KR20120115125A - Method of preparing a biohybrid metal nanoprobe for image measurement of surface-enhanced raman scattering - Google Patents

Abstract

PURPOSE: A method for manufacturing a bio-hybrid metal nanoprobe for measuring surface-enhanced Raman scattering images is provided to manufacture a bio-hybrid metal nanoprobe for measuring surface-enhanced Raman scattering S images in which sensitivity and chemical stability are high, thereby using the metal nanoprobe as a surface-enhanced Raman scattering based bio imaging device. CONSTITUTION: A method for manufacturing a bio-hybrid metal nanoprobe for measuring surface-enhanced Raman scattering images comprises next steps. Seed metal nano particles are prepared. The seed metal nano particles and a Raman dye are heated or collected after mixing so that a metal nano-cluster including the seed metal nano particles and Raman dye is formed. The metal nano-cluster is coated with a protein or first hydrophilic polymer so that the metal nano-cluster is formed. The metal nano-cluster coated with the protein or first hydrophilic polymer is mixed with a second polymer solution so that a second polymer suspension including the metal nano-cluster is manufactured. The suspension is sprayed by an electricity hydraulic power spraying method so that the metal nano-cluster encapsulated by covering the nano-cluster with the second polymer. The encapsulated metal nano-cluster is heated or UV treated and a cross-linkage or non-cross-linkage is generated in between the second polymers covering the metal nano-cluster so that a metal nano-cluster-second polymer network is formed. [Reference numerals] (AA) On-seed(6 to 13nm); (BB) Raman dye+Na3 - citrate+AgNO3; (CC) Stabilizing with protein; (DD) Raman dye+salt; (EE) Stabilizing with polymer; (FF) Silver nano particle plaster(60 to 150nm); (GG) Silver nano cluster(30 to 40nm)

Description

표면-증강 라만 산란 이미지 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법{METHOD OF PREPARING A BIOHYBRID METAL NANOPROBE FOR IMAGE MEASUREMENT OF SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING}METHOD OF PREPARING A BIOHYBRID METAL NANOPROBE FOR IMAGE MEASUREMENT OF SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING}

본 발명은 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Sacattering; 이하, ‘SERS’라고 함) 이미지 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법 에 대한 것이다.
The present invention relates to a method for preparing biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman Sacattering (hereinafter referred to as 'SERS') image measurement.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 마이크로어레이는 바이오 마커 후보를 확인하는 도구로 널리 사용되었다. 이 기술을 이용하면 적은 부피를 가지는 샘플 내 수 개의 단백질의 농도를 동시에 측정할 수 있다. 게다가, ELISA 방법은 종래의 방법보다 단번에 많은 양을 처리할 수 있고(high-throughput performance), 비용이 적게 들고, 그리고 임상에 쉽게 적용할 수 있는 이점이 있다. ELISA 분석에서는, 각각의 어레이 웰에 고정된 바이오 마커 샘플을 수득하기 위해서 형광-기반 마이크로어레이 스캐너가 사용된다. 그러나 이 형광 이미징 기술은 신호 대 노이즈 비율이 좋지 않고 검출 한계값도 좋지 않은 단점이 있다(Bally, M. et al., 2006. Surf. Interface Anal . 38, 1442-1458).Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) microarrays have been widely used as tools for identifying biomarker candidates. Using this technique, the concentration of several proteins in a small volume sample can be measured simultaneously. In addition, the ELISA method has the advantage of being able to process a large amount at a time (high-throughput performance), less expensive, and easier to apply to the clinic than the conventional method. In ELISA analysis, a fluorescence-based microarray scanner is used to obtain a biomarker sample immobilized in each array well. However, the fluorescent imaging technique is disadvantageous in poor detection limits also rather poor signal-to-noise ratio (Bally, M. et al., 2006. Surf. Interface Anal . 38, 1442-1458).

표면증강라만 산란(Surface enhanced Raman scattering, 이하 ‘SERS’)-기반 검출 방법은 고감도 분석법으로 각광을 받고 있다. 이 기술은 샌드위치 면역분석을 이용한다. 다클론 항체(PAb)가 고체 기판에 고정되고, 그 다음 항원 용액 및 라만 리포터가 붙은 면역-금 나노입자가 연속적으로 첨가된다. 리포터 분자의 특징적인 SERS 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 항원 바이오 마커를 정량적으로 분석할 수 있다. 리포터 분자가 거친 금속 표면에 흡착되고 여기광(레이저 광)에 노출되면, “측정 접점(hot junction)”이라고 알려진 리포터 분자의 SERS 활성 사이트에서 전자기적이고 화학적인 증강이 발생하여 SERS 신호가 대폭 증가한다(Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett . 6, 2225-2231). 이 증강 효과는 종래 라만 및 형광 검출법이 가지는 단점인 저감도성의 문제를 해결해 줄 것으로 기대되었다.Surface enhanced Raman scattering (SERS) -based detection methods have been spotlighted as high sensitivity assays. This technique uses sandwich immunoassays. The polyclonal antibody (PAb) is immobilized on a solid substrate, followed by successive addition of immuno-gold nanoparticles with antigen solution and Raman reporter. Antigen biomarkers can be quantitatively analyzed by measuring changes in intensity of characteristic SERS peaks of the reporter molecule. When reporter molecules are adsorbed on rough metal surfaces and exposed to excitation light (laser light), electromagnetic and chemical enhancement occurs at the SERS active site of the reporter molecule, known as “hot junction,” resulting in a significant increase in the SERS signal. (Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett . 6, 2225-2231). This enhancement effect was expected to solve the problem of low sensitivity, which is a disadvantage of conventional Raman and fluorescence detection methods.

SERS는 단일분자 수준에서 생체이미징 및 생체신호를 고감도로 측정할 수 있는 기술로 발전해 왔다. 나노 구조 금속 표면에 흡착된 서로 다른 분자들의 라만 신호는, 은, 금, 구리 등의 경우에 매우 높게 나타난다. 거친 금속 기질 표면에 라만 활성 분자들이 흡착되면, 그들의 SERS 신호는 증가한다. 그 이유는 측정 접점(hot junctions)의 매우 편재화된 플라스몬 중심에서 발생하는 전자기 및 화학 증강 현상 때문이다. 전자기현상은, 거친 금속 기질 또는 금속 응집체 표면과 연관된 국소 표면 플라스몬 공명과 관련이 있다. 반면, 화학 증강은 직접적 전하 이동 또는 홀-쌍 발광(hole-pair excitation process )과 연관되어 있다.SERS has evolved into a technology that can measure bioimaging and bio signals with high sensitivity at the single molecule level. Raman signals of different molecules adsorbed on nanostructured metal surfaces are very high in the case of silver, gold and copper. When Raman active molecules are adsorbed on the rough metal substrate surface, their SERS signal increases. The reason for this is the electromagnetic and chemical enhancement that occurs at the highly localized plasmon centers of the hot junctions. Electromagnetism is associated with local surface plasmon resonance associated with rough metal substrates or metal aggregate surfaces. In contrast, chemical enhancement is associated with direct charge transfer or hole-pair excitation processes.

현재 이 분야에서는 믿을만한 SERS 기질로 이용할 수 있는 특정 구조에 대한 연구가 계속되고 있다. 금 및 나노입자들을 원하는 모양 및 형상으로 만들기 위해서, 이온빔 리소그래피, 전자빔 리소그래피, 나노스피어 리소그래피 및 진공 증발에 관심을 두고 있고, 작은 나노입자를 나노클러스터로 모으는 방법이 이용되고 있다. 이 기술들은 재현성 높은 SERS를 가지는 금 및 은 나노입자의 나노클러스터를 만드는 데 이용된다. Currently there is a continuing study of specific structures that can be used as reliable SERS substrates. In order to bring the gold and nanoparticles into the desired shape and shape, attention is drawn to ion beam lithography, electron beam lithography, nanosphere lithography and vacuum evaporation, and methods of gathering small nanoparticles into nanoclusters have been used. These techniques are used to make nanoclusters of gold and silver nanoparticles with highly reproducible SERS.

그러나 이 기술들은 비용이 많이 들고 대량 생산이 어려운 문제점이 있다. 경제적이고 안정적이며 믿을 수 있는 SERS 기질을 만들기 위해서 실리콘 나노와이어 어레이로 은 나노입자를 코팅하거나[Zhang, M. L., C. Q. Yi, et al. 2008 Applied Physics Letters 92(19); 및 Zhang, B. H., H. S. Wang, et al. 2008 Advanced Functional Materials 18(16): 2348-2355], 금 나노입자를 가지는 다공성 알루미늄 막[Ko, H. and V. V. Tsukruk 2008 Small 4(11): 1980-1984.], 할로우 금 나노구체 및 나노쉘과 컨쥬게이션된 항체[Lee, S., H. Chon, et al. 2009, Biosensors & Bioelectronics 24(7): 2260-2263]에 대한 기술이 보고되었다. 그러나 분자 진동의 증강이 높게 일어나서 편재화된 플라스몬 중심의 수가 적어지기 때문에 증강 효과가 효과적으로 일어나지 않는 단점이 있다. However, these technologies are expensive and difficult to mass produce. Coating silver nanoparticles with silicon nanowire arrays to produce an economical, stable and reliable SERS substrate [Zhang, ML, CQ Yi, et al. 2008 Applied Physics Letters 92 (19); And Zhang, BH, HS Wang, et al. 2008 Advanced Functional Materials 18 (16): 2348-2355], porous aluminum membranes with gold nanoparticles [Ko, H. and VV Tsukruk 2008 Small 4 (11): 1980-1984.], Conjugated with hollow gold nanospheres and nanoshells Antibodies [Lee, S., H. Chon, et al. 2009, Biosensors & Bioelectronics 24 (7): 2260-2263. However, there is a disadvantage that the enhancement effect does not occur effectively because the increase in molecular vibration occurs so that the number of localized plasmon centers decreases.

단일분자 수준을 감지하기 위해서는 SERS 신호가 엄청나게 증강되어야 한다. 단일 분자의 SERS 감지를 위해 은 콜로이드성 나노입자 응집체가 처음 사용되었다[Nie, S. M. and S. R. Emery 1997 Science 275(5303): 1102-1106.]. 이후의 연구 결과들을 통해, 은 나노클러스터가 초감도 감지를 위해 가장 적합하다는 것이 알려졌다[Kneipp, J., H. Kneipp, et al. 2006, Nano Letters 6(10): 2225-2231.]. 만약 라만 리포터 분자가 나노클러스터의 접점에 존재한다면, 신호 세기가 엄청나게 증가한다[Chen, J. W., Y. Lei, et al. 2008, Analytical and Bioanalytical Chemistry 392(1-2): 187-193.]. 입자들 사이의 거리, 금속 플라스몬 영역의 고유 특징, 나노입자의 크기와 농도 그리고 레이저 강도는 신호 증강을 조절하는 중요한 파라미터이다. To detect single molecule levels, the SERS signal must be greatly enhanced. Silver colloidal nanoparticle aggregates were first used to detect single molecules of SERS [Nie, SM and SR Emery 1997 Science] 275 (5303): 1102-1106.]. Subsequent studies have shown that silver nanoclusters are best suited for ultrasensitive detection [Kneipp, J., H. Kneipp, et al. 2006, Nano Letters 6 (10): 2225-2231.]. If the Raman reporter molecule is present at the junction of the nanocluster, the signal strength increases tremendously [Chen, JW, Y. Lei, et al. 2008, Analytical and Bioanalytical Chemistry 392 (1-2): 187-193.]. The distance between the particles, the inherent characteristics of the metal plasmon region, the size and concentration of the nanoparticles and the laser intensity are important parameters controlling signal enhancement.

나노클러스터 도입이 필요한 화학 및 생물 환경은 서로 다르고, 이러한 서로 다른 화학 및 생물 환경에서의 나노클러스터의 안정성은 매우 중요하다. 또한, 바이오센싱 및 바이오이미징 도구로 사용하기 위한 클러스터화된 나노프루브에 있어서, 생체호환성 및 세포독성 역시 중요하다[Matschulat, A., D. Drescher, et al. 2010, Acs Nano 4(6): 3259-3269.]. The chemical and biological environments that require the introduction of nanoclusters are different and the stability of the nanoclusters in these different chemical and biological environments is very important. In addition, for clustered nanoprobes for use as biosensing and bioimaging tools, biocompatibility and cytotoxicity are also important [Matschulat, A., D. Drescher, et al. 2010, Acs Nano 4 (6): 3259-3269.].

현재의 바이오센싱 및 바이오이미징용 광학기술은, LOD(Limit of Detection)가 안좋고 광표백(photo bleaching )현상이 있고, 그리고 멀티플렉싱에 제한이 있다. 특히 현광 기반 감지법을 이용할 때, 위에서 언급한 문제점들이 심하게 나타난다[Bally, M., M. Halter, et al. 2006, Surface and Interface Analysis 38(11): 1442-1458.]. 반면에 라만 분산 기반 센싱 시스템의 경우, 위에서 언급한 문제점들이 해결된다면, 더 좋은 안정성과 멀티플렉싱 능력을 가지는 초감도 감지 도구로 유용하게 이용될 수 있다.Current optical sensing and bioimaging optical technologies have poor limit of detection (LOD), photobleaching, and limitations in multiplexing. The above-mentioned problems are particularly acute when using glimmer-based sensing [Bally, M., M. Halter, et al. 2006, Surface and Interface Analysis 38 (11): 1442-1458.]. On the other hand, in the case of Raman distributed-based sensing system, if the above-mentioned problems are solved, it may be useful as an ultra-sensitivity sensing tool having better stability and multiplexing capability.

금속 나노입자들이 응집된 라만 염료를 기반으로 한 새로운 나노프로브를 SERS 센싱 도구로 이용할 수 있다. 이 프로브들은 조직공학 및 단백질 감지에 이용될 수 있다. 이 응집체들의 독특한 특징은 라만 리포터 분자(라만 염료 분자)가 은 나노입자의 접점(junction)에 붙잡혀 있다는 것이다. 리포터 분자들이 추가적 금속 코팅에 의해 겹쳐지기 때문에 이 분자들은 재현성이 높고 강도가 높은 SERS 신호를 발생시킨다. 그러나 이 나노클러스터들은, 염 농도가 증가하거나 엄격한 pH 조건과 같은 서로 다른 화학 환경에서 안정성이 좋지 않은 단점이 있다. 또한 이 클러스터들은 단백질 안정화 현상으로 인해 고온에서 불안정하다. 클러스터들은 상대적으로 큰 나노입자(50-60 nm)들에 염을 추가하여 만든다. 그러나 감도가 그리 좋지 않은 단점이 있다. 할로우 금 나노구체에 컨쥬게이션된 항체를 사용하여, 암마커 바이오이미징을 위한 고감도의 라만 분산 기반 프로토콜이 제시되었다. 정렬된 금속 다이머를 일렉트로스펀 폴리비닐알콜로 둘러싸거나 사이즈가 큰 응집체를 재현가능한 SERS 기질로 사용하는 법이 제시되었다. 그러나 폴리머 서브마이크론 크기의 입자가 세포 표지 및 이미징 도구로 더 유용하게 사용될 수 있다.New nanoprobes based on Raman dyes with aggregated metal nanoparticles can be used as SERS sensing tools. These probes can be used for tissue engineering and protein detection. The unique feature of these aggregates is that the Raman reporter molecule (Raman dye molecule) is held at the junction of the silver nanoparticles. Because reporter molecules are overlaid by additional metal coatings, they generate a highly reproducible and high intensity SERS signal. However, these nanoclusters have the disadvantage of poor stability in different chemical environments, such as increased salt concentrations or stringent pH conditions. These clusters are also unstable at high temperatures due to protein stabilization. Clusters are made by adding salt to relatively large nanoparticles (50-60 nm). However, there is a disadvantage that the sensitivity is not so good. Using antibodies conjugated to hollow gold nanospheres, a highly sensitive Raman dispersion based protocol for cancer marker bioimaging has been presented. It has been suggested to align the aligned metal dimers with electrophosphor polyvinyl alcohol or to use large size aggregates as reproducible SERS substrates. However, polymer submicron sized particles may be more useful for cell labeling and imaging tools.

본 발명의 발명자들은 고감도이고, 물리적? 화학적 안정성이 높고 생체호환성이 있고 경제적이고 대량 생산이 가능하며, 그리고 SERS 신호 조절이 가능한 SERS 기질에 대해 연구를 계속하였다. 그 결과 SERS 기질의 비독성 및 생체호환성을 유지하면서 원하는 SERS 강도를 조절할 수 있는, SERS 기반 바이오하이브리드 나노프로브를 개발하였다.
The inventors of the present invention are highly sensitive and physical? The study continued on SERS substrates with high chemical stability, biocompatibility, economics, mass production, and control of SERS signals. As a result, SERS-based biohybrid nanoprobes have been developed that can control the desired SERS intensity while maintaining the non-toxicity and biocompatibility of the SERS substrate.

Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett . 6, 2225-2231Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett . 6, 2225-2231

Lee, S., H. Chon, et al. 2009, Biosensors & Bioelectronics 24(7): 2260-2263Lee, S., H. Chon, et al. 2009, Biosensors & Bioelectronics 24 (7): 2260-2263

Matschulat, A., D. Drescher, et al. 2010, Acs Nano 4(6): 3259-3269.Matschulat, A., D. Drescher, et al. 2010, Acs Nano 4 (6): 3259-3269.

Bally, M., M. Halter, et al. 2006, Surface and Interface Analysis 38(11): 1442-1458.
Bally, M., M. Halter, et al. 2006, Surface and Interface Analysis 38 (11): 1442-1458.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해, SERS 기반 바이오하이브리드 금속 나노프로브를 발명하였다. The inventors have invented SERS-based biohybrid metal nanoprobes to solve the above problem.

본 발명의 목적은 SERS 이미지 측정용 금속 나노프로브의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.  An object of the present invention is to provide a method for producing a metal nano probe for measuring the SERS image.

본 발명의 다른 목적은 라만 신호 강도 조절이 가능한 금속 나노프로브의 제조방법을 제공하기 위한 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing a metal nano probe capable of controlling the Raman signal strength.

본 발명의 또 다른 목적은 제조방법이 간단하고 경제적이며 대량 생산이 가능한 SERS 기반 금속 나노프로브의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method for producing SERS-based metal nanoprobes, which is simple, economical, and mass-producible.

본 발명은,The present invention,

시드(seed) 금속 나노입자를 준비하고;Preparing seed metal nanoparticles;

상기 시드 금속 나노입자와 라만 염료를 혼합하고 가열 또는 응집하여 상기 시드 금속 나노입자와 라만 염료를 포함하는 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하고;Mixing and heating or agglomerating the seed metal nanoparticles with the Raman dye to form a metal nanocluster including the seed metal nanoparticles and the Raman dye;

상기 금속 나노클러스터를 단백질 또는 제 1친수성 폴리머로 코팅하여 안정화된 금속 나노클러스터를 만들고;Coating the metal nanocluster with a protein or a first hydrophilic polymer to form a stabilized metal nanocluster;

상기 단백질 또는 제 1친수성 폴리머로 코팅된 금속 나노클러스터를 제2폴리머 용액과 혼합하여 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제 2폴리머 현탁액을 제조하고; Mixing a metal nanocluster coated with the protein or first hydrophilic polymer with a second polymer solution to prepare a second polymer suspension comprising the metal nanocluster;

상기 현탁액을 전기수력적 분사법에 의해 분사하여 상기 제 2폴리머로 상기 금속 나노 클러스터를 둘러싸서 캡슐화된 금속 나노클러스터를 형성하고; 그리고Spraying the suspension by electrohydraulic injection to form encapsulated metal nanoclusters surrounded by the metal nanoclusters with the second polymer; And

상기 제2 폴리머로 캡슐화된 금속 나노클러스터를 가열하거나 자외선 처리하여 상기 금속 나노클러스터를 둘러싸는 제2 폴리머 사이에 가교결합 또는 비가교결합을 발생시킴으로써 상기 금속 나노클러스터-제2 폴리머 네크워크를 형성하는; Forming the metal nanocluster-second polymer network by heating or ultraviolet treating the metal nanoclusters encapsulated with the second polymer to generate crosslinks or non-crosslinks between the second polymers surrounding the metal nanoclusters;

단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법을 제공한다.Provided is a method of making a biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement comprising a step.

상기 캡슐화된 금속 나노클러스터를 형성하는 단계 이후에, 상기 캡슐화된 금속 나노클러스터를 둘러싸는 제2 폴리머 껍질 표면에, 항원, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 생물학적 압타머(biological aptamer), 수용체 및 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 바이오콘쥬게이션(bioconjugation)을 통해 화학적으로 가교결합시키는 것을 더 포함할 수 있다.After forming the encapsulated metal nanocluster, an antigen, an antibody, a polynucleotide, an oligonucleotide, a biological aptamer, a receptor and a ligand are formed on the surface of the second polymer shell surrounding the encapsulated metal nanocluster. The method may further include chemically crosslinking a probe selected from the group consisting of bioconjugation.

상기 금속은 은, 금, 구리, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.The metal may be selected from the group consisting of silver, gold, copper, and mixtures thereof.

상기 시드 금속입자는 금속 나노클러스터를 만들기 위한 종자(seed)가 되는 금속입자를 의미한다. The seed metal particles refer to metal particles that become seeds for making the metal nanoclusters.

상기 “금속 나노클러스터”란, 금속 입자들이 모여서 응집된 응집물을 의미하는 용어로서 이 분야에서 일반적으로 사용되는 용어이다.The term “metal nanocluster” is a term generally used in the art as a term meaning an aggregated aggregate of metal particles.

상기 “바이오하이브리드 금속 나노프로브”란 생체에 적용이 가능한 금속 나노프로브를 의미하는 용어로서 이 분야에서 일반적으로 사용되는 용어이다.The "biohybrid metal nanoprobe" is a term used to mean a metal nanoprobe applicable to a living body and is a term generally used in the art.

상기 “라만 염료”는 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 등을 들 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. The "raman dye" means a Raman active organic compound, and any one widely used in the art may be used without limitation. Specific examples include rhodamine 6G, rhodamine B isothiocyanate (RBITC), adenine, 4-amino-pyrazole (3,4-d) pyrimidine, 2-fluoroadenine, N6-benzoyladenine, kinetin , Dimethyl-allyl-amino-adenine, zeatin, bromo-adenine, 8-aza-adenine, 8-azaguanine, 6-mercaptopurine, 4-amino-6-mercaptopyrazolo (3,4 -d) pyrimindine, 8-mercaptoadenine, 9-amino-acridine and the like, but are not necessarily limited thereto.

상기 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하는 단계에서, 상기 금속 나노클러스터는, 서로 다른 라만 염료를 포함하는 복수개의 금속 나노클러스터일 수 있고, 서로 다른 라만 염료를 통해 제조된 각각의 나노클러스터들을 이용해서 멀티플렉싱 검진이 가능하다. In the forming of the metal nanoclusters, the metal nanoclusters may be a plurality of metal nanoclusters including different Raman dyes, and may be formed by using the respective nanoclusters manufactured through different Raman dyes. Multiplexing checks are possible.

상기 금속 나노클러스터를 코팅하는 단백질의 종류에는 제한이 없으며 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 인슐린(insulin), 콩단백질, 카제인, 젤라틴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. There is no restriction on the type of protein coating the metal nanocluster, any one can be used as long as it is widely used in the art. For example, they may be selected from the group consisting of avidin, streptavidin, bovine serum albumin, BSA, insulin, soy protein, casein, gelatin, and mixtures thereof.

상기 금속 나노클러스터를 코팅하는 제 1 친수성 폴리머는 친수성 폴리머라면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리비닐아세테이트(Polyvinylacetate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid), 폴리말레이산 (polymaleic acid), 실리콘옥사이드 (SiO2) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.The first hydrophilic polymer coating the metal nanocluster may be used without limitation as long as it is a hydrophilic polymer. For example, polyvinyl alcohol (polyvinylalcohol), polyvinylpyrrolidone (polyvinylpyrrolidone), polyvinylacetate, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymaleic acid, silicone Oxide (SiO 2) and mixtures thereof, but is not necessarily limited thereto.

상기 시드 금속 나노입자와 라만 염료를 포함하는 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하는 단계에서, 상기 금속 나노클러스터의 크기는 10에서 1000 nm일 수 있으며, 60에서 100 nm가 바람직하다.In forming the metal nanoclusters including the seed metal nanoparticles and the Raman dye, the metal nanoclusters may have a size of 10 to 1000 nm, preferably 60 to 100 nm.

상기 금속 시드 나노입자 각각의 크기가 1에서 100 nm 일 수 있고 25에서 35 nm가 바람직하며, 상기 시드 나노입자 각각의 크기가 1에서 100 nm 이고 상기 나노클러스터 크기가 10 에서 100 nm일 때 라만 신호가 최대가 된다.The size of each of the metal seed nanoparticles may be from 1 to 100 nm, preferably from 25 to 35 nm, and the Raman signal when each of the seed nanoparticles is from 1 to 100 nm in size and the nanocluster size is from 10 to 100 nm. Is the maximum.

상기 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 금속 나노클러스터의 농도는 0.01에서 20 w/v% 일 수 있으며 0.2에서 1.0 w/v%가 바람직하다.In preparing the polymer suspension including the metal nanoclusters, the concentration of the metal nanoclusters may be from 0.01 to 20 w / v%, preferably from 0.2 to 1.0 w / v%.

상기 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제2 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 폴리머의 농도는 0.0001에서 20 w/v%일 수 있으며 3에서 5 w/v%가 바람직하다.In preparing the second polymer suspension including the metal nanoclusters, the concentration of the polymer may be 20 w / v% at 0.0001 and preferably 3 to 5 w / v%.

상기 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제2 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 폴리머는 친수성 폴리머라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산)[Poly(acrylamide-co-acrylicacid)], 폴리(L-아미노산), 폴리(2-메타크릴옥시에틸트리메틸 암모늄 브로마이드[poly(L-amino acids)], poly(2-methacryloxyehtyltrimethyl ammonium bromide)), 폴리스티렌 술포닉 액시드[polystyrenesulfonic acid] 및 폴리스티렌-폴리스티펜-술포닉액시드 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.In preparing the second polymer suspension including the metal nanocluster, any one of hydrophilic polymers may be used without limitation. For example, poly (acrylamide-co-acrylicacid), poly (L-amino acid), poly (2-methacryloxyethyltrimethyl ammonium bromide [poly (L-amino acids) ], poly (2-methacryloxyehtyltrimethyl ammonium bromide)), polystyrenesulfonic acid and polystyrene-polytifen-sulphonic acid copolymer, but are not necessarily limited thereto.

또한, 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제2 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 제2 폴리머는 소수성 폴리머라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 폴리락타이드 (poly(lactide)), 폴리글라이콜라이드 (poly(glycolide)) 및 폴리스티렌 (poly(styrene))를 들 수 있다. In addition, in the preparing of the second polymer suspension including the metal nanocluster, the second polymer may be any hydrophobic polymer, without limitation. Specific examples thereof include poly (lactide), polyglycolide, and polystyrene.

상기 현탁액을 전기수력적 분사법에 의해 분사하여 상기 폴리머로 상기 금속 나노 클러스터를 둘러싸서 캡슐화된 금속 나노클러스터를 형성하는 단계에서, 상기 전기수력적 분사시에 친수성 용매 또는 소수성 용매가 사용될 수 있다. In the step of spraying the suspension by electrohydraulic injection to form encapsulated metal nanoclusters with the polymer to encapsulate the metal nanoclusters, a hydrophilic solvent or a hydrophobic solvent may be used during the electrohydraulic injection.

상기 제2 폴리머로 캡슐화된 금속 나노클러스터를 가열하거나 자외선을 처리하면, 상기 금속 나노클러스터를 둘러싸는 제2폴리머 사이에 가교결합 또는 비가교결합이 발생하여 상기 금속 나노클러스터-제2폴리머 사이에 네트워크가 형성된다. When the metal nanoclusters encapsulated with the second polymer are heated or subjected to ultraviolet rays, crosslinking or non-crosslinking occurs between the second polymers surrounding the metal nanoclusters, thereby forming a network between the metal nanoclusters and the second polymers. Is formed.

만약 상기 제2폴리머가 친수성 폴리머라면, 이 친수성 폴리머의 가교결합을 통한 네트워크를 형성으로 인해 물에 용해되지 않는다. 반면에 상기 제2폴리머가 소수성 폴리머라면 비가교결합에 의해 네트워크를 형성할 수 있다.If the second polymer is a hydrophilic polymer, it does not dissolve in water due to the formation of a network through crosslinking of the hydrophilic polymer. On the other hand, if the second polymer is a hydrophobic polymer, it may form a network by non-crosslinking.

본 발명에 따른 바이오하이브리드 나노프로브는 위와 같은 네트워크 형성이 가능하기 때문에, 상기 캡슐화된 금속 나노클러스터를 둘러싸는 제2 폴리머 껍질 표면에, 항원, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 생물학적 압타머(biological aptamer), 수용체 및 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 바이오콘쥬게이션(bioconjugation)을 통해 화학적으로 가교결합시킬 수 있다.Since the biohybrid nanoprobe according to the present invention can form a network as described above, the antigen, antibody, polynucleotide, oligonucleotide, biological aptamer on the surface of the second polymer shell surrounding the encapsulated metal nanocluster ), A probe selected from the group consisting of a receptor and a ligand can be chemically crosslinked through bioconjugation.

본 발명의 나노프로브는 제조방법이 어렵지 않아서 제조비용도 경제적이다. 원하는 클러스터 사이즈의 은 나노입자 응집체에 유도된 염료(라만 염료), 단백질 초박 코팅(ultrathin coating)에 의한 안정화 그리고 연속적으로 폴리머를 이용한 캡슐화 공정을 거친다. Nanoprobe of the present invention is not difficult to manufacture a manufacturing cost is also economical. The silver nanoparticle aggregates of desired cluster size are subjected to dyes (Raman dyes), stabilization by protein ultrathin coating, and encapsulation with polymers in series.

폴리머는 일 실시예에 따르면, 바이오하이브리드, 비독성 그리고 하이드로겔 폴리머이고, 캡슐화는 전기수력적 분사기술을 이용한다. 이 폴리머는 수용성 환경에서 잘 부풀고 소프트 매트릭스 상태가 되어서 은 나노클러스터를 잘 붙드는 역할을 한다. 전기수력적 분사(electrohydrodynamic jettig, 이하, ‘EHD 분사’)는 다양한 폴리머 내부에 많은 무기 나노입자를 캡슐화하는 데 잘 이용되고 있는 기술이다[Yoshida, M., K. H. Roh, et al. 2009, Advanced Materials 21(48): 4920]. The polymer is, according to one embodiment, a biohybrid, non-toxic and hydrogel polymer, and the encapsulation uses electrohydraulic injection techniques. The polymer swells in a water-soluble environment and becomes a soft matrix, holding the silver nanoclusters well. Electrohydrodynamic jettig ("EHD injection") is a technique that is well used to encapsulate many inorganic nanoparticles inside various polymers [Yoshida, M., K. H. Roh, et al. 2009, Advanced Materials 21 (48): 4920].

EHD 분사 후, 폴리머 껍질은 고온에서 경화되어 수용성 환경(aqueous media)에 놓인 나노프로브를 안정화시킨다. 내부에 라만 활성 중심을 가지는, 열적으로 가교결합(crosslinked)된 폴리머 비드는 바이오센싱 및 바이오이미징에 쓰이는 민감한 SERS 프로브로 이용될 수 있다. After EHD spraying, the polymer shells are cured at high temperatures to stabilize the nanoprobes placed in aqueous media. Thermally crosslinked polymer beads with a Raman active center therein can be used as sensitive SERS probes for biosensing and bioimaging.

본 발명의 일 실시예에서는, 서로 다른 라만 염료를 동시에 테스트하여 신호 안정성을 증명하였다. 본 발명에 따른 SERS 프로브는, 서로 다른 화학 환경 및 175 ℃ 등의 고온에서, 생체호환성 및 비독성 특성과 더불어서 매우 안정적이다. In one embodiment of the present invention, different Raman dyes were tested simultaneously to demonstrate signal stability. SERS probes according to the invention are very stable, with biocompatible and nontoxic properties, in different chemical environments and at high temperatures such as 175 ° C.

본 발명에 따르면, 다양한 생체 분자 모이어티가 폴리머 비드 표면에 나온 자유 관능기를 이용하여 폴리머 표면에 결합될 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 폴리머 비드 안에 들어갈 금속 나노클러스터의 양을 조절하여 SERS 신호 증강을 조절할 수 있다. 앞서 설명한 모든 특징들은 본 발명의 나노르포브들이 바이오센싱 및 바이오이미징 도구로 사용하는 데 유용한 특징이 될 수 있다.
According to the present invention, various biomolecular moieties can be bound to the polymer surface using free functional groups present on the polymer bead surface. In addition, according to the present invention it is possible to control the SERS signal augmentation by adjusting the amount of metal nanoclusters into the polymer beads. All of the features described above can be useful features for use in the nanorephores of the present invention as biosensing and bioimaging tools.

본 발명의 SERS 이미지 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브는 고감도이고, 화학적 안정성이 높으며, SERS 신호 조절이 가능하고, 생체호환성 및 비독성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 프로브는 SERS 기반 바이오이미징용 도구로 사용될 수 있다.
The biohybrid metal nanoprobe for measuring SERS images of the present invention is highly sensitive, has high chemical stability, is capable of controlling SERS signals, and exhibits biocompatibility and nontoxicity. Therefore, the probe of the present invention can be used as a tool for SERS-based bioimaging.

도 1 은 나노클러스터를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 은 시드 입자는 계산된 양의 라만 염료, 실버 니트레이트, 소듐시트레이드 트리베이직 디하이드레이트와 혼합되었고, 95℃ 오븐에서 30-60분 동안 인큐베이션되었다. 그 다음 실온에서 냉각시키고 BSA(bovine serum albumin)로 안정화시켰다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 폴리머 입자 안에 은 나노클러스터를 넣어서 캡슐화하기 위해 사용하는 전기수력학적 분사 장치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 폴리머 입자 표면에 항체를 컨쥬게이션하는 과정과 바이오센싱 시스템을 나타내는 모식도이다.
도 4는 RBITC 기반 은 나노클러스터가 형성되는 동안의 라만 스펙트럼을 측정한 것이다. 소량의 분취액이 표시된 시간 간격을 두고 추출되어 라만 측정에 사용되었다. 라만 신호 강도는 인큐베이션 시간이 60분이 될 때까지 최대로 증가하였고, 그 다음에 더 큰 클러스터들이 침전되기 때문에 라만 신호 강도는 감소하였다.
도 5는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 RBITC 기반 스펙트럼에서 두 개의 주 피크선 형태를 나타낸 것이다. 최대 라만 신호를 가지기 위한 적정 시간은 60분으로 나타났다.
도 6은 클러스터 형성 동안의 UV-Vis 스펙트럼 측정한 것이다. 샘플의 소량의 분취액(각 200μl)을 표시된 시간 간격에 빼내서 1 mM 소듐 시트레이트로 5배 희석하여 스펙트럼 분석에 이용하였다. 서로 다른 파장의 특징적 숄더를 표시하였다. 인셋 그래프는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 더 긴 파장에서 응집 피크가 나타남을 보여준다((a) RBITC 기반 AgNCs, (b) 인큐베이션 시간에 따른 흡광도 비교 곡선 (c) 흡수 곡선 모양).
도 7은 RBITC 기반 은 나노클러스터의 폴리머 입자 내부의 AgNCs의 양 변화에 따른 라만 신호 변화를 나타낸 것이다. AgNCs가 폴리머 용액의 0.2에서 1.0 w/v%로 다양하였다. (b)는 AgNCs 퍼센티지와 라만 강도의 관계를 나타낸 것이다.
도 8은 서로 다른 화학 환경에서의 캡슐화되지 않은 RBITC 기반 AgNCs(a)과 캡슐화된 RBITC 기반 AgNCs(b)의 라만 신호 안정성을 측정하여 비교하였다. 캡슐화되지 않은 RBITC 기반 AgNCs에서 라만 신호는 pH가 증가할 때 증가할 때 감소하였다. 반면에 캡슐화된 AgNCs의 신호는 안정적이었다.
도 9는 서로 다른 화학 환경에서의 캡슐화되지 않은 RBITC 기반 AgNCs(a)과 캡슐화된 RBITC 기반AgNCs(b)의 라만 신호 안정성을 측정하여 비교하였다. 캡슐화되지 않은 RBITC 기반 AgNCs에서 라만 신호는 NaCl 농도가 증가할 때 감소하였다. 반면에 캡슐화된 AgNCs의 신호는 안정적이었다.
도 10은 무작위로 선택된 14개 스팟에서 측정된 라만 신호를 나타낸 것이다. 그래프는 SERS 신호의 재현성을 측정하기 위해 서로 다른 스팟에서 주 라만 피크의 신호 강도의 변화를 보여준다.
도 11은 서로 다른 배율에서 AgNCs를 캡슐화한 폴리머 입자의 SEM 이미지를 나타낸다. (a) 6.07 KX (b) 10 KX (c) 15KX. (d) AgNCs를 캡슐화한 폴리머 나노입자의 크기 분포도. 각 컬럼은 X-축의 지시값과 동일하거나 작은 크기의 입자 퍼센트를 나타낸다. 입자의 평균 직경은 456 nm이다.
도 12 는 단일 은 나노입자(AgNPs)와 AgNCs의 동력학적 선 분산 결과이다.
도13은 (a) 단일 은 나노입자, (b) RBITC 기반 AgNCs (c) 확대된 단일 은 나노 클러스터의 TEM 이미지이다. (d) 및 (e) 는 은의 존재를 확인하기 위한 AgNCs의 EDS 스펙트럼이다.
도 14 는 AgNCs를 캡슐화한 폴리머 입자의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지이다. (a)는 형광 염료인 RITC-덱스트란을 가지는 드라이 이미지이고 (b) 팽창 이미지이다.
도 15는 증류수에 분산된 폴리머 입자의 공초점 레이저 현미경 이미지이다. FITC-BSA 와 컨쥬게이션되지 않은 것(a-c)과 컨쥬게이션 된 것(d-f)이다.
도 16 (a)는 세포 표면에 부착된 폴리머 입자 내부에 캡슐화된 AgNCs를 나타내고 (b)는 세포의 서로 다른 스팟에서의 라만 신호를 나타낸 것이다.
도 17 은 RBITC 기반 AgNCs를 캡슐화한 폴리머 입자의 TEM 현미경 사진이다. AgNCs의 폴리머 용액의 농도를 (a)는 0.1 w/v%, (b)는 0.2w/v%, (c)는 0.6 w/v% 그리고 (d)는 1.0 w/v %으로 사용해서 제조한 것이다.
도 18 (a)는 본 발명에 따른 폴리머로 캡슐화된 나노클러스터가 표지된 SKBR3 세포의 명시야상 이미지(Bright field image)이고, (b)는 QD-표지 SKBR3 세포의 형광 이미지이고, (c)는 나노클러스터를 이용한 SKBR3 세포의 SERS 맵핑 이미지이다. 라만 이미지는 1645cm^-1에서 가장 강한 RBITC의 라만 피크를 이용하여 측정하였다. 그리고 (d)는 (c)에서 가리키는 화살표 위치의 라만 스펙트라에 대응하는, 나노클러스터가 표지된 SKBR3 세포의 3차원 라만 프로필을 나타낸 것이다.
도 19는 비교예의 soak-in 방법을 나타낸 것이다.
도 20은 비교예의 build-in 방법을 나타낸 것이다.
도 21은 비교예의 soak-in 방법에 의해 준비된 폴리머 입자 속 은 나노클러스터의 TEM 이미지이다.
도 22는 비교예의 build-in 방법에 의해 준비된 폴리머 입자 속 은 나노클러스터의 TEM 이미지이다.
도 23은 EHD 분사, soak-in 방법 및 build-in 방법에 의한 캡슐화를 통해 제조된 나노클러스터의 라만 평균 세기를 비교하여 나타낸 것이다.
도 24는 도 23에 제시된 soak-in 방법에 의해 제조된 나노클러스터의 확장된 라만 세기를 나타낸 것이다.
도 25는 도 23에 제시된 build-in 방법에 의해 제조된 나노클러스터의 확장된 라만 세기를 나타낸 것이다.
도 26의 (a)는 soak-in 방법에 의해 제조된 나노클러스터의 SERS 재현성을 확인하기 위해 12개의 랜덤 스팟에서 취한 SERS 스펙트럼이고, (b)는 RBITC에서 1650 cm^{- 1} 의 라만 세기를 나타낸 것이다.
도 26의 (a)는 build-in 방법에 의해 제조된 나노클러스터의 SERS 재현성을 확인하기 위해 12개의 랜덤 스팟에서 취한 SERS 스펙트럼이고, (b)는 RBITC에서 1650 cm^{- 1} 의 라만 세기를 나타낸 것이다.1 schematically shows a process of manufacturing a nanocluster. Silver seed particles were mixed with a calculated amount of Raman dye, silver nitrate, sodium citrate tribasic dihydrate and incubated in a 95 ° C. oven for 30-60 minutes. It was then cooled to room temperature and stabilized with bovine serum albumin (BSA).
Figure 2 is a schematic diagram showing an electro-hydraulic injection device used to encapsulate the silver nanoclusters in the polymer particles, according to an embodiment of the present invention.
3 is a schematic diagram illustrating a process of conjugating an antibody to a surface of a polymer particle and a biosensing system.
Figure 4 measures the Raman spectrum during the formation of RBITC-based silver nanoclusters. Small aliquots were extracted at the indicated time intervals and used for Raman measurements. Raman signal strength increased maximum until the incubation time was 60 minutes, and then Raman signal strength decreased as larger clusters precipitated.
5 shows two main peakline shapes in the RBITC based spectrum as incubation time increases. The optimal time to get the maximum Raman signal was 60 minutes.
6 is a UV-Vis spectral measurement during cluster formation. A small aliquot of the sample (200 μl each) was withdrawn at the indicated time intervals and diluted 5 times with 1 mM sodium citrate for use in spectral analysis. Characteristic shoulders of different wavelengths are indicated. Inset graphs show aggregation peaks at longer wavelengths with increasing incubation time ((a) RBITC based AgNCs, (b) absorbance comparison curves with incubation time (c) absorption curve shape).
Figure 7 shows the Raman signal change according to the amount of AgNCs in the polymer particles of the RBITC-based silver nanoclusters. AgNCs varied from 0.2 to 1.0 w / v% of the polymer solution. (b) shows the relationship between AgNCs percentage and Raman intensity.
FIG. 8 compares the measurement of Raman signal stability of unencapsulated RBITC based AgNCs (a) and encapsulated RBITC based AgNCs (b) in different chemical environments. In unencapsulated RBITC-based AgNCs, Raman signal decreased with increasing pH. On the other hand, the signal of encapsulated AgNCs was stable.
FIG. 9 compares by measuring Raman signal stability of unencapsulated RBITC based AgNCs (a) and encapsulated RBITC based AgNCs (b) in different chemical environments. Raman signals in unencapsulated RBITC-based AgNCs decreased with increasing NaCl concentrations. On the other hand, the signal of encapsulated AgNCs was stable.
10 shows Raman signals measured at 14 randomly selected spots. The graph shows the change in signal intensity of the main Raman peak at different spots to measure the reproducibility of the SERS signal.
11 shows SEM images of polymer particles encapsulating AgNCs at different magnifications. (a) 6.07 KX (b) 10 KX (c) 15KX. (d) Size distribution of polymer nanoparticles encapsulating AgNCs. Each column represents a percentage of particles of the same or smaller size than the indication on the X-axis. The average diameter of the particles is 456 nm.
FIG. 12 shows the kinetic linear dispersion results of single silver nanoparticles (AgNPs) and AgNCs.
Figure 13 is a TEM image of (a) single silver nanoparticles, (b) RBITC based AgNCs and (c) enlarged single silver nano clusters. (d) and (e) are EDS spectra of AgNCs to confirm the presence of silver.
14 is a confocal laser scanning microscope image of polymer particles encapsulating AgNCs. (a) is a dry image with the fluorescent dye RITC-dextran and (b) an expanded image.
15 is a confocal laser microscope image of polymer particles dispersed in distilled water. Unconjugated (ac) and conjugated (df) with FITC-BSA.
Figure 16 (a) shows AgNCs encapsulated inside polymer particles attached to the cell surface and (b) shows Raman signals at different spots of cells.
17 is a TEM micrograph of polymer particles encapsulating RBITC based AgNCs. The concentration of the polymer solution of AgNCs was prepared using (a) at 0.1 w / v%, (b) at 0.2 w / v%, (c) at 0.6 w / v% and (d) at 1.0 w / v%. It is.
Figure 18 (a) is a bright field image of SKBR3 cells labeled with a nanoencapsule labeled with a polymer according to the invention, (b) is a fluorescence image of QD-labeled SKBR3 cells, (c) SERS mapping image of SKBR3 cells using nanoclusters. Raman images were measured using the Raman peak of the strongest RBITC at 1645 cm ⁻¹ . And (d) shows a three-dimensional Raman profile of SKBR3 cells labeled with a nanocluster, corresponding to Raman spectra at the arrow position indicated in (c).
Figure 19 shows a soak-in method of the comparative example.
20 shows a build-in method of a comparative example.
21 is a TEM image of silver nanoclusters in polymer particles prepared by the soak-in method of Comparative Example.
22 is a TEM image of silver nanoclusters in polymer particles prepared by the build-in method of Comparative Example.
FIG. 23 shows the Raman average intensities of nanoclusters prepared through encapsulation by EHD injection, soak-in method and build-in method.
FIG. 24 shows the expanded Raman intensity of the nanoclusters produced by the soak-in method shown in FIG. 23.
FIG. 25 shows the expanded Raman intensity of the nanoclusters produced by the build-in method shown in FIG. 23.
(A) of FIG. 26 is a SERS spectra taken at 12 random spot, (b) is 1650 cm in RBITC to determine the SERS reproducibility of nanoclusters prepared by the soak-in method ^- shows the Raman intensity of the ¹ .
Figure 26 (a) is the SERS spectrum taken in 12 random spots to confirm the SERS reproducibility of the nanocluster produced by the build-in method, (b) shows the Raman intensity of 1650 cm ^{- 1} in RBITC .

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
Hereinafter, preferred examples are provided to aid the understanding of the present invention, but the following examples are merely illustrative of the present invention, and various changes and modifications can be made within the scope and spirit of the present invention. It is obvious to the skilled person, and it is natural that such variations and modifications fall within the scope of the appended claims.

본 발명에서 AFP(alpha-fetoprotein) 및 ANG(angiogenin)를 샘플 단백질로 사용하였다. AFP는 간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)에서 종양(tumor) 활성은 표시자(indicator)로 잘 알려져 있다(Riaz, A. et al., Clin . Oncl., 2009, 27, 5734-5742). ANG는 종양 성장의 혈관신생(angiogenesis)에 관여하는 14 kDa 의 단백질이다(Srisa-Art, M. et al., Chem . Bio . Chem., 2009, 10, 1605-1611).
In the present invention, AFP (alpha-fetoprotein) and ANG (angiogenin) were used as sample proteins. AFP is well known as an indicator of tumor activity in hepatocellular carcinoma (HCC) (Riaz, A. et al., Clin . Oncl ., 2009, 27, 5734-5742). ANG is a 14 kDa protein involved in angiogenesis of tumor growth (Srisa-Art, M. et al., Chem . Bio . Chem ., 2009, 10, 1605-1611).

실시예Example 1: 재료 및 방법 1: materials and methods

1-1: 재료1-1: Material

실버 니트레이트(99.999%), 소듐 보로하이드라이드(98.0%), 소듐 시트레이트 트리베이직 디하이드레이트(≥99.0 %); BSA (≥96%, 아가로스 겔 전기영동); 로다민(rhodamine) 6G, (R6G 염료 함량 ~95%); 로다민 B 이소티오시아네이트 (RBITC) 컨쥬게이티드 덱스트란(RBITC-덱스트란, MW 70 kDa); 로다민 B 이소티오시아네이트 (RBITC 혼합 아이소머); 에틸렌글리콜 무수물 및 소듐 하이드록사이드(≥98%)는 Sigma Aldrich(USA)에서 구입하였다. Poly(acrylamide-co-acrylicacid, sodium salts, 이하 ‘P(AAm-co AA’) (MW 200 kDa; 10% 아크릴산) 는 Polysciences, Inc에서 구입하였다. 모든 시약은 제조사에서 받은 그대로 사용하였다.
Silver nitrate (99.999%), sodium borohydride (98.0%), sodium citrate tribasic dihydrate (≧ 99.0%); BSA (≧ 96%, agarose gel electrophoresis); Rhodamine 6G, (R6G dye content ˜95%); Rhodamine B isothiocyanate (RBITC) conjugated dextran (RBITC-dextran, MW 70 kDa); Rhodamine B isothiocyanate (RBITC mixed isomer); Ethylene glycol anhydride and sodium hydroxide (≧ 98%) were purchased from Sigma Aldrich (USA). Poly (acrylamide-co-acrylicacid, sodium salts, hereinafter 'P (AAm-co AA') (MW 200 kDa; 10% acrylic acid) was purchased from Polysciences, Inc. All reagents were used as received from the manufacturer.

1-2: 은 시드(1-2: silver seed ( seedseed ) 입자 준비Particle preparation

각각 0.5 M의 실버 니트레이트 수용액, 소듐 보로하이드라이드 및 소듐 시트레이트 트리베이직 다이하이드레이트가 증류수에 준비되었고, 두 시간 내에 사용되었다. 은 시드 입자를 준비하기 위해, 두 개의 용액을 두 개의 삼각플라스크에 따로 준비하였다. 용액 A는 50 ml의 증류수에 4 mM의 실버 니트레이트를 포함하였다. 용액 B는 50 ml의 증류수에 0.6 mM 소듐 보로하이드라이드, 8 mM 소듐 시트레이트, 그리고 2 mM 소듐 하이드록사이드를 포함하였다. 두 용액을 5분 동안 교반시켜서 농도를 균질화시켰다. 그 다음, 강한 교반 하에서 용액 B는 용액 A에 첨가되었다. 이 반응은 어둠 조건에서 10 시간 동안 수행하였다. 은 콜로이드 입자는 0.2μm PTFE 소수성 시린지 필터를 통해 여과되었고 은 막대 또는 큰 사이즈 입자는 제거되었다. 이러한 방법으로 준비된 은 시드는 직경이 6 에서 13 nm이었다. 이 입자들을 어둠 조건, 8-10℃에서 저장하였다.
0.5 M aqueous silver nitrate aqueous solution, sodium borohydride and sodium citrate tribasic dihydrate were prepared in distilled water and used within two hours. To prepare silver seed particles, two solutions were prepared separately in two Erlenmeyer flasks. Solution A contained 4 mM silver nitrate in 50 ml of distilled water. Solution B contained 0.6 mM sodium borohydride, 8 mM sodium citrate, and 2 mM sodium hydroxide in 50 ml of distilled water. Both solutions were stirred for 5 minutes to homogenize the concentration. Then solution B was added to solution A under vigorous stirring. This reaction was carried out for 10 hours in dark conditions. Silver colloidal particles were filtered through a 0.2 μm PTFE hydrophobic syringe filter and silver rods or large sized particles were removed. Silver seeds prepared in this manner ranged in diameter from 6 to 13 nm. These particles were stored at 8-10 ° C. under dark conditions.

1-3: 은 나노클러스터 (1-3: Silver Nanoclusters ( AgNCsAgNCs ) 형성) formation

RBITC(또는 R6G)를 가진 은 나노클러스터(Ag Nanoclusters, 이하 ‘AgNCs’)를 합성하기 위해 25 ml의 은 시드 입자를 글래스 바이얼에 넣고 0.01 M R6G(또는 RBITC) 수용액 25 μl, AgNO₃ 저장 용액 50 μl 그리고 소듐 시트레이트 저장 용액 25 μl와 혼합하였다. 혼합물은 그 다음 전체적으로 5분 동안 교반하였고 표시된 시간 동안 95℃오븐에 두었다. 클러스터 크기와 최대 라만 강도를 최적화하기 위해, 샘플의 작은 분취액(각각 250 μl )이 규칙적 시간 간격으로 추출되어 SERS 신호 분석 검사에 사용되었다. 또한 같은 샘플을 1 mM 소듐 시트레이트 수용액으로 희석시킨 후에 UV-Vis 흡수 스펙트럼 검사를 하였다. 상기 라만 강도가 최대에 도달했을 때 상기 반응은 중단된다. 상기 혼합물은 실온으로 빠르게 냉각되었고 0.5% BSA 수용액 120 μl을 첨가하여 AgNCs를 안정화시켰다. 상기 현탁액은 0.2μm PTFE 소수성 시린지 필터를 통해 여과되었고 실온에서 저장하였다. 상기 과정은 RBITC 기반 AgNCs를 준비하는 데 똑같이 사용되었다. 그러나 클러스터를 형성하는 동안 RBITC의 농도는, R6G의 10 μM와 달리, 7.5 μM로 유지되었다.
To synthesize Ag Nanoclusters with RBITC (or R6G), 25 ml of silver seed particles were placed in a glass vial and 25 μl of 0.01 M R6G (or RBITC) aqueous solution, AgNO ₃ stock solution. 50 μl and 25 μl sodium citrate stock solution. The mixture was then stirred for 5 minutes throughout and placed in a 95 ° C. oven for the indicated time. To optimize cluster size and maximum Raman intensity, small aliquots of the samples (250 μl each) were extracted at regular time intervals and used for SERS signal analysis testing. The same sample was also diluted with 1 mM aqueous sodium citrate solution and then subjected to UV-Vis absorption spectroscopy. The reaction is stopped when the Raman intensity reaches maximum. The mixture was cooled quickly to room temperature and the AgNCs were stabilized by the addition of 120 μl of 0.5% BSA aqueous solution. The suspension was filtered through a 0.2 μm PTFE hydrophobic syringe filter and stored at room temperature. The procedure was used equally to prepare RBITC based AgNCs. However, the concentration of RBITC was maintained at 7.5 μM during cluster formation, unlike 10 μM of R6G.

1-4: 1-4: 폴리머Polymer 입자 내에 은 나노클러스터 캡슐화 Encapsulating Silver Nanoclusters in Particles

상기 제조방법으로 얻어진 AgNCs는 Eppendorf 원심분리기(centrifuge 5424)를 이용하여 10분 동안 5000 rpm에서 원심분리하였고, 1 mM 소듐시트레이트 용액으로 세 번 세척하여 과다한 BSA와 다른 반응물을 제거하였다. 이 AgNCs는 1 mM 소듐 시트레이트 용액에서 재현탁되었다. 물에 준비된 4 w/v%의 P(AAm-co-AA) 용액과 에틸렌 글라이콜이 2:1의 v/v 비율로 혼합되었다. 상기 용액에 서로 다른 양의 AgNCs가 현탁되었다. 그 다음 균일하게 분산된 현탁액을 26 게이지 및 3.5인치 길이의 모세혈관을 가지는 1ml 시린지(Becton-Dickinson, New Jersey, US)에 넣었다. 양극 단자가 알루미늄 호일(Fisherbrand, US)의 수집 기질(the collecting substrate )에 부착되는 반면, 고전압 공급장치(NNC HV 30) 의 음극 단자가 모세관에 부착되었다. 두 전극 사이의 거리는 20-25 cm 이다. 전압은 13 에서 16 kV 로 다양하고, 유속은 0.05 에서 0.08 ml/hr 로 유지되었다. 모든 분사 작업은 실온 조건(ambient conditions)에서 수행되었다. 고체 상태에서 라만과 공초점 레이저 스캐닝 현미경 사진 특성을 알아내기 위해 작은 커버 글래스를 알루미늄 호일 위에 올려 두었다. 폴리머 사슬의 열에 의한 가교결합(thermal crosslinking)을 확실히 하기 위해, 수집 기질은 1750℃에서 5-6 시간 동안 인큐베이션되었다. 열에 의한 가교결합 후, 상기 입자들을 호일에서 긁어 내어 증류수에 분산시켰다. 이 입자들은 팁 소니케이터(VC 505, vibra-cell)를 이용하여 45초 동안 소니케이션하였다. 그 다음 이 입자들은 라만 신호 측정에 사용되었다. 서로 다른 양의 AgCNs을 폴리머 용액에 넣고 이에 대응하는 SERS 효과를 검사하였다.
AgNCs obtained by the above method were centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes using an Eppendorf centrifuge (centrifuge 5424) and washed three times with 1 mM sodium citrate solution to remove excess BSA and other reactants. These AgNCs were resuspended in 1 mM sodium citrate solution. 4 w / v% P (AAm-co-AA) solution prepared in water and ethylene glycol were mixed at a 2: 1 v / v ratio. Different amounts of AgNCs were suspended in the solution. The homogeneously dispersed suspension was then placed in a 1 ml syringe (Becton-Dickinson, New Jersey, US) with 26 gauge and 3.5 inch long capillaries. The positive terminal was attached to the collecting substrate of aluminum foil (Fisherbrand, US), while the negative terminal of the high voltage supply (NNC HV 30) was attached to the capillary. The distance between the two electrodes is 20-25 cm. The voltage varied from 13 to 16 kV and the flow rate was maintained at 0.05 to 0.08 ml / hr. All spraying operations were performed at ambient conditions. A small cover glass was placed on aluminum foil to characterize Raman and confocal laser scanning micrographs in the solid state. To ensure thermal crosslinking of the polymer chains, the collecting substrate was incubated at 1750 ° C. for 5-6 hours. After thermal crosslinking, the particles were scraped off the foil and dispersed in distilled water. These particles were sonicated for 45 seconds using a tip sonicator (VC 505, vibra-cell). These particles were then used to measure Raman signals. Different amounts of AgCNs were placed in the polymer solution and the corresponding SERS effect was examined.

1-5: 1-5: UVUV - - VisVis 및 라만 측정 And Raman measurements

모든 자외선-가시광선(UV-Vis) 흡수 측정은, 실온에서 미디엄 스캔 속도를 나타내는 싱글 스캔 모드에서, 1 mm의 고정된 슬릿 너비를 가지는 UV-1800 (Shimadzu, Japan)를 이용하여, 300에서 850 nm의 범위에서 이루어졌다. 스펙트럼에서 각각의 최대값들이 표지되었다. 라만 측정은 레인쇼 200 라만 현미경 통합시스템을 이용하여 이루어졌다. 10 mW의 레이저 출력을 가지는 여기원으로서 λ=633 nm 의 He-Ne 레이저를 사용하였다. 수집된 라만 스펙트럼에서 레일리 라인(Rayleigh lines)을 제거하기 위해 홀로그래픽 노치 필터를 사용하였다. 20X 대물렌즈가 샘플이 포함된 모세관 내부의 레이저에 포커스를 맞추기 위해 사용되었다. 열에 의한 가교결합 전의 라만 측정은 커버 글래스 표면에 직접적으로 분사된 고체 상태에서 이루어졌다.
All UV-Vis absorption measurements were measured at 300 to 850 using UV-1800 (Shimadzu, Japan) with a fixed slit width of 1 mm in single scan mode showing medium scan rate at room temperature. in the range of nm. Each maximum value in the spectrum is labeled. Raman measurements were made using the Rainshow 200 Raman Microscope Integrated System. As an excitation source having a laser power of 10 mW, a He-Ne laser of λ = 633 nm was used. Holographic notch filters were used to remove Rayleigh lines from the collected Raman spectra. A 20 × objective was used to focus the laser inside the capillary containing the sample. Raman measurements before thermal crosslinking were made in the solid state sprayed directly onto the cover glass surface.

1-6: 1-6: SEMSEM 및  And TEMTEM 이미징Imaging

전자현미경 이미지를 스캔하기 위해 EHD 분사 동안 알루미늄 호일 기질의 표면에 스테인레스 스틸 시트의 작은 조각들을 올려 놓았다. 그 다음 이 입자들은 백금으로 코팅되었고 0.5에서 30 kV의 가속 전력에서 가동되는 TESCAN SEM VEGA를 이용하여 이미지를 찍었다. 6.07kX, 10kX 및 15kX의 서로 다른 배율에서 이미지를 찍었다. 단일 은 나노입자의 TEM 이미징을 위해, 준비된 은 콜로이드를 0.2μm(Dismic 13Jp, ADVANTEC) 디스포저블 PTFE 소수성 시린지 필터로 여과하였고 5번 희석하였다. TEM 그리드는 글래스 슬라이드 표면에 올려두고, TEM 그리드의 카본 코팅된 표면에 6μl 방울을 떨어뜨렸다. 빠른 증발을 위해 소량의 에탄올이 첨가되었다. AgNCs와 유사하게, 0.2 μm 필터로 여과한 준비된 200 μl의 AgNCs를 증류수로 4번 세척하였다. 200μl의 에탄올이 상기 현탁액에 첨가되었다. 5μl의 분취량을 카본 코팅된 TEM 그리드에 올렸다. 그 다음 이 샘플들의 이미지는, 가속 전압 80에서 200 kV에서 작동되는 JEM-2100F(FEG) FE-STEM(Field emission scanning transmission electron microscope)를 이용하여 촬영하였다. 은 나노입자의EDS 스펙트럼은 상기 FE-STEM을 이용하여 수집하였다.
Small pieces of stainless steel sheets were placed on the surface of the aluminum foil substrate during the EHD spray to scan the electron microscope images. The particles were then coated with platinum and imaged using a TESCAN SEM VEGA running at an acceleration power of 0.5 to 30 kV. Images were taken at different magnifications of 6.07kX, 10kX and 15kX. For TEM imaging of single silver nanoparticles, the prepared silver colloid was filtered with a 0.2 μm (Dismic 13Jp, ADVANTEC) disposable PTFE hydrophobic syringe filter and diluted five times. The TEM grid was placed on the glass slide surface and 6 μl drops were dropped on the carbon coated surface of the TEM grid. A small amount of ethanol was added for rapid evaporation. Similar to AgNCs, 200 μl of prepared AgNCs filtered with a 0.2 μm filter were washed four times with distilled water. 200 μl of ethanol was added to the suspension. An aliquot of 5 μl was placed on a carbon coated TEM grid. Images of these samples were then taken using a JEM-2100F (FEG) FE-STEM (Field emission scanning transmission electron microscope) operated at 200 kV at an acceleration voltage of 80. EDS spectra of silver nanoparticles were collected using the FE-STEM.

1-7: 1-7: 폴리머Polymer 입자 표면에  Particle surface FITCFITC -- BSABSA 컨쥬게이션Conjugation

폴리머 나노입자(P-AgNCs) 는 알루미늄 호일에서 벗겨내고 열에 의한 가교결합 후 무게를 재었다. 0.744 x10^-5 몰의 카르복시기와 동등한 0.0053 g의 폴리머 입자는, 증류수 10 ml에 현탁되었고, VCX 500 팁 소니케이터를 이용하여 60초 동안 울트라소니케이션 되었다. 카르복시기의 것보다 몰 농도가 10배 이상인 과다량의 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide-hydrochloride) 0.0142 g이 울트라소니케이션된 입자 현탁액에 첨가되었다. 그 다음 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 활성 입자들을 1분 동안 5000 rpm에서 반복하여 원심분리하여 정제하고 신선한 증류수에 재현탁하였다. 이 입자들을 5번 세척하여 반응하지 않은 EDC를 제거하였다. 그 다음 FITC-BSA(Flourescein isothiocyanate conjugated bovine serum albumin) 0.0050 g을 첨가하여 폴리머 입자의 표면을 개질하였다. 이 혼합물을 밤새 교반하고 원심분리를 이용한 세척을 반복하여 정제하였다.
Polymer nanoparticles (P-AgNCs) were stripped from aluminum foil and weighed after thermal crosslinking. 0.0053 g of polymer particles, equivalent to 0.744 × 10 ⁻⁵ moles of carboxyl group, were suspended in 10 ml of distilled water and ultrasonicated for 60 seconds using a VCX 500 tip sonicator. An excess of 0.0142 g of EDC (1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide-hydrochloride) with a molar concentration of at least 10 times that of the carboxyl group was added to the ultrasonicated particle suspension. The mixture was then stirred at rt overnight. The active particles were purified by repeated centrifugation at 5000 rpm for 1 minute and resuspended in fresh distilled water. The particles were washed five times to remove unreacted EDC. Then, the surface of the polymer particles was modified by adding 0.0050 g of FITC-BSA (Flourescein isothiocyanate conjugated bovine serum albumin). The mixture was stirred overnight and purified by repeated washing with centrifugation.

1-8: 1-8: 나노프로브에On the nanoprobe 항- term- ErbB2ErbB2 컨쥬게이션Conjugation

폴리머 나노입자 (P-AgNCs) 12.5 mg를 팁 소니케이터를 이용하여 30% 진폭에서 1분 동안 5초의 온/오프 간력으로 PBS 버퍼 2.0 ml로 소니케이션하였다. 그 다음 균일하게 분산된 입자를 0.0030 g의 EDC와 PBS 버퍼에 용해된 sulfo-NHS와 혼합하였다. 항체 항-ErbB2(0,5 mg/ μl)를 100 μl의 PBS 버퍼로 희석하였고, 버블이 형성되지 않도록 입자들을 부드럽게 저어주면서, 최종 농도가 2.0 nM이 될 때까지 분산된 입자들을 한 방울 한 방울 떨어뜨렸다. 3 시간 동안 저어 준 후에, 항체와 컨쥬게이션된 입자들을 3000 rpm에서 원심분리하였고 PBS 버퍼로 3 분 동안 세척하였다. 최종적으로 이 입자들을 PBS 버퍼에서 재현탁하였다.
12.5 mg of polymer nanoparticles (P-AgNCs) were sonicated with 2.0 ml of PBS buffer at 5% on / off for 1 minute at 30% amplitude using a tip sonicator. The homogeneously dispersed particles were then mixed with 0.0030 g of EDC and sulfo-NHS dissolved in PBS buffer. The antibody anti-ErbB2 (0,5 mg / μl) was diluted with 100 μl of PBS buffer, gently stirring the particles to prevent bubbles from forming, dropping the dispersed particles drop by drop until the final concentration was 2.0 nM. Dropped. After stirring for 3 hours, the conjugated particles with the antibody were centrifuged at 3000 rpm and washed with PBS buffer for 3 minutes. Finally these particles were resuspended in PBS buffer.

1-9: 세포 준비1-9: Cell Preparation

본 발명에 따른 폴리머로 캡슐화된 나노클러스터의 SERS 이미징 능력을 테스트하기 위한 라만 이미징 타겟으로 ErbB2-과발현 SKBR3를 사용하였다. SKBR3 세포를 커버 글래스에 접종하고 데옥시사이클린(deoxycycline) 없이 배양하였다. 2일 후, 이 세포들을 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분 동안 고정하였다. PBS 버퍼 용액으로 세척한 후, 이 세포들을 실온에서 항-ErbB2가 컨쥬게이션된 나노클러스터와 함께 인큐베이션하였다.
ErbB2-overexpressing SKBR3 was used as a Raman imaging target for testing the SERS imaging ability of the polymer encapsulated nanoclusters according to the invention. SKBR3 cells were inoculated in cover glass and incubated without deoxycycline. After 2 days, these cells were fixed for 15 minutes with 3.7% paraformaldehyde. After washing with PBS buffer solution, the cells were incubated with the anti-ErbB2 conjugated nanoclusters at room temperature.

1-10: 라만 측정1-10: Raman measurement

라만 측정은 레인쇼(Reinshow) 2000 현미경 시스템을 가지고 수행하였다. 10 mW의 레이저 출력을 가지는 여기원으로서 λ=633 nm 의 He-Ne 오퍼레이팅을 사용하였다. 모든 라만 스펙트라는 10초 노출 시간으로 얻어졌다. 콜렉션 패스(collection path)에서 홀로그래필 엣지 필터를 사용하여 수집된 라만 분산으로부터 레일리 선을 제거하였다. CCD(charge-coupled device) 카메라가 스펙트로그래프에 연결되어, 이 조합은 2 cm^-1 스펙트럼 해상도를 제공한다. 50× 대물렌즈와 각 픽셀당 1초의 노출 시간을 가지는 라만 포인트-맵핑업을 사용하여 라만 이미지를 얻었다. 컴퓨터로 조절되는 x-y 번역 단계는 40 μm × 40 μm 영역(총 16,000 픽셀)을 가지는 0.3 μm (x-축) 및 0.3 μm (y-축) 사이의 거리에서 스캔되었다. 세포의 라만 이미지는 1645 cm-1 라만 피크 세기에서 해독되었다.
Raman measurements were performed with a Reinshow 2000 microscope system. He-Ne operating of λ = 633 nm was used as an excitation source having a laser power of 10 mW. All Raman spectra were obtained with a 10 second exposure time. Rayleigh lines were removed from the Raman variances collected using a holographic fill edge filter in the collection path. A charge-coupled device (CCD) camera is connected to the spectrograph, which combination provides 2 cm ^-1 spectral resolution. Raman images were obtained using a Raman point-mapping up with a 50 × objective and an exposure time of 1 second per pixel. The computer controlled xy translation step was scanned at a distance between 0.3 μm (x-axis) and 0.3 μm (y-axis) with a 40 μm × 40 μm region (16,000 pixels total). Raman images of the cells were read at 1645 cm −1 Raman peak intensity.

1-11: 1-11: 공초점Confocal 레이저 스캐닝 현미경 Laser scanning microscope

폴리머 입자의 이미지는 100X 대물렌스(오일 침투 렌즈)를 가지는 Leica TCS SP2 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 촬영하였다. 현탁된 입자들의 분취액 소량을 커버 글래스 위에 두고 팽창 특성을 검사하였다.
Images of polymer particles were taken using a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope with a 100 × objective (oil penetrating lens). An aliquot of the suspended particles was placed on the cover glass and the expansion properties were examined.

실시예Example 2:  2: 폴리머로With polymer 둘러 싸여Surrounded 캡슐화된 은 나노클러스터 제작 Encapsulated Silver Nanocluster Fabrication

도 1은 고감도 바이오센싱 및 바이오이미징에 사용하기 위한 SERS 바이오하이브리드 나노프로브의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것으로, 은 나노입자가 응집하여 은 나노클러스터(AgNCs)를 형성하는 과정을 보여준다. 본 발명에서는 크기가 10 에서 15 nm인 작은 크기의 은 시드 입자를 가지고 시작하였다. 이 은 시드 입자에 서로 다른 라만 염료를 도입하여 응집이 일어났고, 상승된 온도에서 소듐 시트레이트 트리애딕 디하이드레이트에 의해 은 전구체가 환원되기 때문에, 은 시드 입자가 동시에 성장하였다. 이 나노클러스터들은 그 다음 BSA (Albumin from bovine serum)에 의해 안정화되었다. 최종 클러스터 크기는 60에서 100 nm로 조절되었다. FIG. 1 schematically shows a method of preparing SERS biohybrid nanoprobes for use in high sensitivity biosensing and bioimaging, showing the process of aggregation of silver nanoparticles to form silver nanoclusters (AgNCs). In the present invention, we started with small size silver seed particles having a size of 10 to 15 nm. Aggregation occurred by introducing different Raman dyes into the silver seed particles, and the silver seed particles grew simultaneously because the silver precursor was reduced by sodium citrate triadic dihydrate at an elevated temperature. These nanoclusters were then stabilized by Albumin from bovine serum (BSA). Final cluster size was adjusted from 60 to 100 nm.

도 2는 AgNCs를 폴리머 내부에 넣고 캡슐하여 폴리머 서브마이크론 크기의 입자의 제작하는 데 사용되는EHD 분사도구를 나타낸 것이다. AgNCs는 친수성, 생체호환성 그리고 비독성인 폴리머, 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산)( Poly(acrylamide-co-acrylicacid: 이하, ‘P(AAm-co-AA)’)에 단일 분산되었고 금속 모세관이 부착된 플라스틱 시린지에 투입되었다. 시린지 펌프는 폴리머와 AgNCs의 현탁액을 모세관을 통해 분사하기 위해 사용되었다. 고전압 전력 공급 장치의 음극은 금속 모세관에 연결되고, 양극은 수집 기질로 작용하는 양극 단자에 연결되었다. 인셋(inset)은 EHD 분사 동안 테일러 콘(taylor cone), 제트 스트림 개시(jet stream initiation) 및 제트 브레이크업(jet stream initiation)을 보여준다.
FIG. 2 shows an EHD jetting tool used to fabricate polymer submicron-sized particles by encapsulating AgNCs inside a polymer. AgNCs are monodisperse in hydrophilic, biocompatible and non-toxic polymers, poly (acrylamide-co-acrylicacid) (hereinafter referred to as 'P (AAm-co-AA)') and adhere to metal capillaries The syringe pump was used to inject a suspension of polymer and AgNCs through the capillary, the cathode of the high voltage power supply being connected to the metal capillary, and the anode to the anode terminal acting as a collecting substrate. The inset shows the taylor cone, jet stream initiation and jet stream initiation during the EHD injection.

실시예Example 3:  3: 폴리머Polymer 입자의 표면에  On the surface of the particles FITCFITC -- BSABSA 부착 Attach

도 3은 FITC-BSA(flourescein isothiocyanate modified BSA) 또는 다양한 항체들이 폴리머 입자 표면에 개질되는 것을 개략적으로 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 나노프로브의 바이오하이브리드 특성을 증명하기 위해, 폴리머 입자 표면의 비가교결합된 카르복시가 FITC-BSA 또는 항체 부착에 이용되었다. 도 3을 통해, 본 발명에 따른 SERS 나노프로브를 이용하면 복수 개의 마커를 감지할 수 있으므로 멀티플렉싱 검사가 가능함을 알 수 있다.
FIG. 3 schematically illustrates the modification of floorscein isothiocyanate modified BSA (FITC-BSA) or various antibodies to the polymer particle surface. In order to demonstrate the biohybrid properties of the nanoprobes according to the invention, uncrosslinked carboxy on the surface of the polymer particles was used for FITC-BSA or antibody attachment. 3, it can be seen that the multiplexing test is possible because the SERS nanoprobe according to the present invention can detect a plurality of markers.

실시예Example 4: 라만 신호가 최대가 되는  4: Raman signal becomes maximum AgNCsAgNCs 크기 및 라만 염료 농도 최적화  Size and Raman Dye Concentration Optimization

도 4는 AgNCs를 준비하는 동안 측정된 라만 신호를 나타낸다. 기기에 표시된 시간 간격을 두고 샘플로부터 소량의 분취액을 취해, 글래스 모세관에 넣고 Reinshaw 2000 현미경 통합시스템의 633 nm 파장에서 여기되는 He-Ne 레이저 빔 하에 두었다. 레이저 스팟을 20X 대물렌즈에서 가시광선을 사용하여 모세관 내부에 초점을 맞추었다. 좌측 및 우측 그래프는 R6G 라만 염료를 가지는 AgNCs의 라만 신호가 인큐베이션 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 나타낸다. 이 신호는 60분 후에 최대값에 도달하고 그 다음 60에서 90분에서 감소하였다. 인큐베이션 시간이 길어진 후의 신호는 무시하였다. 겹쳐진 그래프선(overlaying plots)은 AgNCs에 흡착된 RBITC의 특징적 라만 피크를 보여주었다. 4 shows Raman signals measured during the preparation of AgNCs. Small aliquots were taken from the samples at the time intervals indicated on the instrument, placed in glass capillaries and placed under a He-Ne laser beam excited at 633 nm wavelength of the Reinshaw 2000 microscope integrated system. The laser spot was focused inside the capillary using visible light in a 20X objective. The left and right graphs show that the Raman signal of AgNCs with R6G Raman dye increases with incubation time. This signal reached its maximum after 60 minutes and then decreased from 60 to 90 minutes. Signals after longer incubation times were ignored. Overlaying plots showed characteristic Raman peaks of RBITC adsorbed on AgNCs.

도 5는 인큐베이션 시간에 따른 RBITC 기반 스펙트럼의 두 개의 주요 라만 피크의 강도를 나타낸 것이다. 피크 위치는 구별하기 위해 표시하였다. 인큐베이션 시간이 길어질수록 수집된 스펙트럼들은, 더 짧은 인큐베이션 시간에서 수집된 스펙트럼 상의 같은 위치에 정확하게 겹쳐졌다. 입자가 심한 응집이 일어나지 않고 특정 사이즈(60에서 100 nm 클러스터 사이즈)로 성장한 후에 라만 신호가 최대가 되도록 라만 염료의 농도가 조절되었다. 60분 후에 최대 라만 신호를 가지는 특정 클러스터 사이즈를 얻기 위해서, RBITC 농도는 7.5 μM 로 조절되었다. 10 μM 및 15 μM 과 같은 더 높은 농도인 경우, 짧은 시간에 각 입자의 성장이 없는 과도한 응집이 유발되어 라만 신호가 낮게 나타난다. 오리지널 은 시드 입자는 시트레이트 이온에 의해 안정화되는데, 시트레이트 이온이 입자 표면의 음이온을 캡핑하여 입자들 사이의 반데르발스 힘을 감소시켜서, 응집 없이 긴 시간 동안 콜로이드가 안정될 수 있게 해준다. 라만 염료가 은 콜로이드와 혼합되면 염료 분자가 나노입자 표면에 흡착되고 이들 사이의 반발력이 감소하면서 동시에 흡착이 일어나고, 계속해서 은은 먼저 존재하던 입자 표면에 증착되어 입자 사이즈가 성장한다. 온도가 950C로 조절되기 때문에 은 입자는, TEM 이미지에서 증명된 것과 같이, 접점(junctions)에서 부분적으로 융합되고 염료 분자를 사로잡는다. 이러한 독특한 구조는, 염료 분자가 이 접점들의 플라스몬 영역 표면에 고도로 편재화되기 때문에 높은 라만 신호를 발생시킨다. 작은 개개의 은 나노입자들은 매우 낮은 라만 신호를 나타내지만, 개개의 은 나노입자가 성장하여 클러스터 사이즈가 되면 라만 신호가 증가한다. 인큐베이션이 시작되고 1 시간이 지난 후 응집 사이즈는 매우 커지고 빠르게 안정화되기 때문에 라만 신호가 낮아진다. 일련의 실험을 통해, 개개의 입자 크기가 25에서 35 nm이고 클러스터 사이즈가 60에서 100 nm일 때 라만 신호가 최대가 됨을 알 수 있다. 이 조건은 최적화되어서 이후의 실시예에 이용되었다.
FIG. 5 shows the intensity of two major Raman peaks of the RBITC based spectrum over incubation time. Peak positions are indicated for differentiation. As the incubation time was longer, the collected spectra were superimposed exactly at the same location on the spectrum collected at the shorter incubation time. Raman dye concentrations were adjusted to maximize the Raman signal after the particles grew to a certain size (60 to 100 nm cluster size) without severe aggregation. To get a specific cluster size with the maximum Raman signal after 60 minutes, the RBITC concentration was adjusted to 7.5 μM. Higher concentrations, such as 10 μM and 15 μM, result in excessive aggregation without growth of each particle in a short time resulting in low Raman signals. The original silver seed particles are stabilized by citrate ions, which cuffate the anions on the particle surface to reduce van der Waals forces between the particles, allowing the colloid to stabilize for a long time without aggregation. When the Raman dye is mixed with the silver colloid, the dye molecules are adsorbed on the surface of the nanoparticles, the repulsion between them decreases and at the same time adsorption occurs, and silver is subsequently deposited on the surface of the previously existing particles to grow the particle size. Since the temperature is controlled at 950 C, the silver particles partially fuse at the junctions and capture the dye molecules, as demonstrated in the TEM image. This unique structure generates high Raman signals because dye molecules are highly localized on the surface of the plasmon region of these contacts. Small individual silver nanoparticles show very low Raman signals, but as individual silver nanoparticles grow to cluster size, the Raman signal increases. One hour after incubation begins, the Raman signal is low because the coagulation size is very large and stabilizes quickly. A series of experiments shows that the Raman signal is maximal when the individual particle size is 25 to 35 nm and the cluster size is 60 to 100 nm. This condition was optimized and used in later examples.

실시예Example 5:  5: AgNCsAgNCs 가 형성되는 동안의  During the formation of UVUV -- VisVis 흡수 스펙트럼 분석 Absorption Spectrum Analysis

도 6은 AgNCs 가 형성되는 동안 수집된 UV-Vis 흡수 스펙트럼이다. 6- 13 nm 사이즈의 작은 개개의 나노입자는 400 nm에서 강한 흡수 피크를 나타낸다. (a)는 RBITC 를 가지는 AgNCs의 서로 다른 인큐베이션 시간에서 수집된 일련의 스펙트럼을 나타낸다. 주 흡수 피크는 인큐베이션 시간이 길어질수록 더 긴 파장으로 이동하는데, 이는 각각의 입자 크기가 커지기 때문이다. 즉 입자의 응축이 일어남을 알 수 있다. 주 흡수 피크는 60 분 후에 410 nm에서 429 nm로 이동하고, 반면 50분의 인큐베이션 시간에서 입자 응집을 나타내는 649 nm의 긴 파장에서 다른 추가 피크가 있다. 525 nm에서의 다른 피크는 RBITC 때문이다. (b)는 주 흡수 곡선이 이동하는 것을 보여준다. 전체적인 경향은, 60분 후에 주 흡수 피크가 410에서 429 nm로 이동한다. (C)는 더 긴 파장에서의 흡수 곡선의 모양이다.  6 is a UV-Vis absorption spectrum collected while AgNCs are formed. Small individual nanoparticles of size 6-13 nm exhibit strong absorption peaks at 400 nm. (a) shows a series of spectra collected at different incubation times of AgNCs with RBITC. The main absorption peak shifts to longer wavelengths as the incubation time is longer because each particle size is larger. That is, it can be seen that condensation of particles occurs. The main absorption peak shifts from 410 nm to 429 nm after 60 minutes, while there are other additional peaks at long wavelengths of 649 nm, indicating particle aggregation at 50 minutes of incubation time. Another peak at 525 nm is due to RBITC. (b) shows that the main absorption curve shifts. The overall trend is that after 60 minutes the main absorption peak shifts from 410 to 429 nm. (C) is the shape of the absorption curve at longer wavelengths.

입자 크기 증가율은 인큐베이션 시간이 증가할수록 감소하는데, 이는 시간이 길어질수록 환원에 쓸 수 있는 은 이온이 감소하기 때문이다. 혼합물의 혼탁도가 증가하고 더 긴 파장에서 피크가 나타나고 최대 라만 신호가 나타나는 것은 최적화된 반응 시간을 나타내는 것이다.
The increase in particle size decreases with increasing incubation time, because the longer the time, the less silver ions available for reduction. Increasing turbidity of the mixture, peaks at longer wavelengths, and maximum Raman signals indicate an optimized reaction time.

실시예Example 6:  6: 폴리머Polymer 입자의 열에 의한  Due to the heat of the particles 가교결합Crosslinking 전과 후의 라만 스펙트럼 측정 Raman spectrum measurements before and after

열에 의한 폴리머의 가교결합은 이 폴리머들이 수용액에서 분해되는 것을 막아 준다. 열에 의한 가교결합 동안, 관능기(아마이드 및 카르복시기)는 방수성 특징을 가지면서 폴리머 사이에서 화학 결합을 형성하고 그들의 형태학적 특징은 아래 반응식 1과 같이 유지된다.
Thermal crosslinking of the polymer prevents the polymer from degrading in aqueous solution. During thermal crosslinking, the functional groups (amides and carboxyl groups) have waterproof properties and form chemical bonds between the polymers and their morphological characteristics are maintained as in Scheme 1 below.

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

AgNCs가 폴리머 입자 내로 캡슐화되어 들어가고 폴리머 껍질은 가교결합이 이루어진다. 반응이 일어난 후의 입자들은 증류수에서 재현탁되었고 라만 신호를 측정하였다. 라만 신호는 안정적이었고 열에 의한 가교결합 전후에 고유한 특성을 그대로 유지하였다. 가교결합된 입자들은, 고온 때문에 비가교결합 입자들보다 조금 낮은 신호를 낼 수도 있다. 그러나 신호가 충분히 높기 때문에 폴리머 내에 들어가는 AgNCs의 양을 조절하여 강한 신호를 만들어 낼 수 있다(도 7 (a) 및 (b)). R6G와 RBITC의 고유한 신호와 비교하기 위해, 피크에 표지를 달았다.
AgNCs are encapsulated into the polymer particles and the polymer shell is crosslinked. After the reaction the particles were resuspended in distilled water and the Raman signal was measured. Raman signals were stable and retained their inherent properties before and after thermal crosslinking. Crosslinked particles may signal slightly lower than uncrosslinked particles due to high temperatures. However, because the signal is high enough, the amount of AgNCs entering the polymer can be controlled to produce a strong signal (Figs. 7 (a) and (b)). Peaks were labeled to compare with the inherent signals of R6G and RBITC.

실시예Example 7:  7: 폴리머Polymer 입자 내부의  Inside the particles AgNCsAgNCs 의 양 변화에 따른 라만 신호 변화Raman Signal Variation with Different Amount

도 7은 폴리머 입자 크기, 염료 농도, 클러스터 크기 및 개별 입자 크기 변수를 고정하고 AgNCs 양에만 변화를 줬을 때의 라만 신호 변화를 나타낸 것이다. RBITC 기반의 라만 활성 AgNCs의 양을 서로 달리하여 원심분리하고, 이를 소량의 시트레이트 이온을 함유한 수용성 폴리머 용액에 재현탁하여 AgNCs를 분산시켰다. 원심분리된 AgCNs에 해당하는 양을 진공 상태에서 얼리고 정량분석을 위해 무게를 측정하였다. AgNCs의 농도는 폴리머 용액의 0.2 에서 1.0 %w/v로 다양하였다(a). 라만 신호는 AgNCs가 증가함에 따라 선형으로 증가하였다(b).
FIG. 7 shows Raman signal changes when polymer particle size, dye concentration, cluster size and individual particle size variables were fixed and only the AgNCs amount changed. The amounts of RBITC-based Raman-activated AgNCs were centrifuged at different concentrations and resuspended in a water-soluble polymer solution containing a small amount of citrate ions to disperse the AgNCs. The amount corresponding to centrifuged AgCNs was frozen in vacuo and weighed for quantitative analysis. The concentration of AgNCs varied from 0.2 to 1.0% w / v of the polymer solution (a). Raman signal increased linearly with increasing AgNCs (b).

이 결과를 통해 본 발명의 제조방법에 따르면, 폴리머 용액 내의 AgNCs의 양을 조절하여 간단하게 SERS 신호를 조절할 수 있음을 알 수 있다. 생체호환성, 친수성 폴리머는, 민감한 생물학적 화학적 환경에서 비독성과 생체호환성을 유지하면서, AgNCs 캡슐화에 적용할 수 있다. 전기수력학적 분사를 이용한 AgNCs의 폴리머 캡슐화는, 이멀젼 폴리머화 방법과 같은 기존의 방법과 비교하였을 때, 상대적으로 단순하고 대량 생산이 가능하고 경제적이며 여러 종류의 SERS 나노브프로브를 생산할 수 있는 장점이 있다. 폴리머 입자 크기는 전압, 폴리머의 중량%, 그리고 폴리머 용액의 점도 등을 조절하여 쉽게 조정할 수 있다. Through this result, according to the manufacturing method of the present invention, it can be seen that the SERS signal can be easily adjusted by adjusting the amount of AgNCs in the polymer solution. Biocompatible, hydrophilic polymers can be applied to AgNCs encapsulation while maintaining nontoxicity and biocompatibility in sensitive biological and chemical environments. The polymer encapsulation of AgNCs using electrohydrodynamic spraying has the advantages of being relatively simple, mass-producible, economical and capable of producing several types of SERS nano probes when compared to conventional methods such as emulsion polymerization. There is this. The polymer particle size can be easily adjusted by adjusting the voltage, the weight percent of the polymer, and the viscosity of the polymer solution.

본 발명에 따르면, 폴리머 입자 내에 포함되는 AgNCs의 양을 달리하여 원하는 라만 신호를 쉽게 조절할 수 있다. 또한 폴리머 캡슐화는 금속과 생물학적 모이어티가 바로 접촉하는 것을 막아주고 추가 기능화가 가능한 표면을 제공해 준다. 폴리머 입자 표면의 비가교결합된 카르복시기는 후속 개질 과정에 쉽게 이용될 수 있다.
According to the present invention, the desired Raman signal can be easily adjusted by varying the amount of AgNCs contained in the polymer particles. Polymer encapsulation also prevents direct contact between metal and biological moieties and provides a surface for further functionalization. Uncrosslinked carboxyl groups on the surface of the polymer particles can be readily used in subsequent modification processes.

실시예Example 8: 캡슐화된  8: encapsulated AgNCsAgNCs 와 Wow 캡슐화 되지Not encapsulated 않은  Not AgNCsAgNCs 비교 compare

본 발명에 따른 캡슐화된 AgNCs와 캡슐화 되지 않은 AgNCs와 를 비교하였다. 도 8은 RBITC 기반 AgNCs의 pH 값에 따른 라만 신호 강도를 나타낸 것이다. pH는 NaOH (1.0M) 및 HCl (0.5M)을 이용하여 1.5 에서 11.0 까지 다양한 값을 만들었다. NeoMet (pH-200L) pH/temp 미터를 이용하여 25℃에서 pH 값을 측정하였다. 도 8의 결과로부터, pH는 AgNCs 라만 강도에 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있다. 폴리머 캡슐을 씌우기 전의 라만 활성 AgNCs의 라만 강도는 pH가 증가함에 따라 큰 폭으로 감소하는데(a), 아마도 단일 은 나노입자가 큰 클러스터에 응집되어 빠르게 안정화되기 때문일 것이다. 반면, 폴리머 입자에 캡슐화된 이후에는 매우 안정적이었다(b). The encapsulated AgNCs according to the present invention were compared with the non-encapsulated AgNCs. Figure 8 shows the Raman signal strength according to the pH value of RBITC-based AgNCs. The pH was varied from 1.5 to 11.0 using NaOH (1.0M) and HCl (0.5M). The pH value was measured at 25 ° C. using a NeoMet (pH-200L) pH / temp meter. From the results in FIG. 8, it can be seen that pH has a great influence on the AgNCs Raman intensity. Raman strength of Raman-activated AgNCs prior to polymer encapsulation decreases significantly with increasing pH (a), probably because single silver nanoparticles aggregate into large clusters and stabilize quickly. On the other hand, it was very stable after encapsulation in polymer particles (b).

본 발명에 따른 나노프로브는 화학적으로 가교결합(또는 비가교결합)된 폴리머 네트워크에 의해 보호되기 때문에 외부의 화학적 환경이 나노프로브의 고유의 성질에 영향을 끼치지 않는다. 따라서 이러한 캡슐화된 AgNCs를 가지는 SERS 나노프로브는 캡슐화되지 않은 나노프로브보다 더 유용하게 이용될 수 있다.Since the nanoprobes according to the invention are protected by chemically crosslinked (or noncrosslinked) polymer networks, the external chemical environment does not affect the inherent properties of the nanoprobes. Therefore, SERS nanoprobes with these encapsulated AgNCs may be more useful than unencapsulated nanoprobes.

두 타입-폴리머 캡슐을 씌우기 않은 것과 씌운 것-의 AgNCs에 이온 세기가 미치는 영향에 대해서도 조사하였다(도 9). NaCl 1.0M 수용액이 클로라이드 이온(Cl^-)을 도입하기 위해 사용되었다. 라만 신호는 클로라이드 이온이 증가함에 따라 감소하였다. 캡슐화되지 않은 AgNCs 의 라만 신호는 NaCl의 양이 증가함에 따라 큰 폭으로 감소하였다. 그러나 캘슐화된 AgNCs 는 염의 양이 많아도 안정적이었다(도 9 (b)).
The effect of ionic strength on AgNCs of both types-with and without polymer encapsulation-was also investigated (Figure 9). An aqueous NaCl 1.0M solution was used to introduce chloride ions (Cl ⁻ ). Raman signal decreased with increasing chloride ion. The Raman signal of unencapsulated AgNCs decreased significantly as the amount of NaCl increased. However, encapsulated AgNCs were stable even at high salt levels (FIG. 9 (b)).

실시예Example 9:  9: SERSSERS 신호의 재현성  Reproducibility of the signal

SERS 신호의 재현성은 정량 분석에서 매우 중요한 문제이다. 도 10은 캡슐화된 AgCNs 샘플의 서로 다른 스팟에서의 라만 신호를 나타낸 것이다. 주 피크의 강도는 참고용으로 그려두었다. 이 신호는 평균값으로부터 작은 편차를 가지면서 재현성이 높다. 스팟들은 무작위로 선택되었고 해당 라만 신호를 측정하였다. 총 14개의 스팟을 조사하여 SERS 신호의 재현성을 확인하였다.
Reproducibility of the SERS signal is an important issue in quantitative analysis. 10 shows Raman signals at different spots of encapsulated AgCNs samples. The intensity of the main peak is plotted for reference. This signal is highly reproducible with a small deviation from the mean value. Spots were randomly selected and the corresponding Raman signal measured. A total of 14 spots were examined to confirm the reproducibility of the SERS signal.

실시예Example 10:  10: AgNCsAgNCs 를 둘러싸는 Surrounding 폴리머Polymer 입자의  Particle SEMSEM 이미지 image

도 11은 (a) 6.07KX, (b) 10.0 KX 및 (c) 15.0 KX에서 AgNCs를 캡슐화하는 폴리머 입자의 SEM 이미지이다. 이 입자들은 30분 동안 스테인레스 스틸 기질에 직접 분사되었다. 샘플들은 백금으로 코팅되었고 그 다음 TESCAN VEGA-SEM을 이용하여 입자 크기 및 크기 분포를 측정하였다. 도 11(d)는 입자들의 크기 분포 정도를 보여주는 것이다. 각각의 컬럼은 각 컬럼의 x-축이 나타내는 값보다 작거나 동일한 직경을 가지는 입자의 퍼센트를 나타낸 것이다. 입자들에 가해지는 무작위 충격 때문에 전자스프레이 기술을 이용하면 다양한 사이즈의 입자가 생산되고, 그래서 크기 분포를 조절하기 어렵다. 그러나 평균 크기는 여전히 특정 파라미터를 조절하여 조절될 수 있다. 작은 입자일수록 세포 표지 및 이미징에 유용하므로, 본 발명에서는 평균 직경을 456 nm 정도로 조절하였다. 평균 크기는 폴리머 농도를 낮게 하거나 점도를 낮게 하거나 전압을 높이거나 전극 사이의 거리를 멀게 하여 쉽게 감소시킬 수 있다. 실험에서는 아래 표 1과 같이, 75/25 v/v% 비율의 물/에틸렌글라이콜 무수물 혼합물에 5 wt/v % 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산) 용액을 사용하였다.
FIG. 11 is an SEM image of polymer particles encapsulating AgNCs at (a) 6.07 KX, (b) 10.0 KX and (c) 15.0 KX. These particles were sprayed directly onto the stainless steel substrate for 30 minutes. Samples were coated with platinum and then particle size and size distribution were measured using TESCAN VEGA-SEM. Figure 11 (d) shows the degree of size distribution of the particles. Each column represents the percentage of particles having a diameter less than or equal to the value represented by the x-axis of each column. Because of the random impact on the particles, the use of electronic spray technology produces particles of various sizes, which makes it difficult to control the size distribution. However, the average size can still be adjusted by adjusting certain parameters. Since smaller particles are useful for cell labeling and imaging, the average diameter was adjusted to about 456 nm in the present invention. The average size can be easily reduced by lowering the polymer concentration, lowering the viscosity, increasing the voltage or increasing the distance between the electrodes. In the experiment, a 5 wt / v% poly (acrylamide-co-acrylic acid) solution was used in a water / ethylene glycol anhydride mixture at a ratio of 75/25 v / v% as shown in Table 1 below.

[표 1][Table 1]

폴리머 농도를 높이면 폴리머 입자의 평균 크기를 증가시킬 수 있다. 폴리머 입자 증가를 위해서, 상기 폴리머 농도 및 점도는 가장 중요한 파라미터이다.
Increasing the polymer concentration can increase the average size of the polymer particles. For polymer particle increase, the polymer concentration and viscosity are the most important parameters.

실시예Example 11:  11: AgNCsAgNCs 의 크기 및 크기 분포 측정The size and size distribution

은 콜로이드(AgNPs)와 은 나노클러스터(AgNCs)의 벌크 특성을 조사하였다. 이를 위해 TEM을 가지고 동적 광 산란을 이용하여 은 콜로이드와 은 나노클러스터의 크기 및 크기 분포를 측정하였다. 이 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 것과 같이 97.0% 이상의 은 시드 입자가 5.6에서 13.6 nm이었다. 이 데이터는 TEM 이미지로부터 확인하였다. AgNCs의 평균 크기는 70.46 nm이었다. 작은 은 나노입자에 대한 추가 피크가 있는데 이는 어쩔 수 없이 반응 혼합물에 존재하는 것이다. 매우 큰 클러스터는 0.2 μm 필터를 이용하여 제거하였다. 염료 농도, 염료의 흡착 성질 및 인큐베이션 시간이 클러스터 형성에 중요한 요인이다. 30분 동안 1500 rpm의 낮은 속도의 원심분리를 이용하여 일정 범위 선까지의 단일 은 나노입자들을 제거할 수 있다.
The bulk characteristics of silver colloids (AgNPs) and silver nanoclusters (AgNCs) were investigated. For this purpose, the size and size distribution of silver colloid and silver nanocluster were measured using dynamic light scattering with TEM. This result is shown in FIG. As shown in FIG. 12, at least 97.0% of the silver seed particles were 5.6 to 13.6 nm. This data was confirmed from the TEM image. The average size of AgNCs was 70.46 nm. There is an additional peak for small silver nanoparticles, which is inevitably present in the reaction mixture. Very large clusters were removed using a 0.2 μm filter. Dye concentration, adsorption properties of dyes and incubation time are important factors for cluster formation. Low speed centrifugation at 1500 rpm for 30 minutes can be used to remove single silver nanoparticles up to a range line.

실시예Example 12: 단일 은 나노입자와  12: with single silver nanoparticles AgNCsAgNCs 의 크기 및 형태 확인Size and shape

투과전자현미경(TEM)을 이용하여 단일 은 나노입자와 AgNCs의 크기 및 형태를 확인하였다. 도 13은, 은 콜로이드와 클러스터의 TEM 이미지를 보여준다. 도 12(a)에 나타난 것과 같이, 단일 나노입자 크기는 6에서 13 nm이다. 인큐베이션 시간 60분 후의 클러스터 크기는 60에서 100 nm이다. 인큐베이션 시간이 증가할수록, 원래 존재하는 은 입자 표면에 추가적으로 은 입자가 증착되기 때문에 개개의 입자 크기는 커진다. 동시에 염료 흡착은 응집을 일으키는 입자들 사이의 반발력을 감소시킨다. 은 콜로이드의 제타 포텐셜은 염료 첨가 후에 적당하게 감소되었다. 동시에 나노입자들 사이의 틈에 염료 분자들이 잡히면서 그들의 접점 (junction)에서 은 나노입자들의 부분적 융합이 일어난다. 은 나노입자의 접점들은 플라스몬 영역 표면에 고도로 편재화되어 있어서 SERS 신호 증가을 위한 잠재적 핫스팟(hotspot)이다. 응집 공정에서 유도된 염료는 은 나노입자들의 접점에서 많은 수의 분자로 존재할 가능성이 있고, 이는 연속적인 은 나노입자의 증착 및 융합에 의해 붙잡힌다. 사이즈가 매우 큰 클러스터는 안정적인 SERS 신호로는 유용하지 않은데, 그 이유는 사이즈가 큰 클러스터는 쉽게 안정화되기 때문이다. 인큐베이션 시간과 염료 농도를 조절하여 원하는 클러스터 사이즈(60 에서 100 nm)를 얻었는데, 각각의 염료는 자신만의 응집 효과가 있기 때문이다.
Transmission electron microscopy (TEM) was used to determine the size and shape of single silver nanoparticles and AgNCs. 13 shows TEM images of silver colloids and clusters. As shown in Figure 12 (a), the single nanoparticle size is 6 to 13 nm. The cluster size after 60 minutes of incubation time is 60 to 100 nm. As the incubation time increases, the individual particle size increases because additional silver particles are deposited on the original silver particle surface. At the same time, dye adsorption reduces the repulsive force between particles causing aggregation. Zeta potential of silver colloids was moderately reduced after dye addition. At the same time, partial fusion of silver nanoparticles occurs at their junctions as the dye molecules are trapped in the gaps between the nanoparticles. The contacts of the silver nanoparticles are highly localized on the surface of the plasmon region, which is a potential hotspot for increased SERS signals. The dye derived from the aggregation process is likely to exist as a large number of molecules at the junction of the silver nanoparticles, which are captured by the deposition and fusion of the continuous silver nanoparticles. Very large clusters are not useful as stable SERS signals because large clusters are easily stabilized. Incubation time and dye concentration were adjusted to obtain the desired cluster size (60 to 100 nm), since each dye had its own aggregation effect.

실시예Example 13:  13: AgNCsAgNCs 를 캡슐화한 Encapsulated 폴리머Polymer 입자의  Particle 공초점Confocal 레이저 스캐닝 현미경 사진 Laser scanning micrograph

도 14는 고체 및 현탁액 상태에서 AgNCs를 캡슐화한 폴리머 입자의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 사진을 나타낸 것이다. 로다민 B 이소티오시아네이트 덱스트란(Rhodamine B isothiocyanate dextran; RBITC)이 0.5 w/v%까지 폴리머 용액에 도입되었다. 염료와 컨쥬게이션된 덱스트란은 증류수 내 폴리머 재현탁 동안 염료를 방출하지 않고 폴리머 입자의 열적 이미드화(thermal imidization )시 화학적으로 가교결합된다. EHD 분사 동안 알루미늄 호일 위에 커버 글래스가 놓인다. 도 14 (a)는 커버 글래스에서 직접 촬영한 은 나노입자를 캡슐화한 폴리머 입자를 나타낸 것이다. 이 입자들은 그 다음 증류수에서 가교결합되고 재현탁되었다. 응집되고 융합된 입자를 제거하기 위해 팁 소니케이터를 이용하여 입자들을 50초 동안 울트라소니케이션 한 후에, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지 촬영을 위해 현탁 단계의 샘플을 준비하였다. 도 14(b)는 현탁된 입자의 이미지를 나타낸 것이다. 이 폴리머는 10.0 mol% 까지의 아크릴산을 함유하고 있는데, 이 폴리머가 유용한 하이드로겔을 형성하게 한다. 이 하이드로겔 입자들은 수용성 미디어에서 쉽게 부풀고 소프트한 구형을 형성한다. 이 입자들의 하이드로겔 특징은 생물학적 도구로 사용하기에 매우 적합하다.
FIG. 14 shows a confocal laser scanning micrograph of polymer particles encapsulating AgNCs in solid and suspension state. Rhodamine B isothiocyanate dextran (RBITC) was introduced into the polymer solution up to 0.5 w / v%. Dextran conjugated with the dye chemically crosslinks upon thermal imidization of the polymer particles without releasing the dye during polymer resuspension in distilled water. The cover glass is placed on the aluminum foil during the EHD spray. 14 (a) shows polymer particles encapsulating silver nanoparticles taken directly from the cover glass. These particles were then crosslinked and resuspended in distilled water. After ultrasonication of the particles for 50 seconds using a tip sonicator to remove aggregated and fused particles, a sample of the suspension step was prepared for confocal laser scanning microscopy imaging. 14 (b) shows an image of suspended particles. The polymer contains up to 10.0 mol% of acrylic acid, which causes the polymer to form useful hydrogels. These hydrogel particles easily swell and form soft spheres in aqueous media. The hydrogel character of these particles is well suited for use as a biological tool.

실시예Example 14:  14: FITCFITC -- BSABSA 컨쥬게이션Conjugation 확인 Confirm

본 발명에 따른 SERS 프로브는 바이오하이브리드 성질이 있다. 폴리머 입자 표면의 비가교 카르복시기를 FITC-BSA(Flourescein isothiocyanate conjugated bovine serum albumin)에 컨쥬게이션하여, 이 프로브들이 세포 이미징 및 센싱을 위한 다수의 생물학적 모이어티에 쉽게 결합될 수 있다는 것을 보여주었다. 폴리머 입자는 가교결합 후 알루미늄 호일에서 벗겨내어 무게를 측정하였다. EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 양을 계산하여 소니케이션 된 폴리머 입자 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물은 실온에서 밤새 교반하였다. EDC는 아민에 카르복시기를 연결시키기 위해 사용하는, 제로 길이의 가교결합제이다. EDC는 자유 카르복시기와 결합하여 아마노반응이 일어나게 한다. FITC-BSA는 단백질 표지에 이용되었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 사진은, 컨쥬게이션 후의 폴리머 입자 표면에 단백질이 존재하는 것을 증명하였다. 도 15 (a)-(c)는 폴리머 입자 표면에서 FITC-BSA 컨쥬게이션 전의 공초점 이미지를 나타낸다. RITC-덱스트란 채널에서 오직 붉은색만 나타나고, FITC 채널에서는 색깔이 관찰되지 않는다. 도 15 (d)-(f)는 컨쥬게이션 후의 결과를 보여준다. 또한 RBITC 채널의 붉은색이 보이고, FITC 채널에서 많은 수의 녹색 입자가 보이는데, 이는 폴리머 입자 표면에 FITC-BSA가 성공적으로 결합하였음을 나타낸다.SERS probes according to the invention have biohybrid properties. The non-crosslinked carboxyl groups on the surface of the polymer particles were conjugated to Fluorescein isothiocyanate conjugated bovine serum albumin (FITC-BSA), demonstrating that these probes can be readily bound to multiple biological moieties for cell imaging and sensing. The polymer particles were peeled off the aluminum foil after crosslinking and weighed. The amount of EDC (1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) was calculated and added to the suspension of sonicated polymer particles. This mixture was stirred at rt overnight. EDC is a zero length crosslinker used to link carboxyl groups to amines. EDC binds to the free carboxyl group, causing the amano reaction to occur. FITC-BSA was used for protein labeling. Confocal laser scanning micrographs demonstrated the presence of proteins on the surface of the polymer particles after conjugation. 15 (a)-(c) show confocal images before FITC-BSA conjugation at the polymer particle surface. Only red color appears in the RITC-dextran channel, and no color is observed in the FITC channel. 15 (d)-(f) show the results after conjugation. In addition, the red color of the RBITC channel is seen, and a large number of green particles are seen in the FITC channel, indicating that the FITC-BSA successfully binds to the polymer particle surface.

실시예Example 15: 세포  15: cell 이미징Imaging

도 16(a)는 세포 표면에 부착된 폴리머 입자 내부에 캡슐화된 AgNCs를 나타내고, (b)는 세포의 서로 다른 스팟에서의 라만 신호를 나타낸 것이다. 여기에 사용된 세포는 한국생명공학연구소에서 입수한 SKBR3 세포이고, 라만 염료는 RBITC이고, 링커는 EDS/NHS, 그리고 항체는 CD44 이다. 도 16(b)를 통해 세포 표면에서 라만 강도가 크게 나옴을 알 수 있다.Figure 16 (a) shows AgNCs encapsulated inside polymer particles attached to the cell surface, and (b) shows Raman signals at different spots of cells. The cells used here are SKBR3 cells obtained from Korea Research Institute of Biotechnology, Raman dye is RBITC, linker is EDS / NHS, and antibody is CD44. It can be seen from Figure 16 (b) that the Raman intensity is large at the cell surface.

실시예Example 16:  16: AgNCsAgNCs 의 캡슐화 및 Encapsulation and AgNCsAgNCs 양 조절 Volume control

도 17은 RBITC 기반 AgNCs를 캡슐화한 폴리머 입자의 TEM 현미경 사진이다. AgNCs가 폴리머 용액에 (a)는 0.1 w/v%, (b)는 0.2 w/v%, (c) 0.6 w/v % 그리고 (d)는 1.0 w/v%의 농도로 AgNCs가 폴리머 용액 내에 들어가 있다. 따라서 본 발명은 폴리머 내로 들어가는 AgNCs의 양을 쉽게 조절할 수 있는 장점이 있다.
17 is a TEM micrograph of polymer particles encapsulating RBITC based AgNCs. AgNCs are present in the polymer solution at concentrations of (a) 0.1 w / v%, (b) 0.2 w / v%, (c) 0.6 w / v% and (d) 1.0 w / v%. Is inside. Therefore, the present invention has the advantage of easily controlling the amount of AgNCs entering the polymer.

실시예Example 17: 항- 17: Anti- ErbB2ErbB2 컨쥬게이티드Conjugated 나노클러스터와  With nanoclusters ErbB2ErbB2 항원 결합  Antigen binding

도 3은 본 발명에 따른 캡슐화된 나노클러스터를 이용한 암세포의 SERS 이미징 과정을 나타낸 것이다. 나노클러스터를 암세포 상의 특정 마커에 선택적으로 부착하기 위해서 나노클러스터 표면에 항체가 컨쥬게이션된다. SKBR3 세포에서 발현된 ErbB2 마커에 선택적으로 폴리머 나노클러스터를 부착시키기 위해서, 항-ErbB2 항체가 나노클러스터 표면에 컨쥬게이션되었다. 여기서 카르복시화된 폴리머 말단(carboxylate-terminated polymer)이 EDC를 이용한 NHS 에스테르화에서의 공유 결합을 함으로써 안정적인 항-ErbB2 고정화(immobilization)이 이루어진다. 항-ErbB2 컨쥬게이티드 나노클러스터가 암세포 상에서 발현된 ErbB2 항원에 부착된다. 비특이적 나노클러스터의 결합은 버퍼 솔루션으로 씻어냈다. 그 다음 나노클러스터 표지 암세포가 커버슬립에 고정되고 이것의 라만 맵핑 이미지를 라만 현미경으로 측정하였다. 입사 레이저빔이 암세포 표면을 비출 때, 암 마커상의 라만 리포터로부터 SERS 신호가 감지된다. 연속적 맵핑 과정을 가진 라만 이미징을 이용하여 암세포의 라만 이미지를 얻을 수 있다. 본 발명에서는 ErbB2를 발현하는 SKBR3 세포를 광학 이미징 타겟으로 이용하였다. Figure 3 shows the SERS imaging process of cancer cells using the encapsulated nanoclusters according to the present invention. Antibodies are conjugated to the nanocluster surface to selectively attach the nanocluster to specific markers on cancer cells. To selectively attach polymeric nanoclusters to ErbB2 markers expressed in SKBR3 cells, anti-ErbB2 antibodies were conjugated to the nanocluster surface. Here, the carboxylate-terminated polymer has a covalent bond in NHS esterification using EDC, resulting in stable anti-ErbB2 immobilization. Anti-ErbB2 conjugated nanoclusters attach to ErbB2 antigen expressed on cancer cells. Binding of nonspecific nanoclusters was washed off with buffer solution. The nanocluster labeled cancer cells were then fixed to the coverslips and their Raman mapping images were measured with a Raman microscope. When the incident laser beam shines on the cancer cell surface, the SERS signal is detected from the Raman reporter on the cancer marker. Raman imaging with a continuous mapping process can be used to obtain Raman images of cancer cells. In the present invention, SKBR3 cells expressing ErbB2 were used as the optical imaging target.

도 18은 SKBR 세포의 명시야상 이미지(a) 및 형광 이미지(b)를 보여준다. 레드 quantum dot (QD)-표지 형광 이미지를 비교용으로 이용하였다. 도 18(b)는 항-ErbB2 컨쥬게이티드 QD 표지된 SKBR3 세포의 형광 이미지를 보여준다. 상기 항-ErbB2 컨쥬게이티드 QDs는 효과적으로 ErbB2-발현 SKBR3 세포에 부착되었다. 그 결과, 도 16(b)와 같이 선명한 붉은 형광 이미지가 관찰되었다. 나노클러스터와 암 마커 사이의 분자 작용에 대한 좀 더 자세한 내용은 라만 맵핑 이미지를 이용하여 알아볼 수 있다. (c)는 1645cm?1에서 가장 강한 RBITC의 라만 피크를 이용한 SERS 맵핑을 나타낸 것이다. 이 라만 맵핑 기술에서, 상기 이미지는 세기 컬러 디코딩(intensity color decoding)에 의해 나타났다. 여기서 백색 블록은 가장 강한 SERS 신호를 나타내고, 흑색 블록은 가장 약한 것을 나타낸다. 0.3μm 간격에서 40 μm× 40 μm 영역이 측정되었다(16,000 맵핑 포인트). 각 스팟은 1초의 노출시간을 가지고 측정되었다. 총 측정 시간은 4 시간 이었다. QD-표지 형광 이미지와 비교하여 보면, 라만 맵핑 이미지가 SKBR3 세포의 표면 막에 ErbB2 마커가 분포된 모습을 더 자세하게 보여준다. (d)는 (c)에서 가리키는 화살표 위치의 라만 스펙트라에 대응하는, 나노클러스터가 표지된 SKBR3 세포의 3차원 라만 프로필을 나타낸 것이다.
18 shows a brightfield image (a) and a fluorescence image (b) of SKBR cells. Red quantum dot (QD) -labeled fluorescence images were used for comparison. 18 (b) shows fluorescence images of anti-ErbB2 conjugated QD labeled SKBR3 cells. The anti-ErbB2 conjugated QDs were effectively attached to ErbB2-expressing SKBR3 cells. As a result, a clear red fluorescence image was observed as shown in FIG. 16 (b). More details on the molecular action between nanoclusters and cancer markers can be found using Raman mapping images. (c) shows the SERS mapping using the Raman peak of the strongest RBITC at 1645cm-1. In this Raman mapping technique, the image is represented by intensity color decoding. Here, the white block represents the strongest SERS signal, and the black block represents the weakest. 40 μm × 40 μm areas were measured at 0.3 μm intervals (16,000 mapping points). Each spot was measured with an exposure time of 1 second. Total measurement time was 4 hours. Compared to QD-labeled fluorescence images, Raman mapping images show the distribution of ErbB2 markers on the surface membrane of SKBR3 cells in more detail. (d) shows the three-dimensional Raman profile of SKBR3 cells labeled with nanoclusters, corresponding to Raman spectra at the arrow position indicated in (c).

비교예Comparative example 1: 재료 및 방법  1: materials and methods

1-1 : 재료1-1: Material

스티렌, 디비닐벤젠, 아크릴산, 포타슘 퍼설페이트(KPS), AIBN, 1-부탄올, 클로로포름, 로다민 이소티오시아네이트 혼합 아이소머(isomer)는 모두 Sigma Aldrich에서 구입하여 받은 그대로 사용하였다.
Styrene, divinylbenzene, acrylic acid, potassium persulfate (KPS), AIBN, 1-butanol, chloroform, and rhodamine isothiocyanate mixed isomers were all purchased from Sigma Aldrich and used.

1-2: 1-2: 이멀젼Emulsion 폴리머화( Polymerization EmulsionEmulsion PolymerizationPolymerization ))

종래 문헌에 기재된 방법에 따라(US 7,776,547 및 US 2005/0191665), 자유 래디컬 이멀젼 폴리머화(free radical emulsion polymerization)를 수행하여 서브마이크론 크기의 폴리머 입자를 합성하였다. 간단하게 설명하면, 1.58 ml의 스티렌, 1.34 ml의 디비닐벤젠 및 0.39 ml와 반응 플라스크(three necked round bottom reaction flask)에 들어 있는 100 ml의 증류수에 첨가하였다. 여기서 디비닐벤젠은 가교제(crosslinker)로 작용한다. 상기 혼합물을 70℃로 가열하였다. 상기 혼합물을 질소 가스로 20분 동안 정화하여 상기 혼합물로부터 산소를 제거하였다. 2.0 ml의 증류수에 용해된 0.06 g의 KPS를 시린지를 통해 상기 혼합물에 첨가하여 폴리머화를 시작하였다. 이 반응은 계속적인 질소 가스의 흐름 하에 70℃에서 저어주면서 8 시간 동안 계속 진행되었다. 8 시간 후에 온도를 실온으로 낮추면서 반응을 멈추었다.
According to the methods described in the prior art (US 7,776,547 and US 2005/0191665), free radical emulsion polymerization was performed to synthesize submicron sized polymer particles. In brief, 1.58 ml of styrene, 1.34 ml of divinylbenzene and 0.39 ml were added to 100 ml of distilled water in a three necked round bottom reaction flask. Divinylbenzene here acts as a crosslinker. The mixture was heated to 70 ° C. The mixture was purged with nitrogen gas for 20 minutes to remove oxygen from the mixture. Polymerization was initiated by adding 0.06 g KPS dissolved in 2.0 ml distilled water to the mixture via syringe. The reaction continued for 8 hours with stirring at 70 ° C. under a continuous stream of nitrogen gas. After 8 hours the reaction was stopped while lowering the temperature to room temperature.

1-3: 1-3: 폴리머Polymer 입자 내에  Within the particles COINCOIN (( compositecomposite organicorganic -- inorganicinorganic nanoparticlenanoparticle ) 캡슐화: Encapsulation: SoakSoak -- inin 방법 Way

비교예 1-2에서 제조된 폴리머 입자를 10,000 rpm에서 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 펠렛 무게를 재고 동등한 부피의 1-부탄올에서 재현탁하였다. COINs을 종래 문헌에 기재된 방법에 따라(US 7,776,547 및 US 2005/0191665) 제조하였고 원심분리하여 무게를 재고, 그리고 1-부탄올 내의 교반 폴리머 현탁액에 첨가하였다. 폴리머 무게에 대한 COINs의 비율은 0.15로 일정하게 유지하였다. 10, 20 및 30배로 희석된 3개의 COINs 샘플을 준비하여 폴리머 입자와 부드럽게 섞어 주었다. 확산 효율을 확인하기 위해 5 시간 동안 인큐베이션을 하였다. 미리 정한 간격으로 다시 샘플을 원심분리하였고 상등액을 제거하였다. 펠렛은 증류수로 재현탁하여 폴리머의 다공성 구조를 해체시켜 폴리머 입자 내로 COINs을 포획하였다. 도 19에 제조 과정을 대략적으로 나타내었다.
The polymer particles prepared in Comparative Examples 1-2 were centrifuged at 10,000 rpm and the supernatant was removed. The pellet weight was weighed and resuspended in an equal volume of 1-butanol. COINs were prepared according to the methods described in the prior art (US 7,776,547 and US 2005/0191665) and weighed by centrifugation and added to the stirred polymer suspension in 1-butanol. The ratio of COINs to polymer weight was kept constant at 0.15. Three COINs samples diluted 10, 20 and 30 times were prepared and gently mixed with the polymer particles. Incubation for 5 hours to confirm diffusion efficiency. The samples were centrifuged again at predetermined intervals and the supernatant was removed. The pellet was resuspended in distilled water to break up the porous structure of the polymer to capture COINs into the polymer particles. The manufacturing process is shown in FIG. 19 roughly.

1-4: 1-4: 폴리머Polymer 입자 내에  Within the particles COINCOIN (( compositecomposite organicorganic -- inorganicinorganic nanoparticlenanoparticle ) 캡슐화: Build-in 방법) Encapsulation: Build-in Method

1-3과 유사한 방법에 약간의 변형을 가한 Build-in 방법이다. 단일 은 나노입자를 폴리머 입자 내로 확산시키고 라만 염료 응집을 진행하였다. 단일 은 나노입자가 폴리머 입자 내에서 응집될 수 있도록 각각의 샘플에 40분의 추가 시간을 적용하였다. 시간 간격을 두고, 단일 은 나노입자의 농도, 나노입자에 대한 폴리머 입자의 비율은 soak-in 방법과 동일하게 유지하였다. 일정하게 지정해 둔 확산 시간 이후에 폴리머 입자를 원심분리하고 증류수로 재현탁하여 build-in COINs을 포획하였다. 도 20에 제조 과정을 대략적으로 나타내었다.
This is a build-in method with a few modifications to methods similar to 1-3. Single silver nanoparticles were diffused into the polymer particles and Raman dye aggregation proceeded. An additional time of 40 minutes was applied to each sample so that single silver nanoparticles could aggregate in the polymer particles. At intervals of time, the concentration of single silver nanoparticles and the ratio of polymer particles to nanoparticles remained the same as the soak-in method. After a predetermined diffusion time, the polymer particles were centrifuged and resuspended in distilled water to capture build-in COINs. The manufacturing process is shown in FIG. 20 roughly.

1-5: 1-5: TEMTEM 이미징Imaging

비교예의 은 나노입자를 포함하는 폴리머 입자를 확인하기 위해 TEM(transmission electron microscopy)을 사용하였다. 폴리머 입자 현탁액은 TEM 그리드로 기화되어 샘플로 사용되었다.
Transmission electron microscopy (TEM) was used to identify polymer particles containing silver nanoparticles of the comparative example. The polymer particle suspension was vaporized into a TEM grid and used as a sample.

1-6: 라만 측정1-6: Raman measurement

폴리머 입자는 원심분리되고 동량의 부피비인 1.25 mg/ml의 증류수로 재현탁되었다. 그리고 현탁 상태에서 앞서 언급한 조건 하에서 라만 신호가 측정되었다. SERS 신호 재현성은 샘플의 15개의 서로 다른 스팟에서 측정되었다.
The polymer particles were centrifuged and resuspended in 1.25 mg / ml of distilled water at the same volume ratio. In suspension, the Raman signal was measured under the aforementioned conditions. SERS signal reproducibility was measured at 15 different spots in the sample.

비교예Comparative example 2: 캡슐화 효율 2: encapsulation efficiency

Soak-in 방법과 buid-in 방법 모두에서 폴리머 입자 내에 나노입자(나노클러스터)가 캡슐화되는 효율이 매우 낮았다(도 21 및 22). 폴리머 입자의 포어(pore) 크기가 너무 작기 때문에, COINs 및 단일 은 나노입자가 폴리머 입자 속으로 확산되기 어렵다. COINs와 단일 은 나노입자가 폴리머 입자 속으로 확산되는 추진력이 매우 작다. 따라서 비교예의 나노클러스터와 비교하였을 때, 본 발명에 따른 나노클러스터(도 17 참고)는, 고밀도로 폴리머 속으로 들어가 캡슐화 효율이 매우 우수함을 알 수 있다.
In both the soak-in and buid-in methods, the efficiency of encapsulating nanoparticles (nanoclusters) in polymer particles was very low (FIGS. 21 and 22). Because the pore size of the polymer particles is too small, COINs and single silver nanoparticles are difficult to diffuse into the polymer particles. COINs and single silver nanoparticles have very little propulsion to diffuse into the polymer particles. Therefore, when compared with the nanoclusters of the comparative example, it can be seen that the nanoclusters (see FIG. 17) according to the present invention enter the polymer at a high density and have an excellent encapsulation efficiency.

비교예Comparative example 3: 라만 신호 세기  3: Raman signal strength

Soak-in 방법과 buid-in 방법을 통해 제조된 나노클러스터가 폴리머 내로 캡슐화되는 효율이 낮기 때문에, 캡슐화된 금속 나노입자의 수가 매우 적어진다. 따라서 이 두 방법을 이용하면 라만 신호 세기가 매우 낮다(도 23-25). 이 두 방법을 이용하면 나노클러스터의 과도한 응집이 일어나거나, 가혹한 유기 환경 하에서 물리적으로 결합된 COINs가 분열되지 않기 때문에 라만 신호 세기가 낮게 나올 수 밖에 없다. 따라서 비교예의 나노클러스터와 비교하였을 때, 본 발명에 따른 나노클러스터(도 23의 EHD Jetting)는 라만 신호 세기가 매우 강함을 알 수 있다.
Due to the low efficiency of encapsulating nanoclusters produced by the soak-in and buid-in methods into polymers, the number of encapsulated metal nanoparticles is very small. Therefore, using these two methods, Raman signal strength is very low (Figs. 23-25). Using these two methods, Raman signal strength is low due to excessive aggregation of the nanoclusters or physically bound COINs under severe organic environments. Therefore, when compared with the nanocluster of the comparative example, it can be seen that the nanocluster (EHD Jetting of FIG. 23) according to the present invention is very strong in Raman signal strength.

비교예Comparative example 3: 라만 신호 재현성  3: Raman signal reproducibility

Soak-in 방법과 buid-in 방법을 이용한 나노클러스터의 캡슐화 효율이 매우 낮기 때문에, 폴리머 내에 들어 있는 나노클러스터의 수는 매우 적거나 거의 없다. 따라서 이 두 방법에 따른 나노클러스터의 SERS 신호 재현성은 매우 낮음을 알 수 있다(도 26 및 27). 비교예와 본 발명에 따른 나노클러스터를 비교하여 보면, 본 발명의 나노클러스터의 재현성(도 10)이 매우 우수함을 알 수 있다.
Since the encapsulation efficiency of nanoclusters using the soak-in and buid-in methods is very low, the number of nanoclusters contained in the polymer is very small or few. Therefore, it can be seen that the SERS signal reproducibility of the nanoclusters according to these two methods is very low (FIGS. 26 and 27). Comparing the nanoclusters according to the present invention with the comparative example, it can be seen that the reproducibility (FIG. 10) of the nanoclusters of the present invention is very excellent.

이상 살펴본 바와 같이, 전기수력적 분사법을 이용하고 폴리머와 나노클러스터 사이에 네트워크를 형성하여 제조된 본 발명의 금속 나노프로브는 캡슐화 효율이 높고 라만 신호 세기가 강하며 재현성이 우수하여 SERS 이미징 측정용 바이오하이브리드 나노프로브로 매우 적합함을 알 수 있다.
As described above, the metal nanoprobe of the present invention manufactured by using an electrohydraulic injection method and forming a network between the polymer and the nanocluster has high encapsulation efficiency, strong Raman signal strength, and excellent reproducibility for SERS imaging measurement. It can be seen that it is very suitable as a biohybrid nanoprobe.

Claims (13)

시드(seed) 금속 나노입자를 준비하고;
상기 시드 금속 나노입자와 라만 염료를 혼합하고 가열 또는 응집하여 상기 시드 금속 나노입자와 라만 염료를 포함하는 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하고;
상기 금속 나노클러스터를 단백질 또는 제 1친수성 폴리머로 코팅하여 안정화된 금속 나노클러스터를 만들고;
상기 단백질 또는 제 1친수성 폴리머로 코팅된 금속 나노클러스터를 제2폴리머 용액과 혼합하여 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제 2폴리머 현탁액을 제조하고;
상기 현탁액을 전기수력적 분사법에 의해 분사하여 상기 제 2폴리머로 상기 금속 나노 클러스터를 둘러싸서 캡슐화된 금속 나노클러스터를 형성하고; 그리고
상기 제2 폴리머로 캡슐화된 금속 나노클러스터를 가열하거나 자외선 처리하여 상기 금속 나노클러스터를 둘러싸는 제2 폴리머 사이에 가교결합 또는 비가교결합을 발생시킴으로써 상기 금속 나노클러스터-제2 폴리머 네크워크를 형성하는;
단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
Preparing seed metal nanoparticles;
Mixing and heating or agglomerating the seed metal nanoparticles with the Raman dye to form a metal nanocluster including the seed metal nanoparticles and the Raman dye;
Coating the metal nanocluster with a protein or a first hydrophilic polymer to form a stabilized metal nanocluster;
Mixing a metal nanocluster coated with the protein or first hydrophilic polymer with a second polymer solution to prepare a second polymer suspension comprising the metal nanocluster;
Spraying the suspension by electrohydraulic injection to form encapsulated metal nanoclusters surrounded by the metal nanoclusters with the second polymer; And
Forming the metal nanocluster-second polymer network by heating or ultraviolet treating the metal nanoclusters encapsulated with the second polymer to generate crosslinks or non-crosslinks between the second polymers surrounding the metal nanoclusters;
Method of preparing a biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement comprising the step.
제1항에 있어서,
상기 캡슐화된 금속 나노클러스터를 형성하는 단계 이후에, 상기 캡슐화된 금속 나노클러스터를 둘러싸는 제2 폴리머 껍질 표면에, 항원, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 생물학적 압타머(biological aptamer), 수용체 및 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브를 바이오콘쥬게이션(bioconjugation)을 통해 화학적으로 가교결합시키는 것을 더 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
After forming the encapsulated metal nanocluster, an antigen, an antibody, a polynucleotide, an oligonucleotide, a biological aptamer, a receptor and a ligand are formed on the surface of the second polymer shell surrounding the encapsulated metal nanocluster. A method for producing a biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement, further comprising chemically crosslinking a probe selected from the group consisting of bioconjugation.
제1항에 있어서,
상기 금속은 은, 금, 구리, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
The metal is selected from the group consisting of silver, gold, copper, and mixtures thereof, the method for producing a bio-hybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement.
제1항에 있어서,
상기 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하는 단계에서, 상기 금속 나노클러스터는, 서로 다른 라만 염료를 포함하는 복수개의 금속 나노클러스터이고 상기 서로 다른 라만 염료를 통해 멀티플렉싱 검진이 가능한 것인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
In the forming of the metal nanoclusters, the metal nanoclusters are a plurality of metal nanoclusters including different Raman dyes and are capable of multiplexing through the different Raman dyes. Method for preparing biohybrid metal nanoprobe for SERS image measurement.
제1항에 있어서,
상기 금속 나노클러스터를 코팅하는 친수성 단백질은, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 인슐린(insulin), 콩단백질, 카제인, 젤라틴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
The hydrophilic protein coating the metal nanocluster is selected from the group consisting of avidin, streptavidin, bovine serum albumin, insulin, soy protein, casein, gelatin, and mixtures thereof. Method for producing a bio-hybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement.
제1항에 있어서,
상기 금속 나노클러스터를 코팅하는 제 1 친수성 폴리머는 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리비닐아세테이트(Polyvinylacetate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid), 폴리말레이산 (polymaleic acid), 실리콘옥사이드 (SiO2) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
The first hydrophilic polymer coating the metal nanocluster is polyvinylalcohol, polyvinylpyrrolidone, polyvinylacetate, polyacrylamide, polyacrylic acid, polyacrylic acid, polyacrylamide. A method for producing biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement, which is selected from the group consisting of maleic acid, silicon oxide (SiO 2) and mixtures thereof.
제1항에 있어서,
상기 시드 금속 나노입자와 라만 염료를 포함하는 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하는 단계에서, 상기 금속 나노클러스터의 크기는 10에서 1000 nm인 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
In the step of forming a metal nanocluster (nanocluster) comprising the seed metal nanoparticles and Raman dye, the size of the metal nanocluster is 10 to 1000 nm surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement Method for producing a biohybrid metal nanoprobe for use.
제7항에 있어서,
상기 금속 시드 나노입자 각각의 크기가 1에서 100 nm이고 상기 나노클러스터 크기가 10 에서 1000 nm일 때 라만 신호가 최대가 되는 것인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 7, wherein
Biohybrid for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement, wherein the Raman signal is maximized when the size of each of the metal seed nanoparticles is 1 to 100 nm and the nanocluster size is 10 to 1000 nm Method for producing metal nanoprobes.
제1항에 있어서,
상기 금속 나노클러스터를 포함하는 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 금속 나노클러스터의 농도는 0.01에서 20 w/v%인 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
In the step of preparing a polymer suspension comprising the metal nanocluster, the concentration of the metal nanocluster is from 0.01 to 20 w / v% bio-hybrid metal nano for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement Method for Producing Probes.
제1항에 있어서,
상기 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 폴리머의 농도는 0.0001에서 20 w/v% 인 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
In the step of preparing a polymer suspension comprising the metal nanocluster, the concentration of the polymer is from 0.0001 to 20 w / v% bio-hybrid metal nano probe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement Manufacturing method.
제1항에 있어서,
상기 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제2 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 제2 폴리머는 친수성 폴리머인 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산) [Poly(acrylamide-co-acrylicacid)], 폴리(L-아미노산), 폴리(2-메타크릴옥시에틸트리메틸 암모늄 브로마이드[poly(L-amino acids)], poly(2-methacryloxyehtyltrimethyl ammonium bromide)), 폴리스티렌 술포닉 액시드[polystyrenesulfonic acid] 및 폴리스티렌-폴리스티펜-술포닉액시드 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
In the step of preparing a second polymer suspension comprising the metal nanocluster, the second polymer is a hydrophilic polymer poly (acrylamide-co-acrylic acid) [Poly (acrylamide-co-acrylicacid)], poly (L- Amino acids), poly (2-methacryloxyethyltrimethyl ammonium bromide [poly (L-amino acids)], poly (2-methacryloxyehtyltrimethyl ammonium bromide)), polystyrene sulfonic acid and polystyrene-polytifen-sulfo A method of making a biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement, which is selected from the group consisting of a nickel acid copolymer.
제1항에 있어서,
상기 상기 금속 나노클러스터를 포함하는 제2 폴리머 현탁액을 제조하는 단계에서, 상기 제2 폴리머는 소수성 폴리머인 폴리락타이드 (poly(lactide)), 폴리글라이콜라이드 (poly(glycolide)) 및 폴리스티렌 (poly(styrene))로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.
The method of claim 1,
In preparing the second polymer suspension including the metal nanocluster, the second polymer is a hydrophobic polymer, poly (lactide), polyglycolide, and polystyrene. (styrene)) is selected from the group consisting of surface-enhanced Raman scattering (SERS) method for producing a biohybrid metal nanoprobe for image measurement.
제1항에 있어서,
상기 현탁액을 전기수력적 분사법에 의해 분사하여 상기 폴리머로 상기 금속 나노 클러스터를 둘러싸서 캡슐화된 금속 나노클러스터를 형성하는 단계에서, 상기 전기수력적 분사시에 친수성 용매 또는 소수성 용매가 사용되는 것인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 바이오하이브리드 금속 나노프로브의 제조방법.









The method of claim 1,
Spraying the suspension by electrohydraulic injection to form encapsulated metal nanoclusters with the polymer to encapsulate the metal nanoclusters, wherein a hydrophilic solvent or a hydrophobic solvent is used during the electrohydraulic injection. , Method for preparing biohybrid metal nanoprobe for surface-enhanced Raman scattering (SERS) image measurement.

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