KR20130020402A - 금속산화물의 절연막을 이용한 바이오 칩 - Google Patents

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wells
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이혜연
박배호
이주경
김아영
황인록
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건국대학교 산학협력단
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Abstract

형광 물질 등의 표시를 하지 않고, 특정한 단백질을 신속, 간편하게 검출하는 것이 가능해지고, 또한, 측정 정밀도가 향상된 바이오 칩을 제공한다.
기판 상에 형성한 전극 배선을 TiO2, SiO2 등의 금속산화물의 절연막으로 피복하고, 이 절연막에 미세 가공 기술에 의해 1 또는 복수의 미소 웰을 형성하고, 각 웰의 바닥부에 프로브 물질을 고정화한 바이오 분자 어레이 칩을 제작한다.

Description

금속산화물의 절연막을 이용한 바이오 칩{Biochip using the insulated membrane of metal oxide}
본 발명은, 금속산화물의 절연막을 이용한 바이오 칩에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 복수의 웰이 형성된 금속산화물의 절연막을 가지고, 검출 감도가 향상된 바이오 칩에 관한 것이다.
최근, 신약 개발 프로세스, 의료 진단 등등의 분야에 있어서, 바이오 칩이 주목받아 연구 개발이 활발히 진행되고 있다.
바이오 칩이란, 고체표면상(고상화 담체로서는, 실리콘 기판, 유리 기판, 고분자, 금 기판 등)에 DNA 등의 핵산, 효소나 항체와 같은 단백질, 펩티드 등의 바이오 분자 어레이, 혹은 세포 등을 고정화하고, 고정화된 바이오 분자 어레이 등의 프로브 물질에 특정한 타겟 물질이 결합했을 때에 생기는 특이적인 반응을 검출하는 것이다[특허 문헌 1, 2].
또한, 프로브 물질로서, 리포솜, β-아미로이드 올리고머, 환원당을 이용한 바이오 칩도 제안되고 있다[특허 문헌 3, 4].
다양한 프로브 물질을 이용하는 것이 가능해져, 바이오 칩의 유용성은, 점점 증대되고 있다. 특히, 미량의 샘플을 이용하여 대량으로 하이스루풋(high throughput:동시에다수의샘플을반응처리가능한: 고속처리가능한)한 검출 및 해석을 할 수 있는 점에서, 대량으로 또한 동시 병행적인 처리가 요구되는 포스트 게놈 시대의 바이오 분자 어레이의 기능 해석 기술에는 바이오 칩 관련 기술이 필수가 되고 있다.
특허 문헌 1～4의 바이오 칩은, 기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선을 형성하고, 그 1 또는 복수의 전극 배선을 절연막으로 피복하고, 그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰을 형성하고, 이어서, 그 1 또는 복수의 웰의 바닥부에 프로브 물질을 고정화함으로써 제작한다.
이와 같은 바이오 칩의 상면도를 도 1에 도시한다. 여기에서는, 유리 기판(10) 상에 8개의 전극 배선(13)을 형성하고, 한번에 8점 측정이 가능한 바이오 칩(1)을 형성한다.
전극 배선(13)의 한쪽의 단부에는 바이오 분자 어레이 영역(131)이 형성되고, 다른 쪽의 단부에는 바이오 분자 어레이 영역에서 검출한 전기적 신호를 취출하기 위한 패드(132)가 형성되어 있다.
도 2에 바이오 분자 어레이 영역(131)의 확대 상면도를 도시한다. 바이오 분자 어레이 영역(131) 상에는 절연성 레지스트막(14)이 형성되고, 이 절연막에 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써, 바이오 분자를 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰(131a)이 형성되어 있다.
바이오 분자 어레이 영역(131)에는, 웰(131a)의 직경이 5㎛ 이상인 경우, 도 2a에 도시하는 바와 같이 단일의 웰을 형성할 수 있고, 웰(131a)의 직경이 서브마이크론 이하 20㎚ 정도까지인 경우, 도 2b에 도시하는 바와 같이 복수의 웰을 배열시킬 수 있다.
바이오 분자 어레이 영역(131)의 단면도를 도 3a에 도시한다. 여기에서는, 유리 기판(10) 상에, 우선, Ti 박막(13a)을 형성하고, 그 위에 Au 박막(13b)을 형성함으로써, Au/Ti 적층 박막으로 이루어지는 전극 배선(13)을 형성했다. Au 박막을 직접 유리 기판에 형성할 수도 있지만, Au 박막의 접착 강도가 약하므로, Au 박막의 박리를 방지하고, 바이오 칩의 신뢰성을 향상시키기 위해 Ti 박막을 이용했다. Ti 이외에 Cr을 이용할 수도 있다.
이 도면이 도시하는 바와 같이, 절연성 레지스트막에 형성된 구멍은, 하부층의 전극 배선의 표면에까지 도달하고 있다. 즉, 바이오 분자 어레이 영역에 형성된 웰의 측면은 절연성 레지스트막(14)에 의해 정해지고, 웰의 바닥부는 전극 배선(13)의 표면에 의해 정해져 있다.
이 구성에 의해, 도 3b에 도시하는 바와 같이, 웰(131a)의 바닥부의 노출된 전극 표면 상에만 프로브가 되는 바이오 분자를 고정화한다. 이 도면에 있어서, 전극 표면 상에 지방질 2중층(4)을 고정화하고, 그 위에 프로브 단백질(2)을 고정화하고 있다.
이와 같은 바이오 칩을 제작하기 위해, 반도체 제조 기술 중 하나인 포토 패브리케이션 기술을 이용할 수 있다. 여기에서는, "포토 패브리케이션 기술"이라는 용어는, 포토리소그래피 기술, 증착 기술, 에칭 기술 등을 조합시킨 기술을 의미한다.
포토 패브리케이션 기술은 이미 IC나 LSI 제조 기술의 하나로서 확립되어 있기 때문에, 종래의 DNA 칩과 같이 소형화나 제조 공정의 자동화가 가능하고, 칩의 대량 생산이나 저가격화로 이어진다.
도 4 ~ 도 9는, 포토 패브리케이션 기술에 의해 바이오 칩을 제작하는 공정을 도시하는 개략도이다.
우선, 직경 5㎛ 이상의 단일 웰을 제작하는 공정에 대해 설명한다. 기판(10) 상에 스핀 코터를 이용하여 감광성 재료인 포토레지스트(11)를 도포하고, 90℃에서 2분간 베이킹한다(도 4a, 4b). 이 설명에서는 유리 기판을 이용했지만, 알루미나 기판, 실리콘 기판, 또는, 실리콘 수지와 같은 수지제 기판 등 어떠한 재질의 기판도 이용할 수 있다.
이어서, 포토마스크를 이용하여 자외선(12a)으로 20초간 노광하고(도 4c), 포토레지스트(11)를 현상하여 전극 배선(13)용의 배선 패턴을 형성한다(도 4d). 포토레지스트에는, 노광에 의해 결합이 분해되어 현상액에 용해되는 것(포지티브형)과, 반대로 중합하여 용해되지 않는 것(네거티브형)이 있으나, 여기에서는 포토레지스트(11)로서 포지티브형 레지스트(AZ1500 : 클라리언트 저팬 주식회사)를 이용한다.
그 후, 진공 증착이나 RF 스퍼터링 등의 증착 기술에 의해 기판 상에 전극 재료가 되는 금속 박막을 형성한다(도 4e).
또한, 이것을 아세톤과 같은 유기 용매 중에 침지하여, 레지스트(11)를 박리함으로써, 유리 기판(10) 상에 전극 배선(13)을 형성한다(도 4f). 전극 배선(13)이 형성된 칩의 개략 상면도를 도 6a에 도시한다. 도 6에 있어서, 한쪽의 단부에 원형의 바이오 분자 어레이 영역(131)이 형성되고, 다른 쪽의 단부에는 전기적 신호를 취출하기 위한 각형 패드(132)가 형성된 전극 배선이 도시되어 있으나, 이것은 전극 배선의 일례로서, 이 형상에 한정되는 것이 아니다. 당업자라면, 바이오센서에 탑재되는 바이오 칩으로서 사용할 수 있는 어떠한 형상으로도 변형할 수 있다.
또한, 전극 배선의 개수도, 사용의 형태에 적합하게 하여, 적절히 증감할 수 있다.
다음에, 스핀 코터를 이용하여 전극 배선(13)이 형성된 기판 상에 절연성 레지스트(14)(AZ1500)를 도포하고, 90℃에서 2분간 베이킹한다(도 5a). 이어서, 포토마스크(12b)를 이용하여 자외선(12a)으로 20초간 노광하고(도 5b), 레지스트(14)를 현상함으로써 전극 표면을 노출시켜, 바이오 분자 어레이 영역(131) 상에 웰(131a)을 형성한다(도 5c). 이것을 150℃에서 5분간 베이킹함으로써, 레지스트(14)를 고착시킨다(도 5d). 웰이 형성된 칩의 개략 상면도를 도 6b에 도시한다.
다음에, 직경이 서브마이크론 이하의 웰의 어레이를 제작하는 공정을 설명한다. 직경 5㎛ 이상의 단일 웰을 제작했을 때와 마찬가지로 하여 전극 배선을 형성하고(도 4), 그 후, 도 5a에 도시하는 공정과 마찬가지로, 스핀 코터를 이용하여 전극 배선(13)이 형성된 기판 상에 절연성 레지스트(14)(ZEP520:일본 제온 주식회사)를 도포하고, 90℃에서 2분간 베이킹한다(도 7a). 이어서, 75kV로 전자 빔(15)을 조사하고(도 7b), 레지스트(14)를 현상함으로써 전극 표면을 노출시켜, 바이오 분자 어레이 영역(131) 상에 복수의 웰(131a)의 배열을 형성한다(도 7c). 이것을 200℃에서 5분간 베이킹함으로써, 레지스트(14)를 고착시킨다(도 7d). 웰이 형성된 칩의 개략 상면도를 도 8에 도시한다.
종래의 반도체 제조 기술을 이용하면, 기판 상에 웰을 형성할 수 있으므로, 상기의 조건에 한정되지 않고, 적절하게 당업자에게 잘 알려진 다른 조건으로 웰을 형성할 수 있다.
다음에, 생물 화학 분야에서 잘 알려져 있는 방법을 이용하여, 웰 바닥부의 전극 표면 상에 지방질 2중층을 형성한다. 구체적으로는, 우선, 칩을 피란하(piranha) 용액(H2O2:H2SO4=1:3[v/v])에 10분간 침지하여 웰 바닥부의 전극 표면 상의 유기 불순 물질을 제거하고, 순수(純水)충분히 세정하고, 에탄올로 세정한 후(도 9a), 1-옥탄데칸티올(ODT)(3)의 에탄올 용액에 침지하여 ODT(3)를 그 -SH기를 통하여 전극 표면에 결합시킨다(도 9b).
이어서, 인산 버퍼(PBS, pH7.4) 중에 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포코올린(POPC)(4)을 용해하여(10mM), POPC(4)의 리포솜 용액을 조제한다. 이 리포솜 용액을 칩에 적하하고, 습도 100%의 환경에서 1시간 정치(靜置)하여, 전극 표면 상에 POPC(4)의 지방질 ２중층을 형성한다(도 9c).
혹은, 99.9몰％의 POPC(4) 및 0.1몰％의 ODT(3)를 클로로포름 중에서 잘 혼합한 후, 용매를 PBS로 교환하여 혼합 리포솜 용액을 조제하고, 이 리포솜 용액을 칩에 적하하여, 전극 표면 상에 POPC(4)의 지방질 ２중층을 형성한다(도 9c).
어느 쪽의 경우도, 웰 바닥부의 전극 표면에만 지방질 ２중층이 고정화되도록, 상기의 레지스트(14)는 ODT의 -SH기가 결합되지 않은 재료일 필요가 있다.
다음에, 1mM의 (11-훼로세닐)운데실폴리옥시에틸렌(Fe-PEG)(5) 및 0.1mM의 비오틴화한 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(Bio-PE)(21)의 인산 버퍼 혼합 용액(pH7.4)을 지방질 ２중층이 형성된 칩에 적하하고, 1시간 방치하여 지방질 ２중층 상에 Fe-PEG(5) 및 Bio-PE(21)를 앵커한다(도 9d). 이때, Fe-PEG(5) 및 Bio-PE(21)의 혼합 용액 중의 몰 농도비를 적절히 조정함으로써, Bio-PE(21)가 분산되어 적당한 밀도로 지방질 ２중층 상에 앵커되도록 한다.
지방질 ２중층은 절연성이므로, 지방질 ２중층 상에서의 현상을 전기적 신호로서 검출하는 것이 불가능하다. 따라서, 지방질 ２중층 표면을 도전성으로 할 목적으로, Fe-PEG(5)를 이용한다.
또한, 이 비오틴 수식 지방질 ２중층이 형성된 칩에 0.2mg/ml의 스트렙트아비딘(22)의 수용액을 적하하고, 습도 100%의 환경에서 1시간 정치하여, Bio-PE(21)의 비오틴과의 특이적 결합에 의해, 스트렙트아비딘(22)을 결합시킨다(도 9e). PBS로 세정함으로써, 지방질 ２중층에 고정화되어 있지 않은 미결합의 스트렙트아비딘을 제거한다.
스트렙트아비딘은, 비오틴과 생물학적으로 가장 강고하고 안정적으로 결합(Kd=10-15M)하는 단백질로서, 4분자의 비오틴과 결합한다.
스트렙트아비딘-비오틴간의 특이적 결합을 이용하여, 스트렙트아비딘을 수식한 분자와, 비오틴을 수식한 또 하나의 분자를 결합시키는 방법이 일반적으로 이용되고 있다. 따라서, 다양한 단백질에 비오틴을 수식하는 기술이 이미 확립되고, 그것을 위한 키트도 시판되고 있다. 또한, 비오틴 수식한 DNA도 상업적으로 입수 가능하다.
Bio-PE(21)는 지방질 ２중층 상에 분산되어 앵커되고, 1개의 스트렙트아비딘 분자에는, 1개의 비오틴만 결합되어 있다고 생각된다.
마지막으로, 미리 비오틴화한 프로브 항체(23)의 용액에 스트렙트아비딘 고정화 칩을 침지함으로써, 스트렙트아비딘-비오틴의 특이적 결합을 통하여 프로브 항체(23)를 웰 바닥부에 고정화한다(도 9f).
스트렙트아비딘이 기판 상에 고정화되어 있는 경우, 비오틴의 유효 결합수는 1인 것이 이미 알려져 있다. 고정화에 의해 비오틴이 접근 가능한 스트렙트아비딘의 결합 부위가 한정되어 있기 때문이라고 생각된다. 특히, 본 발명의 경우, 비오틴에는 단백질이 결합되어 있으므로, 1개의 비오틴화 단백질이 스트렙트아비딘에 결합한 후, 입체 장해에 의해 더욱 비오틴화 단백질이 스트렙트아비딘에 접근할 수 없기 때문이라고 생각된다. 따라서, 1개의 고정화 스트렙트아비딘(22)에는 1개의 비오틴화 프로브 항체(23)가 결합되어 있으면 충분하다고 생각된다.
이와 같은 바이오 칩을 제작하기 위해, 나노임프린팅 리소그래피(NIL) 기술을 이용할 수도 있다.
최근, 나노임프린트 리소그래피(NIL) 기술은, 일렉트로닉스, 포토닉스, 자기 디바이스, 바이올로지 등 다양한 분야에 있어서, 고해상도이고 나노 스케일의 패턴을 형성하기 위한 가장 기대되는 기술 중 하나이다.
NIL 기술은, 수지층에 몰드(스탬프 또는 템플릿이라고도 함.)를 압박함으로써 수지층에 패턴 형성하는 기술로서, 열 NIL 기술 및 광 NIL 기술이 있다. 열 NIL 기술에서는, 열가소성 수지의 층에, 그 유리 전이점 이상의 온도에서, 높은 압력으로 경질의 몰드를 압박하고, 그 상태로 냉각한 후, 몰드를 제거함으로써, 수지층에 패터닝을 행한다. 또한, 광 NIL 기술에서는, 광경화성 수지의 층에 몰드를 압박하고, 그 상태로 UV 등의 광을 조사한 후, 몰드를 제거함으로써, 수지층에 패터닝을 행한다.
또한, 하이스루풋하고 또한 저가격으로 대면적에 릴리프 패턴을 형성하는 NIL 기술로서, 스텝·앤드·플래시·임프린트·리소그래피(SFIL)가 있다. SFIL은, 저온 저압의 조건하에서 행하는 UV-NIL이다. SFIL에서는, 저점도의 광경화성 수지를 기판 상에 적하(滴下)하는 것만으로 수지층을 형성하기 때문에, 스핀 코트를 행할 필요가 없다. 이 기술에 의해, 대면적에 대하여 100㎚ 이하 사이즈의 미소 패턴을 형성할 수 있다[비특허 문헌 1～5].
특허 문헌 5는, NIL 기술을 이용하여, 도 1～4에 기재된 것과 마찬가지의 구성의 바이오 칩을 제작한다.
도 10은, NIL 기술에 의해 바이오 칩을 제작하는 공정을 도시하는 개략도이다.
(1) UV-NIL법
UV 경화성 수지를 이용하여, SiO2 기판 상에 나노 패턴을 형성하는 절연성 레지스트 수지층을 형성한다.
우선, SiO2 기판(16) 상에, 1 중량％의 DMPA를 함유하는 에탄올로 희석한 30 중량％의 UV 경화성 수지를 3000rpm으로 20초간 스핀 코트하여 450㎚ 두께의 UV 경화성 수지의 수지층(17)을 형성한다. 이어서, 핫플레이트 상에서 70℃에서 3분간 예비 가열 처리를 행하여, 용매를 제거한다(도 10a).
몰드(18)를 감압하 및 실온에서, 0.2MPa의 압력으로 1분간 수지층(17)에 압박한다(도 10b). 사용하는 UV 경화성 수지는 저점도의 액체이므로, 실온에서 저압으로 임프린트를 행할 수 있다.
UV 램프를 장착한 나노임프린트 장치(NM-401:메이쇼키코 주식회사 제)를 이용하여, 몰드(18)에 압력을 부하한 상태로, UV 경화성 수지의 수지층(17)에 365㎚의 UV 광(19)을 1분간 조사함으로써(자외선량 200mJ/㎠), UV 경화성 수지의 수지층(17)을 경화하여 경화막(17a)을 형성한다.
몰드(18)를 기판으로부터 제거하고(도 10c), 나노 패턴이 형성된 UV 경화성 수지의 경화막(17a)을 120℃에서 1시간 가열 처리하여, 기계 강도 및 용매 내성을 강화한다.
(2) 열-NIL법
열경화성 수지를 이용하여, SiO2 기판 상에 나노 패턴을 형성하는 절연성 레지스트 수지층을 형성한다.
우선, UV-오존 클리너를 이용하여 세정한 SiO2 기판(16) 상에, 열경화성 수지를 3000rpm으로 20초간 스핀 코트하여 120㎚ 두께의 열경화성 수지의 수지층(17)을 형성한다. 이어서, 핫플레이트 상에서 80℃에서 10분간 예비 가열 처리를 행하여, 용매를 제거한다(도 10a).
그 후, UV 광(9)을 조사하는 대신에, 열경화성 수지의 수지층(17)에 비교적 높은 온도(150℃) 및 압력(10MPa)에서 5분간 몰드(18)를 압박한다(도 10b).
몰드(18)에 압력을 부하한 상태로, 열경화성 수지의 수지층(17)을 냉각함으로써, 열경화성 수지의 수지층(17)을 경화한다. 그 후, 몰드를 기판으로부터 제거하고(도 10c), 열경화성 수지의 경화막(17a)을 형성한다.
이 도면에서는, NIL법을 이용하여 웰을 형성하는 방법만을 도시하고 있으나, 기판(16) 상에 전극 배선을 형성한 후, 전극 배선 상에 웰을 형성할 수 있다. NIL법으로 웰을 형성하면, 두께가 10~15 나노미터 정도의 얇은 경화막이 전극 배선 표면에 잔존한다. 이와 같은 불필요한 경화막은 O2 플라즈마(150W ICP, RIE 30W, 250mTorr, 49sccm O2), 및 에칭 유도 결합 플라즈마 반응성 이온(ICP-RIE)에 의한 드라이 에칭을 30초간 행하여 제거하고, 전극 표면을 노출시켜, 바이오 분자 어레이 영역 상에 복수의 웰의 배열을 갖는 바이오 칩을 형성할 수 있다.
특허 문헌 1～6에 개시 또는 시사된 바이오 칩을 작용 전극으로서 이용하고, 그 외에, 적어도 대극(對極) 및 참조 전극을 포함하는 바이오센서를 제작하면, 바이오 칩 상의 프로브 물질에 타겟 분자가 상호 작용했을 때의 전기 신호의 변화를 고감도로 검출할 수 있고, 시료 중의 타겟 분자의 존재를 검지하고, 더 나아가 그 존재량을 측정할 수 있다. 통상, 전기 신호로서 산화 환원 전류를 사용한다.
타겟 분자의 종류에 따라, 프로브 물질을, DNA, 항체 등의 단백질, 리포솜, β-아미로이드 올리고머, 환원당 등을 이용하여, 폭넓은 분야에서의 측정이 가능해 진다.
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[특허 문헌 2] 일본 특허 제4497903호 명세서
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특허 문헌 1～6에 개시된 바이오 칩을 작용 전극으로서 이용한 바이오센서는, 매우 유용하지만, 본 발명자들은, 얻어지는 산화 환원 전위가 측정할 때마다 크게 변동하는 것에 착안했다. 본 발명자들은, 이 산화 환원 전위의 변동은, 바이오 칩의 절연성 레지스트막의 습윤에 기인하는 것을 알아냈다. 즉, 바이오 칩의 절연막에 레지스트 조성물을 이용하고 있으므로, 바이오 칩을 측정 시료에 침지하고 있을 때에 수지 조성물이 물에 의해 습윤함으로써, 절연성 레지스트막의 막 두께나 절연성에 변화가 생기고, 얻어지는 산화 환원 전위에 영향을 주고 있다고 생각된다.
따라서, 본 발명의 목적은, 절연성 레지스트막의 습윤에 의해, 센서의 측정 변동을 발생시키지 않는 바이오 칩을 제공하는 데 있다.
본 발명은, 프로브 물질을 고정화하기 위한 웰의 어레이가 형성된 바이오 칩으로서, 웰의 바닥부에는 바이오 칩 상의 전극 배선이 노출되어 있다. 금속산화물의 절연막에 형성된 복수의 웰의 바닥부에, 검출 대상에 의해 적절한 프로브 물질을 고정할 수 있다.
보다 상세하게는, 본 발명은, 프로브 물질을 배열하여 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩으로서, 기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선이 형성되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선은, 금속산화물의 절연막으로 피복되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에, 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오 칩에 있어서, 그 1 또는 복수의 웰 바닥부에 노출된 전극 배선 표면 상에, 핵산, 단백질, 펩티드, 리포솜, β-아미로이드 올리고머 및 환원당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브 물질을 고정화 할 수 있다.
본 발명의 바이오 칩에 있어서, 그 금속산화물이, TiO2, SiO2, ZnO로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은, 적어도, 작용 전극, 대극(antipole,對極) 및 참조 전극을 포함하는 바이오센서로서, 여기에, 그 작용 전극은, 본 발명의 바이오 칩, 즉, 프로브 물질을 배열하여 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩으로서, 기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선이 형성되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선은, 금속산화물의 절연막으로 피복되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에, 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩으로서, 그 1 또는 복수의 웰 바닥부에 노출된 전극 배선 표면 상에, 핵산, 단백질, 펩티드, 리포솜, β-아미로이드 올리고머 및 환원당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브 물질이 고정화되고, 처리 전에, 그 바이오 칩의 제1 전기적 신호를 측정하고, 그 바이오 칩을 시험 용액 중에서 처리한 후, 그 바이오 칩의 제2 전기적 신호를 측정하고; 이어서, 제1 전기적 신호와 제2 전기적 신호의 강도 차로부터, 시험 용액 중에 존재하는, 그 1 또는 복수의 프로브 물질과 특이적 결합하는 비표시 타겟 분자(unlabeled target molecules)를 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
여기에서, "처리"란, 프로브 물질과 비표시 타겟 분자를 특이적 결합시키기 위해 필요한 프로세스를 말한다. 따라서, 처리 전, 바이오 칩에 있어서는, 그 1 또는 복수의 프로브 물질에는 비표시 타겟 분자가 결합되어 있지 않다. 또한, 시험 용액 중에 그 비표시 타겟 분자가 존재하고 있으면, 이 처리에 의해, 그 1 또는 복수의 프로브 물질에 비표시 타겟 분자가 특이적 결합한다. 본 발명의 바이오 칩에 상기의 처리를 행하기 전후에, 전기적 신호를 측정하고, 전기적 신호에 변화가 있으면, 그 시험 용액 중에, 비표시 타겟 분자가 존재하고 있었음을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 특히, 전기적 신호로서 산화 환원 전류값을 이용한다.
즉, 본 발명에 따르면, 비표시 타겟 분자의 프로브 물질에의 특이적 결합의 유무를 바이오 칩의 바이오 분자 어레이 상의 산화 환원 상태의 변화로부터 검출한다. 따라서, 타겟 분자에 형광 물질 등을 표시하지 않고, 산화 환원 전류값을 측정 하는 것만으로 특이적 결합을 검출할 수 있으므로, 신속하고 또한 간편한 측정이 가능해진다.
즉, 프로브 물질에 타겟 분자가 결합되어 있지 않은 계에서 측정한 전기적 신호와 프로브 물질에 타겟 분자가 결합한 계에서 측정한 전기적 신호 사이에 통계학적으로 유의한 변화가 있는 경우, 당해 유의한 변화를 타겟 분자와 프로브 물질과의 특이적 결합에 관련지을 수 있다.
본 발명은 또한 프로브 물질을 배열하여 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩의 제조 방법으로서, 기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선을 형성하고, 그 1 또는 복수의 전극 배선을 금속산화물의 절역막으로 피복하고, 이어서, 그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에, 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰을 형성하는, 바이오 칩의 제조 방법도 제공한다.
본 발명의 바이오 칩은, 종래의 어떠한 기술을 적용하여 제작해도 좋다.
특히, 본 발명의 바이오 칩의 제조 방법에 있어서, 그 금속산화물의 절연막에 웰을 형성하는 기술이, 나노임프린팅 기술, KrF 스테퍼 패터닝, E-빔법, 수속 이온빔법으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바이오 칩은 금속산화물을 절연막으로서 이용하므로, 시료 용액에 침지했을 때, 레지스트를 절연막으로서 이용하는 종래의 바이오 칩과 비교하여, 습윤에 의한 전기적 특성에의 악영향이 없으므로, 안정된 측정이 가능해진다.
또한, 본 발명의 바이오 칩은 금속산화물을 절연막으로서 이용하므로, 레지스트를 절연막으로서 이용하는 종래의 바이오 칩과 비교하여, 웰의 사이즈를 작게 만들 수 있으므로, 웰 내부에 단백질 등의 프로브 물질을 고정화할 때, 웰 내부에 다수의 프로브 물질을 끌어들이게 되는 것이 감소되고, 프로브 물질의 센싱 능력이 향상되기 때문에, 보다 높은 정밀도의 측정이 가능해진다.
도 1은 종래예의 바이오 칩의 상면도이다.
도 2는 종래예의 바이오 칩의 바이오 분자 어레이 영역의 상면도이다.
도 3은 종래예의 바이오 분자 어레이 영역의 단면도이다.
도 4는 포토 패브리케이션 기술에 의한 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 5는 포토 패브리케이션 기술에 의한 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 6은 포토 패브리케이션 기술에 의한 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 7은 포토 패브리케이션 기술에 의한 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 8은 포토 패브리케이션 기술에 의한 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 9는 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 10은 나노임프린트 리소그래피 기술에 의한 종래의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 11은 포토 패브리케이션 기술에 의한 본 발명의 바이오 칩의 제조 공정을 설명하는 개략도이다.
도 12는 본 발명의 바이오 칩의 바이오 분자 어레이 영역의 상면의 전자현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예의 바이오 칩의 볼타메트리 측정 결과이다.
도 14는 비교예의 바이오 칩의 볼타메트리 측정 결과이다.
실시예 1 [금속산화막을 절연막으로 하는 바이오 칩]
(1) 바이오 칩의 제조
일반적인 전자 빔(e-빔) 리소그래피법을 이용하여 나노 사이즈의 웰을 갖는 바이오 칩을 제조했다.
우선, 도 4의 (ａ)～ (f)와 같이 종래의 방법과 마찬가지로 기판 상에 전극을 형성한다.
다음에, 스핀 코팅법(5000rmp:60초)을 이용하여, 전극 상에 ｅ-빔용 레지스트(폴리메틸메타크릴레이트)의 2% 클로로벤젠 용액을 150nm 두께로 코팅하고, 열처리 과정을 거쳐 경화한 레지스트막(61)을 형성했다(도 11a).
경화한 레지스트막(61)에, 소정의 패턴으로 전자 빔(62)을 조사하고(도 1lb), 그 후, 기판을 현상 용액(메틸에틸케톤:이소프로필알코올=1:3)에 30초 동안 침지함으로써 레지스트막(61)을 현상했다(도 11c).
이 후, 일반적인 금속 산화 증착 장치를 이용하는 직류 마그네트론 스퍼터링법(금속 타겟, 상온 증착, 압력:5mTorr, DC 전력:60W)에 의해, SiO2를 증착하여 금속산화물막(63)을 형성했다(도 11d).
또한, 기판을 아세톤에 30분 이상 침지하여 증착 후에 남은 레지스트막(61) 및 레지스트 상에 증착한 SiO2를 제거함으로써, 전극 표면을 노출시켜, 복수의 웰(63a)의 배열을 형성했다(도 11e). 얻어진 바이오 칩 개략 상면도는 도시하지 않지만, 도 8과 마찬가지이며, 절연성 레지스트막(14)이 금속산화물(여기서는, SiO2)의 절연막(63)인 점이 상위하다.
상기의 방법으로, 직경 60㎚이고 깊이가 40㎚로 사이즈가 매우 작은 웰의 어레이가 형성되었다. 웰의 어레이 부분의 전자현미경 상을 도 12에 도시한다.
다음에, 도 9a ~ 9f에 도시하는 종래예와 같이, 노출된 전극 배선 상에 스트렙트아비딘을 고정화한 바이오 칩(A)을 제작했다.
(2) 전기 화학적 측정
BAS100B/W 퍼텐쇼스탯(Bioanalytical Systems, Inc.)을 이용하여, 실온에서 바이오 칩의 전기 화학적 측정을 행했다. 측정 시에는, 바이오 칩을 작용 전극으로 하고, 3M KCL 중의 Ag/AgCl을 참조 전극으로 하고, 플래티나 선을 대전극으로 했다(1mM).
각 EC 측정 전에는, 나노 사이즈의 웰의 어레이를 형성한 바이오 칩을 H2SO4 용액 중에서 +1.7V로 1분간 예비 처리를 행했다.
사이클릭 볼타메트리(CV) 측정은, 100mM 인산 완충 생리식염수(pH7.4)를 함유하는 용액 중에서, 스캔 속도 200mV/초로 행했다. CV 측정의 설정은 이하와 같다.
초기 전위:-0.3V, 최종 전위:0.6V, 진폭:25mV, 스텝 전위:4mV, 주기:50Hz.
바이오 칩(A)을 용액에 침지한 직후 및, 침지 후 30분에서 240분까지, CV 곡선을 얻은 결과를 도 13에 도시한다.
도 13의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 금속산화막을 절연막으로서 이용한 바이오 칩은 장시간 용액에 침지해도 CV 곡선의 변동이 없고, 매우 안정되게 측정할 수 있는 것이 도시되었다.
상기의 방법으로 만든 나노 구조의 바이오센서는 기존의 폴리머를 이용하여 제작했을 때보다 작은 크기의 제작이 용이하고, 폴리머보다 내구성 및 안정성 특히 메탈 산화물의 절연성이 매우 좋기 때문에 바이오센서의 성능을 향상시키는 데도 좋다는 것을 알 수 있었다.
비교예 1 [레지스트막을 절연막으로 하는 바이오 칩]
(1) 바이오 칩의 제조
직경 5㎛ 이상의 단일 웰을 제작했을 때와 마찬가지로 하여 전극 배선을 형성하고(도 4), 그 후, 도 5a에 도시하는 공정과 마찬가지로, 스핀 코터를 이용하여 전극 배선(13)이 형성된 기판 상에 절연성 레지스트(14)(ZEP520:일본 제온 주식회사)를 도포하고, 90℃에서 2분간 베이킹한다(도 7a). 이어서, 75kV로 전자 빔(15)을 조사하고(도 7b), 레지스트(14)를 현상함으로써 전극 표면을 노출시켜, 바이오 분자 어레이 영역(131) 상에 복수의 웰(131a)의 배열을 형성했다(도 7c). 이것을 200℃에서 5분간 베이킹함으로써, 레지스트(14)를 고착시켰다(도 7d). 웰이 형성된 칩의 개략 상면도는 도 8에 도시한 것과 마찬가지이다.
다음에, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 노출된 전극 배선 상에 스트렙트아비딘이 고정화된 바이오 칩(B)을 제작했다.
(2) 전기 화학적 측정
실시예 1과 동일한 조건으로, 사이클릭 볼타메트리(CV)법에 의해 바이오 칩의 전기 화학적 측정을 행했다.
바이오 칩(B)을 용액에 침지한 직후 및, 침지 후 20분에서 120분까지, CV 곡선을 얻은 결과를 도 14에 도시한다.
도 14의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 레지스트를 절연막으로서 이용한 바이오 칩은 용액에 침지하면, CV 곡선이 크게 변동했다.
종래의 레지스트막을 절연막으로서 이용하는 바이오 칩과 비교하면, 측정 안정성이 높기 때문에, 정밀도가 높은 측정을 요하는 분야에 응용할 수 있다.
1 : 바이오 칩
10 : 기판
11 : 포토레지스트
12a : 자외선
12b : 포토마스크
13 : 전극 배선
131 : 바이오 분자 어레이 영역
131a, 131b : 웰
132 : 패드
14 : 절연성 레지스트막
15 : 전자 빔
16 : 기판
17 : 수지층
17a : 경화막
18 : 몰드
19 : UV 광
2 : 프로브
21 : 비오틴화 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(Bio-PE)
22 : 스트렙트아비딘
23 : 비오틴화 프로브 항체
3 : 1-옥탄데칸티올(ODT)
4 : 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포코올린(POPC)
5 : (11-훼로세닐)운데실폴리옥시에틸렌(Fe-PEG)
61 : 전자 빔 리소그래피용 레지스트
62 : 전자 빔
63 : 금속산화막
63a : 웰

Claims (7)

  1. 프로브 물질을 배열하여 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩으로서, 기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선이 형성되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선은, 금속산화물의 절연막으로 피복되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에, 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    그 1 또는 복수의 웰 바닥부에 노출된 전극 배선 표면 상에, 핵산, 단백질, 펩티드, 리포솜, β-아미로이드 올리고머 및 환원당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브 물질이 고정화되어 있는, 바이오 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    금속산화물이, TiO2, SiO2, ZnO로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 바이오 칩.
  4. 적어도, 작용 전극, 대극 및 참조 전극을 포함하는 바이오센서로서, 여기에, 그 작용 전극은, 프로브 물질을 배열하여 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩으로서, 기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선이 형성되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선은, 금속산화물의 절연막으로 피복되고, 그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에, 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩으로서,
    그 1 또는 복수의 웰 바닥부에 노출된 전극 배선 표면 상에, 핵산, 단백질, 펩티드, 리포솜, β-아미로이드 올리고머 및 환원당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브 물질이 고정화되고,
    처리 전에, 그 바이오 칩의 제1 전기적 신호를 측정하고,
    그 바이오 칩을 시험 용액 중에서 처리한 후, 그 바이오 칩의 제2 전기적 신호를 측정하고; 이어서,
    제1 전기적 신호와 제2 전기적 신호의 강도 차로부터, 시험 용액 중에 존재하는, 그 1 또는 복수의 프로브 물질과 특이적 결합하는 비표시 타겟 분자를 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  5. 제4항에 있어서,
    그 전기적 신호가, 산화 환원 전류값인 바이오센서.
  6. 프로브 물질을 배열하여 고정화하기 위한 1 또는 복수의 웰이 형성된 바이오 칩의 제조 방법으로서,
    기판 상에 1 또는 복수의 전극 배선을 형성하고,
    그 1 또는 복수의 전극 배선을 금속산화물의 절역막으로 피복하고, 이어서,
    그 1 또는 복수의 전극 배선의 각각의 일 영역상의 절연막에, 전극 표면에 도달하는 1 또는 복수의 구멍을 형성함으로써 1 또는 복수의 웰을 형성하는, 바이오 칩의 제조 방법.
  7. 그 금속산화물의 절연막에 웰을 형성하는 기술이, 나노임프린팅 기술, KrF 스테퍼 패터닝, E-빔법, 수속 이온빔법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제6항의 제조 방법.
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