KR20120134166A - 미량 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼에 물 및 에탄올로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 가하고 용매 추출과정을 수행하여 인삼 추출물을 제조하는 단계; 상기 인삼 추출물에 유산균을 접종하고 발효시켜 인삼 추출물의 발효물을 제조하는 단계; 및 상기 인삼 추출물의 발효물을 열처리하는 단계를 포함하는 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 상기 열처리한 인삼 추출물의 발효물로부터 크로마토그래피법을 수행하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 항염 활성이 우수한 인삼 추출물 및 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 의하면, 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 확인되었으나, 인삼에는 소량 함유되거나 거의 함유되지 아니한 사포닌인 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)의 함량을 현저하게 증가시키고, 이에 따라서 항염 효과도 현저하게 개선된 인삼 추출물을 제조할 수 있으므로, 인삼의 품질 향상과 인삼 제품의 규격화에 이바지할 수 있어서, 인삼과 관련된 다양한 산업에 폭 넓게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 인삼농가를 포함한 인삼 산업 관련 생산 주체의 수익 향상에 이바지할 수 있다.

Description

미량 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물의 제조방법{A METHOD OF PREPARING GINSENG EXTRACT COMPRISING MINOR SAPONIN IN HIGH CONCENTRATION}

본 발명은 미량 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 오가피 나무과의 인삼 속에 속하는 다년생 초본류로 약 11종이 있으며, 한반도 지역에서 재배되는 고려인삼(ginseng, Panax ginseng C. A. Meyer)이 약효가 우수한 것으로 알려져 있다. 상기 인삼은 사포닌, 페놀성 성분, 폴리아세틸렌 성분, 알카로이드 성분 및 다당체 등이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다.

우리가 흔히 인삼이라고 칭하는 것은 수삼 또는 수삼(수분 약 75%)을 건조한 백삼(수분 약 12%)을 말하며, 홍삼은 4년근 내지 6년근 수삼을 엄격히 선별하여 껍질을 벗기지 않은 상태에서 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색 인삼을 말한다. 전통적 방식인 증숙과정을 통해서 얻어진 홍삼은 백삼에 비하여 유용사포닌이 더 많아 인삼의 효능을 증대시킨다고 알려져 있다.

현재까지 알려진 인삼의 효능 중, 대표적인 것으로 항산화 활성, 항균 활성 항암 활성 또는 항염 활성 등이 있으며, 상기 효능은 사람마다 각각의 차이가 있는 것으로 알려져 있다.

상기 인삼의 주된 기능은 인삼에 포함된 진세노사이드에 의한 것으로 알려져 있다. 상기 진세노사이드란 식물에 존재하는 여러 사포닌 중 인삼의 사포닌 성분만을 특별하게 구분하여 명명한 것으로, 상기 진세노사이드는 다양한 약리 효능이 있는 것으로 보고되어 있다. 일 예로, 상기 진세노사이드는 항암, 항알레르기, 항염증, 정신안정, 진통, 기억력 개선, 간 기능 강화 작용, 항당뇨, 항스트레스, 항산화, 면역조절 및 항노화 활성 등이 있는 것으로 보고되어 있다.

그러나, 인삼의 진세노사이드는 고분자 구성성분과 연결되어 있어서, 섭취 후 체내 흡수가 용이하지 않으므로, 장내에 서식하는 미생물에 의해 분해가 되어야 흡수될 수 있다. 일 예로, 홍삼은 진세노사이드 중 수삼에는 없거나 미량 함유되어 있는 진세노사이드 성분인 진세노사이드 Rg3(ginsenoside Rg3), 진세노사이드 Rh1(ginsenoside Rh1) 또는 진세노사이드 Rh2(ginsenoside Rh2) 등의 특이 성분을 가지고 있다. 상기 홍삼의 특이성분은 원래 수삼에 포함되어 있던 사포닌 성분(Major Saponin)인 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1), 진세노사이드 Rb2(ginsenoside Rb2), 진세노사이드 Rc(ginsenoside Rc) 또는 진세노사이드 Rd(ginsenoside Rd) 등의 사포닌이 홍삼을 제조하는 과정에서 가해진 열에 의해 상기 인삼사포닌 배당체가 가수분해 되어 생성되는 프로사포닌(prosaponin) 형태의 성분이다.

따라서, 상기 인삼의 효능이 사람마다 차이가 있는 것은 사람마다 대장세균의 총수 및 활성이 다르므로, 섭취된 인삼에 포함된 진세노사이드의 장내 미생물에 의한 분해 정도가 상이하여, 상기 진세노사이드의 체내 흡수의 정도가 상이하기 때문이다.

그러므로, 인삼의 효능 강화 즉, 흡수가 용이한 진세노사이드의 함량을 증가시켜 우수한 인삼 또는 인삼 제품을 제조하기 위해서는 수삼과 같은 인삼에는 포함되어 있지 않거나 미량 포함되어 있으나, 다양한 약리 작용을 하는 것으로 알려진 진세노사이드 Rg3(ginsenoside Rg3), 진세노사이드 Rk1(ginsenoside Rk1) 진세노사이드 Rg5(ginsenoside Rg5) 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)의 함량을 향상시키는 방법의 개발이 요구된다.

현재까지 개발된 방법은 특정 진세노사이드, 일 예로 Rg2, Rg3 또는 Rh2 등의 함량을 제한적으로 증가시키는 것으로, 다양한 생리 활성을 가지는 것으로 보고된 다양한 진세노사이드의 함량을 증가시키는 방법의 개발이 요구된다.

또한, 선천성 면역반응은 우리 몸의 방어기전인데, 이것은 면역기능을 담당하는 면역세포들이 주위세포나 조직이 손상되었을 때, 즉각적으로 손상된 부위를 회복시키고자 하는 일련의 염증반응을 유도하는 현상이다.

상기 면역세포들은 히스타민(histamine), 일산화질소(nitric oxide, NO) 또는 프로스타글라딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 등의 도움으로 혈관을 통해 손상된 부위로 이동하여 염증반응을 개시한다. 상기 손상된 부위로 이동한 면역세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 또는 IL-6(interleukin-6)와 같은 사이토카인(cytokine) 이나 MIP-1, IL-8 또는 MCP-1등과 같은 케모카인(chemokine)을 분비하여 직접적인 외부침입물질을 파괴하거나 다른 면역세포들을 모아 염증반응을 개시한다.

상기 염증반응을 일으키는 interferon-γ, lipoteichoic acid, lipopolysaccharide(LPS) 등의 염증유발 물질이나 다양한 염증 유도 사이토카인에 노출 될 경우, iNOS(inducible Nitric Oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)가 발현되어, nitric oxide(NO)와 prostaglandin E2가 과량 생성된다. 이들 여러 염증 개시인자들(iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 등)은 활성화된 NF-κB에 의해 전사가 촉진되며, 이로 인해 NO가 필요이상으로 생성되면 shock에 의한 혈관확장, 염증반응에 의해 유발되는 조직손상, mutagenesis, 신경조직의 손상 등을 일으킨다. 또한, COX-2가 과발현될 경우에도 염증반응을 일으킨다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 미량 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 인삼 추출물 및 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 일반적으로 자연에서 채집한 인삼에 존재하지 않거나 미량 존재하는 사포닌인 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 인삼 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 자연에서 채집한 인삼에 다량 포함되어 있는 사포닌 성분(Major Saponin)인 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1), 진세노사이드 Rb2(ginsenoside Rb2), 진세노사이드 Rc(ginsenoside Rc) 또는 진세노사이드 Rd(ginsenoside Rd)의 경우 고분자 구성성분과 연결되어 있어서, 섭취 후 체내 흡수가 용이하지 않으며, 실제로 다양한 기능성을 부여하는 것은 자연에서 채집한 인삼에 존재하지 않거나 미량 존재하는 사포닌인 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)와 같은 인삼사포닌 배당체가 가수분해 되어 생성되는 프로사포닌(prosaponin) 형태의 성분임을 인식하였다.

본 발명자들은 상기 인식을 기초로 인삼 또는 인삼 추출물 등의 인삼 가공품의 고부가가치화를 위해 연구하던 중, 인삼 추출물을 GRAS 미생물인 유산균에 해당하는 기탁번호 KCTC 11377BP를 락토바실러스 브레비스 BJ10(Lactobacillus brevis BJ20 KCTC 11377BP)를 이용하여 발효를 진행하고, 이와 함께 열처리 과정을 수행하는 경우, 기존 인삼 추출물에 비하여 항염 효과가 개선되는 것을 확인하였고, 더 나아가 상기 열처리 과정 후에 크로마토그래피법을 수행하는 경우, 기존 인삼 추출물 특히, 수삼이나 백삼에 비하여 미량 진세노사이드의 함량이 높은 홍삼 추출물에 비하여 현저하게 높은 미량 진세노사이드, 구체적으로 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)을 포함하는 인삼 추출물을 제조할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 인삼에 물 및 에탄올로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 가하고 용매 추출과정을 수행하여 인삼 추출물을 제조하는 단계; 상기 인삼 추출물에 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균을 첨가하고 발효과정을 수행하여 인삼 추출물의 발효물을 제조하는 단계; 및 상기 인삼 추출물의 발효물을 100℃ 내지 150℃에서 60분 내지 120분 동안 가열하는 방법으로 수행하는 인삼 추출물의 발효물을 열처리하는 단계를 포함하는 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 인삼은 두릅나무과의 약용식물로서, 가공 방법에 따라서, 가공하지 아니한 수삼, 수삼을 건조시킨 건삼(백삼), 수삼을 쪄서 건조시킨 홍삼 등이 있고, 재배 방법에 따라서, 인삼밭에서 인위적으로 재배한 재배삼, 인삼씨를 산중에 뿌려서 자연 상태에서 재배한 장뇌삼, 자연상태로 자생한 산삼 등이 있으며, 본 발명에서 인삼은 상기 모든 종류의 인삼을 포함하는 의미로 사용된다. 이러한 측면에서 상기 인삼은 고려인삼(ginseng, Panax ginseng C. A. Meyer), 수삼, 백삼, 화기삼, 전칠삼, 죽절삼, 삼엽삼, 히말라야삼, 홍삼, 산삼, 장뇌삼, 미삼, 원삼 및 산삼으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 일 예로 홍삼, 수삼 및 백삼으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 미량 진세노사이드는 수삼이나 백삼 등에 포함되어 있지않거나 미량 포함되어 있는 진세노사이드 또는 프로진세노사이드를 의미하며, 바람직하게는 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K)일 수 있다.

상기 인삼 추출물을 제조하는 단계는 상기 인삼에 물 및 유기용매로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 물 및 에탄올로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 가하고 용매 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 용매 추출은 열추출, 환류추출, 초음파추출, 고압추출 등의 방법에 의해 수행될 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 용매 추출은 50℃ 내지 100℃, 또는 60℃ 내지 90℃, 또는 70℃ 내지 80℃에서 수행할 수 있다.

상기 인삼은 인삼 뿌리, 인삼 잔뿌리 및 인삼 줄기로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 일 예로 인삼 뿌리 및 인삼미로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 인삼 뿌리 및 인삼미는 중량을 기준으로 5:1(인삼뿌리:인삼미) 내지 1:5(인삼뿌리:인삼미) 또는 3:1(인삼뿌리:인삼미) 내지 1:3(인삼뿌리:인삼미)의 함량으로 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 추출과정은 농축과정 및 건조과정으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 농축과정을 일 예로 감압농축과정일 수 있고, 상기 건조과정은 일 예로 동결 건조과정일 수 있다.

상기 인삼 추출물의 발효물을 제조하는 단계는 상기 인삼추출물에 유산균을 접종하고 발효시키는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스 속 유산균, 비피도박테리움 속 유산균, 류코노스톡 속 유산균, 페디오코카스 속 유산균 및 락토코커스 속 유산균을 포함하는 의미이다.

상기 유산균은 바람직하게는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균일 수 있고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 기탁번호 KCTC 11377BP를 락토바실러스 브레비스 BJ10(Lactobacillus brevis BJ20 KCTC 11377BP)일 수 있다. 상기 락토바실러스 브레비스 BJ10(Lactobacillus brevis BJ20)은 GRAS 미생물로 안전성이 보장되는 미생물이면서도, 본 발명의 발명자에 의해 확인한 결과 발효능이 우수하며, 인삼 추출물의 발효과정을 수행한 결과 사포닌의 배당체 분해능도 우수한 것으로 확인되어, 본 발명의 균주로 선택되었다. 상기 균주는 해조류에 대한 발효능이 우수한 것으로 확인되어, 2008년 8월 19일에 대한민국 대전광역시 유성구 과학로 111번지 소재의 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되어 수탁번호 KCTC 11377BP를 부여받았다.

상기 인삼 추출물의 발효물을 제조하는 단계는 인삼 추출물에 유산균, 바람직하게는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균을 첨가 또는 접종하고 33℃ 내지 39℃, 또는 35℃ 내지 38℃에서 12시간 내지 96시간 또는 24시간 내지 72시간 동안 발효시키는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 유산균은 상기 인삼 추출물이 포함된 일 예로, 인삼 추출물이 0.1% 첨가된 배지에서 전배양한 것일 수 있다. 상기 인삼 추출물의 발효물을 배양하기 위해서는 유산균, 구체적으로 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균이 생육할 수 있는 영양성분이 포함되어야 하며, 이러한 측면에서 상기 인삼 추출물의 발효물은 상기 락토바실러스 속 유산균이 생육할 수 있는 배지에 상기 인삼 추출물의 발효물을 첨가한 것일 수 있다.

상기 배지는 상기 락토바실러스 속 유산균이 생육할 수 있고, 상기 배지 성분 및 상기 배지에 첨가된 인삼 추출물을 발효시킬 수 있는 영양성분이 포함되어 있는 것이면, 특별히 제한되는 것은 아니고, 일 예로 MRS 배지나 식용이 가능한 천연배지, 인삼 추출물의 희석액 또는 인삼 추출물의 희석액에 올리고사카라이드, 당류, 단백질, 아미노산 등의 영양성분을 첨가한 것일 수 있다.

상기 인삼 추출물의 발효물을 열처리하는 단계는 인삼 추출물의 발효물을 열처리하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 열처리는 100℃ 내지 150℃, 또는 110℃ 내지 140℃, 또는 120℃ 내지 130℃에서 10분 내지 240분 또는 30분 내지 180분 또는 60분 내지 120분 동안 가열하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 발효하는 단계 또는 상기 열처리 단계는 추가로 여과 공정을 더욱 수행할 수 있다. 상기 발효하는 단계 전 또는 후에 여과 공정을 수행하거나 상기 열처리 단계 전 또는 후에 수행할 수 있으며, 여과지를 이용하여 여과하거나, 원심분리 후 상층액만을 따로 분리하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 방법을 단계별로 수행, 일 예로 원심분리 후 상층액을 따로 분리한 후, 여과지를 이용하여 여과하는 과정으로 수행할 수 있다.

상기 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법은 상기 열처리한 인삼 추출물의 발효물을 정제하는 과정을 더욱 포함할 수 있다.

상기 정제하는 과정은 흡착용 수지, 바람직하게는 폴리스티렌계 흡착수지, 폴리스티렌계-다이비닐벤젠계 흡착수지, diaion HP 시리즈 흡착수지, Amberlite XAD 시리즈 흡착수지(Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-7, Amberlite XAD-8, Amberlite XAD-16, Amberlite XAD-1180 및 Amberlite XAD-1600), 2MG 흡착수지 및 Sepabead SP-850 흡착수지로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 정제하는 과정은 크로마토그래피법이나 흡착법으로 수행할 수 있다.

상기 정제하는 과정은 상기 흡착용 수지가 충진된 컬럼을 이용하여 흡착 과정 및 탈착 과정을 수행하거나, 크로마토그래피를 수행하는 방법일 수 있다.

상기 정제하기 위하여, 상기 열처리한 인삼 추출물의 발효물을 흡착용 수지에 흡착하는 과정은 증류수를 이용하여 로딩하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 극성물질을 제거하기 위해 탈착하는 과정은 20% 내지 40% 에탄올 수용액 또는 25% 내지 35% 에탄올 수용액을 흡착용 수지에 주입하여, 극성물질을 탈착하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 정제하는 과정은 상기 흡착용 수지가 충진된 컬럼에 상기 수득한 열처리한 발효 홍삼 추출물을 충진시키고, 90% 내지 99.9% 에탄올 수용액 또는 93% 내지 97% 에탄올 수용액을 주입하고, 분획을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 정제하는 과정에서 상기 90% 내지 99.9% 에탄올 수용액을 주입하기 전에 극성물질을 제거하는 과정, 구체적으로 20% 내지 40% 에탄올 수용액 또는 25% 내지 35% 에탄올 수용액을 흡착용 수지에 주입한 후, 상기 극성물질이 탈착된 에탄올 수용액을 제거하는 과정을 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 항염 활성이 우수한 인삼 추출물일 수 있다.

상기 인삼 추출물은 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K)이 다량 포함된 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K의 함량이 상기 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd의 전체 중량 100 중량부를 기준으로 400 중량부 내지 700 중량부 또는 450 중량부 내지 600 중량부 또는 500 중량부 내지 550 중량부일 수 있다.

또한, 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물일 수 있다.

상기 항염 조성물은 염증을 완화, 개선 또는 치료하기 위해 사용되는 조성물을 의미한다.

상기 염증이란 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응으로, 이는 상해 유발 물질과 상해된 조직 모두를 파괴하거나, 약회시키거나 또는 차폐하는 작용을 의미한다.

상기 염증의 특징은 미세혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되고, 백혈구가 염증 조직으로 이동한다는 것으로, 거시적 측면에서는 통상적으로 홍반, 부종, 통각과민(민감성) 및 통증 등의 친숙한 임상적 증상들을 동반하는 것을 의미한다.

상기 염증 반응은 상기 정의된 바와 같이 염증에 의해 특정지워지는 임의의 반응이다. 상기 염증 반응이 상이한 질병 및 상해와 관련되어 나타나는 많은 물리적 불편함(이를테면, 통증 및 기능의 손실)을 일으킨다는 것은 의학분양에서 공지되어 있는 사실이다. 따라서, 염증반응의 물리적 불편함을 감소시키는 제약학적 제제를 투여하는 것은 통상적인 의료 관례이다. 이러한 특성을 갖는 작용 물질은 항염증성으로 분류된다.

이러한 측면에서, 항염증성 약제 또는 항염 조성물은 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 사용된다. 항염증성 약제를 사용하는 치료는 질병에 대한 것이 아니라, 대부분 증상 (즉, 염증)에 관한 것이다.

상기 항염 조성물은 상기 유효성분을 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10.0 중량비(%)로 포함될 수 있다. 상기 항염 조성물은 상기 유효성분 이의 항염 활성을 저해하지 않는 한 추가의 성분들을 포함할 수 있다.

상기 항염 조성물은 오랫동안 식용 또는 약용으로 사용한 인삼을 안전성이 보장되는 물, 에탄올(주정) 또는 GRAS 미생물인 유산균을 이용하여 가공한 것이며, 그 항염 효과가 매우 우수하므로, 상기 항염 조성물은 항염, 자극완화, 진정작용 등의 목적을 달성하기 위한 의약, 화장품, 식품 등에 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 지루(seborrhea), 건선(psoriasis), 여드름(acne) 등과 같이 염증반응을 동반하는 피부질환 관련 제품에 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.

이러한 측면에서 본 발명은 상기 항염 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품, 식품 또는 의약품일 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항염 조성물로 가공한 화장품, 식품, 의약품을 제공한다.

상기 의약품은 그 제형에 있어서 특별히 제한되는 바가 없으며, 목적에 따라서 통상적인 경구용, 비경구용, 국소투여용 등의 제제로 제형화될 수 있다.

분말, 과립, 정제, 캡슐제 등의 경구투여를 위한 제제에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다.

경구용 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등을 포함할 수 있다. 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 그 외, 연고제, 스프레이제, 로션제, 패취제, 패드제, 크림제 등으로 제형화될 수 있다.

상기 식품은 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품 등을 포함한다. 또한, 상기 식품은 건강식품(기능성 식품, 건강보조식품)일 수 있다.

상기 건강식품(기능성 식품, 건강보조식품)은 정제, 캡술제, 분말, 과립, 액상제, 환 등의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장품은 상기 조성물을 유효성분으로 사용한다는 것을 제외하고는 그 제형이나 목적에 있어서 특별히 제한되는 바가 없으며, 예를 들면, 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다. 또한, 각 제형에 있어서, 상기 유효성분 이 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다.

상기 화장품에 배합될 수 있는 성분에는 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 산화 방지제, pH 조정제, 알코올, 색소, 향료 등이 있다.

상기 유지 성분은 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등일 수 있다.

상기 보습제는 수용성 저분자 보습제, 지용성 저분자 보습제, 수용성 고분자 보습제, 지용성 고분자 보습제 등일 수 있다.

상기 에몰리언트제로는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레트테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아린산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 예시할 수 있다.

상기 계면활성제는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 사용할 수 있다.

상기 알코올은 세테아릴 알코올 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 기존 방법에 비하여, 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 확인되었으나, 인삼에는 소량 함유되거나 거의 함유되지 아니한 사포닌인 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)의 함량을 현저하게 증가시키고, 이에 따라서 항염 효과도 현저하게 개선된 인삼 추출물을 제조할 수 있으므로, 인삼의 품질 향상과 인삼 제품의 규격화에 이바지할 수 있어서, 인삼과 관련된 다양한 산업에 폭 넓게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 인삼농가를 포함한 인삼 산업 관련 생산 주체의 수익 향상에 이바지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 추출물 및 홍삼 추출물의 진세노사이드 조성 및 함량을 확인하기 위하여 HPLC를 수행한 결과를 나타내는 그래프로, 상기 도 1a는 홍삼 추출물의 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 본 발명의 발효 홍삼 정제물의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 세포독성을 확인한 그래프로, 상기 그래프의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미하며, 상기 그래프의 세로축은 세포 생존율(Cell viability(%))을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, NF-Κb의 생성량에 미치는 효과를 확인한 사진으로, 상기 사진의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 사진의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 시간은 LPS를 처리한 후, 경과된 시간을 의미하고, 상기 사진의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, I-κB-α의 인산화정도를 I-κB-α 및 p-I-κB-α의 생성량으로 확인한 사진으로, 상기 사진의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 사진의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 시간은 LPS를 처리한 후, 경과된 시간을 의미하고, 상기 사진의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, iNOS의 발현을 확인한 사진으로, 상기 사진의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 사진의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 사진의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미하며, 숫자는 시료의 처리량(ug/ml)을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, iNOS의 발현을 확인한 사진으로, 상기 사진의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 사진의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 사진의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미하며, 숫자는 시료의 처리량(ug/ml)을 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, TNF-α의 mRNA의 생성정도를 확인한 사진으로, 상기 사진의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 사진의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 사진의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미하며, 숫자는 시료의 처리량(ug/ml)을 의미한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, TNF-α의 발현정도를 확인하여 정량화한 그래프로, 상기 그래프의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 그래프의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 그래프의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미하며, 숫자는 시료의 처리량(ug/ml)을 의미한다. 상기 그래프의 세로축은 TNF-α의 발현정도를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 항염활성을 확인하기 위하여, NO의 생성정도를 확인하여 정량화한 그래프로, 상기 그래프의 N은 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군이고, 상기 그래프의 P는 LPS를 처리한 양성 대조군이며, 상기 그래프의 RG는 홍삼 추출물을 의미하고, FRG는 발효 홍삼 추출물을 의미하며, PFRG는 발효 홍삼 정제물을 의미하며, 숫자는 시료의 처리량(ug/ml)을 의미한다. 상기 그래프의 세로축은 NO의 생성정도를 나타낸다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 ; 인삼 추출물의 제조방법

본 실험의 방법에 의해 추출물에 포함된 진세노사이드 함량의 변화 및 항염 효과를 확인하기 위해 사용한 홍삼은 대한민국 충청남도 금산 홍삼을 ㈜동경종합상사(대한민국)에서 입수하였다.

우선, 홍삼 추출물(Red Ginseng Extract, RG)은 상기 홍삼근과 홍삼미를 1:1 비율로 혼합하고 분쇄하여 제조한 홍삼 분쇄물 200 g에 추출용매인 70% 에탄올 수용액 500 ml를 첨가하고 75℃에서 60분 동안 환류추출을 수행하였다. 상기 환류 추출 과정을 3회 반복하였다. 상기 환류 추출액에 의해 수득된 추출액을 모두 모아서 45℃에서 감압농축을 실시하여, 추출용매 성분을 모두 제거하고 동결 건조하여 분말(RG)을 얻었다.

상기 제조된 홍삼 추출물을 발효하여 발효 홍삼 추출물(Fermented Red Ginseng, FRG, 실시예 1)을 제조하였다. 상기 발효 과정은 유산균, 구체적으로 Lactobacillus brevis BJ20(KCTC 11377BP)를 이용하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 상기 분말로 수득한 홍삼 추출물을 0.1 % 첨가한 MRS 배지에서 상기 Lactobacillus brevis BJ20(KCTC 11377BP)를 37 ℃에서 48 시간 동안 전배양을 실시하였다. 상기 전배양한 발효균주를 상기 홍삼추출물이 10% 포함된 MRS배지에 접종하고 37 ℃에서 72 시간 동안 발효하였다.

상기 발효를 마친 후, 상기 발효액을 3000 rpm의 조건에서 10 분간 원심분리한 후, 상층액을 따로 분리하였다. 상기 분리된 상층액으로부터 여과지(membrain filter(0.45um))를 통하여 부유물을 완전히 제거하였다. 상기 부유물을 분리한 발효액을 125℃에서 90분 동안 열처리하여 최종 발효 홍삼 추출물(FRG)을 수득하였다.

상기 발효 홍삼 추출물을 정제하여 발효 홍삼 정제물(Purified Fermented Red Ginseng, PFRG, 실시예 2)을 제조하였다. 보다 구체적으로, 상기 수득한 발효 홍삼 추출물을 HP-20 수지가 충진된 컬럼에 주입하고, 증류수를 로딩(loading)한 후, 30 % 에탄올 수용액을 주입하여 극성물질을 제거하였다. 상기 극성물질을 제거한 후, 95% 에탄올 수용액을 주입하고, 용출액을 수집한 후, 동결건조하여 발효 홍삼 정제물을 제조하였다.

실험예 1: 진세노사이드 성분의 함량 변화 측정

상기 제조한 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물의 진세노사이드 조성 및 함량을 HPLC법을 이용하여 확인하였다.

보다 구체적으로, 상기 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물을 1 mg/mL의 농도로 메탄올에 녹인 후, 하기 표 1의 조건으로 HPLC를 수행하여, 진세노사이드 조성 및 함량을 확인하였다. 상기 확인 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다. 상기 표 2의 major saponin은 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 의미하고, minor saponin은 Rg3, Rk1, Rg5 및 CK를 의미하며, 상기 표 2의 수치는 상기 홍삼 추출물 또는 상기 발효 홍삼 정제물에 포함된 각각에 해당하는 진세노사이드 총 함량(mg/g)을 의미한다.

Instrument		Agillent 1100 series
HPLC 조건	Column	C18(4.6 X 250 mm)
	Mobile phase	A) Acetonitrile : Water(1:9) B) Acetonitrile : Water(9:1)
	Gradient	0-10 min 15 B%, 50-70 min 60 B%, 90 min 45 B% 100-105 min 85 B%, 106-120 min 15 B%
	Detector	VWD 203 nm
	Flow rate	1.0 ml/min
	Injection Volume	20 uL

구분	홍삼 추출물		발효 홍삼 정제물
	Major saponin	Minor saponin	Major saponin	Minor saponin
사포닌 함량 (mg/g)	21.5691	3.6234	2.8869	18.2365

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 보통의 홍삼에 주로 함유된 성분은 인삼과 같이 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd으로 상기 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 진세노사이드를 모두 포함한 major saponin의 함량은 21.5691 mg/g인 반면, 다양한 생리활성의 원인물질로 확인된 Rg3, Rk1, Rg5 및 CK를 모두 포함한 minor saponin의 함량은 3.6234 mg/g으로 상기 성분이 거의 확인되지 않은 인삼에 비해서는 증가되었으나, 여전히 소량인 것으로 확인되었다.

한편, 본 발명의 실시예 2인 발효 홍삼 정제물의 경우에는 상기 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 진세노사이드를 모두 포함한 major saponin의 함량이 2.8869 mg/g으로 소량인 반면, 다양한 생리활성의 원인물질로 확인된 Rg3, Rk1, Rg5 및 CK를 모두 포함한 minor saponin의 함량은 18.2365 mg/g으로 현저하게 증가하였으며, 구체적으로 상기 major saponin의 약 68%가 minor saponin으로 변환된 것으로 확인되었다.

또한, 도 1a 및 도 1b를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 2는 통상적으로 열처리에 의해 증가되는 Rg3 및 Rk1뿐만 아니라, 열처리만으로는 그 함량의 증가가 제한적인 CK 성분도 현저하게 증가되는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 본 발명의 방법에 의하면, 종래 인삼에 비하여 다양한 생리활성을 가지는 Rg3, Rk1, Rg5 및 CK 등의 minor saponin이 포함되어 약효가 우수한 것으로 알려진 홍삼에 비해서도 현저하게 많은 minor saponin이 포함된 인삼 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 인삼 추출물은 다양한 기능성의 측면에서 효과가 우수할 것으로 예상되었다.

실험예 2: 항염활성의 측정

상기 실험예 1에서 다양한 생리활성을 가지는 Rg3, Rk1, Rg5 및 CK 등의 minor saponin이 다량 포함되어 있어서, 다양한 기능성의 측면에서 효과가 우수할 것으로 예상된 발효 홍삼 정제물(실시예 2) 및 발효 홍삼 추출물(실시예 1)의 항염 활성을 홍삼 추출물과 비교하였다.

실험예 2-1. 시료 및 세포

상기 항염 활성을 측정하기 위해 하기 시료와 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 상기 시료의 입수처는 하기와 같다.

Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)은 Hyclone(Thermo Scientific Inc., Germany)에서 구입하였다. fetal bovine serum (FBS)은 Sigma Aldrich Co.(USA)에서 구입하였다. penicillin 및 streptomycin은 Gibco/BRL(USA)에서 구입하였다. 항체와 관련하여, Anti-iNOS monoclonal antibody는 Calbiochem(USA)에서 구입하였고, Anti-β-actin monoclonal antibody는 Sigma Aldrich Co.(USA)로부터 구입하였으며, Anti-NF-κB p65 monoclonal antibody, Anti-COX-2 monoclonal antibody, anti-IκB monoclonal antibody, anti-phospho-IκB monoclonal antibody 와 peroxidase-conjugated secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(USA)로부터 구입하였다.

또한, RT-PCR premix kit은 Solgent Co.(대한민국)로부터 구입하였고, TNF-α ELISA Kits는 Pierce Endogen(USA)에서 구입하였다.

또한, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), sulfanilamide, lipopolysaccharide(LPS) 및 다른 모든 시약들은 Sigma Aldrich Co.에서 구입하였다.

실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW264.7 세포는 ATCC(USA)로부터 분양 받아 사용하였다. 상기 RAW264.7 세포는 상기 DMEM에 10 % FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37 ℃ 및 5 % CO₂ 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다.

상기 시료, 장치 및 세포를 이용하여 염증 반응 관련된 mRNA량, 단백질 발현 정도 및 NO 생성 정도를 측정하여, 항염 효과를 확인하였다. 상기 항염 효과를 확인하기 위한 하기 실험을 수행한 결과는 ANOVA와 independence t-test를 이용해 분석하여, mean ± S.E.M.으로 표시하였다. 각 실험결과의 통계적 유의성 차이는 *p<0.05, **p<0.01 또는 ***p<0.001 로 정의하였다.

실험예 2-2. 세포 독성의 확인

홍삼 추출물과 발효 홍삼 추출물(실시예 1) 및 발효 홍삼 정제물(실시예 2)의 세포독성을 확인하기 위하여, RAW264.7 세포를 이용하여 MTT assay를 통한 세포 생존율을 확인하였다.

보다 구체적으로, 96 well plate에 5×10⁵ cells/ml로 상기 RAW264.7 세포를 분주하고 24 시간 동안 세포를 안정시킨 후, 상기 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물을 각각 1 ug/ml 및 10 ug/ml의 농도로 처리하고, 1 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 0.1 ㎍/㎖의 농도로 LPS를 처리하고, 20시간 동안 37 ℃ 및 5 % CO₂의 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 상기 배양 후, 세포 배양액을 제거하고, MTT를 1 mg/ml의 농도로 처리한 후 2 시간 배양하였다. 상기 배양 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거하고, DMSO 150 ul를 첨가하여 생성된 formazan crystals을 용해시킨 후 ELISA microplate reader(TECAN, Switzerland)를 이용하여 570 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다. 상기 측정결과는 도 2에 나타내었으며, 상기 도 2에 나타낸 세포의 생존율은 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조구(control cell)에 대한 백분율로 표시하였다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물 모두 안전한 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 대부분의 실험결과에서 RAW264.7 세포의 생존율이 100 % 안팎으로 나타났고, 가장 독성이 강한 것으로 나타난 발효 홍삼 정제물을 10 ug/ml 처리한 군에서도 80 %이상의 세포 생존율이 확인되어, 약간의 세포독성만이 있는 것으로 확인되었다.

실험예 2-3. Immunoblot analysis ( Western blotting ) 1

LPS에 의해 유도되는 iNOS, COX-2 또는 TNF-α 등은 전사인자인 NF-κB에 의해 발현된다. 상기 NF-κB는 세포질에서는 IκB와 복합체 상태로 불활성화 되어 있다가 I-κB-α kinase에 의해 I-κB-α가 인산화되면 결합되어 있던 복합체가 분해되어 NF-Κb로 활성화 되어 핵 내로 이동(trnslocation)하게 된다.

따라서, 홍삼 추출물과 발효 홍삼 추출물(실시예 1) 및 발효 홍삼 정제물(실시예 2)의 항염활성을 확인하기 위하여, 상기 NF-Κb에 대한 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 구체적으로 염증과 관련된 단백질의 발현 정도를 면역블롯팅 분석법(Immunoblot analysis)으로 분석하여 확인하였다.

보다 구체적으로, 96 well plate에 5×10⁵ cells/ml로 상기 RAW264.7 세포를 분주하고 24 시간 동안 세포를 안정시킨 후, 상기 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물을 각각 1 ug/ml 및 10 ug/ml의 농도로 처리하고, 1시간 후에 상기 LPS를 0.1 ug/ml처리하여 24시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후, 세포를 수득하고, 상기 수득된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 이것을 PBS와 함께 microtube에 넣고, 12,000 x g의 조건으로 5 분간 원심분리하고, PBS를 제거하였다. 상기 PBS를 제거한 후, 10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 0.5 mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)를 함유하는 hypotonic buffer 200 ul 를 넣고, 10분간 얼음 위에 놓은 후, 15,000 x g의 조건으로 5 분간 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 pellet에 20 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 1 mM PMSF를 함유하는 highsalt buffer 50 μl를 넣어, 10 분 마다 볼텍싱(vortexing)하며 40 분 간 얼음위에 방치한 후, 10 분간 16,000 x g의 조건으로 원심분리하여 핵 분획이 포함된 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 핵 분획이 포함된 상등액을 실험에 이용하여 단백질 함량을 정량하였다.

우선, 동량의 세포 용해액을 5X sample buffer와 혼합하고, 95℃에서 5 분간 끓인 후에 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔(gel)의 단백질을 nitrocellulose membrane상에 이동시키고, blocking buffer(5% skim milk)와 상온에서 2 시간 반응시켜 비특이적 항체결합을 억제하였다. 상기 항체결합을 억제한 후, NF-κB에 대한 항체를 blocking solution에 1:1000으로 희석하여 반응액을 제조한 후, 상기 반응액과 4℃에서 밤샘반응(overnight)을 수행하였다. 상기 반응 후, TBS-T로 30 분간 세척하고 horse-radish peroxidase가 conjugation된 2차 항체로 1 시간 반응시켰다.

상기 2차 항체와 반응시킨 멤브레인(nitrocellulose membrane)은 TBS-T로 30 분간 세척 후, ECL kit(Amersham, GE healthcare, 영국)를 사용하여 FluorChem Imaging System(Cell Biosciences, USA)으로 분석하여 각 단백질의 생성정도를 확인하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 군(N)에 비하여 LPS 처리군(P)에서 NF-κB의 이동(translocation)이 증가하였다. 한편, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, NF-Κb의 이동이 줄어드는 것이 확인되었고, 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 감소되는 것이 확인되었다.

실험예 2-4. Immunoblot analysis ( Western blotting ) 2

홍삼 추출물과 발효 홍삼 추출물(실시예 1) 및 발효 홍삼 정제물(실시예 2)의 항염활성을 확인하기 위하여, 염증과 관련된 다른 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 구체적으로 염증과 관련된 단백질의 발현 정도를 면역블롯팅 분석법(Immunoblot analysis)으로 분석하여 확인하였다.

보다 구체적으로, 96 well plate에 5×10⁵ cells/ml로 상기 RAW264.7 세포를 분주하고 24 시간 동안 세포를 안정시킨 후, 상기 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물을 각각 1 ug/ml 및 10 ug/ml의 농도로 처리하고, 1시간 후에 상기 LPS를 0.1 ug/ml처리하여 24시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후, PBS로 세척하고, 각각의 세포에 buffer(50 mM HEPES (pH7.4), 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ug/ml aprotinin))을 첨가한 후, 4℃에서 30분간 볼텍싱하여 용균(lysis)하였다. 상기 용균 후, 13,000 rpm의 조건에서 30 분간 원심 분리하여 세포 분해물(debris)을 제거한 후, 얻은 세포 용해액을 이용하여 단백질 함량을 정량하였다.

우선, 동량의 세포 용해액을 5X sample buffer와 혼합하고, 95℃에서 5 분간 끓인 후에 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔(gel)의 단백질을 nitrocellulose membrane상에 이동시키고, blocking buffer(5% skim milk)와 상온에서 2 시간 반응시켜 비특이적 항체결합을 억제하였다. 상기 항체결합을 억제한 후, COX-2, iNOS, IκB, p-IκB 및 actin, lamin에 대한 항체를 blocking solution에 1:1000으로 희석하여 반응액을 제조한 후, 상기 반응액과 4℃에서 밤샘반응(overnight)을 수행하였다. 상기 반응 후, TBS-T로 30 분간 세척하고 horse-radish peroxidase가 conjugation된 2차 항체로 1 시간 반응시켰다.

상기 2차 항체와 반응시킨 멤브레인(nitrocellulose membrane)은 TBS-T로 30 분간 세척 후, ECL kit(Amersham, GE healthcare, 영국)를 사용하여 FluorChem Imaging System(Cell Biosciences, USA)으로 분석하여 각 단백질의 생성정도를 확인하였다.

상기 실험결과 중, p-I-κB-α에 대한 실험결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 군(N)에 비하여 LPS 처리군(P)에서 p-I-κB-α의 발현량이 감소되었다가(30분), 다시 회복되는 것(60분)으로 확인되었다. 일반적으로 LPS에 의해 유도(P)되는 I-κB-α의 인산화는 15분 내지 60분까지 계속 증가되는 양상을 보이나, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, 인산화된 I-κB-α(p-I-κB-α)의 양이 감소되고, 특히 60분이 경과된 시점에서 그 발현량이 현저하게 차이가 있는 것으로 확인되었으며, 그 정도가 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 큰 것으로 확인되어, 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물이 I-κB-α의 인산화를 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.

상기 실험결과 중, iNOS에 대한 실험결과를 도 5에 나타내었다. 상기 도 5에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 군(N)에 비하여 LPS 처리군(P)에서 iNOS의 발현량이 증가되었다. 한편, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, iNOS의 양이 처리 농도에 비례하여 감소되었으며, 그 정도가 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 큰 것으로 확인되어, 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물이 iNOS의 발현량을 억제시키는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 RAW 264.7세포의 배지를 FBS(-) 배지로 갈아주고 30분 뒤에, 상기 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물을 1 ug/ml 또는 10 ug/ml 농도로 처리하였다. 상기 시료 처리 후 1 시간 뒤에 0.1 ug/ml 의 농도로 LPS를 처리하고, 4시간 배양한 후 COX-2의 발현량을 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 군(N)에 비하여 LPS 처리군(P)에서 COX-2의 발현량이 현저하게 증가되었다. 한편, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, COX-2의 양이 처리 농도에 비례하여 감소되었으며, 그 정도가 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 큰 것으로 확인되어, 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물이 COX-2의 발현량을 억제시키는 것으로 확인되었다.

실험예 2-5. TNF -α의 생성 여부 확인

홍삼 추출물과 발효 홍삼 추출물(실시예 1) 및 발효 홍삼 정제물(실시예 2)의 항염활성을 확인하기 위하여, TNF-α의 mRNA 생성 억제 여부 및 TNF-α의 발현량을 분석하여 확인하였다.

상기 TNF-α의 mRNA 생성 정도는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

보다 구체적으로, RAW264.7세포를 60 mm dish에 1×10⁶ cells/ml로 세포를 분주하고 24 시간 동안 세포를 안정시킨 후, 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)를 각각 1 ug/ml 및 10 ug/ml로 처리하고, 1 시간 후 LPS를 0.1 ug/ml의 농도로 처리하여 2 시간 배양한 후, 세포를 수확하였다. 상기 수확한 세포를 12,000 rpm 조건에서 3분간 원심분리하여 세포(cell pellet)를 수득한 후, 상기 수득한 cell pellet 에 200 ul TRIzol^®을 넣고 상온에서 5분간 놓아 두었다. 이 후, CHCl₃ 40 ul를 첨가하고 15 초간 흔들어 상온에 3분간 둔 후, 12,000 x g 및 4℃의 조건에서 15 분간 원심분리하고, 상층액만을 분리하였다. 상기 상측액에 isopropanol 100 ul를 넣고 10 분간 상온에 두었다. 이 후, 12,000 x g 및 4℃의 조건에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, ice-cold 75 % 에탄올 200 ul를 넣고 볼텍싱(vortexing)하였다. 이 후, 7500 x g 및 4℃의 조건에서 5 분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 상온에서 10 분간 건조(air dry)하였다. 상기 건조 후, 생성된 침전물에 RNase free water를 넣고 용해시킨 후, 60 ℃에서 10 분간 방치하고 -20℃에 보관하였다.

상기 분리한 RNA를 정량하여 100 ng씩 덜고 forward TNF-α primer(5’-GGC CTT CCT ACC TTC AGA CC-3’) 및 reverse TNF-α primer(5’-AAG CAA AAG AGG AGG CAA CA-3’)와 Actin forward actin primer(5’-TTC TTT GCA GCT CCT TCG TT-3’) 및 Actin reverse actin primer(5’-CTT CTC CAT GTC GTC CCA GT-3’)를 각각 넣고, RT-PCR (annealing Tm = 60 ℃, cycle = 23)을 수행하였다. 상기 RT-PCR을 수행한 PCR product를 2 % agarose gel에 전기영동하고 EtBr로 염색하여 결과를 확인한 후, 도 7에 나타내었다.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 군(N)에 비하여 LPS 처리군(P)에서 TNF-α의 mRNA 생성량이 현저하게 증가되었다. 한편, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, TNF-α의 mRNA의 양이 처리 농도에 비례하여 감소되었으며, 그 정도가 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 큰 것으로 확인되어, 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물이 TNF-α의 mRNA의 발현량을 억제시키는 것으로 확인되었다.

또한, TNF-α의 발현량은 ELISA Kits(Pierce Endogen, USA)를 이용하여 정량화하였다. 상기 측정결과는 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 발효 홍삼 정제물의 항염 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, LPS를 처리하지 않은 군(N)의 경우, TNF-α가 50% 정도 발현된 반면, LPS 처리군(P)에서 NO 생성량이 현저하게 증가되었다. 한편, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, NO의 양이 처리 농도에 비례하여 감소되었으며, 그 정도가 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 큰 것으로 확인되었고, 상기 종류 별로 유의적으로 효과 차이가 확인되었다.

실험예 2-6. Nitric oxide ( NO ) 생성 및 정량

홍삼 추출물과 발효 홍삼 추출물(실시예 1) 및 발효 홍삼 정제물(실시예 2)의 항염활성을 확인하기 위하여, NO 생성 억제 여부를 분석하여 확인하였다.

우선, RAW264.7세포를 60 mm dish에 1×10⁶ cells/ml로 분주하고, 24 시간 동안 세포를 안정시킨 후, 상기 홍삼 추출물, 발효 홍삼 추출물 및 발효 홍삼 정제물을 각각 1 ug/ml 및 10 ug/ml의 농도로 처리하고, 1시간 후에 상기 LPS를 0.1 ug/ml처리하여 24 시간 동안 배양한 후, 배양액을 수집하였다. 상기 배양액을 12,000 rpm의 조건으로 3분 동안 원심분리한 후, 상층액 100 ul를 취해 Griess reagent를 이용하여 정량하였다. 상세하게, 96 well plate에 상기 수득한 상측액 100 ul와 Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid 및 1% α-naphthylamide in H₂0) 150 ul를 혼합하여 실온에서 5 분간 반응시킨 후 540 ㎚에서 ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite (NaNO₂)로 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻은 후, 상기 측정한 흡광도로부터 N0의 농도를 산출하였다. 상기 Standard NO(sodium nitrite)에 대한 표준곡선의 r² 값은 0.99이상이었다. 상기 산출된 NO 값을 도 9에 나타내었다.

상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 발효 홍삼 정제물의 항염 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, LPS를 처리하지 않은 군(N)의 경우, NO가 거의 측정되지 아니한 반면, LPS 처리군(P)에서 NO 생성량이 현저하게 증가되었다. 한편, 상기 홍삼 추출물(RG), 발효 홍삼 추출물(FRG) 및 발효 홍삼 정제물(PFRG)을 처리한 경우, NO의 양이 처리 농도에 비례하여 감소되었으며, 그 정도가 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물이, 발효 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 정제물이 큰 것으로 확인되었고, 상기 종류 별로 유의적으로 효과 차이가 확인되었다.

상기 결과로부터, 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물이 NO의 생성량을 억제시키는 것으로 확인되었다.

상기한 바와 같이, 본 발명인 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물은 세포 독성을 이용한 실험에서 안전성이 인정되었을 뿐만 아니라, iNOS 단백질의 발현양, COX-2의 발현양, NF-kB 발현양, TNF-α의 m-RNA 생성능 및 nitric oxide의 생성량에 의해 확인한 결과, 기존 홍삼 추출물에 비하여 발효 홍삼 추출물 또는 발효 홍삼 정제물의 항염 효과가 유의적으로 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 상기 발효 홍삼 정제물에 포함된 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드, Rk1 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K, CK)의 함량이 홍삼 추출물에 비하여 현저하게 증가된 결과가 일치하는 것으로 평가된다.

우리나라에서 생산되는 인삼은 고려인삼이라 하여 전세계적으로 그 가치가 인정되고 있으나, 세계 인삼 시장에서 약 3% 정도의 점유율을 차지하고 있는 실정이다. 이러한 측면에서, 인삼 가공제품과 관련하여, 다양한 진세노사이드를 포함하는 우수한 원삼인 우리나라의 고려인삼을 가공하여 고부가가치 인삼제품을 제조할 수 있는 본 발명의 기술은 인삼 재배 농가 및 인삼 관련 산업의 고부가가치화에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원 KCTC11377BP 20080819

Claims (8)

1. 인삼에 물 및 에탄올로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 가하고 용매 추출과정을 수행하여 인삼 추출물을 제조하는 단계;
   상기 인삼 추출물에 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균을 첨가하고 발효과정을 수행하여 인삼 추출물의 발효물을 제조하는 단계; 및
   상기 인삼 추출물의 발효물을 100℃ 내지 150℃에서 60분 내지 120분 동안 가열하는 방법으로 수행하는 인삼 추출물의 발효물을 열처리하는 단계
   를 포함하는 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 인삼은 홍삼인 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균은 기탁번호 KCTC 11377BP를 락토바실러스 브레비스 BJ10(Lactobacillus brevis BJ20 KCTC 11377BP)인 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 인삼 추출물의 발효물을 제조하는 단계는 인삼 추출물에 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균을 첨가하고 33℃ 내지 39℃에서 12시간 내지 96시간 동안 수행하는 것인 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 미량 진세노사이드는 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rk1 진세노사이드 Rg5 및 컴파운드 K(Compoun K)인 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 열처리한 인삼 추출물의 발효물을 정제하는 과정을 더욱 수행하는 것을 특징으로 하는 미량 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법.
7. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 항염 활성이 우수한 인삼 추출물.
8. 제7항의 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물.

Images