KR20130085752A - Method for induction cardiac myocyte from somatic cells using direct reprogramming strategy by small molecule treatment without genetic modification - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유전자 도입 없이 저분자성 물질을 이용하여 체세포로부터 심근세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 안전하고 높은 효율로 체세포로부터 화학적 유도 심근세포(Chemically Induced Cardiac Myocyte ; ciCM)로 직접적 역분화(이하, 직접적 리프로그래밍과 혼용하여 사용함)를 하는 방법 및 이에 이용되는 역분화 유도용 배지 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of inducing cardiomyocytes from somatic cells using a low molecular weight material without gene introduction. More specifically, the present invention uses direct dedifferentiation from somatic cells into chemically induced cardiac myocytes (ciCM) using only low molecular weight materials without gene introduction (hereinafter, used in combination with direct reprogramming). It relates to a method and a medium composition for inducing differentiation used therein.
심장질환은 선진국들에서 주된 사망원인으로 자리 잡고 있으며, 우리나라에서도 유병률이 빠른 속도로 증가하고 있는 추세이다. 현재 심근경색 및 비정상적인 심장발달을 치료하기 위한 다양한 시술들이 시행되고 있으나, 심근세포의 낮은 재생능력 때문에 완치에 많은 어려움이 있다. Heart disease is the leading cause of death in developed countries, and the prevalence rate is rapidly increasing in Korea. Currently, various procedures are being performed to treat myocardial infarction and abnormal heart development, but there are many difficulties in curing due to the low regenerative capacity of cardiomyocytes.
현재 심장질환 치료를 위해 가장 많이 시행되고 있는 시술은 장기 이식 및 동물 유래 조직으로 심장조직 일부를 치환하는 시술이다. 하지만 이러한 시술들은 장기 기증자의 확보 및 이종간 면역거부 반응 등의 문제가 완전히 해결되지 않은 과제로 남아 있다. Currently, the most frequently performed procedure for treating heart disease is organ transplantation and replacement of part of the heart tissue with animal-derived tissue. However, these procedures remain a challenge that has not been completely resolved such as organ donor acquisition and cross-immune rejection.
이러한 문제점을 해결하기 위해 많은 연구 그룹들은 심근세포의 이식을 통하여 심장의 기능을 회복시키는 방법에 관한 연구들을 진행하고 있다. 심근세포의 이식에 이용될 세포를 획득하기 위한 방법으로는 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 유도 만능줄기세포 (Induced pluripotent stem cells : iPSC)를 분화시켜서 심근세포를 획득하는 것이 가장 일반적으로 제시되고 있는 방법이다. 하지만 성체줄기세포는 제한된 분화능 및 세포수 확보의 어려움이, 배아줄기세포와 유도 만능줄기세포는 공통적으로 양성종양 (teratoma) 형성의 위험이 문제가 되어서 임상적용에 어려움을 겪고 있다. 나아가 종래의 섬유모세포를 유도 만능줄기세포로 역분화시킨 다음 이를 다시 심근세포로 분화시키는 방법은, 절차가 복잡하고 섬유모세포로부터 유도 만능줄기세포로의 전환비율이 약 0.1%로 매우 낮고, 역분화시간도 약 4 ~ 8주가 소요되는 문제점이 있다.To address this problem, many research groups are working on how to restore cardiac function by transplanting cardiomyocytes. The most common method for obtaining cardiomyocytes by differentiating adult stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells (iPSC) has been proposed. It is a way. However, adult stem cells have difficulty in securing limited differentiation capacity and number of cells, and embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells have difficulties in clinical application because of the risk of teratoma formation. Furthermore, the conventional method of dedifferentiating fibroblasts into induced pluripotent stem cells and then differentiating them into cardiomyocytes is a complicated procedure and the conversion rate from fibroblasts to induced pluripotent stem cells is very low at about 0.1%. There is also a problem that takes about 4 to 8 weeks.
이러한 여러 줄기세포들의 대안으로 최근 제시되고 있는 방법이 바로 ‘직접적 리프로그래밍 (Direct reprogramming)’방법이다. 최근 2개의 연구그룹이 서로 다른 방법을 이용하여 마우스 섬유아세포를 심근세포로 직접적 리프로그래밍 하는데 성공하였다고 보고하였다. An alternative method to these stem cells is the direct reprogramming method. Two groups recently reported success in reprogramming mouse fibroblasts directly into cardiomyocytes using different methods.
본 발명은 이러한 직접적 리프로그래밍 방법에 관한 발명으로, 본 발명의 배경이 되는 기술로서 미국의 Deepak Srivastava 그룹이 3개의 심근유도 유전자 (Mef2C, Gata4, Tbx5)를 선별하고 이들 유전자를 형질도입하여, 마우스 심장 섬유아세포 (cadiac fibroblast) 및 꼬리 유래 섬유아세포 (tail tip fibroblast)를 심장 전구세포 단계를 거치지 않으면서 유도 심근세포 (Induced Cardiac Myocyte ; iCM)로 리프로그래밍하는데 성공하였다고 보고한 바 있다 (Leda M et al., Cell 142(3), 375-386 (2010.08.06)). The present invention relates to such a direct reprogramming method. As a background technology of the present invention, the US Deepak Srivastava group selects three cardiomyocyte genes (Mef2C, Gata4, Tbx5) and transduces them. It has been reported that cardiac fibroblasts and tail tip fibroblasts have been successfully reprogrammed into induced cardiac myocytes (ICMs) without undergoing the cardiac progenitor stage (Leda M et al. al., Cell 142 (3), 375-386 (2010.08.06).
또한 미국의 Sheng Ding 그룹은 iPSC를 유도하는 것으로 알려진 4가지 유전자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)로 체세포를 형질전환시킨 후, 완전히 전분화능을 획득하기 전 ‘역분화 중간단계 (intermediate stage)'에서 특정 신호전달체계를 저해함으로써 심근세포의 특징을 가진 세포의 유도가 가능하였다고 보고하였다 (Jem A. Efe et al., Nature Cell Biology 13, 215-222(2011.01.30)). In addition, the Sheng Ding group of the United States has transformed somatic cells with four genes known to induce iPSCs (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4), and before they fully acquire pluripotency, the 'intermediate stage' Inhibition of specific signaling systems allowed the induction of cells characterized by cardiomyocytes (Jem A. Efe et al., Nature Cell Biology 13, 215-222 (January 30, 2011)).
상기 두 그룹에서 의해 제시된 방법은 여러 줄기세포의 장점만을 포함하면서도 임상적용을 저해하는 요소들을 상당부분 제거했다는 점에서 높이 평가받고 있다. 하지만, 이러한 유도 심근세포(iCM) 역시 유도 만능줄기세포 (iPSC)처럼 바이러스 벡터(viral vector)를 이용한 형질전환 방법을 이용하기 때문에 유전적 변이를 동반할 소지를 내포하고 있다. The methods presented by the two groups are highly appreciated in that they include only the advantages of several stem cells, but eliminate many of the factors that inhibit clinical application. However, these induced cardiomyocytes (iCM) also have the potential to be accompanied by genetic mutations because they use a transformation method using a viral vector (iPSC), such as induced pluripotent stem cells (iPSC).
따라서 iPS로의 역분화 과정을 생략하여 소요되는 시간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 유전적 변이를 일으킬 소지가 있는 유전자 도입이 없는 안전한 새로운 역분화 유도 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다 할 것이다.Therefore, the necessity of shortening the time required by omitting the dedifferentiation process to iPS and the need for a safe new method of inducing dedifferentiation without the introduction of a gene that may cause genetic mutation still remains.
나아가 본 발명의 배경이 되는 기술로서 대한민국 공개특허 10-2009-0085093(2009.08.06)에는 성체 포유동물 심근세포가 분열촉진물질이 풍부한 배지에서 배양되는 경우 심장 줄기 세포로의 역분화를 유도할 수 있는 기술이 기재되어 있으나, 심근세포를 출발물질로 하며 분열촉진물질을 이용하여 심장 줄기 세포로 역분화하는 것으로 체세포로부터 저분자성 물질만으로 심근세포를 유도하는 것에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다.
Furthermore, as a background technology of the present invention, Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2009-0085093 (2009.08.06) discloses that adult mammalian cardiomyocytes may induce reverse differentiation into cardiac stem cells when cultured in a media rich in mitogens. Although a technique has been described, there is no disclosure about inducing cardiomyocytes from somatic cells with only low molecular weight materials by dedifferentiating cardiomyocytes as starting materials and by dividing them into cardiac stem cells using proliferation promoting substances.
본 발명에서는 유전자를 대신하여 저분자성 물질만을 이용하여 리프로그래밍을 유도함으로써 더욱 안전한 심장질환용 세포치료제를 생산하는 방법을 제시하고자 한다. In the present invention, by inducing reprogramming using only low-molecular substances in place of genes, a method for producing a safer cell therapy for heart disease is proposed.
따라서 본 발명의 목적은 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 안전하고 높은 효율로 체세포로부터 유도 심근세포로 직접적 역분화를 하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for directly dedifferentiating from somatic cells to induced cardiomyocytes using only low molecular weight materials without gene introduction in a safe and high efficiency.
본 발명의 다른 목적은 체세포로부터 유도 심근세포로의 역분화를 유도하는 역분화 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a medium composition for inducing differentiation which induces differentiation from somatic cells to induced cardiomyocytes.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Still other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 GSK (glycogen synthease kinase) 억제제, 칼슘채널 애고니스트 (calcium channel agonist), cAMP 시그널링 액티베이터(cAMP signaling activator), TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor), 및 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 물질이 포함된 배양액에서 체세포를 배양하여 심근세포로 유도하는 단계를 포함하는, 저분자성 물질을 이용하여 체세포로부터 심근세포를 유도하는 방법을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a glycosyl synthease kinase (GSK) inhibitor, a calcium channel agonist, a cAMP signaling activator, a TGF-β type I receptor inhibitor (TGF-β type) Inducing somatic cells into cardiomyocytes by culturing somatic cells in a culture medium containing one or more substances selected from the group consisting of I receptor inhibitors (EKR1) and dual inhibitors of extracellular regulated kinase (EKR1) and Ras-GTPase activating protein (Ras-GAP). It provides a method of inducing cardiomyocytes from somatic cells using a low molecular weight material, including.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GSK (glycogen synthease kinase) 억제제, 칼슘채널 애고니스트(calcium channel agonist), cAMP 시그널링 액티베이터(cAMP signaling activator), TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor), 및 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 물질이 포함되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 심근세포를 유도하는 심근세포 역분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a glycosyl synthease kinase (GSK) inhibitor, a calcium channel agonist, a cAMP signaling activator, a TGF-β type I receptor inhibitor (TGF-β type) I receptor inhibitors) and one or more substances selected from the group consisting of an extracellular regulated kinase (EKR1) and a dual inhibitor of Ras-GTPase activating protein (Ras-GAP). Provided is a medium composition for inducing cardiomyocyte dedifferentiation.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 GSK (glycogen synthease kinase) 억제제, 칼슘채널 애고니스트 (calcium channel agonist), cAMP 시그널링 액티베이터(cAMP signaling activator), TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor), 및 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 물질이 포함된 배양액에서 체세포를 배양하여 심근세포로 유도하는 단계를 포함하는, 저분자성 물질을 이용하여 체세포로부터 심근세포를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 물질들이 체세포로부터 심근세포를 유도하는 역할을 하는 심근세포 유도 물질이라는 것은 본 발명자들에 의해 최초로 밝혀졌다 (도 1a ~ 도 1f) According to an aspect of the present invention, the present invention provides a glycosyl synthease kinase (GSK) inhibitor, a calcium channel agonist, a cAMP signaling activator, a TGF-β type I receptor inhibitor (TGF-β type) Inducing somatic cells into cardiomyocytes by culturing somatic cells in a culture medium containing one or more substances selected from the group consisting of I receptor inhibitors (EKR1) and dual inhibitors of extracellular regulated kinase (EKR1) and Ras-GTPase activating protein (Ras-GAP). It provides a method of inducing cardiomyocytes from somatic cells using a low molecular weight material, including. It was first discovered by the present inventors that the substances are cardiomyocyte inducing substances which play a role in inducing cardiomyocytes from somatic cells (FIGS. 1A to 1F).
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 배양액에는 GSK (glycogen synthease kinase) 억제제, TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor), 및 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제가 포함되는 것이 바람직하다. 상기 3종의 심근세포 유도 저분자성 물질이 포함된 배양액으로 심근세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 5종의 심근세포 유도 저분자성 물질을 이용하면 25 ~ 40 %의 더욱 높은 수율로 심근세포를 유도할 수 있다.
The culture medium may include, but is not limited to, a glycogen synthease kinase (GSK) inhibitor, a TGF-β type I receptor inhibitor (TGF-β type I receptor inhibitor), and extracellular regulated kinase (EKR1) and Ras-GTPase activating (Ras-GAP). protein) is preferably included. It is possible to efficiently induce cardiomyocytes with the culture medium containing the three cardiomyocyte-induced low molecular weight substances. More preferably, by using the five cardiomyocyte-derived low molecular weight substances, the cardiomyocytes can be induced at a higher yield of 25 to 40%.
본 발명에서 "GSK 억제제"란 GSK (glycogen synthase kinase) 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2의 업스트림 (upstream) 분자인 GSK1/2를 표적으로 하는 물질들을 의미한다(Polychronopoulos P et al., J Med Chem 47, 935-946 (2004. 02.12)). 본 발명에서 GSK는 바람직하게는 GSK3β를 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 GSK 억제제는 바람직하게는 GSK-3 억제제/WNT 시그널링 액티베이터 (GSK-3 inhibitor /WNT signaling activator)인 chir99021을 의미한다. 상기 chir99021은 아미노피리미딘(aminopyrimidine)으로 표시된다. 그러나 상기 화합물 외에도 1-AKP (1-azakenpaullon)을 포함한 모든 GSK 억제제가 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.
In the present invention, "GSK inhibitor" refers to substances that target GSK1 / 2, which is an upstream molecule of GSK1 / 2 involved in glycosynthetic kinase (GSK) signaling (Polychronopoulos P et al., J Med Chem 47, 935-946 (February 12, 2004). In the present invention, GSK preferably means GSK3β. GSK inhibitor included in the composition of the present invention preferably means chir99021 which is a GSK-3 inhibitor / WNT signaling activator. The chir99021 is represented by aminopyrimidine. However, it will be apparent to those skilled in the art that all GSK inhibitors, including 1-AKP (1-azakenpaullon), in addition to the above compounds, may fall within the scope of the present invention.
본 발명에서 "칼슘채널 애고니스트 (calcium channel agonist)"는 전압의존성 칼슘채널에 직접 작용하여 칼슘전류를 증대시키는 물질을 의미하며, L, N, T, P 형 등의 서브타입을 포함한다(Hess P et al., Nature 311, 538-544 (1984.10.11.)). 상기 칼슘채널 애고니스트는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 L-타입 특이 칼슘채널 애고니스트 (L-type specific calcium channel agonist)인 (±) BayK 8644이다.
In the present invention, "calcium channel agonist" refers to a substance that increases calcium current by directly acting on voltage-dependent calcium channels, and includes subtypes such as L, N, T, and P types (Hess P et al., Nature 311, 538-544 (1984.10.11.). The calcium channel agonist is not limited thereto, but is preferably (±) BayK 8644, which is an L-type specific calcium channel agonist.
본 발명에서, "cAMP 시그널링 액티베이터(cAMP signaling activator)"는 cAMP 신호를 활성화시키는 물질을 의미한다(Hedin L et al., Mol Cell Endocrinol 33, 69-80 (1983.11)). 상기 cAMP 시그널링 액티베이터는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 생리적 특성조절물질로 알려진 포르스콜린 (Forskolin; Coleonol)이다. 그러나 상기 화합물 외에도 8-br-cAMP을 포함한 모든 cAMP 시그널링 액티베이터가 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.
In the present invention, "cAMP signaling activator" means a substance that activates a cAMP signal (Hedin L et al., Mol Cell Endocrinol 33, 69-80 (1983.11)). The cAMP signaling activator is not limited thereto, but is preferably Forskolin (Coleonol), which is known as a physiological property modulator. However, it is apparent to those skilled in the art that all cAMP signaling activators including 8-br-cAMP, in addition to the above compounds, may fall within the scope of the present invention.
본 발명에서, "TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor)"는 TGF-β 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-β I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미한다(Tojo M et al., Cancer Sci. 96, 791-800 (2005. 11)). TGF-β 타입 I (Transforming growth factor-β type I)은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 지방세포형성, 근세포형성, 골세포형성, 상피세포 분화 등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다. 상기 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 A-8301이다. 그러나 상기 화합물 외에도 SB432542을 포함한 모든 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제가 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.
In the present invention, "TGF-β type I receptor inhibitor" refers to a substance that binds to the TGF-β type I receptor and interferes with the normal signaling process of TGF-β I. (Tojo M et al., Cancer Sci. 96, 791-800 (November 2005)). TGF-β type I (Transforming growth factor-β type I) is a multifunctional peptide that has various functions on cell proliferation, differentiation and various cell types. It plays a pivotal role in the growth and differentiation of many tissues, including cell differentiation. The TGF-β type I receptor inhibitor is not limited thereto, but is preferably A-8301. However, it is apparent to those skilled in the art that in addition to the above compounds, all TGF-β type I receptor inhibitors, including SB432542, may fall within the scope of the present invention.
본 발명에서, "EKR1 (extracellular regulated kinase1)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제 (dual inhibitior of ERK1 and Ras-GAP)"는 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)을 동시에 억제하는 물질을 의미한다(Chen S et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 17266-17271 (2006.11.14.)). 본 발명의 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 만능성 유지 물질로 알려진 SC1 (Pluripotin)이다. 나아가 EKR1의 억제제와 Ras-GAP 억제제를 조합하여 이용될 수도 있다. 상기 ERK1 억제제는 이에 한정되는 것은 아니나 바람직하게는 PD0325901 또는 U0126일 수 있다. 상기 U0126은 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminophenylthio] butadiene으로 표시된다. 상기 Ras-GAP 억제제는 AA(Arachidonic acid)일 수 있다. 그러나, 상기 화합물 외에도 모든 ERK1 신호전달 억제제 및 Ras-GAP가 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.
In the present invention, "dual inhibitior of ERK1 and Ras-GAP" of ERK1 and Ras-GAP (Ras-GAP) GTPase activating protein) means a substance that simultaneously inhibits (Chen S et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 17266-17271 (Nov. 14, 2006)). The dual inhibitor of EKR1 (extracellular regulated kinase) and Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein) of the present invention is not limited thereto, but is preferably SC1 (Pluripotin) known as a pluripotent maintenance substance. Furthermore, it may be used in combination with an inhibitor of EKR1 and a Ras-GAP inhibitor. The ERK1 inhibitor is not limited thereto, but may be preferably PD0325901 or U0126. U0126 is represented by 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis [2-aminophenylthio] butadiene. The Ras-GAP inhibitor may be AA (Arachidonic acid). However, it will be apparent to those skilled in the art that in addition to the above compounds, all ERK1 signaling inhibitors and Ras-GAP may fall within the scope of the present invention.
본 발명의 상기 심근세포 유도 물질은 시중에서 구입(Stemgent, Cambridge, MA USA 또는 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA)하여 사용하거나 제조하여 사용할 수 있으며 상기 배양액에 유효 농도로 포함되도록 한다. 배양액의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다. The cardiomyocyte inducing material of the present invention can be used commercially (Stemgent, Cambridge, MA USA or Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA) or manufactured and used to be included in an effective concentration in the culture solution. . Effective concentrations may be affected by factors well known in the art, such as the type of culture and the method of culture.
상기 심근세포 유도 물질의 농도는 체세포를 심근세포로 유도할 수 있는 농도이면 특별히 제한이 없으며, 예를 들어 chir99021 (GSK-3 억제제) 1~10μM, (±) BayK 8644 (calcium channel agonist) 1~10μM, 포르스콜린(Forskolin; cAMP signaling activator) 1~100μM, A-8301 (TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor) 1~10μM, 및 SC1 (Pluripotin) 1~10μM의 농도로 첨가될 수 있다.
The concentration of the cardiomyocyte-inducing substance is not particularly limited as long as it is a concentration capable of inducing somatic cells into cardiomyocytes. For example, chir99021 (GSK-3 inhibitor) 1-10 μM, (±) BayK 8644 (calcium channel agonist) 1- 10 μM, forskolin (cAMP signaling activator) 1-100 μM, A-8301 (TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor) 1-10 μM, and SC1 (Pluripotin) may be added at a concentration of 1-10 μM.
상기 배양액에는 소디움 부틸레이트/ 히스톤디아세틸라제 억제제 (Sodium butyrate/ histone deacetylase inhibitor; Nabu), ROCK의 선택적 억제제 (selective inhibitor of Rho-associated kinase (ROCK); Thiazovivin), LIF (Leukemia inhibitory factor), 및 에스트로겐 리셉터 애고니스트 (estrogen receptor agonist; β-estradiol)로 이루어진 그룹에서 선택되는 물질이 포함되지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 물질들은 저해물질로서 체세포로부터 심근세포로의 유도를 저해하는 것으로 나타났다 (도 1b).
The culture medium contains sodium butyrate / histone deacetylase inhibitor (Nabu), selective inhibitor of Rho-associated kinase (ROCK); Thiazovivin, LIF (Leukemia inhibitory factor), and Estrogen receptor agonist (β-estradiol) is characterized in that it does not contain a substance selected from the group consisting of. These substances have been shown to inhibit the induction of somatic cells into cardiomyocytes as inhibitors (FIG. 1B).
본 발명의 상기 배양액에는 PGE2 (Prostaglandin E2) 및 DMNT 억제제 (DNA methytrasnsferase inhibitor) 중 하나 이상이 더 포함되는 것이 바람직하다. 상기 물질을 추가하면 유도효율이 증가한다 (도 2c 및 도 2d).The culture solution of the present invention preferably further comprises one or more of PGE2 (Prostaglandin E2) and DMNT inhibitor (DNA methytrasnsferase inhibitor). Adding the material increases the induction efficiency (Figures 2c and 2d).
본 발명에서, "PGE2 (Prostaglandin E2)"은 전신의 장기에서 생리적 자극에 의해 생산되고, PG 내에서 가장 다채로운 생리약리작용을 하는 생리적 특성 조절물질을 의미한다 (Coleman R.A et al., Pharmacol. Rev. 46, 205-229 (1994,06)). In the present invention, "PGE2 (Prostaglandin E2)" means a physiological property modulator that is produced by physiological stimulation in the organs of the whole body and has the most physiological pharmacological action in PG (Coleman RA et al., Pharmacol. Rev. 46, 205-229 (1994,06).
본 발명에서 "DMNT 억제제"란 DMNT (DNA methyltransferase)를 억제하는 물질들을 의미한다(Bodo B et al., Cancer Res 65, 6305-6311 (2005.07.15)). 본 발명의 DMNT 억제제는 바람직하게는 RG108을 의미한다. 상기 RG108은 N-Phthalyl-L-tryptophan으로 표시된다. 그러나 상기 화합물 외에도 5-Aza (5-azacytidine)을 포함하는 모든 DMNT 억제제가 본 발명의 범주에 속할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.As used herein, the term "DMNT inhibitor" refers to substances which inhibit DNA methyltransferase (DMNT) (Bodo B et al., Cancer Res 65, 6305-6311 (2005.07.15)). DMNT inhibitors of the invention preferably mean RG108. RG108 is represented by N-Phthalyl-L-tryptophan. However, it will be apparent to those skilled in the art that all DMNT inhibitors including 5-Aza (5-azacytidine) in addition to the above compounds may fall within the scope of the present invention.
상기 저분자성 물질 DMNT 억제제 등은 시중에서 구입(Stemolecule™ Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA)하여 사용하거나 제조하여 사용할 수 있으며 상기 물질 처리에 의해 역분화 효율이 증가된다 (Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008).The low molecular weight DMNT inhibitor and the like can be purchased or used commercially (Stemolecule ™ Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA) and can be used to manufacture and increase the reverse differentiation efficiency by the treatment of the material (Cell Stem Cell , 3, 568-574, 2008).
상기 DMNT 억제제 등은 상기 배양액에 유효 농도로 포함되도록 한다. 배양액의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, PGE2는 1 ~ 10μＭ의 농도로 RG108는 0.1 ~ 10μＭ의 농도로 첨가될 수 있다.
The DMNT inhibitor, etc. are to be included in the culture medium in an effective concentration. Effective concentrations may be affected by factors well known in the art, such as the type of culture medium and culture method. Although not limited thereto, PGE2 may be added at a concentration of 1 to 10 μM and RG108 at a concentration of 0.1 to 10 μM.
본 발명의 심근세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포 (모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한 (matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 심근세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포이며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.
In inducing the cardiomyocytes of the present invention, the type of starting somatic cell (parent cell) is not particularly limited, and any somatic cell can be used. For example, mature somatic cells may be used in addition to somatic cells of the embryonic period. When the induced cardiomyocytes are used for the treatment of diseases, it is preferable to use somatic cells separated from the patient. For example, somatic cells involved in the disease or somatic cells involved in the disease treatment can be used. Preferably, the somatic cells are fibroblasts, and in the present invention, the fibroblasts include all fibroblasts derived from animals such as humans, mice, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, and dogs.
본 발명에서는 상기 체세포를 배양하는 단계는 심근세포로 분화시킬 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게 4일 ~ 28일 동안 배양할 수 있다. 상기 4일 이하에서는 심근세포의 자발적 수축을 확인할 수 없는 등 충분한 분화 유도가 이루어지지 않는다. 더욱 바람직하게는 14 ~ 28일 배양한다.
In the present invention, the step of culturing the somatic cells may be made without limitation as long as it can be differentiated into cardiomyocytes, but may preferably be cultured for 4 days to 28 days. Below 4 days, sufficient differentiation induction is not achieved, such as the inability to identify spontaneous contraction of cardiomyocytes. More preferably, it is cultured for 14 to 28 days.
본 발명의 방법은 혈청 대체물질 (Serum Replacement; SR)이 포함된 무혈청 배양액에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 배양액에 우태아혈청 (FBS) 및 혈청 대체물질 (SR)이 첨가된 배양액에서 4 ~ 8일 동안 배양한 후 혈청 대체물질 (SR)이 포함된 무혈청 배양액에서 배양하여 심근세포로의 유도 효율을 높일 수 있고, 혈청이 추가된 배지에서 배양한 경우의 발생하는 오염 등의 문제점을 완화할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 상기 FBS는 1 ~ 10 %의 농도로, SR은 4 ~ 8일 동안은 8 ~ 12%의 농도로, 그 이후는 18 ~ 22 % 농도로 첨가된다. 상기 범위 내에서 유도 효율을 최대화할 수 있다.
The method of the present invention is characterized in that it further comprises the step of culturing in a serum-free medium containing Serum Replacement (SR). Preferably, the culture medium is incubated for 4 to 8 days in a culture solution containing fetal bovine serum (FBS) and serum substitute (SR), and then cultured in a serum-free medium containing serum substitute (SR) to cardiomyocytes. Induction efficiency can be improved, and problems such as contamination caused when cultured in a medium in which serum is added can be alleviated. Although not limited thereto, the FBS is preferably added at a concentration of 1 to 10%, SR at a concentration of 8 to 12% for 4 to 8 days, and thereafter at a concentration of 18 to 22%. Induction efficiency can be maximized within the said range.
상기 체세포를 배양하는 배양액은 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지 배양액를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM에 10% FBS (Fetal bovine serum) + 10% Serum replacement (SR) + 1% ITS supplement (Insulin, transferrin, sodium selenite) + 1% nonessential amino acid +1% penicillin/streptomycin + ß-mercaptoethanol + 10 ng/ml FGF2 (Fibroblast growth factor) +10 μg/ml Ascobic acid 배지에서 배양하였다.
The culture medium for culturing the somatic cells includes all of the culture medium commonly used in the fibroblast culture in the art. The culture medium used for the culture generally contains a carbon source, a nitrogen source and a trace element component. In a specific embodiment of the present invention, 10% FBS (Fetal bovine serum) + 10% Serum replacement (SR) + 1% ITS supplement (Insulin, transferrin, sodium selenite) + 1% nonessential amino acid + 1% penicillin / streptomycin in DMEM + ß-mercaptoethanol + 10 ng / ml FGF2 (Fibroblast growth factor) + 10 μg / ml Ascobic acid medium.
본 발명에서 용어 "심근세포"는 장래에 기능적인 심근세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 또는 태아형 심근세포, 성체 심근세포의 모든 분화 단계의 세포를 제한 없이 포함하며, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의하여 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 심근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄 (MHC/MLC), α-엑티닌 (α-actinin), 트로포닌 I (cTn I), ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c 등을 들 수 있다. 또는, 심근 전구 세포 또는 심근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커(예, 미오신 중쇄/경쇄,α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP,GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 체세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 다능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표로 활용할 수 있다.
The term "cardiomyocytes" in the present invention includes without limitation, myocardial progenitor cells, or fetal cardiomyocytes, cells of all differentiation stages of adult cardiomyocytes, having the ability to be functional cardiomyocytes in the future, as described below. By at least one, preferably a plurality of methods means at least one, preferably a cell which can be identified by a plurality of markers or criteria. Expression of various cardiomyocyte specific markers can be detected by known biochemical or immunochemical methods, and such methods can be used without limitation. In this method, marker specific polyclonal antibodies or monoclonal antibodies that bind to myocardial progenitor cells or cardiomyocytes can be used. Antibodies that target individual specific markers can be used commercially or without limitation, those prepared by known methods. Examples of markers specific for myocardial progenitor or cardiomyocytes are myosin heavy / light chain (MHC / MLC), α-actinin, troponin I (cTn I), ANP, GATA4, Nkx2.5 and MEF -2c, and the like. Alternatively, the expression of myocardial progenitor or cardiomyocyte specific markers is not limited to specific methods, but amplifies mRNA encoding any marker protein, which is reverse transcriptase mediated polymerase chain reaction (RT-PCR) or hybridization assay, It can be confirmed by molecular biological methods commonly used for detection and interpretation. Nucleic acid sequences encoding proteins specific for myocardial progenitor cells or cardiomyocytes (e.g. myosin heavy chain / light chain, α-actinine, troponin I, ANP, GATA4, Nkx2.5 and MEF-2c) are already known. Obtained from public databases such as GenBank, the marker specific sequences required for use as primers or probes can be readily determined. In addition, to confirm the differentiation of somatic cells into cardiomyocytes, physiological criteria may additionally be used. In other words, cells derived from pluripotent cells may be used as useful indicators, such as having independent pulsatile rhythms, expressing various ion channels, and responding to electrophysiological stimuli.
본 발명에 의한 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GSK (glycogen synthease kinase) 억제제, 칼슘채널 애고니스트 (calcium channel agonist), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor), 및 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 물질이 포함되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 심근세포를 유도하는 심근세포 역분화 유도용 배지 조성물을 제공한다. 상기 물질들이 심근세포를 유도하는 역할을 하는 심근세포 유도 물질이라는 것은 상술한 바와 같다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a glycosyl synthease kinase (GSK) inhibitor, a calcium channel agonist, a cAMP signaling activator, a TGF-β type I receptor inhibitor (TGF-β) inducing cardiomyocytes from somatic cells, characterized in that it comprises one or more substances selected from the group consisting of dual inhibitors of type I receptor inhibitors (EKR1) and extracellular regulated kinase (EKR1) and Ras-GTPase activating protein (Ras-GAP). It provides a medium composition for inducing cardiomyocyte dedifferentiation. As described above, the substances are cardiomyocyte inducing substances that play a role in inducing cardiomyocytes.
상기 조성물에는 GSK (glycogen synthease kinase) 억제제, TGF-β 타입 I 리셉터 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor), 및 EKR1 (extracellular regulated kinase)과 Ras-GAP (Ras-GTPase activating protein)의 이중억제제가 포함되는 것을 특징으로 한다. 상기 3종의 심근세포 유도 물질이 포함된 배양액으로 심근세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 5종의 심근세포 유도 물질을 이용하면 25 ~ 40 %의 더욱 높은 수율로 심근세포를 유도할 수 있다. The composition includes dual inhibitors of glycogen synthease kinase (GSK) inhibitors, TGF-β type I receptor inhibitors (TGF-β type I receptor inhibitors), and extracellular regulated kinase (EKR1) and Ras-GTPase activating protein (Ras-GAP). Characterized in that it is included. Cardiomyocytes can be efficiently induced with a culture medium containing the three cardiomyocyte inducing substances. More preferably, by using the five cardiomyocyte inducing substances, the cardiomyocytes can be induced at a higher yield of 25 to 40%.
상기 조성물에는 PGE2 (Prostaglandin E2) 및 DMNT 억제제 (DNA methytrasnsferase inhibitor) 중 하나 이상이 더 포함되는 것을 특징으로 한다. 상술한 바와 같이, 상기 물질을 추가하면 유도효율이 더욱 증가한다.The composition is characterized in that it further comprises one or more of PGE2 (Prostaglandin E2) and DMNT inhibitor (DNA methytrasnsferase inhibitor). As mentioned above, the addition of the material further increases the induction efficiency.
상기 심근세포 유도 물질의 농도는 체세포를 심근세포로 유도할 수 있는 농도이면 특별히 제한이 없으며, 예를 들어 chir99021 (GSK-3 억제제) 1~10μM, (±) BayK 8644 (calcium channel agonist) 1~10μM, 포르스콜린 (Forskolin; cAMP signaling activator) 1~100μM, A-8301 (TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor) 1~10μM, SC1 (Pluripotin) 1~10μM, PGE2 1 ~ 10μＭ, 및 RG108 0.1 ~ 10μＭ의 농도로 첨가될 수 있다.
The concentration of the cardiomyocyte-inducing substance is not particularly limited as long as it is a concentration capable of inducing somatic cells into cardiomyocytes. For example, chir99021 (GSK-3 inhibitor) 1-10 μM, (±) BayK 8644 (calcium channel agonist) 1- 10 μM, Forskolin (cAMP signaling activator) 1-100 μM, A-8301 (TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor) 1-10 μM, SC1 (Pluripotin) 1-10 μM, PGE2 1-10 μM, and RG108 0.1 May be added at a concentration of ˜10 μΜ.
상기 조성물에는 혈청 대체물질 (Serum Replacement; SR)이 더 포함되는 것을 특징으로 한다. SR 추가로 심근세포로의 유도 효율을 높일 수 있고, 혈청이 추가된 배지에서 배양한 경우의 발생하는 오염 등의 문제점을 완화할 수 있다. 상기 SR의 농도는 체세포를 심근세포로 유도할 수 있는 농도이면 특별히 제한이 없으며, 예를 들어 8 ~ 22 %의 농도로 첨가될 수 있다.
The composition is characterized in that it further comprises a serum replacement (Serum Replacement; SR). The addition of SR can increase the efficiency of induction into cardiomyocytes, and can alleviate problems such as contamination caused when cultured in a medium in which serum is added. The concentration of SR is not particularly limited as long as it is a concentration capable of inducing somatic cells into cardiomyocytes, and may be added, for example, at a concentration of 8 to 22%.
상기 본 발명에 의해 생산된 심근세포는 심장 관련 질환을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Cardiomyocytes produced by the present invention can be usefully used as a cell composition for cell replacement therapy for treating heart-related diseases.
상술한 바와 같이, 본 발명은 마우스 섬유아세포를 유전자 도입 없이 ‘저분자성 물질만을 이용한 유도 심근세포 (Chemically Induced Cardiac Myocyte ; ciCM)’로 리프로그래밍 (Reprogramming)하는 방법에 관한 것이다. 기존의 발명 및 연구 보고들은 유도 심근세포 (Induced Cardiac Myocyte ; iCM)를 만들기 위해 3개의 유전자 (Mef2C, Gata4, Tbx5) 또는 역분화를 유도하는 4개 유전자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)와 한종의 저분자성 물질을 체세포에 처리함으로써 체세포를 리프로그래밍 하였다. As described above, the present invention relates to a method for reprogramming mouse fibroblasts into 'Chemically Induced Cardiac Myocytes (ciCM) using only low molecular weight substances' without introducing a gene. Existing inventions and studies have reported three genes (Mef2C, Gata4, Tbx5) or four genes that induce differentiation (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4) to make induced cardiomyocytes (iCM). And somatic cells were reprogrammed by treating one kind of low molecular weight material with somatic cells.
이와 달리 본 발명자들은 다양한 역분화 유도 물질 및 심근세포 분화 유도 물질 등 저분자성 물질 중에서 '역분화 중간단계'를 통하여 심근세포를 유도할 것으로 예상되는 12종의 저분자성 물질은 선별하였으며, 선별된 저분자성 물질의 라이브러리를 통하여 직접적 리프로그래밍을 시도하였다. 그 결과 12종의 저분자성 물질 처리를 통하여 심근세포와 유사한 자발적 수축 (Spontaneous contraction) 현상을 관찰하였으며, 또한 심근특이적 유전자인 cTnT (cardiac troponinT)의 발현 역시 관찰되었다. 상기 12종의 저분자성 물질 중에서 심근세포를 유도하는 물질 내지 심근세포 유도 필수 물질과 이를 저해하는 물질을 밝혀내었다. 본 발명에 의한 심근세포 유도 필수 물질을 이용하여 유도된 세포는 구조적 특성 및 유전자의 발현 등에서 심근세포와 매우 유사하다는 것을 확인하였다. 또한 이러한 방법으로 유사 심근세포를 유도하였을 때 매우 높은 수율로 리프로그래밍 됨을 확인하였다. 이러한 결과는 심근세포 유도 저분자성 물질을 포함한 배양액에서 세포를 배양하는 간단한 방법을 통하여 체세포를 유도 심근세포로 리프로그래밍 하는 기법을 보여줌으로써, 유전자 조작 없는 자가세포를 이용한 세포치료의 가능성을 열었다 하겠다. 따라서, 본 발명에 의하면 iPS로의 역분화 과정을 생략하여 심근세포 제조에 소요되는 시간을 단축할 수 있을 뿐만 아니라 유전적 변이를 일으킬 소지가 있는 유전자 도입이 없이 안전하고 높은 효율로 유도 심근세포를 유도할 수 있어, 유전자 조작 없는 자가세포를 이용한 세포치료제 개발에 매우 유용한 발명이라 할 것이다.In contrast, the present inventors selected 12 low-molecular substances that are expected to induce cardiomyocytes through 'intermediate re-differentiation' among various low-molecular substances such as induction of differentiation and cardiomyocyte differentiation. Direct reprogramming was attempted through a library of sexual materials. As a result, spontaneous contraction phenomenon similar to cardiomyocytes was observed through treatment of 12 low molecular materials, and the expression of cardiac specific gene cTnT (cardiac troponinT) was also observed. Among 12 kinds of low molecular materials, the cardiomyocyte-inducing substance to cardiomyocyte-derived essential substance and the inhibitory substance were identified. It was confirmed that cells derived from the cardiomyocyte-derived essential substances according to the present invention are very similar to cardiomyocytes in terms of structural characteristics and gene expression. In addition, it was confirmed that induction of similar cardiomyocytes was reprogrammed with very high yield. These results demonstrate the technique of reprogramming somatic cells into induced cardiomyocytes through a simple method of culturing cells in a culture medium containing cardiomyocyte-induced low molecular weight substances, thus opening up the possibility of cell therapy using autologous cells without genetic modification. Therefore, according to the present invention, it is possible to shorten the time required for the production of cardiomyocytes by omitting the dedifferentiation process to iPS and to induce induced cardiomyocytes safely and with high efficiency without introducing genes that may cause genetic mutations. It can be said that the invention is very useful for the development of cell therapy using autologous cells without genetic modification.
나아가 '역분화 중간단계’를 통하여 유도된 세포는 완전히 분화되지 않은 상태의 심근세포의 특성도 보이며 이런 미분화 심근세포는 완전 분화된 심근세포에 비해 세포치료에 적합하다. 왜냐하면, 미분화 상태의 심근세포는 완전분화 상태의 심근세포에 비해 세포 성장 및 이식 후 손상된 장기 내로 착상 효율이 우수하다고 알려져 있기 때문이다. 이러한 관점에서 볼 때, 본 발명에 따른 ‘역분화 중간단계’유도를 통한 심근세포의 유도가 임상적용 있어서 유리하다 할 것이다.Furthermore, the cells induced through the intermediate stage of dedifferentiation show the characteristics of cardiomyocytes that are not fully differentiated, and these undifferentiated cardiomyocytes are more suitable for cell therapy than fully differentiated cardiomyocytes. This is because undifferentiated cardiomyocytes are known to have superior implantation efficiency into damaged organs after cell growth and transplantation compared to fully differentiated cardiomyocytes. From this point of view, the induction of cardiomyocytes through the induction of 'dedifferentiation stage' according to the present invention will be advantageous in clinical applications.
이러한 결과를 종합하여 보았을 때에 본 발명은 세포치료제 개발의 새로운 패러다임인‘직접적 리프로그래밍’을 선도하는 방법론을 제시함과 동시에 더욱 안전한 세포치료제 개발에 한 발 더 다가서는 전기를 제공해 줄 것이다.
Taken together, the present invention will present a methodology leading to a new paradigm of cell therapy development, 'direct reprogramming,' and at the same time, will provide a step closer to developing safer cell therapy.
도 1a는 본 발명에 의한 저분자성 물질을 이용한 ciCM 유도에 사용된 배지 조건 및 처리방법을 보여주는 도면으로, 최초 6일까지 1~10%의 FBS가 포함된 배지에서 키우다가, 6일 이후 혈청 대체물질 (Serum replacement)만을 이용한 배지에서 키움으로써 리프로그래밍 된 세포만을 선별적으로 자랄 수 있도록 도와주는 배지를 이용함.
도 1b는 도 1a의 배양액 조건에 12개의 저분자성 물질 라이브러리와 상기 라이브러리에서 하나의 저분자성 물질을 제거했을 경우를 비교하여 cTnT positive 세포의 유도 효율의 변화를 FACS를 통하여 확인한 결과를 나타내는 도면임.
도 1c는 도 1b의 그래프의 대표 FACS 데이터를 나타내는 도면임.
도 1d ~ 도 1f는 도 1b에서 효율을 저해시키는 물질을 제거한 조합에서 추가적으로 효율 저해 물질은 제거하기 위해, 하나의 물질씩 제거한 조합으로 세포배양 하였을 경우의 cTnT positive 세포 유도 효율을 FACS를 통하여 확인한 결과를 나타내는 도면임.
도 2a 및 도 2b는 도 1a ~ 도 1f 실험에서 선별된 5종의 저분자성 물질에서 하나씩 제거한 조합을 이용하였을 경우, cTnT positive 세포의 유도 효율을 FACS를 통하여 확인한 결과를 나타내는 도면으로, chir99021, 포르스콜린(Forskolin), A-8301, 또는 SC1을 제거하였을 경우 cTnT positive 세포의 유도가 현저히 감소함이 나타남.
도 2c 및 도 2d는 추가적으로 효율을 증가시킬 수 있는 저분자성 물질을 선별하기 위하여, 5종의 저분자성 물질 조합에 탈락된 저분자성 물질 7종 및 후성유전학적 조절 물질을 첨가하였을 경우 cTnT positive 세포의 유도 효율의 변화를 FACS를 통하여 확인한 결과를 나타내는 도면으로, PGE2(Prostaglandin E2), RG108 및 5-azacytidine에 의하여 효율이 증대되는 것으로 나타남.
도 2e 및 도 2f는 위의 5종의 저분자성 물질을 처리한 후 3주 후의 심근특이적 유전자의 발현을 면역형광표지법 (Immunocytochemistry) 및 웨스턴 블럿 (western blot)을 통하여 확인할 결과를 나타내는 도면으로, 면역형광표지법 (Immunocytochemistry)을 통하여 근육 특이적 근절 구조 (sarcomeric structure)를 확인할 수 있었음.
도 3a 및 도 3b는 5종의 심근 유도 저분자성 물질을 다른 신호전달체계 특이적 저분자성 물질로 대체하였을 경우의 cTnT positive 세포의 유도 효율의 변화를 FACS를 통하여 확인한 결과를 나타내는 도면임.
도 4는 도 3의 처리를 시행한 후 면역형광표지법 (Immunocytochemistry)를 통하여 심근 특이적 유전자인 cTnT, α-actinin, αMHC의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도면임.
도 5는 본 발명에 의한 심근세포 유도 방법을 개략적으로 나타낸 개념도로서, 유전자 도입 없이 역분화 유도 저분자성 물질과 심근세포 유도 저분자성 물질을 처리하여 줌으로써 유도 심근세포 (induced Cardiac Myocyte :iCM)로 유도할 수 있음을 보여줌. Figure 1a is a diagram showing the media conditions and treatment method used for ciCM induction using a low molecular weight material according to the present invention, grow in a medium containing 1 ~ 10% FBS until the first 6 days, 6 days after serum replacement Growing in a medium using only serum replacement, use a medium to help selectively grow only reprogrammed cells.
Figure 1b is a diagram showing the result of confirming the change in the induction efficiency of cTnT positive cells by FACS comparing the case of removing the 12 low molecular material library and one low molecular material from the library in the culture conditions of Figure 1a.
FIG. 1C is a diagram showing representative FACS data of the graph of FIG. 1B. FIG.
Figures 1d to 1f is a result of confirming the cTnT positive cell induction efficiency when the cell culture in a combination removed by one material to remove the efficiency inhibitory material in addition to remove the efficiency-inhibiting substance in Figure 1b through FACS It is a drawing.
Figures 2a and 2b is a diagram showing the results of confirming the induction efficiency of cTnT positive cells through FACS when using a combination removed one by one from the five kinds of low-molecular substances selected in the experiments 1a to 1f, chir99021, por Removal of Forskolin, A-8301, or SC1 significantly reduced the induction of cTnT positive cells.
FIG. 2C and FIG. 2D show cTnT positive cells when seven low molecular weight substances and epigenetic modulators were added to five low molecular weight combinations in order to select low molecular weight materials that may further increase efficiency. Figure showing the results of confirming the change in induction efficiency through FACS, the efficiency is shown to be increased by PGE2 (Prostaglandin E2), RG108 and 5-azacytidine.
FIG. 2E and FIG. 2F show the results of confirming the expression of myocardial specific genes after 3 weeks after treatment of the above five low molecular weight substances through immunocytochemistry and western blot. Immunocytochemistry confirmed the muscle specific sarcomeric structure.
3A and 3B show the results of confirming the change in the induction efficiency of cTnT positive cells by FACS when the five myocardial induced low molecular weight substances were replaced with other signaling system specific low molecular weight substances.
4 is a view showing the results of confirming the expression of myocardial specific genes cTnT, α-actinin, αMHC through immunofluorescence labeling (Immunocytochemistry) after the treatment of FIG.
5 is a conceptual diagram schematically showing the method of inducing cardiomyocytes according to the present invention, and induced by induced cardiomyocytes (induced Cardiac Myocyte: iCM) by treating dedifferentiation-induced low molecular material and cardiomyocyte-induced low molecular material without gene introduction. Show that you can.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for describing the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예Example 1. One. 저분자성Low molecular weight 물질 라이브러리에서 In the material library 심근세포Myocardial cell 유도 물질 선별 Inducer Screening
본 발명에서는 심근세포를 유도할 저분자성 물질 라이브러리를 선별하였다. 이를 위해, 현재까지 역분화 유도 및 만능성 유지에 효과가 있다고 알려진 물질 및 심근세포 분화를 촉진하는 물질 등을 포함하여 12개의 저분자성 물질 및 성장인자를 선별하였다. 이 라이브러리에는 만능줄기세포로의 역분화 유도 물질 (Nabu ; Sodium butyrate/ histone deacetylase inhibitor (0.1~1mM), Bix ; bix 01294/ G9a histone methyltransferase (0.2~1μM), Chir 99021 ; GSK-3 inhibitor (1~10μM), Thiazovivin ; selective inhibitor of Rho-associated kinase (ROCK) (1~10μM), (±) BayK 8644 : calcium channel agonist (1~10μM), A-8301 ; TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor (1~10μM)), 만능성 유지 물질 (LIF ; Leukemia inhibitory factor (1000~10000 Unit/ml), IQ-1 ; Wnt/β-catenin signaling modulator (1~10μM), SC1 (Pluripotin) ; dual inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1) and Ras GTPase-activating protein (Ras-GAP) (1~10μM)), 심근세포 성장촉진 물질 (β-estradiol ; estrogen receptor agonist (0.1~10μM)) 및 생리적 특성 조절물질 (PGE2 ; prostaglandin E2/ calcium channel agonist (1~10μM), Forskolin ; cAMP/alcium channel agonist (1~100μM))등을 포함하여 구성하였다. In the present invention, a low molecular weight library for selecting cardiomyocytes was selected. To this end, 12 low-molecular substances and growth factors were selected, including substances known to be effective in inducing reverse differentiation and maintaining pluripotency and substances that promote cardiomyocyte differentiation. The library contains inducers of differentiation into pluripotent stem cells (Nabu; Sodium butyrate / histone deacetylase inhibitor (0.1-1 mM), Bix; bix 01294 / G9a histone methyltransferase (0.2-1 μM), Chir 99021; GSK-3 inhibitor (1 ~ 10 μM), Thiazovivin; selective inhibitor of Rho-associated kinase (ROCK) (1-10 μM), (±) BayK 8644: calcium channel agonist (1-10 μM), A-8301; TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor (1-10 μM)), pluripotent maintenance substances (LIF; Leukemia inhibitory factor (1000-10000 Unit / ml), IQ-1; Wnt / β-catenin signaling modulator (1-10 μM), SC1 (Pluripotin); dual inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1) and Ras GTPase-activating protein (Ras-GAP) (1-10 μM), cardiomyocyte growth promoter (β-estradiol; estrogen receptor agonist (0.1-10 μM)) and physiological properties Regulators (PGE2; prostaglandin E2 / calcium channel agonist (1 ~ 10μM), Forskolin; cAMP / alcium channel agonist (1 ~ 100μM)) were included.
심근세포로의 리프로그래밍 가능성을 평가하기 위해 iPSC 유도에도 많이 사용되고 있는 MEF (mouse embryonic fibroblast ; 마우스 태아 섬유아세포)를 모세포로 하여, 12개의 저분자성 물질을 포함한 배양액에서 배양하였다. 심근세포 유도 배양액은 DMEM에 10% FBS (Fetal bovine serum) + 10% Serum replacement (SR) + 1% ITS supplement (Insulin, transferrin, sodium selenite) + 1% nonessential amino acid +1% penicillin/streptomycin + ß-mercaptoethanol + 10 ng/ml FGF2 (Fibroblast growth factor) +10 μg/ml Ascobic acid 이며 여기에 12종을 포함한 배양액을 48시간에 한 번씩 배양액을 바꾸어 주며 배양하였다. 6일 배양 후, 10% FBS/ 10% SR을 20% SR 조건으로 바꾸어서 추가적으로 1~2주 배양하였다 (도 1a). 구성된 저분자성 물질 라이브러리가 심근세포 유도에 효과가 있는지 확인하기 위해서 FACS (fluorescence-activated cell sorter ; 유세포 분석기)를 통하여 심근세포 특이적인 cTnT (Cardiac troponin T)의 발현을 분석함으로써 심근세포 유도 효율을 평가하였다. 그 결과 저분자성 물질을 처리하지 않은 군과는 다르게 2주간 12개의 저분자성 물질을 처리한 군에서는 약 0.2%의 세포가 cTnT positive한 것으로 확인되었다. To evaluate the possibility of reprogramming into cardiomyocytes, MEF (mouse embryonic fibroblast), which is widely used for iPSC induction, was used as a parent cell and cultured in a culture medium containing 12 low molecular materials. Cardiomyocyte-derived cultures were treated with 10% FBS (Fetal bovine serum) + 10% Serum replacement (SR) + 1% ITS supplement (Insulin, transferrin, sodium selenite) + 1% nonessential amino acid + 1% penicillin / streptomycin + ß -mercaptoethanol + 10 ng / ml FGF2 (Fibroblast growth factor) +10 μg / ml Ascobic acid and 12 cultures were cultured with changing the culture medium every 48 hours. After 6 days of incubation, 10% FBS / 10% SR was changed to 20% SR conditions and cultured for another 1-2 weeks (FIG. 1A). To determine whether the constructed low molecular weight library is effective for cardiomyocyte induction, the cardiomyocyte induction efficiency is evaluated by analyzing the expression of cardiomyocyte-specific cTnT (Cardiac troponin T) by fluorescence-activated cell sorter (FACS). It was. As a result, in the group treated with 12 low molecular weight substances for 2 weeks, about 0.2% of the cells were cTnT positive.
12개의 물질 중 cTnT의 발현을 유도하는데 필수적인 물질이 어떤 것인지 결정하기 위하여, 12종의 저분자성 물질 라이브러리에서 한가지 물질씩 제거하여 처리한 후 cTnT positive한 세포의 비율 변화를 관찰하였다 (도 1b). 12개의 저분자성 물질 라이브러리에서 4종의 물질 (LIF, NaBu, Thiazovivin, β-estradiol)을 각각 제거하였을 때, cTnT positive한 세포의 비율이 높아지는 것을 확인하였다. 하지만, Chir 99021을 제거하였을 경우, cTnT positive한 세포의 비율이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 1b). 또한 4종의 저해물질을 제거한 라이브러리(8종)를 이용하여 2주간 배양한 결과 cTnT positive한 세포의 비율이 약 20% 까지 증가하는 것을 확인하였다 (도 1c 및 도 1d). 이렇게 라이브러리에서 하나의 저분자성 물질을 제거하는 과정을 2차례 더 진행하여서 심근 유도 필수 물질을 선별하였다 (도 1d ~ 도 1f). 그 결과 5종의 저분자성 물질(Chir 99021, (±) BayK 8644, Forskolin, A-8301, SC1)들을 선별하였으며, 이 5종의 저분자성 물질만을 이용하여서도 MEF를 cTnT positive한 세포를 25~40% 정도의 수율로 유도할 수 있음을 확인하였다 (도 1e 및 도 1f).
In order to determine which of the 12 substances are essential for inducing the expression of cTnT, a change in the proportion of cTnT positive cells was observed after treatment by removing one substance from 12 kinds of low molecular materials libraries (FIG. 1B). When four substances (LIF, NaBu, Thiazovivin, and β-estradiol) were removed from twelve low molecular weight libraries, it was confirmed that the ratio of cTnT positive cells increased. However, when Chir 99021 was removed, it was confirmed that the proportion of cTnT positive cells was significantly reduced (FIG. 1B). In addition, as a result of culturing for two weeks using a library (8 species) from which the four inhibitors were removed, it was confirmed that the ratio of cTnT positive cells increased by about 20% (FIGS. 1C and 1D). Thus, the process of removing one low molecular weight substance from the library was performed two more times to select myocardial induction essential substances (FIGS. 1D to 1F). As a result, five kinds of low-molecular substances (Chir 99021, (±) BayK 8644, Forskolin, A-8301, SC1) were selected. It was confirmed that it can be induced with a yield of about 40% (Fig. 1e and 1f).
실시예Example 2. 5개의 2. 5 저분자성Low molecular weight 물질을 통한 유사 Similarity through matter 심근세포Myocardial cell 유도 Judo
위에서 선별된 5종의 후보물질이 심근유도에 중요한 물질인지를 검증하기 위해, 5종의 저분자성 물질 라이브러리에서 하나의 물질을 제거한 상태에서 배양한 후 cTnT의 발현에 어떤 영향을 주는지 확인하였다. 도 2a 및 도 2b에서의 결과처럼 5종의 물질을 모두 처리한 경우 약 25%의 수율로 cTnT positive한 세포가 유도된 데에 비해, chir 99021, 포르스콜린 (Forskolin), A-8301, SC1을 빼고 처리한 군에서는 10% 이하의 낮은 수율로 cTnT positive한 세포가 유도되었다. 하지만 (±) BayK 8644을 제거한 군에서는 상대적으로 높은 수율 (약 19%)로 cTnT positive한 세포가 유도되는 것으로 보아, (±) BayK 8644는 cTnT positive한 세포유도 효율을 증가시키기는 부수적인 역할을 수행하는 것으로 판단된다. In order to verify whether the five candidates selected above are important for myocardial induction, the effects of cTnT expression were examined after culturing with one substance removed from five low molecular weight libraries. As shown in FIGS. 2A and 2B, when treated with all five substances, cTnT positive cells were induced in a yield of about 25%, compared to chir 99021, Forskolin, A-8301, and SC1. The cTnT positive cells were induced with low yields of less than 10% in the groups treated with. However, in the group where (±) BayK 8644 was removed, cTnT positive cells were induced with a relatively high yield (about 19%). (±) BayK 8644 plays a side role in increasing cTnT positive cell induction efficiency. It is judged to perform.
추가적으로 위의 5종의 저분자성 물질 외에 cTnT positive한 세포유도 효율을 증가시킬 수 있는 물질을 선별하기 위해, 앞에서 탈락한 7종의 저분자성 물질과 역분화에 이용되는 후생유전학적 조절 저분자성 물질 (RG108 ; DNA methyltransferase (DMNT) inhibitor (0.1~10μM), 5-Aza ; 5-azacytidine/ DMNT inhibitor (1~10μM)), Valproic acid ; histone deacetylase 1 (HDAC1) inhibitor (1~10μM))을 추가적으로 선별한 후 cTnT positive한 세포 유도효율을 비교하였다. 도 2c 및 도 2d에서 보는 바와 같이 PGE2 (Prostaglandin E2)의 추가에 의해 유도효율이 증가하는 것을 확인하였다. 앞의 선별과정에서 탈락한 물질이 효율증가에 도움을 주는 이유는 탈락된 다른 물질에 의하여 저해되었던 PGE2 (Prostaglandin E2)의 효과가 5종의 필수 저분자성 물질 조성에서는 활성화 되어서 나타난 현상일 것이라고 유추된다. 또한 DMNT 억제제인 5-Aza와 RG108의 추가적인 처리에 의하여서도 효율이 증가하는 것을 보았을 때, iPSC의 역분화 과정과 마찬가지로 후생유전학적 조절이 리프로그래밍 과정에 관여하고 있으며, 이를 조절해 줌으로써 리프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있었다. 하지만 5-Aza의 처리군에서 세포성장의 억제가 관찰되었기 때문에, RG108의 처리가 심근세포 유도에 더욱 효율적일 것으로 판단된다.In addition to the above five low molecular weight substances, in order to select materials that can increase cTnT positive cell induction efficiency, the seven types of low molecular weight substances previously dropped and epigenetic control low molecular weight substances used for reverse differentiation ( RG108; DNA methyltransferase (DMNT) inhibitor (0.1-10 μM), 5-Aza; 5-azacytidine / DMNT inhibitor (1-10 μM)), Valproic acid; Histone deacetylase 1 (HDAC1) inhibitor (1 ~ 10μM)) was further selected and compared with cTnT positive cell induction efficiency. As shown in FIG. 2C and FIG. 2D, it was confirmed that the induction efficiency was increased by the addition of PGE2 (Prostaglandin E2). It is inferred that the material removed during the previous screening process helps to increase efficiency because the effect of PGE2 (Prostaglandin E2), which was inhibited by other dropped materials, was activated in the five essential low molecular weight compositions. . Also, when the efficiency was increased by the additional treatment of DMA inhibitor 5-Aza and RG108, epigenetic control is involved in the reprogramming process as well as the iPSC dedifferentiation process. It can be confirmed that it can increase. However, the inhibition of cell growth was observed in the 5-Aza treatment group. Therefore, the treatment of RG108 may be more effective in inducing cardiomyocytes.
5종의 저분자성 물질과 PGE2 및 RG108을 포함한 7종의 저분자성 물질의 처리를 통하여 심근세포와 유사한 세포가 유도되는지 확인하기 위하여, 3주간 7종의 저분자성 물질을 포함한 배지에서 배양한 후, 면역형광 표지법 (immunocyto- chemistry)을 통하여 심근세포 특이적 유전자인 α-actinin, αMHC (cardiac Myosin Heavy Chain)와 cTnT의 발현을 확인하였다 (도 2e). 또한, 저분자성 물질을 처리하지 않은 대조군과는 다르게 3주간 리프로그래밍한 세포에서는 3개의 심근 특이적 유전자의 발현이 확인되었으며, 3개의 유전자는 심근 세포의 세포내 미세구조의 특징인 근절구조 (sarcomeric structure)를 구성하며 배열되어 있었다. 또한 4주간에 걸쳐 유전자의 발현의 변화를 웨스턴 블럿 (western blot)을 통하여 관찰하여 본 결과, 2주 배양 후 α-actinin, αMHC, cTnT 뿐만 아니라 다른 심근 특이적 유전자 (Tropomysin, Nkx2_5, Mef2c, Tbx5, Gata4)의 발현 역시 확인되었다 (도 2f). 이러한 결과는 5종의 저분자성 물질 및 추가적인 저분자성 물질에 의하여 ciCM (chemically induced Cardiac Myocyte)로의 리프로그래밍이 가능함을 보여주었다.
After incubation in a medium containing 7 low molecular materials for 3 weeks to determine whether cardiomyocyte-like cells are induced by treatment of 5 low molecular materials and 7 low molecular materials including PGE2 and RG108. Expression of cardiomyocyte specific genes α-actinin, αMHC (cardiac Myosin Heavy Chain) and cTnT was confirmed by immunofluorescence labeling (immunocytochemistry) (FIG. 2E). In addition, the expression of three cardiomyocyte-specific genes was confirmed in the cells reprogrammed for three weeks, unlike the control group that did not treat the low molecular weight material, and the three genes were sarcomeric, a characteristic of the intracellular microstructure of cardiomyocytes. structure). In addition, we observed Western blot changes in the expression of genes over four weeks. After two weeks of culture, not only α-actinin, αMHC, cTnT but also other myocardial specific genes (Tropomysin, Nkx2_5, Mef2c, Tbx5) , Gata4) expression was also confirmed (Fig. 2f). These results showed that reprogramming into chemically induced Cardiac Myocytes (ciCM) is possible by the five low molecular weight materials and additional low molecular weight materials.
실시예Example 3. 5종의 3. 5 kinds 저분자성Low molecular weight 물질에 의한 특이적 신호전달체계 조절의 중요성 확인 Identify the importance of regulating specific signaling systems by substances
심근 유도 필수적인 5개의 저분자성 물질 (Chir 99021, (±) BayK 8644, Forskolin, A-8301, SC1)은 각각 특정 신호전달체계의 억제제 및 활성화 물질로 알려져 있다. 위의 물질은 각각 GSK-3 억제제 / WNT 시그널링 액티베이터 (GSK-3 inhibitor /WNT signaling activator; chir 99021), L-타입 특이 칼슘 채널 애고니스트 (L-type specific calcium channel agonist; (±) BayK 8644), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator; Forskolin), TGF-β 타입 I 리셉터 ALK5 억제제 (TGF-β type I receptor ALK5 kinase inhibitor; A-8301), ERK1 및 Ras-GAP의 이중 억제제 (dual inhibitior of ERK1 and Ras-GAP; SC1)로 작동하는 것으로 알려져 있으나, 저분자성 물질의 특성상 여러 신호 전달체계에도 동시에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 특정 신호전달체계를 조절할 수 있는 특이적 저분자성 물질로 위의 5종의 저분자성 물질을 대신하여 봄으로써, 심근유도 효과가 GSK-3, 칼슘 채널 (Calcium Channel), cAMP, TGF-β 타입 I 리셉터 (TGF-β type I receptor), ERK1 및 Ras-GAP 조절에 의하여 나타나는 현상인지 확인하였다. The five low molecular weight substances (Chir 99021, (±) BayK 8644, Forskolin, A-8301, SC1) that are essential for myocardial induction are known as inhibitors and activators of specific signaling systems, respectively. The above substances are GSK-3 inhibitor / WNT signaling activator (chir 99021), L-type specific calcium channel agonist (±) BayK 8644) , cAMP signaling activator (Forskolin), TGF-β type I receptor ALK5 inhibitor (A-8301), dual inhibitors of ERK1 and Ras-GAP Ras-GAP (SC1) is known to operate, but due to the nature of the low molecular weight material is known to affect several signal transmission systems at the same time. Therefore, the cardiac myocardial induction effect is GSK-3, Calcium Channel, cAMP, TGF-β type by replacing the above 5 kinds of low molecular materials with specific low molecular materials that can regulate specific signaling systems. It was confirmed whether the phenomenon is caused by the TGF-β type I receptor, ERK1 and Ras-GAP regulation.
도 2a 및 도 2b와 마찬가지로 한 가지의 저분자성 물질을 제거한 후, 1-AKP (1-azakenpaullon : GSK-3 inhibitor (1~10μM))), (-) BayK 8644 (L-type specific calcium channel agonist (1~10μM))), 8-br-cAMP (cAMP signaling activator (0.1~1mM)), SB432542 (TGF-β type I receptor inhibitor (1~10μM))등 물질을 처리하여 각각의 신호체계 조절을 보충하였다. SC1의 경우 다른 저분자성 물질과는 다르게 두 종의 신호전달체계 (ERK1과 Ras-GAP)을 저해하기 때문에 PD032591 (MEK/ERK inhibitor (1~10μM)))와 AA(Arachidonic acid; Non-specific Ras-GAP inhibitor (0.1~1mM))의 조합을 통하여 효과를 비교하였다. 2A and 2B, after removing one low molecular weight material, 1-AKP (1-azakenpaullon: GSK-3 inhibitor (1-10μM))), (-) BayK 8644 (L-type specific calcium channel agonist (1 ~ 10μM))), 8-br-cAMP (cAMP signaling activator (0.1 ~ 1mM)), SB432542 (TGF-β type I receptor inhibitor (1 ~ 10μM)), etc. Supplemented. SC1, unlike other low-molecular substances, inhibits two signaling systems (ERK1 and Ras-GAP), so PD032591 (MEK / ERK inhibitor (1-10 μM)) and AA (Arachidonic acid; Non-specific Ras) -GAP inhibitor (0.1 ~ 1mM)) was used to compare the effects.
도 3a 및 도 3b에서 보는 바와 같이 각각의 저분자성 물질에서 하나를 뺀 상태에서는 cTnT positive 세포의 유도가 현저하게 감소되지만 1-AKP, (-) BayK 8644, 8-br-cAMP, SB432542를 첨가하여 줌으로써 Chir 99021, (±) BayK 8644, 포르스콜린(forskolin), A-8301에 제거에 의한 효율감소가 모두 보상될 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 ciCM 유도가 GSK-3, Calcium Channel, cAMP 및 TGF-β type I receptor의 신호전달체계를 조절함으로써 나타나는 현상임을 검증한 것이라 하겠다.
As shown in FIGS. 3A and 3B, the induction of cTnT positive cells is significantly reduced in each of the low molecular weight substances, but 1-AKP, (-) BayK 8644, 8-br-cAMP, and SB432542 are added. It was confirmed that the reduction in efficiency due to the removal of Chir 99021, (±) BayK 8644, forskolin, and A-8301 could all be compensated by the addition. These results confirm that ciCM induction is a phenomenon that occurs by regulating signaling system of GSK-3, Calcium Channel, cAMP and TGF-β type I receptor.
실시예Example 4. 5종의 4. 5 kinds 저분자성Low molecular weight 물질에 의한 특이적 신호전달체계 조절의 중요성 검증 Verification of the importance of regulating specific signaling system by substance
실시예 3에서 수행한 각각의 신호전달체계 조절의 중요성을 면역형광표지법 (immunocytochemistry)을 통하여 심근세포 특이적 유전자인 α-actinin, αMHC (cardiac MHC)와 cTnT의 발현을 추가적으로 확인하였다 (도 4). 형광표지법을 통한 실험에서도 역시 실시예 3과 유사한 결과가 나타났다. 하지만, SC1의 제거를 통하여 감소한 효율은 PD032591 및 AA의 조합을 통하여서 회복되지 못하였다. 이러한 현상은 아마도 AA의 효과가 다른 저분자성 물질에 비하여 Ras-GAP 세포신호 특이적으로 작동하는 물질이 아니기 때문에 나타나는 현상이 아닐까 유추된다. 전체적으로 볼 때, Chir 99021, (±) BayK 8644, 포르스콜린 (Forskolin), A-8301에 의한 심근세포 유도는 각각 GSK-3, calcium channel, cAMP, TGF-β type I receptor 신호체계의 특이적 조절에 의하여 나타나는 현상이라고 판단된다.
The importance of the regulation of each signaling system performed in Example 3 was further confirmed by the expression of cardiomyocyte-specific genes α-actinin, αMHC (cardiac MHC) and cTnT through immunofluorescence labeling (Fig. 4). . Experiments with fluorescence labeling also showed similar results as in Example 3. However, the efficiency reduced through the removal of SC1 was not recovered through the combination of PD032591 and AA. This may be inferred because the effect of AA is probably because it is not a Ras-GAP cell signal-specific substance compared to other low molecular weight substances. Overall, cardiomyocyte induction by Chir 99021, (±) BayK 8644, Forskolin, and A-8301 was specific for GSK-3, calcium channel, cAMP, and TGF-β type I receptor signaling systems, respectively. It is judged that it is a phenomenon which appears by adjustment.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Although specific portions of the present invention have been described in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific embodiments are merely examples of preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereto. It is therefore intended that the scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.
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