KR20130035325A - 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 피부 외용제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유함으로써 피부 노화 방지 효과, 피부 보습력 개선 효과, 항염 효과, 여드름 및 피부 트러블 개선 효과, 미백 효과, 아토피성 피부 개선 효과 등 전반적인 피부 상태 개선 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 피부 외용제 조성물{External composition for skin containing saponin derived from the root of Camellia sinensis}
본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유함으로써 피부 노화 방지 효과, 피부 주름 감소 효과, 피부 탄력 증진 효과, 피부 보습력 개선 효과, 항염 효과, 여드름 및 피부 트러블 개선 효과, 미백 효과 및 아토피 증상의 개선 효과 등 전반적인 피부 상태 개선 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.
노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유 라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 노화가 진행되거나 자외선에 의해서, 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는, 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시제나제-2(Cox-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산호 종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부 기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행하지고 있는 것이 현실이다.
사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드와 빌리루빈 등 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.
이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 가지 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.
신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.
이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.
오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 과색소 침착에 대한 치료 및 미용상 문제를 해결하고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.
이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.
피부 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은, 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리 및 화학적 자극인자)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 그 기능을 유지할 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(stratim corneum, horney layer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질 세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다(J. Invest. Dermatol. 1983; 80: 44~49). 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적은 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 '표피 세포의 분화' 또는 '각화(keratinization)'라고 부른다. 각화과정 중의 각질형성세포는 천연보습인자(natural moisturizing factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여, 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다.
그러나, 이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목욕 등의 생활 습관적 요인, 건조한 대기, 오염물질 등의 환경적인 요인 및 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제적으로 현대에 들어서 더욱 늘어난 여러 요인들로 인해 최근에는 건조피부증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 사람들이 점점 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 적절한 피부수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분 손실을 방지하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유능력이 있는 여러 종류의 보습제(moisturizer)가 개발되어 주로 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.
그러나, 생활환경 중에 인간에 대한 위해 요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나면서, 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)가 늦어지고, 각질형성세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로써, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는 상태, 즉 피부장벽기능이 와해된 상태의 피부를 갖게 되는 경우가 증가하는 추세에 있다.
이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피 및 건선 등의 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 이러한 제 질환들은 자체로 수분 보유 기능만을 갖는 통상적인 보습제 만으로는 그 증상을 약간 완화시킬 수는 있으나, 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이다.
일반적으로 두피 및 얼굴을 포함한 피부에서 피지는 피부의 보습 유지나 미생물의 침입을 막는 역할을 담당하지만, 피지가 과잉으로 분비되면 탈모가 촉진되고 여드름이 악화되며 여드름에 의한 모공 확대가 촉진되고 지루성 피부염이 발생하는 등 여러 가지 질환이 유발된다.
이러한 피지의 과분비는 여러 원인에 의해서 발생하는데 그 중에서도 가장 중요한 것은 피지선의 활성에 있어 피지 분비를 촉진하는데 관여하는 호르몬 가운데 하나인 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone: DHT)의 양에 의해서 피지선 세포가 활성화되어 피지가 과분비되는 것이다. 즉, 탈모에 있어서는 세포내에서 테스토스테론(testosterone: T)이 5-알파-리덕타아제 타입 2(5-α-reductase type 2)에 의해서 남성 호르몬 중에 하나인 디하이드로테스토스테론으로 전환됨과 동시에 세포질 내에 있는 수용체 단백질(receptor)과 결합하여 액내로 들어가 탈모를 유발하지만 피부나 피지선에서는 테스토스테론이 5-알파-리덕타아제 타입 1(5-α-reductase type 1)에 의해서 디하이드로테스토스테론으로 전환되어 피지선 세포를 활성화하여 분화가 촉진됨으로써 피지선내의 피지(sebum)를 과분비하여 여드름을 유발하게 된다(J. Invest Dermatol 105:209-214 Diane etc.).
단순한 피지의 과분비외에 발생되는 피부 트러블인 여드름, 탈모 등은 피부의 미세한 염증 반응에 의해서 더욱 악화된다. 여드름의 발생 과정을 살펴보면 과도한 피지가 모낭에 축적되어서 여드름균이 활성화되고 염증이 유발된다.
그러나, 이와 같이 피부에 안전한 천연 소재로서 피지 분비를 근본적인 원인을 통해서 감소시키고, 동시에 염증작용을 완화해 주는 원료는 많지 않은 실정이다.
아토피성 피부염의 증상은 피부 발적, 피부 부종, 물집, 궤양과 심한 가려움을 동반한다. 치료하지 않으면 피부는 피부 반응을 촉진시키는 물질에 계속 노출되어 접촉 피부염이 오랫동안(만성) 지속되는 상태가 될 수 있다. 만성 접촉 피부염은 피부가 두꺼워지고 잘 벗겨지며 건조해지면서 색이 변하고 모발의 소실까지 생긴다.
아토피성 피부염은 상당히 많은 사람들이 앓고 있는데 전 인구의 0.5~1%, 어린이의 경우 5~10%가 고통을 받고 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2~6개월이며, 특히 1세 미만에서 가장 많이 나타나고 85%가 만 다섯 살 안에 나타난다. 보통 어릴 때 잠시 앓는 병이라고 알려져 있으나 환자의 50%는 두 돌 이내에 없어지나 25%는 청소년기까지 가며, 나머지 25%는 성인이 되어도 없어지지 않고 계속된다.
이에, 최근 아토피성 피부에 자극 없이 안심하고 사용할 수 있는 인체 세정제, 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너 등의 피부 외용제 조성물의 수요가 증가하고 있으며, 이와 더불어 아토피성 피부의 상태를 개선하는 항소양 또는 항염 효과를 가진 제품의 다양한 연구가 활발히 진행되고 있다.
녹차는 차나무(Camellia sinensis)의 잎을 사용하는 것으로, 의학적 음료 및 건강 음료로서 소비되고 있으며, 녹차의 의학적인 효과는 주로 녹차의 플라보노이드계 성분에 기인한 것이다. 녹차 잎에서 추출한 다수의 트리테르페노이드 사포닌은 고미질(bitter principle)로서 보고되어 있으며, 트리테르페노이드 사포닌은 녹차의 다른 부분, 즉 씨, 꽃봉오리, 뿌리 등에서도 추출가능하다.
서로 다른 식물 종으로부터 유래한 트리테르펜 사포닌의 살진균, 항바이러스, 항돌연변이, 살정자 또는 피임을 포함한 약물학적 및 생물학적 특성이 연구되어 왔으며 (Hostettmann et al., 1995), 쿠쿠르비타세 (Cucurbitaceae) 과의 한의약용 식물로부터 유래한 트리테르펜 사포닌의 항종양 활성 (Kong et al ., 1993), 원구앤구오의 겉껍질, 잎 또는 가지, 줄기 및 또는 과실-줄기, 뿌리, 종자의 껍질 및 수피로부터의 트리테르페노이드 사포닌을 포함하는 종양 성장 억제 조성물에 대해서 알려진 바 있으나, 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 하는 조성물의 전반적 피부상태 개선 효과에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 차나무 뿌리 유래 트리테르페노이드 사포닌이 항노화, 피부 주름 개선, 미백, 보습 개선 효과뿐만 아니라 여드름 및 피부 트러블, 아토피 증상의 개선 효과도 제공할 수 있으며 피부 혈색 개선의 효과 및 슬리밍 효과도 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 차나무 뿌리 유래 트리테르페노이드 사포닌을 함유하여 피부의 전반적인 상태를 개선시킬 수 있는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 항노화용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 보습용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 여드름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 혈색 및 피부톤 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 모공 축소용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 아토피성 피부 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 차나무 뿌리 유래 사포닌 함유함으로써 항노화, 피부 주름 개선 효과, 피부 미백 효과, 피부 보습 및 아토피 피부 개선 효과, 여드름 및 피부 트러블 개선 효과 및 피부 혈색 개선 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 차나무 (Camellia sinensis) 뿌리 유래 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유한다.
본 발명에서 사용되는 사포닌은 차나무 뿌리 유래의 10종류의 트리테르페노이드 사포닌이며, 본 발명에서는 이를 각각 '차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 내지 R10'으로 지칭한다. 이들 차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 내지 R10은 하기 화학식 1 내지 10의 구조를 가진다.
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본 발명의 조성물은 상기 사포닌을 조성물 총 중량에 대하여 0.1~ 50중량%의 양으로 함유하는 것이 바람직하다. 이는 상기 유효성분의 함량이 0.1중량% 미만이면 상기 성분에 의한 효능, 효과가 미약하고, 50 중량%를 초과하면 피부 안전성 또는 제형상의 문제가 있기 때문이다.
본 발명의 조성물은 항노화용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 탄력을 증진시키고 주름을 개선시키는 효과가 뛰어나다.
본 발명의 조성물은 보습용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 장벽 기능을 강화시키고 피부 각질형성세포의 분화를 유도시킬 수 있다. 따라서 표피 분화의 불완전함으로 생기는 피부건조증, 아토피 피부염, 접촉성 피부염 또는 건선 등을 예방 또는 개선하는 피부 외용제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 여드름 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 항균 효과, 특히 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 우수하며, 또한 항염 효과를 제공한다.
본 발명의 조성물은 혈색 및 피부톤 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부에 적용 시 모세혈관을 확장시키고 혈액순환을 촉진시킴으로써 피부에 영양분을 원활하게 공급하고 피부 노화를 억제시켜 혈색 및 피부톤 개선 효과가 탁월하다.
본 발명의 조성물은 모공 축소, 피지 조절 및 피부 트러블 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부에 적용 시 과잉으로 분비되는 피지를 억제하고, 활성 산소 제거와 콜라겐 합성을 촉진하여 모공을 축소시키며, 염증 인자의 발현 감소로 피부 트러블을 억제하는 효과가 탁월하다. 또한, 우수한 항산화력으로 인해 피부 자극의 생성을 방어할 수 있다.
본 발명의 조성물은 아토피성 피부 개선용 조성물로 사용될 수 있으며, 이는 가려움을 유발시키는 단백질분해효소 활성 수용체-2(Proteinase-Activated Receptor-2, PAR-2)의 활성을 억제하여 우수한 항소양 효과를 제공할 뿐 아니라, 인터류킨-8(Interleukin-8, IL-8)의 분비 감소를 통해 항염증 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 사포닌은 민감성, 자극성 또는 아토피성 피부 및 두피를 안정화시키고 가려움, 열감 및 염증을 개선 또는 완화시키기 위한 피부 외용제 조성물의 유효 성분으로 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 미백용 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 티로시나제 활성을 저해하고 멜라닌의 생성을 억제함으로써 우수한 미백 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.
이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 제형예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[참고예 1] 사포닌의 분리
차나무의 뿌리는 2005년 11월에 제주도 서귀포시 남원읍 한남리에서 수집하였으며, 차나무는 야부기다(Yabukita) 품종으로 20년 된 것을 선택하였다.
신선한 차나무 뿌리 10kg을 작은 조각으로 자르고 80%의 수성 MeOH 8L에 담그어 2일 동안 실온에 두었고, 이러한 추출 방법을 2번 반복하였다. 추출물을 합하고, 진공 하에서 농축시켜 고무질의 갈색 잔여물 540g을 수득하였다. 잔여물 100g을 C18 실리카겔 플래시 컬럼(flash column)에서 용리액으로 H2O(각각 4L) 내의 MeOH를 0 내지 100%로 10%씩 증가시킨 것을 사용하여 크로마노크래피로 분리하고 11개의 분획물(A 내지 K)을 얻었다. 이 중 활성인 분획물 G(4g) 및 H(10g)를 합하고, 실리카겔 컬러에서 다시 크로마토그래피를 실시하여 8개의 분획물(GH1 내지 GH8)을 얻었다.
분획물 중 효소 억제 사포닌 분획물인 GH5(1.02g)를 C18 HPLC(용리액: 50 to 60% aqueous MeCN)로 정제하여 9개의 사포닌인 1(108mg, tR 19.9분), 2(92mg, tR 20.9분), 3(37mg, tR 23.3분), 4(60mg, tR 32.7분), 5(161mg, tR 35.7분), 6(113mg, tR 37.8분), 7(48mg, tR 39.4분), 8(33mg, tR 41.9분), 및 9(56mg, tR 47.9분)를 획득하였다. 또한 C18 HPLC에서 용리액 40 to 49% aqueous MeCN 를 사용하여 분석 샘플 1~3을, 용리액 70 to 80% aqueous MeOH 를 사용하여 샘플 4~8을 수득하였다(각각 49mg, 32mg, 12mg, 16mg, 71mg, 20mg, 12mg, 및 9mg). 상기 분획물 9는 HPLC로 용리액 55 to 60% aqueous MeCN 를 사용하여 추가 정제하였고, 분석 샘플 9(26mg, tR 43.3분) 및 10(8mg, tR 62.7분)를 수득하였다.
분리된 10종의 트리테르페노이드 사포닌을 각각 '차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 내지 R10'으로 지칭하며, 이에 대한 구체적인 분석 결과는 다음과 같다.
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1: 백색 고체; 녹는점 228 - 229℃; [α]20 D : - 28.83 (c 0.43, MeOH); IR (neat): νmax = 3406, 1738, 1714, 1447, 1249, 1039 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.69 (3H, s, H-24) , 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 0.89 (3H, s, H-29), 1.00 (5H, 3H,s, H-25 and 2H, m, H-6), 1.01 (3H, s, H-26), 1.02 (1H, m, Ha-1), 1.03 (3H, d, J = 7.2 Hz, 2MB-H-5), 1.05 (3H, s, H-30), 1.07 (1H, m, Ha-7), 1.26 (1H, t, J = 10.4 Hz, H-5), 1.35 (1H, dd, J = 13.2, 5.2 Hz, Ha-19), 1.38 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.48 (1H, m, Hb-7), 1.50 (3H, s, H-27), 1.56 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.64 (2H, m, Hb-1, H-9), 1.74 (1H, m, Ha-2), 1.84 (1H, m, Hb-2), 1.91 (3H, s, Ac), 1.96 (3H, s, Ac), 1.98 (2H, m, H-11), 2.23 (1H, m, 2MB-H-2), 2.25 (3H, s, Ac), 2.47 (1H, t, J = 14.2 Hz, Hb-19), 2.77 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.10 (1H, d, J = 11.2 Hz, Ha-28), 3.26 (1H, d, J = 11.2 Hz, Ha-23), 3.36 (1H, d, J = 11.2 Hz, Hb-28), 3.42 (1H, t J = 8.0, Hz, GlcA-H-2), 3.54 (2H, m, GlcA-H-3 & Ara-H-3), 3.57 (1H, m, GlcA-H-4), 3.58 (1H, m, Ara-Ha-5), 3.60 (1H, d, J = 11.2 Hz, Hb-23), 3.62 (1H, m, Ara-H-2), 3.63 (1H, m, H-3), 3.80 (1H, m, Ara-H-4), 3.82 (1H, m, GlcA-H-5), 3.90 (1H, m, Ara-Hb-5), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.16 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-15), 5.29 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-16), 5.30 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-21), 5.52 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-22), 5.59 (1H, brs, H-12); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1041.5258 [M + H]+ (calcd. for C52H80O21 + H: 1041.5270).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2: 백색 고체; 녹는점 229 - 230℃; [α] 20 D : - 37.61 (c 0.545, MeOH); IR (neat): νmax = 3314,, 1727, 1444, 1248, 1038 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.69 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-29), 1.00 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-26), 1.08 (3H, s, H-30), 1.26 (1H, m, Ha-19), 1.50 (3H, s, H-27), 1.71 (3H, s, Ang-H-5), 1.90 (3H, s, Ac), 1.91 (3H, d, J = 7.6 Hz , Ang-H-4), 1.93 (3H, s, Ac), 2.24 (3H, s, Ac), 2.50 (1H, t, J = 14.0, Hb-19), 2.78 (1H, dd, J = 14.4, 4.0 Hz, H-18), 3.14 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.26 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-23), 3.39 (1H, d, J = 10.0 Hz, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-23), 3.63 (1H, m, H-3), 4.50 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.18 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-15), 5.28 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-16), 5.38 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-21), 5.60 (1H, brs, H-12), 5.61 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-22), 6.08 (1H, q, J = 7.6 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1039.5142 [M + H]+ (calcd. for C52H78O21 + H: 1039.5114).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3: 백색 고체; 녹는점 233 - 234℃; [α] 20 D : - 28.84 (c 0.208, MeOH); IR (neat): νmax = 3415, 1726, 1368, 1249, 1023 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.70 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-26), 1.01 (3H, s, H-25), 1.08 (3H, s, H-30), 1.35 (3H, s, H-27), 1.50 (1H, m, Ha-15), 1.74 (3H, s, Ang-H-4), 1.80 (1H, m, Hb-15), 1.90 (3H, s, Ac), 1.93 (3H, d, J = 7.6 Hz , Ang-H-5), 2.20 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.4, 4.8 Hz, H-18), 3.10 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.27 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-23), 3.29 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-23), 3.64 (1H, m, H-3), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.10 (1H, brs, H-16), 5.46 (1H, brs, H-12), 5.50 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.58 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 6.08 (1H, q, J = 7.6 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 981.5094 [M + H]+ (calcd. for C50H76O19 + H: 981.5059).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4: 백색 고체; 녹는점 227 - 228℃; [α] 20 D : - 12.56 (c 0.565, MeOH); IR (neat): νmax = 3421, 1718, 1370, 1257, 1041 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.71 (3H, s, H-24), 0.88 (3H, s, H-29), 0.86 (3H, t, J = 8.4 Hz, 2MB-H-4), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, 2MB-H-5), 1.00 (3H, s, H-26), 1.02 (3H, s, H-25), 1.07 (3H, s, H-30), 1.38 (3H, s, H-27), 1.40 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.58 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.82 (3H, s, Ang-H-5), 1.96 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.22 (1H, m, 2MB-H-2), 2.32 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.12 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.27 (1H, overlapped with solvent, Ha-23), 3.37 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.4 Hz, Hb-23), 3.64 (1H, m, H-3), 3.99 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-15), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.29 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-16), 5.41 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.52 (1H, brs, H-12), 5.54 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 6.15 (1H, q, J = 6.8 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1039.5471 [M + H]+ (calcd. for C53H82O20 + H: 1039.5478).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5: 백색 고체; 녹는점 231 - 232℃; [α] 20 D : + 4.35 (c 0.46, MeOH); IR (neat): νmax = 3395, 1711, 1442, 1256, 1039 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.85 (3H, s, H-29), 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 1.01 (3H, s, H-25), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz , 2MB-H-5), 1.04 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-30), 1.13 (3H, s, H-24), 1.42 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.44 (3H, s, H-27), 1.60 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.85 (3H, s, Ang-H-5), 1.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, Ang-H-4), 2.32 (1H, m, 2MB-H-2), 2.62 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.00 (1H, d, J = 10.4 Hz, Ha-28), 3.27 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.71 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-15), 3.79 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-16), 3.89 (1H, m, H-3), 4.32 (1H, d, J = 7.6 Hz, GlcA-H-1), 4.50 (1H , d, J = 6.4 Hz, Ara-H-1), 5.47 (1H, brs, H-12), 5.55 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 5.86 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 6.14 (1H, q, J = 7.2 Hz, Ang-H-3), 9.41 (1H, s, H-23); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 995.5282 [M + H]+ (calcd. for C51H78O19 + H: 995.5216).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6: 백색 고체; 녹는점 229 - 230℃; [α] 20 D : - 9.56 (c 0.23, MeOH); IR (neat): νmax = 3424, 1728, 1538, 1456, 1229, 1070 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.4 Hz, 2MB-H-4), 0.92 (3H, s, H-29), 0.99 (3H, d, J = 7.2 Hz , 2MB-H-5), 1.02 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-30), 1.10 (3H, s, H-24), 1.36 (H, dd, J = 13.6, 4.0 Hz, 2MB-Ha-3), 1.57 (1H, dd, J = 13.6, 7.2 Hz, 2MB-Hb-3), 1.39 (3H, s, H-27), 1.84 (3H, s, Ang-H-5), 1.97 (3H, d, J = 7.2 Hz , Ang-H-4), 2.24 (1H, m, 2MB-H-2), 2.32 (3H, s, Ac), 2.64 (1H, dd, J = 14.4, 4.0 Hz, H-18), 3.12 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.34 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.90 (1H, dd, J = 8.8 & 2.8 Hz, H-3), 3.97 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-15), 4.33 (1H, d, J = 7.6 Hz, GlcA-H-1), 4.49 (1H , d, J = 6.8 Hz, Ara-H-1), 5.28 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-16), 5.41 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.54 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 5.55 (1H, brs, H-12), 6.16 (1H, q, J = 7.2 Hz, Ang-H-3), 9.40 (1H, s, H-23); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1037.5406 [M + H]+ (calcd. for C53H80O20 + H: 1037.5321).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7: 백색 고체; 녹는점 223 - 224℃; [α] 20 D : - 13.01 (c 0.315, MeOH); IR (neat): νmax = 3407, 1714, 1370, 1249, 1039 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz, 2MB-H-4), 0.89 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-25), 0.99 (3H, d, J = 7.2 Hz , 2MB-H-5), 1.00 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-30), 1.16 (3H, s, H-24), 1.37 (3H, s, H-27), 1.38 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.56 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.82 (3H, s, Ang-H-5), 1.97 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.26 (1H, m, 2MB-H-2), 2.31 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.8, 4.0 Hz, H-18), 3.12 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.34 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.68 (3H, s, 23-COOCH 3 ), 3.96 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-15), 4.03 (1H, dd, J = 11.6, 4.4 Hz, H-3), 4.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, GlcA-H-1), 4.50 (1H , d, J = 6.8 Hz, Ara-H-1), 5.28 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-16), 5.41 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.54 (1H, brs, H-12), 5.54 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-22), 6.16 (1H, q, J = 7.0 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1067.5492 [M + H]+ (calcd. for C54H82O21 + H: 1067.5427).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8: 백색 고체; 녹는점 231 - 232℃; [α] 20 D : - 8.62 (c 0.105, MeOH); IR (neat): νmax = 3411, 1722, 1441, 1242, 1073 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.84 (3H, s, H-29), 0.85 (3H, s, H-24), 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 0.98 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-26), 1.02 (3H, d, J = 7.2 Hz , 2MB-H-5), 1.05 (3H, s, H-23), 1.07 (3H, s, H-30), 1.41 (3H, s, H-27), 1.42 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.60 (H, m, 2MB-Hb-3), 1.84 (3H, s, Ang-H-5), 1.98 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-5), 2.30 (1H, m, 2MB-H-2), 2.62 (1H, m, H-18), 2.99 (1H, d, J = 10.0 Hz, Ha-28), 3.18 (1H, dd, J = 9.2, 5.2 Hz, H-3), 3.30 (1H, overlapped with solvent, Hb-28), 3.73 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-15), 3.80 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-16), 4.41 (1H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1), 4.53 (1H , d, J = 6.8 Hz, Ara-H-1), 5.47 (1H, brs, H-12), 5.55 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-22), 5.86 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-21), 6.16 (1H, q, J = 7.2 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 981.5435 [M + H]+ (calcd. for C51H80O18 + H: 981.5423).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9: 백색 고체; 녹는점 232 - 233℃; [α] 20 D : - 24.15 (c 0.31, MeOH); IR (neat): νmax = 3443, 1724, 1459, 1234, 1072 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.71 (3H, s, H-24), 0.84 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 0.88 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz , 2MB-H-5), 1.01 (3H, s, H-25), 1.09 (3H, s, H-30), 1.32 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.37 (3H, s, H-27), 1.44 (1H, m, Ha-15), 1.57 (H, m, 2MB-Hb-3), 1.80 (1H, m, Hb-15), 1.83 (3H, s, Ang-H-5), 1.97 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.20 (1H, m, 2MB-H-2), 2.27 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.0, 3.6 Hz, H-18), 3.08 (1H, d, J = 10.4 Hz, Ha-28), 3.29 (1H, overlapped with solvent, Ha-23), 3.32 (1H, overlapped with solvent, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.0 Hz, Hb-23), 3.63 (1H, m, H-3), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.15 (1H, brs, H-16), 5.45 (1H, brs, H-12), 5.54 (2H, s, H-21 and H-22), 6.16 (1H, q, J = 7.6 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1023.5556 [M + H]+ (calcd. for C53H82O19 + H: 1023.5529).
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10: 백색 고체; 녹는점 232 - 233℃; [α] 20 D : - 22.06 (c 0.29, MeOH); IR (neat): νmax = 3433, 1720, 1458, 1229, 1072 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.70 (3H, s, H-24), 0.85 (3H, t, J = 7.6 Hz, 2MB-H-4), 0.89 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz , 2MB-H-5), 1.01 (3H, s, H-25), 1.09 (3H, s, H-30), 1.36 (3H, s, H-27), 1.37 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.43 (1H, m, Ha -15), 1.55 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.81 (1H, m, Hb-15), 1.83 (3H, s, Ang-H-5), 1.96 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.22 (1H, m, 2MB-H-2), 2.27 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.08 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.29 (1H, overlapped with solvent, Ha-23), 3.32 (1H, overlapped with solvent, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-23), 3.62 (1H, m, H-3), 3.77 (3H, s, GlcA-6-OCH 3 ), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.16 (1H, brs, H-16), 5.46 (1H, brs, H-12), 5.54 (2H, s, H-21 and H-22), 6.16 (1H, q, J = 7.0 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1037.5684 [M + H]+ (calcd. for C54H84O19 + H: 1037.5685).
[시험예 1] 엘라스타아제 활성 억제 효능 측정
본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌의 엘라스타아제 활성 저해능을 EGCG와 비교하여 측정하였다. 사용된 엘라스타아제와 기질은 미국 시그마알드리치 사로부터 상업적으로 구매하였고(Cat.No. E0127), 트리테르페노이드 사포닌은 참고예 1에서 얻어진 차나무 뿌리 유래 사포닌 R1~R10을 사용하였다.
하기의 시험방법으로 엘라스타아제 활성 저해작용을 시험하였다.
96 웰 플레이트에서 10mg/L Tris-HCL 완충액(pH 8.0)으로 조제한 것에 하기 표 1에 나타낸 시험물질 50μL 및 20㎍/mL 엘라스타아제·타입 III 용액 50μL를 혼합하였다. EGCG 250μM 은 양성 대조군으로 사용하였으며 음성 대조군인 비처리군은 증류수를 사용하였다. 그 후, 상기 완충액으로 조제한 0.4514㎎/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100μL를 첨가하고, 25℃에서 15분 반응시켰다. 반응종료 후, 파장 415㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 공시험을 행하여 보정하였다.
엘라스타아제 활성 저해작용의 계산방법은 하기 수학식 1과 같으며, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00011
A: 실험시료 무첨가, 효소 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도
B: 실험시료 무첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도
C: 실험시료 첨가, 효소 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도
D: 실험시료 첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도
화합물 억제정도(%)
비처리군 0
EGCG 65
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 66
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 68
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 70
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 62
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 61
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 63
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 55
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 57
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 66
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 71
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 차나무 뿌리 유래 사포닌의 엘라스타아제 활성 억제 정도가 엘라스타아제 활성 억제제로 알려져 있는 EGCG와 비교하여서도 거의 대부분 EGCG 보다 현저하게 우수한 것으로 나타나 본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌의 엘라스타아제 활성 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능
본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌의 콜라게나아제 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 측정하였다.
2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO2 5%, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 차나무 뿌리 유래 사포닌을 30 ㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.
상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.
노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게나아제의 합성 정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.
Figure pat00012
화합물 발현정도(%)
비처리군 100
레티노익산 75
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 78
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 81
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 73
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 70
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 88
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 71
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 75
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 88
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 76
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 81
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 사포닌의 콜라게나아제 발현 정도가 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노익산과 비교하여서도 콜라게나아제 발현 저해 효과가 비슷한 수준임을 알 수 있다.
이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의사포닌은 기질 메탈로 프로테아제(MMP-1)를 저해시키는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
[제형예 1~10 및 비교제형예 1]
하기 표 3의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다(단위: 중량%).
배합성분 제형예1 제형예2 제형예3 제형예4 제형예5 제형예6 제형예7 제형예8 제형예9 제형예10 비교제형예1
정제수 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 0.1 - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 - 0.1 - - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 - - 0.1 - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 - - - 0.1 - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 - - - - 0.1 - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 - - - - - 0.1 - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 - - - - - - 0.1 - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 - - - - - - - 0.1 - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 - - - - - - - - 0.1 - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 - - - - - - - - - 0.1 -
식물성 경화유 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
스테아린산 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60
글리세롤 스테아레이트 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
스테아릴 알코올 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 & 소디움 스테아로일 락틸에이트 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 &아라키딜글루코사이드 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤올레이트 & 프로필렌글리콜 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
카프릴릭/카르릭 트리 글리세라이드 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00 11.00
사이클로메디콘 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00
방부제, 향 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량 적량
트리에탄올 아민 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
[시험예 3] 피부 탄력 향상 효능 확인
사람에서의 피부 탄력 향상 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1~10와 비교제형예 1의 제형으로 다음과 같이 평가하였다.
30~40대의 건강한 여성 110명을 각각 제형예 1~10와 비교제형예 1의 11개 군에 대해 10명씩 11조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면 왼쪽에 도포하게 한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 표 4의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8(R8(왼쪽)-R8(오른쪽)) 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.
실험제품 피부탄력효과
제형예 1 0.17
제형예 2 0.3
제형예 3 0.27
제형예 4 0.29
제형예 5 0.28
제형예 6 0.17
제형예 7 0.18
제형예 8 0.14
제형예 9 0.27
제형예 10 0.15
비교제형예 1 0.10
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌이 함유된 제형예 1~10는 비교제형예 1을 도포한 군에 비하여 피부 탄력성이 더 증가되었다.
따라서, 본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.
[시험예 4] 피부 주름 개선 효능 확인
본 발명의 조성물에 의한 사람에서의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1~10와 비교제형예 1을 이용하였다.
상기 제형예 1~10와 비교제형예 1의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 110명을 각각 제형예 1~10와 비교제형예 1의 16개 군에 대해 10명씩 11조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.
사용 8주 후
임상 결과		 R1 R2 R3 R4 R5
제형예 1 0.15 0.14 0.14 0.02 0.02
제형예 2 0.11 0.10 0.11 0.01 0.01
제형예 3 0.14 0.13 0.13 0.01 0.01
제형예 4 0.2 0.2 0.18 0.03 0.03
제형예 5 0.17 0.17 0.16 0.02 0.02
제형예 6 0.29 0.24 0.28 0.02 0.02
제형예 7 0.27 0.25 0.27 0.01 0.01
제형예 8 0.15 0.15 0.15 0.03 0.03
제형예 9 0.17 0.14 0.14 0.01 0.01
제형예 10 0.20 0.19 0.19 0.03 0.03
비교제형예 1 0.27 0.26 0.21 0.03 0.03
R1 : 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값
R2 : 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균
R3 : 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값
R4 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값
R5 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값
상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 제형예 1~10의 외용제 조성물은 피부 주름 개선 효과가 아주 우수함을 알 수 있었다.
[시험예 5] 혈색 개선 효과
본 발명에 의한 화장료 조성물의 피부 혈액 순환 촉진 효과를 평가하기 위하여, LDPI(Laser Doppler Perfusion Imager)를 이용하여 피부에서의 혈액순환 정도를 측정하였다. LDPI는 피부에서의 혈액순환을 측정하는 기기로 널리 알려져 있고 현재 사용되고 있는 기기로서, 피부의 모세혈관에서 혈액의 속도 및 양 뿐만 아니라 소동맥과 소정맥에서의 흐름까지 측정해 낼 수 있는 매우 민감한 기기이다.
항온항습실에서 얼굴을 비누로 수세한 후 30분간 적응시키고, LDPI를 이용하여 초기값을 측정하였다. 먼저 평소 손발이 차가운 여성 30명의 이마 아래 부분의 초기 혈류량을 LDPI로 측정하였다. 그런 다음 상기 제형예 1~10 및 비교제형예 1을 1주일 동안 피시험자들에게 사용하도록 한 후에 측정한 혈류량과 상기 초기 측정값을 비교한 결과(피부 혈류량 변화)를 하기 표 6에 나타내었다.
화장료 사용 전후 LDPI 결과-피부 혈류량
시험물질 1주 사용 후 피부 혈류량 변화율(%)
제형예 1 5
제형예 2 20
제형예 3 13
제형예 4 4
제형예 5 5
제형예 6 12
제형예 7 8
제형예 8 9
제형예 9 13
제형예 10 14
비교제형예 1 5
상기 표 6의 결과에서, 본 발명에 의한 화장료 조성물은 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하지 않은 비교제형예 1 보다 피부 혈류량을 현저하게 증가시켰으며, 이러한 혈액 순환 촉진을 통해 혈색이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 궁극적으로 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 화장료 조성물이 피부의 영양분을 효과적으로 전달하고 피부 노화를 억제하며 지연시키는 데 기여할 수 있음을 시사한다.
[시험예 6] 피부톤 개선 효과
상기 제형예 1~10 및 비교제형예 1의 피부톤 개선 효과를 알아보기 위하여 30명의 피험자에게 각각 사용(저녁 1회/일 도포, 총 1주간)하도록 한 후, Facial Stage DM-3(Moritex, Japan) 기기를 활용하여 피부톤 개선 정도를 평가하였다. 피부톤 개선율은 피부의 명도 및 색채 측정값으로 피부의 명도 및 색채 변화 값으로 판단하였으며, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
시험물질 피부톤 개선율(%)
명도(평균±표준편차) 색채(평균±표준편차)
제형예 1 10±1.34 12±2.15
제형예 2 8±1.15 11±2.95
제형예 3 12±2.15 9±0.25
제형예 4 11±2.25 13±2.34
제형예 5 9±0.25 10±0.15
제형예 6 13±2.34 13±2.34
제형예 7 11±1.05 12±1.05
제형예 8 8±1.15 8±0.15
제형예 9 11±2.25 11±2.25
제형예 10 9±0.25 9±0.25
비교제형예 1 5±2.34 5±2.05
표 7의 결과에서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하지 않는 비교제형예 1은 유의적인 피부톤 개선 효능을 보이지 않은 반면, 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 제형예 1~10는 사용전보다 사용후의 피부톤이 많이 개선되는 것을 확인하였다.
[시험예 7] 모공 축소 효과
<콜라겐 생합성 촉진을 통한 모공 축소 효과>
본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌을 콜라겐 생합성 촉진 효과를 TGF-β와 비교하여 측정하였다. 먼저, 섬유아세포(fibroblast)를 24 공(well)에 1 공 당 105개씩 파종(seeding)하여 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이를 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지로 배양한 후 무혈청 배지에 녹인 본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌과 TGF-β를 각각 10ng/ml씩 처리하고 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 프로콜라겐 형(I) ELISA 키트(procollagen type(I))를 이용하여 프로콜라겐(procollagen)의 증감여부를 보았다. 그 결과를 표 8에 나타내었으며, 콜라겐의 합성능은 비처리군을 100으로 하여 대비하였다.
시험물질 콜라겐 합성능(%)
비처리군 100
TGF-β 183.5
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 120.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 135.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 138
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 157.8
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 115
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 125
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 143.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 123.4
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 168.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 112.1
상기 표 8의 결과에서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌은 양성대조군인 TGF-β와 동등하거나 보다 높은 수준의 우수한 콜라겐 합성능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌이 모공 주변의 콜라겐 생성량을 증가시켜 넓어진 모공을 축소시킬 수 있음을 확인하였다.
<모공 축소 효과>
제형예 1~10 및 비교제형예 1의 모공 축소 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 모공 크기가 넓은 피험자 남녀 110명을 선정하여 10명씩 11개 군으로 나누고 각 군별로 얼굴에 제형예 1~10 및 비교제형예 1의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 모공 축소의 효과에 대한 판정은 실험 전과 4주 후 사진을 찍어서 전문가들의 육안 평가로 이루어졌다. 그 결과는 하기 표 9에서 나타내었다(평가 등급: 0 - 전혀 축소 되지 않았다; 5 - 매우 축소되었다).
시험물질 평가 등급
제형예 1 3.5
제형예 2 3.1
제형예 3 2.5
제형예 4 2.9
제형예 5 2.1
제형예 6 3.6
제형예 7 4.1
제형예 8 3.5
제형예 9 2.5
제형예 10 3.1
비교제형예 1 0.4
상기 표 9의 결과로부터, 비교제형예 1은 모공 축소 효과가 없지만, 제형예 1~10의 경우에는 육안으로 확인가능할 정도의 모공 축소 효과를 나타내어 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌은 모공의 크기를 감소시키는 효과가 우수함을 알 수 있었다.
[시험예 8] 피지 분비 억제 효과
<5α-리덕타아제 활성 억제를 통한 피부 과분비 억제 효과>
5α-리덕타아제 활성 억제 효과를 확인하기 위해서 HEK293-5αR2 세포에서 [14C]테스토스테론이 [14C]디하이드로테스토스테론(DHT: dihydrotestosterone)으로 변환되는 비율을 측정하였다. HEK293 세포에 p3 x FLAG-CMV-5αR2를 형질감염시켜서 24 웰 플레이트에 웰당 2.5 x 105 세포로 넣고 배양하였다(Park et al., 2003, JDS. Vol. 31, pp. 191-98). 다음날 효소 기질과 저해제가 첨가된 새로운 배지로 바꿔주었다. 배지의 기질로는 0.05μCi [14C]테스토스테론(Amersham Pharmacia biotech, UK)을 사용하였다.
5α-리덕타아제 활성 억제 정도를 확인하기 위해서 하기 표 10에 나타낸 차나무 뿌리 유래 사포닌을 각각 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 이 때 차나무 뿌리 유래 사포닌을 넣지 않은 것은 음성대조군으로 사용하고, 피나스테라이드(finasteride)를 넣은 것을 양성대조군으로 사용하였다. 이 후 배양 배지를 수거하여 스테로이드를 800 ㎕ 에틸아세테이트로 추출한 다음 상부의 유기용매층을 분리하여 말린 후 남은 잔유물을 다시 50 ㎕ 에틸아세테이트로 녹여서 실리카 플라스틱시트 카이젤겔 60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254) 상에서 에틸아세테이트-헥산(1:1)을 용매로 하여 전개하였다.
플라스틱 시료를 공기 중에서 건조한 후, 동위원소의 양을 측정하기 위하여 바스 시스템을 사용하였는데, 건조된 플라스틱 시트와 엑스레이 필름을 함께 바스 카셋트에 넣어 1주일 후에 필름에 남아있는 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론의 동위원소 양을 측정한 다음 하기 수학식 3 및 4에 따라 전환율 및 저해율을 각각 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
Figure pat00013
Figure pat00014
시험물질 전환율(%) 저해율(%)
음성대조군 48.0 -
양성대조군 27.6 42.5
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 30.2 37.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 34.1 29.0
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 40.1 16.5
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 40.6 15.5
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 45.1 6.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 30.1 37.3
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 34.5 29
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 44.1 8.2
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 32.1 33.2
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 33.1 31.1
상기 표 10의 결과에서, 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론으로 전환시켜 세포질 내에 있는 수용체 단백질과 결합해 핵 내로 들어가 피지선 세포를 활성화하고 분화를 촉진시켜 피지선 내에서 피지를 과분비시키는 역할을 하는 5α-리덕타아제의 활성을 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌이 효과적으로 억제함으로써 테스토스테론의 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 차단하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌이 5α-리덕타아제의 활성을 효과적으로 억제시킴으로써 피지의 과분비를 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
<피지 분비 억제 효과>
상기 제형예 1~10 및 비교제형예 1의 피지 분비 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 피지분비가 많다고 느끼는 피험자 남녀 30명을 선정하여 지정된 부위에 제형예 1~10 및 비교제형예 1의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 피지감소의 효과에 대한 판정은 피지량 측정기(Sebumeter SM810, C+K Electronic Co., 독일)를 사용하여 2주 및 4주 경과 후 평균 피지 감소율(%)을 각각 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
시험물질 피지 감소율(%)
2주 경과 후 4주 경과 후
제형예 1 11 12
제형예 2 14 14
제형예 3 19 17
제형예 4 11 17
제형예 5 12 11
제형예 6 7 5
제형예 7 6 10
제형예 8 18 11
제형예 9 14 11
제형예 10 15 15
비교제형예 1 5 5
상기 표 11의 결과에서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 함유하는 제형예 1~10는 이를 함유하지 않은 비교제형예 1 보다 과잉으로 분비되는 피지를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
[시험예 9] 피부 보습력 증가 효과 측정
차나무 뿌리 유래 사포닌이 피부 보습력 증가에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 상기 제형예 1~10 및 비교제형예 1을 이용하였고, 하기와 같이 평가하였다.
건조 피부로 분류된 40~50대 성인 남녀 110명을 각각 제형예 1~10 및 비교제형예 1의 11개 군에 대해 10명씩 11조로 나누어 영양크림을 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점, 그리고 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 피부수분량측정기(Corneometer CM825, C+K Electronic Co., 독일)로 피부수분량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 12에 나타내었다. 표 12의 결과는 시험개시 직전에 측정한 피부 수분량 측정기 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다.
시험군 수분 증가율 (%)
1주 경과 2주 경과 4주 경과 6주 경과
제형예 1 27 27 27 24
제형예 2 22 24 35 30
제형예 3 21 23 30 30
제형예 4 25 22 25 22
제형예 5 26 29 31 20
제형예 6 30 28 31 17
제형예 7 20 28 30 21
제형예 8 28 28 29 25
제형예 9 30 29 32 27
제형예 10 28 31 35 26
비교제형예 1 30 32 32 15
상기 표 12의 결과를 보면, 비교제형예 1을 도포한 경우에는 도포가 이루어진 4주까지는 약 30% 정도의 수분 증가율을 보이지만, 도포를 중지한 후에는 피부수분량이 감소하는 반면, 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유한 제형예 1~10를 도포한 경우에는 도포를 중지한 후에도 대부분 30% 이상의 피부수분 증가율을 보임을 확인할 수 있다. 이를 통해 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유한 본 발명의 조성물은 피부 보습력 효과과 우수함을 알 수 있다.
[시험예 10] 각질형성세포 분화 촉진 효과 측정
차나무 뿌리 유래 사포닌의 각질형성세포의 분화 촉진 효과를 알아보기 위해, 하기와 같이 각질형성세포의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.
먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 하기 표 13의 시험물질을 배양액에 5 ppm 농도로 처리한 후 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성 대조군, 양성 대조군으로 하였다. 그 다음 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS(Phophate buffered saline)로 세척한 뒤 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리를 하고, 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포 분화정도 평가시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
시험물질 각질형성세포에서의 분화능(%)
저칼슘(0.03mM) 용액
(음성 대조군)		 100
고칼슘(1.2mM) 용액
(양성 대조군)		 210
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 110
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 138
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 117
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 100
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 168
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 132
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 151
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 147
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 136
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 121
상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 차나무 뿌리 유래 사포닌을 처리한 경우 각질 형성 세포의 분화 촉진 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 11] 피부 장벽기능 회복 효과 측정
차나무 뿌리 유래 사포닌이 피부 손상으로 인해 손상된 피부 장벽기능의 회복에 미치는 효과 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 성인 남녀 10명의 상박을 테이프 스트립핑(Tape Stripping) 방법을 이용하여 피부 장벽에 손상을 주고 각각 하기 표 14의 조성으로 제조한 제형예 11~20 및 비교제형예 2의 11개 군을 도포하면서 7일 동안 하루에 한번씩 경피수분손실량(TWEL)의 회복 정도를 Vapometer(Delfin, 핀란드)로 측정 비교하였다. 여기에서 비교제형예 2는 음성대조군으로서 비히클(vehicle)이다. 실험 결과는 하기 표 15에 나타내었다. 표 15의 결과는 장벽 손상 전과 장벽 손상 후의 처리전 차이를 100% 기준으로 하여 비교하였다.
배합성분 제형예 11 제형예 12 제형예 13 제형예 14 제형예 15 제형예 16 제형예 17 제형예 18 제형예 19 제형예 20 비교제형예2
정제수 69 69 69 69 69 69 69 69 69 69 69
프로필렌글리콜 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 1 - - - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 - 1 - - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 - - 1 - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 - - - 1 - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 - - - - 1 - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 - - - - - 1 - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 - - - - - - 1 - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 - - - - - - - 1 - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 - - - - - - - - 1 - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 - - - - - - - - - 1 -
시험군 TWEL 변화 (%)
처리전 1일 2일 3일 4일 5일 6일
제형예 11 100 125.3 105.2 84.2 60.2 48.1 40.1
제형예 12 100 124.7 110.2 90.1 78.1 50.1 35.1
제형예 13 100 120 104.2 88.4 64.1 57.4 32.6
제형예 14 100 119.6 108.2 89.1 62.1 58.1 38.4
제형예 15 100 125.4 110.2 96.1 58.1 59.6 39.1
제형예 16 100 132.1 111.3 95.1 58.7 40.1 35.1
제형예 17 100 114.7 112.5 90.1 60.1 43.1 32.1
제형예 18 100 128.1 107.1 88.4 62.4 52.1 31.0
제형예 19 100 119.7 105.1 84.1 61.2 61.2 29.1
제형예 20 100 120.1 107.3 94.1 65.4 54.1 38.1
비교제형예 2 100 121.4 112.7 98.3 70.5 62.3 43.5
상기 표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 차나무 뿌리 유래 사포닌을 처리할 경우 빠른 속도로 경피 수분 손실량이 정상으로 돌아오며 장벽 손상이 회복됨을 확인할 수 있다.
[제형예 21~30 및 비교제형예 3~4]
하기 표 16에 나타낸 성분 및 함량(중량%)에 따라 제형예 21~30 및 비교제형예 3~4를 제조하였다. 구체적으로 설명하면, 제형예 21~30는 차나무 뿌리 유래 사포닌을 배합시킨 것이고, 비교제형예 3은 여드름 피부 개선의 유효성분을 전혀 포함시키지 않은 것이고, 비교제형예 4는 항균력에 대한 기준으로 삼을 표준물질로서, 여드름 치료제로 많이 사용하는 에리스롬마이신(erythromycin)을 함유시킨 것이다.
제형예 21~30 및 비교제형예 3~4의 제조 방법은 다음과 같다. 하기 표 16의 A상의 성분들을 완전 용해시키고 별도의 용해조에서 B상의 성분들을 완전 용해시킨 다음, B상을 A상에 첨가하여 혼합가용화 시켰다. 여기에 C상의 성분들을 표 16에 기재된 배합비율에 따라 첨가하여 혼합 균일화시킨 다음 여과시켜 본 조성물들을 제조하였다.
구분 제형예 21 제형예 22 제형예 23 제형예 24 제형예 25 제형예 26 제형예 27 제형예 28 제형예 29 제형예
30		 비교제형예3 비교제형예4
A 탈이온수(Deionized Water) To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100
EDTA-2Na 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02
글리세린 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
B 에탄올 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
PEG-60 경화 피마자유(hydrogenated castor oil) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
향료(perfume) 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04
C 차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 5.0 - - - - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 - 5.0 - - - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 - - 5.0 - - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 - - - 5.0 - - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 - - - - 5.0 - - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 - - - - - 5.0 - - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 - - - - - - 5.0 - - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 - - - - - - - 5.0 - - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 - - - - - - - - 5.0 - - -
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 - - - - - - - - - 5.0 - -
에리스롬마이신 - - - - - - - - - - - 5.0
[시험예 12] 여드름균에 대한 항균력 시험
제형예 21~30 및 비교제형예 3~4의 조성으로 제조된 각각의 화장료 조성물을 가지고 여드름 원인 균주인 프로피오니박테리움 아크네스<ATCC 6919: 배지-BHI 브로쓰(broth)>에 대하여 항균력을 시험하였다.
여드름균에 대한 항균력 시험 방법은 다음과 같았다.
(1) 시험 균액 준비
프로피오니박테리움 아크네스는 BHI 브로쓰에 접종하여 혐기 배양한 배양액을 사용하였다.
(2) 희석 용액 준비
BHI 브로쓰(pH 6.8) 또는 LB 브로쓰(pH 4.5) 15ml에 상기 시험 균액을 0.15ml 첨가하여 잘 혼합한 것을 희석용액으로 사용하였다.
(3) 시료 준비
제형예 21~30 및 비교제형예 3~4로부터 제조된 화장료 조성물 원액 그대로를 시료로 사용하였다.
(4) 항균력 시험
1) 96웰의 세포배양관(96 well plate) 1번 행에 출발 농도에 맞도록 시료를 넣고 희석용액으로 총량을 200μl씩을 넣는다.
2) 1번 행의 혼합액을 잘 섞어준 다음 100μl를 취하여 2번 행에 넣고 잘 섞어준 다음, 다시 100μl를 취하여 3번 행에 넣는 방식으로 이중 희석(double dilution)을 행한다.
3) 32℃에서 24시간 및 48시간 정치 배양한 후 현탁된 정도로 균의 증식 유무를 판단하여 균의 증식이 없는 최소농도를 MIC(최소저지농도; Minimum Inhibitory Concentration) 값으로 결정한다. 만약 혼합액이 불투명하여 균의 증식 유무를 판단하기 어려우면 현미경 관찰을 통하여 확인한다.
여드름균에 대한 항균력 시험 결과를 아래 표 17에 나타내었다. MIC는 제형에 함유된 유효성분의 농도로 환산하여 표기하였다.
항목 pH 프로피오니박테리움 아크네스
제형예 21 5.7 15.4
제형예 22 5.7 10.4
제형예 23 5.7 8.8
제형예 24 5.7 3.5
제형예 25 5.7 2.5
제형예 26 5.7 0.7
제형예 27 5.7 2.8
제형예 28 5.7 10.4
제형예 29 5.7 3.5
제형예 30 5.7 0.5
비교제형예 3 5.7 최고 농도(항균력 없음)
비교제형예 4 5.7 > 100 ppm
MIC에서 ppm 농도가 작을수록 여드름균에 대한 항균력에 대하여 유효한 물질이라고 할 수 있는데, 제형예 21~30의 경우 공지의 여드름 치료제인 에리스롬마이신을 사용한 비교제형예 4보다 ppm 농도가 현저하게 작게 나와 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 조성물은 시험균에 대하여 훨씬 우수한 항균력을 가짐을 확인할 수 있다.
[시험예 13] 지질합성(Lipogenesis) 억제 시험
생쥐의 섬유아세포주(fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecos modified eagles medium, GIBCO BRL, Life Technologes 社) 배지가 담긴 6웰 배양 플레이트(culture plate)에 1×105 세포/웰로 부착시켰다. 2일이 지난 후 다시 새로운 DMEM(10% FBS 함유) 배지로 교환하고 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양한 세포를 다시 1㎍/㎖ 인슐린(insulin), 0.5mM IBMX 및 0.25μM 덱사메타손(dexamethasone)을 함유한 DMEM(10% FBS 함유)로 분화 유도를 하고 차나무 뿌리 유래 사포닌 및 카페인을 50μM을 처리한 다음 처리 2일이 경과한 후 다시 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 5일 동안 배양하였다. 5일 후 다시 정상 배지(DMEM, 10% FBS 함유)로 교환하고 상기 세포가 형태적으로 지방세포로 변화할 때까지 관찰하면서 배양하였다.
차나무 뿌리 유래 사포닌의 지방세포 내 지방 축적 억제 효능을 평가하기 위하여 상기에서 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 수단 III 염색(S4136, sigma-aldrich)을 실시하였다. 지방 세포를 인산염 버퍼 내에서 4% 파라포름알데하이드(pH 7.2)로 상온에서 고정한 후에 PBS(phsphate buffered saline)로 수세해준 후에 수단 III으로 염색한 후에 사진을 찍어서 육안 비교하였다. 대조군은 시험물질이나 비교물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 다른 비교군으로 카페인 50μM을 처리하였다. 지방 축적 억제 정도는 염색된 정도를 +++, ++, +, -로 나누어 등급을 부여하였다. 그 결과를 표 18에 나타내었다.
시료 저해율%
대조군 +++
비교군 +
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 +
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 +
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 ++
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 ++
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 +++
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 +
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 +
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 ++
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 ++
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 ++
상기 표 18에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용된 차나무 뿌리 유래 사포닌은 공지된 지질합성 저해 물질인 카페인과 동등하거나 그보다 우수한 지질합성 저해 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서, 지질합성이 억제됨으로써 피지가 감소되어 여드름 발생을 억제할 수 있다.
[시험예 14] 여드름 개선과 피지분비 감소 및 자극 유무의 시험
여드름을 보유하고 있는 120명을 10명씩 12개 군으로 나누고 각각의 군에 해당하는 피험자에게 상기 제형예 21~30 및 비교제형예 3~4로부터 제조된 화장료 조성물을 한 달간 사용하게 하였다. 여드름 개선 척도는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기의 표 19에 10명의 평균점수로 표기하였다.
여드름 소멸 시기는 소멸이 판독된 일수를 기준으로 하였으며, 여드름 재발은 유무로 1개월 뒤의 결과를 기준으로 하였다. 피지 분비감소는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기 표 19에 10명의 평균점수로 표기하였다. 피부자극의 유무는 (자극반응을 보인 명수)/(총 시험자수)로 보았다.
염증성 여드름 개선 면포성 여드름 소멸시기 여드름 재발 피지분비 감소 자극 유무
제형예 21 3.5 4일 무 3.8 1/10
제형예 22 4.1 5일 무 3.5 0/10
제형예 23 3.9 4일 무 3.1 5/10
제형예 24 3.1 4일 무 3.5 4/10
제형예 25 2.5 7일 무 2.5 3/10
제형예 26 3.8 4일 무 3.8 1/10
제형예 27 4 6일 무 4.1 2/10
제형예 28 3.2 4일 무 3.8 8/10
제형예 29 3.5 5일 무 3.5 7/10
제형예 30 3.5 5일 무 3.8 5/10
비교제형예 3 2.1 13일 유 2.0 0/10
비교제형예 4 4.2 2일 무 4.1 9/10
상기 표 19에 나타내 바와 같이, 제형예 21~30는 비교제형예 3에 비해 여드름이 재발되지 않았고, 전반적으로 여드름 개선에 대해 우수한 효과가 있음을 알 수 있다. 한편, 항균력 표준물질을 함유한 비교제형예 4의 경우, 여드름 개선 효과를 보이고 있으나, 사용함에 있어 자극이 강하여 장기적으로 사용하기에 피부자극의 우려가 있으나, 본원 발명에 따른 조성물은 자극이 없는 것으로 나타났다.
[시험예 15] 염증 개선 효과
항염증 효과는 프로스타글란딘의 생성 억제 효과로 평가하였다. 차나무 뿌리 유래 사포닌을 이용하여 대식세포를 대상으로 효과를 측정하였다. 우선, 마우스의 복강에서 채취한 대식세포에 최종농도가 500M이 되도록 아스피린을 첨가해 세포에 잔존하는 시클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX) 활성을 비가역적으로 억제하였다. 그런 다음 상기 현탁액을 96 웰의 세포배양관의 각 웰에 100μl를 넣어 5% CO2와 37℃ 조건의 배양기에서 2시간 동안 배양하여 대식 세포를 용기 표면에 부착시켰다. 이어, 부착된 대식 세포를 PBS로 3회 세척한 후 이를 염증 개선 효과 시험에 사용하였다. 상기 배양된 대식세포 5x104 세포/ml에 LPS를 1%(w/v)로 함유하는 RPMI 배지를 첨가하여 12시간 동안 배양한 후 프로스타글란딘의 생성을 유발하고 차나무 뿌리 유래 사포닌을 100μl 처리하여 유리된 프로스타글란딘을 효소면역 분석법(ELISA)을 이용하여 정량하였다.
이때, 차나무 뿌리 유래 사포닌의 프로스타글란딘의 생성억제 활성은 LPS를 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 각각 생성된 프로스타글란딘의 차이를 100%로 설정하고, LPS와 시료를 함께 처리하여 감소된 프로스타글란딘의 백분율을 통하여 대조군과 비교, 판정하였으며, 그 결과(프로스타글란딘의 생성억제 효과)를 하기 표 20에 나타내었다.
블랭크(Blank) 100%
대조군(아스피린 처리군) 25.0%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 30.0%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 53.4%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 38.1%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 40.1%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 38.1%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 39.4%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 65.1%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 67.1%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 89.1%
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 68.1%
상기 표 20에서 보는 바와 같이, 실험결과 아스피린으로 처리한 대조군과 같이 차나무 뿌리 유래 사포닌을 처리한 경우에도 프로스타글란딘의 생성억제효과가 매우 높음을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌은 우수한 염증 개선 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
또한 차나무 뿌리 유래 사포닌은 피부 염증 인자인 프로스타글란딘의 발현을 억제하여 피부 트러블을 방지하고 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.
[시험예 17] 미백 효과
<티로시나제 저해 효과>
티로시나제 효소는 버섯류(Mushroom)로부터 추출된 것으로 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 먼저 기질인 티로신을 증류수에 용해시켜 0.3mg/ml의 용액으로 만들고 그 용액을 1.0ml씩 시험관에 넣은 다음, 여기에 포타슘-포스페이트 완충용액(0.1mol 농도, pH 6.8) 1.0ml 및 증류수 0.7ml를 첨가하였다.
본 발명의 차나무 뿌리 유래 사포닌을 에탄올 용액에 적당농도로 혼합하여 준비한 각 시료액 0.2ml를 반응액에 넣은 다음 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이때 대조군은 각 시료액 대신 용매만을 0.2ml 넣은 것으로 준비하였고, 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다. 이 반응액에 2500유닛/ml의 티로시나제 용액 0.1ml씩을 넣고 다시 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음물속에 넣어서 급냉시켜 반응을 중지시키고 광전분광분석계로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 21에 나타내었다. 각각의 티로시나제 저해 효과는 하기 수학식 5로 산출하였다.
Figure pat00015
시험물질 티로시나제 저해율(%)
대조군(무첨가) 0
아스코르브산 52
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 58.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 60
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 68.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 65
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 58.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 55.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 30.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 32
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 15
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 53.4
상기 표 21의 결과에서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 제형예 1~10의 화장료 조성물의 티로시나제 억제율이 공지된 티로시나제 저해제인 아스코르브산보다 훨씬 높아 미백 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
<B16/F10 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과>
제형예 1~10, 비교제형예 1 및 코지산을 각각 0.001 중량%로 함유한 시료를 시험물질로 하여 일정 농도로 B16/F10 멜라노마 세포(한국세포주은행)의 배양액에 첨가하여 3일간 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하고 1N NaOH로 세포를 녹여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험물질을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 각 시험물질의 멜라닌 생성 저해 정도를 측정하였다. 수학식 6에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 22에 나타내었다.
Figure pat00016
시험물질 멜라닌생성 억제율(%)
대조군(무첨가) 0
코지산 53
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 62.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 63
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 51
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 45
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 62
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 65
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 70
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 35
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 65
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 55
상기 표 22의 결과에서, 본 발명에 의한 차나무 뿌리 유래 사포닌을 함유하는 제형예 1~10의 화장료 조성물의 멜라닌 생성 억제율이 공지된 멜라닌 생성 저해제인 코지산보다 훨씬 높아 미백 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
[시험예 17] 아토피 증상 개선 효과
<가려움 완화 평가>
실험 하루 전 각질형성세포(세포주명: HaCaT 입수처: ATCC)를 96 웰(well) 플레이트에 4x104세포수/웰이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, HBSS(Hanks' Balanced Salt solution) 버퍼로 96 웰 플레이트를 2회 워싱(washing)한 후, 반응 버퍼(2μM Fluo-4-AM, 20% pluronic acid, 2.5mM probenecid)를 세포에 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 30분, 상온에서 30분간 반응시킨 후, HBSS 버퍼로 2회 워싱하고 차나무 뿌리 유래 사포닌 0.1% 로 세포를 처리하였다. 이 때, 대조군으로는 시험물질을 처리하지 아니한 배지를 사용하였다.
10분간 반응시킨 후, 2U/ml 트립신(Trypsin) 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV)를 처리하고 80초간 세포 내 Ca2+ 농도 변화를 측정하였다. 세포 내 Ca2+ 농도 변화 측정은 플렉스테이션3(FlexStation3: Molecular Device, USA)를 이용하였다. 2U/ml 트립신(Trypsin) 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV) 처리 후 80초간의 플렉스(flex)를 측정하여 얻어낸 값의 최소값과 최대값의 차를 구한 후, 그 값을 2U/ml 트립신 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV) 처리 시의 최소값과 최대값의 차와 비교하여 칼슘 이온들의 세포 내 유입에 대한 억제율(%)을 하기 표 23에 나타내었다.
구분 칼슘 이온들의 세포 내 유입에 대한 억제율(%)
트립신
(2U/ml)		 PAR-2 활성 펩타이드
(5μM)
무처리 대조군(conrol) 10 15
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 21 25
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 18 19
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 20 19
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 11 28
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 11 15
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 19 20
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 25 21
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 24 26
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 15 25
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 20 30
상기 표 23에서 알 수 있듯이, 차나무 뿌리 유래 사포닌을 처리한 경우에 트립신 또는 PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV)에 의한 세포 내 칼슘 이온들의 유입이 감소됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 가려움을 유발시키는 PAR-2 활성을 효과적으로 억제함으로써 우수한 항소양 효과를 제공할 수 있다.
<항염증 효능 평가>
실험 하루 전 피부 각화상피세포(Normal human skin keratinocyte, NHEK, 입수처: Lonza)를 96 웰(well) 플레이트에 5x104 세포수/웰이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, PBS로 세포를 2회 씻어주고 무혈청 KBM(serum free keratinocyte basement media)으로 갈아주었다. 각각의 웰에 차나무 뿌리 유래 사포닌을 30ppm 처리하여 30분간 반응시킨 후, PGSA(10㎍/㎖), PGSA(50㎍/㎖), PGSA(50㎍/㎖)+LPS(1㎍/㎖)를 각각 처리하였다. 이 때, 대조군으로는 시험물질을 처리하지 않은 배지를 사용하였다. 여기서, PGSA(peptidoglycan from S. aureus )는 포도상구균에서 추출한 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로서, 그람 양성(+) 균의 세포벽의 주요 구성 성분이고 박테리아의 세포막 성분들은 염증을 유발시키는 것으로 알려져 있으며, 특히 포도상구균의 경우 아토피 환자의 90% 정도가 이 균에 의한 2차 감염을 일으키는 것으로 보고되어 있다. LPS(lypopolysaccaride)는 그람 음성(-) 박테리아균의 세포막 주요 구성성분이며 염증 유발의 주 원인으로 알려져 있다.
24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후 배양액을 취하여 인터류킨-8(Interleukin-8, IL-8)에 대한 ELISA를 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 24에 나타내었다. ELISA는 제조회사(BD science)의 실험 방법을 이용하였다.
구분 IL-8 분비(pg/㎖)
무처리 대조군(Control) 935.12
PGSA(10㎍/㎖) 4812.60
PGSA(50㎍/㎖) 5895.08
PGSA(50㎍/㎖)+LPS(1㎍/㎖) 6814.91
차나무 뿌리 유래 사포닌 R1 6125.8
차나무 뿌리 유래 사포닌 R2 5955.4
차나무 뿌리 유래 사포닌 R3 6754.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R4 6814.5
차나무 뿌리 유래 사포닌 R5 5988.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R6 6125.3
차나무 뿌리 유래 사포닌 R7 6345.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R8 6855.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R9 6233.1
차나무 뿌리 유래 사포닌 R10 6533.4
상기 표 24에서 차나무 뿌리 유래 사포닌이 PGSA와 LPS에 의해 증가한 IL-8의 분비를 현저히 감소 및 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 PGSA와 LPS에 의해 증가한 IL-8의 분비를 현저히 감소시킴으로써 우수한 항염증 효과를 제공할 수 있다.

Claims (20)

  1. 차나무 뿌리 유래 사포닌을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌인 피부 외용제 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 사포닌은 하기 화학식 1 내지 10의 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00017

    [화학식 2]
    Figure pat00018

    [화학식 3]
    Figure pat00019

    [화학식 4]
    Figure pat00020

    [화학식 5]
    Figure pat00021

    [화학식 6]
    Figure pat00022

    [화학식 7]
    Figure pat00023

    [화학식 8]
    Figure pat00024

    [화학식 9]
    Figure pat00025

    [화학식 10]
    Figure pat00026
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 사포닌은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 항노화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 탄력 증진용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 보습용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 장벽 기능 강화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 각질형성세포 분화 유도용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 여드름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 항균용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 혈색 및 피부톤 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 모공 축소용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피지 조절용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 트러블 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 자극 생성 방어용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 미백용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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