KR20120107501A - 오류 시그널이 배제되는 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출 - Google Patents

오류 시그널이 배제되는 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 위양성 시그널이 배제되는 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출에 관한 것이다. 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법과는 달리, 본 발명은 서로 다른 반응 용기에서의 2 개의 다른 증폭 반응을 포함한다: 앰플리콘을 수득하기 위한 제1차 멀티플렉스 PCR 및 상기 앰플리콘을 이용한 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR. 본 발명은 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생된 위양성 시그널, 비-특이적 혼성화에 의한 위양성 시그널 및 위음성 시그널이 배제되도록 한다.

Description

오류 시그널이 배제되는 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출{Real－Time Multiplexing Detection of Target Nucleic Acid Sequences with Elimination of False Signals}
본 발명은 오류 시그널(false signals)이 배제되는 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산을 검출하기 위한 대부분의 기술들은 타겟 핵산 증폭 과정을 포함하고 있다. 핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 이용되는 필수적인 과정이고, 이에 다양한 증폭 방법이 제시되었다. 예를 들어, Miller, H. I. 등 (WO 89/06700)은, 프로모터/프라이머 서열을 타겟 단일가닥 DNA("ssDNA")에 혼성화 시킨 다음, 상기 서열의 많은 RNA 카피를 전사하는 과정을 포함하는 핵산서열 증폭 방법을 개시하고 있다.
중합효소 연쇄반응(이하,“PCR"이라 한다)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki 등, (1985) Science 230, 1350-1354).
PCR-기반 기술들은 타겟 DNA 서열의 증폭뿐만 아니라 생물학과 의학 연구 분야에서 과학적 응용 또는 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 역전사 효소 PCR (RT-PCR), 분별 디스플레이(Differential Display) PCR (DD-PCR), 공지 또는 미지의 유전자의 PCR을 이용한 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), 임의적 프라이밍 PCR(AP-PCR), 멀티플렉스 PCR, SNP 지놈 타이핑, 및 PCR-기반 지놈 분석이 있다(McPherson and Moller, (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY).
한편, 핵산 증폭을 기반으로 타겟 핵산을 검출하기 위한 방법으로 다양한 실시간 PCR 방법이 개발되고 있다. 실시간 PCR 방법은 실시간으로 타겟의 증폭산물을 검출할 수 있거나 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 하고 오염의 문제가 없다는 측면에서 크게 주목을 받고 있다. 실시간 PCR 방법은 일반적으로 증폭반응 동안 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오타이드 또는 DNA-결합 염료(dye)를 사용한다.
대표적인 DNA-결합 염료인 SYBR Green은 이중 가닥 DNA 사이에 삽입되어 형광을 나타낸다. 그러나, SYBR Green은 DNA 가닥 사이에 비-특이적으로 삽입될 가능성이 높기 때문에, 특이적 타겟 검출에 적합하지 않다. 더 큰 문제는, SYBR Green 기술을 실시간 멀티플렉스 검출에 응용하는 경우, 멜팅커브 분석(melting curve analysis)을 통하여 증폭산물을 동정하여야 하므로, 시간적 및 효율적인 분석면에서 적합하지 않은 것으로 간주된다.
대부분의 실시간 PCR 방법들은 표지 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 종래 실시간 PCR 방법은 (ⅰ) 표지 올리고뉴클레오타이드(프라이머 또는 프로브)의 사용 (ⅱ) 표지 올리고뉴클레오타이드의 특정 형태 또는 구조의 형성(예컨대, 헤어핀-루프 구조) (ⅲ) 올리고뉴클레오타이드에 결합된 표지의 개수, (ⅳ) 시그널의 발생 원리, 또는 (ⅴ) 이용되는 핵산 중합효소의 성질의 측면에서 고유의 특징들을 갖는다. 대표적인 예로는 TaqManTM probe 방법(미국특허 제5,210,015호), 분자적 비콘(Molecular Beacon) 방법(Tyagi 등, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 스콜피온(Scorpion) 방법(Whitcombe 등, Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), 선라이즈(Sunrise 또는Amplifluor) 방법(Nazarenko 등, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), 및 미국특허 제6,117,635호), 럭스(Lux) 방법(미국특허 제7,537,886호), CPT(Duck P, 등. Biotechniques, 9:142-148(1990)), LNA 방법 (미국특허 제6,977,295호) 및 플렉서(Plexor) 방법(Sherrill CB, 등, Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004))을 포함한다.
실시간 PCR 방법의 개발과 더불어 복수의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출할 수 있는 실시간 멀티플렉스 PCR 방법이 제시되어 왔다. 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 다음과 같은 관점에서 합리적인 이점을 갖는다: 시간적-효율성, 비용적-효율성, 편의성 및 고속-대량의 작동성(R.N. Gunson, 등, Journal of Clinical Virology, 43:372-375 (2008)).
그럼에도 불구하고, 종래의 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 프라이머 또는 프로브는 비-특이적 혼성화를 발생시킬 가능성이 높다(R.N. Gunson, 등, Journal of Clinical Virology, 43:372-375 (2008)). 표지 프라이머-기반 실시간 멀티플렉스 PCR의 경우, 표지 프라이머의 다이머(dimer) 형성은 위양성 시그널을 발생시키기 때문에 주요 문제점으로 여겨진다.
실시간 멀티플렉스 PCR 과정의 작동과 관련하여 발생되는 위양성 시그널이 실질적으로 제거 또는 완전히 제거되는 경우에, 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 복수의 타겟 핵산서열을 동시에 검출하는 가장 유망한 기술이 될 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 복수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종래 표지 프라이머-기반 실시간 멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 실시하는 동안 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널을 완벽하게 배제시켜, 복수의 타겟 핵산서열들을 실시간 멀티플렉스 검출할 수 있는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 최소 3 종의 핵산서열을 제1차 멀티플렉스-증폭하여 앰플리콘을 수득하고, 표지 네스티드 프라이머를 이용한 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 의하여 상기 앰플리콘을 증폭시키는 방식을 실시하여, 최소 3 종의 타겟 핵산서열을 검출하는 탁월한 방법을 제시하였다. 본 발명자들은, 상기 신규한 방법이 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 야기된 위양성 시그널을 완벽하게 배제하고, 또한 보다 개선된 민감도 및 특이도로 복수의 타겟 핵산서열을 실시간 멀티플렉스 방식으로 검출한다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 실시간 멀티플렉스 PCR에서 오류 시그널(false signals)이 배제되는 최소 3 종의 타겟 핵산서열에 대한 실시간 멀티플렉스 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 실시간 멀티플렉스 PCR에서 오류 시그널(false signals)이 배제되는 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉스 PCR 검출을 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하며, 실시간 멀티플렉스 PCR(real-time multiplex Polymerase Chain Reaction)에서 오류 시그널이 배제되는 시료 내 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출방법을 제공한다:
(a) 반응 용기에서 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 제1차 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계로서, 상기 제1차 멀티플렉스 PCR은 상기 시료에서 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻기 위하여, 최소 3 종의 타겟 핵산서열을 증폭할 수 있는 조건 하에서 최소 3 종의 프라이머 쌍 및 주형-의존적 핵산중합효소를 이용하여 실시되고;
(b) 상기 단계 (a)에 사용된 반응 용기와 다른 반응 용기에서 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 반응 혼합물을 준비하는 단계로서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 반응 혼합물은 (i) 상기 단계 (a)에서 얻은 앰플리콘, (ii) 상기 앰플리콘의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 최소 3 종의 프라이머 쌍; 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍에서 최소 하나의 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이고, 그리고 (ⅲ) 주형-의존적 핵산 중합효소를 포함하며, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍은, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 최소 하나의 네스티드 프라이머를 포함하고;
(c) 상기 단계 (b)의 상기 반응 혼합물을 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성을 최소 2 사이클 실시하여 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계로서, 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 상기 시그널은 사이클 동안 상기 표지 프라이머 각각으로부터 발생되며, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 오류 시그널은 발생되지 않고 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널은 발생되는 사이클 수로 실시될 수 있고; 그리고
(d) 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 검출은 단계 (c)의 상기 반복의 각 사이클에서, 단계 (c)의 상기 반복의 종료시점에서 또는 단계 (c)의 상기 반복 동안 지정 시간 간격 각각에서 실시되며, 이에 의해 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 상기 시그널은 오류 시그널 없이 실시간 방식으로 얻어진다.
일반적으로, 복수의 타겟 서열을 동시적으로 검출하기 위해 표지 프로브 또는 프라이머를 이용하는 종래 실시간 PCR 기술들을 실시하는 경우, 심각한 문제들이 야기된다. 예를 들면, 표지 프로브(labeled probe)를 이용하는 방법들은 증폭 및 검출을 위해 각각 프라이머 및 프로브와 같은 많은 올리고뉴클레오타이드를 필요로 한다. 따라서, 프라이머 및 프로브로서의 올리고뉴클레오타이드의 적합한 서열을 결정하기가 매우 어렵고, 또한 실시간 멀티플렉스 PCR의 반응 조건을 최적화 하기도 어렵다. 게다가, 이러한 방법들은 올리고뉴클레오타이드의 다이머 형성 또는 비-특이적 혼성화에 의하여 발생되는 위양성 시그널이 발생할 가능성이 높다. 따라서, 프로브-기반 실시간 PCR 방법은 복수의 타겟 서열을 동시적으로 검출하기에 부적합한 것으로 간주된다.
또한, 표지 프라이머(labeled primer)를 이용하는 종래의 실시간 PCR 접근법은 타겟 서열의 실시간 검출에서 위양성 시그널의 발생을 야기하는 표지 프라이머의 다이머 형성에 관련된 불가피한 결점들이 있다. 특히, 이러한 문제점은 복수의 타겟 서열을 동시적으로 검출하기 위한 실시간 멀티플렉스 PCR에서 보다 심각해진다. 실시간 멀티플렉스 PCR은 복수의 표지 프라이머를 필요로 하기 때문에, 이러한 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 위양성 시그널이 발생할 가능성이 높다.
더욱이, 타겟 핵산서열이 매우 적은 양으로 존재하거나 또는 존재하지 않는 경우, 표지 프라이머-기반 실시간 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 시그널이 타겟 핵산서열의 존재에 의한 양성 시그널인지 또는 표지 프라이머의 다이머 형성에 의한 오류 시그널인지를 구별하거나 또는 결정하기가 상당히 어렵다.
한편, 표지 프라이머의 서열 선택은 일반적으로 다이머 형성 문제를 피하기 위한 전략으로서 이용된다. 그러나, 이러한 전략은 다이머 문제를 완벽히 배제하는 점에서 는 여전히 한계를 갖고 있다.
본 발명자들은 종래 표지 프라이머-기반 실시간 멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 실시하는 동안 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널을 완벽하게 배제시켜, 복수의 타겟 핵산서열들을 실시간 멀티플렉스 검출할 수 있는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 최소 3 종의 핵산서열을 제1차 멀티플렉스-증폭하여 앰플리콘을 수득하고, 표지 네스티드 프라이머(labeled nested primer)를 이용한 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 의하여 상기 앰플리콘을 증폭시키는 방식을 실시하여, 최소 3 종의 타겟 핵산서열을 검출하는 탁월한 방법을 제시하였다. 본 발명자들은, 신규한 방법이 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 야기된 위양성 시그널을 완벽하게 배제하면서, 복수의 타겟 핵산서열을 실시간 멀티플렉스 방식으로 검출한다는 것을 확인하였다.
본 발명자들이 아는 한, 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널을 배제하거나 또는 구별하는 네스티드 실시간 방식으로 최소 3 종의 표지 네스티드 프라이머를 이용하여 최소 3 종의 타겟 핵산서열을 동시에 검출할 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해서 최초로 제시되었다.
표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널의 배제(또는 제거)는 다음 세 가지 전략의 절묘한 조합에 의한 것이다. 첫 번째 전략은 복수의 타겟 핵산서열의 전-증폭으로, 이는 실시간 시그널이 발생되는 과정과 분리되어 실시되어야 한다. 두 번째 전략은 전-증폭에 의하여 생성된 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 표지 네스티드 프라이머를 이용하는 것이다. 세 번째 전략은 타겟 시그널은 발생되나 다이머 형성에 의한 위양성 시그널은 발생되지 않는 정도까지 실시간 멀티플렉스 PCR 반응의 사이클 수를 제한하는 것이다.
본 발명에서, 타겟 핵산서열은 먼저 제1차 멀티플렉스 PCR에 의하여 전-증폭되며, 그 후 앰플리콘이 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에서 주형으로 이용된다. 전-증폭은 타겟 핵산서열의 양을 증가시키기 때문에, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안의 타겟 핵산서열에 대한 시그널의 역치 사이클(threshold cycle, Ct) 값은 전-증폭 없이 얻은 Ct 값보다 더 낮게 된다. 반면, 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널의 Ct 값은 전-증폭의 이용과는 상관없이 변하지 않는다. 따라서, 이러한 현상은 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 위양성 시그널의 발생 이전에 발생되고, 이는 결국 양성 타겟 시그널과 위양성 시그널이 구별되도록 한다.
제1차 멀티플렉스 PCR용 프라이머가 제2차 실시간 멀티플렉스 PCR용 표지 프라이머로 이용되는 경우, 제1차 멀티플렉스 PCR동안 발생된 비특이산물 또는 다이머 산물과 표지 프라이머와의 상호작용에 의하여 위양성 시그널이 발생될 가능성이 높다. 반면, 제2차 실시간 멀티플렉스 PCR용 표지 프라이머가 제1차 멀티플렉스 PCR로부터 생성된 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머인 경우, 제1차 멀티플렉스 PCR의 비특이산물 또는 다이머 산물과 표지 네스티드 프라이머와의 상호작용을 피함으로써, 이러한 위양성 시그널이 근본적으로 방지된다.
최종적으로, 본 발명의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR의 사이클 수는 복수의 타겟 시그널은 발생되나 다이머 형성에 의한 위양성 시그널은 발생되지 않도록 제한된다. 따라서, 사이클 수의 제한은 다이머 형성에 의하여 발생된 위양성 시그널은 배제되도록 하고, 결국 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 양성 시그널이 검출되도록 한다.
또한, 본 발명자들은 위양성 시그널, 예컨대, 종래 실시간 멀티플렉스 PCR에서 표지 프라이머의 다이머 형성으로 인한 위양성 시그널이 30 사이클 이후에 발생될 가능성이 높다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 최대 30 사이클로 실시함으로써, 다이머 형성에 의하여 발생된 위양성 시그널이 방지되는 것을 확인하였다. 본 발명의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 전-증폭된 타겟 핵산서열을 이용하여 실시되기 때문에, 본 발명자들은 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 30 사이클 이내에서 얻어진다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최소 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시되며, 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍에서 최소 하나의 프라이머가 제1차 멀티플렉스 증폭으로부터 얻은 해당 앰플리콘의 내부서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이며, 이는 특이성 및 민감도의 향상과 같은 네스티드 PCR 효과의 발생을 가져온다. 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 종래 네스티드 PCR의 제2차 라운드 PCR과 유사한 효과를 발생시킨다. 즉, 본 발명의 제1차 멀티플렉스 PCR은 종래 네스티드 PCR의 제1차 라운드 PCR에 해당하고, 본 발명의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 종래 네스티드 PCR의 제2차 라운드 PCR에 해당한다.
특히, 본 방법의 특징 중 하나는 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에서 네스티드 프라이머를 표지 프라이머로 지정하는 것이다. 따라서, 본 발명은 실시간 PCR에서, 네스티드 증폭 효과에 의하여 복수의 타겟 핵산서열을 검출시 타겟 특이성이 탁월하게 향상되도록 하며, 이는 시료의 비-타겟 서열과의 비-특이 혼성화로 인한 위양성 시그널을 배제 또는 감소시킨다.
또한, 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 비해 본 발명의 방법의 네스티드 효과는 극적으로 민감도를 향상시킨다. 즉, 복수의 타겟 서열 주형이 아주 적은 양으로 존재하는 경우, 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 검출에 한계가 있기 때문에 타겟 시그널을 검출하지 못할 수도 있다. 반면, 본 발명의 방법은 네스티드 증폭 효과에 의해 극적으로 향상된 민감도로 매우 적은 양으로 존재하는 타겟 서열도 정확하게 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명은 “제1차 멀티플렉스 PCR 및 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR의 연속적 조합에 의한 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법(Nested real-time Multiple PCR Method by a Sequential Combination of Primary Multiplex PCR and Secondary Nested Real-time Multiplex PCR)”으로 명명된다.
본 발명의 특징을 표현하기 위하여 사용되는 용어“제1차 멀티플렉스 PCR(Primary Multiplex PCR)”은 시료에서 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 수득하기 위해 최소 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시되는 멀티플렉스 PCR 반응을 의미한다.
본 발명의 특징을 표현하기 위하여 사용되는 용어 “제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR(Secondary Nested Real-time Multiplex PCR)”은, 주형으로서 제1차 멀티플렉스 PCR로부터 수득한 앰플리콘 및 각각의 쌍에서 최소 하나의 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 표지 네스티드 프라이머인 최소 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시하고, 실시간 방식으로 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 발생하는 실시간 멀티플렉스 PCR 반응을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어“위양성 시그널의 배제(elimination)(또는 제거(removal))”또는 “위양성 데이터의 배제(elimination)(또는 제거(removal))”는 타겟 핵산서열이 전-증폭되지 않은 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 반응에 비교하여 위양성 시그널이 감소되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 용어는 위양성 시그널의 실질적인 배제(substantial elimination)를 의미하며, 보다 바람직하게는 위양성 시그널의 완벽한 배제(complete elimination)이다.
본 발명에서 사용되는 시료는 어떠한 시료도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산 가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 증폭에 있어서 최대 효율성을 갖는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드, 유니버설 뉴클레오타이드, 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 복수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “멀티플렉스 검출 또는 멀티플렉싱 검출(multiplex detection or multiplexing detection)”은 반응 용기(예컨대, 반응 튜브)에서 복수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)”은 반응 용기에서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의하여 복수의 타겟이 동시적으로 증폭되는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 멀티플렉스 PCR은 반응 용기에서 최소 3 종의 타겟 핵산서열을 증폭시킬 수 있는 최소 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시되며, 이에 의해 시료에서 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻는다.
타겟 핵산서열의 멀티플렉스 PCR은 당업계에 공지된 PCR 방법들에 따라 실시될 수 있다. 바람직하게는, 멀티플렉스 PCR 반응은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 과정에 따라 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제1차 멀티플렉스 PCR은 최대 50 사이클로 실시되며, 보다 바람직하게는 최대 40 사이클, 보다 더 바람직하게는 최대 30 사이클, 가장 바람직하게는 최대 20 사이클이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제1차 멀티플렉스 PCR은 최소 2 사이클로 실시되며, 보다 바람직하게는 최소 5 사이클, 보다 더 바람직하게는 최소 10 사이클, 가장 바람직하게는 최소 15 사이클이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널의 발생에 필요한 양의 앰플리콘이 제공되도록 제1차 멀티플렉스 PCR의 사이클 수가 결정된다.
시료의 타겟 핵산서열은 DNA 또는 RNA이다. 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형태일 수 있다. 초기 물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80-105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
mRNA가 초기 물질로 이용되는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 구성되며, dT 프라이머가 프라이머로서의 역할을 할 수 있는 범위 내에서 이의 dTMPs의 하나 또는 그 이상은 다른 dNMP로 대체할 수 있다. 역전사는 RNase H 활성을 갖는 역전사효소로 실시될 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 신중하게 반응 조건을 선택함으로써 별도의 RNase H 절단 과정을 생략할 수 있다.
본 발명에 사용되는 프라이머는 타겟 핵산서열(주형)의 한 위치(site)에 혼성화 또는 어닐링되어 이중-가닥 구조를 형성한다. 이러한 이중가닥 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 어닐링의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 제1차 멀티플렉스 PCR 단계에 이용할 수 있으며, 이는 E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우(Klenow)” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus , Thermococcus literalis , 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
중합 반응이 실시되는 경우, 반응 용기에 이러한 반응에 필요한 구성 성분을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 연장반응에 필요한 구성 성분들의 과량은, 원하는 정도의 연장이 구성성분의 농도에 의해 실질적으로 제한되지 않는 정도의 각 구성성분의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 필요한 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP는 반응 혼합물에 충분한 양을 제공하여 연장이 원하는 정도로 이루어질 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
제1차 멀티플렉스 PCR 또는 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건 하에서 활성 상태일 수 있다. 실제로, 버퍼는 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 되어 있다. 따라서, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 멀티플렉스 PCR을 위한 어닐링 또는 혼성화는 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건(stringent condition) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양해 질 수 있다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 40℃ 내지 75℃이고, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1차 멀티플렉스 PCR 또는 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 최소 3 종의 프라이머 쌍 중 최소 하나의 프라이머는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다:
5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
상기 일반식에서, Xp는 타겟 서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고; Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Zr은 타겟 서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위(3’-second priming portion)이고; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 타겟 핵산에 대한 어닐링 측면에서 상기 5’-제1차 프라이밍 부위가 상기 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 상기 어닐링 특이성이 상기 5’-제1차 프라이밍 부위 및 상기 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 상기 프라이머의 전체 혼성화 특이성을 향상시킨다.
DPO 구조는 DSO(dual specificity oligonucleotide)의 프라이머 형태이며, 본 발명자들에 의해 처음 제시되었다(WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)). DPO는 혼성화 또는 어닐링이 분할구역에 의해 서로 분리된 5’-고 Tm 특이성 부위(또는 5’-제1차 프라이밍 부위) 및 3’-저 Tm 특이성 부위(또는 3’-제2차 프라이밍 부위)에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 신규한 개념을 구현한 것으로, 매우 놀라운 향상된 혼성화 특이성을 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Kim 등, Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84(2008); Kim 등, Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii 등, Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))). 상술한 바와 같이, DPO는 서로 다른 혼성화 특성을 갖는 두 개의 프라이머 단편을 궁극적으로 갖게 된다: 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 5’-제1차 프라이밍 부위 및 타겟 특이성을 결정하는 3’-제2차 프라이밍 부위.
위양성 시그널이 배제된 성공적인 멀티플렉스 증폭 반응에 DPO 구조를 갖는 프라이머가 부분적으로 기여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
바람직하게는, 상기 분할부위는 최소 3 개 유니버설 염기를 갖는 연속된 뉴클레오타이드를 포함하며, 보다 바람직하게는 최소 4 개 유니버설 염기, 가장 바람직하게는 최소 5 개 유니버설 염기이다. 택일적으로, 상기 분할부위는 3-10, 3-7, 또는 5-7개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직하게는, DPO 구조의 5’-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3’-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5’-제1차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 15-60 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-40 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 상기 3’-제2차 프라이밍 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 상기 분할부위는 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5’-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 보다 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 3’-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할부위는 바람직하게는, 3-15℃의 Tm을 갖는다.
제1차 멀티플렉스 PCR을 위한 단계 (a)에는 최소 3 종의 프라이머 쌍이 이용되며, 바람직하게는 최소 4 종의 프라이머 쌍, 보다 바람직하게는 최소 5 종의 프라이머 쌍이 이용된다.
타겟 핵산서열의 제1차 멀티플렉스 PCR에 이어, 제1차 멀티플렉스 PCR의 단계 (a)의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시한다. 각각의 쌍 중 최소 하나의 프라이머는, 단계 (a)로부터 얻은 해당 앰플리콘의 각각의 내부서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머인 최소 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시한다. 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 의하여, 최소 3 종의 타겟 핵산서열이 실시간 방식으로 검출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 네스티드 멀티플렉스 PCR용 정방향 및 역방향 프라이머 중 최소 하나는, 단계 (a)로부터 얻은 해당 엠플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “네스티드 프라이머(nested primer)"는 단계 (a)로부터 얻은 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 프라이머를 의미한다. 즉, 네스티드 프라이머는 첫 번째 타겟팅된 뉴클레오타이드 서열 내 뉴클레오타이드 서열로부터 유래되고, 상기 첫 번째 타겟팅된 뉴클레오타이드 서열 내에 포함되어 있는 보다 좁은 두 번째 타겟팅된 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치(flanking)한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “앰플리콘의 내부 서열”은 앰플리콘의 서열로서 최소 하나의 뉴클레오타이드 만큼이라도 내부에 위치하는 서열을 의미한다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 단계 (c)가 실시되는 경우, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안, 최소 3 종의 프라이머 쌍의 각각의 쌍은 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 최소 하나의 네스티드 프라이머를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 사용되는 프라이머가 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 경우, 상기 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화되는 네스티드 프라이머이다.
본 발명에서, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 전-증폭된 산물을 이용하기 때문에, 표지 네스티드 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생된 위양성 시그널 없이 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 발생된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에서 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널은 30 사이클 이내에 발생되며, 보다 바람직하게는 25 사이클 이내, 가장 바람직하게는 20 사이클 이내이다.
본 발명에서, 단계 (c)의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 오류 시그널은 발생시키지 않고 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널은 발생시키는 사이클 수로 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 30 사이클로 실시되며, 보다 바람직하게는 최대 25 사이클, 가장 바람직하게는 최대 20 사이클이다. 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 일반적으로 최소 2 사이클로 실시되며, 바람직하게는 최소 3 사이클, 가장 바람직하게는 최소 5 사이클이다.
본 발명에 따르면, 표지 네스티드 프라이머의 다이머 형성으로 인한 위양성 시그널이 발생하는 사이클 수(또는 Ct 값)는, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 주형 없이 표지 네스티드 프라이머를 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1차 멀티플렉스 증폭 PCR의 산물은 최소 하나의 개별 용기로 분주될 수 있고, 각각의 용기는 제2차 네스티드 멀티플렉스 PCR에서 최소 3 종의 다른 타겟 핵산의 검출에 이용한다. 예를 들면, 10 프라이머 쌍으로 10 종의 다른 타겟 핵산을 증폭시키기 위하여 일차 10-플렉스(plex) PCR을 실시하고, 증폭산물을 3 개의 다른 용기에 분주한 후, 각각의 용기는 실시간 방식으로 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 서브타이핑(subtyping), 그룹핑(grouping) 또는 동정(identification)에 이용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 3 종의 프라이머 쌍의 표지는 서로 상이하거나 또는 동일하다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 최소 3 종의 프라이머 쌍의 각각의 쌍의 표지는 서로 상이하거나 또는 동일하다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “프라이머의 표지는 서로 상이하다”는 (ⅰ) 프라이머에 연결된 표지의 개수, 종류, 흡수 파장 또는 방출 파장 측면에서의 차이; 또는 (ⅱ) 프라이머에 연결된 표지의 시그널 발생 메카니즘의 차이(예컨대, 효소적 절단, 표지를 갖는 프라이머의 3차원적 구조 변화 또는 이중-가닥 PCR 산물로의 표지 프라이머의 삽입에 의한 시그널 발생)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “프라이머의 표지는 서로 동일하다”는 (ⅰ) 프라이머에 연결된 표지의 개수, 종류, 흡수 파장 또는 방출 파장 측면에서의 동일성; 및 (ⅱ) 프라이머에 연결된 표지의 시그널 발생 메카니즘의 동일성(예컨대, 효소적 절단, 표지를 갖는 프라이머의 3차원적 구조 변화 또는 이중-가닥 PCR 산물로의 표지 프라이머의 삽입에 의한 시그널 발생)을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 용어 “표지”는 최소 하나의 표지를 의미하는데 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표지 프라이머는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 포함한다.
바람직하게는, 표지는 타겟 핵산서열에 상보적인 위치(site)에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표지 프라이머는 타겟 핵산서열과의 혼성화 이전에 선형(linear) 구조 또는 분자간(intermolecular) 구조를 갖는다. 분자간 구조의 예로는 헤어핀-루프 또는 G-콰르텟(quartet)구조이다.
본 발명에 유용한 표지는 당업계에 알려진 어떠한 표지도 포함한다. 표지의 대부분은 단일 분자 또는 단일 원자(atom) 표지를 포함하고; 그러나 일부 표지(예컨대, 상호작용적 표지 시스템)는 최소 2 개 또는 그 이상의 표지 분자 또는 원자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프라이머에 연결된 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표지는 형광 표지이고, 바람직하게는 모노(mono) 형광 표지, 보다 바람직하게는 상호작용적 표지 시스템, 가장 바람직하게는 FRET 표지 시스템이다.
상호작용적 표지 시스템은 공여체 분자 및 수용체 분자 사이에 에너지가 비-방사능적(non-radioacively)으로 전달되는 시그널 발생 시스템이다. 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀칭 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다.
상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성, 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다.
보다 바람직하게는, 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의해 발생되고, 보다 더 바람직하게는 FRET 표지 시스템이다.
FRET 표지가 이용되는 경우, 리포터 분자의 형광을 퀀처 분자가 퀀칭되는 범위에서, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자의 위치는 다양해 질 수 있다. 예를 들어, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자는 5-50 뉴클레오타이드 이격될 수 있으며, 바람직하게는 5-40 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-30 뉴클레오타이드 이격될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표지 프라이머의 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 표지 프라이머의 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치한다. 예를 들어, 형광 리포터 분자는 표지 프라이머의 5’-말단에 위치하고, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터 5-50 뉴클레오타이드 이격된 곳에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표지 프라이머의 형광 리포터 분자는 표지 프라이머의 5’-말단 또는 5’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하며, 가장 바람직하게는 표지 프라이머의 5’-말단이다.
본 발명에 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 것도 포함한다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671) 및 Cy5.5 (694). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광 파장이다.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
표지 프라이머에 적용되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예컨대, 플루오레세인 색소 (fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 색소(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR용 최소 3 종의 프라이머 쌍은 타겟 핵산서열에 상보적인 서열을 포함하기만 한다면 어떠한 형태(form) 또는 구조도 가질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상술한 바와 같이 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR용 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍에서 최소 하나의 프라이머는 DPO 구조를 갖는다.
본 발명에서 유용한 표지 프라이머는 종래 실시간 PCR 과정에서 시그널을 발생시키기 위해 당업계에 알려진 어떠한 표지 프라이머도 포함한다. 그것들은 표지 프라이머의 종류에 따라 추가적인 구조적 특징을 포함하거나 또는 특이적 중합 조건을 필요로 할 수 있다.
표지 프라이머의 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: PlexorTM (Sherrill CB, 등, Journal of the American Chemical Society 126:4550-4556(2004)), Antiprimer (Jin Li 등, Clinical Chemistry 52:4 624633 (2006)), Individual dye-labeled oligonucleotides (미국 특허 제6,593,091호), LUXTM (I. A. Nazarenko, 등, Nucleic Acids Res, 30:2089-2095(2002); 미국 특허 제7,537,886호), TSG primer (한국 특허 제10-2009-0127880호), THD primer (국제 특허 제PCT/KR2009/007064호), Lion (미국 특허 제6,248,526호), Self-quenching signal primer (미국 특허 제 5,846,726호 및 제6,054,279호), Sunrise (I.A.Nazarenko, 등, Nucleic acids Research, 125(12):2516-2521(1997); Hernandez M et, al. J. cereal Sci, 39:99-107(2004), 미국 특허 제5,866,336호, 제6,090,552호 및 제6,117,635호) 및 Scorpions (David Whitcombe, 등, Nature Biotechnology, 17:804-807(1999) 및 유럽 특허 제1,088,102호).
표지 프라이머로서 PlexorTM (Sherrill CB 등, Journal of the American Chemical Society 126:4550-4556(2004))를 이용하는 경우, 퀀칭을 위하여 Dabcyl-iso-dGTP을 사용하는 것이 바람직하다.
표지 프라이머로서 안티프라이머(antiprimer)(Jin Li 등, Clinical Chemistry 52:4 624633 (2006))를 이용하는 경우, 프리(free) 프라이머를 퀀칭할 수 있는 안티프라이머가 추가적으로 사용하는 것이 바람직하다.
표지 프라이머로서 Individual dye-labeled oligonucleotides(미국 특허 제6,593,091호)를 이용하는 경우, 각각 단일 표지를 갖는 두 개의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
예시된 표지 프라이머 중 THD 프라이머 및 TSG 프라이머는 본 발명자가 발명한 것이다. 상기 프라이머와 관련하여 본 발명자들이 발견한 바에 따르면, 실시간 멀티플렉스 PCR 증폭에 있어서 THD 프라이머 또는 TSG 프라이머는 최소 3 종의 타겟 핵산서열이 검출되는 시그널을 성공적으로 발생시킨다. 또한, 본 발명자들은 THD 프라이머 또는 TSG 프라이머로부터 나오는 시그널이 프라이머의 구조적 변화 또는 5’-말단의 절단에 의해 발생된다는 놀라운 사실도 발견하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에 사용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 5’→3’뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3’→5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 이들의 조합이다. 바람직하게는, 주형-의존적 핵산 중합효소는 5’→3’뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 또는 이들의 조합이다.
프라이머 시그널링 과정에서, 최종적으로 검출되는 시그널은 바람직하게는, 이중-가닥 PCR 산물로의 표지 프라이머의 삽입, 표지 프라이머의 형태 변화 또는 표지 프라이머의 5’-말단의 절단에 의해 초래된다.
예를 들어, 표지 프라이머가 단일 표지를 갖는 경우, 그것이 이중-가닥 PCR 산물로 삽입될 때, 표지는 형광 강도 증가에 의하여 시그널을 제공한다.
표지 프라이머가 리포터 분자 및 퀀처 분자로 구성된 상호작용적 이중 표지 시스템을 갖고 타겟 핵산서열에 혼성화 되지 않는 경우, 퀀처 분자는 리포터 분자와 3 차원적으로 인접하여 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 퀀칭한다. 상호작용적 이중 표지 프라이머가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터 3 차원적으로 이격되어 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 더 이상 퀀칭하지 못한다. 상호작용적 이중 표지 프라이머의 형태 변화에 의하여, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 얻을 수 있다.
이러한 시그널 발생 과정에서, 표지 프라이머 시스템은 타겟 증폭뿐만 아니라 시그널 발생도 야기하며, 이는 표지 프로브 시스템과는 상이하다.
이중-가닥 PCR 산물로의 표지 프라이머의 삽입 또는 표지 프라이머의 형태 변화에 의하여 발생된 시그널로 타겟 핵산서열을 검출하는 경우, 5’→3’뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소를 이용할 수 있다.
5’→3’뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소의 예는 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다.
택일적으로, 본 발명자들의 이전 발견들에 따르면, 표지 프라이머가 리포터 분자 및 퀀처 분자로 구성된 상호작용적 표지 시스템을 갖는 경우, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소와 접촉함에 따라 그의 3’-말단은 연장되고 그의 5’-말단은 절단되며, 이후 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 방출되면서 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 발생한다. 이러한 표지 프라이머는“THD(Target hybridization Detection”프라이머로 명명된다. 상기 시그널 발생 전략에서, THD 프라이머는 타겟 증폭 및 시그널 발생을 수반하는 이중 기능을 갖는다.
표지 프라이머(예컨대, THD 프라이머) 5’-말단의 절단에 의하여 발생된 시그널로 타겟 핵산서열의 존재를 검출하는 경우, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소를 필요로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있으며 예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis , Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermus antranikianii , Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus를 포함한다. 가장 바람직하게는, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소이다.
3’→5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소를 사용하는 경우, 표지 프라이머는 그의 3’-말단 부위에 인위적 미스매치 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
미스매치 뉴클레오타이드(들)은 3’-말단 부위의 다양한 위치에 위치할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 미스매치 뉴클레오타이드는 프라이머의 3’-말단 또는 프라이머의 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하며, 보다 바람직하게는 프라이머의 3’-말단 또는 프라이머의 3’-말단으로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격된 위치, 보다 더욱 바람직하게는 프라이머의 3’-말단 또는 프라이머의 3’-말단으로부터 1 뉴클레오타이드 이격된 위치, 가장 바람직하게는 프라이머의 3’-말단이다.
미스매치 뉴클레오타이드의 수는 1-5 개이며, 바람직하게는 1-4 개, 보다 바람직하게는 1-3 개, 보다 더욱 바람직하게는 1-2 개, 가장 바람직하게는 1 개다. 프라이머가 최소 2 개의 미스매치 뉴클레오타이드가 있는 경우, 미스매치 뉴클레오타이드는 연속적 또는 불연속적으로 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프라이머의 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 프라이머의 3’-말단 또는 프라이머의 3’-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하며, 가장 바람직하게는 프라이머의 3’-말단이다. 프라이머가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자를 갖는 프라이머의 3’-말단은 3’→5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소에 의하여 절단되어 형광 분자 또는 퀀처 분자를 방출하고, 이에 의해 리포터 분자로부터 나오는 형광 시그널이 언퀀칭되어 타겟 핵산서열을 나타내는 형광 시그널을 얻는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 3’→ 5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있으며, Thermus filiformis, Thermis flavus , Thermococcus literalis , Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae, Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus, Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다. 가장 바람직하게는, 3’→ 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소는 Pfu DNA 중합효소이다.
최종적으로 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다. 시그널 검출은 반복의 각 사이클에서, 반복의 종료시점에서 또는 반복 동안 지정 시간 간격 각각에서 실시될 수 있다. 바람직하게는, 검출의 정확성을 향상시키기 위하여 반복의 각 사이클에서 시그널 검출이 실시될 수 있다.
각 표지에 대한 시그널은 종래 방법들에 의해서 검출되거나 또는 측정될 수 있다. 예를 들어, 형광 시그널은 종래 방법, 예컨대, 형광강도측정기를 이용하여 검출하거나 또는 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 다음을 포함하며, 위양성 시그널이 배제되는 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉스 PCR 검출 키트를 제공한다:
(a) 시료에서 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻기 위하여 상기 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 제1차 멀티플렉스 PCR에 이용되는 최소 3 종의 프라이머 쌍; 및
(b) 상기 앰플리콘의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 최소 3 종의 프라이머 쌍; 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각에서 최소 하나의 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이고, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍은, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 최소 하나의 네스티드 프라이머를 포함하고, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 오류 시그널은 발생되지 않고 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널은 발생되는 사이클 수로 실시될 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 네스티드 멀티플렉스 실시간 PCR 방법을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 키트는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
바람직하게는, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 30 사이클로 실시되며, 보다 바람직하게는 25 사이클, 가장 바람직하게는 20 사이클이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 사용되는 프라이머가 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 경우, 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화되는 네스티드 프라이머이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.
또한 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 표지 프라이머 (labeled primer)의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널의 배제
종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 복수의 표지 프라이머를 필요로 하여 위양성 시그널의 발생을 야기하는 다이머를 형성할 가능성이 높고, 이는 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 심각한 단점 및 한계로 여겨진다. 반면, 본 발명의 방법은 전-증폭된 산물, 표지 네스티드 프라이머(labeled nested priemr) 및 사이클 수의 조절을 이용하여, 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널을 근본적으로 배제한다.
(b) 음성 대조군에서의 위양성 시그널의 배제
종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 복수의 표지 프라이머의 다이머 형성 때문에, 주형이 없는 음성 대조군에서도 위양성 시그널이 나타나는 문제를 갖는다. 그러나, 본 발명은 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생된 위양성 시그널을 완벽하게 배제함으로써, 주형이 없는 음성 대조군에서의 이러한 위양성 시그널 문제를 방지한다.
(c) 비-타겟 서열과 표지 프라이머의 비-특이적 혼성화에 의하여 발생된 위양성 시그널의 배제
당업계에 알려진 일반적인 지식에 따르면, 멀티플렉스 타겟 검출에 있어서 표지 프라이머는 비-타겟 핵산서열과 바-특이적으로 혼성화 될 가능성이 높아 위양성 시그널이 발생된다. 본 발명의 방법에서는, 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 네스티드 프라이머로서 표지 프라이머를 이용하기 때문에 종래 네스티드 PCR과 유사한 효과가 나타나므로 본 발명의 타겟 특이성이 매우 높게 증가하여 비-특이적 혼성화에 의한 위양성 시그널의 발생을 방지한다.
(d) 매우 적은 양의 타겟 서열 검출에서의 위양성 시그널의 배제
매우 적은 양의 타겟 서열의 존재는 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에서는 음성으로 분석될 수 있다. 그러나, 본 발명의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 전-증폭된 산물을 이용하여 실시되기 때문에, 본 발명의 방법으로는 매우 적은 양의 타겟 서열을 검출할 수 있으며 위음성 시그널도 방지하게 된다.
(e) 상기 서술한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 DPO 구조를 갖는 프라이머는 결합 특이성의 향상을 초래하며, 이에 의해 멀티플렉스 PCR에서 프라이머의 비-타겟 결합과 관련된 위양성 시그널을 배제한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
도 1은 제1차 멀티플렉스 PCR 및 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR과 관련된 본 발명을 도식적으로 보여준다. 패널 A는 제1차 멀티플렉스 PCR을 의미한다. 정방향 및 역방향 프라이머는 타겟 핵산서열과 혼성화 되어 연장된다. 변성, 어닐링 및 연장을 포함한 PCR 사이클을 반복함으로써 복수의 타겟 핵산서열이 증폭된다. 제1차 멀티플렉스 PCR용 프라이머는 당업계에 알려진 어떠한 유형 또는 구조(예컨대, DPO (dual priming olgionucleotide) 구조 및 종래 구조)도 가질 수 있다. 패널 B는 표지 네스티드 프라이머를 이용한 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 나타낸다. 최소 하나의 표지를 갖는 정방향 및 역방향 프라이머 중 최소 하나는 제1차 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 해당 엠플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이다. 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 이용할 수 있는 대표적인 프라이머로는 단일 표지 또는 이중 표지 시스템을 갖는 TSG 프라이머, THD 프라이머, 스콜피온, 선라이즈, 럭스, 플렉서 및 안티프라이머가 포함된다. 표지 네스티드 프라이머를 이용하는 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은, 타겟 시그널은 발생시키나 위양성 시그널은 발생시키지 않는 정도로 반응 사이클을 실시함으로써, 표지 프라이머의 다이머 형성에 의한 위양성 시그널이 배제되도록 하여, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 만족스런 시그널을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 PCR 타겟 특이성 및 민감도가 향상되도록 한다.
도 2는 C. trachomatis , N. gonorrhoeae 및 T. vaginalis 검출용 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시한 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 결과를 보여준다. 종래 방법은 표지 프라이머의 다이머 형성으로 인한 위양성 시그널을 발생시켰다.
도 3은 C. trachomatis , N. gonorrhoeae 및 T. vaginalis 검출용 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시한 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 결과를 보여준다. 결과들은 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 30 사이클 실시함으로써 위양성 시그널이 배제된, 타겟 핵산의 존재를 나타내는 양성 시그널이 얻어진다는 것을 보여준다.
도 4는 H. ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2 검출용 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시한 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 결과를 보여준다. 종래 방법은 표지 프라이머의 다이머 형성으로 인한 위양성 시그널을 발생시켰다.
도 5는 H. ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2 검출용 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시한 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 결과를 보여준다. 결과들은 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 30 사이클 실시함으로써 위양성 시그널이 배제된, 타겟 핵산의 존재를 나타내는 양성 시그널이 얻어진다는 것을 보여준다.
도 6은 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 민감도 및 특이성을 보여주는 결과이다. 30 사이클로 실시한 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 H. ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2 검출용 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시하였다. 10-배씩 순차적으로 희석시킨 H. ducreyi의 지놈 DNA(1000 fg에서 1 fg까지)를 주형으로 이용하였다.
도 7은 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 민감도 및 특이성을 보여주는 결과이다. 30 사이클로 실시한 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 H. ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2 검출용 3 종의 프라이머 쌍을 이용하여 실시하였다. 10-배씩 순차적으로 희석시킨 Herpes simplex virus 1의 지놈 DNA(1000 fg에서 1 fg까지)를 주형으로 이용하였다.
도 8은 H. ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2의 검출을 위하여 실시한 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 결과를 보여준다. H. ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2의 지놈 DNA를 주형으로 이용하였다.
실시예
실시예 1: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae 및 Trichomonas vaginalis 에 대한 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널의 배제를 위한 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR의 효과
표지된 프라이머의 다이머 형성으로 인하여 발생되는 위양성 시그널을 배제하는 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법과 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법을 비교하여 실험하였다.
본 실험에서는, C. trachomatis, N. gonorrhoeae 및 T. vaginalis의 세 가지 다른 유형의 타겟 핵산의 검출을 위하여, 제1차 멀티플렉스 PCR용 프라이머 쌍 및 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR용 표지된 네스티드 프라이머를 디자인하였다.
제1차 멀티플렉스 PCR용 프라이머 쌍은 타겟 특이성을 향상시키기 위하여 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖도록 디자인하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위하여, 본 실시예에서는 타겟 시그널 발생용 표지 프라이머로서 이중 표지 프라이머를 이용하였다. 이중 표지 프라이머는 그의 5’-말단에 FAM, Alexa 532 또는 Alexa 647과 같은 형광 리포터 분자를 갖고, BHQI(Block Hole Quencher 1) 또는 BHQ2(Block Hole Quencher 2)와 같은 퀀처 분자를 갖는다. 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자는 18 또는 19 뉴클레오타이드 이격되어 있다. 이중 표지 프라이머는 제1차 멀티플렉스 PCR에 의하여 생성된 해당 앰플리콘의 내부 서열과 혼성화 될 수 있는 네스티드 프라이머이다. 이중 표지 네스티드 프라이머의 타겟 핵산서열과의 어닐링 및 연장은 형광 시그널의 발생을 초래한다. 제2차(secondary) 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위하여, 제1차 멀티플렉스 PCR에 이용된 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머와 함께 이중 표지 네스티드 프라이머를 이용하였다.
표지 네스티드 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생되는 위양성 시그널을 본 발명의 방법이 배제할 수 있는 지의 여부를 실험하기 위하여, 종래의 구조 또는 DPO 구조를 갖는 표지된 네스티드 프라이머의 조합을 이용하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 및 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 모두에 동일한 프라이머 쌍을 이용하였다.
위양성 시그널의 배제를 달성하는 본 발명의 특징을 설명하기 위하여, 한 종류의 주형(N. gonorrhoeae의 지놈 DNA)만을 이용하였다.
본 실시예에서 이용되는 프라이머 서열은 다음과 같다:
C. trachomatis에 대한 프라이머 셋트
CT_F: 5’-TGCAACGGGTTATTCACTCCCIIIIICATTGAAACT-3 (SEQ ID NO: 1)
CT_R: 5’-ACCCATACCACACCGCTTTCTIIIIIGCCTACACGT-3’ (SEQ ID NO: 2)
CT_DLP(18): 5’-[AminoC6 +Alexa532] CACCTTCTCGTACCAAAGC[BHQ1-dT]AGAA-3’ (SEQ ID NO: 3)
N. gonorrhoeae에 대한 프라이머 셋트
NG_F: 5’-CTATTTTTATGAGCCGGAACCGIIIIIAAGCGTGGGA-3’ (SEQ ID NO: 4)
NG_R: 5’-TTGAAGTTGTCGGGAAAGCCIIIIITTCTTGCAAC-3’ (SEQ ID NO: 5)
NG_DLP(18): 5’-[6-FAM]CCCCGTGCTTTTCCATCTT[BHQ1-dT]IIIIITTGCGGGT-3’ (SEQ ID NO: 6)
T. vaginalis에 대한 프라이머 셋트
TV_F: 5’-CCCAAAGGCTAACCGTGAGAIIIIIATCTCCCTCA-3’ (SEQ ID NO: 7)
TV_R: 5’-TCGGCTGTTGTGTTGAAAGCIIIIICACGCTCT-3’ (SEQ ID NO: 8)
TV_DLP(19): 5’-[AminoC6+Alexa647]TGATCTCACAGCCTGGATGG[BHQ2-dT]CA-3’ (SEQ ID NO: 9)
(I: 데옥시이노신)
종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
주형으로 N. gonorrhoeae의 지놈 DNA 1000 fg가 포함되거나 또는 포함되지 않는 2X QuantiTect 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(Qiagen)[11 mM MgCl2, QuantiTect 멀티플렉스 PCR 버퍼, HotstarTaq DNA 중합효소 및 dNTP 믹스] 10 ㎕ 및 각각의 프라이머(SEQ ID: 1, 3, 4, 6, 8 및 9) 5 pmole을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 종래 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 94℃에서 30 초, 55℃에서 60 초 및 72℃에서 10 초 과정을 40 사이클 실시하였다. 각 사이클의 어닐링 단계(55℃)에서 발생된 시그널을 검출하였다.
도 2의 패널 A에 나타난 바와 같이, 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 N. gonorrhoeae의 지놈 DNA만을 주형으로 이용하였음에도 불구하고, N. gonorrhoeae(NG)의 시그널(Ct 값: 33.31)뿐만 아니라 C. trachomatis (CT)의 시그널(Ct 값: 32.89)이 발생되었고, 이는 CT의 시그널이 위양성임을 나타낸다.
도 2의 패널 B에 나타난 바와 같이, 어떠한 주형도 없이 실시한 종래 실시간 멀티플렉스 PCR에서 NG(Ct 값: 33.43) 및 CT(Ct 값: 32.94) 모두로부터 시그널이 발생되었다. 이러한 결과는 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 위양성 시그널이 발생된다는 것을 나타낸다. 따라서, 패널 A의 위양성 시그널(CT)은 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생된 것임을 확인하였다.
또한, 비록 패널 A 및 B에서 시그널이 유사한 패턴으로 생성된 것이 관찰되었으나, 패널 A에서의 NG 시그널은 양성이지만, 패널 B에서의 NG 시그널은 위양성이다. 이러한 결과들은 양성 시그널 및 오류 시그널이 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법으로는 구별되지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
타겟 서열을 검출하기 위한 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 표지 프라이머의 다이머 형성으로 인한 위양성 시그널을 수반할 가능성이 매우 높으며, 이는 타겟 서열에 대한 오류 문제가 없는 검출 결과를 얻기 어렵게 한다.
본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
제1차 멀티플렉스 PCR
주형으로 N. gonorrhoeae의 지놈 DNA 1000 fg가 포함되거나 또는 포함되지 않는 2X 멀티플렉스 마스터 믹스(Qiagen)[6 mM MgCl2, HotstarTaq PCR 버퍼, HotstarTaq DNA 중합효소 및 dNTP 믹스] 10 ㎕ 및 각각의 프라이머(SEQ ID: 1, 2, 4, 5, 7 및 8) 5 pmole을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 제1차 멀티플렉스 PCR을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 열순환기(ABI9700, Applied BioSystems)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 94℃에서 30 초, 55℃에서 60 초 및 72℃에서 60 초 과정을 35 사이클 실시하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR
제1차 멀티플렉스 PCR산물 1 ㎕, 2X QuantiTect 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(Qiagen)[11 mM MgCl2, QuantiTect 멀티플렉스 PCR 버퍼, HotstarTaq DNA 중합효소 및 dNTP 믹스] 10 ㎕ 및 각각의 프라이머(SEQ ID: 1, 3, 4, 6, 8 및 9) 5 pmole을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 94℃에서 30 초, 55℃에서 60 초 및 72℃에서 10 초 과정을 30 사이클 실시하였다. 각 사이클의 어닐링 단계(55℃)에서 발생된 시그널을 검출하였다.
도 3의 패널 A에 나타난 바와 같이, N. gonorrhoeae(NG)을 주형으로 이용한 경우, 본 발명의 방법은 어떠한 위양성 시그널도 없이, N. gonorrhoeae(NG)의 타겟 시그널(Ct 값: 9.14)만을 나타냈다. 또한, 주형이 없는 음성 대조군에서는, 본 발명의 방법은 도 3의 패널 B에 나타난 바와 같이, 어떠한 위양성 시그널도 나타내지 않았다.
이러한 결과들은 본 발명의 방법이, 실시간 멀티플렉스 PCR 방식에 있어서 표지 프라이머의 다이머 형성에 의해 발생되는 위양성 시그널을 배제하여 타겟 핵산서열이 정확하게 검출되도록 한다는 것을 입증한다.
실시예 2: Haemophilus ducreyi , Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2에 대한 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생된 위양성 시그널의 배제를 위한 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR의 효과
본 발명의 재현성을 확인하기 위한 실험으로서, Haemophilus ducreyi, Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2의 3 종의 타겟 핵산서열을 이용하였다. 프라이머 서열 및 라벨링을 제외한, 프라이머의 디자인 및 실험 조건은 실시예 1과 동일한 방식이다. 이중 표지 프라이머는 그의 5’-말단에 Alexa 532, Alexa 594 또는 Alexa 647과 같은 형광 리포터 분자를 갖고, BHQI(Block Hole Quencher 1) 또는 BHQ2(Block Hole Quencher 2)와 같은 퀀처 분자를 갖는다. 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자는 18, 20 또는 21 뉴클레오타이드 이격되어 있다. Herpes simplex virus 1의 지놈 DNA 1000 fg를 주형으로 이용하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 및 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 모두에 동일한 프라이머 쌍을 이용하였다.
본 실시예에서 이용되는 프라이머 서열은 다음과 같다:
H. ducreyi에 대한 프라이머 셋트
HD_F: 5’-AAAGAACGTGAAAAAGCCGACCIIIIIAAAATTACTA-3’ (SEQ ID NO: 10)
HD_R: 5’-ATAGCCCAGAAGGGTTAGCAATIIIIIGACAATCAAT-3’ (SEQ ID NO: 11)
HD_DLP(20):5’-[AminoC6+Alexa532]CCTCGGCTGGTATTACGACTA[BHQ1-dT]CIIIIIAGCCTAGG-3’ (SEQ ID NO: 12)
Herpes simplex virus 1에 대한 프라이머 셋트
HSV1_F: 5’-GTCCTGGTGGTGCAACCGIIIIIAGTTCCGA-3’ (SEQ ID NO: 13)
HSV1_R: 5’-ATACGCACGGTCACCCCACIIIIITGTGAGACT-3’ (SEQ ID NO: 14)
HSV1_DLP(18):5’-[AminoC6+Alexa594]CAGCCGATTACGACGAGGA[BHQ2-dT]IIIIITGACGAGG-3’ (SEQ ID NO: 15)
Herpes simplex virus 2에 대한 프라이머 셋트
HSV2_F: 5’-GTCGTCTGCGCCAAATACGIIIIIGCAGACCC-3’ (SEQ ID NO: 16)
HSV2_R: 5’-CAGGCGATGGTCAGGTTGTIIIIITGCTTTCG-3’ (SEQ ID NO: 17)
HSV2_DLP(21):
5’-[AminoC6+Alexa647]CCGATCACTGTGTACTACGCAG[BHQ2-dT]IIIIIAACGTGCC-3’ (SEQ ID NO: 18)
(I: 데옥시이노신)
종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
프라이머(SEQ ID NO: 10, 12, 14, 15, 17 및 18) 및 주형(Herpes simplex virus 1)을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 종래 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
도 4의 패널 A에 나타난 바와 같이, 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법은 Herpes simplex virus 1(HSV1)의 지놈 DNA만을 주형으로 이용하였음에도 불구하고, Herpes simplex virus 1(HSV1)의 시그널(Ct 값: 33.50)뿐만 아니라 H. ducreyi(HD)(Ct 값: 38.24) 및 Herpes simplex virus 2(HSV2)의 시그널(Ct 값: 32.79)이 발생되었고, 이는 HD 및 HSV2의 시그널이 위양성임을 나타낸다.
도 4의 패널 B에 나타난 바와 같이, 어떠한 주형도 없이 실시한 종래 실시간 멀티플렉스 PCR은 HSV1(Ct 값: 34.52) 및 HSV2(Ct 값: 34.52) 모두로부터 시그널이 발생되었다. 이러한 결과는 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 위양성 시그널(HSV1 및 HSV2)이 발생된다는 것을 나타낸다.
따라서, 패널 A의 HSV2 위양성 시그널은 표지 프라이머의 다이머 형성에 의하여 발생된 것임을 나타내고, 패널 A의 HD 위양성 시그널은 표지 프라이머의 비-특이적 혼성화에 의하여 발생된 것임을 나타낸다.
또한, 패널 A 및 B의 HSV 1 및 HSV2 시그널은 타겟 주형의 존재 여부에 상관없이 발생하였다. 이러한 결과들은 양성 시그널 및 오류 시그널이 종래 실시간 멀티플렉스 PCR 방법으로는 구별되지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
제1차 멀티플렉스 PCR
프라이머(SEQ ID NO: 10, 11, 13, 14, 16 및 17) 및 주형(Herpes simplex virus 1)을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 제1차 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR
프라이머(SEQ ID NO: 10, 12, 14, 15, 17 및 18)를 제외하고, 실시예 1과 동일하게 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
도 5의 패널 A에 나타난 바와 같이, HSV1(Herpes simplex virus 1)을 주형으로 이용한 경우, 본 발명의 방법은 어떠한 위양성 시그널도 없이, HSV1(Herpes simplex virus 1)의 타겟 시그널(Ct 값: 7.99)만을 나타냈다. 또한, 주형이 없는 음성 대조군에서는, 본 발명의 방법은 도 5의 패널 B에 나타난 바와 같이, 어떠한 위양성 시그널도 나타내지 않았다.
이러한 결과들은 본 발명의 방법이, 실시간 멀티플렉스 PCR 방식에 있어서 표지 프라이머의 다이머 형성에 의해 발생된 위양성 시그널을 배제시켜 타겟 핵산서열이 정확하게 검출되도록 한다는 것을 입증한다.
실시예 3: 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에서의 민감도 및 특이성
H. ducreyi , Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2를 검출하기 위한 3 종의 프라이머 쌍의 존재 하에, H. ducreyi 또는 Herpes simplex virus 1의 지놈 DNA를 검출함으로써 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에서의 민감도 및 특이성을 확인하였다.
실시예 2에 서술된 것과 동일한 프라이머 쌍을 이용하였고, 순차적으로 희석시킨 H. ducreyi 또는 Herpes simplex virus 1의 지놈 DNA를 주형으로 이용하였다.
제1차 멀티플렉스 PCR
순차적으로 희석된 H. ducreyi 또는 Herpes simplex virus 1의 지놈 DNA(1000 fg, 100 fg, 10 fg 또는 1 fg), 2X 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(Qiagen)[6 mM MgCl2, HotstarTaq PCR 버퍼, HotstarTaq DNA 중합효소 및 dNTP 믹스] 10 ㎕ 및 각각의 프라이머(SEQ ID: 10, 11, 13, 14, 16 및 17) 5 pmole을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 제1차 멀티플렉스 PCR을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 열순환기(ABI9700, Applied BioSystems)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 94℃에서 30 초, 55℃에서 60 초 및 72℃에서 60 초 과정을 35 사이클 실시하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR
제1차 멀티플렉스 PCR산물 1 ㎕, 2X QuantiTect 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(Qiagen)[11 mM MgCl2, QuantiTect 멀티플렉스 PCR 버퍼, HotstarTaq DNA 중합효소 및 dNTP 믹스] 10 ㎕ 및 각각의 프라이머(SEQ ID: 10, 12, 14, 15, 17 및 18) 5 pmole을 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하였다; 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다; 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 94℃에서 30 초, 55℃에서 60 초 및 72℃에서 10 초 과정을 30 사이클 실시하였다. 각 사이클의 어닐링 단계(55℃)에서 발생된 시그널을 검출하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, H. ducreyi의 타겟 핵산서열을 성공적으로 검출하여 본 방법의 특이성 및 민감도를 확인하였다.
H. ducreyi(HD), HSV1(Herpes simplex virus 1) 및 HSV2(Herpes simplex virus 2)의 동시적 검출을 위하여 제2차 실시간 멀티플렉스 PCR 반응 혼합물에 세 가지 다른 표지 프라이머를 이용하였음에도 불구하고, HSV1 및 HSV2의 어떠한 시그널도 없이 HD의 타겟 시그널만이 검출되었고, 이는 본 방법의 타겟 특이성을 보여준다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법은 10 fg의 H. ducreyi 지놈 DNA까지 검출할 수 있다.
도 7은 Herpes simplex virus 1의 타겟 핵산서열을 검출함으로써 본 발명의 특이성 및 민감도를 확인한 또 다른 실시예를 나타낸다.
H. ducreyi(HD), HSV1(Herpes simplex virus 1) 및 HSV2(Herpes simplex virus 2)의 동시적 검출을 위하여 제2차 실시간 멀티플렉스 PCR 반응 혼합물에 세 가지 다른 표지 프라이머를 이용하였음에도 불구하고, HD 및 HSV2의 어떠한 시그널도 없이 HSV1의 타겟 시그널만이 검출되었고, 이는 본 방법의 타겟 특이성을 보여준다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 본 실시예는 본 발명의 방법이 10 fg의 Herpes simplex virus 1 지놈 DNA까지 검출함을 보여준다.
종합하면, 본 발명의 방법은 실시간 멀티플렉스 방식에 있어서 향상된 민감도 및 특이성으로 타겟 서열을 검출할 수 있다.
실시예 4: 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 방법을 이용한 복수의 타겟 검출
최소 3 종의 다른 타겟 핵산서열이, 본 발명의 방법에 의하여 실시간 방식으로 동시적 검출될 수 있는 지 여부를 실험하기 위하여, H. ducreyi , Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2의 혼합 지놈 DNA를 주형으로 이용하고 실시예 2에 이용된 것과 동일한 프라이머 쌍을 이용하였다.
제1차 멀티플렉스 PCR
주형(H. ducreyi , Herpes simplex virus 1 및 Herpes simplex virus 2의 지놈 DNA 각각 1000 fg)을 제외하고, 실시예 2와 동일하게 제1차 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR
실시예 2와 동일하게 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 H.ducreyi(HD)(Ct; 4.61), Herpes simplex virus 1(HSV1)(Ct; 2.80) 및 Herpes simplex virus 2(HSV2)(Ct; 7.39)의 존재에 대한 3 종의 다른 타겟 시그널을 동시적으로 검출하였다. 주형이 없는 음성 대조군에서는, 어떠한 위양성 시그널도 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명은 실시간 멀티플렉스 방식에 있어서 위양성 시그널을 배제하여 최소 3 종의 다른 타겟 핵산서열이 동시적으로 검출되도록 한다는 것을 입증한다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였으며, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다는 것은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 잘 인식된다.
<110> Seegene, Inc. <120> REAL-TIME MULTIPLEXING DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES WITH ELIMINATION OF FALSE SIGNALS <150> KR10-2009-0130604 <151> 2009-12-24 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 tgcaacgggt tattcactcc cnnnnncatt gaaact 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 acccatacca caccgctttc tnnnnngcct acacgt 36 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 caccttctcg taccaaagct agaa 24 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 ctatttttat gagccggaac cgnnnnnaag cgtggga 37 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 ttgaagttgt cgggaaagcc nnnnnttctt gcaac 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 ccccgtgctt ttccatcttt nnnnnttgcg ggt 33 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 cccaaaggct aaccgtgaga nnnnnatctc cctca 35 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 tcggctgttg tgttgaaagc nnnnncacgc tct 33 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 tgatctcaca gcctggatgg tca 23 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 aaagaacgtg aaaaagccga ccnnnnnaaa attacta 37 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 11 atagcccaga agggttagca atnnnnngac aatcaat 37 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 12 cctcggctgg tattacgact atcnnnnnag cctagg 36 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n denotes deoxyinosine <400> 13 gtcctggtgg tgcaaccgnn nnnagttccg a 31 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 14 atacgcacgg tcaccccacn nnnntgtgag act 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 15 cagccgatta cgacgaggat nnnnntgacg agg 33 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 16 gtcgtctgcg ccaaatacgn nnnngcagac cc 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 17 caggcgatgg tcaggttgtn nnnntgcttt cg 32 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 18 ccgatcactg tgtactacgc agtnnnnnaa cgtgcc 36

Claims (27)

  1. 다음의 단계를 포함하며, 실시간 멀티플렉스 PCR(real-time multiplex Polymerase Chain Reaction)에서 오류 시그널이 배제되는 시료 내 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출방법:
    (a) 반응 용기에서 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 제1차 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계로서, 상기 제1차 멀티플렉스 PCR은 상기 시료에서 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻기 위하여 최소 3 종의 타겟 핵산서열을 증폭할 수 있는 조건 하에서 최소 3 종의 프라이머 쌍 및 주형-의존적 핵산중합효소를 이용하여 실시되고;
    (b) 상기 단계 (a)에 사용된 반응 용기와 다른 반응 용기에서 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 반응 혼합물을 준비하는 단계로서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 반응 혼합물은 (i) 상기 단계 (a)에서 얻은 앰플리콘, (ii) 상기 앰플리콘의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 최소 3 종의 프라이머 쌍; 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍에서 최소 하나의 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이고, 그리고 (ⅲ) 주형-의존적 핵산 중합효소를 포함하며, 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍은, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 최소 하나의 네스티드 프라이머를 포함하고;
    (c) 상기 단계 (b)의 상기 반응 혼합물을 이용하여 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성을 최소 2 사이클 실시하여 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계로서, 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 상기 시그널은 사이클 동안 상기 표지 프라이머 각각으로부터 발생되며, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 오류 시그널은 발생되지 않고 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널은 발생되는 사이클 수로 실시될 수 있고; 그리고
    (d) 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 검출은 단계 (c)의 상기 반복의 각 사이클에서, 단계 (c)의 상기 반복의 종료시점에서 또는 단계 (c)의 상기 반복 동안 지정 시간 간격 각각에서 실시되며, 이에 의해 상기 타겟 핵산서열을 나타내는 상기 시그널은 오류 시그널 없이 실시간 방식으로 얻어진다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 30 사이클로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 25 사이클로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 20 사이클로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 사용되는 상기 프라이머가 상기 표지를 갖는 경우, 상기 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍의 상기 표지는 서로 상이하거나 또는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍의 상기 표지는 서로 상이하거나 또는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 표지 프라이머는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 표지는 상기 타겟 핵산서열에 대해 상보적인 상기 프라이머의 서열에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 금속 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 상호작용적 이중 표지는 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 제1차 멀티플렉스 PCR 또는 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 중 최소 하나의 프라이머는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 타겟 서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고; Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Zr은 타겟 서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위(3’-second priming portion)이고; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 타겟 핵산에 대한 어닐링 측면에서 상기 5’-제1차 프라이밍 부위가 상기 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 상기 어닐링 특이성이 상기 5’-제1차 프라이밍 부위 및 상기 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 상기 프라이머의 전체 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  13. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)의 상기 주형-의존적 핵산 중합효소는 5’→3’뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3’→5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 5’→3’뉴클레아제 활성과 3’→5’엑소뉴클레아제 활성 모두를 갖는 핵산 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 다음을 포함하며, 위양성 시그널이 배제되는 시료 내 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉스 PCR(real-time multiplex PCR) 검출 키트:
    (a) 시료에서 상기 타겟 핵산서열의 앰플리콘을 얻기 위하여, 상기 최소 3 종의 타겟 핵산서열의 제1차 멀티플렉스 PCR에 이용되는 최소 3 종의 프라이머 쌍; 및
    (b) 상기 앰플리콘의 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 최소 3 종의 프라이머 쌍; 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍에서 최소 하나의 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머이고, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR 동안 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍은, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생하는 표지를 갖는 최소 하나의 네스티드 프라이머를 포함하고, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 오류 시그널은 발생되지 않고 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널은 발생되는 사이클 수로 실시될 수 있다.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 키트는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 30 사이클로 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 25 사이클로 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR은 최대 20 사이클로 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 14 항에 있어서, 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR에 사용되는 상기 프라이머가 상기 표지를 갖는 경우, 상기 프라이머는 해당 앰플리콘의 내부 서열에 혼성화 되는 네스티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍의 상기 표지는 서로 상이하거나 또는 동일한 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 최소 3 종의 프라이머 쌍 각각의 쌍의 상기 표지는 서로 상이하거나 또는 동일한 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 표지 프라이머는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 표지는 상기 타겟 핵산서열에 대해 상보적인 상기 프라이머의 서열에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 금속 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 상호작용적 이중 표지는 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 14 항에 있어서, 상기 제1차 멀티플렉스 PCR 또는 상기 제2차 네스티드 실시간 멀티플렉스 PCR을 위한 최소 3 종의 프라이머 쌍 중 최소 하나의 프라이머는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 키트:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 타겟 서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고; Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Zr은 타겟 서열과 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위(3’-second priming portion)이고; p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고; 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고; 상기 분할 부위는 타겟 핵산에 대한 어닐링 측면에서 상기 5’-제1차 프라이밍 부위가 상기 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드의 상기 어닐링 특이성이 상기 5’-제1차 프라이밍 부위 및 상기 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 상기 프라이머의 전체 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  27. 제 15 항에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소는 5’→3’뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소, 5’→3’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3’→5’엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 5’→3’뉴클레아제 활성과 3’→5’엑소뉴클레아제 활성 모두를 갖는 핵산 중합효소인 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020127019048A 2009-12-24 2010-03-15 오류 시그널이 배제되는 타겟 핵산서열의 실시간 멀티플렉싱 검출 KR101552669B1 (ko)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017201239A1 (en) * 2016-05-18 2017-11-23 Integrated Nano-Technologies, Inc. Method for detection of a pcr product
KR20180085061A (ko) * 2015-12-15 2018-07-25 주식회사 씨젠 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출
WO2022014867A1 (ko) * 2020-07-15 2022-01-20 다이아프로브(주) 위양성 발생을 방지하기 위한 양성대조군 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응
WO2022045843A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Seegene, Inc. Method for positive control reaction using pre-positive control composition

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2541710T3 (es) * 2009-11-03 2015-07-23 Sva Statens Veterinärmedicinska Anstalt Procedimiento de genotipado
EP3286329B1 (en) * 2015-04-23 2019-10-30 PathoFinder B.V. Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
CN105256055B (zh) * 2015-11-13 2019-02-05 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局 基于dpo引物的实时荧光pcr检测植物乳杆菌的方法、引物及试剂盒
KR101785687B1 (ko) * 2016-07-20 2017-10-17 (주)다이오진 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법
EP3562958B1 (en) * 2016-12-29 2021-11-03 Seegene, Inc. Method for reducing primer dimer formation and increasing amplification efficiency
JPWO2022054715A1 (ko) 2020-09-11 2022-03-17

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989001050A1 (en) * 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5652106A (en) * 1993-06-04 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Rapid amplification-based subtyping of mycobacterium tuberculosis
GB9514325D0 (en) * 1995-07-13 1995-09-13 Royal Free Hosp School Med Detection and quantification of human herpes virus 7 by enzymic amplification
US5770368A (en) * 1996-05-09 1998-06-23 Metropolitan Water District Of Southern California Cryptosporidium detection method
US5858673A (en) * 1996-06-24 1999-01-12 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method for detecting prostate cells
US6117635A (en) * 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
GB9812768D0 (en) * 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US9261460B2 (en) * 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
DE10164819A1 (de) * 2001-11-20 2005-05-19 Deml, Ludwig, Dr. Verfahren zur Identifizierung von Zielepitopen der T-Zell-vermittelten Immunantwort und zum Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen
CA2507240C (en) * 2002-12-06 2011-05-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Multiplex assay detection of pathogenic organisms
ATE550099T1 (de) * 2003-04-04 2012-04-15 Hoffmann La Roche Verbessertes system für mehrfarbige echtzeit-pcr
US20050233314A1 (en) * 2003-06-30 2005-10-20 National Health Research Institutes Sensitive and quantitative detection of pathogens by real-time nested PCR
WO2005051967A2 (en) * 2003-11-19 2005-06-09 Allelogic Biosciences Corp. Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores
RU2007108303A (ru) * 2004-08-06 2008-09-20 Дженомадрид С.А. (Es) СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ in vitro ДНК ВИЧ ПРИ ПОМОЩИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР
KR100977186B1 (ko) * 2005-03-05 2010-08-23 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중특이성 올리고뉴클레오타이드
WO2008143367A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Seegene, Inc. Haplotyping method by multiplex amplification
EP2171099A1 (en) * 2007-06-20 2010-04-07 Taag-Genetics SA Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities
WO2009035177A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Seegene, Inc. Genotyping of human papilloma viruses by multiplex amplification and size differentiation
EP2294076B1 (en) * 2008-05-27 2017-03-08 TriLink BioTechnologies Chemically modified nucleoside 5'-triphosphates for thermally initiated replication of nucleic acid
KR20110050327A (ko) * 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180085061A (ko) * 2015-12-15 2018-07-25 주식회사 씨젠 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출
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WO2022014867A1 (ko) * 2020-07-15 2022-01-20 다이아프로브(주) 위양성 발생을 방지하기 위한 양성대조군 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응
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