KR20120137078A - Immunosuppressor comprising flavone-typed compounds and compositions for preventing or treating immune diseases - Google Patents

Immunosuppressor comprising flavone-typed compounds and compositions for preventing or treating immune diseases Download PDF

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Abstract

PURPOSE: An immunosuppressor containing flavone-based compounds and a pharmaceutical composition or food composition containing the same are provided to prevent or treat Th1 type or Th2 type immune diseases. CONSTITUTION: An immunosuppresor contains flavone-based compounds as an active ingredient. The flavone-based compounds include 6-methoxy flavone, 7-hydroxy flavone apigenin, luteolin, tangeritin, chrysin, biacalein, scutellarein, woogonin, or formononetin. The immunosuppressor downregulates expression of Th1 or Th2 type cytokine. The cytokine includes IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-gamma, TNF-alpha, or IgE. A composition for preventing or treating Th1 type immune disease contains the immunosuppressor as an active ingredient. A composition for preventing or treating Th2 type immune diseases contains the immunosuppressor as an active ingredient.

Description

플라본 계열 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 억제제 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Immunosuppressor Comprising Flavone-typed Compounds and Compositions for Preventing or Treating Immune Diseases}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to an immunosuppressive agent comprising a flavonoid-based compound as an active ingredient, and a composition for preventing or treating an immunological disease.

본 발명은 플라본 계열 화합물을 유효성분으로 하는 면역 억제제 및 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to an immunosuppressive agent comprising a flavonoid compound as an active ingredient and a composition for the prevention or treatment of an immunological disease.

활성화된 T-세포의 핵 인자(Nuclear factor of activated T cell, NFAT) 전사 인자는 대부분 면역세포에서 발현되고, 면역 반응이 일어나는 동안 유도유전자 전사(inducible gene transcription)에서 매우 중요한 역할을 담당한다(1). NFAT3 군은 다음의 다섯 가지 종류로 이루어져 있다: NFAT1(NFATp, NFATc2), NFAT2(NFATc, NFATc1), NFAT3(NFATc4), NFAT4(NFATx, NFATc3) 및 NFAT5(TonEBP) 그리고 모든 군은 매우 보존된 DNA-결합 도메인을 가진다(2). NFAT1-NFAT4의 활성화는 칼슘 및 칼시뉴린(calcineurin) 시그널 경로에 의해 조절되며, NFAT5는 하이퍼토닉 스트레스에 민감하다(3). T 세포 수용체의 참여시 칼슘의 세포내 저장소로부터의 방출을 자극하고, 막을 통해 원형질막 내부로 유입되어, 이후 칼모둘린-의존-세린/트레오닌 포스파타아제인 칼시뉴린(calcineurin)을 활성화시킨다(4). 칼시뉴린에 의한 NFAT 단백질의 탈인산화는 NFAT가 핵 내부로 빠르게 전이하도록 유도하며, 그것에 의해 NFAT-매개의 유전자 전사가 일어나도록 한다(5). Nuclear factor of activated T-cell (NFAT) transcription factors are mostly expressed in immune cells and play a very important role in inducible gene transcription during the immune response (1 ). The NFAT 3 group consists of the following five categories: NFAT1 (NFATp, NFATc2), NFAT2 (NFATc, NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx, NFATc3) and NFAT5 DNA-binding domain (2). Activation of NFAT1-NFAT4 is regulated by the calcium and calcineurin signal pathways, and NFAT5 is sensitive to hypertonic stress (3). Stimulates release of calcium from the intracellular reservoir upon participation of the T cell receptor and enters the plasma membrane through the membrane to subsequently activate calmodulin-dependent-serine / threonine phosphatase, calcineurin (4 ). Dephosphorylation of the NFAT protein by calcineurin induces NFAT to rapidly transfer into the nucleus, thereby causing NFAT-mediated gene transcription (5).

T 세포에서, NFAT 단백질은 T 세포 발달, 활성, 관용 유도 및 분화(differentiation)에 관계된 유전자 발현을 조절함으로서 다양한 세포 작용들을 제어한다(6). NFAT1, -2 및 -4는 T 세포에 존재하며 이러한 개별적이거나 조합적인 NFAT-결핍 마우스는 T 세포 반응, Th1/Th2 세포 분화 및 사이토카인 발현 프로파일에서 변형을 보였다(7-10). 게다가, 복합 사이토카인 생산과 같은 T 세포 면역 반응에서 결함에 의해 특정되는 SCID 표현형을 가진 환자들은 NFAT 활성의 손상 및 핵에서 NFAT가 오래 존재하지 못하는 것과 연관되어 있었다(11, 12). 면역 시스템에서 NFAT의 중요성은 T 세포 리니지 코미트먼트(lineage commitment) 또는 이후의 항원자극 시 유도되는 IL-2, IFN-γ 및 IL-4,과 같은 사이토카인 유전자 전사에서 NFAT의 조절 활성을 설명하는 여러 논문들에 의해 강조되었다(Ref). 칼시뉴린의 억제자인 사이클로포린 A(CsA) 또는 FK506는 자가 면역 질환이나 칼슘-매개 NFAT 신호 전달 증폭과정을 방해하는 것에 의한 이식 거부 반응과 같은 면역억제제로 사용하여왔다(Ref-AI)(13). 그러나, 이러한 치료제들은 콩팥독성(nephrotoxicity) 또는 신경독성(neurotoxicity)와 같은 수많은 부작용을 초래하였고, 그러한 이유로 치료적 이용에 제한적이었다(14). 따라서, 독성이 낮은 NFAT 기능에 타겟팅을 하는 자연화합물로부터 새로운 약물을 개발하려고 수많은 시도가 있어왔다(15, 16). 플라보노이드는 페놀류 화합물로 여러 종류의 치환기가 달린 세 개의 고리로 이루어진 구조이며, 대부분의 과일 및 야채에서 발견된다(17). 최근의 여러 논문에서 플라보노이드가 항-산화, 항-바이러스 효과, 항-염증, 항암 및 심장 혈관보호(18, 19)와 같은 생물학적이고 약리학적인 활성을 가지고 있는 것을 밝혔다. 어떤 플라보노이드 유도체들은 예컨대 카이네이스 및 전사 인자와 같이 세포-신호 단백질들을 조절함으로서 면역 반응에 대한 조절 활성도 가지고 있다. 따라서, 플라보노이드는 새로운 치료제의 개발에서 잠재성 있는 목표 화합물로 간주한다. 그러나, 각각의 플라보노이드 유도체들의 조절 효과에 대한 정확한 분자 메커니즘에 대한 정보가 부족하다.
In T cells, the NFAT protein controls a variety of cellular activities by regulating gene expression related to T cell development, activity, tolerance induction and differentiation (6). NFAT1, -2, and -4 are present in T cells and these individual or combined NFAT-deficient mice exhibited T cell responses, Th1 / Th2 cell differentiation, and cytokine expression profiles (7-10). In addition, patients with SCID phenotypes specified by defects in T cell immune responses, such as complex cytokine production, have been associated with impaired NFAT activity and a long absence of NFAT in the nucleus (11, 12). The importance of NFAT in the immune system accounts for the modulatory activity of NFAT in cytokine gene transcription such as IL-2, IFN-y and IL-4, which are induced by T cell lineage commitment or subsequent antigen stimulation It was highlighted by several papers (Ref). Cycloporin A (CsA) or FK506, a calcineurin inhibitor, has been used as an immunosuppressive agent, such as an autoimmune disease or a graft rejection reaction by interfering with the calcium-mediated NFAT signal transduction amplification process (Ref-AI) . However, these therapies have resulted in numerous side effects such as nephrotoxicity or neurotoxicity and are therefore limited to therapeutic use (14). Thus, numerous attempts have been made to develop new drugs from natural compounds that target NFAT function with low toxicity (15, 16). Flavonoids are phenolic compounds, composed of three rings with several substituents, and are found in most fruits and vegetables (17). Recent studies have shown that flavonoids have biological and pharmacological activities such as anti-oxidation, anti-viral effects, anti-inflammatory, anti-cancer and cardiovascular protection (18, 19). Certain flavonoid derivatives also have modulatory activity on the immune response by modulating cell-signaling proteins such as, for example, kaineis and transcription factors. Therefore, flavonoids are regarded as potential target compounds in the development of new therapeutic agents. However, there is a lack of information on the exact molecular mechanism for the regulatory effect of each flavonoid derivative.

본 발명자들은 이미 T 세포에서 IL-10 전사의 분자 메커니즘을 규명한바 있다. 원거리 시스-액팅 인자인 CNS-9은 증폭 활성을 가지며, Th2 세포에 IL-10 전사가 상호 상승이 되는 CNS-9로 NFAT1과 IRF4가 참여한다(20). 이러한 자료에 입각하여, 본 발명자들은 CNS-9의 조절 활성을 조절하는 천연 화합물을 선별하기 위한 T 세포 기반 리포터를 개발하였다. 본 발명자들은 6-메톡시플라본(6-methoxyflavone)이 CNS-9의 증폭 활성을 막아, 그로 인하여 T 세포에서 IL-10 발현의 하향조절을 하는 것을 발견하였다. 이 억제 효과는 핵 내부로 NFAT1의 이동을 막는 데에서 기인하며, 그 결과로서 NFAT1이 목표 부위와 결합하는 것을 방해한다. 본 발명자들은 아토피 피부염 마우스 모델에서 활성화된 T 세포에서 생산된 사이토카인 생산의 하향 조절을 보여줌으로써, 6-메톡시플라본의 치료 효능도 있음을 판단하였다. 결과적으로 본 결과는 6-메톡시플라본이 NFAT-매개 T 세포 활성을 억제함으로서 효과적인 면역억제제임을 시사한다.
The present inventors have already identified the molecular mechanism of IL-10 transcription in T cells. CNS-9, a distant cis-acting factor, has an amplifying activity, and CNS-9, in which IL-10 transcription is mutually elevated in Th2 cells, involves NFAT1 and IRF4 (20). Based on these data, the present inventors have developed a T cell-based reporter for screening natural compounds that modulate the modulatory activity of CNS-9. We have found that 6-methoxyflavone blocks the amplification activity of CNS-9, thereby down-regulating IL-10 expression in T cells. This inhibitory effect is due to the inhibition of NFAT1 migration into the nucleus, and as a result it interferes with the binding of NFAT1 to the target site. The present inventors have determined that 6-methoxy flavone has therapeutic effect by showing down regulation of cytokine production produced in activated T cells in an atopic dermatitis mouse model. As a result, the results suggest that 6-methoxy flavone is an effective immunosuppressant by inhibiting NFAT-mediated T cell activity.

따라서, 본 발명의 목적은 플라본 계열 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 억제제를 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an immunosuppressive agent comprising a flavonoid compound as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역 억제제를 유효성분으로 포함하는 Th-1 타입 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating a Th-1 type immunological disease comprising the immunosuppressant as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역 억제제를 유효성분으로 하는 Th-2 타입 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of Th-2 type immune diseases comprising the immunosuppressant as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 플라본 계열 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 억제제를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided an immunosuppressive agent comprising a flavonoid compound as an active ingredient.

본 발명자들은 이미 T 세포에서 IL-10 전사의 분자 메커니즘을 규명한바 있다. 원거리 시스-액팅 인자인 CNS-9은 증폭 활성을 가지며, Th2 세포에 IL-10 전사가 상호 상승이 되는 CNS-9로 NFAT1과 IRF4가 참여한다(20). 이러한 자료에 입각하여, 본 발명자들은 CNS-9의 조절 활성을 조절하는 천연 화합물을 선별하기 위한 T 세포 기반 리포터를 개발하였다. 본 발명자들은 6-메톡시플라본(6-methoxyflavone)이 CNS-9의 증폭 활성을 막아, 그로 인하여 T 세포에서 IL-10 발현의 하향조절을 하는 것을 발견하였다. 이 억제 효과는 핵 내부로 NFAT1의 이동을 막는 데에서 기인하며, 그 결과로서 NFAT1이 목표 부위와 결합하는 것을 방해한다. 본 발명자들은 아토피 피부염 마우스 모델에서 활성화된 T 세포에서 생산된 사이토카인 생산의 하향 조절을 보여줌으로써, 6-메톡시플라본의 치료 효능도 있음을 판단하였다. 결과적으로 본 결과는 6-메톡시플라본이 NFAT-매개 T 세포 활성을 억제함으로서 효과적인 면역억제제임을 시사한다.
The present inventors have already identified the molecular mechanism of IL-10 transcription in T cells. CNS-9, a distant cis-acting factor, has an amplifying activity, and CNS-9, in which IL-10 transcription is mutually elevated in Th2 cells, involves NFAT1 and IRF4 (20). Based on these data, the present inventors have developed a T cell-based reporter for screening natural compounds that modulate the modulatory activity of CNS-9. We have found that 6-methoxyflavone blocks the amplification activity of CNS-9, thereby down-regulating IL-10 expression in T cells. This inhibitory effect is due to the inhibition of NFAT1 migration into the nucleus, and as a result it interferes with the binding of NFAT1 to the target site. The present inventors have determined that 6-methoxy flavone has therapeutic effect by showing down regulation of cytokine production produced in activated T cells in an atopic dermatitis mouse model. As a result, the results suggest that 6-methoxy flavone is an effective immunosuppressant by inhibiting NFAT-mediated T cell activity.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 플라본 계열 화합물은 6-메톡시 플라본, 6-하이드록시플라본, 7-하이드록시플라본 아피제닌(apigenin), 루테오린(Luteolin), 탄제리틴(Tangeritin), 크리신(Chrysin), 바이칼레인(Baicalein), 스쿠텔라레인(Scutellarein), 우고닌(Wogonin) 및 포모노네틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 면역 억제제이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the flavonoid compound is selected from the group consisting of 6-methoxy flavone, 6-hydroxy flavone, 7-hydroxyflavone apigenin, Luteolin, Tangeritin, Wherein the immunosuppressive agent is at least one selected from the group consisting of Chrysin, Baicalein, Scutellarein, Wogonin, and Formonetin.

보다 바람직하게는, 본 발명의 플라본 계열 화합물은 6-메톡시플라본, 7-하이드록시플라본, 바이칼레인, 포모노네틴을 포함하는 면역 억제제이며, 가장 바람직하게는 본 발명은 6-메톡시플라본을 포함하는 면역억제제이다.More preferably, the flavone-based compound of the present invention is an immunosuppressant comprising 6-methoxy flavone, 7-hydroxy flavone, baicalein, and pomanonethine, and most preferably, the present invention includes 6-methoxy flavone Lt; / RTI >

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 플라본 계열 화합물은 보존된 비코딩 서열(Conserved Non-coding Sequence, CNS)의 증폭 활성을 막으며, 보다 바람직하게는 6-메톡시플라본이 보존된 비코딩 서열(Conserved Non-coding Sequence, CNS)의 증폭 활성을 막고, T-세포에서 사이토카인 발현을 하향조절 하는 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the flavonoid compounds of the present invention inhibit the amplification activity of the conserved non-coding sequence (CNS), more preferably the 6-methoxy flavone is preserved Is characterized by blocking amplification activity of the Conserved Non-coding Sequence (CNS) and down-regulating cytokine expression in T-cells.

본 명세서에서 용어 “보존된 비코딩 서열(Conserved Non-coding Sequence, CNS)”은 진화를 통해 보존된 DNA 서열을 의미하며, 단백질을 코딩하지 않으며, 보존된 DNA 서열의 돌연변이율은 매우 낮다. 원거리 유전자 조절 서열(distal cis-elementory element)인 CNS는 Th2 세포의 사이토카인의 미니멀 프로모터의 활성을 증대시키는 인핸서 기능을 한다. 본원 발명에서 보다 바람직하게는 CNS-9가 IL-10 발현을 조절한다.
As used herein, the term " Conserved Non-coding Sequence (CNS) " refers to DNA sequences conserved through evolution, does not encode proteins, and the mutation rate of conserved DNA sequences is very low. The CNS, a remote cis-elementory element, functions as an enhancer to enhance the activity of minimal promoters of cytokines in Th2 cells. In the present invention, more preferably, CNS-9 regulates IL-10 expression.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 CNS(Conserved Non-coding Sequence)의 인핸서 활성을 막고, T-세포에서 사이토카인 발현을 하향조절 하는 것은 핵 내부로 NFAT의 전이를 억제하는 것에 의하는 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, preventing the enhancer activity of the Conserved Non-coding Sequence (CNS) in the present invention, and down-regulating cytokine expression in T-cells by inhibiting the transfer of NFAT into the nucleus It is characterized by.

본 명세서에서, 용어 활성화된 T-세포의 핵 인자(Nuclear factor of activated T cell, NFAT) 전사 인자는 면역 반응에서 중요한 전사 인자군에 속한 일반 명칭을 의미한다. NFAT 패밀리 군의 하나 또는 그 이상은 면역 시스템의 대부분의 세포에서 발현된다. NFAT는 또한 심장, 골격 근육 및 신경 시스템의 발달에 관여한다.In this specification, the term Nuclear factor of activated T cell (NFAT) transcription factor refers to the generic name belonging to the transcription factor group important in the immune response. One or more of the NFAT family members are expressed in most cells of the immune system. NFAT is also involved in the development of the heart, skeletal muscle and nervous system.

NFAT 전사 인자 패밀리는 NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, NFAT5 다섯 가지 군으로 나뉜다. NFATc1 내지 NFATc4는 칼슘 신호로 조절된다. 칼슘 신호는 NFAT 활성에 중요하며, 이는 칼슘 센서 단백질로 널리 알려진 칼모듈린(calmodulin)이 세린/트레오닌 포스파타아제 칼시뉴린(CN)을 활성화시키기 때문이다. 활성화된 CN은 세린-풍부 구역(SRR) 및 NFAT 단백질의 아미노 말단에 있는 SP-반복 서열을 빠르게 탈인산화시켜, 그 결과 핵 위치화 신호를 노출시키도록 구조적인 변화가 일어나고, NFAT의 핵으로의 유입이 일어난다. NFAT 단백질의 핵 유입은 세포질 내의 인산화효소의 유지 및 핵 내의 인산화효소를 유출되는 것에 의해 억제된다. PKA 및 GSK-3β와 같은 유출 인산화효소는 NFAT 핵 유지를 위해 비활성화되어야 한다. NFAT 단백질은 약한 DNA 결합 능력을 가지고 있어, 효과적인 DNA 결합을 위해, NFAT 단백질은 다른 핵에 존재하는 전사 인자와 상호적인 협력이 필요하다. The NFAT transcription factor family is divided into five groups: NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, and NFAT5. NFATc1 through NFATc4 are regulated by the calcium signal. Calcium signals are important for NFAT activity because calmodulin, a well-known calcium sensor protein, activates serine / threonine phosphatase calcineurin (CN). Activated CN rapidly undergoes dephosphorylation of the serine-rich region (SRR) and the SP-repeat sequence at the amino terminus of the NFAT protein, resulting in structural changes to expose the nuclear localization signal, Inflow occurs. Nuclear inflow of NFAT protein is inhibited by the maintenance of phosphorylation enzymes in the cytoplasm and the release of phosphorylated enzymes in the nucleus. Runoff kinases such as PKA and GSK-3? Should be inactivated for NFAT nuclear retention. NFAT proteins have weak DNA binding capacity, so for effective DNA binding, the NFAT protein requires interaction with transcription factors present in other nuclei.

상기 용어 활성화된 T-세포의 핵 인자(Nuclear factor of activated T cell, NFAT) 전사 인자를 본원 발명의 상기 플라본 계열 화합물, 보다 바람직하게는 6-메톡시 플라본, 6-하이드록시플라본, 7-하이드록시플라본 아피제닌(apigenin), 루테오린(Luteolin), 탄제리틴(Tangeritin), 크리신(Chrysin), 바이칼레인(Baicalein), 스쿠텔라레인(Scutellarein), 우고닌(Wogonin) 및 포모노네틴으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 화합물을, 가장 바람직하게는 6-메톡시플라본을 이용하여 NFAT의 핵 전이를 억제할 수 있다. The term " Nuclear factor of activated T cell " (NFAT) transcription factor is used to refer to the above-mentioned flavone-based compound of the present invention, more preferably 6-methoxy flavone, 6- Roxy-flavonoids such as apigenin, Luteolin, Tangeritin, Chrysin, Baicalein, Scutellarein, Wogonin and pomonotenine , Most preferably 6-methoxy flavone, can be used to inhibit NFAT nuclear transfer.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 핵 내부로 NFAT의 전이를 억제하는 것은 상기 6-메톡시플라본이 NFAT가 사이토카인 유전자의 조절 인자와의 결합을 억제하는 것에 의하는 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the inhibition of NFAT transfer into the nucleus of the present invention is characterized in that the 6-methoxy flavone is inhibited by binding of NFAT with a regulatory factor of a cytokine gene do.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 면역 억제제는 Th1 또는 Th2 타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것을 특징으로 한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the immunosuppressive agent according to the present invention is characterized by down-regulating the expression of a Th1 or Th2 type cytokine.

본 명세서에서, 용어 “Th1-타입 사이토카인”은 Th1 세포의 생성 및/또는 활성에 의해 생성되는 사이토카인, 예컨대, IL-1β, IL-2, IL-12, IL-17, IFN-γ 또는 TNF-α 등을 의미한다.As used herein, the term " Th1-type cytokine " refers to cytokines produced by the production and / or activity of Th1 cells such as IL-1β, IL-2, IL-12, IL-17, IFN- TNF-alpha, and the like.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환에 적용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것은 자가면역질환 또는 염증 질환이고, 보다 더 바람직하게는 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병 및 류마티스 관절염이다. The down-regulation of the expression of Th1-type cytokine to which the composition of the present invention is applied is not particularly limited, and preferably applies to transplant rejection, autoimmune disease or inflammatory diseases. More preferably, the down-regulation of the expression of a Th1-type cytokine to which the composition of the present invention is applied is an autoimmune or inflammatory disease, and more preferably, is selected from the group consisting of colitis, inflammatory bowel disease, type 1 diabetes, And rheumatoid arthritis.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것은 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 공다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 천식, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병, 다발경화증, 자폐스펙트럼 장애, 주의력결핍 장애 및 주의력 결핍 과잉행동장애를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Down-regulating the expression of a Th1-type cytokine to which the composition of the present invention is applied may be useful for the treatment and / or prevention of a condition selected from the group consisting of colitis, inflammatory bowel disease, type 1 diabetes, type 2 diabetes, rheumatoid arthritis, Reactive Arthritis, osteoarthritis, Sarcoidosis, Borreliosis, Neurogenic-Borrelia, Tuberculosis, Sarcoidosis, Cerebral Palsy, Graves' Disease, Leprosy, Syphilis, Lyme, Chronic inflammatory syndrome, chronic fatigue syndrome, chronic fatigue syndrome, chronic fatigue syndrome, chronic inflammatory bowel syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, chronic obstructive pulmonary disease, Myoclonic encephalomyelitis, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, multiple sclerosis, autism spectrum disorders, attention deficit disorder, and attention deficit hyperactivity disorder It includes, but is not limited to.

본 명세서에서, 용어 “Th2-타입 사이토카인”은 알러젠-특이 Th2 세포의 생성 및 활성에 의한 IgE 및 매스트 세포 등을 의미한다.As used herein, the term " Th2-type cytokine " refers to IgE and mast cells produced by the production and activation of allergen-specific Th2 cells.

본 발명의 Th2-타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 알러지 질환에 적용된다. Th2 세포는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th2 세포는 체액성 면역반응에 관여한다.The down-regulation of the expression of the Th2-type cytokine of the present invention is not particularly limited, and is preferably applied to allergic diseases. Th2 cells refer to a subset of helper T cell lymphocytes that are specified in terms of gene expression, protein secretion and functional activity. For example, Th2 cells exhibit IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13 cytokine expression patterns. Th2 cells are involved in the humoral immune response.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th2-타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것은 아토피 피부염, 아토피와 관련된 다른 피부학적 질환, 알러지 비염(급성 또는 만성), 고초열 및 알러지 기관지 천식을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Down-regulating the expression of Th2-type cytokines to which the composition of the present invention is applied may include atopic dermatitis, other dermatological diseases associated with atopy, allergic rhinitis (acute or chronic), fever and allergic bronchial asthma, It is not.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 Th2-타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것은 상기 알러지 중 특히 아토피 피부질환을 대상으로 한다.
According to a more preferred embodiment of the present invention, the down-regulation of the expression of Th2-type cytokine to which the composition of the present invention is applied is aimed at atopic skin diseases among the above-mentioned allergies.

본 발명의 Th1 타입 또는 Th2 타입 면역 질환의 예방 또는 치료 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The Th1-type or Th2-type immunological disease preventive or therapeutic composition of the present invention can be prepared from a pharmaceutical composition, and in this case, includes a pharmaceutically acceptable carrier other than the above-mentioned components as an active ingredient. Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 피부 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous infusion, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, topical skin administration and the like.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-2000 mg/kg(체중)이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, severity of disease symptoms, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient Ordinarily skilled physicians can easily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-2000 mg / kg (body weight) per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dosage form by using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

한편, 본 발명의 Th1 타입 또는 Th2 타입 면역 질환의 예방 또는 치료 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 염증성 질환과 같은 Th1 타입 또는 Th2 타입 면역 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.
On the other hand, the composition for the prevention or treatment of Th1 type or Th2 type immune diseases of the present invention can be prepared from foods, especially functional food compositions. Functional food compositions of the present invention include ingredients that are commonly added in the manufacture of food, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings. For example, when it is made of a drink, a flavoring agent or a natural carbohydrate may be added as an additional ingredient in addition to the extract of zucchini as an active ingredient. For example, natural carbohydrates include monosaccharides (e.g., glucose, fructose, etc.); Disaccharides (eg maltose, sucrose, etc.); oligosaccharide; Polysaccharides (eg, dextrins, cyclodextrins, etc.); And sugar alcohols (eg, xylitol, sorbitol, erythritol, and the like). As the flavoring agent, natural flavoring agents (e.g., taumartin, stevia extract, etc.) and synthetic flavoring agents (e.g., saccharin, aspartame, etc.) can be used. Taking into consideration the easy accessibility to foods, the food of the present invention is very useful for the prevention or treatment of Th1 type or Th2 type immune diseases such as inflammatory diseases.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명의 플라본 계열 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 억제제 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 또는 식품 조성물을 사용하면, Th1 타입 또는 Th2 타입 면역 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.(a) Immunosuppressive agents comprising the flavone-based compound of the present invention as an active ingredient and pharmaceutical compositions or food compositions containing them are useful for the prevention or treatment of Th1 type or Th2 type immune diseases.

(b) 본 발명의 면역 억제제는 식물 추출물에서 유래한 것이므로 인체에 안정성을 가지면서 면역 억제에 대해서 우수한 효능을 가진다.(b) Since the immunosuppressant of the present invention is derived from a plant extract, the immunosuppressant of the present invention has stability to the human body and has an excellent immunosuppressive effect.

(c) 본 발명의 면역 억제제는 NFAT가 사이토카인 유전자의 조절 인자와의 결합을 억제시켜, 핵 내부로의 전이를 막아 그 효능을 발휘한다.
(c) The immunosuppressant of the present invention inhibits the binding of NFAT to a regulatory factor of a cytokine gene, thereby preventing its transfer into the nucleus and exerting its effect.

도 1은 CNS-9의 인핸서 활성을 억제하는 천연 화합물을 상대적인 형광 활성도를 이용하여 측정한 도표이다. EL4 세포(6 X 105)에 DMSO 비이클(0.5%) 또는 367개 천연 단일 화합물(0.5 mg/ml)로 처리하였다. 처리 4시간 경과 후, 형광 활성을 Steady-glo 시약을 이용하여 측정하였다. 결과는 미처리 세포 대비 상대적 형광 활성도를 퍼센트로 나타내었다. 50% 이상 활성 억제를 보여준 4 개의 화합물을 스크리닝 하였다. 데이터 값은 표준 편차 감안하여 3번 측정한 평균값이고, 3번의 독립적인 실험을 대표한다. **p<0.01
도 2는 플라보니이드 화합물의 카테고리 표이다. 선택된 네 가지 화합물 정보는 한국 화합물 은행에서 제공받았다. 4 가지 화합물에 대한 명칭, 분자식, 분자량 및 스크리닝에 필요한 몰 농도가 기재되어 있다.
도 3은 6-메톡시플라본(6-MF)이 EL4 T 세포 및 Th2 세포에서 사이토카인 발현량을 효과적으로 억제하는 것을 보여주는 도표이다. 아이소타입 IgG가 대조군으로 이용되었다.
도 4는 인 비트로에서 분화한 Th2 세포를 배지, DMSO 비이클 도는 6-MF로 선-처리하여 PMA와 이오노마이신으로 자극하거나, 자극하지 않은채로 24 시간 동안 둔 결과의 IL-10의 세포내 농도를 유동세포계측법으로 분석한 결과이다.
도 5는 6-MF가 Th1 세포에서 상대적 사이트카인 mRNA 발현량을 억제하고, Th2 세포에서 IL-10 및 IL-4의 세포내 발현량을 억제하는 것을 보여주는 도표이다. 아이소타입 IgG가 대조군으로 이용되었다.
도 6는 인 비트로에서 분화한 Th2 세포를 배지, DMSO 비이클 도는 6-MF로 선-처리하여 PMA와 이오노마이신으로 자극하거나, 자극하지 않은채로 24 시간 동안 둔 결과의 IL-4의 세포내 농도를 유동세포계측법으로 분석한 결과이다.
도 7은 6-MF이 T 세포 내에서 NFAT1의 핵 위치 전위를 감소시키는바, 6-MF의 농도를 5, 10 및 20 uM을 각각 처리하였을 때, 감소량을 pXPG 발광효소를 이용하여 상대적 형광량을 측정한 도표이다. 본 데이터 값은 각각 독립적인 세 번의 실험 값의 평균이며, *p<0.05, **p<0.01이다.
도 8은 인 비트로에서 분화된 Th2 세포에서 상대적인 NFAT1 mRNA량을 6-MF가 있는 환경과 없는 환경에서 측정한 도표이다. 데이터 값은 DMSO 비이클 대비 상대적인 mRNA 퍼센트로 나타내었다. 결과는 표준 편차 고려한 값으로 세 번 측정한 평균이다.
도 9는 총 세포 용해물에서 이오노마이신이 첨가된 PMA로 자극시킨 Th2 세포에 NFAT1의 발현량(좌측 패널) 및 핵 추출물에서의 NFAT1의 발현량(우측패널) 여부를 측정한 단백질 전기 영동 겔 사진이다. 베타-액틴 및 Lamin B는 모두 컨트롤로 이용되었다.
도 10은 a-CD3 및 a-CD28 존재하에서, 6-MF의 부존재 시(w/o) 및 5 uM, 20 uM으로 농도를 각각 처리하였을 때 핵에서 NFAT 발현 정도를 분석하기 위해 면역세포화학 및 컨포컬 현미경 사진을 이용하여 분석하였으며, 모든 이미지는 유사한 결과를 나타내는 세 차례 독립적인 실험의 대표 영상을 나타내었다.
도 11은 6-MF가 NFAT1와 사이토카인 유전자의 조절 인자와의 결합을 막는지 상대적인 NFAT1 결합 정도를 알아본 도표이다. 항-FNAT1 항체를 이용한 ChIP으로 수행하였고, IL-10 CNS-9 구역에서의 특이적 프라이머을 가지고 면역 치강시킨 DNA를 정량적 리얼타임 PCR으로 측량하였다. *p<0.05이다.
도 12는 6-MF가 NFAT1와 사이토카인 유전자의 조절 인자와의 결합을 막는지 상대적인 NFAT1 결합 정도를 알아본 도표로, IL-4 프로모터 구역에서의 특이적 프라이머을 가지고 면역 치강시킨 DNA를 정량적 리얼타임 PCR으로 측량하였다. *p<0.05이다.
도 13은 NFAT1이 CNS-9 영역에 대한 인 비트로 결합을 EMSA를 이용한 전기영동 겔 사진이다. 자극된 Th2 세포의 핵 추출물을 비자극 세포와 비교하여 NFAT-공통서열 및 CNA-9 서열을 포함하는 DNA 탐침 증가를 유도하였고, 경쟁적 올리고머 또는 항체를 첨가하여 NFAT의 결합이 억제되는지 알아보았다. NFAT-공통서열은 양성 컨트롤로서 사용되었다.
도 14는 6-MF가 NFAT1의 탈인화를 억제하지 않고, 직접 NFAT1의 핵 위치 전이를 억제하는지 알아보기 위한 상대적인 발광효소 활성 정도를 알아본 도표로, 패널 a는 EL4 세포에서 pXPG, IL-10 소형 프로모터, CNS-9에서, 패널 b는 pXPG, IL-10 소형 프로모터, IL-2 프로모터 발광효소 리포터 벡터에서 mock, NFAT1 및 CA-NFAT1 발현 벡터를 이용하여 알아보았다. 비자극 EL4 T 세포에서 pXPG 벡터의 발광효소 활성을 기준으로 상대적 활성을 판단하였다. *p<0.05, **p<0.01이다.
도 15는 6-MF가 아토피염-유도 마우스에서 분리한 T 세포 및 B 세포의 기능을 억제하는지 알아보기 위해, 상대적인 사이토카인 mRNA 발현량을 알아본 실험 도표이다. CD4+ T 세포 및 CD19+ B 세포를 아토피 피부염-유도 마우스에서 분리하여, 이오노마이신이 첨가된 PMA(50 ng/ml), LPS(50 mg/ml) 및 IL-4(25 ng/ml)로 세포를 자극시켰다. 처리 2 시간 후, 정량적 리얼타임 PCR으로 분석하고, HPRT의 발현량을 노멀화하였다. 결과는 T 세포에 처리한 DMSO의 mRNA의 발현량을 기준으로 하여 상대적인 양을 측정하였다.
도 16은 아토피 피부염 유도 T 세포(좌측 패널) 및 B 세포(우측 패널)의 증식을 측정한 도표이다. 세포를 배양한 후 72 시간 후에 티미딘 검출 반응으로 증식 정도를 측정한 도표이다.
도 17은 B 세포 배지에서 상층액을 모아 48 시간 동안 배양하고 ELISA를 이용하여 IgE의 농도를 측정한 도표로 DMSO 대비 6-MF를 처리 시 농도를 나타내었다.
도 18은 T 세포(1 X 106)를 먼저 24 시간 동안 선배양하고 난 후, 이를 B 세포(1 X 106)와 함께 추가적으로 72 시간 동안 공동배양하였을 때 6-MF의 IgE 농도에 미치는 영향을 알아보는 도표이다.
도 19는 IL-10 발현의 T 세포 기반 리포터 스크리닝 시스템을 보여주는 그림이다. 마우스 IL-10 유전적 위치에서 보존된 논코딩 서열(CNS)의 분석을 수행하였다. CNS 위치를 동정하기 위해 VISTA 유전자 브라우저를 통해 마우스 DNA 서열을 인간의 서열과 비교하였다. CNS-9 및 IL-10 최소 프로모터 구역을 화살표로 표시하였다.
도 20은 CNS-9 및 IL-10 최소 프로모터를 pGL 4.17 전달체 벡터의 발광효소 유전자의 업스트림 유전자 내부에서 클로닝 한 그림이다.
도 21은 각 클론의 지노믹 DNA의 PCR 결과 전기 영동 겔 사진이다. 각 클론에서 지노믹 DNA를 PCR 시켰다. CNS-9 구역, 네오마이신 저항 유전자 및 발광효소 유전자를 발견하여, PCR 생성물을 1% 아가로스 겔로 분리하였고, 그들의 위치를 화살표로 표시하였다. EL4 T 세포의 지노믹 DNA를 음성 컨트롤로 이용하였다.
도 22는 세포수를 달리 한 안정세포의 발광효소 활성을 측정한 도표이다. 안정세포를 비자극 상태로 두거나 이오노마이신(1 mM)이 첨가된 PMA(50 ng/ml)로 자극시켜 Steady-glo 시약으로 측정하였다.
도 23은 세포수를 달리 한 안정세포의 발광효소 활성을 측정한 도표이다. 비자극에 대한 자극의 상대적인 발광효소 활성 비율을 측정하였다. 독립적인 세 번의 실험의 표준 편차를 고려한 평균값이다. *p<0.05, **p<0.01이다.
도 24는 반응 단계 및 화합물 라이브러리 정보를 스크리닝한 것을 도표화하였다. 안정세포를 플레이트에 1시간 동안 접종하였고, 테스트 화합물을 처리하고 4시간 후에 발광효소 활성 Steady-glo 시약을 이용하여 측정하였다.
도 25는 상기 도 24에서 처리한 테스트 화합물을 구조에 따라 분류한 도표이다. 대표 구조 및 테스트 화합물의 전체 개수를 보여주었다.
도 26은 4 가지 선택된 화합물의 구조를 보여주는 그림이다. 각각 화합물의 명칭은 6-메톡시플라본, 7-하이드록시플라본, 바이칼레인, 포모노네틴이다.
도 27은 도 26에서 언급한 상기 4 가지 화합물의 세포 생존도에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. EL4 T 세포(1 x 104) 또는 일차 T 세포 블라스트(3 x 105)를 100 ml의 96 웰에 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, WST-1 용액(10ml)을 첨가하였고, 플레이트를 1 시간 동안 배양하였다. 450 nm에서 흡수를 측정하였다. 미처리 세포와 비교한 상대적 세포 생존도를 백분율로 나타내었다. 세 번 독립적으로 시행하였고, 표준편차를 고려하여 나타내었다.
도 28은 6-MF이 T 세포 내에서 NFAT1의 핵 위치 전위를 감소시키는바, 6-MF의 농도를 5, 10 및 20 uM을 각각 처리하였을 때, 감소량을 레닐라 발광효소로 정상화시킨 반딧불이 발광효소를 이용하여 상대적 형광량을 측정한 도표이다. 본 데이터 값은 각각 독립적인 세 번의 실험 값의 평균이며, *p<0.05, **p<0.01이다.
도 29는 인 비트로에서 분화된 Th2 세포에서 상대적인 IRF4 mRNA량을 6-MF가 있는 환경과 없는 환경에서 측정한 도표이다. 데이터 값은 DMSO 비이클 대비 상대적인 mRNA 퍼센트로 나타내었다. 결과는 표준 편차 고려한 값으로 세 번 측정한 평균이다.
도 30은 총 세포 용해물에서 이오노마이신이 첨가된 PMA로 자극시킨 Th2 세포에 NFAT1의 발현량(좌측 패널) 및 핵 추출물에서의 NFAT1의 발현량(우측패널) 여부를 측정한 단백질 전기 영동 겔 사진이다. 베타-액틴 및 Lamin B는 모두 컨트롤로 이용되었다.
도 31는 6-MF가 직접적으로 NFAT1의 핵 전이를 억제하며, 탈인산화에 관여하지 않음을 보여주기 위해 리포터 에세이를 수행한 형광 사진이다. pXPG, IL-10 미니멀 프로모터, CNS-9(패널 A) 또는 IL-2 프로모터 발광 효소 리포터 벡터(패널 B)를 mock, NFAT1 및 CA-NAFT1 발현 벡터와 같이 공동 -형질전화시켰다. 12 시간 경과 후, 6-MF가 존재하거나 부존재 시에 세포를 비자극 상태로 유지하거나, 이오노마이신이 첨가된 PMA로 자극시킬 때의 상대적인 pXPG 발광 효소 활성를 비교하였다.FIG. 1 is a chart of natural compounds that inhibit enhancer activity of CNS-9 using relative fluorescence activity. EL4 cells (6 × 10 5 ) were treated with DMSO vehicle (0.5%) or 367 natural single compounds (0.5 mg / ml). After 4 hours of treatment, the fluorescence activity was measured using a Steady-glo reagent. The results showed relative fluorescence activity as a percentage of untreated cells. Four compounds showing over 50% activity inhibition were screened. The data values are the mean values measured three times in consideration of the standard deviation and represent three independent experiments. ** p < 0.01
Fig. 2 is a category table of flavonoid compounds. The selected four compounds were provided by the Korean Chemical Bank. The names of the four compounds, the molecular formula, the molecular weight and the molar concentration required for screening are described.
Figure 3 is a graph showing that 6-methoxy flavone (6-MF) effectively inhibits the amount of cytokine expression in EL4 T cells and Th2 cells. Isotype IgG was used as a control.
Figure 4 shows the intracellular concentration of IL-10, which is the result of preincubation of Th2 cells differentiated in vitro with DMSO vehicle or 6-MF, stimulated with PMA and ionomycin, or left untreated for 24 hours As a result of flow cytometry.
FIG. 5 is a graph showing that 6-MF suppresses mRNA expression of relative cytokine mRNA in Th1 cells and suppresses intracellular expression of IL-10 and IL-4 in Th2 cells. Isotype IgG was used as a control.
Figure 6 shows the intracellular concentration of IL-4 in the presence of 24 hrs of stimulation with PMA and ionomycin, pretreatment of Th2 cells differentiated in vitro with DMSO vehicle or 6-MF, As a result of flow cytometry.
FIG. 7 shows that when 6-MF decreases the nuclear localization of NFAT1 in T cells, when the concentration of 6-MF is treated at 5, 10 and 20 uM, the amount of decrease is compared with that of pXPG luminescence enzyme FIG. This data value is the average of three independent experiments, * p <0.05, ** p <0.01.
FIG. 8 is a graph showing the relative amount of NFAT1 mRNA in Th2 cells differentiated from in vitro, in an environment with and without 6-MF. FIG. Data values are expressed as mRNA percent relative to DMSO vehicle. The result is an average of three measurements, taking into account the standard deviation.
9 is a graph showing the amount of NFAT1 expression (left panel) and the amount of expression of NFAT1 in the nuclear extract (right panel) measured on Th2 cells stimulated with PMA supplemented with ionomycin in total cell lysate It is a photograph. Beta-Actin and Lamin B were all used as controls.
10 shows the results of immunocytochemistry and immunohistochemistry for the analysis of the degree of NFAT expression in the nuclei in the presence of 6-MF (w / o) and 5 uM and 20 uM, respectively, in the presence of a-CD3 and a- Confocal microscope photographs were used to analyze the images. All images showed representative images of three independent experiments showing similar results.
FIG. 11 is a diagram showing the degree of relative NFAT1 binding, in which 6-MF inhibits binding of NFAT1 with a regulatory factor of cytokine gene. DNA was performed with ChIP using anti-FNAT1 antibody and DNA immunostained with specific primers in the IL-10 CNS-9 region was quantitated by quantitative real-time PCR. * p < 0.05.
FIG. 12 is a graph showing the relative degree of NFAT1 binding relative to whether 6-MF inhibits the binding of NFAT1 with a regulatory factor of a cytokine gene. FIG. 12 is a graph showing the relative amount of NFAT1 binding in the quantitative real- PCR. * p < 0.05.
13 is an electrophoresis gel picture NFAT1 the EMSA using the in vitro binding to CNS-9 region. The nuclear extracts of stimulated Th2 cells were compared with non-stimulated cells to induce DNA probe amplification involving NFAT-common and CNA-9 sequences, and competitive oligomers or antibodies were added to inhibit binding of NFAT. The NFAT-common sequence was used as a positive control.
FIG. 14 is a graph showing the relative activity of luminescence enzyme activity to examine whether 6-MF suppresses nuclear localization of NFAT1 directly without inhibiting dephosphorylation of NFAT1. Panel a shows pXPG, IL-10 Panel b was investigated using the mock, NFAT1 and CA-NFAT1 expression vectors in the pXPG, IL-10 small promoter, and IL-2 promoter luminescent enzyme reporter vectors in the small promoter, CNS-9. Relative activity was determined based on the luminescence enzyme activity of pXPG vector in non-stimulated EL4 T cells. * p < 0.05, ** p < 0.01.
FIG. 15 is an experiment chart showing the relative amount of cytokine mRNA expression in order to examine whether 6-MF inhibits the functions of T cells and B cells isolated from atopic salt-induced mice. CD4 + T cells and the CD19 + B cells, atopic dermatitis - isolated from induced mice, Io the Norma who is adding PMA (50 ng / ml), LPS (50 mg / ml) and IL-4 (25 ng / ml ) Lt; / RTI &gt; cells. After 2 hours of treatment, it was analyzed by quantitative real-time PCR and the expression level of HPRT was normalized. The results are expressed as relative amounts based on the amount of mRNA expression of DMSO treated with T cells.
FIG. 16 is a graph showing the proliferation of atopic dermatitis-induced T cells (left panel) and B cells (right panel). And the degree of proliferation was measured by thymidine detection reaction after 72 hours from culturing the cells.
FIG. 17 shows the concentration of IgE in the B cell culture medium when the supernatant was collected for 48 hours and the concentration of IgE was measured using ELISA. The concentration of 6-MF was compared with that of DMSO.
Figure 18 shows the effect of 6-MF on IgE concentration when T cells (1 × 10 6 ) were first preincubated for 24 hours and then co-cultured with B cells (1 × 10 6 ) for an additional 72 hours .
Figure 19 shows a T cell-based reporter screening system for IL-10 expression. Analysis of non-coding sequences (CNS) conserved at the mouse IL-10 genetic site was performed. The mouse DNA sequence was compared with human sequences via the VISTA gene browser to identify CNS positions. The CNS-9 and IL-10 minimal promoter regions are indicated by arrows.
FIG. 20 is a photograph of the CNS-9 and IL-10 minimal promoters cloned in the upstream gene of the luciferase gene of the pGL 4.17 transporter vector.
21 is an electrophoresis gel photograph of the genomic DNA of each clone as a result of PCR. Genomic DNA was PCR amplified from each clone. The CNS-9 region, the neomycin resistance gene and the luciferase gene were found, and the PCR products were separated into 1% agarose gels and their positions were indicated by arrows. Genomic DNA of EL4 T cells was used as a negative control.
FIG. 22 is a chart for measuring the luminescence activity of stable cells with different cell numbers. FIG. Stable cells were either stimulated with PMA (50 ng / ml) supplemented with ionomycin (1 mM) or non-stimulated and measured with a Steady-glo reagent.
FIG. 23 is a chart for measuring the luminescence enzyme activity of a stable cell with different cell numbers. Relative luminescence enzyme activity ratio of stimulation to non-stimulation was measured. It is an average value considering the standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01.
Figure 24 plots the screening of the reaction steps and compound library information. Stable cells were inoculated on the plate for 1 hour, and the test compound was treated and measured 4 hours later using the luminescent enzyme active Steady-glo reagent.
FIG. 25 is a chart showing the test compounds treated in FIG. 24 according to the structure. FIG. Representative structure and total number of test compounds were shown.
Figure 26 is a diagram showing the structure of four selected compounds. The names of the respective compounds are 6-methoxy flavone, 7-hydroxy flavone, baicalen, and pomonotethine.
FIG. 27 is a graph showing the effect of the four compounds mentioned in FIG. 26 on cell viability. EL4 T cells (1 x 10 4 ) or primary T cell blast (3 x 10 5 ) were cultured in 100 ml of 96 wells for 24 hours. After incubation, WST-1 solution (10 ml) was added and the plate was incubated for 1 hour. Absorption at 450 nm was measured. Relative cell viability relative to untreated cells was expressed as a percentage. Three independent experiments were carried out, taking into account the standard deviation.
FIG. 28 shows that 6-MF reduces the nuclear localization potential of NFAT1 in T cells. When the concentration of 6-MF is treated at 5, 10, and 20 uM, the reduction amount is reduced by the firefly luminescence And the relative fluorescence intensity was measured using an enzyme. This data value is the average of three independent experiments, * p <0.05, ** p <0.01.
FIG. 29 is a graph showing the relative amount of IRF4 mRNA in Th2 cells differentiated in vitro from an environment with and without 6-MF. FIG. Data values are expressed as mRNA percent relative to DMSO vehicle. The result is an average of three measurements, taking into account the standard deviation.
30 is a graph showing the amount of NFAT1 expression (left panel) and the amount of expression of NFAT1 in the nuclear extract (right panel) in Th2 cells stimulated with PMA supplemented with ionomycin in total cell lysate It is a photograph. Beta-Actin and Lamin B were all used as controls.
Figure 31 is a fluorescence image in which a reporter assay was performed to show that 6-MF directly inhibits nuclear transfer of NFAT1 and does not participate in dephosphorylation. The pXPG, IL-10 minimal promoter, CNS-9 (panel A) or IL-2 promoter luminescent enzyme reporter vector (panel B) was co-transfected with mock, NFATl and CA-NAFTl expression vectors. After 12 hours, the relative pXPG luminescence activity was compared when the cells were kept in a non-stimulated state in the presence or absence of 6-MF or stimulated with PMA supplemented with ionomycin.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험 재료 및 실험 방법Experimental Materials and Experimental Methods

동물animal

C57BL/6 및 Balb/c 마우스는 SLC Inc.(Shizuoka, Japan)에서 구입하였고, 광주 과학 기술원(GIST)의 동물 실험실에서 특정 무균 환경으로 유지하였다. 동물 실험은 광주 과학 기술원의 실험 동물 운영회에서 승인하였다.
C57BL / 6 and Balb / c mice were purchased from SLC Inc. (Shizuoka, Japan) and maintained in a specific aseptic environment in an animal laboratory of the GIST. Animal experiments were approved by the experimental animal management committee of the Gwangju Institute of Science and Technology.

벡터, 시약 및 항체Vectors, reagents and antibodies

pGL4.17 반딧불이 및 pRL-TK 레닐라 발광효소 벡터는 Promega(WI, USA)에서 구입하였다. NFAT1 및 항상적으로 활성인 NFAT1에 대한 발현 벡터는 Addgene(MA, USA)에서 구입하였다. 다음의 시약들을 사용하였다: 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 이오노마이신은 Calbiochem(CA, USA)에서; DMSO, 6-메톡시플라본 및 IL-12는 Sigma(MO, USA)에서; 인간 IL-2는 국립 암 연구소, Preclinical Repository(Bethesda, USA)에서 ; murine IL-4는 Peprotech(NJ, USA)에서 구입하였다.pGL4.17 Firefly and pRL-TK Renilla luciferase vectors were purchased from Promega (WI, USA). Expression vectors for NFAT1 and the always active NFAT1 were purchased from Addgene (MA, USA). The following reagents were used: perborate 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin in Calbiochem (CA, USA); DMSO, 6-methoxy flavone and IL-12 were obtained from Sigma (MO, USA); Human IL-2 is detected in the National Cancer Institute, Preclinical Repository (Bethesda, USA); Murine IL-4 was purchased from Peprotech (NJ, USA).

다음의 항체들을 사용하였다: 항-CD3(145.2C11), 항-CD28 (37.51), 항-IFN-γ(XMG1.2), 항-IL-12(C17.8), FITC-항-IL-10 (JES5-16E3) 및 FITC-항-IL-4 (11B11)은 BD Pharmingen(CA, USA)에서; anti-IL-4(11B11)은 국립 암 연구소 Preclinical Repository(Bethesda, USA)에서; 항-NFAT1(4G6-G5), 항-IRF4 및 항-Lamin B(C-20)은 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서; 항-β-액틴(ACTN05)은 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다.
The following antibodies were used: anti-CD3 (145.2C11), anti-CD28 (37.51), anti-IFN-y (XMG1.2), anti- 10 (JES5-16E3) and FITC-anti-IL-4 (11B11) were purchased from BD Pharmingen (CA, USA); anti-IL-4 (11B11) was obtained from National Cancer Institute Preclinical Repository (Bethesda, USA); Anti-NFAT1 (4G6-G5), anti-IRF4 and anti-Lamin B (C-20) were obtained from Santa Cruz Biotechnology (CA, USA); Anti-beta-actin (ACTN05) was purchased from Abcam (Cambridge, UK).

IL-10 부위의 컴퓨터 분석Computer analysis of IL-10 site

IL-10 유전자의 120-kb 범위의 유전자 시퀀스는 보존된 논코딩 스퀀스(CNS)를 알아보기 위하여 웹 기반 소프트웨어 VISTA 브라우저 2.0 (http://pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2)를 이용하여 분석하였다.
The gene sequence in the 120-kb range of the IL-10 gene was analyzed using the web-based software VISTA browser 2.0 (http://pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2) to determine the conserved noncoding sequence (CNS) Respectively.

안정세포주의 개발 및 천연 화합물 라이브러리의 선별Development of stable cell lines and selection of natural compound libraries

크기가 작은 프로모터 및 발광효소와 네오마이신 저항 유전자를 포함하는 pGL4.17 벡터 안에 위치한 IL-10의 CNS-9 구역을 클로닝하여 리포터 컨스트럭트를 만들었다. EL4 세포는 생산자의 프로토콜에 따라서Multiporator(Eppendorf, Hamburg, Germany)로 전기천공하였다. 이후, 형질전환 세포는 900 mg/ml의 G418(Invitrogen, CA, USA)가 포함된 배양 배지를 이용하여 선별한다. 367가지 천연 화합물이 포함된 화학 라이브러리는 한국 화합물 은행(대전, 한국)에서 구입하였다. 스크리닝을 하기 위해, 안정세포를 96-웰이 부착된 마이크로플래이트에 6ⅹ105 세포밀도로 접종하였고, 화학 희석액 0.5 mg/ml으로 4시간 동안 처리하였다. 그리고 나서 발광효소 활성을 생산자의 프로토콜에 따라 Steady-Glo 시약(Promega)을 이용하여 측정하였다.
Reporter constructs were made by cloning the CNS-9 region of IL-10 located in the pGL4.17 vector containing the small size promoter and the luminescent enzyme and the neomycin resistance gene. EL4 cells were electroporated into Multiporator (Eppendorf, Hamburg, Germany) according to the manufacturer's protocol. The transformed cells are then screened using a culture medium containing 900 mg / ml of G418 (Invitrogen, CA, USA). Chemical libraries containing 367 natural compounds were purchased from Korea Compound Bank (Daejeon, Korea). For screening, the stable cells were inoculated to 96-well microplates with a cell density of 6 x 10 cells and treated with 0.5 mg / ml of chemical diluent for 4 hours. The luminescence enzyme activity was then measured using a Steady-Glo reagent (Promega) according to the manufacturer's protocol.

일시적 형질전환 및 리포터 분석Transient Transformation and Reporter Analysis

EL4 또는 HEK293FT 세포들은 제조자의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 또는 Multiporator system과 함께 Hypoosmolar 전기천공 완충용액(Eppendorf)으로 전기 천공하여 형질전환 하였다. 리포터 분석에서, pXPG 벡터를 pRL-TK renilla 벡터와 함께 공동형질전환 하였다. 12시간 플래이팅 후에, 화학 물질이 존재하거나 없는 조건에서 PMA와 이오노마이신으로 24시간동안 세포들을 배양하였고, 리포터 활성을 이중 발광효소 분석 시스템(Promega)으로 측정하였다. 반딧불이 발광효소 활성은 renilla 발광효소의 활성에 의해 표준화하였다.
EL4 or HEK293FT cells were transformed by electroporation with Hypoosmolar electroporation buffer (Eppendorf) with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) or Multiporator system according to the manufacturer's protocol. In reporter assays, the pXPG vector was co-transformed with the pRL-TK renilla vector. After 12 hour fermentation, cells were cultured for 24 hours with PMA and ionomycin in the presence or absence of chemicals, and reporter activity was measured with a bioluminescent enzyme assay system (Promega). Firefly luciferase activity was standardized by the activity of renilla luciferase.

세포주 및 T 세포 분화Cell line and T cell differentiation

EL4 마우스 가슴샘종 및 인간 HEK 293FT 세포는 각각 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)과 Invitrogen(CA, USA)에서 구입하였다. T 세포는 림프구와 8주-10주의 C57BL/6 마우스의 비장에서 CD4+ T 세포 분리 자기 구슬(L3T4, Miltenyi, CA, USA)을 이용하여 정제하였다. T 세포는 10%의 FBS, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 소듐 피루브산, HEPES 및 β-머캅토에탄올 등이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. T 세포 분화를 위해, 세포들은 1 mg/ml plate-bound anti-CD3ε 1 mg/ml 및 용해성 anti-CD28 mg/ml을 Th1-skewing(10 ng/ml IL-12 plus 10 mg/ml anti-IL-4) 또는 Th2-skewing(10 ng/ml IL-4, 10 mg/ml anti-IFN-g plus 10 mg/ml anti-IL-12)조건에서 배양하였다. 이후 세포들은 100 U/ml의 재조합 인간 IL-2가 함유된 완전 배지에서 7일 동안 자랐다. 7일차에 분화한 T 세포는 화학물질이 존재하거나 없는 조건에서 PMA와 이오노마이신을 첨가하여 배양하였다.
EL4 mouse thymoma and human HEK 293FT cells were purchased from Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) and Invitrogen (CA, USA), respectively. T cells were purified using CD4 + T cell isolation magnetic beads (L3T4, Miltenyi, CA, USA) in lymphocytes and spleens of C57BL / 6 mice at 8 weeks-10 weeks. T cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS, L-glutamine, penicillin / streptomycin, non-essential amino acid, sodium pyruvic acid, HEPES and beta -mercaptoethanol. For T cell differentiation, cells were incubated with 1 mg / ml plate-bound anti-CD3? 1 mg / ml and soluble anti-CD28 mg / ml with Th1-skewing (10 ng / ml IL-12 plus 10 mg / 4) or Th2-skewing (10 ng / ml IL-4, 10 mg / ml anti-IFN-g plus 10 mg / ml anti-IL-12). The cells were then grown for 7 days in complete medium containing 100 U / ml of recombinant human IL-2. T cells differentiated on day 7 were cultured by adding PMA and ionomycin in the presence or absence of chemical substances.

정량적 RT-PCR 분석Quantitative RT-PCR analysis

모든 RNA는 생산자의 프로토콜에 따라 TRIzol reagent(Molecular Research Center, Ohio, USA)를 이용하여 추출하였다. cDNA는 Improm-II 역전사 시스템(Promega)를 이용하여 1 mg의 RNA를 함유하는 20 μl 혼합물에서 합성하였다. cDNA, SYBR Premix Ex Taq(Takara, Shiga, Japan), 표 1에 있는 프라이머 및 Chromo-4 Detector(MJ research, MA, USA)가 있는 DNA 엔진를 이용하여, 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 데이터는 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 전달효고(HPRT)의 발현 레벨을 이용하여 정상화하였다. All RNAs were extracted using TRIzol reagent (Molecular Research Center, Ohio, USA) according to the manufacturer's protocol. cDNA was synthesized in a 20 μl mixture containing 1 mg of RNA using the Improm-II reverse transcription system (Promega). Quantitative RT-PCR was performed using a DNA engine with cDNA, SYBR Premix Ex Taq (Takara, Shiga, Japan), primers in Table 1 and a Chromo-4 Detector (MJ research, MA, USA). Data were normalized using expression levels of hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT).

GeneGene Sequences (5'- 3')Sequences (5'-3 ') Tm (℃)Tm (℃) HPRTHPRT F : TTATGGACAGGACTGAAAGACF: TTATGGACAGGACTGAAAGAC 59.4259.42 R : GCTTTAATGTAATCCAGCAGGTR: GCTTTAATGTAATCCAGCAGGT 61.0461.04 IFN-gIFN-g F : GAGCCAGATTATCTCTTTCTACCF: GAGCCAGATTATCTCTTTCTACC 60.1060.10 R : GTTGTTGACCTCAAACTTGGR: GTTGTTGACCTCAAACTTGG 59.5559.55 IL-2IL-2 F : TGAGCAGGATGGAGAATTACAGGF: TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG 64.0864.08 R : GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCACR: GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC 63.1863.18 IL-4IL-4 F : CAACGAAGAACACCACAGAGF: CAACGAAGAACACCACAGAG 61.1961.19 R : GGACTTGGACTCATTCATGGR: GGACTTGGACTCATTCATGG 60.4260.42 IL-5IL-5 F : AGCACAGTGGTGAAAGAGACF: AGCACAGTGGTGAAAGAGAC 62.3762.37 R : TCCAATGCATAGCTGGTGATTTR: TCCAATGCATAGCTGGTGATTT 62.7362.73 IL-10IL-10 F : GAAGACAATAACTGCACCCAF: GAAGACAATAACTGCACCCA 60.2760.27 R : CAACCCAAGTAACCCTTAAAGTCR: CAACCCAAGTAACCCTTAAAGTC 61.4361.43 IL-13IL-13 F : GCAACATCACACAAGACCAGAF: GCAACATCACACAAGACCAGA 63.2163.21 R : GTCAGGGAATCCAGGGCTACR: GTCAGGGAATCCAGGGCTAC 64.2264.22 TNF-aTNF-a F : CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAF: CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 61.9461.94 R : TGGGAGTAGACAAGGTACAACR: TGGGAGTAGACAAGGTACAAC 61.1761.17 IRF4IRF4 F : TCCGACAGTGGTTGATCGACF: TCCGACAGTGGTTGATCGAC 64.3364.33 R : CCTCACGATTGTAGTCCTGCTTR: CCTCACGATTGTAGTCCTGCTT 64.3964.39 NFAT1NFAT1 F : ATCTGCAGCATCCCTGTGACF: ATCTGCAGCATCCCTGTGAC 64.7864.78 R : CTGCCCTCCGTCTCATAGTGR: CTGCCCTCCGTCTCATAGTG 64.2264.22

표 1은 정량적 리얼타임에 사용되는 PCR 프라이머 서열이다.
Table 1 shows PCR primer sequences used in quantitative real time.

유세포Flow cell 분석 analysis

T 세포는 24시간동안 배양하였고, 1 mg/ml의 Brefeldin A(Sigma)를 배양을 마치기 14시간 전에 첨가하였다. 세포는 0.5% 사포닌 및 1 %의 BSA를 함유하는 투과 완충용액에서 두 번 세척하였다. 이후 세포를 세포내 탐색을 위해 항체를 부착시켜 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 세척하였고 PBS에서 재현탁하여, 최소 20,000회 결과를 EPIC XLTM 및 EXPO32TM 소프트웨어(Beckman Coulter, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
T cells were cultured for 24 hours, and 1 mg / ml of Brefeldin A (Sigma) was added 14 hours before completion of the culture. Cells were washed twice in permeabilization buffer containing 0.5% saponin and 1% BSA. The cells were then incubated for 20 min at 4 ° C with an antibody attached for intracellular exploration. Cells were washed, resuspended in PBS, and at least 20,000 results were analyzed using EPIC XLTM and EXPO32TM software (Beckman Coulter, CA, USA).

세포 cell 용해물Melt 및 핵 추출 제작 And nuclear extraction production

모든 용해물을 제조하기 위해, Th2 세포를 단백질 분해효소억제제 칵테일이 함유된 물 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 % NP-40)에서 용해시키고, 이후 아이스에서 30분 동안 배양하였다. 핵 추출물을 위해, Th2 세포는 1 시간동안 배양하고 핵 추출물은 이전 연구에서와 마찬가지로 제조하였다(21). 간략하게, T 세포는 차가운 PBS에서 두 번 세척하고, 단백질 분해억제 효소 칵테일(Roche) 및 0.4% NP-40이 함유된 차가운 buffer A 500 ml에서 재현탁 되었다. 세포들을 15분간 아이스에서 배양하여 수를 늘리고, 세포 분쇄액은 3분간 원심분리 하였다. 핵 알갱이는 차가운 buffer B 150 μl에서 재현탁 되었고, 튜브를 충분히 혼합하고 2시간 동안 회전식 진탕기에 두었다. 핵 추출물은 5분간 원심분리하고, 핵 단백질이 포함된 상층액을 실험에서 사용하였다.
To prepare all the lysates, Th2 cells were lysed in a water RIPA buffer containing protease inhibitor cocktail (50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40) Min. &Lt; / RTI &gt; For the nuclear extract, Th2 cells were cultured for 1 hour and the nuclear extract was prepared as in the previous study (21). Briefly, T cells were washed twice in cold PBS and resuspended in 500 ml of cold buffer A containing protease inhibitor cocktail (Roche) and 0.4% NP-40. The cells were cultured in ice for 15 minutes to increase the number, and the cell lysate was centrifuged for 3 minutes. Nuclear pellets were resuspended in 150 μl of cold buffer B, the tubes were mixed well and placed on a rotary shaker for 2 hours. Nuclear extracts were centrifuged for 5 minutes and supernatants containing nuclear proteins were used in the experiments.

면역 immune 블로팅Blotting 법 method

T 세포의 모든 용해물 또는 핵 추출물(20-40 μg)은 7.5~10% SDS-PAGE에 두고, 면역 블로팅 분석을 위해 니트로셀룰로오즈 막 안으로 전기 천공에 의해 형질 전환시켰다. 막은 NFAT1, β-액틴 또는 Lamin B에 대응하는 항체를 달아 배양하였다. 블로팅은 양고추냉이 퍼옥시데이즈(HRP)-컨쥬게이션된 이차 항체(Sigma) 및 ECL 웨스턴 블로팅 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech, IL, USA)를 이용하였다.
All lysates or nuclear extracts (20-40 μg) of T cells were placed on 7.5-10% SDS-PAGE and transformed by electroporation into a nitrocellulose membrane for immunoblot analysis. The membrane was incubated with an antibody corresponding to NFAT1, [beta] -actin or Lamin B. Bleeding was performed using horseradish peroxidase (HRP) -conjugated secondary antibody (Sigma) and ECL Western blotting detection kit (Amersham Pharmacia Biotech, IL, USA).

면역 세포화학Immune cell chemistry

둥근 유리를 12 웰 플래이트에 두었고, 항-CD3(1 mg/ml) 또는 폴리-L-라이신(Sigma)으로 4℃에서 12 시간 동안 처리하여 두었다. 유리는 PBS로 3 차례 세척하였고, 이후 1× 106의 밀도로 T 세포를 유리 위로 전이시켰다. 세포는 6-MF가 존재하거나 없는 조건에서 항-CD28(2 mg/ml)로 처리하여 배양하였고, 10-15분 간 실온에서 아이스 100% 메탄올로 고정시켰다. PBS(0.25 % Triton X-100)로 세척한 후, 세포는 PBST(3 % BSA)로 30분 간 37℃에서 고정시켰다. 세포는 항-NFAT1 항체는 4℃에서 12시간 동안 배양하였고, 이후 FITC-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체로 염색하였다. 대조 염색을 위해, 세포를 20 mg/ml가 함유된 RNase 2X SSC 용액(0.3 M NaOH, 0.03 M sodium citrate, pH7.0)에서 배양하였고, 그리고 나서 핵을 프로피듐 아이오다이드(Invitrogen)로 염색하였다. 염색된 세포는 FV1000 컨포컬 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였고, 영상은 Olympus FLUOVIEW 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
The rounded glass was placed on a 12-well plate and treated with anti-CD3 (1 mg / ml) or poly-L-lysine (Sigma) for 12 hours at 4 ° C. The glass was washed three times with PBS, and then the T cells were transferred to glass at a density of 1 × 10 6 . Cells were treated with anti-CD28 (2 mg / ml) in the presence or absence of 6-MF, and fixed with ice 100% methanol for 10-15 minutes at room temperature. After washing with PBS (0.25% Triton X-100), the cells were fixed with PBST (3% BSA) for 30 min at 37 ° C. The cells were incubated with anti-NFAT1 antibody at 4 ° C for 12 hours and then stained with FITC-conjugated anti-mouse IgG antibody. For contrast staining, cells were cultured in RNase 2X SSC solution (0.3 M NaOH, 0.03 M sodium citrate, pH 7.0) containing 20 mg / ml, and then stained with propidium iodide (Invitrogen) Respectively. The stained cells were observed using an FV1000 confocal microscope (Olympus, Japan) and images were processed using Olympus FLUOVIEW software.

크로마틴Chromatin 면역 침강법( Immunoprecipitation method ( ChIPChIP ) 분석) analysis

이전에 언급하였던 바와 같이 약간의 수정을 가하여 ChIP 분석을 수행하였다(22). 간략히 말해서, Th2 세포를 한 시간 동안 배양하고, 이후에 2% 포름알데하이드 용액을 사용하여 가교-결합시켰다. 분해 버퍼에서 배양시킨 후, 세포 용해질은 Bioruptor(Diagenode, Liege, Belgium)을 이용하여 DNA 조각으로 초음파 분해하였다. 잘려진 크로마틴을 NFAT1 및 래빗 IgG에 대한 항체를 이용하여 면역침강 시켰다. DNA와 항체의 복합체는 단백질 G 아가로스(Millipore, MA, USA)를 이용하여 침강시켰고, 이후, 역 가교 결합시켰다. 선택된 DNA 서열들이 실제 있는지 표 2에 있는 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 확인하였다. 컨트롤로서, 면역 침강전에 정제된 DNA를 넣고 즉시 PCR을 돌렸다. ChIP 분석의 정량적인 수준은 입력된 데이터에 의해 표준화하였고, 데이터는 IgG 샘플에 대한 상대적인 수준으로 표시하였다.
As previously mentioned, ChIP analysis was performed with slight modifications (22). Briefly, Th2 cells were cultured for one hour and then cross-linked using 2% formaldehyde solution. After incubation in digested buffer, the lysates were sonicated with DNA fragments using Bioruptor (Diagenode, Liege, Belgium). Chopped chromatin was immunoprecipitated using antibodies against NFATl and Rabbit IgG. The complex of DNA and antibody was precipitated using protein G agarose (Millipore, MA, USA) and then inverse cross-linked. The selected DNA sequences were confirmed by RT-PCR using the primers shown in Table 2. As a control, the purified DNA was added before immunoprecipitation and the PCR was immediately run. The quantitative level of the ChIP assay was normalized by the input data and the data was expressed at relative levels relative to the IgG sample.

GeneGene Sequences (5'- 3')Sequences (5'-3 ') Tm (℃)Tm (℃) Size (bp)Size (bp) CNS-9CNS-9 F : CTTGAGGAAAAGCCAGCATCF: CTTGAGGAAAAGCCAGCATC 61.6361.63 200200 R : TCTGGAAGTGCCATTCTGTAR: TCTGGAAGTGCCATTCTGTA 60.8760.87 IL-4 Promoter (NFAT binding)IL-4 Promoter (NFAT binding) F : AGGCCGATTATGGTGTAATTTF: AGGCCGATTATGGTGTAATTT 59.8359.83 227227 R : GAGTTAAAGTTGCTGAAACCAR: GAGTTAAAGTTGCTGAAACCA 59.0159.01 IL-4 Promoter (GATA3 binding)IL-4 Promoter (GATA3 binding) F : ACTCATTTTCCCTTGGTTTCAGCF: ACTCATTTTCCCTTGGTTTCAGC 63.8663.86 209209 R : GATTTTTGTCGCATCCGTGGR: GATTTTTGTCGCATCCGTGG 62.5862.58

표 2는 크로마틴 면역 침강법에 사용되는 프라이머 서열 표이다.
Table 2 is a primer sequence table used in the chromatin immunoprecipitation method.

전기 Electricity 영동상Youngdong Award 변화 분석법( Change analysis method EMSAEMSA , , ElectrophoreticElectrophoretic mobilitymobility shiftshift assayassay ))

이전에 언급하였던 바와 같이 약간의 수정을 가하여 EMSA를 수행하였다(23). T4 폴리뉴클레오티드 인산화 효소(NEB, MA, USA)를 이용하여 γ-32P-ATP(PerkinElmer, MA, USA)로 이중 나선형 탐침에 표지시키고, 이후 micro column(GE Healthcare, NJ, USA)으로 정제하였다. T 세포의 핵 추출물(10 μg)을 0.1 mg poly (dI-dC)과 함께 결합 버퍼에서 30분간 배양시켰다. 탐침 서열은 표 3에서 언급하였다. 탐침 배양 30분 전에 경쟁자로서 사용될 비표지 올리고머를 혼합물에 첨가하였다. 슈퍼시프트 분석(supershift analysis)를 위해, 핵 추출물은 목적 단백질에 대응하는 항체와 함께 사전 배양하였다. 샘플은 0.5X TBE 버퍼에서 6% 비변성 폴리아크릴아마이드 겔을 조건으로 하였다.
EMSA was performed with a slight modification as previously mentioned (23). T4 polynucleotide kinase (NEB, MA, USA) using a cover and a double spiral probe with γ- 32 P-ATP (PerkinElmer, MA, USA), was then purified with a micro column (GE Healthcare, NJ, USA) . T cell nuclear extracts (10 μg) were incubated with 0.1 mg poly (dI-dC) in binding buffer for 30 min. The probe sequences are listed in Table 3. Unlabeled oligomers to be used as competitors 30 minutes before probe incubation were added to the mixture. For supershift analysis, the nuclear extract was preincubated with the antibody corresponding to the desired protein. Samples were conditioned on a 6% unmodified polyacrylamide gel in 0.5X TBE buffer.

GeneGene Sequences (5'- 3')Sequences (5'-3 ') NFATNFAT F : GATCGCGGAAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAGF: GATCGCGGAAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAG R : CTGTATGAAACAAATTTTCCACTTTGGGCGATCR: CTGTATGAAACAAATTTTCCACTTTGGGCGATC CNS-9CNS-9 F : AGGACGGCGAGAAGGAAACACAGGTGAACACGCF: AGGACGGCGAGAAGGAAACACAGGTGAACACCC R : GCGTGTTCACCTGTGTTTCCTTCTCGCCGTCCTR: GCGTGTTCACCTGTGTTTCCTTCTCGCCGTCCT

표 3은 EMSA에 사용되는 프로브 서열을 보여주는 표이다.
Table 3 is a table showing probe sequences used in EMSA.

아토피 염 실험의 도입Introduction of atopy salt experiment

Balb/c 마우스 귀 표피를 서지컬 테이프(Nichiban, Japan)로 5번 벗겨내고, 이후 아세톤/올리브 오일 용액(아세톤 : 올리브 오일 = 1 : 3)에 용해된 1% 2,4-다이나이트로클로로벤젠(DNCB)(Sigma) 20 μl로 염색하였다. 4일 후에, 마우스 귀를 집먼지 진드기의 추출물(10 mg/ml, Yonsei University, Korea) 20 ml으로 처리하였다. 아토피 피부염의 도입을 4주간 계속하였다.
The Balb / c mouse ear epithelium was peeled 5 times with a surge tape (Nichiban, Japan) and then washed with 1% 2,4-dinitrochloroacetate dissolved in acetone / olive oil solution (acetone: olive oil = 1: 3) Benzene (DNCB) (Sigma). Four days later, mouse ears were treated with 20 ml of house dust mite extract (10 mg / ml, Yonsei University, Korea). The introduction of atopic dermatitis was continued for 4 weeks.

세포 증식법 분석Cell proliferation assay

CD4+ T 세포를 평평한 96-웰 플래이트에서 웰당 2ⅹ105 cells/well 농도로 72시간 동안 배양하였다. 배양 56시간 후, 방사성 동위원소인 [3H] 티미딘(NEN, MA, USA) 0.5 μCi을 각 웰에 첨가하였고, 추가적으로 16시간 동안 표지시켰다. 세포를 글라스 필터에 모으고 액체 섬광 계수기(Beckman, CA, USA)를 이용하여 개수를 세었다. 증식된 정도를 자극 지수로 나타내었으며, 비배양 세포의 샘플과 함께 1분당 수치로 나누어 계산하였다.
CD4 + T cells were cultured in a flat 96-well plate at a concentration of 2 x 10 cells / well per well for 72 hours. Was added after 56 hours incubation, the radioactive isotope of [3 H] thymidine (NEN, MA, USA) 0.5 μCi per well, were labeled for an additional 16 hours. Cells were collected on a glass filter and counted using a liquid scintillation counter (Beckman, CA, USA). The degree of proliferation was expressed as the stimulation index and was calculated by dividing the number of samples per minute with the sample of non-cultured cells.

IgEIgE 수치 측정 Numerical measurement

AD 주입 후 2주 및 4주 후에, 마우스로부터 혈청을 얻었다. IgE의 농도는 200배 묽힌 혈청 및 IgE ELISA kit(BD Biosciences)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 배양 배지의 IgE 수치를 분석하기 위해 3× 106 CD19+ B 세포를 LPS(10 mg/ml) 및 IL-4(20 ng/ml)와 같이 6-MF를 집어 넣거나 집어 넣지 않은 환경에서 72시간 동안 배양하였다.
Serum was obtained from the mice 2 and 4 weeks after AD injection. The concentration of IgE was measured using a 200-fold diluted serum and IgE ELISA kit (BD Biosciences) according to the manufacturer's protocol. In order to analyze the IgE level of the culture medium, 3 × 10 6 CD19 + B cells were cultured for 72 hours in an environment with or without 6-MF, such as LPS (10 mg / ml) and IL-4 (20 ng / ml) Lt; / RTI &gt;

통계적 분석Statistical analysis

모든 데이터 수치는 표준 편차가 고려된 평균값이다. 통계 분석은 student's t-test를 이용하여 수행하였고, p-value는 0.05 이내에서 유의하다.
All data values are mean values taking standard deviation into account. Statistical analysis was performed using a student's t-test and the p-value was significant within 0.05.

실험 결과Experiment result

6-6- 메톡시플라본(6-MF)은Methoxyflavones (6-MF) CNSCNS -9의 -9 인핸서Enhancer 활성을 억제한다 Inhibit activity

본 발명자들은 일찍이 원거리 유전자 조절 서열(distal cis-elementory element)인 CNS-9이 Th2 세포의 IL-10 유전자 전사에서 중요함을 밝힌바 있다(24). CNS-9은 IL-10의 미니멀 프로모터의 활성을 증대시키고, 이 조절 기능은 CNS-9에서 NFAT1과 IRF4의 참여에 의해 조절된다(24). 이 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 CNS-9의 기능에 의해 IL-10 발현에 조절 효과를 갖는 천연 화합물을 스크리닝하기 위해 T 세포-기반 리포터 시스템을 구성하였다. CNS-9 및 IL-10 미니멀 프로모터 위치를 pGL4.17 리포터 벡터에 있는 발광효소 유전자 업스트림에 집어넣고 복제하였다(도 19, 20). 이 리포터 컨스트럭트로 EL4 세포에 형질전환 한 후에, 본 발명자들은 EL4 클론을 만들었고, 이는 계속적으로 CNS-9의 통제 하에 발광효소를 발현하였다. 안정세포주를 만드는 것은 각 클론에서 추출한 지노믹 DNA 안의 네오마이신-저항 유전자, 발광효소 유전자 및 CNS-9 유전요소의 존재로 확인되었다(도 21). 두 클론의 PCR 생성물은 컨트롤 EL4 세포의 생성물에서 보다 분명히 증가하였다. The present inventors have previously shown that CNS-9, a distal cis-elementary element, is important in the transcription of IL-10 gene in Th2 cells (24). CNS-9 increases the activity of a minimal promoter of IL-10, which is regulated by the involvement of NFAT1 and IRF4 in CNS-9 (24). Based on these results, the present inventors constructed a T cell-based reporter system for screening natural compounds that have a modulatory effect on IL-10 expression by the function of CNS-9. The CNS-9 and IL-10 minimal promoter positions were inserted into the luciferase gene upstream in the pGL4.17 reporter vector and duplicated (Fig. 19, 20). After transfection into EL4 cells with this reporter construct, we made EL4 clones, which consistently expressed the luciferase under the control of CNS-9. The establishment of stable cell lines was confirmed by the presence of the neomycin-resistant gene, the luciferase gene and the CNS-9 genetic element in the genomic DNA extracted from each clone (Fig. 21). The PCR products of the two clones were clearly increased in the products of control EL4 cells.

안정세포가 자극에 즉각적으로 반응하는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 PMA 및 이오노마이신 또는 사이클로포린 A(CsA)로 자극한 후 발광효소의 활성을 알아보았다. 발광효소 활성은 PMA 및 이오노 마이신 자극에 의해 대략 3배에서 5배 정도 증가하였으나, 이러한 증가는 CsA에 의해 억제되었다(데이터로 표시되지 않음). 안정세포를 이용한 스크리닝 시스템의 민감도를 확인한 후에, 본 발명자들은 96-웰 플레이트에서 스크리닝을 위해 최적 세포 수를 측정하였다. 비록 발광효소 활성은 비 자극 상태에서는 세포 수-의존 방식에 따라 증가하지만, 자극 후에는 8ⅹ105 세포 개수일 때 최대 수준을 보여주었다(도 22). 흥미롭게도 세포수가 6ⅹ105개에서 발광효소 수준에서 가장 높은 비를 보여주었고, 스크리닝에 이 조건을 계속 적용하였다(도 23).To determine whether stable cells respond immediately to stimulation, the present inventors examined the activity of the luminescent enzyme after stimulation with PMA and ionomycin or cyclophorin A (CsA). The luminescent enzyme activity was increased approximately 3 to 5 times by PMA and ionomycin stimulation, but this increase was inhibited by CsA (not shown in the data). After confirming the sensitivity of the screening system with stable cells, we measured the optimal cell number for screening in a 96-well plate. Although luminescent enzyme activity increased with cell number-dependent method in the non-stimulated state, it showed the maximum level at 8 × 10 5 cell number after stimulation (FIG. 22). Interestingly, the number of cells showed the highest ratio at the level of the luminescence enzyme at 5 x 10 &lt; 5 & gt ;, and this condition was continuously applied to the screening (Fig. 23).

다음, 본 발명자들은 식물에서 추출한 367개의 천연 단일 화합물을 포함하는 화학 라이브러리를 스크리닝하였다. 발광효소 활성은 화학적 처리 후 4시간이 지나 측정하였다(도 24). 라이브러리는 플라본(flavone), 스틸벤(stilbene) 및 터핀(terpene)의 몇 가지의 구조 유사체의 유도체들로 분류하였다(도 25). 모든 스크리닝은 세 번씩 반복 수행하였고, 오직 재현성을 보여주는 화합물들만을 우선 선발하였다. 본 발명자들은 6-메톡시플라본(6-MF), 7-하이드록시플라본(HF), 바이칼레인(BC) 및 포모노네틴(FN) 4가지 화합물을 발견하였으며, 이들은 안정세포의 발광효소 활성을 50% 이상 낮추었다(도 1, 2). 이후, 본 발명자들은 세포 생존을 억제하는데서 유래한 억제 효과의 가능성을 배제하기 위해 이들 화합물의 세포 독성을 확인하였다. 각 선별된 화합물들 모두 EL4 세포 또는 T 세포의 생존도에 중요한 변화를 야기하지 않았다(도 27). 화학 정보 및 구조들은 도 2 및 도 26에서 각각 설명하였다. 흥미롭게도, 모든 화합물들은 대략 250달톤의 분자량인 플라보노이드 백본을 가지고 있는 플라본 유도체들이다. 6-MF가 상기 4가지 화합물 중에서 CNS-9 매개의 발광효소 활성을 억제하는데 가장 효과적이기 때문에(도 1), 본 발명자들은 6-MF 활성의 분자 메커니즘에 초점을 맞추었다.
Next, the present inventors screened chemical libraries containing 367 natural single compounds extracted from plants. The luminescence enzyme activity was measured after 4 hours after the chemical treatment (Fig. 24). The library was classified as derivatives of several structural analogues of flavone, stilbene and terpene (Fig. 25). All screening was repeated three times, and only those compounds showing reproducibility were selected first. The present inventors have found four compounds of 6-methoxy flavone (6-MF), 7-hydroxy flavone (HF), baicalein (BC) and formononetin (FN) 50% or more (Figs. 1 and 2). Hereinafter, the present inventors confirmed cytotoxicity of these compounds in order to exclude the possibility of the inhibitory effect resulting from inhibiting cell survival. Each of the selected compounds did not cause significant changes in the survival of EL4 or T cells (Figure 27). Chemical information and structures are described in FIGS. 2 and 26, respectively. Interestingly, all compounds are flavone derivatives having a flavonoid backbone with a molecular weight of approximately 250 daltons. Since 6-MF is most effective in inhibiting CNS-9 mediated luciferase activity among the four compounds (Fig. 1), we have focused on the molecular mechanism of 6-MF activity.

6-6- MFMF 는 T 세포의 사이토카인 발현을 억제한다.Inhibits cytokine expression of T cells.

본 발명자들은 6-MF가 T 세포에서 IL-10 발현을 억제하는지 여부를 확인하였다. 도 3에서 보이는 바와 같이, 6-MF의 처리는 DMSO-처리한 EL-4 세포와 비교하여 IL-10 전사의 증가를 매우 억제하였다. 게다가, 6-MF는 Th-2 분화 세포에서 IL-10의 m-RNA양이 거의 50% 줄어들게 하였다(도 3). 세포 유압기를 이용한 세포내 IL-10 분석을 통해 6-MF가 Th2 세포로부터의 IL-10 생성물을 60% 정도로 상당히 감소시켰다는 사실을 보여주었다(도 4). 이러한 결과들은 6-MF가 CNS-9의 인핸서 활성을 억제시킴으로써 IL-10 발현에 억제 효과를 가짐을 보여준다.The present inventors have confirmed whether 6-MF inhibits IL-10 expression in T cells. As shown in FIG. 3, treatment of 6-MF significantly inhibited the increase of IL-10 transcription compared to DMSO-treated EL-4 cells. In addition, 6-MF reduced the amount of IL-10 m-RNA by almost 50% in Th-2 differentiated cells (Figure 3). Intracellular IL-10 analysis using a cell hydraulic device showed that 6-MF significantly reduced IL-10 production from Th2 cells by as much as 60% (FIG. 4). These results show that 6-MF has an inhibitory effect on IL-10 expression by inhibiting the enhancer activity of CNS-9.

6-MF의 억제 효과가 IL-10에만 한정되는지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 T 세포에 다른 사이토카인들의 발현을 분석하였다. 6-MF를 처리한 Th2 세포에서 IL-4 및 IL-13의 전사에서 비슷한 정도의 억제가 관찰되었고(도 5), 이것은 Th2 세포의 IL-4 생성의 현저한 감소를 이끌었다(도 6). 흥미롭게도, 6-MF는 Th1 세포에서 IFN-γ의 전사도 감소시켰다(도 5). 이러한 결과들은 6-MF가 T 세포의 몇 몇의 사이토카인의 음성 조절 전사에 의해 면역 억제제로서의 역할을 하는 것을 시사한다. 게다가, 6-MF는 몇 가지 중요 인자들을 억제하는데, 이들은 자극시 그들의 사이토카인의 전사에 중요하다.
To determine whether the inhibitory effect of 6-MF is confined to IL-10, we analyzed the expression of other cytokines in T cells. Similar inhibition of IL-4 and IL-13 transcription was observed in Th2 cells treated with 6-MF (Fig. 5), leading to a significant reduction in IL-4 production in Th2 cells (Fig. 6). Interestingly, 6-MF also reduced IFN-y transcription in Th1 cells (Figure 5). These results suggest that 6-MF acts as an immunosuppressant by negative regulatory transcription of several cytokines in T cells. In addition, 6-MF inhibits several important factors, which are important for the transcription of their cytokines during stimulation.

6-6- MFMF 는 T 세포에서 In T cells NFAT1NFAT1 의 핵 전이를 억제한다.Lt; / RTI &gt;

어떻게 6-MF가 T 세포안의 몇 개의 사이토카인의 전사를 다운 조절하는지 조사히기 위해, 본 발명자들은 발현의 변화 및 전사 인자들의 활성을 조사하였다. 이전에 설명했던 것처럼, NFAT1 및 IRF4는 CNS-9의 인핸서 활성에 매우 중요한 인자들이다. 게다가, NFAT1은 IL-2, IL-4, IL-10, 및 IFN-γ 등의 다수 사이토카인들의 조절에 핵심 전사 인자들 중에 하나이다(25).To examine how 6-MF down-regulates the transcription of several cytokines in T cells, we investigated changes in expression and activity of transcription factors. As previously described, NFAT1 and IRF4 are very important factors for enhancer activity of CNS-9. In addition, NFAT1 is one of the key transcription factors in the regulation of multiple cytokines such as IL-2, IL-4, IL-10, and IFN-γ (25).

첫째로, 본 발명자들은 CNS-9 리포터 시스템을 사용하여 NFAT1-매개의 전사촉진의 효과를 분석하였다. 도 7에서 보여주듯이, NFAT1은 NFAT1의 과다 발현 없는 자극과 비교하여 발광효소 활성을 2배까지 증가시켰다. 그러나, 6-MF 처리는 양-의존적 방법으로 NFAT1의 전사 촉진을 억제시켰고, 그것에 의하여, 기본 수준이 되었다(도 7). 흥미롭게도, 6-MF는 IRF4의 과다 발현에 의해 증가한 발광효소 활성도 방해하였다(도 28). 이러한 결과들은 6-MF가 NFAT1 또는 IRF4의 활성을 조절함에 따른 억제 효과를 일으키는 것을 시사한다. 그러나 본 발명자들은 정확한 인자를 확인할 수 없었는데, 그 이유는 CNS-9에 NFAT1 및 IRF4가 모두 참여하고 있었기 때문이다.First, we used the CNS-9 reporter system to analyze the effects of NFAT1-mediated transcriptional stimulation. As shown in Fig. 7, NFAT1 increased the luminescence enzyme activity by a factor of 2 as compared to stimulation without overexpression of NFAT1. However, 6-MF treatment inhibited the transcriptional stimulation of NFATl in a positive-dependent manner, thereby resulting in basal levels (FIG. 7). Interestingly, 6-MF also inhibited increased luminescent enzyme activity by overexpression of IRF4 (Figure 28). These results suggest that 6-MF induces an inhibitory effect by modulating the activity of NFAT1 or IRF4. However, the present inventors could not confirm the correct factor because the CNS-9 involved both NFAT1 and IRF4.

그래서 본 발명자들은 6-MF가 처리된 Th2 세포에 NFAT1 및 IRF4의 발현 수준을 분석하였다. NFAT1 또는 IRF4는 6-MF가 존재하고 있음에도 비슷한 수준의 전사를 유지하였다(도 8 및 도 29). 게다가, 6-MF는 전체 세포 용해물에서 NFAT1 또는 IRF4의 발현 수준을 변화시키지 않았다(도 9,도 30 왼쪽 패널). 따라서, 본 발명자들은 6-MF가 NFAT1 또는 IRF4의 핵 전이에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 흥미롭게도, 6-MF는 핵 내부의 NFAT1 단백질의 자극-의존적 증가를 확실히 감소시켰다(도 9, 오른쪽 패널). 그러나, IRF4 발현에 중요한 변화가 6-MF-처리된 Th2 세포의 핵에서 관찰되지 않았다(도 30, 오른쪽). 이러한 결과들은 6-MF가 T 세포에서 NFAT1의 핵 전이를 억제함으로써 사이토카인의 발현을 억제함을 보여준다. 이러한 데이터는 6-MF가 전사후 수준에서 NFAT1의 활성을 음성적으로 조절한다는 것을 시사한다. Thus, the present inventors analyzed the expression levels of NFAT1 and IRF4 in 6-MF treated Th2 cells. NFAT1 or IRF4 maintained a similar level of transcription despite the presence of 6-MF (FIGS. 8 and 29). In addition, 6-MF did not alter the expression levels of NFAT1 or IRF4 in whole cell lysates (Figure 9, left panel, Figure 30). Therefore, the present inventors investigated whether 6-MF affects NFAT1 or IRF4 nuclear transfer. Interestingly, 6-MF significantly reduced the stimulation-dependent uptake of NFAT1 protein in the nucleus (Figure 9, right panel). However, significant changes in IRF4 expression were not observed in the nuclei of 6-MF-treated Th2 cells (Fig. 30, right). These results show that 6-MF suppresses the expression of cytokines by inhibiting NFAT1 nuclear transfer in T cells. These data suggest that 6-MF negatively regulates the activity of NFAT1 at post-transcriptional levels.

다음, 본 발명자들은 NFAT1이 핵 내부로 전이되는지 직접적으로 분석하기 위해 면역세포화학을 수행하였다. 도 31에서 보여주듯이, NFAT1(초록)은 자극 없는 경우, Th2 세포의 세포질에 남아있었다. 그러나 CD3 및 CD28의 참여는 NFAT1의 활성을 이끌었으며, 핵 내부(빨강)으로 NFAT1의 전이를 증가시키는 결과를 낳았다. 이후, 본 발명자들은 6-MF의 처리 후 NFAT1의 핵 전이를 분석하였다. Th2 세포 자극이 NFAT1의 핵으로의 전이를 명백히 유도하는데 반하여, 6-MF는 이 핵 전이를 강하게 억제한다(도 10). 이러한 결과들은 6-MF가 T 세포에서 NFAT1의 핵 전이를 억제함으로써 사이토카인의 발현을 억제시키고 있음을 보여준다.
Next, the present inventors performed immunocytochemistry to directly analyze whether NFATl is transferred into the nucleus. As shown in Fig. 31, NFAT1 (green) remained in the cytoplasm of Th2 cells in the absence of stimulation. However, the involvement of CD3 and CD28 led to the activation of NFAT1, resulting in increased nuclear transfer (red) of NFAT1. After that, the present inventors analyzed nuclear transfer of NFAT1 after 6-MF treatment. Th2 cell stimulation clearly induces metastasis of NFAT1 to the nucleus, whereas 6-MF strongly inhibits this nuclear metastasis (Figure 10). These results show that 6-MF inhibits the expression of cytokines by inhibiting NFAT1 nuclear transfer in T cells.

6-6- MFMF 는 The NFAT1NFAT1 이 사이토카인 유전자의 조절 인자와의 결합을 억제한다.Thereby inhibiting the binding of the cytokine gene to a regulatory factor.

본 발명자들은 6-MF에 의하여 줄어든 전이가 NFAT1이 조절 위치에 결합하는 것을 감소시킬 것이고, 그로 인하여 목적 사이토카인의 다운-조절의 결과를 낳을 것이라고 가정하였다. 이를 명확히 하기 위해, 본 발명자들은 ChIP 방식을 통해 Th2 세포에서 NFAT1의 인 비보 결합을 분석하였다. CNS-9에 결합한 NFAT1은 PMA 및 이오노마이신 자극으로 5배 가량 증가하였으나, 6-MF 처리시 이러한 증가가 억제되었다(도 11). 비슷하게, NFAT1의 IL-4 프로모터 구역에의 결합은 6-MF가 처리된 Th2 세포에서 감소하였다(도 12). NFAT1의 IL-4의 GATA3 결합 부위에 결합은 음성 컨트롤로 보여졌다(도 12)We hypothesized that the 6-MF reduced metastasis would reduce the binding of NFATl to the regulated locus, thereby resulting in the down-regulation of the desired cytokine. To clarify this, we analyzed the in vivo binding of NFAT1 in Th2 cells via the ChIP method. NFAT1 bound to CNS-9 was increased five-fold by PMA and ionomycin stimulation, but this increase was inhibited by 6-MF treatment (FIG. 11). Similarly, binding of NFATl to the IL-4 promoter region was reduced in 6-MF treated Th2 cells (Figure 12). Binding to the GATA3 binding site of IL-4 of NFATl was shown to be a negative control (Figure 12)

이후, 본 발명자들은 NFAT1이 CNS-9 영역에 대한 인 비트로 결합을 EMSA를 이용하여 조사하였다. 자극된 Th2 세포의 핵 추출물은 비자극 세포와 비교하여 NFAT-공통서열 또는 CNS-9 서열을 포함하는 DNA 탐침의 증가를 보여주었다(도 13, 레인 1, 2, 7 및 8). 그러나, 6-MF는 NFAT1가 이들 DNA 탐침과 결합의 감소를 유도하였다(도 13, 레인 3 및 9). 이 NFAT1 결합은 경쟁 상대 탐침의 존재에 의해 억제되었다(도 13, 레인 4, 5, 10 및 11). 비록 항-NFAT1 항체는 DNA 탐침의 슈퍼시프트를 유도하지 않았지만, NFAT1 결합은 탐침들의 양이 줄어드는 것에 의해 확인되었다. 상기 결과들로부터 본 발명자들은 MF-6가 NFAT1이 사이토카인 유전자의 조절 부위에 결합하는 것을 억제한다고 결론지었다.
Then, the present inventors investigated in vitro binding of NFAT1 to the CNS-9 region using EMSA. Nuclear extracts of stimulated Th2 cells showed an increase in DNA probes containing NFAT-common or CNS-9 sequences compared to non-stimulated cells (Fig. 13, lanes 1, 2, 7 and 8). However, 6-MF induced NFATl to decrease binding with these DNA probes (Fig. 13, lanes 3 and 9). This NFATl binding was inhibited by the presence of competing probe (Figure 13, lanes 4, 5, 10 and 11). Although the anti-NFAT1 antibody did not induce super-shift of the DNA probe, NFAT1 binding was confirmed by the reduction in the amount of probes. From these results, the present inventors concluded that MF-6 inhibits NFATl from binding to the regulatory region of the cytokine gene.

6-6- MFMF 는 직접적으로 Directly NFAT1NFAT1 의 핵 전이를 억제하지만, Lt; RTI ID = 0.0 &gt; nuclear transfer, 탈인산화를Dephosphorylation 억제하지 않는다. Do not suppress.

비록 6-MF는 NFAT1의 핵 전이를 감소시키지만, 본 발명자들은 이에 대한 명확한 분자 메커니즘을 규명하지 못했다. NFAT 활성은 연속적인 과정에 의해 매개된다. 자극은 NFAT의 칼시뉴린-의존 탈인산화를 활성화시키고, 그에 의하여 핵 내부로 전이된다. 따라서, 본 발명자들은 6-MF는 탈인산화 과정을 방해함으로써 NFAT의 핵 전이를 억제한다고 조사하였다. 이러한 가능성을 분석하기 위해, 본 발명자들은 NFAT1의 항상적으로 활성화 형태(CA-NFAT1)로 존재하는 EL4 세포에서 리포터 분석을 실시하였다. Although 6-MF reduced the nuclear translocation of NFAT1, we failed to identify a clear molecular mechanism for this. NFAT activity is mediated by a continuous process. The stimulus activates calcineurin-dependent dephosphorylation of NFAT, thereby transducing into the nucleus. Thus, the present inventors investigated that 6-MF inhibits nuclear transfer of NFAT by interfering with the dephosphorylation process. To analyze this possibility, we performed reporter assays in EL4 cells present in the always active form of NFATl (CA-NFATl).

만약 6-MF가 탈인산화 과정에서 NFAT1 활성을 조절한다면, CA-NFAT1의 트랜스 활성을 억제할 수 없다. 비록 CA-NFAT1의 과발현이 자극 없는 조건에서 NFAT1보다 발광효소 활성을 보다 증가시키도록 유도하였으나, 자극 후 CNS-9의 인핸서 활성의 수준과 비슷한 수준을 보여주었다(도 14). 흥미롭게도, 6-MF 처리시 CA-NFAT1의 존재에도 불구하고 여전히 CNS-9의 발광효소 활성을 억제하였다(도 14 패널 a). 이러한 결과는 6-MF가 NFAT의 탈인산화를 억제하지는 않으나, NFAT의 핵 전이를 직접적으로 억제한다는 것을 시사한다.If 6-MF regulates NFAT1 activity during dephosphorylation, it can not inhibit the transactivation of CA-NFAT1. Although overexpression of CA-NFAT1 induced more luminase activity than NFAT1 in the absence of stimulation, it showed a level similar to the level of enhancer activity of CNS-9 after stimulation (FIG. 14). Interestingly, despite the presence of CA-NFAT1 in 6-MF treatment, it still inhibited the activity of CNS-9 luminescence enzyme (Fig. 14 panel a). These results suggest that 6-MF does not inhibit the dephosphorylation of NFAT, but directly inhibits nuclear transfer of NFAT.

이러한 결과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 NFAT 결합 서열의 세 개의 직렬 반복 서열을 포함하는 IL-2 프로모터의 리포터 시스템에서 6-MF 활성을 분석하였다. CNS-9 리포터 시스템의 결과와 유사하게, 6-MF는 CA-NFAT1가 존재하고 있음에도 IL-2 프로모터의 발광효소 활성을 감소시켰다(도 14 패널 b). 내인적으로 발현된 NFAT1의 효과를 최소화하기 위해, 본 발명자들은 HEK 293 세포에서 동일한 실험을 수행하였다. CA-NFAT1의 과발현에 의한 발광효소 활성의 증가는 EL4 세포에서 보다 HEK 293세포에서 더욱 인상적이었다(도 31 패널 a, b). 그러나 6-MF는 여전히 발광효소 활성의 기본 수준으로 이끄는 CA-NFAT1의 트랜스 활성을 억제하였다.
To confirm these results, we analyzed 6-MF activity in a reporter system of the IL-2 promoter containing three serially repeated sequences of the NFAT binding sequence. Similar to the results of the CNS-9 reporter system, 6-MF reduced the activity of the IL-2 promoter in the presence of CA-NFAT1 (Fig. 14 panel b). To minimize the effect of internally expressed NFAT1, we performed the same experiment in HEK 293 cells. The increase in luciferase activity by overexpression of CA-NFAT1 was more impressive in HEK 293 cells than in EL4 cells (Figure 31, panel a, b). However, 6-MF still inhibited the transactivation of CA-NFAT1 leading to basal levels of luminescent enzyme activity.

6-6- MFMF 는 아토피 피부염-유도 마우스에서 T세포 및 B세포의 기능을 억제한다.Inhibits the function of T cells and B cells in atopic dermatitis-induced mice.

다음, 본 발명자들은 NFAT1의 전이를 억제함으로써, 6-MF의 염증에서 면역억제제로의 치료 가능성을 판단하였다. 아토피 피부염은 만성 염증 피부 질환으로 알려져 있으며, 이는 Th2-타입의 면역 반응에 의해 매개되고, 그로 인하여 IgE 및 예컨대 IL-4, IL-5 및 IL-13과 같은 Th2-타입의 사이토카인의 수준이 증가하는 것을 보여준다. 게다가, 피부 염증의 만성 단계는 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 염증 촉진 사이트카인의 생성물을 보여준다(참고 문헌). 본 발명자들은 테이프 스트리핑 및 DNCB으로 항원성 투여로 Balb/c 마우스 귀에서 아토피 피부염을 유도하였다. 마우스에서 CD4+ T 세포 및 CD19+ B 세포를 분리한 후에, 6-MF 처리하여 그들의 기능에 주는 영향을 분석하였다. 도 15에 보여 지듯이, 6-MF는 PMA와 이오노마이신 자극과 비교하여, CD4+ T 세포로부터의 Th1 및 Th2 타입의 사이토카인의 발현을 크게 다운 조절하였다. 게다가, 6-MF 처리시 T 세포 및 B 세포의 증식 정도를 각각 약 55%와 40%로 억제하였다(도 16).Next, the present inventors judged the possibility of treatment as an immunosuppressive agent in the inflammation of 6-MF by inhibiting the transfer of NFAT1. Atopic dermatitis is known as chronic inflammatory skin disease, which is mediated by a Th2-type of immune response, and thus the levels of IgE and Th2-type cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-13 . In addition, the chronic stage of skin inflammation shows the products of inflammation-promoting cytokines such as IFN-y and TNF-a (see references). We induced atopic dermatitis in Balb / c mouse ear by antigenic administration with tape stripping and DNCB. CD4 + T cells and CD19 + B cells were separated from the mice and then subjected to 6-MF treatment to analyze their effect on function. As shown in FIG. 15, 6-MF significantly down-regulated the expression of Th1 and Th2 type cytokines from CD4 + T cells compared with PMA and ionomycin stimulation. In addition, the degree of proliferation of T cells and B cells was inhibited to about 55% and 40%, respectively, by 6-MF treatment (Fig. 16).

혈청 내의 증가한 IgE는 아토피 피부염의 진단적 특성이며, 마찬가지로 실험 마우스 모델은 또한 질병 유발 2주후에 IgE의 증가를 보여주었다(데이터로 보여주지 않음). 따라서 본 발명자들은 6-MF가 B 세포에 의한 IgE 형성에 조절 활성을 가지는지 평가하였다. 아토피 피부염 모델의 B 세포는 상당한 양의 IgE를 만들어냈고, 이는 LPS 및 IL-4로 자극 시 더욱 증가하였다(도 17). 그러나 B 세포에 6-MF 처리 시 IgE 형성을 약간 감소시켰다(도 17). T 세포는 B 세포의 활성, 분화 및 면역 반응에 중요하기 때문에, 본 발명자들은 T 세포와 같이 배양 후 B 세포에서 IgE 생성물에 미치는 6-MF의 효과를 검토하였다. 아토피 피부염 마우스에서 분리한 T 세포는 24시간 동안 6-MF가 존재하는 환경에서 CD3 및 CD28의 도입에 의하여 활성화되었다. 이후, B 세포는 72시간 동안 LPS 및 IL-4가 존재하는 환경에서 T 세포와 함께 배양하였다. 비활성화 T 세포와 함께 배양한 조건과 비교 시, 활성화된 T 세포는 B 세포로부터의 IgE 생성을 약 2배 정도 증가시켰다(도 18). 그러나 6-MF 처리된 T 세포는 B 세포로부터의 IgE 증가를 유도할 수 없었다(도 18). 이 데이터 모두 6-MF는 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 억제하는 면역 억제제로서의 역할을 하는 것임을 보여준다.
Increased IgE in serum is a diagnostic feature of atopic dermatitis and similarly experimental mouse model also showed an increase in IgE 2 weeks after disease induction (data not shown). Therefore, the present inventors evaluated whether 6-MF has regulatory activity on IgE formation by B cells. B cells of the atopic dermatitis model produced significant amounts of IgE, which increased further upon stimulation with LPS and IL-4 (Fig. 17). However, 6-MF treatment of B cells slightly reduced IgE formation (FIG. 17). Since T cells are important for B cell activation, differentiation and immune response, we examined the effect of 6-MF on IgE products in B cells after incubation with T cells. T cells isolated from atopic dermatitis mice were activated by the introduction of CD3 and CD28 in the presence of 6-MF for 24 hours. B cells were then incubated with T cells in the presence of LPS and IL-4 for 72 hours. Compared with conditions incubated with inactivated T cells, activated T cells increased IgE production from B cells by about 2-fold (Figure 18). However, 6-MF treated T cells could not induce IgE increase from B cells (Figure 18). All of these data show that 6-MF plays a role as an immunosuppressive agent that suppresses the immune response mediated by T cells.

Claims (17)

플라본 계열 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역 억제제.
An immunosuppressive agent comprising a flavone-based compound as an active ingredient.
제 1 항에 있어서, 상기 플라본 계열 화합물은 6-메톡시 플라본, 6-하이드록시플라본, 7-하이드록시플라본 아피제닌(apigenin), 루테오린(Luteolin), 탄제리틴(Tangeritin), 크리신(Chrysin), 바이칼레인(Baicalein), 스쿠텔라레인(Scutellarein), 우고닌(Wogonin) 및 포모노네틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
According to claim 1, wherein the flavone-based compound is 6-methoxy flavone, 6-hydroxy flavone, 7- hydroxy flavone apigenin (lutegenin), Luteolin (Tangeritin), Chrysin (Chrysin), Baikalein (Baicalein), Scutellarein (Scutellarein), Ugonin (Wogonin) and immunosuppressive agent, characterized in that at least one selected from the group consisting of pomononetin.
제 2 항에 있어서, 상기 6-메톡시플라본은 보존된 비코딩 서열(Conserved Non-coding Sequence, CNS)의 증폭 활성을 막고, T-세포에서 사이토카인 발현을 하향조절 하는 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
The immunosuppressive agent according to claim 2, wherein the 6-methoxyflavone blocks amplification activity of a conserved non-coding sequence (CNS) and downregulates cytokine expression in T-cells. .
제 3 항에 있어서, 상기 CNS(Conserved Non-coding Sequence)의 인핸서 활성을 막고, T-세포에서 사이토카인 발현을 하향조절 하는 것은 핵 내부로 NFAT의 전이를 억제하는 것에 의하는 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
4. The method of claim 3, wherein preventing the enhancer activity of the Conserved Non-coding Sequence (CNS) and down-regulating cytokine expression in T-cells is by inhibiting the transfer of NFAT into the nucleus. Inhibitors.
제 4 항에 있어서, 상기 CNS는 CNS-9인 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
The immunosuppressive agent according to claim 4, wherein the CNS is CNS-9.
제 4 항에 있어서, 상기 핵 내부로 NFAT의 전이를 억제하는 것은 상기 6-메톡시플라본이 NFAT가 사이토카인 유전자의 조절 인자와의 결합을 억제하는 것에 의하는 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
5. The immunosuppressive agent according to claim 4, wherein the inhibition of the transfer of NFAT into the nucleus is caused by the 6-methoxyflavone inhibiting binding of NFAT to a regulatory factor of the cytokine gene.
제 1 항에 있어서, 상기 면역 억제제는 Th1 또는 Th2 타입 사이토카인의 발현을 다운 조절하는 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
2. The immunosuppressant according to claim 1, wherein the immunosuppressive agent down-regulates Th1 or Th2 type cytokine expression.
제 7 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, TNF-α 또는 IgE 것을 특징으로 하는 면역 억제제.
8. The immunosuppressive agent according to claim 7, wherein the cytokine is IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, TNF-α or IgE.
상기 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 면역 억제제를 유효성분으로 포함하는 Th1-타입 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
A composition for the prophylaxis or treatment of a Th1-type immune disease comprising the immunosuppressant of any one of claims 1 to 8 as an active ingredient.
제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. The composition of claim 9, wherein said composition is a food composition.
제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. The composition of claim 9, wherein the composition is a pharmaceutical composition.
제 9 항에 있어서, 상기 Th1-타입 면역 질환은 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. The composition of claim 9, wherein the Th1-type immune disease is transplant rejection, autoimmune disease or inflammatory disease.
상기 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 면역 억제제를 유효성분으로 포함하는 Th2-타입 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
A composition for the prophylaxis or treatment of a Th2-type immune disease comprising the immunosuppressant of any one of claims 1 to 8 as an active ingredient.
제 13 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 13, wherein the composition is a food composition.
제 13 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 13, wherein the composition is a pharmaceutical composition.
제 13 항에 있어서, 상기 Th2-타입 면역 질환은 알러지 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 13, wherein the Th2-type immune disease is an allergic disease.
제 16 항에 있어서, 상기 알러지 질환은 아토피 피부질환인 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 16, wherein the allergic disease is atopic skin disease.
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