KR20120127450A - 진단분석 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

생물학적 샘플에 존재하는 바이러스, 세균 또는 다른 미생물과 같은 병원균을 특히 동정하기 위한 진단 분석 방법은 분석될 샘플이 그 속에 접종되어있고 및 존재할 수 있는 병원균의 복제가 일어나는 액체 배양 배지의 탁도 및/또는 병원균의 농도를, 기계적 판독법으로, 측정하고 연속적으로 감시하는 것으로, 상기 측정과 감시하는 것은 상기 배양 배지에서 성장하는 병원균의 복제 동안 동적으로 수행되는 제1단계; 및 - 맥팔랜드 탁도 척도와 같은 표준화된 값의 척도에 따라 탁도의 및/또는 상기 병원균의 농도의 소정의 값에 도달한, 상기 제1단계로부터 직접적으로 수득한 생물학적 샘플을 함유한 액체 배양배지의 적어도 분취액을 취함으로써, 및 병원균을 동정하기 위해, 제1단계의 측정 결과에 의존해서 그 기능하는 데 있어서 교정되는, 질량분광분석 동정 수단 (15)에서 상기 분취액을 직접적으로 사용함으로써, 수행되는 병원균을 동정하는 제2단계를 포함한다. 상기 병원균의 탁도 및/또는 농도의 소정의 값은 각 경우에서 상기 제2 동정 단계를 수행하기 위해 확인되는 특수한 필요에 기반하여, 상기 제1단계 동안, 예비적으로 선택된다.

Description

진단분석 방법 및 장치{Method and apparatus for diagnostic analyses}
본 발명은 진단 분석(Diagnostic analyses), 더 상세하게는, 질량 분광분석적 측정 수단에 의해 바이러스(viruses), 세균(bacteria) 또는 다른 미생물(micro-organism)과 같은 병원균을 동정하는 진단 분석용 방법 및 장치에 관한 것이다.
항생제에 대한 시험관내 민감도 시험 (안티바이오그램)은 현재 국제적 지침에 기준하여, 항생제의 최적화된 농도 (중단점) 또는 기수적 희석(scale dilution) (M.I.C) 에 대해 시험하기 위해 표준화된 세균 현탁액을 설정하는 것을 제공하는 것으로 알려져 있다.
분석된 세균의 수는 그 시험에 채택된 방법의 민감도에 관계없이 표준화되어야 한다.
접종물의 제조는 모든 민감도 시험 또는 안티바이오그램에서 가장 결정적인 경로의 하나이다. 접종물은 저해 영역의 크기(차원)에 상당한 영향을 끼칠 수 있다.
접종물 방법의 선택은 실전적인 참고사항에 의해 주로 조율되나, 미생물의 현탁액 밀도를 탁도의 명확한 표준물 또는 등가의 라텍스와 비교하는 것과 같은 표준화의 특정 유형이 채용된다면, 또는 광도 측정 수단을 만듦으로써, 그 결과는 더 좋아진다.
특히, 접종물의 표준화에 가장 광범위하게 사용되는 표준화 방법은 특정 범위내의 세균수를 보유하기 위해 세균 현탁액의 탁도를 규제하는 참조물로서 미생물학에서 전형적으로 사용되는 맥팔랜드(McFarland) 탁도 표준을 사용하고 있다.
고전적인 미생물학에서, 맥팔랜드 탁도는 항생제 상에서의 시험 (안티바이오그램)을 개시할 수 있거나 또는 표현형질적 동정을 수행할 수 있는 통상적인 것으로 알려져 있다. 정상적으로, 페트리 디쉬에서의 성장은 분리된 콜로니들을 나타내며, 이러한 세균들을 0.5 맥팔랜드 값, 즉 탁도 수준이 얻어질 때까지 희석시킨다.
맥팔랜드 표준들 (0.1,…,0.3,…,0.5,…,1,…,2,…,3,…,4,…)은 황산과 염화 바륨 이수화물의 특정 부피를 첨가하여 특정 광학 밀도를 가진 황산 바륨 용액을 얻음으로써 제조될 수 있다.
사용된 가장 공통적인 표준은, 약 1.5x108 CFU/ml을 포함하는, 멸균 생리액 또는 성장 배양액의 세균 현탁액의 것과 시각적으로 비견될 만한 표준을 공급하는 맥팔랜드 0.5 표준이다.
일단 표준화되면, 접종물의 현탁액은 제조 15분 내에 사용되어야 한다.
본 출원인의 출원번호 UD2009A000048호는, 직접적인 안티바이오그램의 실행과 연계되어지는, 맥팔랜드 탁도의 표준화를 빠르게 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 특히 생물학적 액체 및 특히 소변 에서의 세균 존재에 의해 영향을 받는, 및 신속히 항생제 요법을 시작해야 하는 환자에게 특히 유용하다.
세포 배양물의 역동적 환경에서 세포 배양 및 농도를 감시하는 방법을 개시한 출원번호 제 US-A-2005/254055호가 또한 알려져 있다.
대안적인 세균 동정법으로서, 예를 들어, 국제특허 출원 제WO-A-2009/065580호 (WO'580)는 바이러스, 세균 또는 다른 미생물과 같은 병원균의 동정을, 예를 들어 페트리 디쉬에서의 고형 배지와 같은 명확한 고형 성장 배지에서 배양 성장 후 원심분리된 생물학적 유체 샘플로부터 펠렛으로서 직접 침전된 병원균으로부터 수득된, 그들 단백질 프로필을 분광측정법으로 수행하는 것으로 알려져 있다. 페트리 디쉬에서의 세균 성장은 정상적으로는 6 내지 12 시간 사이에서 일어난다. 그러한 배양 배지에서는, 오염 세균까지도 성장할 수 있고, 임의의 경우, 상기 동정법은, 질량 분광분석계에 적용되기 위해, 하기를 염두에 두어야 한다:
-펠렛의 세균 덩어리를 통상적인 매트릭스와 접촉하게 하여 샘플을 이온화시키고, 및 달톤 질량 최저치가 2,500인 상황에서, 상기 세균 덩어리들은 3,000 내지 15,000 달톤 의 달톤 범위 내에 있어야 한다. 이러한 범위 위의 값을 가지게 되면 질량 분광분석기를 막히게 할 위험이 있다.
WO'580에 설명된 방법으로 양성 샘플로부터 얻은 펠렛은 진행중인 감염을 야기한 세균과 오염물을 구별하지 못한다는 것이 또한 주목되어야 한다.
결론적으로, WO'580는 동정 라이브러리를 이용하여 세균을 동정하는 탐지 알고리즘이 샘플 내에 있는 세균의 수가 조합된 두 개 종류보다 많은 경우 구별하지 못한다는 점에서, 분석될 샘플 내에 있는 최대 두 개 세균을 구별하는 것에 그 한계를 가지고 있다. 따라서, 상기 공지된 기술은 감염을 야기한 세균은 물론 특히 다른 오염 세균의 존재에 약점이 있다.
더구나, 이러한 기술은 매우 명쾌하지 않은 질량 스펙트럼에 가본적인 방해의 문제점을 종종 부여할 수 있다. 또한, 상기 원심분리 방법은 시간을 연장시키고 및 전체 분석 비용을 증가시킨다.
본 발명의 목적은, 진단 분석, 특히, 감염의 원인 병원균은 물론 다른 오염 병원균의 존재의 경우에도 신속하고, 경제적이고 신뢰할 수 있는, 및 질량 분광분석의 수단에 의해 후속적인 동정 단계를 단순화시키는, 세균, 바이러스 또는 다른 미생물과 같은 병원균을 동정하는, 방법을 완벽하게 하고 그 장치를 달성하는 것이다.
본 출원인은 본 발명을 고안, 시험 및 구체화하여 당해분야의 현 상태의 단점을 극복하고 이러한 및 다른 목적과 장점을 얻었다.
본 발명은 독립항에서 설정되고 특징화되어 있지만 종속항에서 본 발명의 다른 특징과 주요 발명 아이디에 대한 변형이 설명되어 있다.
본 발명은 본 명세서에서 참조문헌으로 전체적으로 기입된 국제 특허 출원 제 WO-A-2009/065580호에서 설명된 병원균 동정 기술을 그 기본으로 채용하고 있다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 참조문헌으로 전체적으로 기입된 본 출원인의 특허 출원번호 제UD2009A000048호에 설명되어 있는 바와 같이, 맥팔랜드 척도의 수단으로써, 병원균의 복제가 있는 샘플을 함유한 배양액의 탁도의 측정에 기초하고, 및 본 명세서에 참조문헌으로 전체적으로 기입된 본 출원인의 이태리 특허번호 제 IT-B-1.259.750호 및 이태리 특허 출원번호 제 UD2008A000190호에 설명된 바와 같이, CFU (콜로니 형성 단위)로 계산된 세균 적재량의 경우 병원균 적재량을 결정하는 것에 기초한다.
특히, 특허 출원번호 제 UD2009A000048 호에서, 직접적인 안티바이오그램을 수행하기 위해, 성장단계에 있는 세균의 후속적인 동정 단계에 사용될 성장단계에서의 동일한 생물학적 샘플로부터 소망의 탁도 값이 얻어진다.
특히 특허출원 제 UD2009A000048호에서, 생물학적 샘플이 그 속으로 접종되었고 및 탁도가 세균의 성장 단계 동안 분석 하에서 샘플의 현탁액으로부터 직접적으로 꾸준히 측정된 액체 배양액에 의해 형성된 현탁액의 맥팔랜드 표준에 따라 탁도를 결정하기 위해, 광산란 측정은, 명확한 역치가, 맥팔랜드 표준에 따라 표명될 때, 일반적으로 0.5의 값에 도달할 때까지, 수행된다.
본 발명의 특징에 따라서, 특히 생물학적 샘플에 존재하는 바이러스, 세균 또는 다른 미생물과 같은 병원균을 동정하기 위한, 본 발명에 따른 진단 분석 방법은:
분석될 샘플이 접종되어 있는 및 존재할 수 있는 병원균의 복제나 성장이 일어나는, 유리하게는 분석될 병원균의 성장에 특이적이고 선택적인 액체 배양 배지의 탁도 및/병원균의 농도를, 기계적 판독법의 수단으로써, 바람직하게는 광산란법 또는 특정 구체예에서는, 또한 광도측정법 또는 다른 광전자적 기술의 수단으로써, 또는 고주파나 심지어 초음파에 기초하여, 측정하고 및 연속적으로 감시하는 것, 즉 조사된 샘플 내에 존재하는 병원균을, 세균의 경우 CFU로 표시하면서, 계수하는 것으로서, 상기 측정 및 감시하는 것은 액체 배양 배지에서 성장하는 병원균이 복제하는 동안 동적으로 수행되는 제1단계; 및
진행중인 병원균의 복제에 의해 야기된 및/또는 맥팔랜드 탁도 척도와 같은 표준화된 값의 척도에 따른 병원균의 농도 또는 수의 소정의 값, 및/또는 세균의 경우 CFU로 표시되는 병원균의 농도의 적절한 값에 도달한, 제1단계로부터 직접적으로 얻은 생물학적 샘플을 함유한 액체 배양배지의 적어도 분취물을 취함으로써 및 상기 병원균을 동정하기 위해, 제1단계의 측정결과에 의존하여 그 기능하는 데 있어서 교정되는 질량 분광분석적 동정 수단에 상기 분취물을 직접적으로 사용함으로써 수행되는 병원균을 동정하는 제2단계를 포함한다.
본 발명에 따라서, 탁도의 소정의 값 및/또는 병원균의 농도 또는 계수의 값은, 각각의 경우에, 질량 분광분석법에 의해 제2 동정 단계를 수행하기 위해 확인된 특수 필요에 근거하여, 제1단계 동안 예비적으로 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 제2단계는 수동적으로 수행되는 반면, 특정 구체예에서, 제2단계는 바람직한 맥팔랜드 탁도에서 샘플의 적절한 자동 취득과 전달을 제공하면서, 자동으로 수행된다.
유리하게는, 제1단계에서 병원균의 탁도 및/또는 상대적인 농도나 계수의 소정의 값을 얻는 데 필요한 시간은 후속적인 제2 동정 단계가 상기 샘플 내 오염 병원균의 가능한 존재와는 무관하도록 설정된 것이다.
유리하게도, 제1단계에서 탁도 및/또는 병원균의 상대적인 농도나 계수의 소정의 값을 얻는 데 필요한 시간은 45분 내지 3시간, 더욱 유리하게는 1 시간 미만으로 구성되며, 분석에서 오염물의 영향을 피하기 위해 상기 샘플을 3시간 이내 사용되어야 한다.
본 발명의 다른 특징은 진단 분석, 특히 생물학적 샘플 내에 존재하는 바이러스, 세균 또는 다른 미생물과 같은 병원균을 동정하는 장치에 관한 것으로, 상기 장치는:
-분석될 샘플이 그 속에 접종되어 있고 및 존재할 수 있는 병원균의 복제가 일어나는 액체 배양 배지의, 탁도 및/또는 병원균의 농도 또는, 세균의 경우는 CFU로 표시되는, 시험되는 샘플 내의 병원균의 계수를 바람직하게는 광산란법, 또는 광도측정법 또는 다른 광전자적 기술의 수단으로써 또는 고주파 또는 심지어 초음파에 기초하여, 측정하고 연속적으로 감시하는 수단; 및
-진행중에 있는 병원균의 복제에 의한 것인, 탁도의 소정의 값, 및/또는 맥팔랜드 탁도 척도와 같은 표준화된 척도에 따른 병원균의 농도나 계수 및/또는 세균의 경우 CFU로 표시되는 병원균의 농도의 소정의 값에 도달한, 생물학적 샘플을 함유하는 액체 배양 배지의 적어도 하나의 분취물 내에서 병원균을 동정할 수 있는 질량 분광분석적 동정 수단을 포함하며; 상기 질량 분광분석 동정 수단은 그 기능하는 데 있어서, 상기 측정 및 감시 수단에 의해 얻어진 병원균의 탁도 및/또는 농도의 측정치의 결과에 기준하여 교정된다. 상기 측정 및 감시 수단은 병원균의 농도나 계수의 측정치와 함께 또는 이에 대한 대안으로 상기 탁도 값의 소정의 등급적 진행과 관련된 제1데이터, 및 상기 병원균의 탁도값 및/또는 농도나 계수 및 그 속에 적재된 샘플로부터의 중량값의 범위 사이의 한정적인 상관관계에 관련된 제2데이터가 기억된, 상기 질량 분광분석 동정 수단의 기능에 적절하도록 선택되어진 기억 수단이 구비된 프로세싱 수단을 포함한다.
상기 프로세싱 수단은 상기 질량 분광분석 동정 수단의 특정 필요에 기초하여 각각의 경우에 선택되는 상기 제2데이터에 포함된 값들 중 하나에 기반하여 상기 제1데이터 중에서, 세균의 경우 CFU로 표시되는, 병원균의 탁도 및/또는 농도의 상기 소정의 값을 선택할 수 있다.
상기 병원균의 탁도 값 및/또는 상대적인 농도를 얻는 데 필요한 시간은 상기 질량 분광분석 동정 수단에 의한 동정이 상기 샘플 내의 오염 병원균의 있을 수 있는 존재와 무관하게 되도록 구성되고, 이러하도록 상기 측정 및 감시 수단이 고안된 것이다.
광산란 측정 또는 이러한 목적에 사용될 수 있는 다른 기술의 예비 단계의 장점은 액체 배양 배지로 접종의 순간부터 탁도의 차등적 측정 수단에 의한 장애의 가능한 요인을 제거하면서, 탁도의 수준이 적절하게 측정되고 및 선택된다는 것이다. 따라서, 기본적인 탁도가 측정된다. 공통적으로, 각 샘플에 대해서, 병원균의 계수는 측정된 탁도의 검출을 지지하기 위해 표명될 수 있다.
세균 또는 다른 병원균의 존재에 대해서 분석될 샘플의 기본적 판독은 병원성 세균의 활성적인 복제에 전적으로 기인할 수 있는 및 세균의 증가하는 질량의 무게 량에 관련된 탁도를 구성하는, 탁도의 후속적인 판독값에 대하여, 그러한 장애 요인을 제거할 수 있게 한다.
액체 배지에서의 성장은 성장의 매우 낮은 초기값에서도, 검출된 탁도와 연계하여 병원균의 계수의 가능한 동시적 측정이 이루어 지면서, 탁도를 측정함으로써 성장을 강조할 수 있게 하며, 그러므로, 약 45분 내지 약 3 시간 사이에 해당하는 매우 짧은 시간 내에 양성적으로 되며 및 상기 탁도를 측정함으로써, 동정용 질량 분광분석기에 의해 요구되는 달톤 무게값을 보증하는 적절성을 샘플에 제공한다.
기껏 45분 접종 후에서도 얻어지는, 이러한 탁도 값은, 질량분광분석기에의해 요구되는 적절성을 샘플에 제공하면서 세균 또는 다른 병원균의 동정을 개시하게 한다.
광산란법 또는 다른 적절한 기술을 사용한 상기 맥팔랜드 측정은 질량 분광분석법의 후속적인 분석에 대해 결정적이라고 간주되는 달톤 질량과 등가인 탁도를 제공한다.
상기 배양물의 예비단계 동안 광산란법을 사용하는 것은 그것의 높은 감도 특성이 질량 분광분석기를 사용하여 후속적인 동정 단계에 대하여 최적의 탁도 수준을 빠르게 검출할 수 있게 하며, 따라서 작업시간을 더 가속화시키다는 점에서 바람직하다. 그러나, 더 일반적으로, 비탁계 (nephelometric) 레이저 기술 또는 광도측정 판독 시스템과 같은 또는 진단 실험실 유형의 기구 사용 분야에서 통상적으로 사용되는 광전자적 또는 고주파나 초음파와 같은 다른 탁도 검출 시스템과 같은 다른 적절한 기술을 또한 사용할 수 있다.
본 발명은 액체 배양배지에서 성장하는 실증화된 샘플 및 명확한 달톤 무게와 상호연관된 소정의 맥팔랜드 탁도값에 표준화된 샘플을 임의의 질량 분광분석기에서 사용할 수 있게 한다.
본 발명은 샘플 내에서의 오염 세균 및 몇가지 세균종의 존재의 문제를 극복할 수도 있다.
샘플 내에서, 예를 들어, 액체 우생적 배양액에 접종된 소변내의 세균의 복제 단계는 샘플의 탁도가 증가되는 것으로 그 자체를 증명하는 것으로 알려져 있다. 역동적 맥팔랜드 평가법은 제1 세균 복제로부터 올바르게 증가된 탁도를 검출하도록 하며 및 유리하게도 가능한 양성의 결과는 기껏 45분 배양 후에 얻어진다.
이러한 제1단계에서, 복제됨에 따라 증가된 탁도를 야기하는 것은 감염을 일으킨 세균이다. 대신에, 샘플을 취득하는 동안 수집된 오염 박테리아는 상기 소변 샘플내의 새로운 환경에 적응하는 데 시간이 걸리며 따라서 수 시간 후에서 만 그들의 성장이 나타나게 된다.
전형적인 예는 비뇨생식 장치에 거주하는 세균, 예를 들어, 응집효소(coagulase) 음성 포도상구균(Staphylococcus)로서, 이는 소변 샘플을 취하는 동안 우연히 수집되며 따라서 통상적인 배양 배지 상에서 성장을 보일 수 있다.
다른 예는, 호흡기 샘플을 취하는 경우에, 타액내의 포도상구균 또는 비병원성 포도상구균, 또는 효모나 다른 오염 유기체의 존재일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은, 생물학적 샘플이 접종된, 특히, 액체 배양 배지 내에서의 생물학적 샘플의 탁도를, 질량 분광분석법에 의한 후속적인 세균 동정 단계를 위해, 0.1에서 10으로 진행되는 맥팔랜드 탁도 값의 창구에서, 광산란법 또는 다른 동등한 또는 대안적 적절한 방법에 의해, 측정하는 것을 제공한다. 탁도의 수준은 수행될 분광분석법 분석에 필요한 역치에 비례하는 데, CFU에서의 역치값은 102,103,104,105,106,등으로 주어진다.
특히, 맥팔랜드 탁도값과 달톤 중량간의 관계를 아는 것은, 문제의 분광분석적 측정치에 최적인 3,000 15,000 달톤 범위 중량에 상응하게 성장하는 샘플의 맥팔랜드 탁도를 조절하는 것이 가능하다. 실제, 질량 분광분석기는 3,000 - 15,000 달톤 중량 범위에 있는, 단백질 이온의 인지에 적합한 액체 물질이 공급되어야 한다는 것을 안다면, 탁도 측정기는 맥팔랜드 탁도의 상관된 값이, 분석될 샘플의 최적화에 의존하여 도달되었다는 것을 알게하며 및 또한, 동시에, 탁도에서 변이를 야기하는 복제 중에 있는 병원균의 계수를 제공하면서, 자동적인 작업 사이클 중에, 과도한 탁도의 및 15,000 달톤 이상 또는 2,500 달톤 미만의 적절한 범위 외에 있는 샘플을 사용하는 것을 피하도록 조절될 수 있다. 결론적으로, 맥팔랜드 탁도의 동적인 감시는 기기가 막히는 것을 피하기 위해, 질량 분광분석 기기에 의해 요구되는 최적 한계치 내에 세균 적재가 있는 샘플을 적재하도록 한다.
본 발명은 따라서 요구되는 바 가변적 맥팔랜드 탁도에서 측정된 액체 형태의 배양 배지를 사용하게 하여, 샘플이 질량 분광분석기에 삽입되어 샘플을 동정할 수 있게 한다.
본 발명에 따라서 개발된 방법은 오염 세균의 성장을 배제하면서, 배양 성장에 양성인 샘플의 탁도 값을 제공할 수 있게 한다. 이것은 분석될 동일 샘플 내에 두 개 이상의 세균종이 있는 경우 WO'580에 의해 나타난 문제를 해결해 준다. 이것은, 상기 오염물이 새로운 성장 환경에 적응하기 때문에 오염물의 성장에서의 소위 유도기 (lag phase)가 알려져 있는 관계로, 전술한 바와 같이 빠른 시간이 주어진다면, 필요한 탁도 값의 역동적 측정치는 WO'580에서 설명된 한계를 제거하게 하기 때문이다.
본 발명은 WO'580에서 설명된 바와 같은 펠렛상에서의 농축 단계를 극복하며 따라서 성장하는 샘플을 직접적으로 사용하여, WO'580와 비교하여, 동정 단계를, 적절한 맥팔랜드 탁도 값을 이용하여 간편화시키고 빠르게 촉진할 수 있게 한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 배양 배지에서 성장하는, 명확한 맥팔랜드 탁도 값을 나타내는 생물학적 샘플을, 통상적으로 3,000 내지 15,000 달톤 내에 있는, 질량 분광분석기에서 사용될 달톤 질량 측정치에 의존하여 선택하는 것이 제공된다.
광산란법 또는 다른 적절한 기술을 사용하는, 맥팔랜드 탁도 측정기는, 이미 설명한 바와 같이, 적재물이 두 개의 세균을 가진다면, 정상적으로는 상기 공지된 질량 분광분석 시시템이 여전히 잘 작동하지만, 세 개 이상의 세균이 있는 경우 응답을 더 이상 신뢰할 수 없기 때문에, 혼합된 적재 샘플을 판독하는 것을 피하기 위해, 상이한 맥팔랜드 탁도 0.1,…,0.2,….,0.3,…0.5,…등에 스칼라 판독 프로그램을 이용하여 조절될 수 있다.
오염 세균이 샘플, 예를 들어 소변이 들어가는 시험관 또는 병에서, 그들의 자연적인 성장 환경이 아님에 따라, 적응할 일정 시간이 소요되기 때문에, 그들은 성장 3시간, 통상적으로는 4 내지 5시간 복제하기 시작하고, 따라서 지수기의 병원균의 성장 그래프와 함께 또는 그 대신, 맥팔랜드 값이 도달하는 빠른 복제의 처음 45분 기간을 고려하기 때문에, 상기 제안된 방법은 오염 세균에 의해 및 이들로부터 유도되는 가 명확성 (false positivity)에 의해 거의 또는 전혀 영향을 받지 않는다. 사실, 감염을 야기한 세균을, 큰 활성의 더 긴 적응 시간을 요하는 오염 세균과 구별하면서, 45 분 만에 높은 복제기에 있는 세균의 적재량을 결정하는 것이 가능하다.
그러므로, 스칼라 맥팔랜드 값 0.1, …,0.5,…등을 확인하는 것은, 언급한 바와 같이, 처음 복제된다고 하면, 예를 들어, 소변 샘플의 경우 비뇨기에서의 감염을 야기한 세균만을 확실히 동정하게 한다..
본 발명은 소변 또는 다른 생물학적 액체와 같은, 접종된 물질을 가진 액체 배양액 용기 내의 세균 적재물의 지수 성장이, 질량 분광분석법으로써 예비 선택된 소정의 탁도를 이용하여 동정을 수행하기 위해, 대조 및 특정의 프로그램화될 데이터를 제공하기 때문에, 후속적인 동정 단계를 자동화하게 한다.
순수한 세균 콜로니 및 최대 두 개 세균의 존재까지 허용되는 것으로 최고의 결과를 얻는 (세균종의 세 개 콜로니로부터 또는 더 이상으로부터는 결과의 신뢰성이 급격히 감소된다) WO'580에 비해, 본 발명은, 주로 단일 미생물 배양물에 대하여 처음 3 시간 내에, 통상적으로, 맥팔랜드 탁도 측정에 의해 복제를 활성적으로 측정하는 것이 확인될 수 있다는 점에서, 순수한 콜로니를 수득하지 않고 운행될 수 있다. 예를 들어, 소변 샘플에 대해서, 병인의 70%는 단일 미생물 성장에 의해 야기되며 15%가 두 개 미생물 종에 기인한다.
다중 미생물 성장의 가능성 있는 존재를 특별히 참조하면, 시스템의 검출 순간에, 도달된 명확한 맥팔랜드 탁도에 의해 중지되는, UD2009A000048에서와 같은 빠른 배양 단계는, 존재할 수 있는 세균의 처음 지수 성장 단계 중에, 질량 분광분석법을 사용하여, 따라서 초기 단계에 샘플을 동정 시험할 수 있게 한다. 이것은, 우세한 병원균이 과발현될 것이고 및 다른 존재하는 세균은, 오염물이고 따라서 지수 단계에 있지 않는다면, 잠재성으로 남아있게 될 것이며 따라서 분광분석의 순간에 절대적인 농도의 관점에서 전체적으로 무시할 만하며, 및 이들은 질량 분광분석적 동정 시스템이 바탕을 둔 단백질 또는 지질 프로필의 분석에 방해하지 않을 것을 의미한다.
WO'580에서 일어나는 바와 같이, 상시 시스템에 의한 프로필의 검출을 동일한 수준에서 교란하는 방해하는 것이 동일하게 향상될 수 있다.
더구나, 질량 분광분석적 동정 전의 배양 단계 중에 선택적 액체 배양 배지를 사용하게 되면 분광분석기의 성능을 더 향상시킬 수 있을 것이다.
실제, 선택적 배지 또는 선택적 물질, 예를 들어 항체나 다른 것이 첨가된 배지를 사용하여, 상기 배양 단계는 또한 선택적 배양 배지 사용없이, 상기 질량 분광분석기 동정 시스템이 직접적으로 동정할 수 없거나 만족할 만한 방식으로 구별할 수 없는, 명확한 미생물 또는 특히 미생물의 종 이하, 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 MRSA를 미리 선택하는 요소로서 작용할 수 있다. 선택적 배양 배지에서의 성장의 단계는 따라서 질량 분광분석기에 의한 동정 기술을 보조하고 향상시키는 진단 장치이다.
그러므로, 광산란법 또는 다른 대안적이고 유사한 기술을 사용하여, 질량 분광분석법으로 후속적인 병원균 동정에 대한 예비적이고 준비적인, 탁도 측정은:
- 액체 상의 우생적 배양 배지에서의 배양 성장에 양성적인 것으로 표명되는 동일한 샘플 또는 이의 분취물을 질량 분광분석법에 의한 후속적인 동정을 위해서 사용하는 것;
- 상기 양성 샘플의 원심분리에 의한 펠렛화 단계를 피하면서 동일한 샘플을 사용하는 것;
- 상기 양성 샘플의 원심분리에 의한 펠렛화를 피하는 것;
- 과도하게 탁한 샘플의 사용을 피하고 질량 분광분석기가 막히는 것을 예방하기 위해, 적절하고도 후속 질량 분광분석법에 대해 3,000 - 15,000 달톤의 최적 범위에 상응하는, 맥팔랜드 값 및/또는 세균의 경우에 CFU로 표시되는, 세균 수의 결과를 제공하는 것;
- 통상 성장의 3 시간 내에 사용된다면, 샘플 취득 단계에서, 오염균의 성장을 분석에서 배제시키는 것;
- 전술한 성장 3 시간 내에 사용된다면 오염물 없이 샘플을 질량 분광분석기에 제공하는 것;
- 세균의 경우 CFU로 표시되는 병원균 수를 또한 동시에 표시하면서, 통상 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.00, 1.25, 1.5, 1.75, 2.00, 2.22, 2.5 등인, 질량분광분석기 사용에 요구되고 적합한 것으로 간주되는 탁도의 범위로 양성 샘플을 제공하는 것;
- 질량 분광분석기를 사용하여, 감염 야기 병원균은 물론 동일 샘플에서 최대 두 개 세균까지 활성 및 오염 복제 병원균의 존재를 동정하는 것;
- 질량 분광분석기로 검출시 측정할 수 있는 최소, 즉, 2,500 달톤에 등가인 맥팔랜드 탁도 값을 가지는 양성 샘플을 제조하는 것;
- 표준화된 맥팔랜드 척도와, 세균의 경우 CFU로 표시되는 병원균 계수에 따른 탁도 측정치 및 질량 분광분석기에 의한 검출에 적합한 분자량 간의 상호관계를 결정하는 것;
- 특정의 구체예에서, 질량 분광분석기로부터 적절한 반응을 수득하면서, 특정 라이브러리를 이용하여 해석하기 어려운 세균 (예를 들어, 스타필로코커스 아오레우스 MRSA)을 검출하게 할 수 있는 선택적 액체 배양 배지를 사용하는 것을 가능하게 한다.
적절한 예비 선택된 탁도 타겟에 설정된 표준 탁도, 전형적으로는, 맥팔랜드 척도의 탁도 및 세균의 경우 CFU로 표시되는 병원균의 계수를 역동적으로 측정하는 것은 분석되는 샘플이 질량 분광분석기를 사용하여 얻을 수 있는 신속한 동정을 수행하기에 적당하게 만들어 주며, 이로써 예비 선택된 탁도의 자동 검출 과정에서, 신속하고 및 WO'580에서 설명된 바와 같은 동정을 방해하는 문제점을 가지지 않는. 자동화된 작업 시스템이 제공될 수 있다.
연속적으로 샘플의 맥팔랜드 탁도를 역동적으로 판독하는 것은 또한, 분석된 동일한 샘플을 4/5 시간 배양 후 동정하는 것에 대해서, 시초 배양 시간 (약 45분 내지 약 3시간) 후에 오염 세균의 존재를 질량 분광분석법으로 동정하는 것을 확인할 수 있게 한다.
지질 물질 또는 특이적 유당물질로 바이러스 또는 다른 미생물을 적절히 대응함으로써 본 발명은 또한 세균적 동정뿐 아니라 바이러스 동정에도 적합하다.
어려운 세균 성장용 선택적 액체 배양 배지 또는 특히 관심있는 특정 세균의 성장에 적합한 배지의 선택은 본 발명의 분야와 범위 내에 있다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 특징은 비제한적 예로 주어진 구체예의 바람직한 형태의 하기 설명에서 더욱 명확해질 것이며, 첨부된 도면을 참고하면:
도 1은 본 발명에 따른 진단 분석용 장치를 도식적으로 나타낸 도면이고;
도 2는 도 1의 장치의 일부분을 도식적으로 나타낸 도면이고;
도 3은 시간에 따른 세균 적재물의 발달을 나타낸 그래프이다.
이해를 돕기 위해, 동일 참조 번호는, 가능한 곳에서, 도면에서 실질적으로 동일한 공통의 요소를 확인하려고 사용되었다. 구체예의 일 형태의 요소와 특징은 추가의 설정없이 다른 형태의 구체예에 혼입될 수 있다고 이해된다.
첨부 도면을 참조하면, 본 발명에 따른 방법은 액체 배양액 또는 우생적 배양액에서 복제하는 생물학적 샘플을 소정의 명확한 맥팔랜드 탁도 값에서 광산란법을 이용하여 제조하는 것 및 후속적으로 제조된 샘플 또는 이의 분취물을, 존재할 수 있는 병원균을 동정하기 위한 질량 분광분석 측정에 사용하는 것을 제공한다. 비록, 비제한적 방식으로 광산란법을 지칭하지만, 본 발명은 전술한 바와 같이 다른 유사한 기술을 제공할 수 있다.
이 경우, 상기 방법은 장치 (10) (도 1)을 사용하는 데, 이 장치는 광확산 측정 장비 (12) 및 예를 들어, MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) 유형의 질량 분광분석기 (15)를 포함한다.
상기 장비 (12)는 전자기파를 투과하며, 그 내부에 우생학적 배양액에 접종된 생물학적 샘플의 현택액에서 세균 성장이 제공되는 수용 요소 또는 시험관 (16)을 사용하는 것을 제공한다.
상기 장비 (12)는 시험관 (16)에 수용된 현탁액에 의해 산란된 광이 검출되는 판독 유닛 (11) , 및 상기 판독 유닛(11)에 의해 받은 신호를 분석 목적상 가공하는, 컴퓨터와 같은 프로세싱 수단(26)를 포함한다.
본 발명에서, 상기 샘플은 가능한 병원성 미생물에 대한, 예를 들어, 명확한 세균 종에 대한 실체적 증거를 증명하기 위해 배양 시험하며, 만약 양성이라면, 소정의 탁도 및 병원균 농도로 제조된 하나를 후속적인 세균 동정 단계에 직접적으로 사용한다.
시험관에서 상기 샘플의 맥팔랜드 탁도를 도 1에서의 판독 유닛 (11)에 의해 측정하는 것은, 이 경우에, 직접적으로는 분석 단계에서, 즉, 대양 시험 중에 세균 성장과 동일한 시간에서, 레이저 광 및 광산란 판독에 기초하여서, 분석하에 있는 샘플에서의 세균 적재량을 결정한다.
특히, 판독 유닛 (11)은 방출기 수단 (13)이 구비되는 데, 이에 의해 간섭성, 편광된 (레이저) 및 시준된 광이 만들어져서 시험관 (16)를 타격하게 된다.
또한, 상기 판독 유닛(11)은 제1 및 제2 센서 수단 (18, 20)을 포함하며, 이에 의해 현탁액에 의해 광확산 또는 굴절된 광 (22, 24)을 시간에 따라 검출하게 된다.
상기 제1 및 제2 센서 수단 (18, 20)은 상응하는 신호 (S1, S2)를 발생시킬 수 있고, 이들은 프로세싱 수단(26)으로 전달된다.
복제하는 세균이 존재하는 생물학적 샘플은 분산된 광을 방출하며 이는 상기 판독 유닛 (11)이 검출하고 프로세싱 수단 (26)이 가공하여 시간에 따른 세균 성장의 발전을 나타내는 특정 곡선을 제공하게 된다.
제1 및 제2 센서 수단 (18, 20)은, 시험관 (16)에 대하여, 서로 상이한, 제1(P1) 및 제2 (P2) 각도 위치 (도 1)에 상응하게 위치하여, 각각 제1 (P1) 및 제2 (P2) 각도 위치와 연계되어 있는, 시간의 경과에 대한 세균 현탁액의 탁도의 발달의 제1 (V1(t)) 및 제2 (V2(t)) 곡선을 결정한다.
이 경우, 제1 및 제2 센서 수단 (18, 20)은 광선 (14)의 방향에 대하여 두 개의 미리 정해진 각도 α 및 β, 예를 들어, 각각 30°및 90°에서 위치하게 된다 (도 1).
상기 프로세싱 수단 (26)은 데이터 (D1, D2)가 기억되어 있는 데이터베이스를 가진 기억 수단 (28)를 포함하며, 이들은 각각 맥팔랜드 탁도의 점진적 척도 값 및 맥팔랜드 탁도 척도에서 달톤 중량으로의 전환값에 관한 것이어서, 상기 샘플이 제조된 맥팔랜드 값과 질량 분관분석기 (15)에 의해 사용된 최적 중량 범위와 연계시킬 수 있게 된다. 성장 단계 동안 샘플의 미리 정해진 맥팔랜드 탁도의 수준, 예를 들어, 0.5에 도달하는 데 걸린 시간은 상기 샘플의 처음 세균 적재량에 의존하며, 여기서, 계수값이 클수록, 상기 미리 정해진 맥팔랜드 역치가 더 빠르게 도달될 것이다.
소정의 맥팔랜드 값에 도달하는 것과 연계하여 또는 그 대안으로서, 상기 판독 유닛 (11)은 존재할 수 있는 병원균을, 세균의 경우는 CFU로 표시하면서, 계수할 수 있다. 실제로, 광산란기술에 기반한 비탁계 유형의 경우에, 수행되는 광학 측정은 시간의 함수로서 지수 발달에 기반하여, 세균 계수의 정량적 측정을 가능하게 한다.
특히, 센서 (18, 20)에 의해 검출된 광은 전기적 신호로 전환된 후 프로세싱 수단 (26)으로 전송되고 이는 데이터를 처리하는 것과 결과를 계산하게 된다.
상기 샘플에 존재하는 미생물의 양과 복제 속도와 같은 분석 매개변수들을 정하기 위해, 상기 세균 성장 곡선을 상기 프로세싱 수단 (26)의 데이터베이스에 포함된 참조값과 비교한다.
상기 계산 방법은 현탁액 내부의 세균 성장은 전환된 광의 강도의 시간에 따른 변화를 야기한다.
상기 전환된 광을 주기적으로 판독하는 시험되는 플라즈마 샘플 내부의 세균 콜로니의 성장곡선을, 공지된 내삽법으로 작성하게 하며, 상기 곡선은 검출기가 위치한 검출의 각도와 관계가 있다.
상기 성장 곡선은 시간의 함수로서 지수 진행, 즉 CB=AeK n (t-t) 0+C을 가지는 것이 실험적으로 증명되었다.
상기 식에서, CB는 전환 광의 강도를 나타내고, A와 C는 각각 시험되는 세균 종 및 시초 농도에 의존하는 상수이고, Kn은 검출기의 위치 각도를 고려한 매개변수이고, t는 시간이고 및 t0는 샘플 내 존재하는 세균 수와 연관된 지연시간이다.
소정의 맥팔랜드 탁도 및 병원균 수를 결정하는 것은, 특히, 복제하는 샘플을 가진 액체 배지가 너무 탁해서 맥팔랜드 척도를 사용한 병원균 정량 결정이 어려운 반면, 성장 곡선을 사용한 정량이 더 신뢰가 있는 경우, 또는 반대로, 상기 배지가 너무 묽은 경우 유용하다. 일단 제조된 후, 샘플 또는 그 분취물은 질량 분광분석기 (15)로 전달되고 이는 병원균의 동정을 수행한다. 상기 질량 분광분석기 (15)의 구성 및 기능 상세는, 예를 들어, WO'580에 알려져 있고, 여기서는 설명하지 않는다.
본 발명은 따라서, 배양 단계에서 세균 질량의 증가에 의해 소망되고 결정된 미생물의 농도 및/또는 탁도를 선택할 수 있게 되고, 이는 질량 분광분석기에 의해 얻어지는 후속 동정 단계와 연계되어 있다.
부분적인 변경 및/또는 부가가 상기 진단 분석용 장치 (10) 및 방법에, 전술한 바와 같이, 본 발명의 분야와 범위를 벗어나지 않고 이루어 질 수 있다는 것은 명백하다. 또한, 비록 본 발명이 특정 실시예를 참조하여 설명되었지만, 당해분야의 기술자는 청구범위에 설정된 특성을 가지는 진단 분석용 장치 및 방법의 많은 다른 등가물을 확실히 성취할 수 있을 것이고, 따라서 모든 것이 청구범위에 정의된 보호 범위에 들어간다는 것이 명백하다.

Claims (6)

  1. 생물학적 샘플에 존재하는 바이러스, 세균 또는 다른 미생물과 같은 병원균을 특히 동정하기 위한 진단 분석 방법에 있어서:
    - 분석될 샘플이 그 속에 접종되어있고 및 존재할 수 있는 병원균의 복제가 일어나는 액체 배양 배지의 탁도 및/또는 병원균의 농도를, 기계적 판독법으로, 측정하고 연속적으로 감시하는 것으로, 상기 측정과 감시하는 것은 상기 배양 배지에서 성장하는 병원균의 복제 동안 동적으로 수행되는 제1단계; 및
    - 맥팔랜드 탁도 척도와 같은 표준화된 값의 척도에 따라 탁도의 및/또는 상기 병원균의 농도의 소정의 값에 도달한, 상기 제1단계로부터 직접적으로 수득한 생물학적 샘플을 함유한 액체 배양배지의 적어도 분취액을 취함으로써, 및 병원균을 동정하기 위해, 제1단계의 측정 결과에 의존해서 그 기능하는 데 있어서 교정되는, 질량분광분석 동정 수단 (15)에서 상기 분취액을 직접적으로 사용함으로써, 수행되는 병원균을 동정하는 제2단계를 포함하며;
    상기 병원균의 탁도 및/또는 농도의 소정의 값은 각 경우에서 상기 제2 동정 단계를 수행하기 위해 확인되는 특수한 필요에 기반하여, 상기 제1단계 동안, 예비적으로 선택되고, 여기서 후속 동정이 상기 샘플 내의 오염 병원균의 존재와는 무관하게 되도록 제1 단계에서 병원균의 탁도 및/또는 상대적인 농도의 소정값을 얻는 데 필요한 시간이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제1단계에서 상기 병원균의 탁도 및/또는 상대적인 농도의 소정의 값을 얻는 데 필요한 시간은 45분 내지 3시간 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 제1단계에서 병원균의 탁도 및/또는 상대적인 농도의 소정의 값을 가지게 된 샘플을 제2단계에서 3시간 이내에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 전술항 중 임의의 항에 있어서,
    상기 제1단계는 제2단계에서 동정될 샘플의 3,000 내지 15,000 달톤 중량에 상응하는 샘플의 탁도 값을 공급할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 전술항 중 임의의 항에 있어서,
    소정의 병원균를 배양하기 위해, 선택적인 액체 배양 배지 또는 선택적인 물질이 첨가된 선택적인 배지를, 상기 제1단계에서 사용하는 것을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 생물학적 샘플에 존재하는 바이러스, 세균 또는 다른 미생물과 같은 병원균을 특히 동정하기 위한 진단 분석 장치에 있어서:
    - 분석될 샘플이 그 속에 접종되어있고 및 존재할 수 있는 병원균의 복제가 일어나는 액체 배양 배지의 탁도 및/또는 병원균의 농도를, 기계적 판독법으로, 측정하고 연속적으로 감시하는 수단 (12); 및
    - 맥팔랜드 탁도 척도와 같은 표준화된 값의 척도에 따른 탁도의 및/또는 상기 병원균의 농도의 소정의 값에 도달한, 상기 제1단계로부터 직접적으로 수득한 생물학적 샘플을 함유한 액체 배양배지의 적어도 분취액 내에서 병원균을 동정할 수 있는 질량분광분석 동정 수단(15)으로서, 상기 측정 및 감시 수단(12)에 의해 수득된 탁도 및/또는 병원균 농도의 측정값의 결과에 기반하여, 그 기능 중에 교정되는 질량 분광분석 동정 수단 (15)으로서, 상기 측정 및 감시 수단 (12)에 의해 수득된 병원균의 탁도 및/또는 농도의 측정치 결과에 기반하여, 그 기능에서 교정되는 질량 분광분석 동정 수단 (15)를 포함하며;
    상기 측정 및 감시 수단 (12)는 상기 측정 및 감시 수단은 병원균의 농도나 계수의 측정치와 함께 또는 이에 대한 대안으로 상기 탁도 값의 소정의 등급적 진행과 관련된 제1데이터 (D1), 및 상기 병원균의 탁도 및/또는 농도의 값과 그 속에 적재된 샘플로부터의 중량값의 범위 사이의 한정적인 상관관계에 관련된 제2데이터 (D2)가 기억된, 상기 질량 분광분석 동정 수단(15)의 기능에 적절하도록 선택되어진 기억 수단이 구비된 프로세싱 수단을 포함하며, 상기 프로세싱 수단 (26)은 상기 질량 분광분석 동정 수단(15)의 특정 필요에 기초하여 각각의 경우에 선택되는 상기 제2데이터(D2)에 포함된 값들 중 하나에 기반하여 상기 제1데이터 중(D1)에서 병원균의 탁도 및/또는 농도의 상기 소정의 값을 선택할 수 있고, 여기서, 상기 질량 분광분석 동정 수단 (15)에 의한 동정은 샘플내의 오염 병원균의 존재와 무관하도록 병원균의 소정의 탁도값 및/또는 상대적인 농도를 얻는데 필요한 시간이 구성되고 이러하게, 상기 측정 및 감시 수단(12)가 설정되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
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