KR20120107000A - Interferon analogs - Google Patents

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KR20120107000A
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xaa
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analog
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KR1020127020081A
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크라스 포엘스트라
자이 프라카시
엘레오노라 벨자르스
루치 반살
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바이오리온 테크놀러지스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 의료 분야에 관한 것이다. 그 밖의 다른 것들 중에서, 이는 더 적은 원하지 않는 부작용을 나타내는 인터페론(interferons, IFNs)의 생물학적으로 유효한 유사체 및 이의 치료상의 용도에 관한 것이다. IFN 유사체를 제공하고, 이의 천연 수용체에 결합을 조절하는 모이어티(moiety)는 적어도 기능적으로 교란되고, 상기 유사체는 세포내 IFN 활성도를 조절할 수 있는 신호전달 모이어티(signaling moiety)를 포함하고, 상기 신호전달 모이어티는 이의 N-말단에, 선택적으로 링커를 통해, 상기 IFN 수용체 외에 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 타겟팅 도메인과 함께 제공된다. The present invention relates to the medical field. Among other things, this relates to biologically effective analogs of interferons (IFNs) that exhibit fewer unwanted side effects and their therapeutic uses. Moieties that provide for IFN analogs and modulate binding to their natural receptors are at least functionally disturbed, and the analogs include signaling moieties capable of modulating intracellular IFN activity, and The signaling moiety is provided at its N-terminus with at least one targeting domain capable of binding to cell surface receptors in addition to the IFN receptor, optionally via a linker.

Description

인터페론 유사체{INTERFERON ANALOGS}Interferon analogues {INTERFERON ANALOGS}

본 발명은 의료 분야에 관한 것이다. 그 밖의 다른 것들 중에서, 이는 더 적은 원하지 않는 부작용을 나타내는 인터페론(interferons, IFNs)의 생물학적으로 유효한 유사체 및 이의 치료상의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to the medical field. Among other things, this relates to biologically effective analogs of interferons (IFNs) that exhibit fewer unwanted side effects and their therapeutic uses.

약 10 가지 분명한 IFNs 는 포유동물에서 확인된다; 이들 중 7 가지는 인간에서 형성된다. 이들은 3 가지의 IFN 클래스(classes) 중으로 일반적으로 분리된다: 타입 I IFN, 타입 II IFN, 및 타입 III IFN. 모든 타입 I IFNs는 IFNAR1 및 IFNAR2 사슬(chains)로 이루어진 IFN-α 수용체(IFNAR)로서 알려진 특정한 세포 표면 수용체 복합체에 결합한다. 인간에 존재하는 타입 Ⅰ 인터페론은 IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω 이다. 인터페론 타입 II 는 IFNGR에 결합한다. 인간에서, 이는 IFN-γ이다. 이들의 특정한 세포 표면 수용체와 상호 작용함으로써, IFNs 는 신호 전달 인자(signal transducer) 및 전사의 활성인자(signal transducer and activator of transcription, STAT) 복합체를 활성화시킨다; STATs 는 특정한 면역계 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자(transcription factors)의 패밀리(family)이다. 몇몇 STATs 는 타입 I 및 타입 II IFNs 에 의해 활성화된다. 그러나, IFN 타입 각각은 유일한 STATs를 또한 활성화시킬 수 있다(Platanias, L. C. 2005 Nature reviews. Immunology 5 (5): 375-386).
About 10 distinct IFNs are identified in mammals; Seven of these are formed in humans. These are generally separated into three IFN classes: Type I IFN, Type II IFN, and Type III IFN. All type I IFNs bind to specific cell surface receptor complexes known as IFN-α receptors (IFNARs) consisting of IFNAR1 and IFNAR2 chains. Type I interferons present in humans are IFN-α, IFN-β and IFN-ω. Interferon type II binds to IFNGR. In humans, this is IFN-γ. By interacting with their specific cell surface receptors, IFNs activate signal transducer and activator of transcription (STAT) complexes; STATs are a family of transcription factors that regulate the expression of certain immune system genes. Some STATs are activated by type I and type II IFNs. However, each of the IFN types can also activate unique STATs (Platanias, LC 2005 Nature reviews. Immunology 5 (5): 375-386).

모든 IFN 클래스에 속하는 IFNs는 바이러스 감염과 싸우기 위해 매우 중요하다. 이들은 숙주 세포 내에서 바이러스성 복제를 "간섭(interfere)"하는 이들의 능력을 따서 명명하긴 하지만, IFNs 는 그 밖의 기능을 갖는다: 이들은 천연의 킬러세포(natural killer cells) 및 대식세포와 같은 면역 세포를 활성화시킨다; 이들은 T 림프구에 대한 항원 제시(antigen presentation to T lymphocytes)를 상향-조절함으로써(by up-regulating) 감염(infection) 또는 종양 세포의 인지를 증가시킨다; 및 이들은 바이러스에 의한 새로운 감염을 저항하도록 감염되지 않는 숙주 세포의 능력을 증가시킨다. 아픈 근육(aching muscles) 및 열과 같은, 특정한 숙주 증상은 감염 동안에 IFNs의 생산과 관련된 것이다.
IFNs belonging to all IFN classes are very important to fight viral infections. Although they are named after their ability to "interfere" viral replication in host cells, IFNs have other functions: they are immune cells, such as natural killer cells and macrophages. Activates; They increase infection or tumor cell perception by up-regulating antigen presentation to T lymphocytes; And they increase the ability of uninfected hosts cells to resist new infections by viruses. Certain host symptoms, such as aching muscles and fever, are associated with the production of IFNs during infection.

IFNγ는 활성된 면역 세포에 의해 생산된 다면발현 사이토카인(pleiotropic cytokine)이다. 이는 모든 세포 타입에서 거의 발현된 IFNγ 수용체를 통해 작용하지만, 이는 엄격한 종 특이성을 나타낸다. IFNγ는 현저한 효과를 갖는 면역학적, 바이러스성 및 암 질병(Younes and Amsden, J Pharm Sci 2002)의 치료에 적용된다. 게다가, 몇몇의 연구는 신장 및 간 섬유증에서 IFNγ의 잠재적인 역할을 입증하였다(Kidney Int. 1999 ;56:2116-27, Hepatology 1996 23:1189-99).
IFNγ is a pleiotropic cytokine produced by activated immune cells. It acts through almost expressed IFNγ receptors in all cell types, but this shows stringent species specificity. IFNγ is applied to the treatment of immunological, viral and cancer diseases (Younes and Amsden, J Pharm Sci 2002) with significant effects. In addition, several studies have demonstrated the potential role of IFNγ in renal and hepatic fibrosis (Kidney Int. 1999; 56: 2116-27, Hepatology 1996 23: 1189-99).

불행하게도, 현재 이용할 수 있는 인터페론의 짧은 순환 반감기 및 원하지 않는 전신성 부작용(undesirable systemic side effects)은 이의 임상적인 적용을 제한하고 임상 실험조차도 중지된다. 예를 들어 리포좀(liposomes), 마이이크로스페어(microspheres) 및 엘라스토머(elastomers) 내로 IFNγ를 포함시킴으로써 이러한 문제를 피하도록 많은 시도가 이루어졌다(Pharm Res. 2000 17 :42-8, Pharm Res. 1996 13:1464-75, J Control Release. 2005 102:607-17). 세포-특이적인 수송 접근(Cell-specific delivery approaches)은 지금까지 사용되지 않았다. 이러한 접근은, 이들은 항상 이러한 수용체가 발현된 타겟 세포에 그치게 되도록(so that they always end up in target cells that express these receptors), 생물학적 효과를 끌어내도록 이들 자신의 수용체에 수송하는데 필요한 사이토카인을 일반적으로 불가능하게 간주되는 사실을 고려하여 놀랍지 않다. 그 밖의 타겟 수용체로의 수송은 따라서 대부분의 경우에 소용이 없을 것이고, 기껏 잘해야 활성도의 손실을 야기하는 그 밖의 세포 유형에서 흡수 또는 추가적인 부작용의 다양성을 유도할 것이다.
Unfortunately, the currently available short circulating half-lives and undesirable systemic side effects of interferon limit its clinical application and even stop clinical trials. Many attempts have been made to avoid this problem, for example by including IFNγ in liposomes, microspheres and elastomers (Pharm Res. 2000 17: 42-8, Pharm Res. 1996 13 : 1464-75, J Control Release. 2005 102: 607-17). Cell-specific delivery approaches have not been used to date. This approach generally requires the transport of cytokines necessary to transport their own receptors to elicit biological effects, so that they always end up in target cells that express these receptors. Not surprising, given the fact that it is considered impossible. Transport to other target receptors will therefore be useless in most cases and will at best lead to a variety of uptake or additional side effects in other cell types that cause loss of activity.

그러나, 상기 분자가 종-특이적(species-specific)인 수용체 결합 모이어티(receptor binding moiety) 및 비-종 특이적이고 세포 내에 작용하는 신호전달 모이어티(signalling moiety)을 포함하기 때문에, INF의 구조가 유일한 타겟팅 기회를 제공함을, 본 발명자는 인지하였다. 이러한 새로운 타겟 수용체가 이러한 신호전달 모이어티의 세포내 방출 및 그 다음의 세포내/핵 INFγ 신호전달 경로의 활성화를 가능하게 한다면, IFNγ의 유일한 구조가 다른 타겟 수용체에 대한 INFγ의 신호전달 모이어티의 수송을 가능하게 함을 놀랍게도 발견하였다. 예를 들어, 전장 IFNγ 또는 비-타겟된 IFNγ 모방체(non-targeted IFNg mimetic)와 비교하였을 때, 혈소판 유래 증식 인자(Platelet Derived Growth Factor, PDGF) 수용체를 타겟하는(targeted) 절단된 IFNγ 모방체(truncated IFNγ mimetic)는 급성 간 손상 마우스 모델에서 현저하게 보다 적은 전신적인 부작용을 나타낸다.
However, because the molecule contains species-specific receptor binding moieties and non-species specific, intracellular signaling moieties, the structure of the INF The inventors have recognized that provides a unique targeting opportunity. If these new target receptors enable intracellular release of these signaling moieties and subsequent activation of intracellular / nuclear INFγ signaling pathways, the only structure of IFNγ is the signaling moiety of INFγ for other target receptors. It was surprisingly found to enable transportation. For example, truncated IFNγ mimetics that target platelet-derived growth factor (PDGF) receptors when compared to full-length IFNγ or non-targeted IFNg mimetic (truncated IFNγ mimetic) exhibits significantly less systemic side effects in acute liver injury mouse model.

이에 맞춰, 본 발명은 인터페론(IFN)의 유사체에 관한 것으로서, 이의 천연 수용체에 결합을 조절하는 상기 모이어티(the moiety mediating binding to its natural receptor)는 적어도 기능적으로 교란되고, 상기 유사체는 세포내 IFN 활성도를 조절할 수 있는 신호전달 모이어티를 포함하고, 상기 신호전달 모이어티는 이의 N-말단에, 선택적으로 링커를 통해, IFN 수용체 외의 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 타겟팅 도메인과 함께 제공된다. 바람직하게, 상기 유사체는 IFN 감마(IFNγ) 유사체이다.
Accordingly, the present invention relates to analogs of interferon (IFN), wherein the moiety mediating binding to its natural receptor, which modulates binding to its natural receptor, is at least functionally disturbed and the analog is intracellular IFN. A signaling moiety capable of modulating activity, said signaling moiety provided with at least one targeting domain capable of binding to its N-terminus, optionally via a linker, cell surface receptors other than IFN receptors do. Preferably, the analog is an IFN gamma (IFNγ) analog.

이형 타겟팅 모이어티(heterologous targeting moiety)가 제공된 인터페론 유사체는 본 분야에 알려져 있다. 제WO2008/068621호는 종양 타켓팅 모이어티 또는 종양 맥관구조 타겟팅 모이어티(tumor vasculature targeting moiety)과 같은 타겟팅 모이어티 및 IFNγ의 접합 생성물(conjugation product)을 공개하였다. 상기 선행 기술은 부작용을 유발하는 이의 천연 수용체에 여전히 결합할 수 있는 전장 IFNγ에 대한 접합(conjugation)만을 나타내었다.
Interferon analogs provided with heterologous targeting moieties are known in the art. WO2008 / 068621 discloses conjugation products of IFNγ and targeting moieties such as tumor targeting moieties or tumor vasculature targeting moieties. The prior art only showed conjugation to full-length IFNγ that could still bind to its natural receptor causing the side effects.

제EP0844252호는, 특히 친화성 크로마토그래피, 예방 접종(immunisation), 진단 테스트의 성장, 백신(vaccines) 및 약제학적 조성물의 분야에서 새로운 또는 개선된 생명공학 응용을 제공하도록, 상기 고리형 펩티드(cyclic peptides) 상에 결합하는 화학적인 접목(chemical grafting), 즉 고체 지지대(solid support), 고분자량 화합물, 마커(marker) 및/또는 그 밖의 고리형 펩티드에 대한 이들의 부착을 차후에 가능하게 하는, 고리형 펩티드 및 이들의 제조 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 이는 인터페론에 대한 그 밖의 것들 중에, 생물학적 분자에 대한 고리형 펩티드 리간드의 커플링(coupling)을 알려준다. 제EP0844252호에서 이의 천연 수용체에 대한 기능적인 결합 도메인이 결여된 절단된 IFN 분자의 사용에 대해 어떠한 언급도 없었다.
EP0844252 describes cyclic peptides to provide new or improved biotechnology applications, particularly in the fields of affinity chromatography, immunisation, diagnostic test growth, vaccines and pharmaceutical compositions. chemical grafting that binds onto peptides, i.e. rings, which subsequently enable their attachment to solid supports, high molecular weight compounds, markers and / or other cyclic peptides It is an object of the present invention to provide type peptides and methods for their preparation. This reveals the coupling of cyclic peptide ligands to biological molecules, among others for interferons. In EP0844252 no mention was made of the use of truncated IFN molecules lacking a functional binding domain for its natural receptors.

본 발명의 인터페론 유사체는, 이의 치료상의 용도[보다 적은 부작용, 증가된 효능, 보다 적은 분자량 때문에 감소된 항원성(antigenicity)] 뿐만 아니라, 이의 생산 과정(재조합 합성)에 대하여, (변형된) 전장 인터페론의 사용을 넘는 명확하고 예상하지 못한 장점을 갖는다.
The interferon analogs of the present invention are (modified) full length for their therapeutic use (reduced side effects, increased potency, reduced antigenicity due to lower molecular weight), as well as their production process (recombinant synthesis). It has clear and unexpected advantages over the use of interferon.

이의 천연 수용체에 결합을 조정하는 모이어티의 기능적인 교란(functional disruption)은 수용체 결합 도메인에 하나 또는 그 이상의 관련된 아미노산 잔기의 결실(deleting), 삽입(inserting), 치환(substituting)에 의해 성취될 수 있다. 인터페론 수용체 결합 도메인은 확인되었고, 본 분야에서 알려졌다. 예를 들어, INFγ 수용체에 대한 쥣과 IFNγ의 결합은 적어도 부분적으로 결실된 첫 번째 40, 30 또는 20 N-말단 잔기에 의해 파괴될 수 있다.
Functional disruption of the moiety that modulates binding to its natural receptor can be achieved by deleting, inserting, or substituting one or more related amino acid residues in the receptor binding domain. have. Interferon receptor binding domains have been identified and known in the art. For example, binding of VIII and IFNγ to the INFγ receptor may be disrupted by the first 40, 30 or 20 N-terminal residue that is at least partially deleted.

하나의 실시형태에서, 상기 유사체는 세포내 신호전달(intracellular signalling)에 포함되는 상기 잔기만을 포함하는 절단된 IFNγ 폴리펩티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포내 신호전달은 핵 전좌(nuclear translocation) 및/또는 항-바이러스성 활성도를 포함할 수도 있다.
In one embodiment, the analog is a truncated IFNγ polypeptide comprising only the residues involved in intracellular signaling. As used herein, intracellular signaling may comprise nuclear translocation and / or anti-viral activity.

바람직하게, 세포내 활성도를 조정하는 상기 신호전달 모이어티은, 인간 및 쥣과 IFN의 C-말단에서 발견된 바와 같은 다염기 핵 위치 신호 모티프[polybasic nuclear localization signal (NLS) motif]를 포함한다(Subramaniam et al. 2000, J. Cell Science 113, 2771-2781). 이러한 NLS 모티프가 신호 전달인자 및 전사의 활성인자(signal transducer and activator of transcription, STAT)를 갖는 복합체를 형성하는 것으로 생각되어 진다; STATs는 특정한 면역계 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자(transcription factors)의 패밀리(family)이다. 몇몇 STATs는 타입 I 및 타입 II IFNs 둘 다에 의해 활성화된다. 그러나, IFN 타입 각각은 유일한 STATs를 또한 활성화시킬 수 있고(Platanias, L. C. 2005 Nature reviews. Immunology 5 (5): 375-386), STAT 활성화(activation)는 모든 IFNs에 대한 매우 잘 규정된 세포 신호전달 경로(the most well defined cell signaling pathway), 전형적인 야누스 키나아제-STAT(Janus kinase-STAT, JAK-STAT) 신호전달 경로를 개시한다. 이러한 경로에서, JAKs는 IFN 수용체와 연관되어 있고, IFN과 그 다음의 수용체 관계와 연관되어 있고, STAT1 및 STAT2 둘 다를 인산화한다. 결과적으로, IFN-자극 유전자 인자 3(IFN-stimulated gene factor 3, ISGF3) 복합체-이는 STAT1, STAT2 및 IRF9 로 불리는 세 번째 전사 인자를 포함한다-는 형성되고, 세포핵 내로 이동한다. 핵의 내부에, ISGF3 복합체는 특정 유전자의 프로모터(promoters)에서 IFN-자극된 반응 요소(IFN-stimulated response elements, ISREs)라 불리는 특정한 뉴클레오티드 서열에 결합한다; 이는 이러한 유전자의 전사를 유도한다.
Preferably, said signaling moiety that modulates intracellular activity comprises a polybasic nuclear localization signal (NLS) motif as found at the C-terminus of human and murine IFN (Subramaniam). et al. 2000, J. Cell Science 113, 2771-2781. It is believed that these NLS motifs form complexes with signal transducers and activators of transcription (STAT); STATs are a family of transcription factors that regulate the expression of certain immune system genes. Some STATs are activated by both type I and type II IFNs. However, each IFN type can also activate unique STATs (Platanias, LC 2005 Nature reviews. Immunology 5 (5): 375-386), and STAT activation is a very well defined cellular signaling for all IFNs. The most well defined cell signaling pathway, a typical Janus kinase-STAT (JAK-STAT) signaling pathway. In this pathway, JAKs are associated with IFN receptors, are associated with IFN and subsequent receptor relationships, and phosphorylate both STAT1 and STAT2. As a result, an IFN-stimulated gene factor 3 (ISGF3) complex, which comprises a third transcription factor called STAT1, STAT2 and IRF9, forms and migrates into the cell nucleus. Inside the nucleus, the ISGF3 complex binds to specific nucleotide sequences called IFN-stimulated response elements (ISREs) in promoters of specific genes; This induces transcription of these genes.

본원에 제공된 유사체는 아미노산 서열 (R)KRXRS(R)을 포함하는 다염기 NLS 모티프를 포함할 수도 있고, 이 식에서 X 는 어떠한 아미노산 잔기이고, 바람직하게 X 는 R, K, S 또는 T 이다. 바람직하게, 상기 NLS 모티프는 상기 유사체의 C-말단 끝(C-terminal end)에 위치한다. 하나의 실시형태에서, 이는 상기 서열, 바람직하게 C-말단 서열 RKRKRSR, KSKRSR, KRTRS 또는 KRTRSQ를 포함한다.
Analogs provided herein may comprise a polybasic NLS motif comprising an amino acid sequence (R) KRXRS (R), wherein X is any amino acid residue, and preferably X is R, K, S or T. Preferably, the NLS motif is located at the C-terminal end of the analog. In one embodiment, this comprises said sequence, preferably the C-terminal sequence RKRKRSR, KSKRSR, KRTRS or KRTRSQ.

특정한 측면에서, 상기 신호전달 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열로 이루어져 있다: (a) 아미노산 서열 KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR; (b) 아미노산 서열 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ 또는 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ; (c) 아미노산 서열 AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC; (d) (a), (b) 또는 (c)의 서열의 적어도 10, 바람직하게 적어도 15, 인접한 아미노산 스트레치(stretch); (e) 세포내 신호전달 활성도가 유지된다면, a) 또는 b) 또는 c)와 적어도 70 %, 바람직하게 적어도 80 %, 보다 바람직하게 적어도 90 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및 (f) 상기 신호전달 활성도, 예를 들어 핵 전좌(nuclear translocation)가 유지된다면, 최대한 10, 바람직하게 최대한 8, 보다 바람직하게 최대한 5 아미노산 잔기가 결실되거나, 첨가되거나 또는 치환된, (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 아미노산 서열; (g) x 가 어떠한 아미노산 잔기인 공통 서열 VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS; (h) x 가 어떠한 아미노산 잔기인 공통 서열 VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS; (i) x 가 어떠한 아미노산 잔기인 공통 서열 Vxxxx[V/I]Q[R/H][Q/K]A[F/V/I][N/H]ELI[R/Q]Vx[H/A][Q/E]L[L/S]P[E/A][S/A][S/A][L/K]xxKRKRS;
In certain aspects, the signaling moiety comprises or consists of a sequence selected from the group consisting of: (a) the amino acid sequence KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR; (b) amino acid sequence YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ or YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ; (c) amino acid sequence AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC; (d) at least 10, preferably at least 15, contiguous amino acid stretches of the sequences of (a), (b) or (c); (e) an amino acid sequence that exhibits at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% identity with a) or b) or c) if intracellular signaling activity is maintained; And (f) if said signaling activity, eg nuclear translocation, is maintained, at most 10, preferably at most 8, more preferably at most 5 amino acid residues are deleted, added or substituted, (a) Or the amino acid sequence under (b) or (c); (g) consensus sequence VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS, wherein x is any amino acid residue; (h) consensus sequence VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS, wherein x is any amino acid residue; (i) consensus sequence Vxxxx [V / I] Q [R / H] [Q / K] A [F / V / I] [N / H] ELI [R / Q] Vx [H, where x is any amino acid residue / A] [Q / E] L [L / S] P [E / A] [S / A] [S / A] [L / K] xxKRKRS;

(a) 하의 아미노산 서열은 절단된 IFNγ 서열을 나타내고, (b) 하의 상기 서열은 인간 동족체(human homologue)이고, (c) 하의 상기 서열은 랫 동족체(rat homolog)이다. 바람직하게, 본 발명의 동족체는 (a), (b) 또는 (c)의 서열의 적어도 10, 바람직하게 적어도 15, 보다 바람직하게 적어도 20의 인접한 아미노산 스트레치(stretch)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 스트레치는 (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 서열의 N-말단 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이는 (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 서열의 C-말단 서열, 바람직하게 적어도 마지막의 15 개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 스트레치는 (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 서열의 내부 서열(internal sequence)을 포함한다. 대표적인 서열은 LLPESSLRKRKRSR, KFEVNNPQVQRQ, QAFNELIRVVHQLL, MAELSPAAKTGKRTRSQ, YSVTDLNVQRKAI, KAIHELIQVMAELS 이다.
The amino acid sequence under (a) represents a truncated IFNγ sequence, the sequence under (b) is a human homologue, and the sequence under (c) is a rat homolog. Preferably, the analogs of the invention comprise at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20 contiguous amino acid stretches of the sequences of (a), (b) or (c). In one embodiment, the stretch comprises the N-terminal sequence of the sequence under (a) or (b) or (c). In another embodiment, it comprises the C-terminal sequence of the sequence under (a) or (b) or (c), preferably at least the last 15 amino acids. In another embodiment, the stretch comprises an internal sequence of the sequence under (a) or (b) or (c). Representative sequences are LLPESSLRKRKRSR, KFEVNNPQVQRQ, QAFNELIRVVHQLL, MAELSPAAKTGKRTRSQ, YSVTDLNVQRKAI, KAIHELIQVMAELS.

본 숙련자는, (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 서열에 대한 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체(variant)가 본 발명의 범위 내에 또한 있음을 이해할 수 있을 것이다. 신호전달 활성도(signaling activity), 예를 들어 핵 전좌(nuclear translocation)가 유지된다면, 최대한 10, 바람직하게 최대한 8, 보다 바람직하게 최대한 5 아미노산 잔기가 결실되거나, 첨가되거나 또는 치환된, (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 아미노산 서열.
Those skilled in the art will appreciate that variants with one or more amino acid modifications to the sequences under (a) or (b) or (c) are also within the scope of the present invention. If signaling activity, for example nuclear translocation, is maintained, at most 10, preferably at most 8, more preferably at most 5 amino acid residues are deleted, added or substituted, (a) or the amino acid sequence under (b) or (c).

인간 및 쥣과 INFγ 서열의 정렬은, 36 잔기 중 15(41 %)는 동일하고, 36 잔기 중 24(66 %)는 양전하로 대전된다(positively charged). 동일성 매치(identity match)는 clustal W 정렬 소프트웨어에 따라 실시되었다.
The alignment of human and murine INFγ sequences is identical in 15 (41%) of 36 residues and 24 (66%) of 36 residues are positively charged. Identity matches were performed according to clustal W alignment software.

Figure pct00001

Figure pct00001

상기 서열 사이에 라인은, 상기 본원 (g) 하에 나열된(recited) 공통 서열(consensus sequence)을 산출하는, 상기 보전된 잔기(conserved residues)를 나타낸다. 인간, 랫(rat) 및 마우스 인터페론 감마의 정렬은 (h) 및 (i) 하의 공통 서열을 제공할 수 있다.
Lines between the sequences indicate the conserved residues that yield consensus sequences recited under (g) above. Alignment of human, rat and mouse interferon gamma may provide consensus sequences under (h) and (i).

하나의 실시형태에서, 유사체는 상기에 언급된 공통 서열 (g) , (h) 또는 (i)에 따라 신호전달 모이어티(signalling moiety)를 포함한다. 그 밖의 유용한 서열은, 세포내 신호전달 활성도를 유지한다면, (a) 또는 (b) 또는 (c)와 적어도 70 %, 바람직하게 적어도 80 %, 보다 바람직하게 적어도 90 %, 가장 바람직하게 적어도 95 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
In one embodiment, the analog comprises a signaling moiety according to the consensus sequence (g), (h) or (i) mentioned above. Other useful sequences are at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with (a) or (b) or (c) if they maintain intracellular signaling activity. Amino acid sequences that indicate identity.

특정한 측면에서, 상기 유사체는 공통 서열에 따라 신호전달 모이어티를 포함한다: Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4 Val Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Gln Xaa10 Xaa11 Ala Xaa12 Xaa13 Glu Leu Ile Xaa14 Val Xaa15 Xaa16 Xaa17 Leu Xaa18 Pro Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24 Xaa25, 이 식에서, Xaa1, Xaa2, Xaa3 Xaa4 Xaa6 Xaa11, Xaa13, Xaa14, Xaa16 Xaa17, Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 및 Xaa25 는 어떠한 아미노산 잔기이고, Xaa5 는 Asn 또는 Thr 와 같은 극성, 비전하 잔기이고, Xaa7 는 Pro 또는 Leu 와 같은 무극성, 소수성 잔기이고, Xaa8 은 Gln 또는 Asn과 같은 극성, 비전하 잔기이고, Xaa9 는 Val, Ile 또는 Leu와 같은 무극성 소수성 잔기이고, Xaa10 은 Arg, His 또는 Lys와 같은 극성, 염기성 잔기이고, Xaa12 는 Phe, Val 또는 Ile과 같은 무극성 소수성 잔기이고, Xaa15 는 Val, Ile, Met와 같은 무극성 소수성 잔기이다.
In certain aspects, the analogs comprise signaling moieties according to consensus sequences: Xaa 1 Xaa 2 Xaa 3 Xaa 4 Val Xaa 5 Xaa 6 Xaa 7 Xaa 8 Xaa 9 Gln Xaa 10 Xaa 11 Ala Xaa 12 Xaa 13 Glu Leu Ile Xaa 14 Val Xaa 15 Xaa 16 Xaa 17 Leu Xaa 18 Pro Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21 Xaa 22 Xaa 23 Lys Arg Lys Arg Ser Xaa 24 Xaa 25 , where Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 Xaa 4 Xaa 6 Xaa 11 , Xaa 13 , Xaa 14 , Xaa 16 Xaa 17 , Xaa 18 Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21 Xaa 22 Xaa 23 Xaa 24 and Xaa 25 are any amino acid residues, Xaa 5 is a polar, non-charged residue such as Asn or Thr , Xaa 7 is a nonpolar, hydrophobic residue such as Pro or Leu, Xaa 8 is a polar, non-charged residue such as Gln or Asn, Xaa 9 is a nonpolar hydrophobic residue such as Val, Ile or Leu, and Xaa 10 is Arg, A polar, basic residue such as His or Lys, Xaa 12 is a nonpolar hydrophobic residue such as Phe, Val or Ile, and Xaa 15 is apolar such as Val, Ile, Met Hydrophobic residues.

바람직하게, 유사체는 신호전달 모이어티로서의 쥣과 IFNγ에서의 잔기 95 내지 133 또는 인간 IFNγ에서의 잔기 95 내지 134 에 해당하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 항 바이러스성 활성도를 갖는다(Mujtaba et al. 2006, Clinical and Vaccine Immunology, Vol. 13, No.8, p.944-952).
Preferably, the analog comprises a sequence corresponding to residues 95-133 in IFNγ or VIII as a signaling moiety or residues 95-134 in human IFNγ. Such sequences have antiviral activity (Mujtaba et al. 2006, Clinical and Vaccine Immunology, Vol. 13, No. 8, p.944-952).

유사체의 신호전달 활성도는 본 분야에서 공지된 발명에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 쥣과 대식세포 세포주에 의해 세포 내로 흡수되었을 때, STAT1α의 핵 전좌를 유도하도록 상기 유사체의 능력은 Subramaniam et al에 의해 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 신호전달 활성도는 또한 전사인자 Stat1alpha 및 Stat1alpha의 핵 임포터(nuclear importer), 임포틴-알파 유사 NPI-1(importin-alpha analog NPI-1)을 갖는 복합체 형성에 의해 또한 평가될 수 있다. 특히 Subramaniam et al. (2001, J. Interferon Cytokine Res. 21(11):951-959)를 참고하라. 그 밖의 적절한 생체외 검정은 RAW 세포주와 같은 쥣과 대식세포에서 NO-생산을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 유사체는 이의 전장 인터페론 카운터파트(full length interferon counterpart)의 적어도 30 %, 바람직하게 적어도 50 %, 보다 바람직하게 적어도 75 % 의 (생체외) 활성도를 나타낸다. 세포 특이적인 타겟팅은 생체외 상대적으로 낮은 활성도를 나타내는 유사체의 생체내 효험(in vivo efficacy)을 상당히 증진시킬 수 있다.
Signaling activity of analogues can be readily determined by inventions known in the art. For example, when taken up into cells by murine macrophage cell lines, the ability of the analog to induce nuclear translocation of STAT1α can be measured as described by Subramaniam et al. Signaling activity can also be assessed by forming complexes with the transcription factors Stat1alpha and the nuclear importer of Stat1alpha, importin-alpha analog NPI-1. In particular, Subramaniam et al. (2001, J. Interferon Cytokine Res. 21 (11): 951-959). Other suitable in vitro assays include NO-production in murine and macrophages, such as RAW cell lines. In one embodiment, the analog exhibits an (in vitro ) activity of at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 75% of its full length interferon counterpart. Cell-specific targeting can significantly enhance the in vivo efficacy (in vivo efficacy) of the analog indicating a relatively low activity in vitro.

상기 본원에 언급된 바와 같이, 본 발명의 유사체는, 예를 들어, 리간드 결합 상에서 식균 작용 경로(endocytic pathway)에 들어가는 수용체 및/또는 일정한 수용체 턴-오버(constant receptor turn-over)의 파트(part)로서 상기 유사체의 세포내 활용(intracellular uptake)을 조절할 수 있는, 기능적인 IFN-수용체 결합 도메인의 부재 및 선택가능한 수용체에 결합할 수 있는 타겟팅 도메인의 존재에 의해 특징지어진다. 이해될 수 있는 바와 같이, 타겟된 선택적인 또는 "부차적인(secondary)" 수용체는 세포 타입 특이적인 발현의 몇몇의 정도를 가져야한다. 아주 흔하게 발현된 수용체는 중요하지 않은 적절한 후보물질이다. 게다가, 상기 수용체는 세포내 신호전달 모이어티에 반응하는 세포 상에 발현되어야 하고, 즉, IFNγ 유사체의 경우에, 이는 IFNγ-반응 요소(IFNγ-responsive element)를 포함해야한다.
As mentioned hereinabove, analogs of the present invention may comprise, for example, receptors that enter the endocytic pathway on ligand binding and / or parts of constant receptor turn-over. ) Is characterized by the absence of a functional IFN-receptor binding domain capable of regulating intracellular uptake of the analog and the presence of a targeting domain capable of binding to selectable receptors. As can be appreciated, the targeted or "secondary" receptor targeted must have some degree of cell type specific expression. Very often expressed receptors are not important candidates. In addition, the receptor must be expressed on cells that respond to intracellular signaling moieties, ie in the case of IFNγ analogues, it must comprise an IFNγ-responsive element.

바람직하게, 상기 타겟팅 도메인은, 섬유아세포(fibroblast) 및 섬유아세포-유사 세포(fibroblast-like cells), 예를 들어 근섬유아세포(myofibroblasts), 포탈 섬유아세포(portal fibroblasts), 혈관간막세포(mesangial cells), 인터스티셜 섬유아세포(interstitial fibroblasts), 알베올라 섬유아세포(alveolar fibroblasts) 또는 기질 세포(stromal cells)에 특이적인 수용체에 결합할 수 있다. IFNγ-유사체는 종양 세포에서 발현되는 제2 수용체를 통해 특이적으로 타겟될 수 있는, 종양 세포에서의 아포토시스(apoptosis)를 유도할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 수용체는 PDGF 수용체, 콜라겐 타입 VI 수용체, TGFβ 수용체, TNFα 수용체 및 IL1β 수용체, 인슐린 성장 인자 수용체, VEGF 수용체 및 케모카인 수용체(e.g. CXCR4)를 포함하는 사이토카인 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 매우 좋은 결과는, 상기 유사체가 PDGF 수용체, 바람직하게 PDGF-β 수용체에 타겟된(targeted) 경우에, 수득된다. 그 밖의 절절한 타겟팅 도메인(targeting domains)은, 세포 부착을 조절하는 피브로넥틴(fibronectin) 내의 서열로서 원래 확인된 트리펩티드(tripeptide) Arg-Gly-Asp(RGD)와 같은 세포 부착 펩티드(cell adhesion peptides)를 포함한다. RGD 모티프는 많은 그 밖의 단백질에서 현재 발견되고, 이러한 것들 중에 모두는 아니지만 많은 부분에서 세포 부착을 지원한다. 상기 인테그린(integrins), 세포-표면 단백질의 패밀리는 세포 부착 분자에 대한 수용체로서 작용한다. 인테그린의 서브셋(subset)은 이들의 리간드 내에 RGD 모티프, 세포-기층(cell-substratum) 및 세포-세포 상호작용 둘 다를 조절하는 이의 결합을 인지한다. RGD-포함하는 유사체는 혈전증 및 암과 같은 질병의 치료에 대한 치료학적 제제로서 사용될 수 있다.
Preferably, the targeting domain is fibroblast and fibroblast-like cells, for example myofibroblasts, portal fibroblasts, mesialial cells. It can bind to receptors specific for interstitial fibroblasts, alveolar fibroblasts or stromal cells. IFNγ-analogues can induce apoptosis in tumor cells, which can be specifically targeted through a second receptor expressed in tumor cells. In one embodiment, the receptor is from the group consisting of a cytokine receptor comprising a PDGF receptor, collagen type VI receptor, TGFβ receptor, TNFα receptor and IL1β receptor, insulin growth factor receptor, VEGF receptor and chemokine receptor (eg CXCR4) It is selected. Very good results are obtained when the analog is targeted to the PDGF receptor, preferably the PDGF-β receptor. Other moderate targeting domains include cell adhesion peptides such as tripeptide Arg-Gly-Asp (RGD) originally identified as a sequence in fibronectin that regulates cell adhesion. Include. RGD motifs are currently found in many other proteins and support cell adhesion in many, but not all, of these. The family of integrins, cell-surface proteins, acts as a receptor for cell adhesion molecules. A subset of integrins recognize their binding within their ligands that regulates both the RGD motif, cell-substratum and cell-cell interactions. RGD-containing analogs can be used as therapeutic agents for the treatment of diseases such as thrombosis and cancer.

특정한 측면에서, 상기 타겟팅 도메인 타겟(targeting domain targets)은 올리고당 또는 당단백질에 대한 수용체, 바람직하게 아시알로당단백질(asialoglycoprotein, ASGP) 수용체 또는 만노오스 수용체(CD 206)에 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 타겟팅 도메인은, 담체 분자(carrier molecule)에 접합된(conjugated), 올리고당, 바람직하게 만노오스 또는 락토오스이다. 또 다른 실시형태에서, 만노오스-6-인산(mannose-6-phosphate, M6P) 또는 이의 유도체는 M6P/IGF II 수용체에 대한 타겟팅 도메인(targeting domain)으로서 사용될 수 있다. 예를 들어 제EP1117443호를 참고하라.
In certain aspects, the targeting domain targets may bind to receptors for oligosaccharides or glycoproteins, preferably asialoglycoprotein (ASGP) receptors or mannose receptors (CD 206). For example, the targeting domain is an oligosaccharide, preferably mannose or lactose, conjugated to a carrier molecule. In another embodiment, mannose-6-phosphate (M6P) or derivatives thereof can be used as the targeting domain for the M6P / IGF II receptor. See, for example, EP1117443.

전체로서 유사체가 예를 들어 재조합적으로(recombinantly) 쉽게 생산될 수 있는 융합 폴리펩티드(fusion polypeptide)이 되도록, 상기 타겟팅 도메인이 바람직하게 단백질 기질 (펩티드)[proteinaceous substance (peptide)]이다. 그러나, 타겟팅 도메인의 비-단백질 그 밖의 타입(non-proteinaceous other types)은 또한 당류(saccharides), 지질(lipids), 핵산(nucleic acids), 합성 분자(synthetic molecules) 등과 같은 또한 예상된다.
The targeting domain is preferably a proteinaceous substance (peptide) such that the analog as a whole is, for example, a fusion polypeptide that can be readily produced recombinantly. However, non-proteinaceous other types of targeting domains are also contemplated, such as sugars, lipids, nucleic acids, synthetic molecules, and the like.

하나의 측면에서, 상기 타겟팅 도메인은 적어도 하나의 고리형 펩티드 부분(cyclic peptide portion)을 포함한다. 펩티드는 시스테인-이황화물(cysteine-disulfide) 또는 란티오닌 가교 형성(bridge formation)을 포함하는 다양한 수단에 의해 환화될(cyclised) 수 있다. 목적하는 세포 타입에 대한 본 발명의 유사체를 타겟팅하는데 유용한 고리형 펩티드는 본 분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 제EP1117443호는 세포 수용체 인지 펩티드(cell receptor recognising peptide)(RPR)를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 고리형 펩티드를 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 유사체는, RGD, KPT, SRN, NLI 및 LID 로 이루어진 군으로부터 선택된 이의 (고리형 또는 선형) 타겟팅 도메인 최소한의 아미노산 서열을 포함한다.
In one aspect, the targeting domain comprises at least one cyclic peptide portion. Peptides may be cyclised by various means including cysteine-disulfide or lanthionine bridge formation. Cyclic peptides useful for targeting analogs of the invention to the cell type of interest are described in the art. For example, EP1117443 refers to a cyclic peptide comprising at least one sequence encoding a cell receptor recognizing peptide (RPR). In one embodiment, analogs of the invention comprise a minimal amino acid sequence thereof (cyclic or linear) targeting domain selected from the group consisting of RGD, KPT, SRN, NLI and LID.

바람직한 실시형태는, 바람직하게 (고리형) 펩티드 부분의 적어도 하나의 반복 서열(at least one tandem repeat)의 형태에서, 다수의 수용체 결합 서열을 포함하는 타겟팅 도메인(targeting domain)을 갖는 유사체에 관한 것이다. 상기 반복 서열은, 1 내지 5의 아미노산의 링커를 통해 연결된, 두 가지의 고리형 펩티드 부분, 바람직하게 동일한 고리형 펩티드 부분을 포함할 수도 있다. 이는 PDGF, TGFβ 또는 IL-10 수용체와 같은 이합체(dimer)로서 유효한 수용체를 타겟팅하기 위한 특정한 장점이다.
Preferred embodiments relate to analogs having a targeting domain comprising a plurality of receptor binding sequences, preferably in the form of at least one tandem repeat of the (cyclic) peptide moiety. . The repeat sequence may comprise two cyclic peptide moieties, preferably identical cyclic peptide moieties, linked through a linker of 1 to 5 amino acids. This is a particular advantage for targeting effective receptors as dimers such as PDGF, TGFβ or IL-10 receptors.

하나의 실시형태에서, 상기 타겟팅 도메인은, 아미노산 서열 X1SRNLIDX2의 하나, 바람직하게 두 개의 복사본[copie(s)]을 포함하고, 상기 X1 및 X2 는 고리형 구조가 형성되도록 서로 (펩티드) 결합[(peptidic) bond]을 형성할 수 있는 모이어티(moieties)를 나타내고, 상기 서열 SRNLID는 고리의 부분이다. 두 개의 복사본은 1 내지 7의 아미노산의 링커 서열(linker sequence)에 의해 바람직하게 간격을 둔다(spaced). 바람직하게, X1 및 X2 는 Cys 잔기이다. 링커가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, 아미노산 잔기와 같은 1 내지 7의 아미노산 서열인 아미노산 서열 CSRNLIDC-링커-CSRNLIDCS 를 포함하는 타겟팅 도메인이 이합체 PDGFβ 수용체에 결합하는데 매우 유효함을, 본 발명자는 발견하였다. 예를 들어, 이들은 비교 실험을 실행하였고, 상기 PDGF-수용체에 결합할 수 있는 두 개의 고리형 펩티드가 6개의 아미노산으로 이루어진 스페이서를 통해 서로 연결된 반면에, 그 밖의 구조물에서, 이러한 두 개의 고리형 펩티드는 11개의 아미노산의 스페이서(spacer)를 통해 결합된다. 구조물 둘 다에서, 상기 스페이서는 약물 또는 트레이서(tracer)의 결합을 가능하게 하도록 리신 잔기를 포함한다. 비시클릭 구조물(bicyclic constructs) 둘 다는, 결합을 조사하기 위해 FITC 로 표지되고, PDGF-수용체가 발현되는, 3T3 세포 배양물에 첨가하고, 2 hrs 동안 배양하였다. FITC에 대한 항체와 함께 배양(incubation) 및 염색한(staining) 다음에, 면역조직 화학상의 데이터(immunohistochemical data)는 6 개의 아미노산의 스페이서를 포함하는 구조물의 현저한 결합을 나타낸 반면에, 오직 낮은 결합만이 11 개의 아미노산의 보다 긴 스페이서(longer spacer)를 포함하는 구조물과 함께 관찰되었다.
In one embodiment, the targeting domain comprises one, preferably two copies of the amino acid sequence X 1 SRNLIDX 2 [copie (s)], wherein X 1 and X 2 are combined with each other to form a cyclic structure ( Peptide) shows moieties capable of forming a peptidic bond, wherein the sequence SRNLID is part of a ring. The two copies are preferably spaced by the linker sequence of amino acids 1-7. Preferably, X 1 and X 2 are Cys residues. Targeting domains comprising the amino acid sequence CSRNLIDC-linker-CSRNLIDCS, wherein the linker is an amino acid sequence of 1 to 7, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7, amino acid residues, are highly effective at binding to the dimeric PDGFβ receptor The inventors have discovered. For example, they ran comparative experiments, where two cyclic peptides capable of binding to the PDGF-receptor were linked to each other through a spacer of six amino acids, while in other constructs, these two cyclic peptides Is bound through a spacer of eleven amino acids. In both constructs, the spacers comprise lysine residues to enable binding of the drug or tracer. Both bicyclic constructs were added to 3T3 cell cultures, labeled with FITC to examine binding, and expressed with PDGF-receptors, and incubated for 2 hrs. After incubation and staining with antibodies to FITC, immunohistochemical data showed significant binding of the structure comprising spacers of six amino acids, whereas only low binding Observations were made with structures comprising longer spacers of these 11 amino acids.

하나의 실시형태에서, 상기 링커는 4 또는 5 개의 아미노산 잔기, 바람직하게 Gly, Ala, Ser 및 Thr 잔기의 군으로부터 선택된 것이고, 보다 바람직하게 글리신 잔기인 이들 중 적어도 3 개로 이루어질 수도 있다. 바람직한 링커는 m 이 1 또는 2 인 서열 K(GS)mGG로 이루어져 있다. 특정한 예로서, 상기 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 또는 CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS를 포함하거나 이로 이루어져 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 링커는 5 또는 6 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 바람직하게 Asp, Lys, Gly, Ala, Ser 및 Thr 잔기의 군으로부터 선택된 것이다. 좋은 결과는 글리신 잔기인, 4 내지 7 개의 잔기, 적어도 4, 바람직하게 적어도 5 의 링커와 함께 획득된다. 그 밖의 적절한 링커는 Gly 및 Asp 잔기로부터 선택된 4 내지 7 개의 잔기의 서열을 포함하고, 예를 들어 n + m 이 4 내지 7 이고, n =4 이고 M 은 0 내지 3 사이의 정수인 [G n D m]. 특정한 실시형태에서, 상기 타겟팅 도메인은, n + m 이 4 내지 7 이고, n =4 이고 M 은 0 내지 3 사이의 정수인 아미노산 서열 CSRNLIDC[G n D m ] CSRNLIDC 를 포함하거나 또는 이로 이루어져 있다. 예를 들어, 상기 타겟팅 도메인은 서열 CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC 또는 CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC 로 이루어져 있거나 또는 포함한다.
In one embodiment, the linker is selected from the group of 4 or 5 amino acid residues, preferably Gly, Ala, Ser and Thr residues, and may more preferably consist of at least three of these being glycine residues. Preferred linkers consist of the sequence K (GS) m GG, wherein m is 1 or 2. As a specific example, the targeting domain comprises or consists of the amino acid sequence CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS or CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS. In another embodiment, the linker consists of 5 or 6 amino acid residues and is preferably selected from the group of Asp, Lys, Gly, Ala, Ser and Thr residues. Good results are obtained with linkers of 4 to 7 residues, at least 4, preferably at least 5, which are glycine residues. Other suitable linkers include sequences of 4 to 7 residues selected from Gly and Asp residues, for example, n + m is 4 to 7, n = 4 and M is an integer from 0 to 3 [G n D m ]. In certain embodiments, the targeting domain comprises or consists of the amino acid sequence CSRNLIDC [G n D m ] CSRNLIDC wherein n + m is 4 to 7, n = 4 and M is an integer from 0 to 3. For example, the targeting domain consists of or comprises the sequence CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC or CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC.

상기 타겟팅 도메인은 어떠한 수단, 예를 들어 링커 또는 스페이서 서열(spacer sequence)에 의해 신호전달 도메인에 부착될 수도 있다. 적절한 링커 서열은 길이에 있어서 일반적으로 15 까지, 바람직하게 10 까지의 아미노산 잔기이다. 폴리알라닌 링커는 사용될 수도 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 것은 서열 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIR VVHQLLPESSLRKRKRSR, CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR 또는 CSRNLIDC GGGDGGCSRNLIDCSAAA KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR 로 이루어진 인터페론 감마 유사체이다.
The targeting domain may be attached to the signaling domain by any means, for example by a linker or spacer sequence. Suitable linker sequences are amino acid residues of up to 15, preferably up to 10, in length. Polyalanine linkers may be used. For example, provided herein is the sequence CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIR VVHQLLPESSLRKRKRSR, CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR or CSRNLIDC GGGDRKVQRRKVQRRVI

상기 타겟팅 도메인은 또한 담체 분자, 예를 들어 알부민을 통해 신호전달 도메인에 또한 부착될 수도 있다. 만약 상기 타겟팅 도메인이 비-단백질 기질(non-proteinaceous substance), 예를 들어 만노오스 또는 락토오스와 같은 올리고당이라면, 이는 특히 유리하다. 하나의 실시형태에서, 상기 담체 분자는 히드록실(hydroxyl), 아민(amine) 및/또는 황산염(sulphate)과 같은 유리 반응기(free reactive groups)를 포함한다. 상기 담체의 크기는, 알부민, 락토페린(lactoferrin) 또는 피브로넥틴(fibronectin)과 같은, 바람직하게 내인성 혈장 단백질(endogenous plasma protein)이다.
The targeting domain may also be attached to the signaling domain via a carrier molecule, for example albumin. If the targeting domain is a non-proteinaceous substance, for example oligosaccharides such as mannose or lactose, this is particularly advantageous. In one embodiment, the carrier molecule comprises free reactive groups such as hydroxyl, amine and / or sulfate. The size of the carrier is preferably an endogenous plasma protein, such as albumin, lactoferrin or fibronectin.

본 발명은 또한, 비시클릭 PDGF-타겟팅 도메인과 접합된, 관심 화합물(compound of interest), 예를 들어, 생물학적으로 유효한 분자(biologically active molecule)를 포함하는 접합체(conjugate)에 관한 것이고, 상기 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 X1SRNLIDX2의 두 개의 복사본을 포함하고, X1 및 X2 가 함께, 비시클릭 구조를 형성되도록, 펩티드 결합 또는 이황화결합(peptidic or disulphide bond)과 같은 결합을 형성할 수 있는 모이어티(moieties)를 나타내고, 상기 서열 SRNLID 는 고리의 각 부분이다. 바람직하게, X1 및 X2 는 이황화결합 형성을 통해 고리화(cyclisation)를 가능하게 하는 Cys 잔기이다. 본 발명에 따른 접합체는, 상기 두 개의 복사본이 2 내지 7의 아미노산의 링커 서열에 의해 공간을 두는 것을 특징으로 한다. 이러한 특정한 스페이서 길이가 이합체(dimer)로서 유효한, PDGF 수용체의 매우 효율적인 타겟팅을 가능하게 함을, 놀랍게도 발견하였다. 따라서, 타겟팅 도메인과 접합된 관심 화합물을 포함하는 접합체를 또한 제공하고, 상기 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 X1SRNLIDX2-링커- X3SRNLIDX4 를 포함하고, X1 및 X2의 쌍 및 X3 및 X4의 쌍은 이환체 구조가 형성되도록 (펩티드) 결합을 형성할 수 있으며, 상기 서열 SRNLID 는 고리의 각 부분이며, 상기 링커는 2 내지 7의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열이다. 상기 본원에 기재된 바와 같이, 상기 링커는 4 또는 5 의 아미노산 잔기로 이루어질 수도 있다. 그들은 Gly, Ala, Ser, Asp, Lys 및 Thr 잔기의 군, 바람직하게 글리신 잔기인 그들의 적어도 3 개로부터 선택될 수 있다. 바람직한 링커는 m 이 1 또는 2 인 서열 K(GS)mGG 로 이루어져 있다. 특정한 예로서, 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 또는 CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS 를 포함하거나 이로 이루어져있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 링커는 5 또는 6 의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 바람직하게 Asp, Gly, Ala, Ser 및 Thr 잔기의 군으로부터 선택된 것이다. 좋은 결과는 글리신 잔기인, 4 내지 7의 잔기, 적어도 4, 바람직하게 적어도 5 의 링커와 함께 수득된다. 그 밖의 절절한 링커는 Gly 및 Asp 잔기로부터 선택된, 4 내지 7 잔기의 서열을 포함하고, 예를 들어, n+m 이 4 내지 7이고, n = 4 이고 M 이 0 내지 3 사이의 정수인 [G n D m]. 특정한 실시형태에서, 상기 타겟팅 도메인은 n + m 이 4 내지 7 이고, n = 4 이고, M 이 0 내지 3 사이의 정수인 아미노산 서열 CSRNLIDC[G n D m ] CSRNLIDC 를 포함하거나 이로 이루어져 있다. 예를 들어, 상기 타겟팅 도메인은 서열 CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC 또는 CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC 로 이루어져 있거나 또는 이를 포함한다.
The invention also relates to conjugates comprising a compound of interest, eg, a biologically active molecule, conjugated with a bicyclic PDGF-targeting domain, wherein the targeting domain A moiety comprising two copies of the amino acid sequence X 1 SRNLIDX 2 and capable of forming a bond such as a peptide bond or disulphide bond such that X 1 and X 2 together form a bicyclic structure Tee, and the sequence SRNLID is each part of a ring. Preferably, X 1 and X 2 are Cys residues that allow for cyclisation through disulfide formation. The conjugate according to the invention is characterized in that the two copies are spaced by a linker sequence of 2 to 7 amino acids. It was surprisingly found that this particular spacer length allows for highly efficient targeting of the PDGF receptor, which is effective as a dimer. Thus, there is also provided a conjugate comprising a compound of interest conjugated with a targeting domain, said targeting domain comprising the amino acid sequence X 1 SRNLIDX 2 -linker-X 3 SRNLIDX 4 , a pair of X 1 and X 2 and X 3 and The pair of X 4 may form a (peptide) bond such that a dicyclic structure is formed, wherein the sequence SRNLID is each part of a ring and the linker is an amino acid sequence consisting of 2 to 7 amino acid residues. As described herein above, the linker may consist of 4 or 5 amino acid residues. They may be selected from the group of Gly, Ala, Ser, Asp, Lys and Thr residues, preferably at least three of them glycine residues. Preferred linkers consist of the sequence K (GS) m GG, wherein m is 1 or 2. As a specific example, the targeting domain comprises or consists of the amino acid sequence CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS or CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS. In another embodiment, the linker consists of 5 or 6 amino acid residues, preferably selected from the group of Asp, Gly, Ala, Ser and Thr residues. Good results are obtained with linkers of 4 to 7, residues of at least 4, preferably at least 5, which are glycine residues. Other truncated linkers comprise a sequence of 4 to 7 residues, selected from Gly and Asp residues, eg, [G n wherein n + m is 4 to 7, n = 4 and M is an integer between 0 and 3; D m ]. In a particular embodiment, the targeting domain comprises or consists of the amino acid sequence CSRNLIDC [G n D m ] CSRNLIDC wherein n + m is 4 to 7, n = 4 and M is an integer from 0 to 3. For example, the targeting domain consists of or comprises the sequence CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC or CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC.

세포 타겟팅 도메인으로서 서열 SRNLID 의 사용은 본 분야에 알려져 있다. 제WO00/23113호는 5000 달톤보다 더 큰 담체 분자, 예를 들어 혈청 알부민(serum albumin)에 대한 수용체 인지 펩티드(receptor recognizing peptide, RRP)를 포함하는 고리형 펩티드의 컨주게이션(conjugation)을 나타낸다. 대표적인 RRP 는 PDGF 수용체 결합 서열 XSRNLIDCX이고, X 는 고리화의 위치(location of cyclisation)를 나타낸다. 고리형 펩티드 구조 내에, 다수의 RRP 서열이 존재할 수도 있음을 가르쳐준다. 이는 또한 담체 분자에 하나 이상(예를 들어, 5 내지 15 개의 고리형 펩티드)이 부착됨을 또한 나타낸다. Hagens et al. (2007) Pharmaceutical Res. Vol. 24, pp. 566-574는 간성상세포(hepatic stellate cells)에 대해 알부민과 접합된 고리형 펩티드 CSRNLIDC의 수송을 나타낸다. 따라서, 상기 선행기술의 접합체(conjugates) 모두는 담체 분자에 대한 RRPs의 부착에 의지한다. 상기 고리형 모이어티는 담체 분자에 부착되지 않는 대신에 2 내지 7 개의 아미노산의 특정한 스페이서 길이를 갖는 탠덤 모티프(tandem motif)에 위치한, 본 발명의 접합체의 구성은 상기 기술에 나타내거나 또는 제시되지 않았다. 제WO00/23113호에 따라 접합체와 비교한 바와 같이, 이러한 잘 나타낸 비시클릭 구조(this well defined bicyclic structure)가 이합체의 PDGF 수용체에 결합하는 접합체를 증진시킬 수 있음을 발견하였고, 담체에 부착된 상기 다수 수용체 결합 서열의 번호 및 공간적인 방향(spatial orientation)은 무작위로 추출되고, 보다 적게 조절된다. 본 발명의 접합체에서의 두 개의 고리형 모이어티 사이의 거리를 고정시키는 탠덤 입체배치(tandem configuration)는 이합체 PDGF-수용체와 최적으로 상호작용하도록 디자인된다(designed). 게다가, 상대적으로 큰 담체 분자의 존재는 입체 장해(steric hindrance)에 의한 수용체 상호작용을 감소시킬 수도 있다.
The use of the sequence SRNLID as a cell targeting domain is known in the art. WO 00/23113 shows the conjugation of cyclic peptides comprising receptor recognizing peptides (RRPs) for carrier molecules larger than 5000 Daltons, for example serum albumin. Representative RRP is the PDGF receptor binding sequence XSRNLIDCX, where X represents the location of cyclisation. It is taught that there may be multiple RRP sequences within the cyclic peptide structure. It also indicates that at least one (eg 5 to 15 cyclic peptides) is attached to the carrier molecule. Hagens et al. (2007) Pharmaceutical Res. Vol. 24, pp. 566-574 shows the transport of cyclic peptide CSRNLIDC conjugated with albumin to hepatic stellate cells. Thus, all of the prior art conjugates rely on the attachment of RRPs to carrier molecules. The constitution of the conjugate of the present invention is not shown or shown in the above description, wherein the cyclic moiety is not attached to a carrier molecule but is located in a tandem motif having a specific spacer length of 2 to 7 amino acids. . As compared to the conjugate according to WO00 / 23113, it was found that this well defined bicyclic structure could enhance the conjugate binding to the PDGF receptor of the dimer, The number and spatial orientation of the multiple receptor binding sequences are randomly extracted and less regulated. Tandem configurations that fix the distance between two cyclic moieties in the conjugates of the present invention are designed to optimally interact with dimeric PDGF-receptors. In addition, the presence of relatively large carrier molecules may reduce receptor interactions due to steric hindrance.

비시클릭 펩티드(bicyclic peptide)는 제약업(the pharmaceutical industry)에 매우 유리한 생산 방법을 제공하는 재조합 기술을 통해 또는 화학적으로 제조될 수 있다. 게다가, 비시클릭 구조는, 혈관외 조직(extravascular tissues) 내로 쉽게 침투될 수 있는, 화학적인 독립체(chemical entity)[약물 또는 트레이서(tracer)], 중합체[예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, PEG], 작은 펩티드 또는 세포-특이적인 저분자량 화합물을 생산하는 단백질에 직접적으로 부착될 수 있다. 특히, 종양 타겟팅 목적에 대해, 이러한 조직 침투는 매우 관련될 수도 있다.
Bicyclic peptides can be prepared chemically or via recombinant techniques that provide a production method that is very advantageous to the pharmaceutical industry. In addition, bicyclic structures include chemical entities (drugs or tracers), polymers (eg, polyethylene glycol, PEG), which can easily penetrate into extravascular tissues, It can be attached directly to proteins that produce small peptides or cell-specific low molecular weight compounds. In particular, for tumor targeting purposes, such tissue infiltration may be very relevant.

매우 좋은 결과는 3 내지 5 개의 아미노산 잔기로 이루어진 링커와 함께 성취된다. 하나의 실시형태에서, 상기 접합체는 아미노산 서열 CSRNLIDC-링커- CSRNLIDCS (BiPPB)를 포함하고, 상기 링커는 2 내지 7, 바람직하게 3 내지 5의 아미노산 서열, 아미노산 잔기이다. 이러한 비시클릭 펩티드는 PDGF 수용체(PDGF-R)에 대한 높은 친화력을 갖는 저분자량 타겟팅 리간드로서 적절하게 사용된다. 상기 펩티드는 화학적 또는 재조합 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 링커는 발견할 수 있는 표지(detectable label), 약물 및/또는 진단과 같은 관심 화합물의 공유결합 부착(covalent attachment)에 사용될 수 있는 반응성 곁사슬(reactive side chain)과 함께 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다. 적절한 반응성 아미노산은 리신, 세린 및 트레오닌, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 메티오닌 및 트립토판을 포함한다.
Very good results are achieved with linkers consisting of 3 to 5 amino acid residues. In one embodiment, the conjugate comprises the amino acid sequence CSRNLIDC-linker- CSRNLIDCS (BiPPB), wherein the linker is an amino acid sequence of 2 to 7, preferably 3 to 5, amino acid residues. Such bicyclic peptides are suitably used as low molecular weight targeting ligands with high affinity for the PDGF receptor (PDGF-R). The peptides can be prepared by chemical or recombinant synthesis. The linker contains one or more amino acid residues along with a reactive side chain that can be used for covalent attachment of compounds of interest such as detectable labels, drugs and / or diagnostics. It may also include. Suitable reactive amino acids include lysine, serine and threonine, arginine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, cysteine, asparagine, glutamine, tyrosine, methionine and tryptophan.

생물학적으로 유효한 모이어티는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine) 또는 프로스타글란딘 활성도(prostaglandin activity)를 포함하는 유용한 생물학적 활성도의 어떠한 타입을 가질수도 있다. 이는 단백질(proteinaceous) 또는 비-단백질 성질(non-proteinaceous nature)일 수 있다. 예를 들어, 상기 모이어티는 약물, 사이토카인, 케모타인, 호르몬, 프로스타글란딘 등으로부터 선택된 군으로부터 선택된 것이다. 특정한 예는 PGE2, 15d-PGJ2, IL-10, IFNγ, 절단된 IFNγ를 포함한다. 단백질 모이어티는 N- 또는 C-말단에서 유전적 융합(genetic fusion)에 의해 PDGF-R 특이적인 타겟팅 도메인에 편리하게 부착될 수도 있다. 하나의 실시형태에서, 이는 N-말단에 접합된다.
Biologically effective moieties may have any type of useful biological activity, including cytokines, chemokines or prostaglandin activities. It may be of proteinaceous or non-proteinaceous nature. For example, the moiety is selected from the group selected from drugs, cytokines, chemokines, hormones, prostaglandins and the like. Specific examples include PGE2, 15d-PGJ2, IL-10, IFNγ, truncated IFNγ. Protein moieties may also be conveniently attached to PDGF-R specific targeting domains by genetic fusion at the N- or C-terminus. In one embodiment it is conjugated to the N-terminus.

본 발명에 따라 유사체(analog) 또는 접합체(conjugate)는 본 분야에 알려진 방법에 의해 코어(core) 및/또는 담체 또는 수송 분자(delivery molecule)와 결합될 수도 있다. 적절한 코어 또는 담체는 덴드리머(dendrimers), 리포솜(liposomes), 및 천연, 합성 또는 반-합성 중합체(semi-synthetic polymers)(가지형 또는 선형)를 포함한다. 이들이 보다 높은 수용성(water-solubility), 생물학적 이용도(bioavailability), 및 생체 적합성(biocompatibility) 약물을 제공할 수 있기 때문에, 덴드리머가 약물 투여의 상이한 루트에 유용한 첨가제로서 이들 자신을 성공적으로 보여준다. Chen et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 97 Issue 1, pg. 123 - 143 를 참고하라. 예로서, 본 발명은 덴드리머 또는 리포솜에 접합된 IFNγ-유사체를 제공한다. 상기 리포좀은 (항-암) 약물을 포함할 수도 있다.
Analogs or conjugates in accordance with the present invention may be associated with the core and / or carrier or delivery molecule by methods known in the art. Suitable cores or carriers include dendrimers, liposomes, and natural, synthetic or semi-synthetic polymers (branched or linear). Because they can provide higher water-solubility, bioavailability, and biocompatibility drugs, dendrimers successfully show themselves as additives useful for different routes of drug administration. Chen et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 97 Issue 1, pg. See 123-143. By way of example, the present invention provides IFNγ-analogs conjugated to dendrimers or liposomes. The liposomes may also comprise (anti-cancer) drugs.

하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 인터페론 유사체 또는 PDGFR-타겟된 접합체(PDGFR-targeted conjugate)는, 효능(efficacy) 및/또는 안정성을 증진시키는 것과 같이, 이의 약물학적 특성을 향상시키도록 일반적인 방법에 의해 변경된다. 하나의 실시형태에서, 이는, 적어도 하나의 비 항원성 중합체(non antigenic polymer)의 부착, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEGs) 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체에 의해 반감기를 향상시키기 위해 변형된다. PEGylation 는 타겟 고분자(target macromolecule)와 함께 PEG의 반응성 유도체(reactive derivative)의 배양에 의해 일상적으로 달성된다. 약물 또는 치료상의 단백질에 대한 PEG의 일반적인 부착은 숙주의 면역계(host's immune system)로부터의 제제를 "차폐(mask)"시킬 수 있고, 신장 클리어런스(renal clearance)를 감소시킴으로써 이의 순환 시간을 연장시키는 제제의 유체 역학적 크기(hydrodynamic size)(용액에서의 크기)를 증가시킬 수 있다.
In one embodiment, the interferon analogue or PDGFR-targeted conjugate according to the invention is a general method to enhance its pharmacological properties, such as to enhance efficacy and / or stability. Is changed by. In one embodiment, it is modified to enhance half-life by attachment of at least one non antigenic polymer, for example by a polymer selected from the group consisting of polyethylene glycols (PEGs) and derivatives thereof. PEGylation is routinely achieved by culturing a reactive derivative of PEG with a target macromolecule. The general attachment of PEG to drugs or therapeutic proteins can "mask" the agent from the host's immune system and extend its circulation time by reducing renal clearance. Can increase the hydrodynamic size (size in solution).

본 발명의 추가적인 측면은, 본 발명에 따른 단백질 인터페론 유사체를 코딩하는 분리된 핵산 서열 또는 상기 본원에 기재된 바와 같은 단백질 PDGFR-타겟된 접합체(proteinaceous PDGFR-targeted conjugate)를 코딩하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 숙련자는, 적절한 핵산 서열, 예를 들어 표준 재조합 DNA 기술을 사용한 상기 타겟팅 모이어티 및 생물학적으로 유효한 모이어티 둘 다를 코드하는 융합 구조물(fusion construct)를 설계하고 구성할 수 있을 것이다. 분리된 핵산 서열은 발현 벡터, 예를 들어 박테리아 또는 포유동물의 숙주 세포에서의 재조합 단백질 생산을 위해 설계된 벡터의 부분(part)일 수도 있다. 또한, 본 발명에 따라 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 바람직하게 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 포유동물의 숙주 세포이다.
A further aspect of the invention relates to an isolated nucleic acid sequence encoding a protein interferon analogue according to the invention or an isolated nucleic acid sequence encoding a proteinaceous PDGFR-targeted conjugate as described herein above. will be. The skilled artisan will be able to design and construct a fusion construct that encodes both the appropriate nucleic acid sequence, eg, the targeting moiety and biologically effective moiety using standard recombinant DNA techniques. The isolated nucleic acid sequence may be part of an expression vector, such as a vector designed for recombinant protein production in a bacterial or mammalian host cell. Also provided is a host cell comprising a nucleic acid sequence or vector according to the invention, preferably said host cell is a bacterial or mammalian host cell.

본원에 나타낸 유사체 또는 PDGF-타겟된 접합체는 신체(body) 내에 이의 분배에 대해 향상된 특성을 갖는다. 보다 명확하게, 이는 특정한 화합물의 생물학적 활성도를 유지시키면서, 관심 생물학적으로 유효한 화합물을 관심 세포에 유도를 가능하게 한다. 세포-특이성(cell-specificity)을 획득하도록, 이러한 매개 물질(mediators)은, 병에 걸린 조직(diseased tissue)에 관련된 타겟 수용체 주위에 이들 농도를 증가되도록 어드레스 표지(address label)가 갖추어져 있다. 따라서, 추가적인 실시형태는 IFN 유사체 또는 PDGF-타겟된 접합체(PDGF-targeted conjugate) 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정한 양상은, 비-타겟된 IFNγ와 비교한 바와 같이 감소된 부작용을 나타내는, 타겟된 IFNγ 유사체, 바람직하게 비-타겟된 IFNγ 유사체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 대표적인 약제학적 조성물은, m 이 1 또는 2 인, 서열 CSRNLIDCK(GS)mGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQ VQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR, 예를 들어 CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR을 포함하거나 또는 이로 구성된 펩티드를 포함한다. 또 다른 대표적인 약제학적 조성물은 타겟팅 도메인에 접합된 생물학적으로 유효한 분자를 포함하는 접합체(conjugate)를 포함하고, 상기 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 CSRNLIDC-링커- CSRNLIDCS을 포함하고, 상기 링커는 2 내지 7, 바람직하게 3 내지 5의 아미노산 서열, 아미노산 잔기이다.
Analogs or PDGF-targeted conjugates shown herein have improved properties for their distribution within the body. More specifically, this allows the induction of a biologically effective compound of interest into the cell of interest while maintaining the biological activity of the particular compound. To achieve cell-specificity, these mediators are equipped with address labels to increase these concentrations around target receptors associated with diseased tissue. Accordingly, further embodiments relate to pharmaceutical compositions comprising an IFN analogue or PDGF-targeted conjugate and a pharmaceutically acceptable carrier. Certain aspects relate to pharmaceutical compositions comprising targeted IFNγ analogs, preferably non-targeted IFNγ analogs, which exhibit reduced side effects as compared to non-targeted IFNγ. Exemplary pharmaceutical compositions comprise or comprise a peptide consisting of or comprising a peptide consisting of or consisting of the sequence CSRNLIDCK (GS) m GGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQ VQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRS, eg, CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR. Another exemplary pharmaceutical composition comprises a conjugate comprising a biologically effective molecule conjugated to a targeting domain, wherein the targeting domain comprises the amino acid sequence CSRNLIDC-linker- CSRNLIDCS, wherein the linker is 2 to 7, preferably 3 to 5 amino acid sequences, amino acid residues.

암, 바이러스성 질환, 섬유증 질환(fibrotic disease), 경화성 질환(sclerotic disease) 및 만성 또는 급성 염증성 질환으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 IFN(γ) 유사체의 용도를 또한 제공한다. 대표적인 질환은 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 간질성 섬유증(interstitial fibrosis), 폐 섬유증(lung fibrosis)[특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis)], 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론병(Crohns disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 패혈증(sepsis)을 포함한다.
IFN (γ) according to the present invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prophylaxis of cancer, viral diseases, fibrotic diseases, sclerotic diseases and diseases selected from chronic or acute inflammatory diseases The use of analogues is also provided. Typical diseases include glomerulosclerosis, interstitial fibrosis, lung fibrosis (idiopathic pulmonary fibrosis), atherosclerosis, rheumatoid arthritis Diseases, ulcerative colitis (colitis ulcerosa), glomerulonephritis and sepsis.

IFNγ는 항바이러스성 활성도(antiviral activity)를 또한 갖는 것으로 알려져 있다. 생물활성을 나타내고, 유도장치(homing device)가 제공된 천연 IFNγ의 모든 활성도를 나타내는 것으로 발견된 IFNγ의 절단된 형태(truncated form)가 상기 분자에 부착되기 때문에, 본 발명의 유사체는 항바이러스성 활성도도 가지고 있다. 대표적인 질환은 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 또는 인간 호흡장애 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)에 의해 초래되는 감염(infection)을 포함한다. RSV 는 기도 감염(respiratory tract infections)을 야기하는 바이러스이다. 이는 유아기(infancy) 및 유년기(childhood) 동안에 보다 낮은 기도 감염(lower respiratory tract infection) 및 병원 방문의 주요한 원인이다. 때때로 유아는 하나의 RSV 시기(season) 내에 한번 뿐 아니라 징후적으로 감염될 수 있다. 미국에서, 유아의 60 % 는 이들의 첫 번째 RSV 시기 동안에 감염되고, 거의 모든 어린이는 2 내지 3 살까지 바이러스로 감염될 것이다. RSV로 감염된 이들 중에, 2 내지 3 % 는 입원(hospitalization)을 필요하게 만드는 모세기관지염(bronchiolitis)으로 발달될 것이다. 심한 RSV 감염은 나이든 환자 중에서 점점 더 발견된다. 어떠한 백신(vaccine)도 없다. 치료는, 산소를 포함하는 보존적인 치료(supportive care)로 한정된다. 온화한 기후에서, 겨울에 해당하는 달 동안에 매년의 유행병이 있다. 열대 기후에서, 감염이 우기 동안에 가장 흔하다.
IFNγ is also known to have antiviral activity. Since the truncated form of IFNγ found to be bioactive and found to exhibit all the activity of native IFNγ provided with a homing device, analogs of the present invention have antiviral activity Have. Representative diseases include infections caused by influenza virus or human respiratory syncytial virus (RSV). RSV is a virus that causes respiratory tract infections. This is a major cause of lower respiratory tract infections and hospital visits during infancy and childhood. Sometimes infants can be symptomatically infected as well as once within one RSV season. In the United States, 60% of infants will be infected during their first RSV period, and almost all children will be infected with the virus by 2-3 years. Of those infected with RSV, 2-3% will develop bronchiolitis, which requires hospitalization. Severe RSV infection is found more and more among older patients. There is no vaccine. Treatment is limited to supportive care involving oxygen. In temperate climates, there is an annual pandemic during the winter months. In tropical climates, infections are most common during the rainy season.

이런 이유로 본 발명은, 본 발명에 따른 IFN 유사체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 피검자(subject)에게 제공하는 것을 포함하는, 암, 바이러스성 질환, 섬유증 질환, 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 간질성 섬유증(interstitial fibrosis), 폐 섬유증(lung fibrosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론병(Crohns disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 패혈증(sepsis)과 같은 경화성 질환 및 만성 또는 급성 염증성 질환으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 상기 질병은 간질환, 바람직하게 간경변(liver cirrhosis)과 같은 만성 간질환(chronic liver disease)일 수도 있다. 본 분야에서의 숙련자는, 적용(application)의 방식, 투여가 일어난 피검자의 크기(size), 몸무게, 건강 상태 등이 적용된 투여량을 조절할 것이다. 투여는 약제의 투여를 위한 그 자체가 알려진 어떠한 방식으로 발생될 수 있다. 본 발명에 따라 IFNγ 유사체는, 예를 들어 비강 내 수송(intranasal administration) 또는 흡입(inhalation)에 의해, 폐내 수송(intrapulmonary delivery)을 위한 형태로 의약 조성물(medicinal composition)(치료상의 또는 예방을 위한)에 유리하게 사용된다. 유효 성분으로서 IFNγ 유사체를 포함하는 흡입 장치(inhalation device)가 또한 제공된다.
For this reason, the present invention includes cancer, viral diseases, fibrosis diseases, glomerulosclerosis, interstitial fibrosis, which comprises providing to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of an IFN analogue according to the invention. (interstitial fibrosis, lung fibrosis, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, Crohns disease, colitis ulcerosa, glomerulonephritis and sepsis And a method for the treatment or prophylaxis of a disease selected from a sclerotic disease such as) and a chronic or acute inflammatory disease. The disease may be a liver disease, preferably chronic liver disease such as liver cirrhosis. Those skilled in the art will adjust the dosages to which the mode of application, the size of the subject, the weight, the state of health, etc., to which the administration has taken place has been applied. Administration can occur in any manner known per se for the administration of a medicament. According to the present invention, IFNγ analogs may be used in the form of a pharmaceutical composition (for therapeutic or prophylaxis) in the form for intrapulmonary delivery, for example by intranasal administration or inhalation. It is used to advantage. An inhalation device is also provided comprising an IFNγ analog as an active ingredient.

도 1 : 마우스로부터 모방(mimetic) IFNγ의 클로닝(cloning). 지라세포(Splenocytes)는 PHA 로 자극되고(stimulated), RNA 는 분리된다. 특정한 프라이머를 사용하여 RT 및 PCR 은 예상된 크기의 PCR 산물을 산출한다. BL21 세포에서의 구조물의 발현 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)은 모방체(mimetic)의 생산을 확인한다.
도 2 : 재조합 모방 IFNγ는 마우스 3T3 섬유아세포에서의 항-섬유화 효과(anti-fibrotic effects)를 나타낸다. 세포는 섬유화 마커(fibrosis marker)인 α-민무늬근 액틴(a-Smooth muscle actin)에 대해 착색시킨다.
도 3 : 비시클릭 PDGF-수용체 타겟팅 도메인을 코딩하는(encoding) pET39b-BiPPB의 구성.
도 4 : PDGFR-타겟팅된 IFNγ 접합체를 코딩하는 pET39b-BiPPB-IFNgamma의 구성.
도 5 : pET39b-BiPPB-모방IFNγ의 구성.
도 6 : INFγ에 대한 pPB-펩티드의 결합을 나타내는 IFNγ-BiPPB 및 모방 IFNγ-BiPPB의 점 블럿 분석(Dot Blot analysis).
도 7 : 인간 간성상 세포주(human hepatic stellate cell line) LX2 세포에서의 결합 연구(Binding study). 세포는 PDGFR-결합 펩티드에 대해 염색된다. 염색(Staining)은 타겟 세포에 대한 pPB-포함하는 구조물의 결합을 나타낸다.
도 8 : 급성 간 손상 마우스 모델에서 치료의 부작용을 연구하기 위한 혈구계수 분석(Blood count analysis). WBC= 백혈구 수치(white blood cell count). LYM= 림프구(lymphocytes). PLT= 혈소판 수치(platelet count). RBC= 적혈구 수치(red blood cell count). 세부사항에 대해 실시예 4 를 참고하라.
도 9 : 간 섬유화 마커 MMP13 및 TIMP1의 실시간 PCR 분석. 세부사항에 대해 실시예 4 를 참고하라.
도 10 : 급성 CCl4-유도된 간-손상 마우스 모델에서의 모방 IFN□-PEG-BiPPB의 효과. a-SMA (A), 콜라겐-I (B) 및 데스민(desmin)(C)의 측정 - 간 절편(liver sections)의 염색은 올리브 오일(olive oil)-처리된 정상 마우스, 및 IFNγ, 모방 IFNγ, 모방 IFNγ-PEG, 모방 IFNγ-PEG-BiPPB (5 ㎍/mice) 또는 PBS만을 받은 CCl4-처리된 마우스로부터 획득되었다. 정량(Quantitation)은 컴퓨터로 처리된 세포-D 이미징 소프트웨어(computerized Cell-D imaging software)를 사용하여 실행하였다. 데이터는 그룹 당 5 마리의 마우스로부터 평균 ± SEM를 나타낸다. #P<0.05 대 PBS-치리된 올리브 오일 그룹; *P<0.05, **P<0.01 대 PBS 처리된-CCl4 그룹. 세부사항에 대해 실시예 6 을 참고하라.
도 11 : CCl4 투여 또는 올리브 오일 후 3 일에, 마우스에서 간 섬유화(liver fibrosis)에 대한 마커(markers)의 리얼타임 PCR 분석(Real Time PCR analysis). 마우스는 나타낸 바와 같이 상이한 화합물로 처리되고, 콜라겐 1a1 (A), a-SMA (B), 데스민(C) 및 TIMP1 (D) mRNA 수치가 측정되었다. 세부사항에 대해 실시예 6 을 참고하라.
도 12 : CCl4 투여 또는 올리브 오일 후 3일에, 마우스의 전혈(whole blood)에서 혈구 계수 분석. 마우스는 나타낸 바와 같이 상이한 화합물로 처리되고, 혈소판수(Platelet count)(PLT: fig A), 백혈구 계수(WBC, fig B) 및 림프구 계수(C)는 콜터계수기(coulter counter)를 사용하여 측정된다. 세부사항에 대해 실시예 6 을 참고하라. 1: Cloning of mimetic IFNγ from mice. Splenocytes are stimulated with PHA and RNA is isolated. Using specific primers, RT and PCR yielded PCR products of expected size. Expression of the constructs and Western blotting in BL21 cells confirms the production of mimetic.
2: Recombinant mimic IFNγ shows anti-fibrotic effects in mouse 3T3 fibroblasts. Cells are stained for a-Smooth muscle actin, a fibrosis marker.
Figure 3: Construction of pET39b-BiPPB encoding the bicyclic PDGF-receptor targeting domain.
4: Construction of pET39b-BiPPB-IFNgamma encoding PDGFR-targeted IFNγ conjugates.
5: Construction of pET39b-BiPPB-mimetic IFNγ.
FIG. 6: Dot Blot analysis of IFNγ-BiPPB and mimic IFNγ-BiPPB showing binding of pPB-peptide to INFγ.
Figure 7: Binding study in human hepatic stellate cell line LX2 cells. Cells are stained for PDGFR-binding peptides. Staining indicates the binding of pPB-containing constructs to target cells.
FIG. 8: Blood count analysis to study the side effects of treatment in acute liver injury mouse model. WBC = white blood cell count. LYM = lymphocytes. PLT = platelet count. RBC = red blood cell count. See Example 4 for details.
Figure 9: Real-time PCR analysis of liver fibrosis markers MMP13 and TIMP1. See Example 4 for details.
10: Effect of mimic IFN □ -PEG-BiPPB in acute CCl 4 -induced liver-damaged mouse model. Determination of a-SMA (A), Collagen-I (B) and Desmin (C)-Staining of liver sections is olive oil-treated normal mice, and IFNγ, mimics Obtained from CCl 4 -treated mice receiving only IFNγ, mimic IFNγ-PEG, mimic IFNγ-PEG-BiPPB (5 μg / mice) or PBS. Quantitation was performed using computerized Cell-D imaging software. Data represent mean ± SEM from 5 mice per group. #P <0.05 vs. PBS-treated olive oil group; * P <0.05, ** P <0.01 vs. PBS treated-CCl 4 group. See Example 6 for details.
FIG. 11: Real Time PCR analysis of markers for liver fibrosis in mice 3 days after CCl 4 administration or olive oil. Mice were treated with different compounds as shown and collagen 1a1 (A), a-SMA (B), desmine (C) and TIMP1 (D) mRNA levels were measured. See Example 6 for details.
12: Blood cell count analysis in whole blood of mice, 3 days after CCl4 administration or olive oil. Mice are treated with different compounds as shown and platelet count (PLT: fig A), leukocyte count (WBC, fig B) and lymphocyte count (C) are measured using a coulter counter. . See Example 6 for details.

실험적인 부분(Experimental part ( EXPERIMENTALEXPERIMENTAL SECTIONSECTION ))

간 섬유화(Liver Fibrosis)는 간의 상처(hepatic scars)를 유도하는 세포외 매트릭스 성분의 과도한 축적(excessive accumulation)에 의해 특징지어진다. 데이터에 대해, 어떠한 성공적인 치료도 간 섬유화의 치료에 대해 이용가능하다. 간성산세포(Hepatic stellate cells, HSCs) 및 섬유아세포(fibroblasts)는, 혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor, PDGF) 및 형질변형 성장 인자-β(transforming growth factor-beta, TGFβ)와 같은 중대한 성장 인자에 의해 활성화된, 질병의 진행(progression)에 포함된 중요한 이펙터 세포(key effector cells)이다. 인터페론 감마(IFNγ)는 간 섬유화 동안 시험관 내( in -vitro) 및 생체내( in - vivo )의 다양한 유익한 효과를 갖는 것으로 나타낸다. 그러나, IFNγ는 엄격한 종 특이성(strict species specificity)을 나타내고, 이의 잠재적인 임상적인 사용을 제한하는 짧은 순환하는 반감기(short circulating half life)를 갖는다. 게다가, INFγ는, 임상적인 실험으로부터의 환자의 빈번한 철수(frequent withdrawal)를 유발하고, 그 결과에 따라 이러한 실험의 실패를 유도하는, 면역계, 내피 세포(endothelial cells) 및 중추신경계(Central Nervous System)에서의 심각한 부작용(예를 들어, 우울증을 유발)을 갖는다. 이러한 문제점을 피하도록, 본 발명자는, 세포외 수용체 인지 사이트가 결여되고, 다운스트림(downstream) IFNγ 신호전달 캐스케이드(signalling cascade)에 직접적으로 상호작용하는 신호전달 모이어티를 포함하고 이로 인하여 IFNγ의 예상된 기능(prospective functions)이 유지되는, IFNγ의 안정된 펩티드 모방체(stable peptide mimetic)를 생산하였다.
Liver Fibrosis is characterized by excessive accumulation of extracellular matrix components that induce hepatic scars. For the data, any successful treatment is available for the treatment of liver fibrosis. Hepatic stellate cells (HSCs) and fibroblasts have significant growth such as platelet derived growth factor (PDGF) and transforming growth factor-beta (TGFβ). Key effector cells involved in disease progression, activated by factors. Interferon-gamma (IFNγ) is within the test tube during liver fibrosis (in -vitro) and in vivo - shows to have a variety of beneficial effects (in vivo). However, IFNγ exhibits strict species specificity and has a short circulating half life that limits its potential clinical use. In addition, INFγ triggers the frequent withdrawal of patients from clinical trials and, as a result, the failure of these trials, the immune system, endothelial cells, and the central nervous system (Central Nervous System). Have serious side effects (eg, causing depression). To avoid this problem, we include signaling moieties that lack extracellular receptor recognition sites and that interact directly with downstream IFNγ signaling cascades and thereby predict the IFNγ. A stable peptide mimetic of IFNγ was produced that retained prospective functions.

PDGF 수용체 발현이 특히 HSCs에서 간 손상 동안에 매우 상향-조절되기(up-regulated) 때문에, IFNγ 및 IFNγ 모방 펩티드의 특이성을 증가시키기 위해, BiPPB[PDGF-베타-수용체에 대한 비시클릭 펩티드(Bicyclic peptide against the PDGF-beta -receptor)]에 융합된 IFNγ 및 모방 펩티드가 생성되었다.
Since PDGF receptor expression is highly up-regulated during liver injury, especially in HSCs, to increase the specificity of IFNγ and IFNγ mimetic peptides, Bicyclic peptides for BiPPB [ P DGF-beta-receptors ( Bi cyclic) p eptide against the P DGF- b eta -receptor)] is fused IFNγ and a peptide mimic the resulted.

실시예 1 : 모방 IFN γ 마우스 지라세포의 클로닝은 갓 채취한 지라(fresh spleens)로부터 분리되고, 사이토카인 생성을 자극하도록 PHA[식물성 혈구응집소(Phytohemagglutinin)]의 존재 하에서 배양하였다. 자극(stimulation)의 24 hrs 후에, RNA 는 분리되고, cDNA 는 모방 IFNγ 특정한 전방향 및 역방향 프라이머(specific forward and reverse primers)를 사용한 퓨전 DNA 중합효소(phusion DNA polymerase)에 의한 PCR 증폭한 다음에 유전자 특이적인 역방향 프라이머를 사용하여 합성된다. 획득된 단편은 PshA1/EcoRI 사이트에서 pET42a[원핵 발현 벡터(prokaryotic expression vector)]에서 클로닝되고, 상기 양성 클론(positive clones)은 제한 절단 분석(restriction digestion analysis)에 의해 확인된다. 도 1 을 참고하라.
Example 1 mimic the IFN γ mouse spleen cells Cloning was isolated from fresh spleens and cultured in the presence of PHA (Phytohemagglutinin) to stimulate cytokine production. After 24 hrs of stimulation, RNA is isolated and cDNA is PCR amplified by fusion DNA polymerase using mimic IFNγ specific forward and reverse primers followed by gene It is synthesized using specific reverse primers. The obtained fragment is cloned in pET42a (prokaryotic expression vector) at the PshA1 / EcoRI site, and the positive clones are identified by restriction digestion analysis. See FIG. 1.

절단된 마우스 인터페론 감마의 5' -> 3' 뉴클레오티드 서열(NCBI 참고 서열: NM_008337.2)(nt 457-nt 572)은 하기한 바와 같다:The 5 '-> 3' nucleotide sequence of the cleaved mouse interferon gamma (NCBI reference sequence: NM_008337.2) (nt 457-nt 572) is as follows:

457 gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcgc tg 572 a
457 gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcgc tg 572 a

서열에서 마지막 아미노산인, 시스테인 전에 종결 코돈을 삽입하기 위해 마지막 뉴클레오티드가 첨가된다. 상기 펩티드의 적절한 폴딩(folding)을 제공하고, 또한 융합 단백질(BiPPB 와 함께)에서, 이황화결합 때문에 부적절한 폴딩을 피하기 위해 시스테인은 서열로부터 제거된다.
The last nucleotide is added to insert the stop codon before cysteine, the last amino acid in the sequence. Cysteine is removed from the sequence to provide proper folding of the peptide and also to avoid inappropriate folding due to disulfide bonds in the fusion protein (with BiPPB).

코딩된 아미노산 서열은 AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR*이다.
The encoded amino acid sequence is AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR * .

* 은 종결 코돈을 나타낸다.
* Indicates a stop codon.

IFN γ- BiPPB 및 모방 IFN γ- BiPPB 의 클로닝 . 비시클릭 PDGF 타겟팅 도메인 BiPPB를 코딩하는 핵산 서열은 4 개의 프라이머(각각의 단편에 대해 2)를 사용한 두 가지의 단편(fragments)의 증폭에 의해 생성된 다음에, 내재된 Bam HI 제한 부위(inbuilt Bam HI restriction site)를 사용하여 묶인(ligated) 다음에, ScaI/NotI 부위에서의 pET39b 벡터에서 클론되었다. IFNγ 및 모방 IFNγ는 펩티드 융합 프라이머[정방향(forward)] 및 IFNγ 또는 모방 IFNγ 역방항 프라이머를 사용하여 PCR 증폭된다. 증폭된 단편은 절단되고, NotI/XhoI 부위에서 pET39b-BiPPB 벡터에 묶이고(ligated), 양성 클론은 제한 절단 분석(restriction digestion analysis)에 의해 체크된다. 도 4 및 5 를 참고하라, 모든 구조물의 서열은 자동화된 DNA 시퀀싱에 의해 추가적으로 확인된다.
Cloning of the IFN γ- BiPPB and imitation IFN γ- BiPPB. The nucleic acid sequence encoding the bicyclic PDGF targeting domain BiPPB was generated by amplification of two fragments using four primers (2 for each fragment), followed by an inbuilt Bam HI restriction site. After ligated using the HI restriction site, it was cloned in the pET39b vector at the ScaI / NotI site. IFNγ and mimic IFNγ are PCR amplified using peptide fusion primers (forward) and IFNγ or mimic IFNγ reversed primers. The amplified fragment is cleaved and ligated to the pET39b-BiPPB vector at the NotI / XhoI site, and the positive clones are checked by restriction digestion analysis. 4 and 5, the sequences of all constructs are further confirmed by automated DNA sequencing.

BiPPBBiPPB

BiPPB 에 대한 뉴클레오티드 서열 : Nucleotide sequence for BiPPB:

tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca
tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca

BiPPB에 대한 아미노산 서열 : CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS(또한 도 3 을 참고하라)
Amino acid sequence for BiPPB: CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS (see also FIG. 3)

인터페론 감마[전장(Interferon gamma fullfull lengthlength )])]

뉴클레오티드 서열 : 마우스 인터페론 감마(NCBI 참고 서열: NM_008337.3)Nucleotide sequence: mouse interferon gamma (NCBI reference sequence: NM_008337.3)

gcggccgca 457 gcca agtttgaggt caacaaccca 481 caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa 541 tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcg 569 ataa
gcggccgca 457 gcca agtttgaggt caacaaccca 481 caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa 541 tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcg 569 ataa

마우스 IFNgamma에 대한 아미노산 서열Amino Acid Sequences for Mouse IFNgamma

MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC

융합된 단백질의 뉴클레오티드 서열(BiPPB-IFN 감마)Nucleotide sequence of the fused protein (BiPPB-IFN gamma)

tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca gcggccgca Interferon gamma sequence (NM_008337.3).
tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca gcggccgca Interferon gamma sequence (NM_008337.3).

BiPPB-IFN감마에 대한 아미노산 서열Amino Acid Sequences for BiPPB-IFNgamma

CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS AAAMNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
 CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS AAA MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRKQRSNELIRVVRK

이탤릭체는 BiPPB를 나타낸다; 일반 문자는 IFNgamma 모방을 나타낸다; 굵은 글씨(bold)는 링커 또는 스페이서를 나타낸다. 또한 도 4 를 참고하라.
Italics indicate BiPPB; Ordinary characters represent IFNgamma imitations; Bold indicates a linker or spacer. See also FIG. 4.

BiPPBBiPPB 로 융합된 모방 인터페론 감마Fused Imitation Interferon Gamma

상기 융합 단백질(BiPPB-IFN 감마 모방체)의 뉴클레오티드 서열Nucleotide sequence of the fusion protein (BiPPB-IFN gamma mimetics)

tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca gcggccgca 457 gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcg 569 ataa
tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca gcggccgca 457 gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccacc act gttgcc

BiPPB-IFN감마 모방체에 대한 아미노산 서열Amino Acid Sequences for BiPPB-IFNgamma Mimetics

CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS AAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR*
CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS AAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR *

이탤릭체는 BiPPB를 나타낸다; 일반 문자는 IFN감마 모방체를 나타낸다; 굵은 글씨는 링커 또는 스페이서를 나타낸다. 또한 도 5 를 참고하라.
Italics indicate BiPPB; Generic characters represent IFNgamma mimetics; Bold letters indicate linkers or spacers. See also FIG. 5.

그 다음에 핵산은 IPTG 도입(induction)을 사용하여 상기 발현을 위한 BL21 세포(E. coli) 내로 형질변형된다(transformed). 발현된 단백질은 항-IFNγ 항체 및/또는 항-PPB 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 또는 점 블럿 분석(Dot Blot analysis)으로 분석된다(도 6 을 참고하라). 그리고 난 다음에, 발현된 단백질(His Tag와 함께)은 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 통해 음성 조건(native conditions) 하에서 정제된다. 상기 태그는 단백질 가수 분해적으로 분열되고, 추가적으로 세파로오스 컬럼 크로마토그래피(sepharose column chromatography)를 사용하여 정제된다.
The nucleic acid is then transformed into BL21 cells ( E. coli ) for the expression using IPTG induction. The expressed protein is analyzed by SDS-PAGE and Western blot analysis or Dot blot analysis using anti-IFNγ antibody and / or anti-PPB antibody (see FIG. 6). The expressed protein (with His Tag) is then purified under native conditions via Ni-NTA column chromatography. The tag is proteolytically cleaved and further purified using sepharose column chromatography.

실시예 2 : 분열되고 유효한 모방 IFN γ의 항-섬유증 효과( Anti - fibrotic effects) : 우리는 면역 세포 화학(immuno-cytochemistry)에 의해 평가된 바와 같이 마우스 NIH3T3 섬유아세포에서의 분열된 IFNγ 모방 펩티드의 항-섬유증 효과를 측정하였다[a-SMA 염색(a-SMA staining)]. 간단하게, 3T3 섬유아세포는 6 x 104 cells/well의 밀도로 24 웰 플레이트에 접종되고, 24 시간 후에, 세포를 밤새 0.5% FBS 를 포함하는 배지에서 단식시켰다(starved). 그 후에, 세포를 상이한 화합물을 갖는 스타베이션 배지(PDGF 50 ng/ml, TGFβ 10 ng/ml, 모방 IFNγ 1㎍/ml, 50ng/ml PDGF + 1㎍/ml 모방 IFNγ 및 10 ng/ml TGFβ + 1㎍/ml 모방 IFNγ)에 배양시켰다. 배양의 48 hrs 후에, 세포를 세척하고, 에탄올:아세톤(1:1)로 고정시키고, α-SMA(활성화된 섬유아세포의 마커)에 대해 염색하였다(stained for α-SMA).
 Example 2: Anti - fibrotic effects of cleaved and effective mimic IFN γ : We report the cleavage of cleaved IFNγ mimetic peptides in mouse NIH3T3 fibroblasts as assessed by immuno-cytochemistry. Anti-fibrotic effect was measured [a-SMA staining]. Briefly, 3T3 fibroblasts were seeded in 24 well plates at a density of 6 × 10 4 cells / well, and 24 hours later, the cells were starved overnight in medium containing 0.5% FBS. Subsequently, the cells were treated with a stabilization medium with different compounds (PDGF 50 ng / ml, TGFβ 10 ng / ml, mimic IFNγ 1 μg / ml, 50ng / ml PDGF + 1 μg / ml mimic IFNγ and 10 ng / ml TGFβ + 1 μg / ml mimic IFNγ). After 48 hrs of incubation, cells were washed, fixed with ethanol: acetone (1: 1) and stained for α-SMA (marker of activated fibroblasts) (stained for α-SMA).

실시예 3 : 인간 LX2 세포에서의 BiPPB 및 모방 IFN γ- BiPPB 의 결합 연구: 우리는 LX2 세포(human HSCs)에서의 BiPPB 및 모방-BiPPB의 결합을 측정하였다. 간단하게, LX2 세포는 3 x 104 cells/well의 세포 밀도로 48 웰 플레이트에 평판배양 하였다(plated). 24 hrs 후에, 세포는 밤새 배지(-FBS)에서 단식시켰다(starved). 그리고 난 다음에, 세포를 결합을 위해 실온에서 2 hrs 동안 상이한 화합물(BiPPB, PPB-HSA 및 BiPPB-모방 IFNγ)로 배양하였다. 결합한 후에, 세포를 PBS 로 광범위하게 세척하고, 에탄올:아세톤(1:1)로 고정시키고, PPB 에 대해 염색하였다. 결과는 도 7 에 나타내었다.
Example 3 Binding Study of BiPPB and Mimic IFN γ- BiPPB in Human LX2 Cells : We measured the binding of BiPPB and mimic-BiPPB in LX2 cells (human HSCs). Briefly, LX2 cells were plated in 48 well plates at a cell density of 3 × 10 4 cells / well. After 24 hrs, cells were starved overnight in medium (-FBS). The cells were then incubated with different compounds (BiPPB, PPB-HSA and BiPPB-mimetic IFNγ) for 2 hrs at room temperature for binding. After binding, cells were washed extensively with PBS, fixed with ethanol: acetone (1: 1) and stained for PPB. The results are shown in FIG.

실시예 4 : 마우스에서의 급성 CCl 4 -유도된 간 손상에서의 생체 내 효과 연구: 재조합 IFNγ, 모방 IFNγ, 재조합 융합 단백질 IFNγ-BiPPB 및 재조합 융합 단백질 모방 IFNγ-BiPPB가 급성 CCL4 -유도된 간 손상 마우스 모델에서 항-섬유화 효과(anti-fibrotic effects)에 대해 테스트하였다. 1 일에, 상기 동물은 올리브오일에서의 사염화탄소(carbon tetrachloride)(CCl4) 또는 올리브오일(대조군 n=6)의 단일 복강내의 투여량(single intra-peritoneal dose)(1ml/kg)을 제공받았다. CCl4 주입의 24 hrs 후에, 2 일 및 3 일에, 동물을 PBS (n=6), IFNγ의 50,000 U/mice(n=6), 모방 IFNγ의 50,000 U/mice(n=5), IFNγ-BiPPB의 50,000 U/mice(n=6), 모방 IFNγ-BiPPB의 50,000 U/mice(n=6)로 처리하였다. 그 후에, 4 일에, 동물을 희생시키고, 혈구 계소(blood counts)를 수행하였고, 항-섬유화 효과를 정량 PCR 을 사용하여 평가하였다(Hemmann S, Graf J, Roderfeld M, Roeb. J Hepatol. 2007 May;46(5):955-75를 참고하라). 결과를 도 8 및 9 에 나타내었다.
 Example 4 In Vivo Effect Study in Acute CCl 4 -Induced Liver Injury in Mice: Acute CCL 4 - Induced Recombinant IFNγ, Mimic IFNγ, Recombinant Fusion Protein IFNγ-BiPPB and Recombinant Fusion Protein Mimic IFNγ-BiPPB Anti-fibrotic effects were tested in injured mouse models. On day 1, the animals received a single intra-peritoneal dose (1 ml / kg) of carbon tetrachloride (CCl 4 ) or olive oil (control n = 6) in olive oil. . After 24 hrs of CCl 4 injection, on days 2 and 3, animals were treated with PBS (n = 6), 50,000 U / mice of IFNγ (n = 6), mimic 50,000 U / mice (n = 5) of IFNγ, IFNγ -50,000 U / mice of BiPPB (n = 6) and mimic IFNγ-BiPPB of 50,000 U / mice (n = 6). Thereafter, on day 4, animals were sacrificed, blood counts were performed, and the anti-fibrotic effect was assessed using quantitative PCR (Hemmann S, Graf J, Roderfeld M, Roeb. J Hepatol. 2007 May; 46 (5): 955-75). The results are shown in FIGS. 8 and 9.

도 8 에 나타낸 데이터는, 모방-BiPPB가, CCl4-유도된 간 섬유화(p<0.01)와 관련된 전혈에서의 백혈구 계수(WBC) 및 림프구 계수(lymphocyte count, lym)의 상향조절(upregulation)을 약화시키는데에 있어서 변형되지 않는 INFγ 보다 더 유효함을 나타낸다. 대조적으로, 동물에게 변형되지 않은 INFγ(p< 0.0025) 대신에 모방-INFγ-BiPPB를 주었을 때, INFγ 처리와 관련된 혈소판 계수(PLT)에서의 감소(이는 INFγ의 매우 잘 알려진 부작용이다)가 더 적게 심각하다(less severe). The data shown in FIG. 8 shows that mimic-BiPPB shows upregulation of leukocyte count (WBC) and lymphocyte count (lym) in whole blood associated with CCl 4 -induced liver fibrosis (p <0.01). More effective than unmodified INFγ in weakening. In contrast, when animals were given mimic-INFγ-BiPPB instead of unmodified INFγ (p <0.0025), there was less reduction in platelet count (PLT) associated with INFγ treatment (this is a very well known side effect of INFγ). Not severe.

도 9에 나타낸 데이터는, 모방-INFγ-Bi-PPB 에게 항-섬유증 활성도(antifibrotic activity)를 부여함을 나타낸 것이다: 이는 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinases)(MMP13)의 CCl4-유도된 상향 조절(CCl4-induced upregulation)을 약화시킨다. 비율 MMP-13 대 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases, TIPM1)는 천연 INFγ와 수득된 것과 유사하지만, 모방 INFγ(p<0.03)보다 더 낫고, 이는 모방 INFγ와 Bi-PPB의 결합(coupling)이 유리함을 나타내는 것이다. 도 8 및 9에서의 전체적인 데이터는, 모방 INFγ-BiPPB 가 천연 INFγ와 비교하여 보다 효력이 있고, 보다 적은 부작용을 가짐을 나타내는 것이다.
The data shown in FIG. 9 show that the mimic-INFγ-Bi-PPB confers anti-fibrotic activity: CCl 4 -derived of matrix metalloproteinases (MMP13) Weakens upregulation (CCl 4 -induced upregulation). Tissue Inhibitor of Metalloproteinases (TIPM1) is similar to that obtained with native INFγ, but better than mimic INFγ (p <0.03), which is equivalent to mimic INFγ and Bi-PPB. Coupling is an advantage. Overall data in FIGS. 8 and 9 indicate that mimic INFγ-BiPPB is more potent and has fewer side effects compared to native INFγ.

실시예Example 5: 5:

모방 인터페론 감마 접합체Mimic interferon gamma conjugate 의of 화학적인 합성:  Chemical synthesis:

모방 IFN γ- PEG - BiPPB 접합체 : 0.111 μmol 비시클릭 PDGFR 인지 펩티드(Bicyclic PDGFR recognizing peptide)(BiPPB, 2223.2 Da, Genosphere Biotechnologies)는 3 hrs 동안 0.337μmol의 말레이미드-PEG-숙신이미딜 카르복시 메틸 에스테르(maleimide-PEG-succinimidyl carboxy methyl ester, Mal-PEG-SCM, 2 KDa, Creative PEGworks)와 결합된다. 그 후에, Mal-PEG-SCM의 유리기를 차단하기 위해 리신(0.337 μmol)을 첨가하였다. 반응의 1 hr 후에, 상기 합성된 생산물 BiPPB-PEG-MAL(0.112 μmol)을 실온에서 밤새 탈아세틸화된 시약(deacetylating reagent)의 존재 하에서 0.56 μmol의 모방 IFNγ-ATA (4689 Da, Genosphere Biotechnologies)와 반응시켰다. 최종적으로, 7 KDa 슬라이드-a-레이저 G2 투석 카세트(slide-a-lyzer G2 dialysis cassettes)(Thermo scientific)를 사용하여, 상기 합성된 모방 IFNγ-PEG-BiPPB 접합체(8828.2 Da)를 PBS 에 반하여(against PBS) 광범위하게 투석시켰다.
Mimic IFN γ- PEG - BiPPB conjugate : 0.111 μmol Bicyclic PDGFR recognizing peptide (BiPPB, 2223.2 Da, Genosphere Biotechnologies) contained 0.337 μmol of maleimide-PEG-succinimidyl carboxy methyl ester (3 hs). maleimide-PEG-succinimidyl carboxy methyl ester, Mal-PEG-SCM, 2 KDa, Creative PEGworks). Thereafter, lysine (0.337 μmol) was added to block the free groups of Mal-PEG-SCM. After 1 hr of the reaction, the synthesized product BiPPB-PEG-MAL (0.112 μmol) with 0.56 μmol mimic IFNγ-ATA (4689 Da, Genosphere Biotechnologies) in the presence of deacetylating reagent overnight at room temperature. Reacted. Finally, using the 7 KDa slide-a-lyzer G2 dialysis cassettes (Thermo scientific), the synthesized mimic IFNγ-PEG-BiPPB conjugate (8828.2 Da) against PBS ( against PBS).

모방 IFN γ- PEG 접합체: 0.107 μmol 모방 IFNγ-ATA(4689 Da)는 2hrs 동안 0.321 μmol의 폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB, 2 KDa, Nektar therapeutics)와 반응시키고, 그 다음에 상기 생성물을 광범위하게 투석시켰다.
Mimic IFN γ- PEG conjugate : 0.107 μmol Mimic IFNγ-ATA (4689 Da) was treated with 0.321 μmol of poly (ethylene glycol) -succinimidyl α-methylbutanoate (mPEG-SMB, 2 KDa, Nektar therapeutics) for 2hrs. Reaction, and the product was then dialyzed extensively.

Figure pct00002

Figure pct00002

실시예Example 6 : 6:

급성 간 손상 마우스 모델에서의 모방Imitation of Acute Liver Injury in a Mouse Model IFNIFN γ-γ- PEGPEG -- BiPPBBiPPB 의 of 정맥내Intravenous 투여 후의 섬유증 파라미터( Fibrosis parameters after administration fibroticfibrotic parametersparameters )에서의 효과) In

단백질 수준(Protein levels ( proteinprotein levellevel )에서의 섬유증 파라미터의 분석 :Analysis of fibrosis parameters in

마우스에게 간 손상을 유도하도록 1일에 CCl4를 복강내 주입하였다. 2일 및 3일에, 마우스는 IFNγ(5 ug/dose), 모방IFNγ-PEG, 모방IFNγ-PEG-BiPPB(5μg/dose) 또는 PBS 만으로 처리되었다. 4 일에, 동물은 희생되었다; 간 및 상이한 기관은 추가적인 분석을 위해 수집되었다. 간-절편은 아세톤으로 고정되고, 건조되고 PBS로 다시 수화되었다. 그리고 난 다음에, 상기 절편은 1 hr 동안 일차 항체(primary antibody)(콜라겐, SMA 및 데스민)와 배양되었다. 그 후에, 상기 절편을 30 min 동안 내인성 페록시다아제 활성도(endogenous peroxidase activity)를 위해 0.03% H2O2 로 차단하였다. 그 뒤에, 절편은 2차 항체 HRP 접합된 토끼 항-염소 항체(1:100, DAKO)와 배양한 다음에, HRP 접합된 염소 항-토끼 항체(1:100, DAKO)로 30 min 동안 배양하였다. 페록시다아제 활성도는 20 min 동안 AEC (Sigma)를 사용하여 진전되고(developed), 핵(nuclei)은 헤마톡시린(hematoxylin)(Fluka)과 함께 대비 염색제로 착색되었다. 상기 절편은 Kaiser's 젤라틴과 함께 고정되고, 광학 현미경(light microscope)(Olympus) 하에서 시각화되었다. 양적인 분석을 위해, 27 개의 현미경을 이용한 사진으로 기록하고, 양성적으로-염색된 영역(positively-stained areas)을 컴퓨터화된 Olympus Cell D 이미징(imaging) 소프트웨어를 사용하여 수량화하였다. 결과를 도 10 에 나타내었다.
Mice were intraperitoneally injected with CCl 4 per day to induce liver damage. On days 2 and 3, mice were treated with IFNγ (5 ug / dose), mimic IFNγ-PEG, mimic IFNγ-PEG-BiPPB (5 μg / dose) or PBS only. On day 4, the animal was sacrificed; Liver and different organs were collected for further analysis. Liver sections were fixed with acetone, dried and rehydrated with PBS. Then, the sections were incubated with primary antibodies (collagen, SMA and desmine) for 1 hr. Thereafter, the sections were blocked with 0.03% H 2 O 2 for endogenous peroxidase activity for 30 min. Subsequently, the sections were incubated with a secondary antibody HRP conjugated rabbit anti-goat antibody (1: 100, DAKO) and then incubated with HRP conjugated goat anti-rabbit antibody (1: 100, DAKO) for 30 min. . Peroxidase activity was developed using AEC (Sigma) for 20 min, and nuclei were stained with contrast stain with hematoxylin (Fluka). The sections were fixed with Kaiser's gelatin and visualized under a light microscope (Olympus). For quantitative analysis, 27 microscope images were recorded and positively-stained areas were quantified using computerized Olympus Cell D imaging software. The results are shown in FIG.

유전자 발현 수준에서의 섬유증 파라미터(Fibrosis parameters at gene expression level ( fibroticfibrotic parametersparameters )의 분석:) 'S analysis:

간 조직으로부터 전체적인 RNA 는 제조 회사의 지시에 따라 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. RNA 농도(concentration)는 UV 분광 광도계(미국 델라웨어 윌밍턴에 위치하는 NanoDrop Technologies)로 정량화하였다. 전체적인 RNA(1.6 ㎍)는 cDNA 합성 키트(Promega)와 함께 50 μl의 전체적인 부피에서의 역전사(reverse transcription)를 위해 사용되었다. 모든 프라이머는 Sigma-Genosys(Haverhill, UK)로부터 입수하였다. 10 ng의 cDNA는 양적인 리얼 타임 PCR 분석을 위해 사용되었다. 제조회사의 지시에 따라 SYBR green PCR mix(Applied Biosystems)를 사용하여 반응이 실행되었다. 상기 샘플을 ABI 7900HT 서열 탐지 시스템(sequence detection system)(Applied Biosystems)으로 분석하였다. 최종적으로, 한계 사이클 수(threshold cycle number, Ct)를 각각의 유전자에 대해 계산하였고, 참고 유전자(reference gene) GAPDH의 발현에 대해 정상화된 후에 상대적인 유전자 발현이 계산되었다. 결과를 도 11 에 나타내었다. 부작용의 분석을 도 12 에 나타내었다.
Total RNA from liver tissue was isolated using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. RNA concentration was quantified with a UV spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). Total RNA (1.6 μg) was used for reverse transcription in an overall volume of 50 μl with cDNA Synthesis Kit (Promega). All primers were obtained from Sigma-Genosys (Haverhill, UK). 10 ng cDNA was used for quantitative real-time PCR analysis. The reaction was performed using SYBR green PCR mix (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions. The samples were analyzed with an ABI 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems). Finally, threshold cycle number (Ct) was calculated for each gene and relative gene expression was calculated after normalization to the expression of reference gene GAPDH. The results are shown in FIG. Analysis of side effects is shown in FIG. 12.

실시예Example 7 : 7:

확립된 후기의 간 섬유화 마우스 모델(Established late liver fibrosis mouse model ( establishedestablished advancedadvanced liverliver fibrosisfibrosis mouse  mouse modelmodel )에서 모방 Imitation from) IFNIFN γ-γ- PEGPEG -- BiPPBBiPPB 의 of 정맥내Intravenous 투여 후에 섬유화 파라미터에서의 효과 Effect on Fibrosis Parameters After Administration

단백질 수준에서의 섬유화 파라미터의 분석:Analysis of Fibrosis Parameters at the Protein Level:

수컷 balb/c 마우스(20-22g)는 8 주 동안 복강 주사(intra-peritoneal injections)에 의해 일주일에 두 번 올리브 오일로 처리하거나 또는 CCl4의 증가하는 투여량[주(week) 1: 올리브 오일에서 조제된 0.5 ml/kg; 주 2: 0.8 ml/kg 및 주 3-8: 1 ml/kg]으로 처리하였다. 주 7 및 8 에, 마우스는 PBS, 모방IFNγ-PEG 또는 모방IFNγ-PEG-BiPPB(5 mg/mice, 일주일 당 3 번)로 정맥 주사로 처리하였다. 모든 마우스는 8 주에 희생되었다; 혈액 및 간 샘플을 차후의 측정을 위해 수집하였다. 상기 간 절편을 콜라겐 I 및 데스민, CD68, 33D1 및 MHC 클래스(class) II 에 대해 염색하였다. IFNγ의 타겟된 절단된 형태(targeted truncated form)(mimIFNγ-biPPB)가 마우스에서 이러한 만성 간 섬유화 모델에서의 상기 섬유화 파라미터에서의 상당한 감소가 유도됨이 발견되었다; 콜라겐 I 및 데스민 염색 둘 다는, 처리되지 않은 CCl4-마우스와 비교하여 mimIFNγ-biPPB-처리된 CCl4 마우스에서 완전히 감소되었다. 이와 대조적으로, 수용체 결합 부위가 결핍된, 타겟되지 않은 mimIFNγ의 처리는 이러한 파라미터에서 어떠한 효과도 유도되지 않은 반면에, 전장 마우스 IFNγ는 콜라겐 I 및 데스민 염색에서의 오직 작은 감소만이 유도되었다. 천연 (마우스) IFNγ는 염증 세포(inflammatory cells)[CD68+ 대식세포(macrophages), 호중구(neutrophils), 33D1+ 수상돌기 세포(dendritic cells)]의 침투 뿐만 아니라 증가된 MHCII 발현을 유도한다. 대조적으로, MimIFNγ-BiPPB 가 간에서의 이러한 증가된 염증성 반응을 유도하지 않는다.
Male balb / c mice (20-22 g) were treated with olive oil twice a week by intra-peritoneal injections for 8 weeks or with increasing doses of CCl 4 [week 1: olive oil 0.5 ml / kg prepared in; Week 2: 0.8 ml / kg and week 3-8: 1 ml / kg]. At weeks 7 and 8, mice were treated intravenously with PBS, mimic IFNγ-PEG or mimic IFNγ-PEG-BiPPB (5 mg / mice, 3 times a week). All mice were sacrificed at 8 weeks; Blood and liver samples were collected for subsequent measurements. The liver sections were stained for collagen I and desmin, CD68, 33D1 and MHC class II. It has been found that the targeted truncated form of IFNγ (mimIFNγ-biPPB) induces a significant reduction in the fibrosis parameters in this chronic liver fibrosis model in mice; Both collagen I and desmin staining were completely reduced in mimIFNγ-biPPB-treated CCl4 mice compared to untreated CCl4- mice. In contrast, treatment of untargeted mimIFNγ lacking a receptor binding site induced no effect on these parameters, whereas full-length mouse IFNγ induced only a small decrease in collagen I and desmin staining. Native (mouse) IFNγ induces increased MHCII expression as well as infiltration of inflammatory cells (CD68 + macrophages, neutrophils, 33D1 + dendritic cells). In contrast, MimIFNγ-BiPPB does not induce this increased inflammatory response in the liver.

실시예Example 8 : 8 :

PDGFPDGF 수용체에  On the receptor 타겟된Targeted 절단된  Cut IFNIFN γ 유사체는 유효하지만, 보다 적은 부작용을 일으킨다. γ analogs are effective but cause fewer side effects.

BiPPB 화학적으로 결합된 모방-IFNγ의 타겟된 접합체는 합성되고, 생체외 마우스 3T3 섬유아세포에서 이의 항-섬유화 효과를 위해 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 특징지었다. 생체 내에서, 타겟된 접합체는 4 일(급성) 및 8 주(만성)에 마우스에서 CCl4로 유도된 간 섬유증 모델에서 조사되었다. 몇몇의 섬유증 파라미터 및 염증 세포의 침투는, 면역 조직 화학 및 유전자 발현 분석을 사용하여 간에서 평가되었다.
Targeted conjugates of BiPPB chemically bound mimic-IFNγ were synthesized and characterized using Western blot analysis for its anti-fibrotic effect in ex vivo mouse 3T3 fibroblasts. In vivo, the targeted conjugates were examined in a liver fibrosis model induced by CCl 4 in mice on day 4 (acute) and week 8 (chronic). Several fibrosis parameters and infiltration of inflammatory cells were assessed in the liver using immunohistochemistry and gene expression analysis.

결과 : 성공적으로 합성된 접합체는 TGF베타-유도된 마우스 섬유아세포에서 콜라겐 발현의 저해를 야기한다. 생체 내에서, IFNγ의 타겟된 펩티도미에틱(targeted peptidomimetic)(mimIFNg-biPPB)은 마우스에서의 급성 및 만성 간 섬유증에서의 섬유증 파라미터에서의 상당한 감소가 유도되었다. 수용체 결합 도메인이 결여된 타겟되지 않은 mimIFNγ로 처리는 효과를 나타내지 않았고, 변형되지 않은 마우스 전장 IFNγ는 오직 보통의 감소만을 나타내었다. 이러한 마우스 전장 IFNγ는 염증 세포(CD68+ 대식세포, 호중구, 33D1+ 수상돌기 세포)의 침투 뿐만 아니라 증가된 MHCII 발현을 유도한다. 이와 대조적으로, MimIFNγ-BiPPB는 염증 반응을 유도하지 않는다(데이터로 나타내지 않음).
Results: Successfully synthesized conjugates result in inhibition of collagen expression in TGFbeta-induced mouse fibroblasts. In vivo, targeted peptidomimetic (mimIFNg-biPPB) of IFNγ induced a significant reduction in fibrosis parameters in acute and chronic liver fibrosis in mice. Treatment with untargeted mimIFNγ lacking the receptor binding domain did not work, and unmodified mouse full length IFNγ showed only a modest decrease. These mouse full-length IFNγ induces increased MHCII expression as well as infiltration of inflammatory cells (CD68 + macrophages, neutrophils, 33D1 + dendritic cells). In contrast, MimIFNγ-BiPPB does not induce an inflammatory response (data not shown).

실시예Example 9 : 9:

마우스에서 피하 종양 모델에서의 모방Imitation of a Subcutaneous Tumor Model in Mice IFNIFN γ-γ- PEGPEG -- BiPPBBiPPB 로의 연구Research into

물질 및 방법Materials and methods

20 내지 25 g의 무게의 정상 수컷 C57BL/6 및 Balb/c 마우스는 Harlan (네덜란드 자이스트에 위치)로부터 입수하였다. 그들은 12:12-시간 낮/밤 주기로 유지시키고, 자유식으로 정상 식이요법을 받았다. 동물 연구를 위한 모든 실험적인 프로토콜은 호르닝겐 대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인을 받았다. 피하 종양을 유도하도록, C26 세포는 성장 단계에서 이들을 유지하도록 동물에서의 주사 전에 하루에 125-mm3 플라스크에 배양되었다. 세포는 트립사니제이션(trypsanization)에 의해 분리되고, 트립신은 원심분리에 의해 제거된다. 세포 펠릿(cell pellet)은 PBS 에서 재현탁된다(resuspended). 100 μl의 PBS에서 현탁된 1 × 106 세포(B16 및 C26 세포)의 전부는 Balb/c 마우스의 옆구리에 피하 주사되었다. 종양 성장은 디지털 노 기스(digital Vernier caliper)를 사용하여 종양 크기를 측정이 이어졌다. 종양 부피는 화학식을 사용하여 확립되었고 : a × b2 / 2, a 는 종양 길이를 나타내고, b 는 종양 너비를 나타낸다. C26 종양은 기재된 바와 같이 마우스에서 유도된다. 이러한 종양 크기는 치료의 시작을 위한 최적의 종양 크기로서 나타내기 때문에 종양 부피가 50 내지 100 mm3의 범위에 도달하였을 때, 치료는 5 일에 시작되었다. 동물(그룹당 n = 4)은, 마취[O2/아이소플루레인(isoflurane)] 하에서 선택적인 날에 비히클(vehicle)(PBS), 모방IFNγ-PEG(5 mg/dose), 모방IFNγ-PEG-BiPPB(5 mg/dose)의 6 번의 투여량으로 정맥 내 주사하였다. 종양 크기는 마취 하에 측정되었다. 어떠한 치료의 효과를 관찰할 수 없기 때문에, C26 종양을 갖는 동물은 20 일에 희생되었다. 가스 마취(O2/아이소플루레인) 하에 동물은 희생되었고, 종양은 분리하고, 동결 절편(cryosection)을 위해 차가운 이소펜탄에 고정시켰다.
Normal male C57BL / 6 and Balb / c mice weighing 20 to 25 g were obtained from Harlan (located in the Netherlands Zist). They maintained a 12: 12-hour day / night cycle and were given a free diet. All experimental protocols for animal research were approved by the Animal Ethics Committee of the University of Horningen. To induce subcutaneous tumors, C26 cells were cultured in 125-mm 3 flasks per day prior to injection in animals to maintain them at the growth stage. Cells are separated by trypsanization and trypsin is removed by centrifugation. Cell pellets are resuspended in PBS. All of 1 × 10 6 cells (B16 and C26 cells) suspended in 100 μl of PBS were injected subcutaneously into the flanks of Balb / c mice. Tumor growth was followed by measuring tumor size using a digital Vernier caliper. Tumor volume was established using the formula: a × b2 / 2, a indicates tumor length and b indicates tumor width. C26 tumors are induced in mice as described. Since this tumor size is shown as the optimal tumor size for the start of treatment, treatment started on day 5 when the tumor volume reached the range of 50 to 100 mm 3 . Animals (n = 4 per group) were treated on vehicle (PBS), mimetic IFNγ-PEG (5 mg / dose), mimetic IFNγ-PEG- on selective days under anesthesia [O 2 / isoflurane]. It was injected intravenously at 6 doses of BiPPB (5 mg / dose). Tumor size was measured under anesthesia. Animals with C26 tumors were sacrificed on day 20 because no effect of any treatment could be observed. Animals were sacrificed under gas anesthesia (O 2 / isoflulane), tumors were separated and fixed in cold isopentane for cryosection.

4-μm-두꺼운 동결 절편(thick cryostat sections)은 스냅-동결된 조직으로부터 제조되고, 표준 면역퍼옥시다제 방법(standard immunoperoxidase methods)에 따라 CD31에 대해 염색되었다. 우리는, C26 종양의 종양 절편에서의 혈관 내강 면적(blood vessel lumen area) 및 혈관 밀도(blood vessel density)의 측정을 위해 CD31 염색[내피 세포 마커(endothelial cell marker)]을 분석하였다. 결과는 처리되지 않은 종양 및 모방 IFNγ로 처리된 마우스의 종양에서의 현저한 신생혈관생성(angiogenesis)을 나타낸 반면에, 모방 IFNγ-BiPPB으로 처리된 마우스는 이들의 종양에서 신생혈관생성에서의 강한 감소를 나타내었다(데이터로 나타내지 않음).
4-μm-thick cryostat sections were prepared from snap-frozen tissue and stained for CD31 according to standard immunoperoxidase methods. We analyzed CD31 staining (endothelial cell marker) for measurement of blood vessel lumen area and blood vessel density in tumor sections of C26 tumors. The results showed significant angiogenesis in untreated tumors and tumors of mice treated with mimicking IFNγ, whereas mice treated with mimicking IFNγ-BiPPB showed a strong decrease in angiogenesis in their tumors. Shown (not represented by data).

실시예Example 10 : 10:

폐 섬유증에서의 In pulmonary fibrosis PDGFPDGF -수용체 -Receptor 타겟된Targeted 절단된  Cut INFINF γ의 효과.effect of γ.

IPFIPF 환자에서의In patients INFINF γ-기반 치료를 위한 배경 및 이유: Background and Reasons for γ-Based Treatment:

특발성 폐 섬유화증(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 진단1 ,2 후의 오직 3 내지 5 년의 중앙 생존기간(median survival)을 갖는 진행형 실질 폐 질환(progressive parenchymal lung disease)이다. IPF 외에, 폐 섬유증의 그 밖의 타입은 좋지 못한 예후, 특히 섬유화된(fibrosing) 비-특이적인 간질성 폐렴(non-specific interstitial pneumonia, NSIP) 및 예를 들어 몇몇의 자가-면역 질환(auto-immune diseases) 및 외인성 알레르기성 폐포염(extrinsic allergic alveolitis)의 말기 섬유화(end-stage fibrosis)를 갖는다. 질병 매커니즘의 부족한 이해 때문에 폐 섬유증에 대한 어떠한 효율적인 치료도 없다.
Idiopathic pulmonary fibrosis is a (Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) is a progressive lung parenchyma with a median survival (median survival) of only 3 to 5 years after diagnosis 1, 2 (progressive parenchymal lung disease ). In addition to IPF, other types of pulmonary fibrosis have poor prognosis, especially fibrosing non-specific interstitial pneumonia (NSIP) and for example some auto-immune diseases. diseases and end-stage fibrosis of extrinsic allergic alveolitis. There is no efficient treatment for pulmonary fibrosis because of a poor understanding of the disease mechanism.

(근)섬유아세포는 폐 섬유증3의 모든 타입에서의 중심 역할(central role)을 갖는다. 폐에 대한 계속 진행 중인 손상(Ongoing damage to the lungs)은 근섬유아세포에 대한 이들의 변형 및 섬유아세포의 모집(recruitment)을 갖는 조절되지 않는 복구 매커니즘(dysregulated repair mechanisms)의 개시를 유도한다. 근섬유아세포는 콜라겐과 같은 세포외 매트릭스 성분의 과량을 생산하는 섬유증에서의 주요한 작용인자 세포(key effector cells)이다. 근섬유아세포는 폐 섬유증3의 치료를 위한 가장 중요한 치료상의 타겟일 것으로 현재 추정된다. 근섬유아세포의 증식 및 형질전환(transformation)에서의 주요한 성장 인자는 형질전환 성장 인자 베타(transforming growth factor beta, TGFb), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGR) 및 엔도텔린-1(endothelin-1)이고, 많은 새로운 치료는 이러한 인자 또는 이들의 수용체를 저해하는 것에 집중되어 있다. 그러나, 근섬유아세포 작용을 조절하는 것을 기초로 한 대부분의 임상 실험은 실망스러운 결과1를 나타내었다.
(Muscle) fibroblasts have a central role in all types of pulmonary fibrosis 3 . Ongoing damage to the lungs leads to the initiation of dysregulated repair mechanisms with their modifications to myofibroblasts and the recruitment of fibroblasts. Myofibroblasts are key effector cells in fibrosis that produce an excess of extracellular matrix components such as collagen. Myofibroblasts are currently estimated to be the most important therapeutic target for the treatment of pulmonary fibrosis 3 . The major growth factors in the proliferation and transformation of myofibroblasts are transforming growth factor beta (TGFb), platelet-derived growth factor (PDGR) and endothelin-1 (endothelin). -1), and many new treatments focus on inhibiting these factors or their receptors. However, most clinical trials based on modulating myofibroblast action showed disappointing results 1 .

인터페론 감마(IFNγ)는 IPF의 임상 실험에서 대개는 아마 가장-연구된 항-섬유증 매개체(the most-studied anti-fibrotic mediator)이다. 이는, 섬유화 반응4의 해결을 위해 중요한, STAT-1(신호 전달인자 및 전사-1의 활성 인자)-1-의존성 경로[(Signal Transducers and Activators of Transcription-1)-dependent pathway]를 통해 근섬유아세포 성장 정지 및 아포토시스(apoptosis)를 조절한다. 초기의 기대되는 시작에도 불구하고, IFNγ가 생존5을 연장시키지 않음을 보다 큰 INSPIRE 실험은 결론을 내렸다. 그러나, IFNγ는 피하에 투여되고, IFNγ 수용체가 몸의 거의 모든 세포에서 발견되기 때문에 이는 심각한 용량을 제한하는 부작용을 갖는다. 이러한 것들은 인플루엔자-유사 질환(influenza-like illness) 및 피로5(fatique)를 포함한다. 흡입 투여(Inhaled administration)는 이러한 문제를 부분적으로 피할 수 있고, 하나의 실험은 IPF에서의 에어로졸화된 IFNγ의 효과를 연구하기 위해 현재 등록되어 있다(http://clinicaltrials.gov를 참고하라).
Interferon gamma (IFNγ) is probably the most-studied anti-fibrotic mediator in clinical trials of IPF. This is because myofibroblasts via the STAT-1 (Signal Transducers and Activators of Transcription-1) -dependent pathway, which are important for the resolution of fibrosis reaction 4 , Regulate growth arrest and apoptosis. Despite the initial expected start, larger INSPIRE experiments concluded that IFNγ did not prolong survival 5 . However, IFNγ is administered subcutaneously and since IFNγ receptors are found in almost every cell of the body, it has side effects that limit severe doses. These include influenza-like illness and fatigue 5 . Inhaled administration can partially avoid this problem, and one experiment is currently registered to study the effects of aerosolized IFNγ in IPF (see http://clinicaltrials.gov).

근섬유아세포 내의 IFNγ의 농도를 증가시키기 위한 또 다른 방법 및 이와 같은 효능(efficacy)은 약물 타겟팅의 발상에 사용된다: 약물은 타겟 세포에 의해 특이적으로 흡수되는 세포-선택적인 약물 담체(cell-selective drug carriers)와 결합되고, 상기 약물은 이러한 세포 내에 방출됨으로써, 전신의 부작용을 감소시키면서 타겟 세포에 높은 국소 농도가 획득된다. 예를 들어 근섬유아세포는 약물 타겟팅 목적6에 사용될 수 있는 PDGF-수용체를 특이적으로 상향 조절한다(upregulate).
Another method for increasing the concentration of IFNγ in myofibroblasts and such efficacy is used in the idea of drug targeting: the drug is a cell-selective drug carrier that is specifically absorbed by the target cell. combined with drug carriers, the drug is released into these cells, thereby obtaining high local concentrations in the target cells while reducing systemic side effects. For example, myofibroblasts specifically upregulate PDGF-receptors that can be used for drug targeting purposes 6 .

CCl4 가 간 섬유화를 유도할지라도, 상기 폐는 시트크롬 P450 활성도의 보다 낮은 발현을 또한 갖고, 따라서 CCL4[이러한 효소에 의해 독성 화합물로 바뀜(turned into toxic compounds by this enzyme)]는 폐 조직에 또한 약간 활성화된다. 이러한 것은, 섬유화 활성도를 개시하는, 차례로 PDGF 수용체를 발현하는 섬유화 세포(profibrotic cells)의 활성화(activation)를 유도한다. 이러한 모델은 특발성 폐섬유화증의 모델(IPF, ref 8 및 9를 참고하라)로서 사용된다. 간 조직에서 INFγ의 항섬유화 효과(antifibrotic effects)를 조사하면서, 폐 조직에서 현저한 변화가 검사관에 의해 주목되었다. CCl4-처리된 마우스로부터의 폐의 무게는 정상 마우스의 폐보다 현저하게 더 높지만(정상에서의 몸무게의 0.75±0.05 % 대 처리되지 않은 CCl4-처리된 마우스에서 b.w.의 2.03 ±0.15 %; P < 0.01), 이러한 증가는 PPB-PEG-INFγ와 함께 처리에 의해 현저하게 감소된다(b.w의 1.53 ± 0.11 %; P < 0.05 대 처리되지 않는 CCl4 마우스). CCl4-처리된 마우스의 폐는 섬유증으로 진행될 수 있는 증상, 분산성 폐포염(diffuse alveolitis)에 의해 영향을 받고, 폐는 향상된 콜라겐 염색을 나타냄을 현미경 검사에 의해 나타났다. 이러한 마우스는 PDGF-수용체 인지 펩티드에 결합된 IFNγ로 처리하였을 때, 우리는 폐에서의 현저하게 감소된 폐포염 및 감소된 콜라겐 침전(reduced collagen deposition)을 발견하였다. 중요하게, 타겟된 IFNγ의 이러한 유리한 효과는 폐 질환이 확립된(establishing) 후에 획득된다.
Although CCl 4 induces liver fibrosis, the lung also has a lower expression of citchrome P450 activity, so CCL 4 [turned into toxic compounds by this enzyme] Is also slightly activated. This induces activation of profibrotic cells that in turn express fibrosis activity, which in turn expresses PDGF receptors. This model is used as a model of idiopathic pulmonary fibrosis (see IPF, ref 8 and 9). While investigating the antifibrotic effects of INFγ in liver tissue, significant changes in lung tissue were noted by the examiner. The weight of lungs from CCl 4 -treated mice was significantly higher than that of normal mice (0.75 ± 0.05% of normal weight vs. 2.03 ± 0.15% of bw in untreated CCl4-treated mice; P < 0.01), this increase is markedly reduced by treatment with PPB-PEG-INFγ (1.53 ± 0.11% of bw; P <0.05 vs untreated CCl4 mice). The lungs of CCl 4 -treated mice were affected by diffuse alveolitis, a symptom that could progress to fibrosis, and microscopic examination showed that the lungs exhibited enhanced collagen staining. When these mice were treated with IFNγ bound to PDGF-receptor recognition peptides, we found significantly reduced alveolitis and reduced collagen deposition in the lungs. Importantly, this beneficial effect of targeted IFNγ is obtained after lung disease is established.

따라서, PDGF-수용체-타겟된 INFγ가 중요한 PDGFβ-수용체 발현을 갖는 어떠한 조직에 축적될 수 있고, 폐에서의 이의 효과에 의해 설명될 수 있을 뿐만 아니라 그 밖의 조직에서 항섬유화 효과를 발휘할 수 있음을, 우리는 결론지을 수 있다. 따라서, 본 발명의 INFγ 유사체는, PDGF-수용체의 증진된 발현에 의해 특징지어지는 그 밖의 조직에서의 특발성 섬유증 및 그 밖의 형태의 섬유증 또는 경화증을 치료하는데 사용될 수도 있다.
Thus, PDGF-receptor-targeted INFγ can accumulate in any tissue with significant PDGFβ-receptor expression and can be explained by its effect in the lung as well as exert antifibrotic effect in other tissues. We can conclude. Thus, the INFγ analogs of the present invention may be used to treat idiopathic fibrosis and other forms of fibrosis or sclerosis in other tissues characterized by enhanced expression of PDGF-receptors.

실시예Example 11 : 11:

다양한 수용체에 대한 절단된 Cleaved for various receptors IFNIFN 감마의 타겟팅(Gamma Targeting ( targetingtargeting ))

이러한 실험에서, 쥣과 IFNγ의 신호전달 모이어티(mimIFNγ) 및 세포 표면 타겟팅 도메인(cell surface targeting domain)을 포함하는 본 발명의 유사체가 PDGF 수용체 뿐만 아니라 그 밖의 세포 표면 수용체를 유효하게 타겟팅할 수 있음을 나타낸다. 대표적인 테스트된 타겟팅 도메인은 락토오스[아시알로당단백질(Asialoglycoprotein)에 대한 리간드(ligand)(ASGP)], 만노오스[만노오스 수용체에 대한 리간드(CD 206)] 및 트리펩티드 RGD(수용체 ανβ3 인테그린 수용체에 대한 리간드)를 포함한다. mimIFNγ의 서열은 FEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR로 이루어져 있다. IFNγ 활성도를 테스트하기 위한 다양한 세포 타입 및 상이한 파라미터가 연구에서 사용되었다. 상기 대조군 샘플은 온전한 쥣과 INNγ(intact murine INNγ)에 노출된다. 세부사항에 대해 하기의 표를 참고하라.In these experiments, analogs of the present invention, including murine and IFNγ signaling moieties (mimIFNγ) and cell surface targeting domains, can effectively target PDGF receptors as well as other cell surface receptors. Indicates. Representative tested targeting domains include lactose [ligand for Asianloglycoprotein (ASGP)], mannose [ligand for mannose receptor (CD 206)] and tripeptide RGD (receptor ανβ3 integrin receptor) ). The sequence of mimIFNγ consists of FEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR. Various cell types and different parameters for testing IFNγ activity were used in the study. The control sample is exposed to intact murine and int murine INNγ. See the table below for details.

Figure pct00003

Figure pct00003

락토오스-Lactose HSAHSA -- PEGPEG -- IFNIFN γ과 함께 실험 : Experiment with γ:

합성synthesis

락토오스-HSA[25 개의 락토오스 분자가 인간 혈청 알부민(human serum albumin)과 결합됨]가 이작용기 PEG 분자(bifunctional PEG molecule)(2KDa)와 결합된다. 투석(dialysis) 후에, 락토오스-HSA-PEG 는 마우스로부터 유도된 SATA-변형된 절단된 IFNγ(SATA-modified truncated IFNγ)와 결합된다. 합성된 생산물(Lac-HSA-PEG-mimIFNγ)은 PBS에 대비하여(against PBS) 광범위하게 투석된다(dialysed).
Lactose-HSA [25 lactose molecules bound to human serum albumin] is bound to a bifunctional PEG molecule (2KDa). After dialysis, lactose-HSA-PEG is bound to SATA-modified truncated IFNγ derived from mice. The synthesized product (Lac-HSA-PEG-mimIFNγ) is dialysed extensively against agar (Pagast PBS).

인간 간세포에서의 실험 :Experiments in human hepatocytes:

인간 간세포(HepG2)는 12 웰 플레이트(1 x 105 cells/well)에 평판되었다. 상기 세포를 5 %/37 ℃/CO2 인큐베이터(incubator)에서 밤새 성장시켰다. 그 다음에, Lac-HSA와 차단된 2 hrs 후에, 세포는, Lac-HSA-PEG-IFNγ(1ug/ml), Lac-HSA 또는 Lac-HSA-PEG-IFNγ(1ug/ml)로 유도된 마우스 IFNγ, 인간 IFNγ(1ug/ml), 마우스 IFNγ(1ug/ml), 배지와 함께 배양되었다. 배양의 24 hrs 후에, 세포를 용해시키고, RNA 를 분리하고, 역전사하였다(reverse transcribed). cDNA 는 IFNγ에 대응하여 유도된 것으로 알려진, 세포내 부착 분자 1(Inter-Cellular Adhesion Molecule 1, ICAM1) 발현의 분석에 사용되었다. 18srRNA는 하우스키핑 대조군(housekeeping control)으로 사용된다.
Human hepatocytes (HepG2) were plated in 12 well plates (1 × 10 5 cells / well). The cells were grown overnight in a 5% / 37 ° C./CO 2 incubator. Then, after 2 hrs blocked with Lac-HSA, cells were induced with Lac-HSA-PEG-IFNγ (1ug / ml), Lac-HSA or Lac-HSA-PEG-IFNγ (1ug / ml). Incubated with IFNγ, human IFNγ (1ug / ml), mouse IFNγ (1ug / ml), medium. After 24 hrs of incubation, cells were lysed, RNA was isolated and reverse transcribed. cDNA was used for the analysis of Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 (ICAM1) expression, known to be induced in response to IFNγ. 18srRNA is used as a housekeeping control.

결과 :result :

예상된 바와 같이, 마우스 절단된 IFNγ 또는 Lac-HSA 둘 중 어느 것도 인간 간세포에서 ICAM1 발현을 유도하지 않는데 반하여, 인간 IFNγ 및 마우스 유도된 Lac-HSA-PEG-IFNγ 둘 다는 인간 간세포에서 ICAM1 발현을 상향 조절한다(upregulated). 게다가, Lac-HSA-PEG-IFNγ-유도된 ICAM1 발현은 과량의 Lac-HSA에 의해 거의 완전하게 차단된다.
As expected, neither human cleaved IFNγ or Lac-HSA induced ICAM1 expression in human hepatocytes, whereas both human IFNγ and mouse induced Lac-HSA-PEG-IFNγ upregulated ICAM1 expression in human hepatocytes. Upregulated. In addition, Lac-HSA-PEG-IFNγ-induced ICAM1 expression is almost completely blocked by excess Lac-HSA.

결론 :conclusion :

마우스 (절단된) INFγ가 인간 간세포에서 효과가 없음을 나타냄으로써, INFγ의 종-특이성이 확인되었다. 그러나, 이러한 사이토카인은, 아시알로당단백질 (ASGP) 수용체를 통해 간세포에 들어가는 것으로 알려진, 타겟 모이어티 락토오스와 결합한 후에 인간 세포에서 생리활성 화합물(bioactive compound)로 변한다. ASGP-수용체에 대한 특이성은 Lac-HSA에 의해 이러한 수용체의 차단(blockade)에 의해 나타난다. INFγ의 신호전달 부분(signaling part)(이는 종 특이적이지 않음)이 펩티드 대신에 당 모이어티를 사용하는 PDGF-수용체보다 다른 타겟 수용체를 통해 섬유아세포보다 그 밖의 타겟 세포의 세포질(cytoplasm) 내로 수송될 수 있음을, 이는 입증한다. 간세포 타겟팅은 간염 B 및 C 의 치료를 위해 특히 관련있고, ICAM-1 상향조절(upregulation)은 항바이러스성 활성도(antiviral activity)를 증진시키기 위한 생리적인 반응(physiological response)이다. 이러한 실험은 항바이러스성 화합물(antiviral compound)로서 본 발명에 따른 세포-특이적인-절단된 INFγ(cell-specific-truncated INFγ)의 사용을 지지한다.
Species-specificity of INFγ was confirmed by indicating that mouse (cut) INFγ is ineffective in human hepatocytes. However, these cytokines turn into bioactive compounds in human cells after binding to the target moiety lactose, which is known to enter hepatocytes via the asialo glycoprotein (ASGP) receptor. Specificity for the ASGP-receptor is indicated by the blockade of this receptor by Lac-HSA. The signaling part of INFγ (which is not species specific) is transported into the cytoplasm of other target cells than fibroblasts through other target receptors than PDGF-receptors using sugar moieties instead of peptides. This proves that it can be done. Hepatocyte targeting is particularly relevant for the treatment of hepatitis B and C, and ICAM-1 upregulation is a physiological response to enhance antiviral activity. This experiment supports the use of cell-specific-truncated INFγ according to the present invention as an antiviral compound.

유사하게, 만노오스는 표준 기술에 따라 절단된 마우스 INFγ와 결합되고(L. Beljaars et al J. of Hepatology 29: 579-588, 1998), 이러한 만노실레이트된(mannosylated) INFγ의 생물활성도는 판독-출력 파라미터(read-out parameters)로서 MHC 클래스 II 발현을 갖는 마우스 대식세포에서 나타났다(rtPCR 방법).
Similarly, mannose is associated with mouse INFγ cleaved according to standard techniques (L. Beljaars et al J. of Hepatology 29: 579-588, 1998), and the bioactivity of these mannosylated INFγ is read- It appeared in mouse macrophages with MHC class II expression as read-out parameters (rtPCR method).

이러한 세포에 결합되지 않는, 내피 결합 펩티드 RGD- 또는 이의 조절 펩티드 RAG(its control peptide RAG)는 표준 방법에 따라 절단된 마우스 INFγ와 또한 결합된다. 결과적으로 생성된 유사체는, 신생혈관생성을 반영하는 파라미터인 튜브 형성(tube formation)을 측정함으로써 내피 세포(H5V)의 배양(cultures)에서 이들의 생물학적 활성도에 대해 평가되었다. H5V 세포에 의한 튜브 형성은 이러한 검정에서 RGD 에 의해 가장 강력하게 저해된다(데이터로 나타내지 않음).
Endothelial binding peptide RGD- or its control peptide RAG (RAG), which does not bind to such cells, also binds to the truncated mouse INFγ according to standard methods. The resulting analogs were evaluated for their biological activity in cultures of endothelial cells (H5V) by measuring tube formation, a parameter reflecting angiogenesis. Tube formation by H5V cells is most strongly inhibited by RGD in this assay (data not shown).

결론 : 타겟팅 모이어티(예를 들어, 올리고당 또는 펩티드)에 대한 접합(conjugation)에 의해 절단된 마우스 INFγ의 변경(Modification)은 이러한 사이토카인의 신호전달 부분의 생물활성도 교란없이 실현가능하다. 이의 천연 수용체에 대한 결합에 결함이 있지만, 대신에 상기 유사체의 세포의 흡수를 조절하는 분명한 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는, INFγ 유사체의 수송은 더 적은 부작용을 갖는 보다 효과적인 치료상의 적용을 가능하게 한다.
Conclusions : Modification of mouse INFγ cleaved by conjugation to a targeting moiety (eg oligosaccharide or peptide) is feasible without disturbing the bioactivity of the signaling portion of this cytokine. Although defective in binding to its natural receptors, the transport of INFγ analogs, which can instead bind to distinct cell surface receptors that regulate the uptake of cells of the analogs, allows for more effective therapeutic applications with fewer side effects. do.

참고문헌references

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실시예Example 11: 11:

배양되거나 또는 갓 분리된 일차 세포(Primary cells cultured or freshly isolated ( freshlyfreshly isolatedisolated primaryprimary cellscells )에 대한 For) BiPPB 의Of BiPPB 결합 연구 Combined research

이러한 실시예는, 화학적으로 또는 재조합 기술을 통해 생성된 Bi-PPB 는 PDGFβ-수용체에 특이적으로 결합함을 나타낸다. 수용체 특이성은 특정한 항PDGF-β-수용체 항체와 결합을 차단함으로써 설명된다. 이것이 랫, 마우스 및 인간의 근-섬유아세포-유사 세포에 결합함으로써 BiPPB 는 종 비-특이적이다. 상기 모노시클릭 형태는 상기 타겟 수용체에 결합하지 않기 때문에, 수용체 상호작용은 적어도 2 개의 고리형 펩티드(at least two cyclic peptides)를 필요로 한다.
This example shows that Bi-PPB produced chemically or via recombinant technology specifically binds to PDGFβ-receptors. Receptor specificity is described by blocking binding to specific antiPDGF-β-receptor antibodies. BiPPB is species non-specific because it binds to myofibroblast-like cells in rats, mice and humans. Because the monocyclic form does not bind the target receptor, receptor interaction requires at least two cyclic peptides.

BiPPBBiPPB 의 서열:Sequence of:

C(1)S R N L I D C(1)G G G D G G C(2)S R N L I D C(2) : C (1) S R N L I D C (1) G G G D G G C (2) S R N L I D C (2):

Cys(1)-Cys(1) 및 Cys(2)-Cys(2) 이황화물 다리 고리화(disulfide bridge cyclisations).
Cys (1) -Cys (1) and Cys (2) -Cys (2) disulfide bridge cyclisations.

방법 :Way :

BiPPB의 결합은 일차 갓 분리된 랫 간성상 세포(primary freshly isolated rat hepatic stellate cells)에서 수행되었다. 세포는 배양 배지에서 30,000 cells/well로 8-웰 유리판(8-well glass plates)(미국 일리노이 네이퍼빌 눈크에 위치하는 Lab-Tek)에 접종되었다. 37 ℃/5 % CO2에서 밤새 배양한 후에, 세포를 PBS 로 세척하고, 그 다음에 실온에서 FITC-표지된 PPB[모노시클릭(monocyclic)] 또는 BiPPB [비시클릭(bicyclic): 10 μg/ml]와 함께 배양하였다. 결합을 차단하기 위해, 항-PDGF-βR IgG 는, FITC가 PPB 또는 BiPPB 와 결합되기 전에 1 h 세포에 첨가되었다. 2 h 후에, 세포는 차가운 PBS로 3 내지 4 번 세척하고, 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 핵을 DAPI 로 대비 염색하고, 시티플루오르(citifluor)[항-페이드 지시제(anti-fade reagent)]에서 고정시키고, 형광현미경 하에서 시각화하였다.
Binding of BiPPB was performed in primary freshly isolated rat hepatic stellate cells. Cells were seeded in 8-well glass plates (Lab-Tek, Naperville, Nuke, Ill.) At 30,000 cells / well in culture medium. After overnight incubation at 37 ° C./5% CO 2, the cells are washed with PBS and then FITC-labeled PPB [monocyclic] or BiPPB [bicyclic: 10 μg / ml at room temperature Incubated with]. To block binding, anti-PDGF-βR IgG was added to 1 h cells before FITC was bound with PPB or BiPPB. After 2 h, cells were washed 3-4 times with cold PBS and fixed with 4% paraformaldehyde. Nuclei were counterstained with DAPI, fixed in citifluor (anti-fade reagent) and visualized under fluorescence microscopy.

일차 갓 분리된 인간 근섬유아세포(primary freshly isolated human myofibroblasts), 마우스 3T3 섬유아세포 및 인간 간성상세포(human hepatic stellate cells)(LX2)에서 유사한 결합 실험을 수행하였다. 인간 간성상세포에 대해, BiPPB의 서열은 하기와 같다:Similar binding experiments were performed on primary freshly isolated human myofibroblasts, mouse 3T3 fibroblasts and human hepatic stellate cells (LX2). For human hepatic stellate cells, the sequence of BiPPB is as follows:

C(1)S R N L I D C(1) KGSGSGG C(2)S R N L I D C(2) : C (1) S R N L I D C (1) KGSGSGG C (2) S R N L I D C (2):

Cys(1)-Cys(1) 및 Cys(2)-Cys(2) 이황화물 다리 고리화(disulfide bridge cyclisations)
Cys (1) -Cys (1) and Cys (2) -Cys (2) disulfide bridge cyclisations

결과 : PDGF-수용체가 2합체 상호작용(dimeric interaction)을 필요로 하지만, FITC-결합된 모노시클릭 PPB 는 어떠한 결합을 나타내지 않는다. FITC-결합된 BiPPB 는 이러한 세포에 대한 결합의 수용체 특이성을 나타내는, PDGF 수용체 항체에 의해 거의 완전하게 차단된, 테스트된 세포 타임에 대한 현저한 결합을 나타낸다(데이터를 나타내지 않음).
Results: Although PDGF-receptors require dimeric interaction, FITC-bound monocyclic PPB does not show any binding. FITC-bound BiPPB shows significant binding to the tested cell times, almost completely blocked by PDGF receptor antibodies, indicating receptor specificity of binding to these cells (data not shown).

Claims (29)

인터페론 감마(IFNγ)의 유사체로서,
이의 천연 수용체에 결합을 조절하는 모이어티(moiety)는 적어도 기능적으로 교란되고, 상기 유사체는 세포내 IFNγ 활성도를 조절할 수 있는 신호전달 모이어티를 포함하고, 상기 신호전달 모이어티는 이의 N-말단에, 선택적으로 링커를 통해, 상기 IFNγ 수용체 외에 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 타겟팅 도메인과 함께 제공되는, 인터페론 감마의 유사체.
As an analog of interferon gamma (IFNγ),
The moiety that modulates binding to its natural receptor is at least functionally disturbed and the analog comprises a signaling moiety capable of regulating intracellular IFNγ activity, the signaling moiety at its N-terminus And an analog of interferon gamma, optionally provided with at least one targeting domain capable of binding to a cell surface receptor in addition to the IFNγ receptor, via a linker.
제1항에 있어서,
상기 세포내 활성도를 조절하는 상기 신호전달 모이어티는 다염기 핵 위치 신호(nuclear localization signal, NLS) 모티프를 포함하는, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 1,
The analogue of interferon gamma, wherein said signaling moiety that modulates intracellular activity comprises a polybasic nuclear localization signal (NLS) motif.
제2항에 있어서,
상기 다염기 NLS 모티프는 X 가 어떠한 아미노산 잔기인 아미노산 서열 (R)KRXRS(R), 바람직하게 X 는 R, K, S 또는 T 인 (R)KRXRS(R)을 포함하는, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 2,
Wherein the polybasic NLS motif comprises an amino acid sequence (R) KRXRS (R) wherein X is any amino acid residue, preferably X (R) KRXRS (R) wherein R, K, S or T.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 신호전달 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 인터페론 감마의 유사체:
(a) 아미노산 서열 KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR;
(b) 아미노산 서열 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ;
(c) 아미노산 서열 AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC;
(d) (a), (b) 또는 (c) 하의 상기 서열의 적어도 10, 바람직하게 적어도 15, 인접한 아미노산 스트레치(stretch);
(e) 세포내 신호전달 활성도가 유지된다면, (a) 또는 (b) 또는 (c)와 적어도 70 %, 바람직하게 적어도 80 %, 보다 바람직하게 적어도 90 % 동일성을 나타내는 아미노산 서열; 및
(f) 상기 신호전달 활성도, 예를 들어 핵 전좌(nuclear translocation)가 유지된다면, 최대한 10, 바람직하게 최대한 8, 보다 바람직하게 최대한 5 아미노산 잔기가 결실되거나, 첨가되거나 또는 치환된, (a) 또는 (b) 또는 (c) 하의 아미노산 서열;
(g) x 가 어떠한 아미노산 잔기인 공통 서열 VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS;
(h) x 가 어떠한 아미노산 잔기인 공통 서열 VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS; 및
(i) x 가 어떠한 아미노산 잔기인 공통 서열 Vxxx[Q/N][F/V/I]Q[R/H][Q/K]A[F/V/I][N/H]ELI[R/Q]Vx[H/A][Q/E]L[L/S]P[E/A][S/A][S/A][L/K]xxKRKRS.
4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The signaling moiety is an analog of interferon gamma comprising a sequence selected from the group consisting of:
(a) amino acid sequence KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR;
(b) amino acid sequence YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ;
(c) amino acid sequence AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC;
(d) at least 10, preferably at least 15, contiguous amino acid stretches of said sequence under (a), (b) or (c);
(e) an amino acid sequence that exhibits at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% identity with (a) or (b) or (c) if intracellular signaling activity is maintained; And
(f) if said signaling activity, eg nuclear translocation, is maintained, at most 10, preferably at most 8, more preferably at most 5 amino acid residues are deleted, added or substituted, (a) or amino acid sequence under (b) or (c);
(g) consensus sequence VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS, wherein x is any amino acid residue;
(h) consensus sequence VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS, wherein x is any amino acid residue; And
(i) consensus sequence Vxxx [Q / N] [F / V / I] Q [R / H] [Q / K] A [F / V / I] [N / H] ELI [where x is any amino acid residue R / Q] Vx [H / A] [Q / E] L [L / S] P [E / A] [S / A] [S / A] [L / K] xxKRKRS.
제4항에 있어서,
하기의 서열에 따라 신호전달 모이어티를 포함하는, 인터페론 감마의 유사체:
Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4 Val Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Gln Xaa10 Xaa11 Ala Xaa12 Xaa13 Glu Leu Ile Xaa14 Val Xaa15 Xaa16 Xaa17 Leu Xaa18 Pro Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24 Xaa25,

이 식에서,
Xaa1, Xaa2, Xaa3 Xaa4 Xaa6 Xaa11, Xaa13, Xaa14, Xaa16 Xaa17, Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 및 Xaa25 는 어떠한 아미노산 잔기이고,
Xaa5 는 Asn 또는 Thr 와 같은 극성, 비전하 잔기이고,
Xaa7 는 Pro 또는 Leu 와 같은 무극성, 소수성 잔기이고,
Xaa8 은 Gln 또는 Asn과 같은 극성, 비전하 잔기이고,
Xaa9 는 Val, Ile 또는 Leu와 같은 무극성 소수성 잔기이고,
Xaa10 은 Arg, His 또는 Lys와 같은 극성, 염기성 잔기이고,
Xaa12 는 Phe, Val 또는 Ile과 같은 무극성 소수성 잔기이고,
Xaa15 는 Val, Ile, Met와 같은 무극성 소수성 잔기인, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 4, wherein
Analogs of interferon gamma, including signaling moieties according to the following sequence:
Xaa 1 Xaa 2 Xaa 3 Xaa 4 Val Xaa 5 Xaa 6 Xaa 7 Xaa 8 Xaa 9 Gln Xaa 10 Xaa 11 Ala Xaa 12 Xaa 13 Glu Leu Ile Xaa 14 Val Xaa 15 Xaa 16 Xaa 17 Leu Xaa 18 Pro Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21 Xaa 22 Xaa 23 Lys Arg Lys Arg Ser Xaa 24 Xaa 25 ,

In this expression,
Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 Xaa 4 Xaa 6 Xaa 11 , Xaa 13 , Xaa 14 , Xaa 16 Xaa 17 , Xaa 18 Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21 Xaa 22 Xaa 23 Xaa 24 and Xaa 25 are any amino acid residues,
Xaa 5 is a polar, non-charged residue such as Asn or Thr,
Xaa 7 is a nonpolar, hydrophobic moiety such as Pro or Leu,
Xaa 8 is a polar, non-charged residue such as Gln or Asn,
Xaa 9 is a nonpolar hydrophobic moiety such as Val, Ile or Leu,
Xaa 10 is a polar, basic residue such as Arg, His or Lys,
Xaa 12 is a nonpolar hydrophobic moiety such as Phe, Val or Ile,
Xaa 15 is an analog of interferon gamma, which is an apolar hydrophobic residue such as Val, Ile, Met.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 타겟팅 도메인은, 섬유아세포(fibroblast) 및 섬유아세포-유사 세포(fibroblast-like cells), 바람직하게 근섬유아세포(myofibroblasts), 포탈 섬유아세포(portal fibroblasts), 혈관간막세포(mesangial cells), 인터스티셜 섬유아세포(interstitial fibroblasts), 알베올라 섬유아세포(alveolar fibroblasts) 및/또는 기질 세포(stromal cells)에 특이적인 수용체에 결합할 수 있는, 인터페론 감마의 유사체.
The method according to any one of claims 1 to 5,
The targeting domain is fibroblast and fibroblast-like cells, preferably myofibroblasts, portal fibroblasts, mesialial cells, interstitial An analog of interferon gamma capable of binding to receptors specific for interstitial fibroblasts, alveolar fibroblasts and / or stromal cells.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 타겟팅 도메인은, 올리고당(oligosaccharide) 또는 당단백질(glycoprotein)에 대한 수용체, 바람직하게 만노오스 6-인산/인슐린-유사 성장 인자-Ⅱ 수용체(M6P/ IGF2R), 아시알로당단백질(ASGP) 수용체 또는 상기 만노오스 수용체(CD 206)에 결합할 수 있는, 인터페론 감마의 유사체.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
The targeting domain is an receptor for oligosaccharides or glycoproteins, preferably mannose 6-phosphate / insulin-like growth factor-II receptor (M6P / IGF2R), asialo glycoprotein (ASGP) receptor or An analog of interferon gamma, capable of binding to mannose receptor (CD 206).
제7항에 있어서,
상기 타겟팅 도메인은, 담체 분자에 접합된, 올리고당, 바람직하게 만노오스(-6-인산) 또는 락토오스인, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 7, wherein
The targeting domain is an analog of interferon gamma, which is an oligosaccharide, preferably mannose (-6-phosphate) or lactose, conjugated to a carrier molecule.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수용체는 PDGF 수용체, 콜라겐 타입 VI 수용체, 및 TGF베타 수용체, TNF알파 수용체, 인슐린 성장 인자 수용체, VEGF 수용체, 케모카인 수용체 및 IL1베타 수용체를 포함하는 사이토카인 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된, 인터페론 감마의 유사체.
7. The method according to any one of claims 1 to 6,
The receptor is an analog of interferon gamma, selected from the group consisting of PDGF receptor, collagen type VI receptor, and cytokine receptor including TGFbeta receptor, TNFalpha receptor, insulin growth factor receptor, VEGF receptor, chemokine receptor and IL1beta receptor. .
제9항에 있어서,
수용체는 PDGF 수용체, 바람직하게 PDGFβ 수용체인, 인터페론 감마의 유사체.
10. The method of claim 9,
The receptor is an analog of interferon gamma, which is a PDGF receptor, preferably a PDGFβ receptor.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 타겟팅 도메인은 적어도 하나의 고리형 펩티드 일부를 포함하는, 인터페론 감마의 유사체.
11. The method according to any one of claims 1 to 10,
The targeting domain comprises an analog of at least one cyclic peptide.
제11항에 있어서,
상기 타겟팅 도메인은 고리형 펩티드 일부의 적어도 하나의 반복 서열, 바람직하게 동일한 고리형 펩티드 일부를 포함하는, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 11,
Wherein the targeting domain comprises at least one repeating sequence of a portion of the cyclic peptide, preferably the same portion of the cyclic peptide.
제11항에 있어서,
반복 서열 내의 상기 두 개의 고리형 펩티드 일부는 2 내지 7 아미노산의 링커를 통해 연결되는, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 11,
An analog of interferon gamma, wherein some of the two cyclic peptides in the repeating sequence are linked via a linker of 2 to 7 amino acids.
제13항에 있어서,
상기 링커는 (i) m이 1 또는 2 인, 서열 K(GS)mGG, 및 (ii) n + m 은 4 내지 7 이고, n ≥ 4 이고, M 은 0 내지 3 사이의 정수인, 일반식 서열 [GnDm] 로 이루어진 군으로부터 선택된, 인터페론 감마의 유사체.
The method of claim 13,
The linker is of the general formula (i) wherein m is 1 or 2, the sequence K (GS) m GG, and (ii) n + m is 4 to 7, n ≥ 4 and M is an integer from 0 to 3 An analog of interferon gamma, selected from the group consisting of sequence [G n D m ].
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 타겟킹 도메인은 적어도 아미노산 서열 RGD, KPT, SRN, NLI 및/또는 LID를 포함하는, 인터페론 감마의 유사체.
15. The method according to any one of claims 1 to 14,
Wherein the targeting domain comprises at least the amino acid sequence RGD, KPT, SRN, NLI and / or LID.
제15항에 있어서,
상기 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 CSRNLIDC-링커-CSRNLIDCS를 포함하고, 상기 링커는 3 내지 7, 바람직하게 4 또는 5의 아미노산 서열, 아미노산 잔기인, 인터페론 감마의 유사체.
16. The method of claim 15,
The targeting domain comprises an amino acid sequence CSRNLIDC-Linker-CSRNLIDCS, wherein the linker is an amino acid sequence of 3 to 7, preferably 4 or 5, amino acid residues.
타겟팅 도메인에 접합된 관심 화합물을 포함하는 접합체로서,
상기 타겟팅 도메인은 아미노산 서열 X1SRNLIDX2-링커-X3SRNLIDX4를 포함하고, X1 및 X2 의 쌍 및 X3 및 X4 의 쌍은 이환체 구조가 형성되도록 결합, 바람직하게는 펩티드 결합(peptidic bond)을 형성할 수 있으며, 상기 서열 SRNLID 는 고리의 각 부분이며, 상기 링커는 2 내지 7, 바람직하게 3 내지 5의 아미노산 서열, 아미노산 잔기인, 접합체.
A conjugate comprising a compound of interest conjugated to a targeting domain,
The targeting domain comprises an amino acid sequence X 1 SRNLIDX 2 -linker-X 3 SRNLIDX 4 , The pair of X 1 and X 2 and the pair of X 3 and X 4 may form a bond, preferably a peptidic bond such that a dicyclic structure is formed, wherein the sequence SRNLID is each part of a ring, and The linker is an amino acid sequence of 2 to 7, preferably 3 to 5, amino acid residues.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
바람직하게 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된, 적어도 하나의 비-항원성 중합체와 함께 제공되는, 유사체 또는 접합체.
The method according to any one of claims 1 to 17,
Analogs or conjugates, provided with at least one non-antigenic polymer, preferably selected from the group consisting of polyethylene glycol and derivatives thereof.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 단백질 유사체(proteinaceous analog) 또는 접합체를 코딩하는 분리된 핵산 서열.
An isolated nucleic acid sequence encoding a proteinaceous analog or conjugate according to any one of claims 1 to 18.
제19항에 따라 분리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
An expression vector comprising a nucleic acid sequence isolated according to claim 19.
제18항에 따른 핵산 서열 또는 제20항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 포유동물의 숙주 세포인, 숙주세포.
A host cell comprising a nucleic acid sequence according to claim 18 or a vector according to claim 20, wherein said host cell is a bacterial or mammalian host cell.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유사체 또는 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
A pharmaceutical composition comprising an analog or conjugate according to any one of claims 1 to 18 and a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant and / or excipient.
암, 바이러스성 질환, 섬유증 질환(fibrotic disease), 경화성 질환(sclerotic disease) 및 만성 또는 급성 염증성 질환으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유사체 또는 접합체의 용도.
19. The method of claim 1 for the preparation of a medicament for the treatment or prophylaxis of cancer, viral diseases, fibrotic diseases, sclerotic diseases and diseases selected from chronic or acute inflammatory diseases. Use of an analog or conjugate according to any one of the preceding claims.
암, 바이러스성 질환, 섬유증 질환, 경화성 질환 및 만성 또는 급성 염증성 질환으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료를 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유사체 또는 접합체.
An analogue or conjugate according to any one of claims 1 to 18 for the treatment for the treatment or prevention of cancer, viral diseases, fibrosis diseases, sclerotic diseases and chronic or acute inflammatory diseases.
제24항에 있어서,
간질환, 바람직하게 간경변증과 같은 만성 간질환의 치료를 위한 유사체 또는 접합체.
25. The method of claim 24,
Analogues or conjugates for the treatment of liver disease, preferably chronic liver disease such as cirrhosis.
제24항에 있어서,
바이러스성 질환, 바람직하게 인플루엔자 바이러스 또는 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)에 기인한 질환을 치료하기 위한, 유사체 또는 접합체.
25. The method of claim 24,
Analogues or conjugates for the treatment of viral diseases, preferably diseases caused by influenza virus or respiratory syncytial virus (RSV).
제1항 내지 제18항에 따른 유사체 또는 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 암, 바이러스성 질환, 섬유증 질환, 경화성 질환 및 만성 또는 급성 염증성 질환으로부터 선택된 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료방법.
Treating a disease selected from cancer, viral disease, fibrosis disease, sclerotic disease and chronic or acute inflammatory disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an analog or conjugate according to claim 1 or Treatment for prevention.
제27항에 있어서,
상기 질환은 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 간질성 섬유증(interstitial fibrosis), 폐 섬유증(lung fibrosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론병(Crohns disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 패혈증(sepsis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 바람직하게 상기 질환은 간 질환, 보다 바람직하게 간경변증과 같은 만성 간질환인, 치료방법
28. The method of claim 27,
The diseases include glomerulosclerosis, interstitial fibrosis, lung fibrosis, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis ulcerosa, glomerulonephritis and sepsis, preferably the disease is a liver disease, more preferably a chronic liver disease such as cirrhosis.
제27항 또는 제28항에 있어서,
상기 투여는 점막 투여(mucosal administration), 바람직하게 폐내 투여(intrapulmonary administration)를 포함하는, 치료방법.
29. The method of claim 27 or 28,
The administration comprises mucosal administration, preferably intrapulmonary administration.
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