KR20130014942A - 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (1) 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 배발생(embryogenic) 조직을 아그로박테리움(Agrobacterium)와 공조배양(co-cultivation)하는 제1단계; (2) 상기 제1단계로 부터 수득한 공조배양된 백합나무의 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 형질전환 배발생조직을 선발하는 제2단계; (3) 상기 제2단계로 부터 수득한 형질전환 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 체세포배 유도하는 제3단계; 및 (4) 상기 제3단계로 부터 수득한 체세포배에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 발아식물체를 재분화하는 제4단계; 를 포함하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법에 관한 것이다.
본 발명은 향후 바이오매스(biomass), 내충성 및 내한성 등의 기능성 백합나무 품종의 창생(創生) 및 그 실용화를 이루기 위한 필수적인 일련의 형질전환 및 그로부터 형질전환체 획득의 기술완성을 위해 필요한 것으로 백합나무 신품종육성 등에 관한 연구에 긍정적인 효과를 부여하는 유리한 효과가 인정된다고 할 것이다.

Description

백합나무 배발생조직의 형질전환 방법{The transformation method of Liriodendron tulipifera embryonic tissue}
본 발명은 형질전환에 관한 기술로서 보다 상세하게는 백합나무 배발생조직의 형질기술에 대한 것이다. 한편 본 발명의 발명자는 국책과제인 ‘BT 기반기술을 이용한 백합나무 대량생산 실용화’과제 수행 중 백합나무 배발생조직의 형질전환 기술을 개발하기에 이른 것이다.
백합나무(Liriodendron tulipifera)는 북아메리카가 원산지로 높이가 약 13m에 달하며 나무껍질은 잿빛과 검은빛이 섞인 갈색이다. 잎은 어긋나고 넓고 둥근 달걀 모양이며 길이와 나비는 6～18cm 정도이다.
백합나무의 꽃은 5～6월에 녹색을 띤 노란색으로 피고 가지 끝에 지름 약 6cm의 튤립 같은 꽃이 1개씩 달린다. 꽃받침조각은 3개, 꽃잎은 6개이다. 꽃잎 밑동에는 주황색의 무늬가 있다.
암술과 수술이 많고 꽃이 진 다음 꽃턱이 길이 7cm 정도 자란다. 열매는 폐과로서 10～11월에 익으며, 날개가 있고 종자가 1～2개씩 들어 있다. 미국에서는 생장이 빠르므로 중요한 용재수(用材樹)로 쓰나 한국의 중부 이남에서는 관상용으로 심는 것이 일반적이다.
관련 기술로는 본 발명자가 출원하여 등록받은 ‘체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법[특허등록번호 : 10-0889342]’ 이 있으며, 이 발명은 체세포배발생을 이용한 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 번식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백합나무의 번식방법에 있어서, 백합나무 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계, 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계, 상기 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키키는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 백합나무의 번식방법에 관한 것이다.
또 다른 관련 기술로는 본 발명자가 출원하여 공개된 ‘백합나무의 체세포배 발생 방법[출원공개번호 : 10-2011-0056056]’이 있으며, 이 발명은 백합나무의 체세포배 발생 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백합나무의 종자로부터 배발생조직을 증식하는 단계; 와 상기 증식된 배발생조직을 세포방사 배양법(cell spreading culture)을 이용하여 체세포배 발생시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합나무의 체세포배 발생 방법에 관한 것이다.
상기 관련 기술은 공히 백합나무를 대상으로 하는 점에서는 동일하지만, 본 발명은 배발생 조직의 형질전환을 기술적 특징으로 한다는 점에서 상이하다.
본 발명에서는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법을 제공함을 목적으로 한다. 특히 합나무의 배발생조직의 항생제(geneticin) 내성 임계 농도, 백합나무의 배발생조직과 아그로박테리움과의 형질전환 시간 등 구체적인 조건을 제시함을 목적으로 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 (1) 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 배발생(embryogenic) 조직을 아그로박테리움(Agrobacterium)과 공조배양(co-cultivation)하는 제1단계; (2) 상기 제1단계로 부터 수득한 공조배양된 백합나무의 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 형질전환 배발생조직을 선발하는 제2단계; (3) 상기 제2단계로 부터 수득한 형질전환 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 체세포배 유도하는 제3단계; 및 (4) 상기 제3단계로 부터 수득한 체세포배에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 발아식물체를 재분화하는 제4단계; 를 포함하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 아그로박테리움은 서열번호 1의 aux promoter, 서열번호 2의 외래 목적 유전자 및 선발표지유전자인 nptII유전자로 구성된 발현벡터 pBI121을 아그로박테리움 LBA 4404에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 상기 공조배양은 71~73시간인 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는 형질전환 배발생조직 선발을 위한 상기 제2단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 (a) 30mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 2주 동안 처리하는 제a단계; (b) 50mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 2주 동안 처리하는 제b단계; 및 (c) 70mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 4~6주 동안 처리하는 제c단계; 를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는 체세포배 유도를 위한 상기 제3단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 30mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 6~8주 동안 처리하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는 발아식물체 재분화를 위한 상기 제4단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 50mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 4주 동안 처리하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
한편 본 발명은 상기 방법 중 선택된 어느 하나의 방법으로 형질전환된 백합나무 배발생조직을 제공한다.
본 발명인 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법은 백합나무의 배발생조직을 아그로박테리움 (Agrobacterium)과 공조배양 후 형질전환된 조직 유도, 그로부터 체세포배 발생 및 식물체 재분화 (발아체)까지 획득하는 일련의 기술에 관한 것이다.
이에 본 발명은 향후 바이오매스(biomass), 내충성 및 내한성 등의 기능성 백합나무 품종의 창생(創生) 및 그 실용화를 이루기 위한 필수적인 일련의 형질전환 및 그로부터 형질전환체 획득의 기술완성을 위해 필요한 것으로 백합나무 신품종육성 등에 관한 연구에 긍정적인 효과를 부여하는 유리한 효과가 인정된다고 할 것이다.
도 1은 pAUX 유전자벡터 모식도에 관한 것이다.
pAUX : Agrobacterium tumefaciens aux gene promoter
pNOS : Nopaline synthase promoter
NPT II : Neomycin phosphotransferase II
TZS : Trans - zeatin synthase
도 2는 형질전환 예상 배발생조직에 관한 것이다.
도 3은 형질전환된 배발생조직으로부터 체세포배 유도에 관한 것이다.
도 4는 비형질전환 및 형질전환 조직 유래 체세포배 발아 비교에 관한 것이다.
도 5는 외래 DNA PCR 확인한 것이다.(N: non-transgenic, T1～38: Transgenic)
좌 : Primer, T-gene 1/T-gene 2
우 : Primer T-gene 1/TZS 2
도 6은 RT-PCR 활성 비교에 관한 것이다.
도 7은 비형질전환체 및 형질전환체의 기관 분화율 비교에 관한 것이다.
1 : 비형질전환체
2, 3, 4 : 형질전환체
도 8은 비형질전환체(왼쪽) 및 형질전환체(오른쪽)의 발아식물체 비교에 관한 것이다.
도 9는 비형질전환체 및 형질전환체의 기관 길이 비교에 관한 것이다.
1 : 비형질전환체
2, 3, 4 : 형질전환체
도 10은 비형질전환체 및 형질전환체의 엽록소 함량 비교에 관한 것이다.
1 : 비형질전환체
2, 3, 4 : 형질전환체
본 발명은 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (1) 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 배발생(embryogenic) 조직을 아그로박테리움(Agrobacterium)과 공조배양(co-cultivation)하는 제1단계; (2) 상기 제1단계로 부터 수득한 공조배양된 백합나무의 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 형질전환 배발생조직을 선발하는 제2단계; (3) 상기 제2단계로 부터 수득한 형질전환 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 체세포배 유도하는 제3단계; 및 (4) 상기 제3단계로 부터 수득한 체세포배에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 발아식물체를 재분화하는 제4단계; 를 포함하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 아그로박테리움은 서열번호 1의 aux promoter, 서열번호 2의 외래 목적 유전자 및 선발표지유전자인 nptII유전자로 구성된 발현벡터 pBI121을 아그로박테리움 LBA 4404에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 상기 공조배양은 71~73시간인 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는 형질전환 배발생조직 선발을 위한 상기 제2단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 (a) 30mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 2주 동안 처리하는 제a단계; (b) 50mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 2주 동안 처리하는 제b단계; 및 (c) 70mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 4~6주 동안 처리하는 제c단계; 를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는 체세포배 유도를 위한 상기 제3단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 30mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 6~8주 동안 처리하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
보다 상세하게는 발아식물체 재분화를 위한 상기 제4단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 50mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 4주 동안 처리하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법 중 선택된 어느 하나의 방법으로 형질전환된 백합나무 배발생조직에 관한 것이다.
본 발명에 기재된 geneticin은 하기의 화학식(1)과 같은 구조를 같는 aminoglycoside 항생제(antibiotic)이다.
Figure pat00001
...... 화학식(1)
또한 본 발명에 기재된 cefotaxime은 하기의 화학식(2)과 같은 구조를 같는 cephalosporin 항생제(antibiotic)이다.
Figure pat00002
...... 화학식(2)
이하 실험을 통해 검증한 본 발명의 기술적 특징 내지 임계적 의의를 중심으로 본 발명을 구체적으로 설명한다.
[1] 배발생조직의 생장과 geneticin 임계농도와의 관계실험
Figure pat00003

상기와 같이 배발생조직의 생장과 geneticin 임계농도와의 관계를 실험한 결과 백합나무 배발생조직의 항생제 (geneticin) 내성 임계농도는 30mg/L 임을 확인할 수 있었다.
[2] Agrobacterium과의 형질전환 시간에 따른 형질전환 조직 유도 효과 실험
Figure pat00004
상기와 같이 Agrobacterium과의 형질전환 시간에 따른 형질전환 조직 유도 효과를 실험한 결과 백합나무 배발생조직과 Agrobacterium과의 형질전환 시간은 30분임을 확인할 수 있었다.
[3] Acetosyringon 처리농도에 따른 형질전환 조직 유도 효과 실험
Figure pat00005
상기와 같이 Acetosyringon 처리농도에 따른 형질전환 조직 유도 효과를 실험한 결과 백합나무 배발생조직과 형질전환 시 acetosyringon 처리농도는 0mg/L 임을 알 수 있었다.
[4] Agrobacterium 농도(OD)에 따른 형질전환 조직 유도 효과 실험
Figure pat00006

상기와 같이 Agrobacterium 농도(OD)에 따른 형질전환 조직 유도 효과를 실험한 결과 백합나무 배발생조직과 형질전환 시 Agrobacterium 농도(OD)는 0.5 임을 확인할 수 있었다.
[5] 공조배양 (co-cultivation) 시간에 따른 형질전환 조직 유도 효과 실험
Figure pat00007

상기와 같이 공조배양 시간에 따른 형질전환 조직 유도 효과를 실험한 결과 백합나무 배발생조직과 형질전환 시 Agrobacterium 공조배양(co-cultivation)의 시간은 3일임을 알 수 있었다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.
<110> Korea Forest Research Institute(KFRI) <120> The transformation method of Liriodendron tulipifera embryonic tissue <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aux promoter gene sequence <400> 1 ttcgttgtgc tgagggaact gagatagatc tcgccagaga aacgttcaat gatttttgct 60 tggagtgaaa aaggcaaata attatagagg aaggaagtca gaaatgctgc gcagtagggc 120 cacttgtata agtgccggtc gaacactgct ggtggaaagt caaaagcgtg aagtattagt 180 tgaactctgt tactaaattg agataaatgg gatattttat tcgaaagtac tgtttgagat 240 ctagcgacaa taataatgtc atcttatgag attgcatggc aatatggatc taatatttgg 300 cataaataga tggtggtttt gtctccactt ttaaaccttc acagcgttac cctaacacct 360 cttaattgcg tacactcctt tcaaccgcat 390 <210> 2 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tzs gene seqeunce <400> 2 atctcatcta cggaccgact tgcagcggca aaacggacat gcgatccaaa aaccgggtgg 60 ccggtggttg cccttgatcg tgtgcaatgt gtcctcaagt agcggaagac ctttggaatc 120 ggaattgcaa tcaacgcgag aatatatgcc ccctcaccga gggcatcctt gacgctgaga 180 gtgcccacgt cgactctgga ttggcggaag tccgaagacg gtcttattct cgaggggggt 240 cgattattgc atggctaaaa gtccgttttg gagatcgggt tttcatggca tgtcgtcttg 300 gggattcgga cgcctttctc acccgagcca agcacgcgtt gcgccatccg ggaagatcgc 360 ccctcgttgt tggaggagtt ggcgaactct ggccgctcga ccgattttgg aagatatcga 420 cggatatcgc tggcaattcg taacacgatc tcgcaatcag ccagttgcca aatattgatg 480 cgggcggcac tagaggccat agctaatgaa tatcttgaac atgcgctctc caggagcgca 540 gtggccagaa gatggcgcag gacagcctgt ttgcccggta cgctgacgga 590

Claims (7)

  1. (1) 백합나무(Liriodendron tulipifera)의 배발생(embryogenic) 조직을 아그로박테리움(Agrobacterium)과 공조배양(co-cultivation)하는 제1단계;
    (2) 상기 제1단계로 부터 수득한 공조배양된 백합나무의 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 형질전환 배발생조직을 선발하는 제2단계;
    (3) 상기 제2단계로 부터 수득한 형질전환 배발생조직에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 체세포배 유도하는 제3단계; 및
    (4) 상기 제3단계로 부터 수득한 체세포배에 geneticin 및 cefotaxime을 처리하여 발아식물체를 재분화하는 제4단계; 를 포함하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아그로박테리움은 서열번호 1의 aux promoter, 서열번호 2의 외래 목적 유전자 및 선발표지유전자인 nptII유전자로 구성된 발현벡터 pBI121을 아그로박테리움 LBA 4404에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움인 것을 특징으로 하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 공조배양은 71~73시간인 것을 특징으로 하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법.
  4. 제1항에 있어서, 형질전환 배발생조직 선발을 위한 상기 제2단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 (a) 30mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 2주 동안 처리하는 제a단계; (b) 50mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 2주 동안 처리하는 제b단계; 및 (c) 70mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 4~6주 동안 처리하는 제c단계; 를 포함하는 것임을 특징으로 하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법.
  5. 제1항에 있어서, 체세포배 유도를 위한 상기 제3단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 30mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 6~8주 동안 처리하는 것임을 특징으로 하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법.
  6. 제1항에 있어서, 발아식물체 재분화를 위한 상기 제4단계의 geneticin 및 cefotaxime 처리는 50mg/L 의 geneticin 및 250mg/L cefotaxime 을 4주 동안 처리하는 것임을 특징으로 하는 백합나무 배발생조직의 형질전환 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 선택된 어느 하나의 방법으로 형질전환된 백합나무 배발생조직.
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