provided is a biosensor comprising a measurement unit in which the bound second fusion material is fixedly present on a support.

또 다른 구체예는 일구체예의 바이오 센서를 이용한 표적물질 탐지 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method for detecting a target substance using a biosensor of one embodiment.

측정하고자 하는 표적의 양이 적을 경우 정확도 및 신뢰성이 낮아 측정이 불가능였다. 이를 개선하기 위하여 퀀칭 시스템을 이용한 바이오 센서를 개발하였다.When the amount of target to be measured was small, the measurement was impossible due to the low accuracy and reliability. In order to improve this, a biosensor using a quenching system has been developed.

일 양상은 표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 존재하는 반응부, 표적물질 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정된 측정부를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.In one aspect, a reactant capable of binding to a target material and a reactant having a first fusion material bound to an absorber, a target material, or a fluorescent material coupled to a target material or a detection material capable of binding to a target material coupled to the target material Provided is a biosensor comprising a measurement unit is fixed to the second fused material on the support.

용어, "퀀칭"(Quenching)이란, 들뜬 상태에 있는 분자에 작용하여 에너지 이동, 전자 이동, 혹은 다른 화학 과정에 의해 에너지를 상실시켜 바닥상태로 되돌리는 작용을 의미하는 것으로서, 형광물질에서 방출되는 형광을 흡수하는 현상을 말한다.The term "quenching" refers to the action of acting on molecules in an excited state to lose energy by energy transfer, electron transfer, or other chemical processes and return them to the ground state. The phenomenon of absorbing fluorescence.

용어, "흡광물질"이란 형광물질 또는 광원으로부터 에너지 또는 빛을 흡수하는 물질을 의미하며, 금속나노입자일 수 있다. 상기 금속나노입자는 금나노입자, 은나노입자, 금쉘나노입자, 은쉘나노입자, 분자체 산소(Molecular oxygen), 요오드화물 이온(iodide ions) 및 아크릴아마이드(acrylamide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로 금속나노입자, 금속 나노입자로 구성된 금속쉘(shell)나노입자, 나노입자로 구성된 금속나노구조체, 분자체 산소(Molecular oxygen), 요오드화물 이온(iodide ions) 및/또는 아크릴아마이드(acrylamide)로 구성된 고분자 구조체 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The term "absorbing material" means a material absorbing energy or light from a fluorescent material or a light source, and may be a metal nanoparticle. The metal nanoparticle is any one selected from the group consisting of gold nanoparticles, silver nanoparticles, gold shell nanoparticles, silver shell nanoparticles, molecular sieve oxygen (Molecular oxygen), iodide ions and acrylamide (acrylamide) Specifically, metal nanoparticles, metal shell nanoparticles (shell) nanoparticles composed of metal nanoparticles, metal nanostructures composed of nanoparticles, molecular sieves (Molecular oxygen), iodide ions (iodide ions) and / or acrylamide It may be a polymer structure composed of (acrylamide), but is not limited thereto.

용어, "형광물질"이란 외부에서 흡수한 에너지를 특정 파장의 빛으로 방출하는 물질로서, 형광단백질(fluorescent protein), 형광분자, 생체발광 단백질(bioluminescent protein) 및 양자점(quantum dot)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 상기 형광 단백질의 예로는 녹색형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP) 등 일 수 있다. 상기 형광분자로는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 등이 있을 수 있으며, 상기 형광 염료는, 플루오레신, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물, 이들의 배합물을 포함할 수 있다.The term "fluorescent material" refers to a material that emits energy absorbed from outside as light of a specific wavelength, and is composed of fluorescent proteins, fluorescent molecules, bioluminescent proteins, and quantum dots. It may be any one selected. Examples of such fluorescent proteins are green fluorescent protein (GFP), modified green fluorescent protein, enhanced green fluorescent protein (EGFP), red fluorescent protein (RFP), enhanced red fluorescence Protein (ERFP), blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (EBFP), yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), indigo fluorescent protein (CFP), and enhanced indigo fluorescent protein (ECFP) and the like. The fluorescent molecules may include fluorescent dyes, semiconductor nanocrystals, lanthanide chelates, and the like, and the fluorescent dyes may include fluorescein, 6-FAM, rhodamine, Texas red, tetramethyltamine, and carboxy. Rhodamine, Carboxyrotamine 6G, Carboxyrodol, Carboxyrodamine 110, Cascade Blue, Cascade Yellow, Comarin, Cy2 (cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5 .5, Cy-chromium, phycoerythrin, PerCP (ferridinine chlorophyll-a protein), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxy-4 ', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyflu Oresin), NED, ROX (5- (and-6) -carboxy-X-rhodamine), HEX, Lucifer Yellow, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green (Oregon Green) 500, Oregon Green 514, Alexa Floor, 7-amino-4-methylcomarin-3-acetic acid, BODIPY FL, Bodyfi FL-Br 2, Bodyfi 530/550 , Conjugate Sites may include a storage, a combination thereof.

상기 표적물질은 항원 단백질, 리간드, DNA, 환경 호르몬, 환경 오염 물질, 및 바이러스 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 상기 반응물질 및 검출물질과 결합할 수 있는 물질이라면 그 종류는 제한되지 않는다.The target material may be any one selected from the group consisting of antigenic protein, ligand, DNA, environmental hormone, environmental pollutant, virus, etc., but the kind is limited as long as it is a substance capable of binding the reactant and the detection material. It doesn't work.

상기 "반응물질"이란 표적물질과 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하나, 특별한 화학 반응 없이 결합이 이루어질 수 있는 물리적 결합이 바람직하다. 상기 반응물질의 예로는 항체, 항체의 단편인 Fab나 재조합 scFv 등 일 수 있으며, 리셉터 또는 리셉터의 단편일 수 있다.The "reactant" means a substance capable of binding to a target substance. The bond can be both chemical and physical bonds, but a physical bond is preferred in which the bond can be made without a special chemical reaction. Examples of the reactant may be an antibody, a Fab or a recombinant scFv, which is a fragment of the antibody, or a receptor or a fragment of the receptor.

상기 "검출물질"이란 표적물질, 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하나, 특별한 화학 반응 없이 결합이 이루어질 수 있는 물리적 결합이 바람직하다. 상기 반응물질의 예로는 항체, 항체의 단편인 Fab나 재조합 scFv 등 일 수 있으며, 리셉터 또는 리셉터의 단편일 수 있다.The "detection material" means a material capable of binding to a target material or a reactant bound to the target material. The bond can be both chemical and physical bonds, but a physical bond is preferred in which the bond can be made without a special chemical reaction. Examples of the reactant may be an antibody, a Fab or a recombinant scFv, which is a fragment of the antibody, or a receptor or a fragment of the receptor.

상기 제1 융합물질은 반응물질과 흡광물질이 결합된 물질로서, 상기 결합은 화학적 결합 또는 물리적 결합 중 어느 하나 일 수 있으며, 반응물질과 흡광물질은 직접 결합되거나, 링커에 의해 결합될 수 있다.The first fusion material is a material in which the reactant and the light absorber are combined, and the bond may be either a chemical bond or a physical bond, and the reactant and the light absorber may be directly bonded or linked by a linker.

상기 제2 융합물질은 검출물질과 형광물질이 결합된 물질로서, 상기 결합은 화학적 결합 또는 물리적 결합 중 어느 하나 일 수 있으며, 검출물질과 형광물질은 직접 결합되거나, 링커에 의해 결합될 수 있다.The second fusion material is a material combined with a detection material and a fluorescent material, the binding may be any one of a chemical bond or a physical bond, the detection material and the fluorescent material may be directly bonded or by a linker.

상기 지지체는 상기 제2 융합물질이 결합되어 있는 것으로서, 지지체의 재질은 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF (Poly-vinylidene fluoride), PET (poly(ethyleneterephthalate)), PES (polyethersulfone), 유리섬유 및 나일론으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 지지체는 미세 채널의 표면, 유동이 가능한 금속 입자 또는 고분자 입자의 표면 일 수 있으며, 또한 상기 유동이 가능한 입자는 자기장(magnetic field), 전자기장(electromagnetic field) 또는 초음파(ultrasonic waves)에 의해 이동의 제어가 가능할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The support is bonded to the second fusion material, the material of the support is composed of nitrocellulose, cellulose, polyvinyllidene fluoride (PVDF), poly (ethyleneterephthalate), PET (polyethersulfone), glass fiber and nylon It may be any one selected from the group, but is not limited thereto. In addition, the support may be the surface of the microchannel, the surface of the metal particles or polymer particles that can flow, and the flowable particles are moved by a magnetic field, an electromagnetic field or ultrasonic waves. It may be possible to control, but is not limited thereto.

상기 반응부 및 측정부는 미세관을 통하여 서로 연결되거나, 또는 멤브레인로 서로 연결될 수 있다. 상기 멤브레인은 천연 또는 합성 재료의 다공질 재료일 수 있으며, 니트로셀룰로오스 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The reaction unit and the measurement unit may be connected to each other through a microtubule, or may be connected to each other by a membrane. The membrane may be a porous material of natural or synthetic materials, and may be nitrocellulose, but is not limited thereto.

상기 바이오 센서는 모든 생물학적 측정 장치에 적용될 수 있으며, 마이크로어레이칩, 측방유동(Lateral flow)분석 키트와 같은 장치가 이에 해당될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The biosensor may be applied to any biological measurement device, and a device such as a microarray chip and a lateral flow analysis kit may be applicable thereto, but is not limited thereto.

일 양상은 상기 바이오 센서가 포함된 측방유동분석 키트일 수 있다.One aspect may be a side flow analysis kit containing the biosensor.

상기 측방유동분석 키트는, 표적물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 존재하는 반응부, 표적물질 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 존재하는 측정부, 및 오류 확인을 위한 컨트롤부 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수부를 포함할 수 있다.The lateral flow analysis kit may include a sample part into which a sample containing a target material is input, a reaction part capable of binding to a target material, and a reaction part, a target material, or a target material having a first fusion material combined with an absorber material; The detection unit capable of binding the reactant coupled with the fluorescent substance and the second fusion material combined with the fluorescent substance are fixed on the support, and the control unit for checking the error and the liquid sample can absorb the capillary phenomenon. It may include an absorbing part.

상기 측방유동분석 키트의 각각 샘플부, 반응부, 측정부, 컨트롤부 및 흡수부는 미세관을 통하여 서로 연결되거나, 또는 멤브레인로 서로 연결될 수 있다. 상기 멤브레인은 천연 또는 합성 재료의 다공질 재료일 수 있으며, 니트로셀룰로오스 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Each of the sample part, the reaction part, the measuring part, the control part and the absorbing part of the lateral flow analysis kit may be connected to each other through a microtubule, or may be connected to each other by a membrane. The membrane may be a porous material of natural or synthetic materials, and may be nitrocellulose, but is not limited thereto.

상기 샘플부는 표적물질을 포함하는 시료가 처음 흡수되는 부분으로, 반응부를 구성하거나 또는 반응부와 측정부를 연결하는 멤브레인의 한쪽 끝단을 그대로 사용하거나 별도의 부재로 구성될 수 있고 표적물질을 포함하는 시료를 모세관 현상에 의해 표적물질을 반응부로 이동시킨다. The sample part is a portion in which a sample including a target material is first absorbed, and constitutes a reaction part, or may use one end of a membrane connecting the reaction part and the measuring part as it is, or may be configured as a separate member, and includes a sample containing a target material. Move the target material to the reaction part by capillary action.

상기 반응부는 표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질가 존재하는 곳으로서, 시료가 흡수되는 경우 유동성을 획득하여 미세채널 또는 멤브레인을 통하여 측정부로 이동할 수 있다. 상기 반응부는 유리섬유, 셀룰로즈 등과 같은 재질로 이루어질 수 있다. 상기 멤브레인은 시료의 유동성을 확보할 수 있는 재질이라면 제한되지 않으며, 다공성막으로 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 상세하게는, 항체 또는 특이적 결합물질, 및 효소 단백질을 고정화하고 비특이적 반응을 최소화하는 니트로셀룰로스, 셀룰로스, PVDF, PET, PES, 유리섬유, 나일론 등과 같이 일정한 미세 구멍(Micropore) 크기의 조절이 가능한 소수성 다공성 막이 사용될 수 있다. 또한, 반응부와 측정부는 동일한 멤브레인 위에 위치할 수 있다. The reaction part is a reaction material capable of binding to a target material and a first fusion material in which an absorbent material is coupled. When the sample is absorbed, the reaction part may acquire fluidity and move to the measurement part through a microchannel or a membrane. The reaction part may be made of a material such as glass fiber or cellulose. The membrane is not limited as long as it is a material capable of securing fluidity of the sample, and it is preferable that the membrane is made of a porous membrane. More specifically, control of constant micropore size such as nitrocellulose, cellulose, PVDF, PET, PES, glass fiber, nylon, etc., which immobilizes antibodies or specific binding agents and enzyme proteins and minimizes nonspecific reactions. Possible hydrophobic porous membranes can be used. In addition, the reaction unit and the measurement unit may be located on the same membrane.

상기 컨트롤부는 테스트 결과의 양성 대조군으로서 오류로 인한 반응 유무를 파악하기 위한 곳이다. 상기 컨트롤부는 항상 시료에 포함되는 있는 물질 또는 반응부에 존재하는 흡광물질과 결합할 수 있는 물질이 있을 수 있다. 상기 컨트롤부에 결합된 물질은 항체, 항체의 단편인 Fab나 재조합 scFv 등 일 수 있으며, 리셉터, 리셉터의 단편 또는 흡광물질과 결합할 수 있는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The control part is a positive control of the test result and is a place for determining whether there is a response due to an error. The control unit may be a material that is always included in the sample or a material that can be combined with the light absorbing material present in the reaction unit. The substance bound to the control portion may be an antibody, a Fab or a recombinant scFv, which is a fragment of the antibody, or the like, but may be a compound capable of binding to a receptor, a fragment of the receptor, or an absorber, but is not limited thereto.

상기 흡수부는 모세관 현상에 의해 시료를 충분히 흡수할 수 있는 것으로서, 셀룰로오스, 무명. 친수다공성 폴리머 등이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
The absorbing part is capable of sufficiently absorbing the sample by capillary action, and is cellulose and cotton. It may be a hydrophilic polymer or the like, but is not limited thereto.

또 다른 양상은, 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 있는 반응부에 표적물질이 포함된 시료를 투입하는 단계; 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 있는 측정부에서 형광물질이 방출하는 형광량을 측정하는 단계; 및 시료 투입 후 측정부에서 방출하는 형광량의 감소량을 계산하는 단계를 포함하는 표적물질 검출 방법을 제공한다.In another aspect, the method comprising the steps of: injecting a sample containing the target material to the reaction unit having a first fusion material combined with the reactant and the absorber; Measuring the amount of fluorescence emitted by the fluorescent material in a measuring unit in which a second fusion material, to which a detection material and a fluorescent material are bound, is fixed on a support; And it provides a target material detection method comprising the step of calculating the amount of reduction of the amount of fluorescence emitted from the measuring unit after the sample input.

상기 표적물질 검출방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다. The target substance detection method will be described in detail for each step as follows.

먼저, 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 있는 반응부에 표적물질이 포함된 시료를 투입하는 단계를 포함할 수 있다.First, the method may include inputting a sample including a target material into a reaction part including a first fusion material in which a reactant and an absorber are combined.

상기 반응부에는 특정 파장을 흡수할 수 있는 흡광물질과 반응물질이 결합된 제1 융합물질이 도포되어 있을 수 있다. 반응부에 있는 제1 융합물질은 시료에 포함된 표적물질과 반응한다. 반응부와 측정부 사이에는 미세 채널 또는 멤브레인에 의해 연결되어 있을 수 있으며, 시료 내의 액체가 이동함에 따라 표적물질과 제1 융합물질의 결합된 상태로 함께 이동될 수 있다. The reaction unit may be coated with a first fusion material combined with a light absorbing material and a reaction material that can absorb a specific wavelength. The first fusion material in the reaction part reacts with the target material included in the sample. The reaction unit and the measuring unit may be connected by a microchannel or a membrane, and may move together in a combined state of the target material and the first fusion material as the liquid in the sample moves.

이후, 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 있는 측정부에서 형광물질이 방출하는 형광량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.Thereafter, the method may include measuring the amount of fluorescence emitted by the fluorescent material in the measuring unit in which the second fusion material in which the detection material is combined with the fluorescent material is fixed on the support.

측정부에는 검출물질이 형광물질와 결합된 제2 융합물질의 형태로 측정부의 지지체에 도포되어 있을 수 있다. 이때 제2 융합물질은 측정부의 지지체에 직접 혹은 링커 등에 의해 결합되어 있을 수 있다.The measuring unit may be applied to the support of the measuring unit in the form of a second fused material combined with a fluorescent material. In this case, the second fusion material may be directly bonded to the support of the measurement unit or by a linker.

이후, 시료 투입 후 측정부에서 방출하는 형광량의 감소량을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 측정부에서는 특정 파장의 빛을 조사함에 따라 그 빛을 흡수한 형광물질에 의해 형광이 방출되며, 시료 내의 표적물질에 의해 제1 융합물질과 제2 융합물질이 결합 또는 근접하게 될 경우, 제1 융합물질내의 흡광물질에 의해 형광물질의 형광이 퀀칭되어 형광량이 감소되게 된다. Thereafter, the method may include calculating an amount of reduction in the amount of fluorescence emitted from the measuring unit after the sample is added. The measurement unit emits fluorescence by the fluorescent material absorbing the light as it is irradiated with a specific wavelength, and when the first fusion material and the second fusion material are combined or approached by the target material in the sample, the first The fluorescence of the fluorescent material is quenched by the light absorbing material in the fusion material, thereby reducing the amount of fluorescence.

특정 파장의 빛을 내는 형광물질에 특정 파장을 흡수하는 흡광물질이 항원과 같은 표적물질에 의해 결합할 경우, 형광물질와 반응한 흡광물질의 양에 따라 형광의 세기는 감소하게 되며, 이러한 감소 정도를 수치화할 수 있다. 이와 같이 퀀칭 효과를 이용한 형광의 세기의 감소량은 매우 적은량의 흡광물질이 존재할 때에도, 표적물질의 함량에 비례하여 감소하므로, 미량의 표적물질의 검출에 유용하게 이용될 수 있다(도 9 참조). 특히, 저농도 구간(0.05 ~ 200 ng/ml)에서 기존 방법에 비해 우수한 민감도를 보임을 알 수 있었다(도 9 참조). 다만, 고농도 구간(500 ~ 10,000 ng/ml)에서는 종래의 형광측정 방법에 비해 민감도가 떨어지기 시작하는 것을 확인하였다(도 10 및 11 참조).When a light absorbing material absorbing a specific wavelength is bound to a fluorescent material emitting a specific wavelength by a target material such as an antigen, the intensity of fluorescence decreases depending on the amount of light absorbing material reacted with the fluorescent material. Can be quantified As such, the amount of decrease in fluorescence intensity using the quenching effect decreases in proportion to the content of the target material even when a very small amount of light absorbing material is present, and thus may be usefully used for detecting a small amount of the target material (see FIG. 9). In particular, it can be seen that in the low concentration range (0.05 ~ 200 ng / ml) showed excellent sensitivity compared to the conventional method (see Figure 9). However, in the high concentration section (500 ~ 10,000 ng / ml) it was confirmed that the sensitivity begins to drop compared to the conventional fluorescence measurement method (see FIGS. 10 and 11).

상기 표적물질 검출 방법은 다양한 방법으로 이용될 수 있으며, 측방유동 방식에 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 측방유동 방식은 수직유동(vertical flow)나 통과유동(flow though) 방식을 포함한다. 상기 수직유동 방식의 경우, 시료는 병렬로 배치된 다공성 막 등에 수직으로 쌓일 수 있다.
The target material detection method may be used in various ways, but may be applied to the lateral flow method, but is not limited thereto. The lateral flow method includes a vertical flow or a flow though method. In the case of the vertical flow method, the sample may be stacked vertically on the porous membrane and the like arranged in parallel.

또 다른 양상은, 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 있는 반응부에 표적물질이 포함된 시료를 투입하는 단계; 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 있는 측정부에서 형광물질이 방출하는 형광량을 측정하는 단계; 측정부에서 흡광물질에 의한 흡광도를 측정하는 단계; 및 시료 투입 후 측정부에서 방출하는 형광량의 감소량 및 흡광도를 계산하는 단계를 포함하는 표적물질 검출 방법을 제공한다.In another aspect, the method comprising the steps of: injecting a sample containing the target material to the reaction unit having a first fusion material combined with the reactant and the absorber; Measuring the amount of fluorescence emitted by the fluorescent material in a measuring unit in which a second fusion material, to which a detection material and a fluorescent material are bound, is fixed on a support; Measuring absorbance by the absorbing material in the measuring unit; And calculating a decrease amount and an absorbance of the amount of fluorescence emitted from the measurement unit after the sample is added.

상기 표적물질 검출방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다. The target substance detection method will be described in detail for each step as follows.

먼저, 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 있는 반응부에 표적물질이 포함된 시료를 투입하는 단계를 포함할 수 있다.First, the method may include inputting a sample including a target material into a reaction part including a first fusion material in which a reactant and an absorber are combined.

상기 반응부에는 특정 파장을 흡수할 수 있는 흡광물질과 반응물질이 결합된 제1 융합물질이 도포되어 있을 수 있다. 반응부에 있는 제1 융합물질은 시료에 포함된 표적물질과 반응한다. 반응부와 측정부 사이에는 미세 채널 또는 멤브레인에 의해 연결되어 있을 수 있으며, 시료 내의 액체가 이동함에 따라 표적물질과 제1 융합물질의 결합된 상태로 함께 이동될 수 있다. The reaction unit may be coated with a first fusion material combined with a light absorbing material and a reaction material that can absorb a specific wavelength. The first fusion material in the reaction part reacts with the target material included in the sample. The reaction unit and the measuring unit may be connected by a microchannel or a membrane, and may move together in a combined state of the target material and the first fusion material as the liquid in the sample moves.

이후, 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 있는 측정부에서 형광물질이 방출하는 형광량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.Thereafter, the method may include measuring the amount of fluorescence emitted by the fluorescent material in the measuring unit in which the second fusion material in which the detection material is combined with the fluorescent material is fixed on the support.

측정부에는 검출물질이 형광물질와 결합된 제2 융합물질의 형태로 측정부의 지지체에 도포되어 있을 수 있다. 이때 제2 융합물질은 측정부의 지지체에 직접 혹은 링커 등에 의해 결합되어 있을 수 있다.The measuring unit may be applied to the support of the measuring unit in the form of a second fused material combined with a fluorescent material. In this case, the second fusion material may be directly bonded to the support of the measurement unit or by a linker.

이후, 시료 투입 후 측정부에서 방출하는 형광량의 감소량을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 측정부에서는 특정 파장의 빛을 조사함에 따라 그 빛을 흡수한 형광물질에 의해 형광이 방출되며, 시료 내의 표적물질에 의해 제1 융합물질과 제2 융합물질이 결합 또는 근접하게 될 경우, 제1 융합물질내의 흡광물질에 의해 형광물질의 형광이 퀀칭되어 형광량이 감소되게 된다. 이와 같이 퀀칭 효과를 이용한 형광의 세기의 감소량은 매우 적은량의 흡광물질이 존재할 때에도, 표적물질의 함량에 비례하여 감소하므로, 미량의 표적물질의 검출에 유용하게 이용될 수 있다(도 9 참조). Thereafter, the method may include calculating an amount of reduction in the amount of fluorescence emitted from the measuring unit after the sample is added. The measurement unit emits fluorescence by the fluorescent material absorbing the light as it is irradiated with a specific wavelength, and when the first fusion material and the second fusion material are combined or approached by the target material in the sample, the first The fluorescence of the fluorescent material is quenched by the light absorbing material in the fusion material, thereby reducing the amount of fluorescence. As such, the amount of decrease in fluorescence intensity using the quenching effect decreases in proportion to the content of the target material even when a very small amount of light absorbing material is present, and thus may be usefully used for detecting a small amount of the target material (see FIG. 9).

또한, 측정부에서 흡광물질에 의한 흡광도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 흡광도라 함은 일반 광원을 측정부에 조사한 후 흡광물질에 의해 흡수되는 정도를 의미하는 것이다. 이러한 흡광도는 높은 농도의 흡광물질에 비례한다(도 10 참조). 상기의 방법에 따른 퀀칭을 이용한 표적검출 방법으로 표적을 검출한 결과, 저농도 및 고농도의 표적물질 존재시에 모두 검출이 가능함을 확인하였다(도 11 및 12 참조). In addition, the measuring unit may include the step of measuring the absorbance by the light absorbing material. The absorbance means the degree to which the general light source is absorbed by the absorbing material after irradiating the measurement unit. This absorbance is proportional to the high concentration of absorbent material (see FIG. 10). As a result of detecting the target by the target detection method using quenching according to the above method, it was confirmed that the detection in the presence of both low concentration and high concentration of the target substance (see FIGS. 11 and 12).

일 구체예의 표적물질 검출 방법은 기존에 민감도 향상을 위해 쓰여지는 증강 방법의 경우 2차 반응이 추가적으로 필요하다는 단점과 생성된 은나노입자가 측정부 주변에도 비특이적으로 생기기 때문에 측정시 발생하는 노이즈의 증가로 신뢰도에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있다는 단점을 극복하였다. 따라서, 기존의 면역측정법과는 달리 미량의 특정 항원도 측정 가능하므로, 미량의 생체 물질의 검출에 유용하게 사용될 수 있다. In one embodiment, the target material detection method has a disadvantage in that an additional secondary reaction is required in the case of an augmentation method used to improve sensitivity and an increase in noise generated during measurement because the generated silver nanoparticles are generated nonspecifically around the measurement unit. Overcoming the disadvantage that it may adversely affect the reliability. Therefore, unlike conventional immunoassay, even a small amount of a specific antigen can be measured, and thus can be usefully used for detecting a small amount of a biological material.

도 1은 형광물질을 이용한 측방유동분석 키트에 대한 개념을 나타낸 것이다.
도 2는 나노입자를 이용한 측방유동분석 키트에 대한 개념을 나타낸 것이다.
도 3은 나노입자를 증폭하기 위해 은나노입자를 이용하는 방법에 대한 개념을 나타낸 것이다.
도 4는 퀀칭 시스템을 적용한 측방유동분석 키트에 대한 개념을 나타낸 것이다.
도 5a, 5b 및 5c는 각각 금나노입자의 색, 전자 현미경 사진 및 흡수 파장을 나타낸 것이다.
도 6a, 6b 및 6c는 각각 은나노입자의 색, 전자 현미경 사진 및 흡수 파장을 나타낸 것이다.
도 7a, 7b 및 7c는 각각 금쉘나노입자의 색, 전자 현미경 사진 및 흡수 파장을 나타낸 것이다.
도 8은 입자의 크기에 따른 흡수 파장을 도식화한 것이다.
도 9는 표적물질이 저농도 구간일 경우 퀀칭에 의해 측정된 값 및 흡광도를 도식화한 것이다.
도 10은 표적물질이 고농도 구간일 경우 흡광도를 도식화한 것이다.
도 11은 전체 농도 구간에 대한 흡광도를 도식화한 것이다.
도 12는 퀀칭에 의해 측정된 값 및 흡광도를 도식화한 것이다.Figure 1 shows the concept of the lateral flow analysis kit using a fluorescent material.
Figure 2 shows the concept for lateral flow analysis kit using nanoparticles.
3 illustrates a concept of a method of using silver nanoparticles to amplify nanoparticles.
Figure 4 shows the concept of a lateral flow analysis kit applying a quenching system.
5A, 5B, and 5C show the color, electron micrograph, and absorption wavelength of gold nanoparticles, respectively.
6A, 6B and 6C show the color, electron micrograph and absorption wavelength of silver nanoparticles, respectively.
7A, 7B and 7C show the color, electron micrograph and absorption wavelength of gold shell nanoparticles, respectively.
8 is a diagram illustrating absorption wavelengths according to particle sizes.
9 is a diagram illustrating the values and absorbance measured by quenching when the target material is a low concentration section.
10 is a diagram illustrating the absorbance when the target material is a high concentration section.
Figure 11 shows the absorbance for the entire concentration section.
12 is a plot of the values and absorbance measured by quenching.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, one or more embodiments will be described in more detail by way of examples. However, these embodiments are intended to illustrate one or more embodiments, and the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

제조예Manufacturing example 1:  One: 흡광물질Absorbing material 제조 Produce

<1-1> <1-1> 금나노입자Gold nanoparticles 합성 (흡수 파장 520  Synthesis (absorption wavelength 520 nmnm ))

삼각 플라스크에 테트라클로로금(III) 산(Tetrachloroauric (III) acid) (Sigma) 120 mg 을 증류수 250 ml 에 녹인 후 약 600 rpm으로 교반하면서 100 ℃가 되도록 가열하였다. 물이 끓기 시작하면 증류수에 녹아있는 1% 시트르산삼나트륨 용액(Trisodium citrate solution) 50 ml를 첨가한 뒤 10분간 더 가열하였다. 가열하는 10분 동안 용액의 색이 노랑-검정-보라-짙은 빨간색 순으로 변하였다. 색이 완전히 변했을 때 교반을 한 상태에서 식혀서, AuNP(Au nanoparticles) 용액을 완성하였다.
In a Erlenmeyer flask, 120 mg of tetrachloroauric (III) acid (Sigma) was dissolved in 250 ml of distilled water and heated to 100 ° C. while stirring at about 600 rpm. When the water began to boil, 50 ml of 1% trisodium citrate solution dissolved in distilled water was added, followed by further heating for 10 minutes. The color of the solution changed in the order yellow-black-purple-dark red during 10 minutes of heating. When the color was completely changed, the mixture was cooled under stirring, thereby completing AuNP (Au nanoparticles) solution.

<1-2> <1-2> 은나노입자Silver nanoparticles 합성 (흡수 파장 420  Synthesis (absorption wavelength 420 nmnm ))

50 ml 3구 둥근 플라스크에 에틸렌 글리콜(J.T baker) 7.5 ml에 AgNO3 (Adrich) 40 mg을 녹인 후 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 1 g을 녹였다. 그 후, 가열 기구에 넣은 후 120 ℃에서 4시간 동안 가열하였다. 그 후, 상온에서 식힌 후 3차례 원심분리(12000 rpm, 10분)를 하여 세척하였다.
In a 50 ml three-necked round flask, 40 mg of AgNO 3 (Adrich) was dissolved in 7.5 ml of ethylene glycol (JT baker), followed by dissolving 1 g of polyvinylpyrrolidone. Thereafter, the mixture was placed in a heating apparatus and heated at 120 ° C. for 4 hours. After cooling at room temperature, the mixture was washed three times by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes).

<1-3> <1-3> 금쉘나노입자Gold Shell Nanoparticles (( AuAu shellshell nanoparticlesnanoparticles ) 합성 (흡수 파장 630 Synthesis (absorption wavelength 630 nmnm ))

상기에서 제조된 Ag NPs를 세척 없이 1 ml Ag 원액을 0.4 mM 농도의 증류수중 시트르산삼나트륨 용액 50 ml에 넣고 희석하였다. 희석된 용액을 3구 둥근 플라스크에 넣고 가열 기구에서 100 ℃로 가열하면서 빠르게 교반하였다. 100 ℃로 가열된 용액에 10 mM로 증류수중 테트라클로로금(III) 산 용액(Sigma) 2 ml를 마이크로펌프(Harvard apparatus)를 이용하여 45 ml/h로 일정하게 떨어뜨렸다. 주입 완료 후 20분간 더 반응시켰다. 가열 기구를 제거한 후 상온에서 식힌 후 NaCl을 과량 넣어 생성된 하얀 AgCl 염을 제거하였다. 염을 제거한 후, 1 mm 필터로 거른 후 3차례 원심분리(7000 rpm, 10분)하여 세척하였다.
The Ag NPs prepared above were diluted with 50 ml of trisodium citrate solution in 0.4 mM distilled water without washing. The diluted solution was placed in a three necked round flask and stirred rapidly while heating to 100 ° C. in a heating apparatus. 2 ml of tetrachlorogold (III) acid solution (Sigma) in distilled water at 10 mM was constantly dropped to 45 ml / h using a micropump (Harvard apparatus). After completion of the injection, the reaction was further performed for 20 minutes. After removing the heating apparatus, the mixture was cooled to room temperature, and excess NaCl was added to remove the white AgCl salt. After removing the salt, it was filtered through a 1 mm filter and washed by centrifugation three times (7000 rpm, 10 minutes).

제조예Manufacturing example 2:  2: 흡광입자에Absorbing particles 항체 고정화 Antibody Immobilization

항체를 결합시키기 전에 증류수로 3차례 원심분리(7,000 rpm, 10분간)하여 세척하였다. 원심분리 rpm은 금속입자에 따라 다르게 실시하였다. 금나노입자(Gold NPs)(파장 520nm)은 15,000 rpm에서 30 분간 실시하였고, 은나노입자(파장 420nm)은 10,000 rpm에서 30 분간 실시하였고, 금쉘(Au shell)(파장 630 nm)은 10,000 rpm에서 30 분간 실시하였다.The antibody was washed by centrifugation (7,000 rpm, 10 minutes) three times with distilled water before binding the antibody. Centrifugation rpm was performed differently depending on the metal particles. Gold NPs (wavelength 520 nm) were carried out for 30 minutes at 15,000 rpm, silver nanoparticles (wavelength 420 nm) were carried out for 30 minutes at 10,000 rpm, and Au shell (wavelength 630 nm) was 30 at 10,000 rpm. It was carried out for a minute.

세척 후 흡광입자인 금속입자를 버퍼에 분산시켰다. 그 후, UV/vis 스펙트로미터를 이용하여 버퍼에 분산된 금속입자의 광학 밀도를 2로 맞추었다. 1 ml PBS에 재분산 시킨 후 항체(100 ug/ml) 100 ㎕를 넣고 4 ℃ 냉각실에서 약하게 교반하며 하룻밤 동안 (또는 6h 동안) 반응시켰다. 반응 종료 후, BSA를 1 %로 첨가한 후 1h 동안 상온에서 반응시켰다. 반응하지 않은 1항체와 SH-PEG를 원심분리(7000 rpm, 10분)하여 제거하였다. 반응하지 않은 항체 및 SH-PEG를 제거한 후, 초음파를 이용하여 재분산 후 냉장 보관하였다.
After washing, the metal particles, which are absorbing particles, were dispersed in a buffer. Thereafter, the optical density of the metal particles dispersed in the buffer was adjusted to 2 using a UV / vis spectrometer. After redispersion in 1 ml PBS, 100 μl of the antibody (100 ug / ml) was added thereto, and the mixture was reacted overnight (or 6 h) with gentle stirring in a 4 ° C. cooling chamber. After completion of the reaction, BSA was added at 1% and reacted at room temperature for 1 h. The unreacted antibody and SH-PEG were removed by centrifugation (7000 rpm, 10 minutes). After the unreacted antibody and SH-PEG were removed, it was redispersed using ultrasonic waves and then stored in the refrigerator.

제조예Manufacturing example 3: 형광입자에 항체 고정화 3: Antibody Immobilization on Fluorescent Particles

50mM 인산완충액(phosphate Buffer)(pH 7.4, 0.9 % NaCl) 100 ml를 제조하였다. 또한, 50 mM MES 버퍼(pH 6.0) 100 ml를 제조하였다. 그 후, MES 버퍼에 항체를 10 ~ 25 mg(2 ~ 5 mg/ml)을 원심분리기 튜브에 넣고 녹였다. 그 후 0.2 % 형광비드 5 ml를 넣고 상온에서 15분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 EDAC(Invitrogen) 40 mg을 넣고　볼텍싱하여 섞어　주었다. 그 후 희석된 NaOH로 pH 6.5로 적정한 후, 상온에서 360도 회전 혼합기를 이용하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응의 퀀칭을 위해 10 mM(최종 농도 기준) 글리신을 넣어준 뒤 30분간 상온에서 인큐베이션하였다. 반응하지 않은 단백질은 원심분리기를 통하여 제거하였다. 제거하는 단백질의 크기에 따라 원심분리기의 조건은 다음과 같이 조절하였다. 단백질의 0.5 um 또는 그 이상인 경우 25,000 g에서 30 ~ 60 분간 원심분리기를 이용하며 분리하고,　1 um의 경우 3,000 ~ 5,000 g에서 20 분간 수행하며,　20 ~ 40 nm의 경우 투석을 이용하여 단백질을 분리하였다. 특히 투석의 경우에도,　0.2 nm보다 작을 경우에는 100,000 ~ 300,000 MW 컷-오프 셀룰로오즈 에스터 투석 튜브(cut-off cellulose ester dialysis tube)를　사용하였다(평균 0.03 ~ 1 um 까지 BSA, 아비딘, IgG 제거에 효율적임). 분리된 단백질을 50 mM PBS에 소니케이션 또는 볼텍싱으로 분산하였다. 상기 분산 과정을 2회 더 수행하였다(총 3회 세척). 그 후 50 mM PBS(1 % BSA, 최종 버퍼 기준)에 재분산하였다. 재분산된 용액에 2 mM 소듐 아지드를 첨가 후 얼리지 않고 4 ℃에서 보관하였다.
100 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.4, 0.9% NaCl) was prepared. In addition, 100 ml of 50 mM MES buffer (pH 6.0) was prepared. Thereafter, 10-25 mg (2-5 mg / ml) of the antibody was dissolved in MES buffer in a centrifuge tube. Then 5 ml of 0.2% fluorescent beads were added and incubated at room temperature for 15 minutes. After incubation, 40 mg of EDAC (Invitrogen) was added and vortexed to mix. Thereafter, the mixture was titrated with diluted NaOH to pH 6.5, and reacted at room temperature for 2 hours using a 360-degree rotary mixer at room temperature. After completion of the reaction, 10 mM (based on the final concentration) glycine was added to quench the reaction and incubated at room temperature for 30 minutes. Unreacted proteins were removed by centrifugation. The conditions of the centrifuge were adjusted as follows according to the size of the protein to be removed. If the protein is 0.5 um or more, separate it by using a centrifuge at 25,000 g for 30 to 60 minutes, perform 20 minutes at 3,000 to 5,000 g for 1 um, and separate the protein by dialysis at 20 to 40 nm. It was. Especially in the case of dialysis, 100,000 ~ 300,000 MW cut-off cellulose ester dialysis tube was used for smaller than 0.2 nm (effective for removing BSA, avidin, IgG up to 0.03 ~ 1 um on average). being). The isolated protein was dispersed by sonication or vortexing in 50 mM PBS. The dispersion procedure was performed two more times (three washes in total). It was then redispersed in 50 mM PBS (1% BSA, based on final buffer). 2 mM sodium azide was added to the redispersed solution and stored at 4 ° C without freezing.

제조예Manufacturing example 4 : 테스트 시약의 제조 4: Preparation of Test Reagents

4.3g　NaHCO3, 5.3g　Na2CO3를 H2O 1L에 녹인 후 pH 9.4로 적정하여 코팅 버퍼(Coating Buffer)를 제조하였다.　또한, 1.13 g　Na2HPO4, 0.2 g　KH2PO4, 0.2 g KCl, 8 g　NaCl, 5 g BSA, 및 1 mL Tween 20을 H2O 1L에 녹인 후 pH 7.4로 적정하여 에세이 버퍼를 제조하였다. 또한, 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 3.4 g Na2HPO4, 0.6 g　KH2PO4, 10 g BSA, 및　14.89 g EDTA를 H2O 1L에 녹여 인큐베이션 버퍼(Incubation　Buffer)를 제조하였다. 또한, 9g NaCl 및 1 ml Tween20을 H2O 1L에 녹이고, pH 7.4로 적정하여 세척 버퍼를 제조하였다.
4.3g NaHCO 3 , 5.3g Na 2 CO 3 was dissolved in H 2 O 1L and titrated to pH 9.4 to prepare a coating buffer (Coating Buffer). In addition, an assay buffer was prepared by dissolving 1.13 g Na 2 HPO 4 , 0.2 g KH 2 PO 4 , 0.2 g KCl, 8 g NaCl, 5 g BSA, and 1 mL Tween 20 in 1 L of H 2 O and titrating to pH 7.4. It was. In addition, an incubation buffer was prepared by dissolving 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 3.4 g Na 2 HPO 4 , 0.6 g KH 2 PO 4 , 10 g BSA, and 14.89 g EDTA in H 2 O 1L. In addition, 9 g NaCl and 1 ml Tween20 were dissolved in 1 L of H 2 O, and titrated to pH 7.4 to prepare a wash buffer.

실시예 1 : Example 1: ELISAELISA 테스트 Test

<1-1> <1-1> 퀀칭Quenching 시스템을 이용한 형광의 감소량 측정을 통한 시료 검출 Sample detection by measuring the amount of fluorescence reduction using the system

코팅 버퍼(Coating buffer)에 항체가 고정화된 형광입자를 0.5 %로 희석 후 96 웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 호일로 덮고 4°C에서 하룻밤동안(12 ~ 18 h) 인큐베이션하였다. 다음날, 세척 버퍼를 400 ㎕이상 넣어 4회 세척하였다. 그 후, 에세이 버퍼(assay　Buffer)를 웰 당　300 ㎕씩 첨가한　후 호일을 덮고 상온에서 1h 동안 반응시켰다. 반응이 종료 후, 용액을 제거하였다. 용액을 제거한 후, 블랭크 웰(blank well)을 제외한 모든 웰에 50 ㎕의 인큐베이션 버퍼(cubation buffer)를 넣었다. 그 후, 항원 농도별로 반응시킨 흡광입자 용액을 100 ㎕씩 넣고 호일을 덮고 상온에서 1h 동안 인큐베이션하였다.After diluting the fluorescent particles immobilized with the antibody in the coating buffer (0.5%) to 0.5%, 100 μl of each was added to the 96 well plate. Plates were covered with foil and incubated overnight at 4 ° C. (12-18 h). The next day, wash buffer was added four times with 400 µl or more. Thereafter, an assay buffer (assayassaBuffer) was added to 300 μl per well, and then the foil was covered and reacted at room temperature for 1 h. After the reaction was completed, the solution was removed. After the solution was removed, 50 μl of incubation buffer was added to all wells except the blank wells. Thereafter, 100 μl of the absorber particles reacted with each antigen concentration was added thereto, the foil was covered, and incubated at room temperature for 1 h.

인큐베이션이 끝난 후 세척 버퍼를 300 ㎕이상 넣어 4회 세척하였다. 세척후 0.01 M, pH 7.4 PBS를 200 ㎕씩 각 웰에 넣었다. 그 후, 플레이트 리더(Plate reader)를 이용하여 항원 농도에 따른 결과 값을 측정하였다.
After incubation, the wash buffer was added four times with 300 µl or more. After washing, 200 μl of 0.01 M, pH 7.4 PBS was added to each well. Thereafter, a plate reader was used to measure the results according to the antigen concentration.

<1-2> <1-2> 흡광의Absorbance 증가량 측정을 통한 시료 검출 Sample detection via incremental measurement

코팅 버퍼에 항체를 5 ug/ml로 희석한 후 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 호일로 덮고 4 ℃에서 하룻밤동안(12 내지 18h) 인큐베이션하였다. 다음날, 세척 버퍼를 400 ㎕이상 넣어 4회 세척하였다. 에세이 버퍼를 웰당　300 ㎕씩 첨가한　후 호일을 덮고 상온에서 1h 동안 반응시켰다. 반응이 종료 후 용액을 제거하였다. 블랭크 웰을 제외한 모든 웰에 50 ㎕의 인큐베이션 버퍼를 넣었다. 그 후 항원 농도별로 반응시킨 흡광입자 용액을 100 ㎕ 넣고 호일을 덮고 상온에서 1h 동안 인큐베이션을 하였다.Antibodies were diluted to 5 ug / ml in the coating buffer and then 100 μl each were added to 96-well plates. Plates were covered with foil and incubated overnight at 4 ° C. (12-18 h). The next day, wash buffer was added four times with 400 µl or more. Essay buffer was added to 300 μl per well, and then the foil was allowed to react for 1 h at room temperature. The solution was removed after the reaction was completed. 50 μl of incubation buffer was added to all wells except the blank wells. Thereafter, 100 μl of the absorbed particle solution reacted according to the antigen concentration was added to the foil, and incubated at room temperature for 1 h.

인큐베이션 종료 후, 세척 버퍼를 300 ㎕이상 넣고 4회 세척하였다. 그 후, 0.01 M, pH 7.4 PBS를 200 ㎕씩 각 웰에 넣었다. 그 후, 플레이트 리더를 이용하여 항원 농도에 따른 결과값을 측정하였다.
After the completion of incubation, more than 300 μl of washing buffer was added and washed four times. Thereafter, 200 μl of 0.01 M, pH 7.4 PBS was added to each well. Then, the result value according to antigen concentration was measured using the plate reader.

<1-3> 형광 증가량 측정을 통한 시료 검출<1-3> Sample detection through fluorescence increase measurement

코팅 버퍼에 항체를 5 ug/ml로 희석한 후 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 호일로 덮고 4 ℃에서 하룻밤동안(12 내지 18h) 인큐베이션하였다. 다음날, 세척 버퍼를 400 ㎕이상 넣어 4회 세척하였다. 에세이 버퍼를 웰당　300 ㎕씩 첨가한　후 호일을 덮고 상온에서 1h 동안 반응시켰다. 반응이 종료 후 용액을 제거하였다. 블랭크 웰을 제외한 모든 웰에 50 ㎕의 인큐베이션 버퍼를 넣었다. 그 후 항원 농도별로 반응시킨 형광입자 용액을 100 ㎕ 넣고 호일을 덮고 상온에서 1h 동안 인큐베이션 하였다.Antibodies were diluted to 5 ug / ml in the coating buffer and then 100 μl each were added to 96-well plates. Plates were covered with foil and incubated overnight at 4 ° C. (12-18 h). The next day, wash buffer was added four times with 400 µl or more. Essay buffer was added to 300 μl per well, and then the foil was allowed to react for 1 h at room temperature. The solution was removed after the reaction was completed. 50 μl of incubation buffer was added to all wells except the blank wells. Thereafter, 100 μl of the fluorescent particle solution reacted according to the antigen concentration was added to the foil, and incubated at room temperature for 1 h.

인큐베이션 종료 후, 세척 버퍼를 300 ㎕이상 넣고 4회 세척하였다. 그 후, 0.01 M, pH 7.4 PBS를 200 ㎕씩 각 웰에 넣었다. 그 후, 플레이트 리더를 이용하여 항원 농도에 따른 결과값을 측정하였다.After the completion of incubation, more than 300 μl of washing buffer was added and washed four times. Thereafter, 200 μl of 0.01 M, pH 7.4 PBS was added to each well. Then, the result value according to antigen concentration was measured using the plate reader.

1:금속나노입자, 2:형광입자, 3:금나노입자, 4:은나노입자, 5:표적물질(항원), 10:반응물질, 11:검출물질, 12: 흡광물질을 검출하기 위한 물질, 21:LED, 22:PD(photodiode), 30:흡광 입자, 31:형광입자, 32:금속쉘, 33:금속쉘내부, 34:금속쉘, 35:금속쉘내부, 36:금속흡광물질, 37:금속흡광물질, 101:시료부, 102:반응부, 103:측정부, 104:흡수부, 105:테스트 라인, 106:컨트롤 라인, 107:하우징, 108:시료 투입부, 110:측정부, 111:반응부1: metal nanoparticle, 2: fluorescent particle, 3: gold nanoparticle, 4: silver nanoparticle, 5: target material (antigen), 10: reactant, 11: detection material, 12: material for detecting absorbing material, 21: LED, 22: PD (photodiode), 30: absorbing particles, 31: fluorescent particles, 32: metal shell, 33: metal shell inside, 34: metal shell, 35: metal shell inside, 36: metal absorbing material, 37 : Metal absorbing material, 101: sample part, 102: reaction part, 103: measuring part, 104: absorbing part, 105: test line, 106: control line, 107: housing, 108: sample input part, 110: measuring part, 111: reaction part

Claims (17)

표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 존재하는 반응부, 표적물질 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 존재하는 측정부를 포함하는 바이오 센서.Reactants capable of binding to a target material and a first fusion material in which a light absorbing material is coupled to a reaction part, a target material or a second material in which a detection material and a fluorescent material are capable of binding to a reactant bound to the target material A biosensor comprising a measuring unit in which the fusion material is fixed on the support. 제1항에 있어서, 상기 표적물질은 DNA, 항원 단백질 및 리간드인 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the target material is DNA, antigen protein, and ligand. 제1항에 있어서, 상기 반응물질은 표적물질에 결합할 수 있는 항체, Fab, scFv, 리셉터 및 리셉터 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the reactant is any one selected from the group consisting of an antibody, a Fab, a scFv, a receptor, and a receptor fragment capable of binding to a target material. 제1항에 있어서, 상기 흡광물질은 금속나노입자 또는 금속쉘나노입자 또는 고분자 구조체인 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the light absorbing material is a metal nanoparticle or a metal shell nanoparticle or a polymer structure. 제4항에 있어서, 상기 흡광물질은 금나노입자, 은나노입자, 금쉘나노입자, 은쉘나노입자, 분자체 산소(Molecular oxygen), 요오드화물 이온(iodide ions) 및 아크릴아마이드(acrylamide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 바이오 센서. The method of claim 4, wherein the light absorbing material is selected from the group consisting of gold nanoparticles, silver nanoparticles, gold shell nanoparticles, silver shell nanoparticles, molecular sieve oxygen (Molecular oxygen), iodide ions and acrylamide The biosensor which is any one selected. 제1항에 있어서, 상기 검출물질은 표적물질 또는 표적물질과 결합된 물질과 결합할 수 있는 항체, Fab, scFv 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the detection material is any one selected from the group consisting of an antibody, Fab, and scFv capable of binding to a target material or a substance bound to the target material. 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 형광단백질, 형광분자, 생체발광 단백질 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the fluorescent material is any one selected from the group consisting of a fluorescent protein, a fluorescent molecule, a bioluminescent protein, and a quantum dot. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 미세 채널의 표면 또는 유동이 가능한 금속 입자, 고분자 입자의 표면인 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the support is a surface of a microchannel or a surface of a metal particle or a polymer particle capable of flowing. 제8항에 있어서, 상기 유동이 가능한 금속 입자 또는 고분자 입자는 자기장(magnetic field), 전자기장(electromagnetic field), 초음파(ultrasonic waves)에 의해 이동의 제어가 가능한 바이오 센서.The biosensor of claim 8, wherein the flowable metal particles or polymer particles are controlled by a magnetic field, an electromagnetic field, and ultrasonic waves. 표적물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 존재하는 반응부, 표적물질 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 존재하는 측정부, 및 오류 확인을 위한 컨트롤부 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수부를 포함하는 측방유동분석 키트.The sample unit into which the sample containing the target material is introduced, the reaction unit capable of binding to the target material, and the reaction unit including the first fusion material combined with the absorber, the target material or the reactant bound to the target material Side flow analysis including a measurement unit in which a second fused material combined with a detectable substance and a fluorescent substance is fixed on the support, and a control unit for error checking and an absorption unit capable of absorbing a liquid sample by capillary action. Kit. 제10항에 있어서, 상기 반응부와 측정부 사이에 미세채널로 연결되어 있는 것인 측방유동분석 키트.The lateral flow analysis kit of claim 10, wherein the side flow analysis kit is connected between the reaction part and the measurement part by a microchannel. 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 있는 반응부에 표적물질이 포함된 시료를 투입하는 단계;
검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 있는 측정부에서 형광물질이 방출하는 형광량을 측정하는 단계; 및
시료 투입 후 측정부에서 방출하는 형광량의 감소량을 계산하는 단계를 포함하는 표적물질 검출 방법.Injecting a sample including a target material into a reaction part including a first fusion material combined with a reactant and an absorber;
Measuring the amount of fluorescence emitted by the fluorescent material in a measuring unit in which a second fusion material, to which a detection material and a fluorescent material are bound, is fixed on a support; And
The target material detection method comprising the step of calculating the amount of reduction in the amount of fluorescence emitted from the measuring unit after the sample input. 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 있는 반응부에 표적물질이 포함된 시료를 투입하는 단계;
검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 있는 측정부에서 형광물질이 방출하는 형광량을 측정하는 단계;
측정부에서 흡광물질에 의한 흡광도를 측정하는 단계; 및
시료 투입 후 측정부에서 방출하는 형광량의 감소량 및 흡광도를 계산하는 단계를 포함하는 표적물질 검출 방법.Injecting a sample including a target material into a reaction part including a first fusion material combined with a reactant and an absorber;
Measuring the amount of fluorescence emitted by the fluorescent material in a measuring unit in which a second fusion material, to which a detection material and a fluorescent material are bound, is fixed on a support;
Measuring absorbance by the absorbing material in the measuring unit; And
The target material detection method comprising the step of calculating the amount of absorbance and the decrease in the amount of fluorescence emitted from the measurement unit after the sample input. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 흡광물질은 금속나노입자, 금속쉘나노입자 또는 고분자 구조체인 표적물질 검출 방법.The method of claim 12, wherein the light absorbing material is a metal nanoparticle, a metal shell nanoparticle, or a polymer structure. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 흡광물질은 금나노입자, 은나노입자, 금쉘나노입자, 은쉘나노입자, 분자체 산소(Molecular oxygen), 요오드화물 이온(iodide ions) 및 아크릴아마이드(acrylamide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 표적물질 검출 방법.The method according to claim 12 or 13, wherein the light absorbing material is gold nanoparticles, silver nanoparticles, gold shell nanoparticles, silver shell nanoparticles, molecular sieve oxygen (Molecular oxygen), iodide ions (acrylamide) and acrylamide Target material detection method which is any one selected from the group consisting of. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 지지체는 미세 채널의 표면 또는 유동이 가능한 금속 입자, 고분자 입자의 표면인 표적물질 검출 방법.The method of claim 12, wherein the support is a surface of a microchannel or a surface of a metal particle or a polymer particle capable of flowing. 제16항에 있어서, 상기 유동이 가능한 금속 입자 또는 고분자 입자는 자기장(magnetic field), 전자기장(electromagnetic field), 초음파(ultrasonic waves)에 의해 이동의 제어가 가능한 표적물질 검출 방법.The method of claim 16, wherein the flowable metal particles or polymer particles are controlled by a magnetic field, an electromagnetic field, and ultrasonic waves.
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CN109298182A (en) * 2017-07-24 2019-02-01 北京健平九星生物医药科技有限公司 A kind of preparation method and fluorescence immune chromatography card of fluorescence immune chromatography card
KR20190071932A (en) * 2017-12-15 2019-06-25 가천대학교 산학협력단 Method of preparing carbon quantum dots from broccoli and method for detecting silver

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