KR20130012426A

KR20130012426A - 녹조류 유래 ｄ―글루카르산 생산 방법

Info

Publication number: KR20130012426A
Application number: KR1020110073628A
Authority: KR
Inventors: 이선복; 이신엽
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2013-02-04
Also published as: KR101835130B1

Abstract

본 발명은 녹조류 유래 당을 이용하여 D-글루카르산(D-glucaric acid)을 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 D-글루카르산 생산 유전자를 도입한 재조합 미생물을 이용하여 녹조류 원초로부터 얻어진 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)을 D-글루카르산으로 전환하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 녹조류 원초를 건조 및 분쇄하여 녹조류를 입자화 하는 단계; 녹조류 분말을 산촉매 가수분해 함으로써 단당류를 생산하는 단계; 생산된 단당류를 D-글루카르산 생산 유전자가 삽입된 재조합 미생물 발효를 이용하여 D-글루카르산으로 전환하는 단계로 구성되어 있다. 본 발명은 기존에 산업적으로 사용되지 않던 녹조류 자원을 이용하여 산업적 활용가치가 높은 화학제품을 생산하는 신규 발효 공정이라는 특징을 가진다.

Description

녹조류 유래 Ｄ―글루카르산 생산 방법{Method for the production of D-glucaric acid from green seaweed}

본 발명은 녹조류 유래 당을 이용하여 바이오 플라스틱(bio-based plastic)의 단량체로 활용 가능한 D-글루카르산(D-glucaric acid)를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 D-글루카르산 생산 유전자를 도입한 재조합 미생물을 이용하여 녹조류 원초로부터 얻어진 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)를 D-글루카르산으로 전환하는 방법에 관한 것이다.

21세기 인류가 해결해야 할 중요한 문제인 화석연료의 고갈 문제는 에너지와 뿐만 아니라 플라스틱과 정밀화학 물질 등의 화학 산업의 원료 고갈이라는 측면에도 심각한 영향을 미칠 것으로 예상되고 있다. 에너지 문제의 경우 태양광 발전, 풍력, 수력, 원자력 등과 같은 대안이 많은 반면, 화학 산업 원료의 경우 바이오매스의 활용이 유일한 대안으로 여겨지고 있기 때문에 이를 활용하여 기존의 석유화학 제품을 효과적으로 대체하는 방법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 석유유래 플라스틱 제품을 대체할 바이오플라스틱의 경우 옥수수와 같은 전분계 바이오매스가 주 원료로 이용되고 있으며 일부 제품의 경우 상용화되어 시장에 진출하였다. 그러나 기존의 전분계 원료는 주로 식용작물인 곡물류를 사용하기 때문에 식품 및 가축사료의 가격을 상승시키는 등의 문제를 수반한다. 이와 같은 문제를 극복하기 위하여, 비식용 바이오매스인 목본 또는 초본식물의 리그노셀룰로스 (lignocellulose)을 사용하는 연구가 고려되고 있으나 난분해성 방향족 중합체인 리그닌(lignin)을 제거하기 위해 복잡하고 고비용이 수반되는 전처리 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다.

본 발명은 비식용 바이오매스인 해조류를 이용하여 화학 산업원료를 생산하는 기술에 관한 것으로서, 녹조류 바이오매스를 이용하여 산업적 활용 가능성이 큰 D-글루카르산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 해조류 바이오매스는 육상계 바이오매스에 비하여 성장속도가 빠르며, 해양에서 대량으로 재배가 가능하며, 이산화탄소 흡수 능력이 매우 뛰어나다. 이러한 장점들로 인하여 해조류 바이오매스는 차세대 바이오플라스틱의 원료로서 최적의 바이오매스로 판단되고 있다. 또한 이러한 해조류는 리그닌 성분을 거의 함유하지 않기 때문에 당화가 용이하다는 장점을 가지고 있다.

D-글루카르산은 다이카르복시산(dicarboxylic acid)으로서 polyamide계열 플라스틱의 원료로 활용이 가능한데, 대표적인 활용 가능성으로 기존의 석유화학 유래의 나이론(Nyron) 생산 원료인 아디프산(adipic acid)를 대체할 수 있다. D-글루카르산은 에스테르화 반응에 이은 다이아민(diamine)과의 결합 반응을 통해 폴리아마이드계열 플라스틱인 폴리글루카르아마이드(PGA: polyglucaramide)로 전환이 가능하다. 상기 다이아민은 헥사메틸 다이아민(hexamethyl diamine) 등이 활용될 수 있다 (Kiely, D. E. et al. (1994) J. Am . Chem . Soc ., 116: 571-578). 이와 같은 활용 가능성으로 인해 미국 에너지성에서는 D-글루카르산을 바이오매스로부터 얻을 수 있는 10대 고부가 물질 중 하나로 선정한 바 있다 (U.S Department of Energy (2004) Top Value Added Chemicals from Biomass).

해조류 바이오매스의 경우 기존의 육상계 바이오매스와는 구성 당의 성분이 상당부분 다르기 때문에 이를 효율적으로 활용하기 위해서는 이러한 특이한 구성 성분에 초점을 맞춘 연구가 요구되고 있다. 해조류의 다양한 구성성분 중 녹조류 유래의 D-글루쿠론산은 그 구성성분 비가 높음에도 불구하고 이를 효과적으로 활용하여 화학제품에 응용하는 기술은 개발된 예가 없다. 녹조류는 보통의 경우 건조 중량 기준으로 탄수화물을 45~60% 정도 함유하고 있다. 구성 당 성분은 종류 및 비율은 종에 따라 다양하나 대부분의 경우 D-글루쿠론산을 상당량 함유하고 있다. 본 발명의 주요 실시 예로 사용된 구멍갈파래의 경우 D-글루쿠론산이 전체 탄수화물의 30~40%를 차지하고 있다.

바이오매스 유래 D-글루카르산의 생산에 관한 기존의 연구는 D-글루코즈(D-glucose)를 원료로 이용하여 D-글루카르산을 생산한 예가 있다 (Moon, T. S. et al. (2009) Appl . Environ . Microbiol . 75: 589-595). D-글루코즈를 이용하여 D-글루카르산을 생산하는 기존의 연구는 대장균 내에서 PPS(phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system), 미오이노시톨-1-인산 신타아제 (myo-inositol-1-phosphate synthase), 포스파타제(phosphatase), 미오이노시톨 옥시게네이즈 (myo-inositol oxygenase), 유론산 탈수소효소(urinate dehydrogenase) 등 복잡한 연쇄 효소 반응을 거쳐 D-글루카르산을 생산하기 때문에 투입된 D-글루코즈 양 대비 그 생산성이 매우 낮다 (<17.4%). 그 중 미오이노시톨-1-인산 신타아제, 미오이노시톨 옥시게네이즈, 유론산 탈수소효소 등의 유전자는 각각 다른 종류의 외래 생물체로부터 도입 되었기 때문에 미생물 내에서 그 발현이 효율적이지 못하다는 단점도 지닌다. 반면, 본 발명과 같이 녹조류를 구성하는 D-글루쿠론산을 직접 원료로 사용할 경우 두가지 효소의 도입만으로 효과적으로 D-글루카르산을 생산할 수 있기 때문에 기존의 D-글루코즈를 이용한 생산법보다 공정 단계가 단축된다는 장점이 있으며 그 생산 효율성도 높다.

또한, 본 발명과 기존의 연구의 가장 큰 차이 중 하나는 D-글루카르산 락토네이즈의 추가 도입이다. 본 발명에서 활용된 D-글루쿠론산 탈수소효소 및 D-글루카르산 락토네이즈를 이용한 이단계 효소 반응 유전자 도입은 녹조류 유래 D-글루카르산 생산에 매우 유리한 측면이 있다. 기존의 생산법의 경우는 최종 미생물 발효 산물로 D-글루카르산락톤이 생산되며 생산된 D-글루카르산락톤이 자발적인 반응에 의하여 D-글루카르산으로 전환하는 방법을 택하고 있다. 그러나 일반적인 미생물 발효조건인 중성 및 약산성 조건에서는 D-글루카르산락톤이 본래의 형태를 유지하는 특징이 있다. 따라서 D-글루카르산 락토네이즈 유전자를 추가로 도입하여 미생물 내에서 D-글루카르산락톤을 효과적으로 D-글루카르산으로 전환하는 기술이 본 발명의 매우 중요한 요소라 할 수 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 D-글루카르산 생산 유전자가 삽입된 재조합 미생물을 이용하여 녹조류 원초로부터 얻어진 D-글루쿠론산을 효율적으로 D-글루카르산으로 전환하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 해조류 중 녹조류 원초를 건조한 뒤 분쇄하여 입자화하는 단계, 산 촉매를 이용하여 가수분해함으로써 D-글루쿠론산을 포함한 단당류를 회수하는 단계, D-글루카르산 생산 유전자가 삽입된 재조합 미생물 발효를 이용하여 D-글루쿠론산을 D-글루카르산으로 전환하는 단계로 이루어져 있다. 본 발명의 재조합 미생물 발효에서 있어서 Chromohalobacter salexigens 유래의 D-글루쿠론산 탈수소효소 및 D-글루카르산 락토네이즈로 이루어진 두 가지 유전자만을 도입하기 때문에 기존의 복잡한 반응을 단축할 수 있으며 D-글루카르산을 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, D-글루카르산 락토네이즈의 도입을 통해 D-글루쿠론산 탈수소효소만을 도입하는 경우에 비해 생산 수율을 향상시킬 수 있다.

본 발명은 기존에 폐자원으로 여겨지던 녹조류 바이오매스를 활용하여 D-글루카르산을 생산함으로써 바이오 플라스틱(bio-based plastic)을 효과적으로 생산하여 해양생물자원의 산업적 활용도를 높이는 효과와 미생물 발효를 활용한 친환경 공정을 통해 공정과정에서 발생하는 유해한 산업폐기물을 저감시키는 효과가 있다.

도 1은 D-글루쿠론산 탈수소효소에 의하여 D-글루쿠론산이 D-글루카르산 락톤으로 전환된 후 D-글루카르산 락토네이즈 반응에 의하여 최종 생성물인 D-글루카르산이 생산되는 본 발명의 핵심반응을 보여준다.
도 2는 D-글루쿠론산 탈수소효소의 기질 활성이 반응 온도에 따라지는 양상을 보여주며 최적 활성이 37.5℃에서 나타남을 보여준다.
도 3은 D-글루쿠론산 탈수소효소의 기질 활성이 반응 pH에 따라 달라지는 양상을 보여주며 최적 활성이 pH8.5에서 나타남을 보여준다.
도 4는 D-글루카르산 락토네이즈의 기질 활성에 의해 D-글루카르산이 생산되는 양상을 보여주는 결과이며 효소 반응이 자발적 반응에 비해 월등히 빠른 반응속도가 나타남을 보여준다.

본 발명은 (1) 녹조류 원초를 입자화하는 단계; (2) 상기 입자화된 녹조류 원초를 산 촉매 가수분해를 통하여 녹조류 유래 D-글루쿠론산을 회수하는 단계; 및 (3) D-글루카르산 생산 유전자가 삽입된 재조합 미생물 발효를 이용하여 상기 D-글루쿠론산을 D-글루카르산으로 전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹조류 유래 D-글루카르산 생산 방법을 제공한다. 상기 녹조류는 D-글루쿠론산을 포함하는 종으로서 갈파래, 구멍갈파래, 참홑파래, 가시파래, 납작파래, 창자파래, 매생이, 청각, 떡청각, 옥덩굴, 구슬청각 및 잎파래로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 (1) 단계는 (a) 녹조류 원초를 냉수에서 세척하여 함유 당 성분의 유출을 최소화하는 단계; (b) 상기 세척한 녹조류 원초를 건조하여 함유 당 성분의 변형을 최소화하는 단계; 및 (c) 상기 건조된 녹조류 원초를 분쇄기를 이용하여 입자 크기를 1.0 mm 이하로 입자화하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (2) 단계의 산 촉매는 황산, 염산, 질산, 인산, 아세트산, 개미산, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 테트라부틸암모늄 중황산(tetrabutylammonium bisulfate), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 황산수소(1-butyl-3-methylimidazolium hydrogen sulfate), 및 1-메틸-이미다졸륨 황산수소(1-methylimidazolium hydrogen sulfate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 (3) 단계의 재조합 미생물은 알카리진스(Alcaligenes), 아스로박터(Arthrobacter), 바실러스(Baccilus), 브레비박테리움(Brevibacterium ), 클러스트리디엄(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 데케라(Dekkera), 에스케리키아(Escherichia), 엔트로코커스(Enterococcus), 한세눌라( Hansenula), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 살모넬라(Salmonella), 및 자이모모나스(Zymomonas)로 구성된 군에서 선택되는 종에 D-글루카르산 생산 유전자를 삽입하여 제조된 것일 수 있다.

또한, 상기 (3) 단계의 재조합 미생물은 D-글루쿠론산을 D-글루카르산락톤으로 전환하는 역할, 및 D-글루카르산락톤을 D-글루카르산으로 전환하는 역할을 수행할 수 있는 폴리펩타이드(polypeptide)의 유전정보를 모두 포함하도록 D-글루카르산 유전자를 삽입한 유전자 재조합 미생물일 수 있다.

상기 D-글루쿠론산을 D-글루카르산락톤으로 전환하는 과정에서 D-글루쿠론산을 기질로하여 D-글루카르산 락톤을 생산할 수 있는 폴리펩타이드는 D-글루쿠론산 탈수소효소(D-glucuronic acid dehydrogenase)일 수 있고, 상기 D-글루쿠론산 탈수소효소는 서열번호 2와 아미노산 서열이 ClustalW 방법 기반 80% 이상의 유사성을 가지는 유전자를 이용할 수 있다.

상기 D-글루카르산락톤을 D-글루카르산으로 전환하는 과정에서 D-글루카르산락톤을 기질로하여 D-글루카르산을 생산할 수 있는 폴리펩타이드는 D-글루카르산 락토네이즈(D-glucaric acid lactonase)일 수 있고, 상기 D-글루카르산 락토네이즈는 서열번호 4와 아미노산 서열이 ClustalW 방법 기반 80% 이상의 유사성을 가지는 유전자를 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹조류의 건조 및 분쇄

본 발명의 녹조류 원초의 건조 및 분쇄단계에서는 불필요한 이물질이 제거된 녹조류를 60~80도에서 충분히 건조하여 20% 이하의 수분을 유지한 상태에서 분쇄기를 이용하여 건조된 녹조류를 0.5 mm 정도의 크기로 입자화 하였다. 상기 녹조류 분말을 산 촉매를 이용하여 가수분해하는 단계는 산 촉매의 종류, 가수분해 반응온도 및 반응시간, 산 촉매의 농도, 녹조류 원초와 용매의 비율이 단당류의 생성에 중요한 영향을 준다. 가수반응에 사용되는 산 촉매의 종류로는 H₂SO₄ (sulfuric acid), HCl (hydrochloric acid), HNO₃ (nitric acid), CH₃COOH (acetic acid), HCOOH (formic acid), CF₃COOH (trifluoroacetic acid), (CH₃CH₂CH₂CH₂)₄N(HSO₄) (tetrabutylammonium bisulfate), C₈H₁₆N₂O₄S (1-butyl-3-methylimidazolium hydrogen sulfate), C₄H₆N₂ _·H₂SO₄ (1-methylimidazolium hydrogen sulfate) 등을 예시할 수 있으나, 염산, 황산, 질산 등의 강산을 처리하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 산가수분해 반응온도로는 110~140℃가 바람직하며 최적 가수분해 반응시간은 가수분해 조건에 따라 다르지만 일반적으로 온도가 높고 촉매 농도가 높을수록 최적 반응시간이 줄어들게 된다. 산 촉매의 농도로는 0.1~1.0 M 농도 조건하에서 수행하는 것이 바람직하다. 산 촉매에 의해 가수분해된 용액은 NaOH 등의 강염기를 이용하여 중화하게 되는데 최종 용액이 염기성을 띌 때 D-글루쿠론산이 안정한 상태로 유지되기 때문에 pH 7.0~9.0의 산도를 유지하여 보관하는 것이 바람직하다.

실시예 2. D- 글루카르산 생산 유전자의 클로닝 및 발현

회수된 녹조류 유래 D-글루쿠론산을 D-글루카르산으로 전환하는 단계를 수행하기 위하여 해양 미생물인 Chromohalobacter salexigens 유래의 D-글루쿠론산 탈수소효소(D-glucuronic aicd dehyrogenase) 및 D-글루카르산 락토네이즈(D-glucaric acid lactonase)를 발현용 vector인 pQE-80L에 삽입 및 대장균에서 대량 발현한 뒤, 이를 Ni-NTA column으로 정제하여 사용하였다. 최종 클로닝된 유전자는 하기 SEQ ID NO 1(D-글루쿠론산 탈수소효소), SEQ ID NO 3(D-글루카르산 락톤)과 같으며 각각의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4과 같다.

실시예 3. D- 글루쿠론산을 효소 전환하여 D- 글루카르산락톤 생산

실험에 사용된 글루쿠론산탈수소 효소는 해양 미생물인 Chromohalobacter salexigens로부터 클로닝되어 발현용 vector인 pQE-80L에 삽입 및 대장균에서의 대량 발현과 정제 과정을 거쳐 얻어졌다. 상기 효소 10㎍을 2mM 글루쿠론산과 0.2mM의 NAD⁺가 함유된 용액 1ml에 첨가하였고 UV 340nm에서의 흡광도를 측정함으로써 반응양상을 확인하였다.

글루쿠론산 탈수소효소에 반응하는 기질을 선별하기 위하여 상기 반응조건과 동일한 반응 조건에서 기질의 종류만 달리하여 효소의 상대적인 활성도를 측정하였다. 반응에 사용된 기질은, 글루쿠론산, 글루쿠론산 락톤, 갈락투론산(D-galacturonic acid), D-glucuose, D-gluconic acid, D-gluconic acid lactone, D-galactose, D-galactonic acid, 글루카르산, 글루카르산 락톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용하였다. 하기 [표 1]과 같이 글루쿠론산 탈수소효소가 글루쿠론산, 글루쿠론산 락톤 및 갈락투론산에 선택적으로 활성을 보임을 확인하였다.

기질 종류에 따른 글루쿠론산 탈수소효소의 상대 효소활성도

기질	D- glucuronic acid	D- glucuronic acid lactone	D- galacturonic acid	D- glucose	D- gluconic acid
상대 효소활성도 (%)	100	41.7	59.0	0.0	0.0
기질	D- gluconic acid lactone	D- galactose	D- galactonic acid	D- glucaric acid	D- glucaric acid lactone
상대 효소활성도 (%)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

글루쿠론산 탈수소효소의 반응에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 효소반응의 온도를 5~50℃까지 변화시켜가며 효소의 활성도를 비교하였다. 효소 반응 온도는 5℃, 10℃, 20℃, 30℃, 32.5℃, 35℃, 37.5℃, 40℃, 45℃, 50℃로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용하였다. 반응 pH를 8.0으로 동일하게 유지하기 위하여 50mM Tris-HCl buffer에서 반응을 진행하였다. 하기 [도면 2]과 같이 37.5℃에서 글루쿠론산 탈수소효소의 최적 활성이 나타남을 확인하였다.

글루쿠론산 탈수소효소의 반응에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 효소반응의 pH를 3.0~12.0까지 변화시켜가며 효소의 활성도를 비교하였다. 효소 반응 pH는 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 8.5, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용하였다. 개별 반응에 대하여 pH를 유지하기 위하여 50mM buffer를 사용하였으며 그 종류는 하기와 같이 반응 pH범위에 해당하는 buffer를 선택하여 사용하였다. pH 3.0~5.0: citrate-NaOH buffer; pH 6.0~7.0: sodium phosphate buffer; pH 7.5~9.0: Tris-HCl buffer; pH 10.0~12.0: Glycine-NaOH buffer. 하기 [도면 3]과 같이 pH 8.5에서 글루쿠론산 탈수소효소의 최적 활성이 나타남을 확인하였다.

실시예 4. D- 글루카르산락톤을 효소 전환하여 D- 글루카르산 생산

D-글루쿠론산 탈수소효소에 의해 생성된 D-글루카르산락톤을 D-글루카르산으로 전환하기 위하여 D-글루카르산 락토네이즈의 효소 활성을 측정하였다. 실시예 3과 동일한 방법으로 발현 및 정제된 효소를 이용하여 반응을 수행하였으며 상기 효소 100㎍을 20mM D-글루카르산락톤이 함유된 pH 7.0 완충 용액 1ml에 첨가하여 반응이 시작되었다. 반응 온도는 상온인 25도로 설정하여 수행하였다. 반응이 완료된 용액은 실린지 필터 (0.2 ㎛)로 필터한 후 RI 검출기와 Aminex HPX-87H (Bio-rad) 칼럼이 장착된 HPLC로 분석하였다. 이동상으로는 5 mM의 황산수용액을 사용하였고, 흐름 속도는 0.6 ㎖/분, 칼럼의 온도는 35℃로 설정하여 분석하였다. 대조군으로 위와 동일한 조건 하에서 D-글루카르산 락토네이즈만 첨가되지 않은 시료를 사용하였으며 자발적 반응(spontaneous reaction)에 의한 D-글루카르산의 생성량을 확인하여 효소활성 결과와 비교하였다.

실험 결과는 [도면 4]와 같이 2시간 30분의 반응 시간이 경과하였을때 D-글루카르산 락토네이즈 반응의 경우 14.6 mM의 D-글루카르산을 생산한 반면, 자발적 반응은 D-글루카르산 생산량이 0.9 mM에 그쳐, 효소 반응이 필수적으로 요구됨을 알 수 있다.

실시예 5. 재조합 미생물을 이용한 D- 글루카르산 생산

실시예 3, 4에서 효소 활성이 확인되었으므로 D-글루쿠론산 탈수소효소 및 D-글루카르산 락토네이즈 유전자를 발현용 플라스미드인 pQE80 형태로 삽입하여 함께 발현시킨 뒤, D-글루쿠론산을 투입하여 최종 D-글루카르산이 생성되는지 확인하였다. 외래 단백질 발현 및 D-글루카르산 생산성을 확인하기 위한 배양은 3.5 L 발효기에 이루어졌다. 대장균 배양용 LB배지 2 L에 재조합 균주의 전 배양액 2~4%를 접종한 후, 초기 pH 5.6~6.0, 37도에서 약 3시간 배양 후 O.D. 600nm 값이 0.4에 도달하였을 때 1 mM IPTG를 첨가하여 효소 발현을 시작하였다. 효소 발현 시작과 함께 기질인 D-글루쿠론산을 10 g/L의 농도로 첨가하고 5시간 동안 배양하였다. 첨가한 기질의 소비속도 및 잔류량과 D-글루카르산 생산량은 RI 검출기가 장착된 HPLC를 사용하여 분석하였다. 배양 실험 결과 재조합균주는 D-글루쿠론산을를 이용하여 4.8 g/L의 D-글루카르산을 생산이 확인되었다. 반면 대조군인 일반 대장균은 D-글루카르산 생산이 확인되지 않았다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for the production of D-glucaric acid from green seaweed <130> PB11-09458 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 804 <212> DNA <213> Chromohalobacter salexigens <400> 1 atgctcaatc gtttgttggt gaccggggct gctggtggtg tggggagtgc gattcgccca 60 catcttggaa cgctggcgca cgaggtccgt ctgtcggata tcgtcgatct cggcgcggcc 120 gaggcgcacg aggagattgt tgcctgcgac ctggccgatg cccaggccgt tcatgatctg 180 gtcaaggatt gcgacggtat cattcacctc ggtggggtgt cggtggaacg tccctggaac 240 gatattctcc aggccaacat catcggcgcc tacaacctgt atgaagccgc caggaacctc 300 ggcaagccgc gcatcgtgtt cgccagttcc aatcacacca tcggttatta tccacgcact 360 acgcggatcg acaccgaagt gccgcgccgt cccgactcgc tgtatggctt gtccaagtgt 420 tttggtgagg atctggcgag cctgtattac cacaagttcg atatcgagac cctcaacata 480 cgcatcggtt cgtgttttcc caagcccaag gacgcgcgga tgatggccac ctggctgagc 540 gtcgatgact tcatgcgcct gatgaagcgt gccttcgtgg ctcccaagct gggatgcacc 600 gtcgtctatg gcgcctcggc gaataccgag tcgtggtggg acaacgacaa gtcggcattt 660 ctcggctggg ttccgcagga cagttcggaa atctggcggg aggagatcga acagcaggcc 720 ggcgagatcg accctgacga tccggcagtc atctaccagg gtggcaaatt cgtggcggcg 780 gggcatcccg acgacgctga gtaa 804 <210> 2 <211> 267 <212> PRT <213> Chromohalobacter salexigens <400> 2 Met Leu Asn Arg Leu Leu Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Gly Ser 1 5 10 15 Ala Ile Arg Pro His Leu Gly Thr Leu Ala His Glu Val Arg Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Val Asp Leu Gly Ala Ala Glu Ala His Glu Glu Ile Val Ala 35 40 45 Cys Asp Leu Ala Asp Ala Gln Ala Val His Asp Leu Val Lys Asp Cys 50 55 60 Asp Gly Ile Ile His Leu Gly Gly Val Ser Val Glu Arg Pro Trp Asn 65 70 75 80 Asp Ile Leu Gln Ala Asn Ile Ile Gly Ala Tyr Asn Leu Tyr Glu Ala 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Lys Pro Arg Ile Val Phe Ala Ser Ser Asn His 100 105 110 Thr Ile Gly Tyr Tyr Pro Arg Thr Thr Arg Ile Asp Thr Glu Val Pro 115 120 125 Arg Arg Pro Asp Ser Leu Tyr Gly Leu Ser Lys Cys Phe Gly Glu Asp 130 135 140 Leu Ala Ser Leu Tyr Tyr His Lys Phe Asp Ile Glu Thr Leu Asn Ile 145 150 155 160 Arg Ile Gly Ser Cys Phe Pro Lys Pro Lys Asp Ala Arg Met Met Ala 165 170 175 Thr Trp Leu Ser Val Asp Asp Phe Met Arg Leu Met Lys Arg Ala Phe 180 185 190 Val Ala Pro Lys Leu Gly Cys Thr Val Val Tyr Gly Ala Ser Ala Asn 195 200 205 Thr Glu Ser Trp Trp Asp Asn Asp Lys Ser Ala Phe Leu Gly Trp Val 210 215 220 Pro Gln Asp Ser Ser Glu Ile Trp Arg Glu Glu Ile Glu Gln Gln Ala 225 230 235 240 Gly Glu Ile Asp Pro Asp Asp Pro Ala Val Ile Tyr Gln Gly Gly Lys 245 250 255 Phe Val Ala Ala Gly His Pro Asp Asp Ala Glu 260 265 <210> 3 <211> 864 <212> DNA <213> Chromohalobacter salexigens <400> 3 gtgtccgatc ttcccgccaa cactcgcccg cttgatggcc cggcacccaa actcaaggcg 60 ccgcccggtg cgaccgactg tcatatccat ctgtatctgc cgggcttcga tgcccagccc 120 ggtggtccga agattcccga gctggcaacg gtcgagaatt accgacagat ccagcgttgg 180 ctgtcgctcg agcgtgtggt ggtcactcaa cccaatgcct accagcgtga caatcgcgcc 240 ttgctcacgg cgctgggcca gttgggcact gacagcgcac gcggtgtcgc ggcagtgacg 300 cccgagatat cggacagcga gcttcgggac tggcatgaca aaggggtgcg cggtgcacgg 360 atcatgaacc tgccgggggg cgccgttgcc agcgatcaga tgctcgaggt cgagcaacgg 420 attcgtccga tgggctggca cctgatggtt cagttcaatg gctgcaagtt gaacgattac 480 ctcgcggatc tgcagcgtat cgagggcgaa tacatcatcg atcatatcgg caagttcatg 540 ccgccggtgt cggcggacga ccctcgggtg gatgacattc tgcggctgct cgatcgcggc 600 aatgcctggt tcaagatatg tgccggctat gaagccagcc ggctcggcgg tcccggctac 660 gcggatgtcg gggcgatcgc caagcgggtc atcggccatg cgccagagcg catcatctgg 720 gggagcaact ggccgcacgt cggcgtgccg cgcgagcaat accccgacga tgccgagcag 780 ctcgatgtct tgctcgactg ggcgtccccc gaggtgcgcc agagaatact ggtcgataat 840 ccggcgacgt tgtatggctt ctga 864 <210> 4 <211> 287 <212> PRT <213> Chromohalobacter salexigens <400> 4 Met Ser Asp Leu Pro Ala Asn Thr Arg Pro Leu Asp Gly Pro Ala Pro 1 5 10 15 Lys Leu Lys Ala Pro Pro Gly Ala Thr Asp Cys His Ile His Leu Tyr 20 25 30 Leu Pro Gly Phe Asp Ala Gln Pro Gly Gly Pro Lys Ile Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Val Glu Asn Tyr Arg Gln Ile Gln Arg Trp Leu Ser Leu Glu 50 55 60 Arg Val Val Val Thr Gln Pro Asn Ala Tyr Gln Arg Asp Asn Arg Ala 65 70 75 80 Leu Leu Thr Ala Leu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Ser Ala Arg Gly Val 85 90 95 Ala Ala Val Thr Pro Glu Ile Ser Asp Ser Glu Leu Arg Asp Trp His 100 105 110 Asp Lys Gly Val Arg Gly Ala Arg Ile Met Asn Leu Pro Gly Gly Ala 115 120 125 Val Ala Ser Asp Gln Met Leu Glu Val Glu Gln Arg Ile Arg Pro Met 130 135 140 Gly Trp His Leu Met Val Gln Phe Asn Gly Cys Lys Leu Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Asp Leu Gln Arg Ile Glu Gly Glu Tyr Ile Ile Asp His Ile 165 170 175 Gly Lys Phe Met Pro Pro Val Ser Ala Asp Asp Pro Arg Val Asp Asp 180 185 190 Ile Leu Arg Leu Leu Asp Arg Gly Asn Ala Trp Phe Lys Ile Cys Ala 195 200 205 Gly Tyr Glu Ala Ser Arg Leu Gly Gly Pro Gly Tyr Ala Asp Val Gly 210 215 220 Ala Ile Ala Lys Arg Val Ile Gly His Ala Pro Glu Arg Ile Ile Trp 225 230 235 240 Gly Ser Asn Trp Pro His Val Gly Val Pro Arg Glu Gln Tyr Pro Asp 245 250 255 Asp Ala Glu Gln Leu Asp Val Leu Leu Asp Trp Ala Ser Pro Glu Val 260 265 270 Arg Gln Arg Ile Leu Val Asp Asn Pro Ala Thr Leu Tyr Gly Phe 275 280 285

Claims

하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹조류 유래 D-글루카르산 생산 방법:
(1) 녹조류 원초를 입자화하는 단계;
(2) 상기 입자화된 녹조류 원초를 산 촉매 가수분해를 통하여 녹조류 유래 D-글루쿠론산을 회수하는 단계; 및
(3) D-글루카르산 생산 유전자가 삽입된 재조합 미생물 발효를 이용하여 상기 D-글루쿠론산을 D-글루카르산으로 전환하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 녹조류는 D-글루쿠론산을 포함하는 종으로서 갈파래, 구멍갈파래, 참홑파래, 가시파래, 납작파래, 창자파래, 매생이, 청각, 떡청각, 옥덩굴, 구슬청각 및 잎파래로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 녹조류 유래 D-글루카르산 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (1) 단계는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법:
(a) 녹조류 원초를 냉수에서 세척하여 함유 당 성분의 유출을 최소화하는 단계;
(b) 상기 세척한 녹조류 원초를 건조하여 함유 당 성분의 변형을 최소화하는 단계; 및
(c) 상기 건조된 녹조류 원초를 분쇄기를 이용하여 입자 크기를 1.0 mm 이하로 입자화하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 산 촉매는 황산, 염산, 질산, 인산, 아세트산, 개미산, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 테트라부틸암모늄 중황산(tetrabutylammonium bisulfate), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 황산수소(1-butyl-3-methylimidazolium hydrogen sulfate), 및 1-메틸-이미다졸륨 황산수소(1-methylimidazolium hydrogen sulfate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (3) 단계의 재조합 미생물은 알카리진스(Alcaligenes), 아스로박터(Arthrobacter), 바실러스(Baccilus), 브레비박테리움(Brevibacterium ), 클러스트리디엄(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 데케라(Dekkera), 에스케리키아(Escherichia), 엔트로코커스(Enterococcus), 한세눌라( Hansenula), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 살모넬라(Salmonella), 및 자이모모나스(Zymomonas)로 구성된 군에서 선택되는 종에 D-글루카르산 생산 유전자를 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (3) 단계의 재조합 미생물은 D-글루쿠론산을 D-글루카르산락톤으로 전환하는 과정, 및 D-글루카르산락톤을 D-글루카르산으로 전환하는 과정의 역할을 수행할 수 있는 폴리펩타이드(polypeptide)의 유전정보를 모두 포함하도록 D-글루카르산 유전자를 삽입한 유전자 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 D-글루쿠론산을 D-글루카르산락톤으로 전환하는 과정에서 D-글루쿠론산을 기질로하여 D-글루카르산 락톤을 생산할 수 있는 폴리펩타이드는 D-글루쿠론산 탈수소효소(D-glucuronic acid dehydrogenase)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 D-글루카르산락톤을 D-글루카르산으로 전환하는 과정에서 D-글루카르산락톤을 기질로하여 D-글루카르산을 생산할 수 있는 폴리펩타이드는 D-글루카르산 락토네이즈(D-glucaric acid lactonase)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 D-글루쿠론산 탈수소효소는 서열번호 2와 아미노산 서열이 ClustalW 방법 기반 80% 이상의 유사성을 가지는 유전자를 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 8항에 있어서,
상기 D-글루카르산 락토네이즈는 서열번호 4와 아미노산 서열이 ClustalW 방법 기반 80% 이상의 유사성을 가지는 유전자를 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법.