KR20120135053A

KR20120135053A - 허혈성 조직 영상을 위한 플루오르?１８ 표지 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염

Info

Publication number: KR20120135053A
Application number: KR1020120056099A
Authority: KR
Inventors: 정재민; 호이게바자르 라티카; 이동수; 정준기; 이명철
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2012-12-12
Also published as: KR101427292B1

Abstract

본 발명은 허혈성 조직 영상을 위한 플루오르-18 표지 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 본 발명에 의한 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 금속 및 F-18과 팔면체 구조로 안정하게 착체를 형성하여 F-18을 80-90%의 우수한 수율로 표지할 수 있으므로 양전자 방출 방사선 의약품 제조시, 유용하게 사용될 수 있어, 간질, 뇌혈관 질환, 각종 암, 뇌신경계질환 및 관상동맥질환 등을 판단하는 양전자 단층촬영에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

허혈성 조직 영상을 위한 플루오르?１８ 표지 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염{F-18 labeled triazanonane derivatives or pharmaceutically acceptable salt thereof for hypoxic tissue imaging}

본 발명은 허혈성 조직 영상을 위한 플루오르-18 표지 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.

양전자방출 단층촬영술(Positron Emission Tomography, PET)은 양전자를 방출하는 방사성 동위원소가 표지 된 분자 탐침을 이용하여 실시간으로 인체를 3-D 영상화시켜 질병의 유무와 진행 정도에 대한 정보를 제공하고, 실질적으로 인체적용 가능한 진단용 분자 영상기술로서 진단 영상분야에서도 가장 큰 증가추세를 나타내고 있다. 양전자를 방출하는 여러 가지 핵종 중에서 플루오린-18(¹⁸F)은 의료용 입자가속기에서 쉽게 고순도로 생산되며 표지반응을 포함한 전체 제조 공정/시간, 환자의 방사성 피폭 등을 고려할 때 양전자방출 단층촬영술에 매우 적합한 특성이 있기 때문에 가장 많이 연구가 되고 있는 방사성 핵종이다.

양전자단층촬영(PET)에 가장 널리 사용되는 플루오르-18(F-18)은 사이클로트론에서 생산되어 물에 녹은 상태로 공급되는데 이때, 플루오라이드가 되므로 수용액 상에서는 화학적인 활성이 없어 생물활성 물질에 표지하기 어렵다. 따라서 물을 제거하고 테트라부틸 암모늄 또는 크라운에테르등의 물질을 추가하여 활성화시킨 후 이탈기(good leaving group)를 가지고 있는 전구체와 유기용매 상에서 반응하여 표지하는 방법이 일반적으로 널리 사용된다.

F-18이 표지된 양전자방출 방사성의약품 제조시 물을 제거하려면, 일반적으로 가열을 하면서 기체를 버블링(bubbling)하거나 감압하여 증발시키는 방법을 사용하고 있다. 이때, 1 내지 10 mL 이상 크기의 용기가 필요하여 자동합성장치의 크기를 줄이지 못하는 단점 및 물을 증발시키는데 걸리는 시간이 다른 공정에 비하여 길어 합성하는 시간까지 길어지는 단점이 있다. 이에, 물을 제거할 필요가 없는 공정을 만들 수 있는 F-18 표지법의 연구가 많이 진행되어 왔다.

그 중 가장 진보된 방법으로는 임뮤노메딕스(immunomedics)사의 특허 WO 2008/088648, US 2008/0253964, US 2009/0155166 및 일련의 논문들(McBride WJ, et al. A novel method of 18F radiolabeling for PET, J Nucl Med(2009) 50:991-998; Laverman P, et al. A novel facile method of labeling octreotide with 18F-fluorine. J Nucl Med(2010) 51:454-461; McBride WJ, et al. Improved 18F labeling of peptides with a fluoride-aluminum-chelate. Bioconjug Chem(2010) 21:1331-1340)에 의하면, F-18과 알루미늄의 착체를 먼저 형성한 후 이를 옥트레오타이드V 등의 생물활성 물질과 결합한 NOTA 유도체에 킬레이트를 형성하여 표지하는 것으로서, 이는 수용액 중에서 일어나는 반응이므로 따로 물을 제거하는 공정이 추가되지 않아도 되므로 반응 공정이 간편해지고 반응시간 또한 짧아진다는 장점이 있다고 개시되어 있다.

그러나, 상기 임뮤노메딕스의 방법에 의한 F-18표지 방법은 물을 제거하는 공정이 추가되지 않아도 되어 보다 경제적으로 F-18을 표지할 수 있으나, 상기 표지 효율이 50% 수준에 머물러 있는 단점이 있어, 이를 획기적으로 개선할 방안이 절실히 필요한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 표지 효율을 향상시키기 위한 연구를 하던 중, 신규한 트리아자노난 유도체를 합성하고, 상기 트리아자노난 유도체가 F-18의 표지효율 향상에 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

특허문헌 1: WO 2008/088648 특허문헌 2: US 2008/0253964 특허문헌 3: US 2009/0155166

비특허문헌 1: McBride WJ, et al. A novel method of 18F radiolabeling for PET, J Nucl Med(2009) 50:991-998 비특허문헌 2: Laverman P, et al. A novel facile method of labeling octreotide with 18F-fluorine. J Nucl Med(2010) 51:454-461 비특허문헌 3: McBride WJ, et al. Improved 18F labeling of peptides with a fluoride-aluminum-chelate. Bioconjug Chem(2010) 21:1331-1340

본 발명의 목적은 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트리아자노난 유도체와 금속 및 플루오르의 착화물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 트리아자노난 유도체와 금속 및 플루오르 착화물을 유효성분으로 함유하는 방사성 의약품을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트리아자노난 유도체와 알루미늄 및 플루오르-18과의 착체 형성을 위한 키트를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 치환기는, 본 명세서에서 기재한 바와 같다.)

또한, 본 발명은 상기 트리아자노난 유도체와 금속 및 플루오르의 착화물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 트리아자노난 유도체와 금속 및 플루오르 착화물을 유효성분으로 함유하는 방사성 의약품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트리아자노난 유도체와 알루미늄 및 플루오르-18과의 착체 형성을 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 의한 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 금속 및 F-18과 팔면체 구조로 안정하게 착체를 형성하여 F-18을 80-90%의 우수한 수율로 표지할 수 있으므로 따라서, 양전자 방출 방사성의약품 제조시, 유용하게 사용될 수 있어, 간질, 뇌혈관 질환, 각종 암, 뇌신경계질환 및 관상동맥질환 등을 판단하는 양전자 단층촬영에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 F-18을 표지한 화합물을 알루미나 카트리지를 통과시켜 정제한 후, TLC로 분리한 데이터를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 및 2의 화합물(a) NODA-Et-NI와(b) NODA-Pr-NI에 ¹⁸F을 표지한 후 실온에서와 인혈청에서의 안정성을 4시간까지 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 2의 화합물(a) NODA-Et-NI와(b) NODA-Pr-NI에 ¹⁸F을 표지한 후 정상산소와 저산소조건에서 HeLa, CHO, CT26 세포에 대한 섭취를 1시간 동안 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 2의 화합물(a) NODA-Et-NI와(b) NODA-Pr-NI에 ¹⁸F을 표지한 후 CT26 종양세포를 이식한 마우스에 정맥주사를 하고 생체내 분포를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 및 2의 화합물(a) NODA-Et-NI와(b) NODA-Pr-NI에 ¹⁸F을 표지한 후 CT26 종양세포를 이식한 마우스에 정맥주사를 하고 30분, 1시간, 2시간 후에 PET 촬영한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

상기 화학식 1에 있어서,

상기 R은

,

또는

이고; 및

n은 1 내지 3의 정수이다.

본 발명에 따른 화학식 1의 트리아자노난 유도체는 트리아자노난 링의 두 개의 질소에 아세틸기를 도입한 모핵(이하, NODA라 한다)을 기본으로 하고 나머지 하나의 질소에 여러 가지 생물활성물질을 포함한다.

종래 금속에 전자를 줄 수 있는 O, N, S 원자가 NODA의 가운데에 착물을 형성할 금속과 5각형이나 6각형을 이룰 수 있는 위치에 있지 않는 화합물을 요구하고 있으며, 만약 상기 O, N, S 원자가 NODA의 가운데에 착물을 형성할 금속과 5각형이나 6각형을 이룰 수 있는 위치에 존재하는 경우에는 F-18이 금속과 착물을 형성할 때 방해를 받아 표지 효율이 저하되는 문제점이 있기 때문에, 종래 NODA 모핵에서 치환기에 N, O 또는 S가 없거나 이 원자들이 금속과 착물을 형성할 경우 7각형 이상이 되도록 형성함으로써, F-18이 표지될 때 영향을 받지 않는 화합물이 개발되고 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 유도체는 니트로이미다졸 또는 니트로트리아졸 고리 내의 질소는 3급아민이면서 이중결합과 콘쥬게이션되어 있어 전자주게로서의 작용이 약하여 비록 질소가 알루미늄과 5각형 또는 6각형을 형성할 수 있는 위치에 있지만 표지효율이 높은 장점이 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 트리아자노난 유도체의 바람직한 예는 하기와 같다:

(1) 2,2'-(7-(2-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)에틸)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일)다이아세틱 에시드; 또는

(2) 2,2'-(7-(3-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)프로필)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일)다이아세틱 에시드.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 트리아자노난 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산(D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 트리아자노난 유도체는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액의 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 표시되는 바와 같이,

보호기로 보호된 화학식 2로 표시되는 NODA 화합물과 염기를 유기용매에 녹인 후, 니트로이미다졸 또는 니트로트리아졸 화합물을 첨가하여 반응을 수행하여 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는 단계(단계 1); 및

상기 단계 1에서 얻은 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유기용매에 녹인 후, 탈보호반응을 수행하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는 단계(단계 2)를 포함하는 상기 화학식 1의 트리아자노난 유도체의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

(상기 반응식 1의 n 및 R은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, P는 보호기로서, ^t부틸과 같은 알킬보호기, 벤질옥시카보닐기(Cbz), t-부톡시카보닐기(t-Boc), p-메톡시벤질기(PMB) 또는 9-플루오렌일메톡시카보닐기(Fmoc)이다)

이하, 본 발명에 따른 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.

단계 1

본 발명에 따른 상기 단계 1은 보호기로 보호된 화학식 2로 표시되는 NODA 화합물과 염기를 유기용매에 녹인 후, 니트로이미다졸 또는 니트로트리아졸 화합물을 첨가하여 반응을 수행하여 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는 단계이다.

상기 유기용매는 아세토나이트릴, 테트로하이드로퓨란, 메틸렌클로라이드, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드 또는 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 사용할 수 있고, 아세토나이트릴 및 테트로하이드로퓨란을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 염기는 포타슘카보네이트 또는 소듐카보네이트를 사용할 수 있고, 포타슘카보네이트를 사용하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 상기 화학식 2로 표시되는 NODA 화합물과 포타슘카보네이트를 아세토나이트릴에 녹인 후, 상기 혼합물에 나이트로이미다졸-프로필브로마이드 화합물을 첨가한 후, 아세토나이트릴을 한방울씩 가한 후, 20시간 동안 교반시킨 상온에서 교반하여 반응 종결 후, 컬럼크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 화합물을 수득하였다.

단계 2

본 발명에 따른 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 화학식 3으로 표시되는 화합물을 탈보호 반응을 수행하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다.

상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 용매에 녹인 후, 산을 첨가한 후, 반응을 수행하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.

이때, 사용 가능한 산으로는 염산, 황산, 질산, 아세트산 또는 트리플루오르아세트산 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다.

또한, 사용가능한 용매로는 반응에 악영향을 미치지 않는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라히드로퓨란, 디에틸에테르, 톨루엔, 디메틸포름아미드 또는 1,4-다이옥산 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 1,4-다이옥산을 사용하지 않을 수 있다.

나아가, 반응 온도는 특별히 제한되지는 않으나, 상온 내지 용매의 비등점 범위 내에서 수행될 수 있다.

구체적으로, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 1,4-다이옥산 용매하에 진한염산을 첨가하여 상온에서 15시간 동안 교반한 후 RP-HPLC를 수행하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 트리아자노난 유도체와 금속 및 플루오르가 6개의 배위자를 갖는 팔면체를 형성하는 착화물을 제공한다.

상기 플루오라이드는 F-18인 것이 바람직하다.

또한, 상기 금속은 알루미늄, 갈륨, 인듐, 탈륨, 이트륨 또는 루테늄을 사용할 수 있고, 바람직하게는 알루미늄을 사용할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 트리아자노난 고리 가운데에 상기 금속 중 알루미늄이 결합할 경우, 트리아자노난 고리 내의 3개의 질소와 COOH의 리간드는 쉽게 알루미늄과 결합할 수 있고, 알루미늄이 결합된 구조는 오각형을 형성하여 안정한 구조를 형성하게 될 수 있다. 상기 알루미늄의 경우 6개의 배위자와 결합하는 금속이므로 하나의 결합을 더 할 수 있고, 이때, 같은 분자구조 내에 있는 다른 배위자와 나머지 하나의 결합을 형성한다면 상기 화합물에 표지하기 위해 추가하는 F-18과의 결합하기 어렵게 되고 같은 분자구조 내의 다른 배위자와 불안정한 결합을 형성한다면 F-18과의 결합력이 우수할 것으로 판단된다.

상기 착화물의 제조방법에 있어서, ¹⁸F 표지는 폴리머 카트리지를 사용할 수 있다. 구체적으로, MCl₃6H₂O(M은 금속)를 0.1M 초산 나트륨완충액(pH 4)에 녹여 2 mM MCl₃ 스톡 용액을 만들고 폴리머 카트리지인 QMA light 카트리지에 0.4 M KHCO₃ 및 증류수를 흘려 주어 활성화시킨 후, 사이클로트론에서 생산한 ¹⁸F을 흘려서 포집하였다. 생리 식염수를 상기 카트리지에 흘려 금속-¹⁸F가 표지된 화합물을 용출해내고 이 용액에 반응 용매를 넣어 희석시킨 후 Alumina N 카트리지를 통과시켜 상기 착화물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 트리아자노난 유도체와 금속 및 플루오르 착화물을 유효성분으로 함유하는 방사성 의약품을 제공한다.

상기 착화물은 트리아자노난 유도체와 금속 및 F-18이 6개의 배위자를 갖는 팔면체를 형성하여 안정한 구조를 형성함으로써 F-18을 84~90%로 표지할 수 있어 PET 등을 이용한 방사성 의약품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 트리아자노난 유도체와 알루미늄과 같은 금속 및 플루오르-18과의 착체 형성을 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 비발열성 멸균 형태의 F-18 표지 방사성 의약품 제조용 키트로써, 상기 트리아자노난 유도체에 금속 착화합물을 이용한 F-18 표지를 편리하게 하기 위하여 미리 트리아자노난 유도체와 적당한 완충용액을 액체 상태로 첨가하여 약학적으로 바람직한 멸균 바이알에 분주하여 밀봉한 채 사용하거나 냉장, 냉동 또는 냉동 건조시켜 보관한 후 필요시에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 2,2'-(7-(2-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)에틸)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일)다이아세틱 에시드(2,2'-(7-(2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic acid; NODA-Et-NI)의 제조

단계 1: 2,2'-(7-(2-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)에틸)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일)다이아세틱 에시드 t-부틸 에스테르의 제조

상기 화학식 4로 표시되는 NODA^tBu(0.05 g, 0.139 mmol) 및 K₂CO₃(0.058 g, 0.42 mmol)를 아세토나이트릴(2 mL)에 첨가한 후, 상기 혼합물에 나이트로이미다졸릴-프로필브로마이드(0.098 g, 0.42 mmol)을 첨가한 후, 아세토나이트릴(1 mL)용액을 한 방울씩 가하고 20시간 동안 상온에서 교반하여 반응을 수행하였다. 반응 종결을 TLC(메틸렌클로라이드:메탄올 = 9:1)로 확인하고, 여과한 후, 상기 여액을 감압 건조하였다. 상기 반응물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(메틸렌 클로라이드/메탄올=90:10)로 분리 정제하여 황색 고체 0.051 g(0.99 mmol)을 순수한 형태로 70% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD, 300 MHz): δ 7.37(s, 1H), 4.53-4.49(t, J=12 Hz, 2H), 3.25(s, 4H), 2.84-2.81(m, 8H), 2.66-2.64(m, 4H), 2.46-2.42(t, 2H), 1.96-1.87(m, 2H), 1.39(s, 18H).

¹³C NMR(CD₃OD, 75 MHz): δ 171.4, 144.7, 128.2, 127.2, 80.8, 59.7,

56.1, 55.8, 55.6, 54.6, 48.2, 28.4, 28.1.

Mass specturm(ESI⁺): [M + H]⁺calculated for C₂₃H₄₁N₆O₆: 511.32; found 511.2.

TLC Rf=0.4(95% MC, 5% MeOH)

단계 2: 2,2'-(7-(2-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)에틸)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일) 다이아세틱 에시드의 제조

상기 단계 1에서 제조된 화학식 5로 표시되는 화합물 NODA-tBu-Et-NI(0.026 g, 0.05 mmol)의 다이옥세인(2 mL) 용액에 진한염산(0.5 mL)을 첨가하고 실온에서 15 시간 동안 교반하여 반응을 수행하였다. 상기 가수분해 반응의 종결을 ESI-매스를 이용하여 확인한 후, 반응 혼합물을 와트만(Whatman) 주사 여과기(0.45 μm)로 여과하고 감압 건조하였다. 최종 생성물은 RP-HPLC(A:10 mM HCl; B:MeCN; B를 0에서 100%로 30분간 농도 증가 후 B 100%를 5분간 유지)로 분리하고, 회수한 분액을 건조시켜 옅은 황색의 목적화합물0.017 g을 85% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD, 300 MHz): δ 7.34(s, 1H), 6.99(s, 1H), 3.78(s, 4H), 3.51(s, 2H), 3.36(s, 4H), 3.26(s, 4H), 3.19(s, 5H), 1.81(s, 1H).

¹³C NMR(CD₃OD, 75 MHz): δ 172.3, 145.0, 129.0, 128.8, 57.2, 55.7, 51.2, 50.9, 45.2.

Mass spectrum(ESI⁺), [M + H]⁺ calculated for C₁₅H₂₅N₆O₆: 385.18; Found 385.3.

HRMS(ESI⁺), (M+H)⁺ calculated for C₁₅H₂₅N₆O₆: 385.1836; Found 385.1837.

<실시예 2> 2,2'-(7-(3-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)프로필)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일)다이아세틱 에시드(2,2'-(7-(3-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)propyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic acid)(NODA-Et-NI)의 제조

단계 1: 2,2'-(7-(3-(2-니트로-1H-이미다졸-1-일)프로필)-1,4,7-트리아조난-1,4-다이일)다이아세틱 에시드 t부틸 에스테르의 제조

상기 실시예 2의 단계 1에서 나이트로이미다졸릴-프로필브로마이드를 사용하는 대신 에틸-4-브로모발릴레이트(0.030 g, 0.153 mmol)를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 화학식 6으로 표시되는 목적화합물(0.051 g, 70%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 300 MHz, 25 ℃): δ 1.19(t, 3H, J = 6 Hz), 1.38(s, 18H), 1.69-1.59(m, 2H), 1.83-1.76(m, 2H), 2.31(t, 2H, J = 6 Hz), 2.71-2.66(m, 2H), 3.80-3.03(m, 16H), 4.06(q, 2H).

¹³C NMR(CDCl₃, 75MHz, 25 ℃):δ 14.1, 21.8, 23.9, 28.1, 33.3, 48.8, 52.1, 55.5, 57.6, 60.4, 81.6, 170.6(CO), 172.8(CO) ppm.

ESI-MS: m/z = 486.5 for [M + H]+.

단계 2: 2,2'-(7-(3-(2-니트로-1H- 이미다졸 -1-일)프로필)-1,4,7- 트리아조난 -1,4- 다이일 ) 다이아세틱 에시드의 제조

상기 실시예 1의 단계 2에서 화학식 5로 표시되는 화합물 NODA-tBu-Et-NI을 사용하는 대신 상시 화학식 6으로 표시되는 NODA-tBu-Pr-NI(0.024 g, 0.05 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여 화학식 1B로 표시되는 옅은 황색의 목적화합물을 0.015 g(0.38 mmol, 83%) 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD, 300 MHz): δ 7.27(s, 1H), 6.96(s, 1H), 4.34(brs, 2H), 3.75(brs, 5H), 3.39-3.47(m, 5H), 3.29(brs, 4H), 3.16(s, 4H), 2.23(brs, 2H).

¹³C NMR(CD₃OD, 75 MHz): δ 172.6, 144.8, 128.5, 128.4, 63.0, 57.2, 55.6, 51.6, 51.3, 50.3, 47.3, 25.3.

Mass spectrum(ESI⁺), [M + H]⁺ calculated for C₁₆H₂₇N₆O₆: 399.2; Found 399.3.

HRMS(ESI⁺),(M+H)⁺ calculated for C₁₆H₂₇N₆O₆: 399.1992; Found 399.1996.

<실험예 1> F-18 표지

상기 실시예에서 합성한 화합물들에 ¹⁸F을 표지하여 그 표지 효율을 조사하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

AlCl₃6H₂O를 0.1 M 초산 나트륨완충액(pH 4)에 녹여 2 mM AlCl₃ 스톡 용액을 제조하였다. QMA light 카트리지에 0.4 M KHCO₃ 5 mL 및 증류수 10 mL를 흘려주어 활성화시킨 다음 사이클로트론에서 생산한 ¹⁸F을 흘려서 포집하였다. 생리식염수 0.4 mL을 카트리지에 흘려주어 ¹⁸F를 용출하였고 여기에 AlCl₃ 스톡용액을 가하여 실온에서 10분간 두어 27~90 nmol의 Al을 포함하는 Al¹⁸F 용액을 제조하였다. 0.1M 초산나트륨 완충액 1 mL에 상기 실시예의 화합물을 30~100 nM 되게 녹이고 여기에 앞에서 만든 Al¹⁸F 용액을 가하여 110 ℃로 가열한 히팅블록에서 10분간 반응시켜 표지하였다. 표지된 화합물은 Alumina N 카트리지를 통과시켜 정제하였다.

표지효율은 Instant Thin Layer Chromatography Silica Gel(ITLC-SG, Gelman Science, Ann Arbor, MI)을 80% MeCN으로 전개한 후 TLC 스캐너(Bioscan AR-2000)와 오토라디오그라피(BAS2500 Imaging System)로 방사능 분포를 탐지하여 계산하였다. 표지 후, ITLC로 확인하였을 때 표지되지 않은 ¹⁸F는 원점에 남아 있고 표지된 화합물들은 Rf가 0.4~0.5 사이에 존재함을 TLC 스캐너로 확인하였고, 이를 Alumina N 카트리지를 통과하여 정제하니 표지되지 않는 ¹⁸F가 완전히 제거됨을 도 1 을 통해 확인할 수 있었다(도 1 참조).

상기 실시예 화합물에 대한 표지효율을 하기 표 1에 나타내었다.

화합물	표지효율(%)
실시예 1	84.5
실시예 2	87.9

상기 표 1에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 트리아자노난 유도체는 모두 84% 이상의 양호한 표지효율을 나타내는 것으로 확인되었다.

따라서, 양전자 방출 방사성의약품 제조시, 유용하게 사용될 수 있어, 각종 암, 뇌신경계질환 및 관상동맥질환 등을 판단하는 양전자 단층촬영에 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 2> 안정성 시험

본 발명에 따른 ¹⁸F 표지된 화합물을 녹인 용액에 대한 실온 안정성 및 37 ℃ 인혈청 중에서 안정성을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

상기 표지화합물들을 10분, 30분, 60분, 120 및 240분 동안 상기 조건에서 배양한 후, 화합물이 분해된 정도를 ITLC를 이용하여 80% 아세토나이트릴로 전개하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1 및 2의 화합물 모두 4시간 동안 매우 안정함을 확인할 수 있었다.

따라서, 양전자 방출 방사성의약품 제조시, 유용하게 사용될 수 있어, 간질, 뇌혈관 질환, 각종 암, 뇌신경계질환 및 관상동맥질환 등을 판단하는 양전자 단층촬영에 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 3> 인혈청 단백질 결합 측정

본 발명에 따른 ⁶⁸Ga 표지 화합물과 인혈청 단백질의 결합 유무를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

상기 ⁶⁸Ga 표지 화합물을 각각 37 ℃에서 10분 및 60분 동안 인혈청(1 mL)과 배양한 후, PD-10 컬럼(pre-conditioned with 1 mL of 1% BSA/0.1 M DTPA)에 로딩하고 PBS으로 흘려 0.5 mL 분획씩 30개의 시험관에 받았다. 각 시험관의 방사능을 감마카운터로 측정하고 2 L씩 샘플을 각 시험관에서 채취하여 여과지에 찍은 후 쿠마시에 블루(Coomassie blue) 염색을 하여 단백질 피크를 확인하였다. 각 분획의 방사능 커브를 그려 단백질 결합 퍼센트를 계산한 결과를 표 2에 나타내었다.

	단백질 결합(%)
	10분	60분
⁶⁸Ga-NODA-Et-NI (실시예 1)	0.24 ± 0.03	0.64 ± 0.03
⁶⁸Ga-NODA-Pr-NI (실시예 2)	0.32 ± 0.06	0.36 ± 0.07

상기 표 2에 나타난 바와 같이, ⁶⁸Ga로 표지된 실시예 1과 2의 화합물 모두 인혈청 단백질과 결합률이 매우 낮아 혈액에서의 소실률이 우수한 것으로 예측할 수 있었다.

<실험예 4> 시험관내 섭취 시험

본 발명에 따른 표지된 화합물의 시험관내 섭취 여부를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 이때, 세포주는 CHO(Chinese Hamster Ovarian cancer), Hela(Henrietta Lacks cervical cancer), CT26(마우스 대장암)을 사용하였다.

먼저, 모든 세포주는 10% 우태아혈청과 1% 항생제 혼합액을 가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 사용하여 37 ℃에서 5%의 이산화탄소를 보충한 공기중에서 배양하였다. 실험을 위하여 4x10⁵ 세포씩 12-웰 플레이트로 계대하여 하룻밤 배양한 다음, 정상 산소(5% CO₂ 포함 공기)와 저산소(5% CO₂ 포함 질소) 하에서 4시간 동안 배양하여 조건을 맞추었다. 여기에 F-18로 표지한 실시예 1의 화합물 NODA-Et-NI와 실시예 2의 화합물 NODA-Pr-NI를 각각 100 μL(0.18 MBq)씩 가하고 60분 더 배양하였다.

5분, 15분, 30분, 60분에 각 웰을 DMEM으로 세척하고 0.5% SDS용액을 첨가하여 세포들을 녹여 감마카운터로 측정하여 세포에 섭취된 방사능을 측정하였다. 녹인 세포액의 단백질 양은 바이신토닉 에시드 방법으로 측정하여 단백질 mg당 섭취된 방사능의 양을 계산하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 실시예의 두 화합물 모두 모든 세포주들에서 저산소조건에서 증가하는 세포섭취를 보여 주어, 저산소암세포의 영상에 사용할 수 있음을 보여 주었다(도 3 참조).

<실험예 5> 마우스 생체내 분포 시험

본 발명에 따른 표지된 화합물의 마우스 생체내 분포를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

먼저, CT26 세포를 10% 우태아혈청과 1% 항생제 혼합액을 가한 RPMI1640으로 배양한 다음 10 mL의 PBS로 세척하여 balb/c 마우스에 어깨에 4x10⁵ 세포씩 주사하고 14일 동안 키워 0.8~1.1 g의 종양을 제조하였다. 생체내 분포 시험을 위하여 F-18로 표지된 니트로이미다졸-트리아자노난 유도체 0.15 MBq/0.1 mL씩을 꼬리정맥을 통하여 주사하였다.

10분, 60분, 120분에 마우스를 희생시켜 종양, 혈액, 근육 등의 조직들을 절제하여 무게를 재고 방사능을 측정하였다. 각각의 조직에 섭취된 방사능은 투여한 양에 대한 조직의 단위 그램당 섭취된 백분율(% ID/g)로 계산하여 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 두 화합물 모두 10분에 신장섭취가 11.1% ID/g과 9.8% ID/g으로 가장 높았고, 이는 시간이 지남에 따라 재빠르게 감소하였다. 그 다음으로 간섭취가 높았는데 이는 시간이 지나도 느리게 감소하였다. 혈액과 폐섭취는 10분에는 높았으나 재빨리 감소하였다. 종양/근육 섭취 비율은 NODA-Et-NI가 1시간 후에 14.5 그리고 NODA-Pr-NI가 2시간 후에 37.44로 매우 높은 값을 나타내어 저산소암 조직 영상화에 유용함을 보여 주었다(도 4 참조).

<실험예 6> 마우스 PET 영상 시험

본 발명에 따른 표지된 화합물의 마우스 생체내 분포를 확인하기 위하여 하기 PET 영상 실험을 수행하였다.

상기 실험예 5와 같이 CT26 종양을 이식한 마우스에 F-18로 표지한 NODA-Et-NI과 NODA-Pr-NI를 각각 14.4 MBq(0.1 mL) 씩 꼬리정맥으로 주사하고 2% 아이소플루란으로 마취한 다음 30분, 60분, 120분에 애니멀 PET/CT 스캐너(GE Healthcare, Princiton, New Jersey)를 이용하여 PET 촬영을 하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 화합물 모두 신장으로 배설이 빨리 되고 저산소암에 섭취됨을 확인하였고, 특히 NODA-Et-NI가 간과 신장 섭취가 좀 더 높은 것을 확인하였다(도 5 참조).

따라서, 양전자 방출 방사선 의약품 제조시, 유용하게 사용될 수 있어, 간질, 뇌혈관 질환, 알츠하이머 등의 뇌신경계질환 및 관상동맥질환, 심근병증 등의 심장질환을 판단하는 양전자 단층촬영에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 트리아자노난 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에 있어서,
상기 R은
,
또는
이고; 및
n은 1 내지 3의 정수이다).
제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물과 금속 및 플루오라이드의 착화물.
제2항에 있어서, 상기 플루오라이드는 F-18인 것을 특징으로 하는 착화물.
제2항에 있어서, 상기 금속은 알루미늄, 갈륨, 인듐, 탈륨, 이트륨 또는 루테늄인 것을 특징으로 하는 착화물.
제2항에 있어서, 상기 금속은 알루미늄인 것을 특징으로 하는 착화물.
제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물과 금속 및 F-18 착화물을 유효성분으로 함유하는 방사성 의약품.
제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물과 금속 및 F-18 착화물 형성을 위한 키트.