KR20120086533A - Thrombolytic fucoidan derived from undaria pinnatifida sporophylls - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 미역포자(Undaria pinnatifida sporophylls) 유래의 혈전용해용 푸코이단에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 미역포자에서 유래되고 분획화되지 않은 것을 특징으로 하는 혈전용해 용도를 갖는 푸코이단에 관한 것이다.
The present invention relates to a fucoidan for thrombolysis derived from Undaria pinnatifida sporophylls, and more particularly, to a fucoidan having a thrombolytic use derived from seaweed spores and not fractionated.
유로키나아제 또는 조직 플라즈미노겐 활성화제(t-PA)는 중증 또는 광범위 심부정맥혈전증, 폐색전증, 심근경색증의 치료, 및 폐색된 정맥내 또는 투석용 캐눌라의 처리를 위한 혈전제로서 임상적으로 사용된다. 재조합 t-PA를 사용하는 혈전용해 요법은 급성 심근경색증에서 효과적이지만, 이러한 치료는 상당히 느린 재관류 속도 및 빈번한 조기 재폐색에 의해 제한된다. 혈전용해 요법 이후의 관상동맥 재폐색은 헤파린 투여에도 불구하고 환자의 1/3에서 발생한다. 헤파린은 3원 착물을 형성함으로써 트롬빈이 피브린 중합체에 결합하는 것을 촉진하므로, 관상 재폐색의 예방 효능이 제한적이다. 조기 재폐색은 혈전용해 요법 동안에 혈전으로부터 트롬빈이 방출되는 메카니즘에 의한 것일 수 있다. 활성 형태의 트롬빈(CPU)은 내인성 피브린용해를 하향 조절하는 프로카복시펩티다아제 U를 활성화시키는 것으로 최근에 알려졌다. 그러므로, 혈전용해 효능을 향상시키는 한가지 방법은 이론적으로는 전-혈전용해 효과를 가질 수 있는 저분자량의 트롬빈 직접 억제제에 t-PA를 결합시켜서, 피브린 결합된 트롬빈을 억제하고/하거나 CPU 활성화를 억제하는 것일 수 있다.Eurokinase or tissue plasminogen activator (t-PA) is used clinically as a thrombosis agent for the treatment of severe or widespread deep vein thrombosis, pulmonary embolism, myocardial infarction, and treatment of occluded intravenous or dialysis cannula. do. Thrombolytic therapy using recombinant t-PA is effective in acute myocardial infarction, but this treatment is limited by the significantly slower reperfusion rate and frequent early reclosure. Coronary artery reobstruction after thrombolytic therapy occurs in one third of patients despite heparin administration. Heparin promotes the binding of thrombin to fibrin polymers by forming ternary complexes, thus limiting the prophylactic efficacy of coronary reobstruction. Early reclosure may be due to the mechanism by which thrombin is released from thrombi during thrombolytic therapy. The active form of thrombin (CPU) has recently been known to activate procarboxypeptidase U, which downregulates endogenous fibrin lysis. Therefore, one way to improve thrombolytic efficacy is to theoretically bind t-PA to low molecular weight thrombin direct inhibitors that may have a pro-thrombolytic effect, thereby inhibiting fibrin bound thrombin and / or inhibiting CPU activation. It may be.
관상동맥 혈전증은 일반적으로는 죽상경화판의 파열에 의해 일어난다. 트롬빈과 같은 강한 혈소판 작용제의 국소 발생 및 질병있는 동맥에 존재하는 고 전단력 때문에, 동맥 혈전에는 종종 혈소판이 풍부하다. 그러나, 혈소판이 풍부한 혈전은 t-PA에 의해 잘 용해되지 않는다. 그러므로, 추가적인 출혈 위험없이 현재의 혈전용해제의 효능을 최대화하는 다른 유형의 혈전용해제에 대한 연구가 계속된다.Coronary thrombosis is usually caused by rupture of atherosclerotic plaques. Due to the local development of strong platelet agonists such as thrombin and the high shear forces present in diseased arteries, arterial clots are often rich in platelets. However, platelet-rich thrombi are poorly dissolved by t-PA. Therefore, research continues on other types of thrombolytics that maximize the efficacy of current thrombolytics without the risk of additional bleeding.
종래, 푸코이단은 대부분의 in vitro 연구에서 t-PA 유도된 혈전용해 활성에 대해 자극 효과를 나타내는 것으로 알려졌으며, 이는 α2-플라즈민 억제제로부터 플라즈민 활성을 보호하고 피브린 중합체 형성 속도를 감소시키는 메카니즘을 시사한다. 자극 활성의 크기는 설페이트화 정도에 따라 좌우되고, 푸코이단의 추가적인 화학적 설페이트화에 의해 증가된다.Conventionally, fucoidan has been shown to have a stimulatory effect on t-PA induced thrombolytic activity in most in vitro studies, which protects plasmin activity from α2-plasmin inhibitors and reduces the rate of fibrin polymer formation. Suggest. The magnitude of the stimulatory activity depends on the degree of sulphation and is increased by further chemical sulphation of fucoidan.
갈조류로부터 추출된 분지형 설페이트화 푸칸인 푸코이단은 직접적인 트롬빈 억제에 의해 매개되는 항응고 및 항혈전 효과를 갖는 반면, 극피동물로부터 유래된 선형 푸칸은 포유동물 글리코사미노글리칸에 대해 보고된 바와 같이 트롬빈 억제에 있어 헤파린 보조인자(cofactor) II의 존재를 필요로 한다. 트롬빈은 피브리노겐을 피브린(프로트롬보)으로 전환시켜서 혈전 형성을 촉진시키고 proCPU를 CPU(항피브린용해성)로 전환시켜서 혈전 안정화를 촉진시키므로, 이러한 직접적인 트롬빈 억제는 내인성 피브린용해 시스템을 용이하게 할 수 있다. 푸코이단의 항응고 및 항혈전 활성화는 널리 연구되어 왔으나, in vitro 피브린용해 시스템에 관하여는 거의 알려져 있지 않다. Soeda 등은 시판중인 물질(Fucus . vesiculosus)을 화학적 설페이트화하여 제조되는 고 설페이트화 푸코이단이 Lys-플라즈미노겐의 t-PA-촉매화된 활성화를 증가시키고, α2-플라즈민 억제제로부터의 플라즈민 활성을 보호함으로써 t-PA-유도된 혈장괴 용해(plasma clot lysis)를 자극한다고 보고하였다. Doctor 등은 정제된 시판중인 푸코이단이 2개-사슬의 t-PA 및 저분자량 u-PA에 의해 Glu- 및 Lys-플라즈미노겐의 활성화를 촉진시킴을 증명하였다. 또한, 푸코이단이 PAI-1(plasminogen-activator inhibitor-1)에 결합하여 PAI-1의 활성화를 감소시킨다는 것이 푸코이단-세파로즈 친화도 크로마토그래피로부터 알려졌다. 또한, Nishino 등은 E. Kurome 유래의 푸코이단이 t-PA-매개된 플라즈미노겐 활성화에 부가하여 HMW u-PA-매개된 플라즈미노겐 활성화에 의해 플라즈민 발생을 크게 증가시킴을 나타내었다. 이러한 모든 in vitro 선행기술은 혈전용해 활성에서의 푸코이단 역할을 암시하고 있으나, 푸코이단 단독으로 사용되어 in vivo 혈전증 모델에서 혈전용해 효과를 갖는 것에 대해서는 보고된 바 없다.Fucoidan, a branched sulfated fucan extracted from brown algae, has anticoagulant and antithrombotic effects mediated by direct thrombin inhibition, whereas linear fucans derived from echinoderm have been reported for mammalian glycosaminoglycans. Thrombin inhibition requires the presence of heparin cofactor II. Since thrombin promotes thrombus formation by converting fibrinogen into fibrin (prothrombo) and promotes thrombus stabilization by converting proCPU into CPU (antifibrin soluble), this direct thrombin inhibition can facilitate the endogenous fibrin dissolution system. . Anticoagulant and antithrombotic activation of fucoidan have been widely studied, but little is known about the in vitro fibrin lysis system. Soeda et al. Reported that high sulfated fucoidans prepared by chemical sulphation of commercially available substances ( Fucus . Vesiculosus ) increase t-PA-catalyzed activation of Lys-plasminogen and plasma from α 2 -plasmin inhibitors. It has been reported to stimulate t-PA-induced plasma clot lysis by protecting the min activity. Doctor et al. Demonstrated that purified commercial fucoidan promotes Glu- and Lys-plasminogen activation by two-chain t-PA and low molecular weight u-PA. Fucoidan-Sepharose Affinity Chromatography has also been shown to reduce the activation of PAI-1 by binding to PAI-1 (plasminogen-activator inhibitor-1). Nishino et al. Also showed that fucoidan from E. Kurome significantly increased plasmin generation by HMW u-PA-mediated plasminogen activation in addition to t-PA-mediated plasminogen activation. All these in vitro prior art suggest a role of fucoidan in thrombolytic activity, but no reports have been made of fucoidan alone to have a thrombolytic effect in an in vivo thrombosis model.
대한민국 특허출원 10-2004-0003912호 ‘심혈관계 질환 개선 조성물’에는 해조류로부터 유래된 알긴산 2?70중량%, 푸코이단 0.5?30중량%, 라미나린 1?50중량%, 플로로글루시놀류 2?70중량% 및 푸코스테롤 0.01?10중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환 개선 조성물이 개시되어 있고, Republic of Korea Patent Application No. 10-2004-0003912 'cardiovascular disease improvement composition' has 2 to 70% by weight of alginic acid, 0.5 to 30% by weight of fucoidan, 1 to 50% by weight of laminarin, phloroglucinol 2? Disclosed is a cardiovascular disease improvement composition comprising 70% by weight and 0.01-10% by weight of fucosterol,
대한민국 특허출원 10-2008-0120587 호 ‘푸코이단을 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물’에는 푸코이단을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진 및 활성용 약학 조성물이 기재되어 있으며, Republic of Korea Patent Application No. 10-2008-0120587 'Pharmaceutical composition for promoting bone formation and active containing fucoidan' describes a pharmaceutical composition for promoting bone formation and active containing fucoidan as an active ingredient,
대한민국 특허출원 10-2006-0009097 호 ‘푸코이단을 함유하는 항비만용 고추장’에는 고추장 제조시, 푸코이단 분말 0.5~3 중량%를 첨가하여 제조함을 특징으로 하는 항암 기능성 증진 고추장의 제조방법이 기재되어 있으나, 선행 기술중 어디에도 푸코이단 만을 이용하여 혈전용해제로 사용하는 것에 대하여는 기재된 바가 없다.
Korean Patent Application No. 10-2006-0009097 'An anti-obesity kochujang containing fucoidan' describes the preparation of anti-cancer functional enhancement kochujang characterized by adding 0.5 to 3% by weight of fucoidan powder when preparing kochujang. However, none of the prior art has been described for the use of thrombolytics using only fucoidan.
본 발명에서는 미역포자(Undaria pinnatifida sporophylls)로부터 유래된 분획되지 않은 저분자량 푸코이단 분획물의 혈전용해 효과를 혈전증 모델 실험쥐를 통해 연구하고, 이를 헤파린, Fucus vesiculous 유래의 시판중인 푸코이단 공급원, t-PA 및 유로키나아제와 비교하여, 우수한 혈전용해 및 t-PA 자극 효과를 갖는 푸코이단을 제공하고자 한다.In the present invention, the thrombolytic effect of unfractionated low molecular weight fucoidan fractions derived from seaweed spores ( Undaria pinnatifida sporophylls ) was studied in thrombosis model mice, and commercially available fucoidan sources from heparin, Fucus vesiculous , t-PA and Compared to urokinase, it is intended to provide fucoidan with good thrombolytic and t-PA stimulatory effects.
본 발명에서는 미역포자(Undaria pinnafida sporophylls: UPS-UF)에서 유래되어 분획화되지 않은 것을 특징으로 하는 혈전용해용 푸코이단이 제공된다. Seaweed spores ( Undaria) in the present invention pinnafida Sporophylls (UPS-UF) is provided by thrombolytic fucoidan characterized in that it is not fractionated.
또한, 본 발명에서는 미역포자(UPS-UF)에서 유래되어 분획화되지 않은 것을 특징으로 하는 t-PA 자극용 푸코이단이 제공된다. In addition, the present invention provides a fucoidan for t-PA stimulation, which is derived from Wakae spores (UPS-UF) and is not fractionated.
본 발명에 따르면, in vivo 혈전증 모델에서 푸코이단을 단독으로 사용하여도 혈전용해가 관찰된다. 이는 헤파린이 설페이트화 다당류로서의 항혈전 및 항응고 특성을 갖더라도 단독으로 혈전용해 효과를 나타내지 않는 것과 대조적이다. According to the present invention, thrombolysis is observed even when fucoidan is used alone in an in vivo thrombosis model. This is in contrast to the fact that heparin does not show a thrombolytic effect alone, even though it has antithrombotic and anticoagulant properties as sulfated polysaccharides.
이는, 자극 활성을 뒷받침하는 메카니즘으로부터 혈전증 시스템과 푸코이단의 작용 메카니즘이 완전히 상이함을 나타낸다. 푸코이단은 트롬빈과 PAI-1 둘다와 결합 친화도를 갖는 것으로 알려져 있으며, 따라서 이들의 억제제로 작용할 수 있다.This indicates that the mechanisms of action of the thrombosis system and fucoidan from the mechanisms supporting stimulatory activity are completely different. Fucoidans are known to have binding affinity with both thrombin and PAI-1 and may therefore act as inhibitors of them.
플라즈미노겐과 마찬가지로, t-PA는 부분 분해된 피브린 상에 노출된 라이신(lysine)에 대하여 높은 친화도를 갖는다. Like plasminogen, t-PA has a high affinity for lysine exposed on partially degraded fibrin.
도 3으로부터 알 수 있듯이, 국소 방출되어 순환하는 t-PA는 플라즈미노겐을 플라즈민으로 전환시키고, 이는 다시 피브린을 분해시켜서 그의 용해를 돕는다. 플라즈미노겐 활성화제 억제제(PAI-1)는 혈관 구성성분에서 t-PA의 주요 억제제이다. 트롬빈은 보다 많은 혈소판을 활성화시켜서 손상 부위로 동원시키고, 이어서 일차 혈소판 플러그(primary platelet plug)의 안정화를 위해 충분한 피브린을 발생시킨다. 응괴 과정동안에 형성된 물질인 트롬빈과 FXa는 t-PA 방출의 효과적인 유발물질이다. 트롬빈은 피브리노겐을 피브린(프로트롬보)으로 전환시켜서 혈전 형성을 촉진하고 proCPU를 CPU(항피브린용해성)로 전환시킴으로써 혈전 안정화를 촉진하므로, 푸코이단과 트롬빈의 결합은 t-PA 방출을 증가시키거나 내인성 피브린용해 시스템을 용이하게 할 수 있다. 또한, 푸코이단과 PAI-1의 결합은 PAI의 t-PA로의 억제 활성을 감소시킬 수 있고, 혈전용해를 효과적으로 용이하게 할 수 있다.As can be seen from FIG. 3, locally released and circulating t-PA converts plasminogen into plasmin, which in turn breaks down fibrin to aid its dissolution. Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) is a major inhibitor of t-PA in vascular components. Thrombin activates more platelets to mobilize to the site of injury and then generates enough fibrin for stabilization of the primary platelet plug. Thrombin and FXa, which are formed during the clotting process, are effective inducers of t-PA release. Since thrombin promotes thrombus formation by converting fibrinogen into fibrin (prothrombo) and promotes thrombus stabilization by converting proCPU into CPU (antifibrin soluble), the combination of fucoidan and thrombin increases t-PA release or endogenous Fibrin dissolution systems can be facilitated. In addition, the binding of fucoidan and PAI-1 can reduce the inhibitory activity of PAI to t-PA and can effectively facilitate thrombolysis.
피브린에 t-PA가 결합하면 플라즈미노겐이 플라즈민으로 활성화되는 속도가 100배 이상 증가한다. 따라서, 플라즈민 발생은 피브린, 플라즈미노겐 및 t-PA 간의 3원 착물 형성을 포함하는 순차적이고 순서화된 활성 메카니즘이다. 그러므로, 조절된 경로로 인해 국소 정맥내 t-PA 농도가 t-PA의 충분히 큰 세포내 저장 풀(storage pool) 내에서 신속하고 실질적으로 증가하므로, 푸코이단과 PAI-1의 결합은 t-PA와 피브린의 결합을 용이하게 할 수 있으며, 따라서 플라즈미노겐 활성화를 용이하게 할 수 있다(도 3). 또한, 이는 내피세포로부터의 플라즈미노겐 또는 내인성 t-PA의 생성을 증가시킬 수 있고, 그 결과 플라즈민 농도를 증가시키고, 혈전에 의해 폐색된 동맥에서 혈전용해가 일어나게 할 수 있다.Binding of t-PA to fibrin increases plasminogen activation by plasmin more than 100-fold. Thus, plasmin generation is a sequential and ordered active mechanism involving the formation of ternary complexes between fibrin, plasminogen and t-PA. Therefore, because of the regulated pathway, local intravenous t-PA concentration increases rapidly and substantially in a sufficiently large intracellular storage pool of t-PA, so the binding of fucoidan and PAI-1 is associated with t-PA. The binding of fibrin can be facilitated, thus facilitating plasminogen activation (FIG. 3). It may also increase the production of plasminogen or endogenous t-PA from endothelial cells, resulting in increased plasmin concentrations and thrombolysis in arteries occluded by blood clots.
트롬빈의 직접적인 억제제로서, 푸코이단은 proCPU 활성화를 낮춤으로써 t-PA의 혈전용해 속도를 더 효율적으로 증가시킬 수 있고, 도 3에 나타낸 바와 같이 플라즈미노겐-피브린 결합 속도를 증가시킬 수 있다. 즉, 푸코이단과 PAI-1 또는 트롬빈의 결합은 혈관내 플라즈민을 효과적으로 증가시킴으로써 폐색 동맥내 혈전용해 시스템을 용이하게 할 수 있다.As a direct inhibitor of thrombin, fucoidan can more efficiently increase the thrombolytic rate of t-PA by lowering proCPU activation and can increase the plasminogen-fibrin binding rate as shown in FIG. 3. That is, the binding of fucoidan and PAI-1 or thrombin can facilitate the endovascular thrombolytic system by effectively increasing vascular plasmin.
LMWF 분획물은 분획화되지 않은 푸코이단보다 10배 많은 양인 1000 mg kg-1 양으로 주입될 때까지 폐색 동맥에서 혈전용해를 지연(retardation)시켰다. 또한, Fucus 푸코이단을 제공받은 마우스 그룹은 미역포자 푸코이단을 제공받은 마우스에 비해, 시간-재관류(time-to-reperfusion)에서 거의 2배 증가된 200 mg kg-1에서 재관류를 나타내었다. 그러므로, 푸코이단의 혈전용해 활성은 푸코이단의 설페이트화 정도 및 화학 구조식 둘다에 의해 좌우될 수 있다. 그 밖의 선행기술이 t-PA 및/또는 PAI-1 잠재적 억제제의 내인성 방출을 자극하는 측면에서 푸코이단의 혈전용해 활성을 뒷받침하는 메카니즘을 설명하는데 필요하다.LMWF fractions retarded thrombolysis in the occluded arteries until injected in an amount of 1000 mg kg −1, 10 times more than unfractionated fucoidan. Fucus The group of mice receiving fucoidan exhibited reperfusion at 200 mg kg −1 , almost a 2-fold increase in time-to-reperfusion, compared to mice receiving seaweed spore fucoidan. Therefore, the thrombolytic activity of fucoidan can depend on both the degree of sulfated and chemical structure of the fucoidan. Other prior art is needed to describe the mechanisms that underpin thrombolytic activity of fucoidan in terms of stimulating the endogenous release of t-PA and / or PAI-1 potential inhibitors.
재관류가 발생하지 않는 일정한 t-PA 투약량에 최소량의 푸코이단, 10mg kg-1의 UPS-UF을 추가 주입한 경우에는 폐색 동맥의 복구가 관찰되지 않았다. 이러한 자극 효과는 5 mg kg-1에서 관찰되지 않으므로 투약량 의존적인 것으로 보인다. 이러한 발견은 in vitro 연구에 대한 선행 기술의 내용과 일치한다.Recovery of the occlusion artery was not observed when a minimum amount of fucoidan, 10 mg kg -1 UPS-UF was added to a constant t-PA dose without reperfusion. This irritant effect is not observed at 5 mg kg −1 and therefore appears to be dose dependent. This finding is consistent with the content of the prior art for in vitro studies.
보다 흥미롭게, 푸코이단-자극된 재관류 마우스에서의 혈류 복구는 동일한 투약량(10 mg kg-1)으로 투여된 헤파린-처리군에 비해 재폐색이 없었다(p < 0.05). 혈전용해 요법동안에 혈전으로부터 활성 트롬빈이 방출될 수 있다. 푸코이단과 헤파린 간의 양태 차이는 트롬빈과의 활성 차이에 기인한 것일 수 있다. 헤파린은 트롬빈과 피브린 중합체의 결합을 촉진시켜서 재폐색에 일조하는 반면, 푸코이단은 트롬빈과 직접 결합할 수 있어서 도 3의 메카니즘에 의해 제시된 바와 같이 피브린 형성을 억제한다.More interestingly, blood flow recovery in fucoidan-stimulated reperfusion mice was not re-occluded compared to the heparin-treated group administered at the same dose (10 mg kg −1 ) (p <0.05). Active thrombin can be released from thrombi during thrombolytic therapy. Aspect differences between fucoidan and heparin may be due to differences in activity with thrombin. Heparin promotes the binding of thrombin and fibrin polymers to assist in occlusion, while fucoidan can bind directly to thrombin to inhibit fibrin formation, as shown by the mechanism of FIG. 3.
경동맥 혈전에는 혈소판이 풍부하고, 고 농도의 PAI-1을 함유한다. 그러므로, 경동맥 혈전은 주로 PAI-1때문에 t-PA에 의해 잘 용해되지 않는다. Undaria 푸코이단은 혈소판 응집을 억제하고 PAI-1의 가능한 억제제이기 때문에, t-PA의 혈전용해를 개선시킬 수 있다.Carotid artery clots are rich in platelets and contain high concentrations of PAI-1. Therefore, carotid artery thrombi is poorly lysed by t-PA mainly due to PAI-1. Because Undaria fucoidan inhibits platelet aggregation and is a possible inhibitor of PAI-1, it can improve thrombolysis of t-PA.
해조류 푸코이단(Undaria pinnatifida sporophylls 유래)만을 직접 단독 투여하여서 in vivo 혈전증 모델에서 처음으로 폐색 동맥의 혈전용해가 관찰되었다. 상이한 해조류 종으로부터 수득된 푸코이단 공급원은 보다 많은 주입량에서 느린 재관류를 나타내었다. 이는 이러한 효과를 나타내지 않은 헤파린과 대조적이다. 또한, 상기 푸코이단은 t-PA를 투입하는 경우에는 혈전용해를 나타내기에 불충분한 최소 투약량에서 혈전용해 효과를 나타내고, 자극 효과를 나타낸다. 폐색 마우스의 푸코이단-매개된 재관류 동맥 모두에서 재폐색에 관찰되지 않았다. 그러므로, 상기 데이터는 푸코이단이 혈전증 모델에서 t-PA 혈전용해 활성에 대한 혈전용해제 및 자극제 둘다로서 작용할 수 있음을 나타낸다. 푸코이단의 이러한 활성은 트롬빈 또는 PAI-1와의 결합 특성에 기인한 것일 수 있다.
Seaweed Fucoidan ( Undaria pinnatifida Thrombolysis of the occlusion artery was observed for the first time in an in vivo thrombosis model by direct administration of only sporophylls . Fucoidan sources obtained from different seaweed species showed slow reperfusion at higher doses. This is in contrast to heparin, which did not exhibit this effect. In addition, when the t-PA is injected, the fucoidan exhibits a thrombolytic effect at a minimum dosage that is insufficient to exhibit thrombolysis, and exhibits a stimulating effect. No occlusion was observed in all of the fucoidan-mediated reperfusion arteries of occlusion mice. Therefore, the data indicate that fucoidan can act as both thrombolytic and stimulant for t-PA thrombolytic activity in the thrombosis model. This activity of fucoidan may be due to its binding properties with thrombin or PAI-1.
본 발명에 따르면, 미역포자(Undaria pinnatifida sporophylls:UPS-UF) 유래의 분획화되지 않은 푸코이단은 t-PA를 자극하는 효과를 가지며, 단독으로 소량 사용되더라도 혈전용해 효과를 나타내는 효과를 갖는다.
According to the present invention, unfractionated fucoidan from Undaria pinnatifida sporophylls (UPS-UF) has an effect of stimulating t-PA and exhibiting a thrombolytic effect even when used alone.
도 1a는 Balb/c 마우스의 좌측 경동맥 영역 위에 3분동안 5% 염화제2철을 적용하여서 동맥 혈전증을 유도하는 것을 보여주는 이미지이고, 도 1b는 혈전으로 채워진 혈관내 공간을 보여주는 혈전증 영역의 단면도이며, 여기서 푸코이단 60 내지 200 mg kg-1은 완전 폐색된지 20분후에 꼬리 정맥을 통해 주입되었다.
도 2a는 해부 현미경을 통해 복측 경부를 관찰하는 것을 보여주는 이미지이고(마우스 머리가 위로 향해있다), 도 2b는 혈류로 인해 흔량의 적혈구 세포가 있는 것을 보여주는 복구 영역의 단면도이다.
도 3은 혈전용해 활성에서 푸코이단의 작용 메카니즘을 개략적으로 나타내는 도면이다.FIG. 1A is an image showing induction of arterial thrombosis by applying 5% ferric chloride for 3 minutes over the left carotid artery region of Balb / c mouse, and FIG. 1B is a cross-sectional view of the thrombosis region showing the vascular space filled with thrombi , Wherein 60-200 mg kg −1 of fucoidan was injected through the tail vein 20 minutes after complete occlusion.
FIG. 2A is an image showing observation of the ventral neck through an anatomical microscope (mouse head up), and FIG. 2B is a cross-sectional view of the repair area showing the presence of common red blood cells due to blood flow.
3 is a schematic representation of the mechanism of action of fucoidan in thrombolytic activity.
물질 및 방법Materials and methods
물질matter
미역포자(Undaria pinnatifida sporophylls :UPS-UF) 유래의 분획화되지 않은 푸코이단을 준비하였다. 즉, 푸코이단을 pH 2.0의 염산 용액에 의해 1시간동안 65℃에서 3회 연속 추출하고, 여과후 여액을 모아 농축한후 3배의 에탄올을 가하여 원료푸코이단을 얻었다. 증류수에 재용해한 원료 푸코이단 용액에 부분 정제를 위해서 세틸피리미디늄 클로라이드를 가하여 산성획분을 침전시킨 후 염화칼슘을 투여하여 분획하였으며, 투석후 얻은 용액에 재차 에탄올을 사용하여 잔여 알긴산 분리를 위해 침전을 이용하여 정제하였다. XAD 소수성 겔 크로마토그래피를 이용하여 추가적인 정제를 실시하여서 폴리페놀 구성성분을 제거하였다. 라디칼 해중합 공정에 의해 저분자량 푸코이단 (UPS-LMWF, 6 내지 10kD)을 생산하였다. Fucus vesiculosus (FV-UF) 유래의 분획화되지 않은 또 다른 푸코이단 공급원을 시그마(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 구입하고, 소수성 겔 연속 크로마토그래피를 이용하여 추가 정제한 후에 이용하였다. 사노피 파마슈티칼즈(Sanofi Pharmaceuticals, 대한민국 서울)에서 헤파린을 입수하였다. t-PA를 베링거 잉겔하임(Boeringer Ingelheim)으로부터 제공받았다.
Seaweed Spore ( Undaria pinnatifida Unfractionated fucoidan from sporophylls ( UPS-UF) was prepared. That is, fucoidan was extracted three times continuously at 65 ° C. for 1 hour with a hydrochloric acid solution having a pH of 2.0. Cetylpyrimidinium chloride was added to the raw fucoidan solution re-dissolved in distilled water to precipitate acidic fractions, followed by calcium chloride administration. The precipitated solution was separated using ethanol and precipitated for separation of residual alginic acid. Purified using. Additional purification was performed using XAD hydrophobic gel chromatography to remove polyphenol components. Low molecular weight fucoidans (UPS-LMWF, 6-10 kD) were produced by a radical depolymerization process. Fucus Another unfractionated fucoidan source from vesiculosus (FV-UF) was purchased from Sigma (St. Louis, MO) and used after further purification using hydrophobic gel continuous chromatography. Heparin was obtained from Sanofi Pharmaceuticals (Seoul, South Korea). t-PA was provided by Boeringer Ingelheim.
동맥 혈전증 모델Arterial thrombosis model
본 연구에서는 Bal/c 마우스(18 내지 25g, 미국 매사츄세츠주 타코마 소재)를 사용하였다. 동물을 우리에 가두고, '실험동물 관리 및 이용에 관한 지침 (the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)'에 따라 관리하였다. 실험실 동물의 이용 절차는 대구 카톨릭대학 병원의 실험동물운영위원회(the Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인받았다. 100g 체중당 7.5mg의 케타민 하이드로클로라이드(호프만-라 로슈(Hoffmann-La Roche), 스위스 바즐) 및 2.5mg의 자일라진을 복강내 투여하여 마우스를 마취시켰다. 마취 후에, 우측의 온목동맥 영역의 바로 위 피부를 절개하였다. 이어서, 근막을 끝이 무디게 해부하고, 좌측의 온목동맥 부분을 노출시켰다. 미니어처 도플러 유속 탐침기(miniature Doppler flow probe)(Model 0.5 VB, 트랜소닉 시스템(Transonic System), 미국 뉴욕주 이타카 소재)를 사용하여 경동맥 혈류를 측정하였다. 5% 염화제2철(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)로 포화된 2장의 필터지(1 x 2 mm)(겔 블롯 페이퍼(Gel Blot Paper), GB003, Schleicher and Schuell, 미국 뉴햄프셔주 킨 소재)를 적용시켜서 혈전증을 유도하였다. 상기 필터지를 혈관 외막 표면과 접해있는 경동맥의 반대 면에(하나는 아래에, 하나는 위에) 놓았다. 필터지를 3분동안 적용시킨 후에 제거하였다. 필터지를 적용한 후 2분마다 경동맥 혈류를 관측하였다.
Bal / c mice (18-25 g, Tacoma, Mass.) Were used in this study. Animals were kept in cages and managed according to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Procedures for the use of laboratory animals were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Daegu Catholic University Hospital. Mice were anesthetized by intraperitoneal administration of 7.5 mg ketamine hydrochloride (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland) and 2.5 mg xylazine per 100 g body weight. After anesthesia, the skin just above the area of the right carotid artery was dissected. The fascia was then blunt dissected, exposing the left part of the carotid artery. Carotid artery blood flow was measured using a miniature Doppler flow probe (Model 0.5 VB, Transonic System, Ithaca, NY). Two filter papers (1 x 2 mm) saturated with 5% ferric chloride (Sigma, St. Louis, MO) (Gel Blot Paper, GB003, Schleicher and Schuell, Keene, NH) Was applied to induce thrombosis. The filter paper was placed on the opposite side (one below and one above) of the carotid artery in contact with the vascular envelope membrane surface. The filter paper was removed after 3 minutes of application. Carotid blood flow was observed every 2 minutes after applying the filter paper.
혈전용해 치료(처리)Thrombolysis Treatment (Treatment)
마우스(6 내지 8주령, 20 내지 25g 중량)를 경동맥 손상 모델로 하였다. 도플러 유속 탐침기에 바로 근접한 동맥 표면 위에, 5% FeCl3로 포화된 필터지(1 x 2mm)를 3.0분동안 놓아서 경동맥 손상을 유도하였다(도 2a). 원뿔 형상의 초음파 겔을 유속 탐침기 표면에 적용하여서 동맥과 효율적으로 접하게 하였다. 도플러 비트(Doppler beat)가 사라지는 것으로 정의되는 폐색시까지의 시간을 기록하였다. 폐색 20분후에 UF, LMWF, 분별화되지 않은 돼지 헤파린, 유로키나아제 및 재조합 조직 플라즈미노겐 활성화제(t-PA)를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 10 내지 1000mg/kg 투약량을 주입하였다. 도플러 비트가 사라지는 것으로 정의되는 재관류까지의 시간을 기록하였다. 재관류후 60분동안 또는 재관류가 발생하지 않은 경우에는 약물 주입을 시작한지 1.5시간동안 경동맥 혈류를 관측하였다.Mice (6-8 weeks old, 20-25 g weight) were used as carotid artery injury models. On the arterial surface immediately adjacent to the Doppler flow rate probe, a filter paper saturated with 5% FeCl 3 (1 × 2 mm) was placed for 3.0 minutes to induce carotid artery damage (FIG. 2A). Conical ultrasonic gels were applied to the surface of the flow rate probe to ensure efficient contact with the artery. The time to occlusion, defined as the Doppler beat disappearing, was recorded. Twenty minutes after occlusion, UF, LMWF, unfractionated porcine heparin, urokinase and recombinant tissue plasminogen activator (t-PA) were injected intravenously via the tail vein into a 10-1000 mg / kg dose. The time to reperfusion, defined as the Doppler bit disappearing, was recorded. Carotid blood flow was observed for 60 minutes after reperfusion or 1.5 hours after drug infusion if no reperfusion occurred.
트롬빈의 직접억제로서 t-PA의 혈전용해 활성에 대한 푸코이단의 자극 효과를 연구하기 위해서, t-PA 15 mg kg-1 또는 10 mg kg-1에 부가하여 1 내지 10 mg kg-1 투약량의 분획화되지 않은 푸코이단 또는 헤파린을 주입하였다. 시간-재관류 변화를 측정하였다.To study the stimulating effect of fucoidan on the thrombolytic activity of t-PA as a direct inhibitor of thrombin, fractions of 1 to 10 mg kg -1 in addition to 15 mg kg -1 or 10 mg kg -1 of t-PA Unpurified fucoidan or heparin was injected. The time-reperfusion change was measured.
통계 분석Statistical analysis
데이터를 평균± SEM으로 표기하였다. 5 그룹내 동물의 혈전용해 활성을 비결합 스튜던트(Student) t 테스트를 이용하여 비교하였다. p < 0.05을 갖는 수치를 유의하게 다른 것으로 간주하였다. 데이터를 평균± SEM으로 표기하였다. 비결합 스튜던트 t 테스트를 이용하여 그룹을 비교하였다.
Data are expressed as mean ± SEM. The thrombolytic activity of the animals in the 5 groups was compared using the unbound Student t test. Values with p <0.05 were considered significantly different. Data are expressed as mean ± SEM. Groups were compared using the unbound Student's t test.
결과result
혈전증 발병률Thrombosis incidence
경동맥내 혈전증 형성에 대한 FeCl3(2 내지 10%)의 농도-의존적 효과를 Balb/C 마우스에서 증명하였다. 도플러 유속 탐침기에서 도플러 비트가 감소하거나 사라지는 것으로 혈전증 형성 및 완전 폐색을 알 수 있다. 2% FeCl3 처리 후에는 혈류에 대한 효과가 관찰되지 않았다. 5% FeCl3 농도에서는 도 1a에 나타난 바와 같이 10분 이내에 완전히 폐색된 5마리중 5마리 모두에서 관찰되었다. 동맥 혈전의 절제부를 H/E로 염색한 후에 광학 현미경으로 검사하고, 도 1b에 나타낸 바와 같이 혈관내 공간이 혈전으로 완전히 채워졌다.
Concentration-dependent effects of FeCl 3 (2-10%) on intracarotid thrombosis formation were demonstrated in Balb / C mice. Thrombosis formation and complete occlusion can be seen by the decrease or disappearance of the Doppler bit in the Doppler flow rate probe. No effect on blood flow was observed after 2% FeCl 3 treatment. At 5% FeCl 3 concentrations were observed in all 5 of 5 fully occluded within 10 minutes as shown in FIG. 1A. Excision of the arterial thrombi was stained with H / E and then examined under an optical microscope, and the vascular space was completely filled with thrombus as shown in FIG.
혈전용해 활성Thrombolytic activity
혈전용해 약물 평가에서 유용성을 증명하기 위해서, 5% FeCl3-유도된 동맥 혈전증 모델을 이용하여 푸코이단과 헤파린의 효과를 t-PA 및 유로키나아제와 비교하여 연구하였다. 그 결과를 하기 표 1에 요약하였다.To demonstrate utility in thrombolytic drug evaluation, the effects of fucoidan and heparin were studied using t-PA and urokinase using a 5% FeCl 3 -induced arterial thrombosis model. The results are summarized in Table 1 below.
UPS-UF
(상용)FV-UF
(Commercial)
폐색성 혈전이 형성된 후에, 각 그룹의 5마리 마우스는 60 내지 200 mg kg-1 투약량의 UPS-UF, UPS-LMWF, FV-UF, 헤파린을 제공받았고, 한 그룹의 5마리 마우스는 60 내지 1000 mg kg-1 투약량의 UPS-LMWF를 제공받았으며, 2개 그룹의 5마리 마우스는 대조군으로서 10 내지 100 mg kg-1 투약량의 t-PA 및 유로키나아제를 제공받았고, 폐색 동맥의 재개방이 일어나는 재관류 투약량을 연구하였다. t-PA 처리된 마우스 5마리 중 5마리에서는 경동맥이 15 내지 30분 이내에(평균값, 16.67 ± 2.88분) 복구되어, 최대 혈류 약 100%에서 혈관 개방을 유지하는데 있어서 완전한 효능을 나타낸 반면, 유로키나아제-처리된 마우스 5마리 중 5마리에서는 혈류 관측 2시간동안 재관류가 발생하지 않았다. 100 mg kg-1의 UPS-UF를 투여한지 30 내지 60분 이내에(평균값, 37.5± 12.4분) 재관류가 관찰되었다. 이러한 재관류 투약량은 UPS-LMWF을 주입하는 경우에는 1000 mg kg-1까지 증가하였다. FV-UF를 100 mg kg-1 투약량으로 주입할 때, 투약량이 200 mg kg- 1으로 증가할 때까지는 재관류가 관찰되지 않았고, 이어서 투여한지 63.3± 7.2분후에 재관류가 발생하였다. 복원된 동맥 절제부의 현미경 이미지는 도 2b에 나타난 바와 같이 혈류로 인한 흔량의 적혈구 세포를 나타낸다. 1시간 이내에는 모든 재관류된 마우스에서 재폐색이 관찰되지 않았다. 이와 대조적으로, 헤파린 60 내지 1000 mg kg-1 투약량으로 처리한 5마리 마우스중 5마리에서는 혈류를 관측하는 1.5시간동안 재관류가 발생하지 않았다.
After the obstructive thrombus was formed, five mice in each group received 60-200 mg kg -1 doses of UPS-UF, UPS-LMWF, FV-UF, heparin and one group of mice received 60-1000 Reperfusion dose with mg kg -1 dose of UPS-LMWF, 5 mice in 2 groups received 10-100 mg kg -1 dose of t-PA and urokinase as controls, with reopening of the occlusion artery Was studied. In 5 of 5 t-PA treated mice, the carotid artery recovered within 15 to 30 minutes (mean, 16.67 ± 2.88 minutes), showing full efficacy in maintaining vascular openness at about 100% of the maximum blood flow, while urokinase 5 out of 5 treated mice did not experience reperfusion for 2 hours of blood flow observation. Reperfusion was observed within 30 to 60 minutes (mean value, 37.5 ± 12.4 minutes) of administration of 100 mg kg −1 UPS-UF. This reperfusion dose increased to 1000 mg kg −1 with UPS-LMWF. When injected into the FV-UF with 100 mg kg -1 dose, the dose 200 mg kg - were perfusion is not observed until the increase in 1, then after the administration was 63.3 ± 7.2 min after the perfusion occurs. Microscopic images of reconstructed arterial ablation show common red blood cells due to blood flow as shown in FIG. 2B. Reclosure was not observed in all reperfused mice within 1 hour. In contrast, 5 of 5 mice treated with a heparin 60-1000 mg kg −1 dose did not experience reperfusion for 1.5 hours of blood flow.
t-t- PAPA 유도된 혈전용해에 대한 For induced thrombolysis 푸코이단의Fucoidan 자극 효과 Irritant effect
t-PA 투약량에 부가하여 푸코이단 주입 투약량의 함수로서 시간-재관류를 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 요약하였다. Time-reperfusion was measured as a function of fucoidan infusion dose in addition to the t-PA dose, and the results are summarized in Table 2 below.
(n=5)NR
(n = 5)
(n=4)NR
(n = 4)
(n=6)17.2 ± 2.3
(n = 6)
(n=4)24.0 ± 7.1
(n = 4)
(n=4)24.6 ± 1.8
(n = 4)
(n=4)23.0 ± 5.6
(n = 4)
(n=5)NR
(n = 5)
(n=3)41.6 ± 15.5
(n = 3)
(n=4)9.3 ± 3.7 *
(n = 4)
* 재폐색은 주입후 16±5.3분에 발생하였고, 재관류는 출혈이 계속되면서 35±15분에 발생하였다.
NR은 재관류가 발생하지 않았음을 의미한다.Time-reperfusion in minutes was measured as a function of infusion dose of fucoidan or heparin.
Reoccurrence occurred 16 ± 5.3 minutes after injection and reperfusion occurred 35 ± 15 minutes with bleeding.
NR means no reperfusion occurred.
10 mg kg-1의 t-PA가 제공된 마우스에서는 주입후 60분까지는 재관류가 관찰되지 않았고, 이어서 분획화되지 않은 푸코이단 10mg을 부가적으로 정맥내 주입하고, 푸코이단 주입후 17.2분에 재관류가 발생하였다. 이와 대조적으로, t-PA에 부가하여 헤파린 10 mg kg-1을 주입한 후 9.3± 3.7분에 재관류가 관찰되었고, 이어서 5분후에 간헐적인 재폐색이 관찰되었으며, 인접 손상 동맥에서 출혈이 계속되면서 재관류가 다시 관찰되었다. 그러나, 이러한 재폐색은 t-PA에 부가하여 헤파린 1.25 mg kg-1을 주입하였을 때 관찰되었다. t-PA 15mg kg-1을 제공받은 마우스에서, 푸코이단 5 또는 10 mg kg-1을 부가적으로 주입한지 24± 7.1분 후에 재관류가 발생하였고, 시간-재관류의 변화는 통계적으로 유의하지 않았다.Reperfusion was not observed in mice given 10 mg kg −1 of t-PA until 60 minutes post-injection, followed by an additional intravenous injection of 10 mg of unfractionated fucoidan, followed by reperfusion 17.2 minutes after the fucoidan injection. . In contrast, reperfusion was observed at 9.3 ± 3.7 minutes after injecting 10 mg kg -1 of heparin in addition to t-PA, followed by intermittent reclosure after 5 minutes, with bleeding continuing in the adjacent injured artery. Reperfusion was observed again. However, this reclosure was observed when injecting 1.25 mg kg −1 of heparin in addition to t-PA. In mice receiving 15 mg kg −1 of t-PA, reperfusion occurred 24 ± 7.1 minutes after additional injection of fucoidan 5 or 10 mg kg −1 , and the change in time-reperfusion was not statistically significant.
Claims (2)
Thrombolytic fucoidan, characterized in that not derived from seaweed spores (Undaria pinafida sporophylls (UPS-UF)).
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