KR20120069658A - 생식력 제어를 위한 로니다민 유사체 - Google Patents

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조셉 에스 태쉬
라마파 차크라살리
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Abstract

생식력 제어는 대상에서 생식력을 감소시키기 위하여 화학식 I에 따른 화합물의 하나 이상의 투여량을 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 생식력 제어는 남성 대상에서 세르톨리 세포 기능을 손상; 대상에서 정자형성을 억제; 대상에서 정소 무게를 감소; 여성 대상에서 난소 무게를 감소; 여성 대상에서 혈청 프로게스테론을 감소; 여성 대상에서 난소 여포 기능을 손상; 대상에서 가역적인 불임을 유발시키기 위해 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 생식력을 되돌리기 위하여, 본 방법은 대상에서 생식력을 되돌리기 위하여 대상으로의 화합물 투여를 중단하는 단계를 포함할 수 있다. 화합물은 대상을 비가역적으로 불임시키기 위해 투여될 수 있다.

Description

생식력 제어를 위한 로니다민 유사체 {LONIDAMINE ANALOGUES FOR FERTILITY MANAGEMENT}
본 발명은 가멘다졸(gamendazole)과 H2-가멘다졸 및 그 밖의 것들과 같은 로니다민의 신규 유사체에 관한 것이다. 특히, 가멘다졸 및 H2-가멘다졸과 같은 로니다민의 신규 유사체들의 일부는 남성 및 여성을 불임시키며 생식 가능성을 억제하는데 유용하다.
인간 및 다른 포유동물에서 의도되지 않은 임신의 예방은 개발도상국 및 선진국 모두에서 지속적인 관심사이다. 임신의 예방을 위한 다양한 방법 및 제품들이 제안되거나 개발되어왔다. 이러한 제품들은 외과적 불임술, 콘돔, 프로게스테론 또는 프로게스테론 및 에스트로겐의 조합을 함유하는 경구 피임약, 프로게스테론의 지연방출형을 함유하는 피하 이식, 자궁내 장치, 살정자 크림 또는 겔, 및 스폰지 또는 격막과 같은 질내 장벽을 포함한다.
남성 피임용 접근법은 장벽 방법, 호르몬 방법, 주기 방법, 및 면역학적 방법을 포함한다. 보다 최근에 연구자들은 정소에서 세르톨리 세포 및 생식세포 사이의 접합 복합 위치를 붕괴시킴으로써 정자형성을 억제하는 화합물을 조사하기 시작하였다. 이러한 화합물의 하나는 로니다민(1-(2,4,-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산)이다. 로니다민은 정자형성의 효과적인 억제제로 발견된 인다졸-카복실산 화합물 그룹에 속한다. 하지만 높은 복용량에서의 로니다민의 반정자형성 효과는 비가역적이며 독성이 있다는 것이 발견되었다. 일반적으로 Lonidamine: A New Pharmacological Approach to the Study and Control of Spermatogenesis and Tumors, Chemotherapy, 27 Suppl. 2, 1-120 (1981a 1981b); Lonidamine, Proceedings of the 2nd International Symposium, Vancouver (1982) 참조.
로니다민의 여러 유사체들이 정자형성 억제제로 최근 조사되었다. Silvestrini et al., 미국특허 No. 6,001,865; Baiocchi et al., 미국특허 No. 5,112,986; Silvestrini, 미국특허 No. 4,282,237; Palazzo et al., 미국특허 No. 3,895,026; Cheng et al., Two New Male Contraceptives Exert Their Effects by Depleting Germ Cells Prematurely from the Testis, BIOLOGY OF REPRODUCTION 65, 449-461 (2001); Grima et al., Reversible Inhibition of Spermatogenesis in Rats Using a New Male Contraceptive 1-(2,4-dichlorobenzyl)-인다졸-3-carbohydrazide, BIOLOGY OF REPRODUCTION 64, 1500-1508 (2001); Corsi et al., 1-Halobenzyl-1H-인다졸-3-carboxylic acids: A New Class of Antispermatogenic Agents, J. MED. CHEM., Vol. 19, No. 6, 778-783 (1976); Palazzo et al., Synthesis and pharmacological properties of 1-substituted 3-dimethylaminoalkoxy-1H-인다졸s, J. MED. CHEM. Vol. 9, 38-41 (1966) 참조. 이러한 진전들에도 불구하고, 반정자형성적이지만 바람직하게는 독성 부작용들을 나타내지 않는 화합물들에 대한 요구가 존재한다.
eEF-1 알파(eEF-1 알파 S) mRNA의 체세포 형태는 사실상 성인 생식선의 남성 및 여성 생식세포에서 발견되지 않지만 신경배 단계 이후 배아세포에서 매우 풍부하다. 이에 반해, eEF-1 알파(eEF-1 알파 O) mRNA의 다른 형태는 난원세포 및 난황형성전 난모세포에서 매우 농축되어있지만 난자 및 배아에서는 발견되지 않는다. 또한 eEF-1 알파 O mRNA는 성인 정소의 정원세포 및 정모세포에서 존재한다. 후자의 발견은 생식세포-특이적 유전자 산물로서의 eEF-1 알파 O mRNA을 확인하였다. 비록 생식세포는 매우 적은 eEF-1 알파 S mRNA를 함유하지만 다수의 eEF-1 알파 S 레트로슈도유전자(retropseudogenes)가 X. 레비스(X. laevis) 염색체에 존재한다. 이들 유전자들은 생식세포에서 mRNA의 역전사 및 이후 cDNA 복제들의 염색체 DNA로의 통합으로부터 발생하는 것으로 여겨진다. 배아가 난원세포 또는 정원세포로 분화하기 전 배아의 초기 생식세포에서 eEF-1 알파 S 슈도유전자가 발생한다는 것이 제안된다. Abdallah et al., Germ cell-specific expression of a gene encoding eukaryotic translation elongation factor 1 alpha (eEF-1 alpha) and generation of eEF-1 alpha retropseudogenes in Xenopus laevis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 9277-9281 (1991) 참조.
단백질 합성은 감수분열 및 체세포분열 동안 세포주기의 제어하에 있는 것으로 여겨진다. cdc2 키나아제를 위한 기질 및 단백질 합성 장치의 구성성분들 사이의 어떠한 관련성이 따라서 가장 중요할 것이다. 제노푸스 레비스 난모세포의 감수분열 동안 이 키나아제를 위한 기질들 중 하나는 두 개의 다른 단백질인 P36 및 P30과 복합된 p47 단백질이다. P47 및 P30에 대한 부분적인 아미노산 서열 데이터로부터 판단된 바에 따라 P30 및 P47 단백질은 아르테미아 살리나(Artemia salina)의 단백질 합성 신장 인자(EF) 1 베타 및 1 감마와 유사한 것으로 보고되었다. Belle et al., A purified complex from Xenopus oocytes contains a p47 protein, an in vivo substrate of MPF, and a p30 protein respectively homologous to elongation factors EF-1 gamma and EF-1 beta. FEBS Lett. 255: 101-104 (1989) 참조. 이 논문은 제노푸스로부터 유래한 P30, P47 및 P36으로 이루어진 복합체가 아르테미아로부터 유래한 EF-1 베타, EF-1 감마, 및 EF-1 델타 복합체와 다음 두 가지 기준에 따라 일치한다는 것을 보여준다. 1) 둘다 리보솜에 결합하는 신장인자 1 알파-매개성 운반 RNA 및 신장인자 1 알파 상의 구아닌 뉴클레오티드의 교환을 비교될 정도로 자극한다. 2) 제노푸스로부터 유래한 단백질 복합체 P30.P47.P36의 세 서브유닛의 각각은 아르테미아로부터 유래한 EF-1 베타 감마 델타의 해당하는 서브유닛들의 하나와 구조적 상동성을 나타낸다. 아마 적어도 인비트로 튜불린과 연관된 EF-1 감마의 인산화는 단백질 합성의 증가를 수반하는 감수분열의 시작 이후 과정들에서 중요하다. Janssen et al., A major substrate of maturation promoting factor identified as elongation factor 1 beta gamma delta in Xenopus laevis. J. Biol. Chem. 266: 14885-14888 (1991) 참조.
본 발명은 일정 기간 동안 대상에서 생식력의 감소 및 이후 생식력의 회복과 같은 생식력 제어를 위한 방법에 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 이러한 생식력 제어는 대상에서 생식력을 감소시키기 위해 화학식 I에 따른 화합물의 1회 이상의 투여량을 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다:
화학식 I
Figure pct00001
화학식 I에서: R1은 카복실, 아크릴, 또는 카복실산 히드라지드이며; R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 시클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며; X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며; Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다. 상기 화합물은 화학식 I의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터일 수 있다. 일 실시태양에서, R2가 수소인 경우, Z1, Z2, Z3, 및 Z4의 적어도 하나가 질소이며 나머지는 독립적으로 탄소 또는 질소이거나; 또는 R1이 -COOH, -CONHNH2, -CONHN(CH3)2, -CH=CHCOOH가 아니다.
일 실시태양에서, 화합물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 6-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 6-플루오르-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터.
일 실시태양에서, 화합물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 가멘다졸(gamendazole); 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 (JWS-2-72 또는 H2-가멘다졸); 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]아크릴산 (TH 2-192); 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (TH 2-178); 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (TH 2-179); 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS 1-190); 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 2-22); 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 1-282); 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터.
또한 생식력 제어는 남성 대상에서 세르톨리 세포 기능을 손상시키기에 유효한 양으로 화합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 대상에서 정자형성을 억제하기에 유효한 양으로 투여될 수 있다. 또한 화합물은 대상에서 정소 무게를 감소시키기에 유효한 양으로 투여될 수 있다.
또한 생식력 제어는 여성 대상에서 난소 무게를 감소시키기에 유효한 양의 화합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한 화합물은 여성 대상에서 혈청 프로게스테론을 감소시키기에 치료적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 화합물은 여성 대상에서 난소 여포 기능을 손상시키기에 유효한 양으로 투여될 수 있다.
일 실시태양에서, 대상에서 가역적인 생식력을 유발하기에 유효한 양으로 화합물을 투여할 수 있다. 생식력을 되돌리기 위하여, 본 방법은 대상에서 생식력을 되돌리기 위해 대상으로의 화합물의 투여를 중단하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 화합물은 대상을 비가역적으로 불임시키기 위해 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 불임을 위해 1회 이상의 투여를 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 화합물은 1회 투여로 대상에서 불임을 유도하기 위해 유효한 양으로 투여될 수 있다. 선택적으로 화합물은 대상에서 불임을 유도하기 위해 다중 투여 요법으로 투여될 수 있다.
일 실시태양에서, 생식력 제어는 남성 대상에서 정자형성을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 생식력 제어 방법은 정자형성을 억제하기 위하여 화학식 I에 따른 화합물을 남성 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 화학식 I은 본 명세서에서 기술되었다. 남성 생식력 제어 방법은 적어도 다음 중 하나에 부합하도록 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법을 포함할 수 있다: 대상의 체중 유지; 인히빈 B의 생산 억제; 순환하는 여포-자극 호르몬(FSH) 증가; 화합물-관련 독성 억제; 구조화된 정자발생 세포-타입 레이어링 감소; 정자 감소; 정자세포 감소; 정원세포 감소; 생식 상피 감소; 생식세포의 양 감소; 정소 무게 감소; 열충격단백질 HSP90AB1 억제; 진핵세포 번역신장인자 1 알파 1(EEF1A1) 억제; 인터루킨 단백질의 생산 증가; 또는 NF-KappaB 억제제 알파(Nfkbia)의 생산 증가. 남성 생식력은 투여량 및 또는 투여 요법에 따라 가역적이거나 비가역적일 수 있다. 높은 투여량은 남성 대상에서 영구적으로 세르톨리 세포 기능을 손상시킬 수 있다. 낮은 투여량은 가역적인 불임을 제공할 수 있으며, 대상으로의 화합물의 투여 중단은 대상에서 정자형성 가능성을 되돌릴 수 있다.
일 실시태양에서, 본 화합물은 여성을 위한 생식력 제어에 사용될 수 있다. 화합물은 단독으로 또는 다른 생식력 제어 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물(예를 들어, 화학식 I)은 생식력을 감소시키기 위해 여성 대상에게 투여될 수 있다. 화합물은 적어도 다음 중 하나에 부합하도록 유효한 양으로 여성 대상에게 투여될 수 있다: 대상의 체중 유지; 인히빈 B의 생산 억제; 에스트라디올의 생산 억제; 난소 무게 감소; 혈청 프로게스테론 감소; 프로게스테론 생산 억제; 폐쇄 난소 여포 유도; 생존 가능한 난소 여포의 수 감소; 생식세포의 양 감소; 또는 배란 억제. 여성 생식력은 투여량 및 또는 투여 요법에 따라 가역적이거나 비가역적일 수 있다. 높은 투여량은 여성 대상에서 영구적으로 난소 여포를 손상시킬 수 있다. 낮은 투여량은 가역적인 불임을 제공할 수 있으며, 대상으로의 화합물의 투여 중단은 여성 대상에서 난소 여포 가능성을 되돌릴 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a는 대조군과 비교하여 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-30을 투여받은 동물의 전체 체중의 변화를 도시한다.
도 1b는 대조군과 비교하여 RC-MC-30을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 오른쪽 정소 무게의 변화를 도시한다.
도 1c는 대조군과 비교하여 RC-MC-30을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 왼쪽 정소 무게의 변화를 도시한다.
도 1d는 대조군과 비교하여 RC-MC-30을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 세정관 상피의 상피 높이를 도시한다.
도 1e는 대조군과 비교하여 RC-MC-30을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 세정관 스테이지를 도시한다.
도 2a는 25 mg/kg의 RC-MC-30를 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 2b는 200 mg/kg의 RC-MC-30를 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 3a는 대조군과 비교하여 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-86을 투여받은 동물의 전체 체중의 변화를 도시한다.
도 3b는 대조군과 비교하여 RC-MC-86을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 오른쪽 정소 무게의 변화를 도시한다.
도 3c는 대조군과 비교하여 RC-MC-86을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 왼쪽 정소 무게의 변화를 도시한다.
도 3d는 대조군과 비교하여 RC-MC-86을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 세정관 상피의 상피 높이를 도시한다.
도 3e는 대조군과 비교하여 RC-MC-86을 25 mg/kg 투여받은 동물 및 200 mg/kg 투여받은 동물의 세정관 스테이지를 도시한다.
도 4a는 25 mg/kg의 RC-MC-86을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 4b는 200 mg/kg의 RC-MC-86을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 5a는 정소 무게에 대해 RC-MC-110과 비교한 로니다민의 투여량 의존적인 효과를 도시한다.
도 5b는 6.0, 3.0, 1.5, 1, 및 0.5 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 동물 및 25 mg/kg의 로니다민 및 대조군과 비교된 동물의 전체 체중을 도시한다.
도 5c는 6.0, 3.0, 1.5, 1, 및 0.5 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 동물 및 25 mg/kg의 로니다민 및 대조군과 비교된 동물의 세관 스테이지를 도시한다.
도 5d는 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-110 및 DD-MC-I를 투여받은 동물의 전체 체중을 도시한다.
도 5e는 비교 화합물인 DD-MC-I(1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산)의 것들과 비교한 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 동물의 왼쪽 정소 무게를 도시한다.
도 6a는 0.5 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 6b는 1.0 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 6c는 1.5 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 6d는 3.0 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 6e는 6.0 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 6f는 RC-MC-110 연구에 대한 대조군으로서 옥수수 오일을 투여받은 쥐의 정소의 조직학적 사진이다.
도 7은 정소 조직에 대한 가멘다졸 또는 로니다민(LND)의 단일 투여의 비교를 제공하는 이미지를 포함한다: 패널 A-B는 부형제를 단독 투여받은 대조군 동물로부터의 정소를 나타낸다; 패널 C-D는 IP 25 mg/kg LND에 반응한 동물로부터의 정소를 나타낸다; 패널 E-F는 IP 25 mg/kg 가멘다졸-처리된 동물로부터의 정소를 나타낸다; 패널 G-H는 경구 6 mg/kg 가멘다졸-처리된 동물로부터의 정소를 나타낸다; 패널 I-J는 경구 3 mg/kg 가멘다졸-처리된 동물로부터의 정소를 나타낸다. 패널 A, C, E, G, 및 I는 모두 동일한 배율이다, 막대=200μm. 패널 B, D, F, H, 및 J는 모두 동일한 배율이다, 막대=200μm.
도 8은 가멘다졸 또는 LND의 단일 경구 투여 5일 이후 정소 무게에 대한 투여량 의존적인 효과를 나타내는 그래프를 포함한다. LND-처리된 쥐에서 관찰된 높은 변화성은 5마리 쥐들 중 2마리가 LND에 대한 반응을 나타내지 않는다는 사실 때문이다.
도 9a-9b는 LND, AF-2785, AF-2364, 및 가멘다졸의 단일 IP 투여 이후 체중 변화를 나타내는 그래프를 포함한다. 동물들은 실험의 시작 시 생후 60일이었으며, 화합물 투여 전날, 투여하는 날(0일, 화살표), 및 2 및 5일 이후 무게를 측정하였다. 도 9a는 25 mg/kg에서 투여된 화합물을 나타낸다. 도 9b는 200 mg/kg에서 투여된 화합물을 나타낸다. 대조군은 5 ml/kg의 담체(완충된 DMSO)를 투여받았다.
도 10은 짝짓기 실험 이후 가멘다졸-처리된 동물들에서 정소 조직을 나타내는 이미지를 포함한다; 패널 A-B는 부형제를 단독으로 투여받은 대조군 동물로부터의 정소를 나타낸다; 패널 C-D는 3 mg/kg의 가멘다졸에 의해 불임성이 된 동물로부터의 생식력을 회복한 정소를 나타낸다; 패널 E-F는 6 mg/kg의 가멘다졸에 의해 불임성이 된 동물로부터의 생식력을 회복한 정소를 나타낸다; 패널 G-H는 6 mg/kg의 가멘다졸에 의해 불임성이 된 동물로부터의 불임성이 남아있는 정소를 나타낸다. 패널 A, C, E, 및 G는 모두 동일한 배율이다, 막대=200μm. 패널 B, D, F, 및 H는 모두 동일한 배율이다, 막대=200μm.
도 11a-11c는 6 mg/kg에서 부형제 또는 가멘다졸로 처리된 증명된 불임성 수컷 쥐에서 순환하는 인히빈 B, FSH, 및 테스토스테론 수준의 비교를 나타내는 그래프이다. 가멘다졸-처리된 쥐는 27주의 기간 동안 생식력을 회복한 동물 대 불임성이 남아있는 동물로 분리되었다. 도 10a는 인히빈 B를 나타낸다: 검출한계는 25 pg/ml이다. 인간 인히빈 B 표준은 거세된 쥐 혈청에서 재구성되었다; 따라서, 결과들은 인간 인히빈 B에 대해 상대적이다. 도 10b는 FSH를 나타낸다: 검출한계는 1.5 ng/ml이다. 도 10c는 테스토스테론을 나타낸다: 검출한계는 0.04 ng/ml이다.
도 12a-12b는 인비트로 초기 세르톨리 세포에서 가멘다졸 반응 및 결합을 나타내는 그래프를 포함한다. 세르톨리 세포는 표시된 농도에서 가멘다졸의 존재 또는 부존재 하에서 배양되었다. 배지는 처리 72시간 이후 인히빈 B(도 12a)에 대해 및 처리 48시간 이후 ATP 함량(도 12b)을 위한 세포에 대해 수집되고 분석되었다.
도 13은 가멘다졸(GMZ-BT-UV)의 생쥐 세르톨리 세포에 대한 인비트로 결합 이미지를 포함한다. 패널 A는 포르말린 고정되고 세제로 용해된 세르톨리 세포에서 GMZ-BT-UV 결합을 나타낸다. 패널 B는 10-배 과량의 가멘다졸의 존재하에서의 결합을 나타낸다. 패널 C는 10-배 과량의 LND의 존재하에서의 결합을 나타낸다. 패널 D는 FITC-아비딘 단독을 이용한 제어 배양을 나타낸다. 막대=50μm.
도 14 패널 A는 비오틴결합(biotinylated) 가멘다졸(가멘다졸-BT)을 이용한 TM-4 세르톨리 세포 세포질 단백질 친화 결합을 나타낸다: 레인 1 및 2 - 각각 은-염색된 출발 세포질 및 미리-세척된 아비딘-아가로스 처리된 세포질. 레인 3 및 4 - 부존재(레인 3) 및 10-배 과량의 가멘다졸의 존재(레인 4)하에서 가멘다졸-BT로 배양된 세포질로부터 얻어진 가멘다졸 용출액. 레인 5 및 7 - 가멘다졸-BT 단독으로 배양된 세포질이 적용된 컬럼으로부터의 250 및 600 mM NaCl 용출액. 레인 6 및 8 - 가멘다졸-BT와 과량의 가멘다졸로 배양된 세포질이 적용된 컬럼으로부터의 250 및 600 mM NaCl 용출액. 레인 3에서의 화살표 - 밴드는 HSP90AB1로서 MALDI-TOF MS에 의해 확인되었다. 레인 7에서의 화살표 밴드는 EEF1A1로서 MALDI-TOF MS에 의해 확인되었다.
도 14 패널 B는 가멘다졸-BT를 이용한 쥐 정소 세포질 단백질 친화 결합을 나타낸다: 레인 1 및 2 - 각각 쿠마씨-염색된 출발 세포질 및 미리-세척된 아비딘-아가로스 처리된 세포질. 컬럼은 1.5 mM (레인 3-4), 이후 3.0 mM (레인 5-6) 가멘다졸, 이후 600 mM NaCl (레인 7-8)로 단계적으로 용출되었다. 각 쌍에서 첫번째 레인은 가멘다졸-BT 단독으로 배양된 세포질로부터의 용출액을 나타내며, 두번째 레인은 가멘다졸-BT와 과량의 가멘다졸로 배양된 세포질로부터의 용출액을 나타낸다. 레인 3에서 90 kDA에서의 화살표는 HSP90AB1로서 MALDI-TOF MS에 의해 확인된 밴드를 가리킨다. 레인 7에서 53 kDA에서의 화살표는 EEF1A1로서 MALDI-TOF MS에 의해 확인되었다. 패널 B에서 아래 두 개의 이미지는 각각 HSP90AB1 및 EEF1A1에서 화살표에 의해서 지시된 겔의 해당 지역을 나타내는 HSP90AB1 및 EEF1A1의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 14 패널 C는 비오틴결합 가멘다졸(가멘다졸-BT)을 이용한 ID8 난소암 세포 세포질 단백질 친화 결합을 나타낸다. 레인들은 상기 패널 A와 동일한 처리를 나타낸다. 레인 3 및 7에서의 화살표는 각각 HSP90AB1 및 EEF1A1의 위치에 해당하는 밴드를 가리킨다.
도 15 패널 A는 BT-UV-가멘다졸의 정제된 S. 세레비사에(S. cerevisae) HSP82에 대한 직접 결합 및 가멘다졸과 LND에 의한 경쟁을 나타낸다.
도 15 패널 B는 정제된 효모 HSP82에 대한 13.7μM BT-UV-가멘다졸과 HSP90 억제제 겔다나마이신 및 KU-1의 경쟁 결합을 나타낸다.
도 15 패널 C는 가멘다졸과 LND에 의한 정제된 O. 카니쿨러스(O. caniculus) EEF1A1에 대한 13.7μM BT-UV-가멘다졸의 경쟁적인 결합을 나타낸다.
도 15 패널 D는 정제된 S. 세레비시아에(S. cerevisiae) TEF1에 대한 BT-UV-가멘다졸의 직접 결합 및 가멘다졸에 의한 경쟁적인 결합을 나타낸다.
도 15 패널 E는 정제된 S. 세레비시아에(S. cerevisiae) TEF1에 대한 BT-UV-가멘다졸의 직접 결합 및 대조군 단백질 TEF3 및 HSB1에 대한 결합의 부존재를 나타낸다.
도 16은 가멘다졸로 처리된 MCF-7 세포에서 ERBB2, AKT1, HSP90, 및 액틴의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 모든 농도는 μM로 보고되었으며 알려진 HSP90 억제제인 겔다나마이신(500 nM)이 양성 대조군으로 사용되었다.
도 17은 가멘다졸에 의해 변형되지 않은 초기 세르톨리 세포에서 HSP90AB1 및 EEF1A1의 면역조직화학을 나타낸다. 가멘다졸의 부존재(패널 A) 또는 존재(패널 B)하에서 24시간 동안 배양된 초기 생쥐 세르톨리 세포에서 HSP90AB1의 면역조직화학. 가멘다졸의 부존재(패널 C) 또는 존재(패널 D)하에서 24시간 동안 배양된 초기 생쥐 세르톨리 세포에서 EEF1A1의 면역조직화학. 막대=50μm.
도 18a-18b는 토끼 망상적혈구 용해질에서 반딧불이 루시페라제의 복원 및 세포 증식에 대한 HSP90 억제의 효과를 나타내는 그래프를 포함한다. 도 18a는 이전에 기술된 바와 같이 결정된 열적으로 변성된 반딧불이 루시페라제의 HSP90-매개성 재폴딩(refolding)을 억제하기 위한 가멘다졸(밀폐된 원) 및 노보비오신(열린 원)의 능력을 나타낸다. 값들은 3중으로 수행된 하나의 대표적인 실험에 대한 평균 ± SE를 나타낸다. 분석은 3번 반복되었으며 노보비오신의 IC50은 이전에 발표된 값과 매우 잘 연관되었다. 도 18b는 다양한 농도에서 가멘다졸(폐쇄된 원) 또는 노보비오신(열린 원)과 배양된 MCF-7 세포를 나타낸다. 생존 가능한(viable) 세포가 방법 섹션에서 기술된 MTS/PMS 분석을 이용하여 수량화되었다. 값들은 3중으로 수행된 하나의 대표적인 실험에 대한 평균 ± SE를 나타낸다. 분석은 3번 반복되었으며 노보비오신의 IC50은 이전에 발표된 값과 매우 잘 연관되었다.
도 19a-19b는 TEF1 뉴클레오티드 결합 분석을 나타내는 그래프를 포함한다. mant-GMPPNP (A) 및 mant-GDP (B)의 분취량이 50μM 가멘다졸과 함께 결합 완충액 및 TEF1(1μM)에 첨가되었다. 형광이 mant 모이어티에 대한 280 nm에서의 여기 및 440 nm의 방출을 통해 FRET에 의해 측정되었다. 데이터는 K d 값을 제공하기 위한 쌍곡선 커브에 적합하였다.
도 20은 0-240분 동안 가멘다졸 (10 nM)로 처리된 및 처리되지 않은 초기 세르톨리 세포에서 Il1a의 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 21은 H2-가멘다졸의 단일 경구 투여(100mg/kg) 5일 이후 난소 무게가 감소되고(도 21 패널 A) 프로게스테론의 혈청 수준이 감소된(도 21 패널 B) 암컷 생쥐를 나타내는 그래프를 포함한다.
도 22는 H2-가멘다졸 투여(100mg/kg) 5일 이후 다수의 폐쇄/사멸 여포의 존재를 나타내는 난소 조직의 이미지를 포함한다.
도 23은 증가하는 투여량에 대한 생식력 억제의 가능성을 나타내는 그래프를 포함한다.
본 발명의 화합물의 일부는 열충격 단백질에 또는 열충격 단백질과 연관된 샤프론 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 결합함으로써 이들의 불임 효과를 나타내는 것이 주의 깊게 관찰된다. 본 발명의 화합물이 열충격 단백질 HSP90AB1을 억제할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한 본 발명에서 기술된 화합물들이 진핵세포 번역신장인자 1 알파 1(EEF1A1)을 억제할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한 화합물은 인터루킨 1 및/또는 NF-KappaB 억제제 알파(Nfkbia)의 증가를 유도할 수 있다. 또한 화합물은 세르톨리 세포 및 난소여포와 같은 난소세포를 우선적으로 표적화할 수 있다.
90 kDa 열충격 단백질은 세포 내 기능을 조절하는 샤프론 집단에 속하며 열충격 뿐만 아니라 세포 과정에서 수반되는 많은 수의 주요 단백질들의 형태적인 성숙 이후 변성된 단백질의 재폴딩을 위해 필요하다. 따라서, HSP90 단백질 또는 연관된 단백질을 억제하는 것은 생식력을 억제하기 위해 유용할 수 있다. 효모에서, 83kDa에서 약간 낮은 분자량을 가진 Hsp90의 동족체(Hsp83)는 동일한 기능을 제공한다. 샤프론의 Hsp90 집단은 4개의 다른 이소폼(isoforms)으로 이루어져있다. Hsp90α 및 Hsp90β가 세포질에서 우세하게 발견되며, 94 kDa 글루코스-조절성 단백질("GRP94")은 소포체에 국한되며, Hsp75/종양 괴사 인자 수용체 연관 단백질 1("TRAP-1")은 주로 미토콘드리아 기질에 존재한다. 이들 Hsp90은 코샤프론(cochaperones), 이뮤노필린(immunophilins), 및 파트너 단백질의 존재하에서 새로 형성된 발생기 펩티드의 생물학적으로 활성인 3차원 구조체로의 형태적 성숙을 초래하는 다중단백질 복합체를 만들기 위해 클라이언트 단백질에 결합한다.
아래에서 보다 충분하게 논의된 바대로, Hsp90은 활성 호모다이머(homodimer)의 N-말단 부위에 ATP 결합 부위를 가진 ATP-의존적 단백질이다. Hsp90의 ATPase 활성의 파괴는 다중단백질 복합체의 안정화 및 프로테아좀-매개성 가수분해를 겪는 클라이언트 단백질의 추후 유비퀴틴화을 초래한다.
보다 구체적으로, ATP-의존적인 방식에서, Hsp70은 응집을 방지함으로써 초기 펩티드를 안정화하기 위해 새로 합성된 단백질에 번역되는 중에(cotranslationally) 및/또는 번역 이후에(posttranslationally) 결합한다. Hsp70/폴리펩티드 이원 복합체(binary complex)의 안정화는 Hsp70이 새로 생성된 펩티드에 결합한 이후 생기는 Hsp70 상호작용 단백질("HIP")의 결합에 의존한다. Hsp70-Hsp90 조직화 단백질("HOP")은 Hsp70 및 Hsp90 모두에 의해 인식되는 잘 보존된 TPRs(테트라트리코펩티드 반복)를 포함하며, Hsp70/HIP 및 Hsp90의 결합을 증진시켜 헤테로단백질 복합체를 초래한다. 텔로미어 및 스테로이드 호르몬 수용체의 경우에, 클라이언트 단백질은 Hsp70, HIP, 및 HOP의 동반된 방출과 함께 Hsp70 시스템으로부터 Hsp90 호모다이머로 전달된다. 시스 /트랜스 프롤릴-이성질화효소 활성(FKBP51, FKBP-52, 또는 CyP A)에 대해 ATP 및 이뮤노필린이 결합하자마자, 이들 총체는 클라이언트 단백질을 이의 3차원 구조체로 폴딩한다. 이후 단계에서, ATP의 가수분해 및 폴딩 단백질 Hsp90 파트너 단백질, 및 ADP의 방출을 증진시키는 N-말단 영역 근처에서 p23은 Hsp90에 결합한다.
형태적인 성숙을 위해 Hsp90에 의존적인 단백질의 예들은 다음을 포함한다: 종양유발 Src 키나아제, Raf, p185, 돌연변이 p53 (일반적인 p53이 아님), 텔로미어, 스테로이드 호르몬 수용체, 폴로-형 키나아제 ("PLK"), 단백질 키나아제 B ("AKT"), 죽음 도메인 키나아제 ("RIP"), MET 키나아제, 초점 접착 키나아제 ("FAK"), 아릴 탄화수소 수용체, RNA-의존 단백질 키나아제 ("PKR"), 산화질소 생성효소 ("NOS"), 중심체 단백질 등. 추가적으로, 사이클린 의존 키나아제 4 ("CDK4"), 사이클린 의존 키나아제 6 ("CDK6"), 및 인간 상피세포 성장인자 수용체 2 ("Her-2")와 같은 다른 단백질들이 Hsp90의 클라이언트 단백질들로 여겨진다. 결론적으로, 여러 신호전달 경로가 Hsp90 단백질 폴딩 기구의 파괴에 의해 동시에 억제될 수 있기 때문에 Hsp90 억제는 생식 가능성을 억제하는 치료법의 개발을 위한 표적이다.
따라서, 본 발명은 로니다민 구조에 기초한 신규 화합물(예를 들어, 로니다민 유사체들), 및 생식력을 제어하는 사용 방법에 관한 것이다. 로니다민 (1-(2,4,-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산)은 인다졸-카복실산 화합물의 그룹에 속한다. 생식 가능성 억제에 사용될 수 있는 로니다민 유사체들의 일부 예들이 다음에 개시되어 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 화학식 I에 따른 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터가 제공된다:
화학식 I
Figure pct00002
화학식 I에서: R1은 카복실, 아크릴, 또는 카복실산 히드라지드이며; R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 시클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며; X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며; 및 Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다.
R2가 수소가 아닌 임의의 다른 것인 경우, R1은 -COOCH3, -COOCH2CH3, -CH=CHCOOH, -CH=CHCOOCH3 , -CONHNH2, -CONHNHCH3, 또는 -CONHN(CH3)2 일 수 있다. R2가 수소인 경우, Z1, Z2, Z3, 및 Z4의 적어도 하나가 질소이며 나머지는 독립적으로 탄소 또는 질소이거나; 또는 R1은 -COOH, -CONHNH2, -CONHN(CH3)2, -CH=CHCOOH가 아니다. 또한 R1은 프로피온산, 2-메틸 프로피온산, 옥시란-카복실산, 시클로프로판 카복실산, 프로피온산 메틸 에스터, 2-메틸 프로피온산 메틸 에스터, 옥시란-카복실산 메틸 에스터, 시클로프로판 카복실산 메틸 에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 카복실산 또는 카복실산 에스터일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)인다졸-3-카복실산 메틸 에스터(또한 RC-MC-30로도 언급된다)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00003
본 발명의 다른 양태에서, 1-[(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 에틸 에스터 (RC-MC-156)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00004
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-[(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 프로필 에스터 (RC-MC-158)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00005
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 N-메틸 히드라지드 (RC-MC-120)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00006
본 발명의 다른 양태에서, 6-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 (DD-MC-I)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00007
또 다른 양태에서, 본 발명은 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 (JSW-1-284)을 포함하는 화합물을 포함한다.
Figure pct00008
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-20)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00009
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-280)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00010
또한, 본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-18)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00011
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-1-190)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00012
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-프로피온산을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00013
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-1-298)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00014
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2-클로로, 4-플루오르벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-2-36)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00015
본 발명의 또 다른 양태에서, 6-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (DD-MC-II)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00016
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-282) 를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00017
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2-클로로, 4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-2-22)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00018
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-1-162)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00019
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-158)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00020
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-1-170)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00021
1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-160)를 포함하는 화합물을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 양태이다.
Figure pct00022
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (RC-MC-100)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00023
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-1-276)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00024
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-14)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00025
본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-270)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00026
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-12)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00027
또 다른 본 발명의 양태에서, 시스 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (시스 RC-MC-110)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00028
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-1-294)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00029
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2-클로로, 4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-2-40)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00030
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸-아크릴산 (RC-MC-217)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00031
본 발명의 또 다른 양태에서, 트랜스 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터 (트랜스 RC-MC-200)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00032
본 발명의 또 다른 양태에서, 시스 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터 (시스 RC-MC-200)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00033
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (RC-MC-101)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00034
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-274)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00035
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-2-16)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00036
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 (JWS-2-72; H2-가멘다졸)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00037
JWS-2-72 (H2 가멘다졸)
본 발명의 또 다른 양태에서, 가멘다졸로도 알려진, 트랜스 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (RC-MC-110)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00038
가멘다졸 (RC-MC-110)
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산을 포함하는 화합물이 제공된다 (RC-MC-294).
Figure pct00039
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터 (JWS-2-70)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00040
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(4-클로로-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-212)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00041
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(4-클로로-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터(JWS-2-210)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00042
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(4-클로로-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-2-224)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00043
본 발명의 또 다른 양태에서, 시스- 및 트랜스-3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산 (RC-MC-228)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00044
본 발명의 또 다른 양태에서, 시스- 및 트랜스-2-[1-(2,4-디클로로-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산 (JWS-3-6)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00045
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로프-2-엔-1-올 (RC-MC-223)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00046
본 발명의 또 다른 양태에서, 트랜스-3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴로나이트릴을 포함하는 화합물이 제공된다 (RC-MC-222 트랜스).
Figure pct00047
본 발명의 또 다른 양태에서, 시스-3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴로나이트릴을 포함하는 화합물이 제공된다 (RC-MC-222 시스).
Figure pct00048
본 발명의 또 다른 양태에서, 4-[1-(2,4-디클로로-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-부트-3-엔-2-온 (RC-MC-216)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00049
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-3-[2-(1H-테트라졸-5-일)-비닐]-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸 (RC-MC-225)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00050
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드 (RC-MC-205)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00051
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (RC-MC-288)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00052
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (RC-MC-287)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00053
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (RC-MC-292)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00054
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터 (RC-MC-291)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00055
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (RC-MC-263) 를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00056
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (RC-MC-262)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00057
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (RC-MC-265)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00058
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터 (RC-MC-264)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00059
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-102)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00060
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-100)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00061
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 (JWS-2-112)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00062
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터 (JWS-2-110)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00063
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-2-104) 를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00064
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(4-클로로-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-216) 을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00065
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(4-클로로-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-214) 를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00066
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(4-클로로-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-2-232) 을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00067
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (TH-2-178) 을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00068
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 (TH-2-192)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00069
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (TH-2-179)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00070
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-122)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00071
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-120)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00072
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 (JWS-2-132)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00073
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-2-124) 를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00074
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (RC-MC-260)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00075
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (RC-MC-251) 를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00076
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (RC-MC-261) 을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00077
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터 (RC-MC-257)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00078
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산 (RC-MC-247) 을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00079
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산-3-메틸 에스터 (RC-MC-252)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00080
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-(2-카복시-비닐)-1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-인다졸-6-카복실산 (RC-MC-259)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00081
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-3-(2-메톡시카보닐-비닐)-1H-인다졸-6-카복실산 (RC-MC-258)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00082
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-1-260)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00083
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-1)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00084
또한, 본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-254)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00085
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-300)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00086
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-1-268)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00087
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-2-10)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00088
또한, 본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-258)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00089
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-302)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00090
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-270)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00091
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-268)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00092
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS-2-278)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00093
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-4-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (JWS-2-94)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00094
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-4-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-92)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00095
또 다른 양태에서, 화학식 II(A)에 따른 화합물이 제공되며, 치환체들은 화학식 I에 관련되어 기술된 것과 동일하다:
Figure pct00096
화학식 II(A) 유도체의 예들은 다음을 포함한다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘]-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘]-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘]-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-일]아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-일]아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-일]아크릴산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드. 추가적인 예들이 본 명세서에서 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H- 피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 (JWS-1-114)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00097
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘]-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-110)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00098
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-일] 아크릴산 (JWS-2-176)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00099
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-112)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00100
또한, 본 발명은 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H- 피라졸로[4,3-b]피리딘 -3-카복실산 (JWS-1-230)을 포함하는 화합물을 포함한다.
Figure pct00101
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-228)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00102
또한, 본 발명은 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-232)를 포함하는 화합물을 포함한다.
Figure pct00103
또한, 본 발명은 1-(2,4-디클로로벤질)-5-메톡시-1H- 피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 (JWS-1-144)을 포함하는 화합물을 포함한다 .
Figure pct00104
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-5-메톡시-1H- 피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-142)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00105
또한, 본 발명은 1-(2,4-디클로로벤질)-5-메톡시-1H- 피라졸로[4,3-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드 (JWS-1-146)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00106
또 다른 양태에서, 화학식 II(B)에 따른 화합물이 제공된다:
Figure pct00107
또 다른 양태에서, 화학식 II(C)에 따른 화합물이 제공되며, 치환체들은 화학식 I에 관련되어 기술된 것과 동일하다:
Figure pct00108
화학식 II(C) 유도체들의 예는 다음을 포함한다: 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-일]아크릴산; 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-일]아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-일]아크릴산; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 히드라지드; 및 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 히드라지드. 추가적인 예들이 본 명세서에서 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 (JWS-1-132)을 포함하는 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H- 피라졸로[3,4-c]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-1-130)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00110
또 다른 양태에서, 화학식 II(D)에 따른 화합물이 제공되며, 치환체들은 화학식 I에 관련되어 기술된 것과 동일하다:
Figure pct00111
화학식 II(D) 유도체들의 예는 다음을 포함한다: 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-일]-아크릴산; 및 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산 (RC-MC-86)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00112
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-일]-아크릴산 (RC-MC-65)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00113
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산 히드라지드 (RC-MC-60)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00114
또 다른 양태에서, 화학식 II(F)에 의해 포함되는 화합물이 제공되며, 치환체들은 화학식 I에 관련되어 기술된 것과 동일하다:
Figure pct00115
화학식 II(F) 유도체들의 예는 다음을 포함한다: 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-3-일]-아크릴산; 및 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-3-카복실산 히드라지드.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-피라졸로[3,4-b] 피라진-3-카복실산 (JWS-2-298)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00116
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-피라졸로[3,4-b] 피라진-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-296)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00117
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-3-일]-아크릴산 (JWS-3-1)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00118
또 다른 양태에서, 화학식 II(E)에 의해 포함되는 화합물이 제공되며, 치환체들은 화학식 I에 관련되어 기술된 것과 동일하다:
Figure pct00119
화학식 II(E) 유도체들의 예는 다음을 포함한다: 1-(2,4-디클로로벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-3-일]-아크릴산; 및 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-3-카복실산 히드라지드.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-피라졸로[4,3-d] 피리미딘-3-카복실산 (JWS-2-256)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00120
본 발명의 또 다른 양태에서, [1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-피라졸로[4,3-d] 피리미딘-3-카복실산 메틸 에스터 (JWS-2-246)를 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00121
본 발명의 또 다른 양태에서, 3-[1-(2,4-디클로로-벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-3-일]-아크릴산 (JWS-2-254)을 포함하는 화합물이 제공된다.
Figure pct00122
본 발명은 또한 다음 설명에 의해 기술되며, 본 발명에 대한 제한의 의도로 해석되어서는 안된다.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 6-위치에서 다음과 같은 할로겐, 알콕시 또는 카복실산인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 5-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산-3-메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산-3-메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산-3-메틸 에스터; 3-(2-카복시-비닐)-1-(2,4-디플루오르-벤질)-1H-인다졸-6-카복실산; 3-(2-카복시-비닐)-1-(2-클로로-4-플루오르-벤질)-1H-인다졸-6-카복실산; 3-(2-카복시-비닐)-1-(2-플루오르-4-클로로-벤질)-1H-인다졸-6-카복실산; 1-(2,4-디플루오르-벤질)-3-(2-메톡시카보닐-비닐)-1H-인다졸-6-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르-벤질)-3-(2-메톡시카보닐-비닐)-1H-인다졸-6-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로-벤질)-3-(2-메톡시카보닐-비닐)-1H-인다졸-6-카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 트리할로알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(4-플루오르-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(4-메틸-2-클로로-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(4-메틸-2-플루오르-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(4-플루오르-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(4-메틸-2-클로로-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(4-메틸-2-플루오르-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸-아크릴산; 트랜스 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 시스 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 저급 알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 디할로알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 모노할로알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 알콜인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 메틸 에스터; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 알콜인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(4-플루오르-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(4-메틸-2-클로로-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(4-메틸-2-플루오르-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(4-플루오르-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(4-메틸-2-클로로-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(4-메틸-2-플루오르-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 아미노인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일] 아크릴산 메틸 에스터; 1-(2,4-디클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드; 및 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 히드라지드.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 화학식 I(A)에 따른 R1을 포함할 수 있다:
Figure pct00123
화학식 I(A).
화학식 I(A) 유도체의 예들은 다음을 포함한다: 1-(2,4-디플루오르-벤질)-3-[2-(1H-테트라졸-5-일)-비닐]-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-3-[2-(1H-테트라졸-5-일)-비닐]-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-3-[2-(1H-테트라졸-5-일)-비닐]-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 화학식 I(B)에 따른 R1을 포함할 수 있다:
Figure pct00124
화학식 I(B)
여기서 R3는 수소, 알킬, 아랄킬, 또는 시클로알킬;
및 W는 탄소 또는 산소;
X 및 Y는 독립적으로 할로겐; 및/또는
R2는 트리할로알킬.
화학식 I(B) 유도체의 예들은 다음을 포함한다: 3-[1-(2,4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 2-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2,4-플루오르벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 2-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 및 2-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-할로-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산 에스터인 R1 및 수소인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)인다졸-3-카복실산 메틸 에스터; 1-[(2,4-디플루오르벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 에틸 에스터; 1-[(2-클로로-4-플루오르벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 에틸 에스터; 1-[(2-플루오르-4-클로로벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 에틸 에스터; 1-[(2,4-디플루오르벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 프로필 에스터; 1-[(2-클로로-4-플루오르벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 프로필 에스터; 및 1-[(2-플루오르-4-클로로벤질)-1H-인다졸]-3-카복실산 프로필 에스터.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 수소, 알콕시, 또는 카복실산인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로-벤질)-1H-인다졸-3,6-디카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 트리할로알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(4-플루오르-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(4-메틸-2-클로로-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(4-메틸-2-플루오르-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산;
3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2,4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2,4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 2-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 2-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2,4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-2-메틸프로피온산; 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2,4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 3-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산; 2-[1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실릭; 2-[1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실릭; 2-[1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실릭; 및 2-[1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-시클로프로판카복실릭.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 디할로알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-디플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 모노할로알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 트리할로알콕시인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(4-플루오르-2-메틸-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(4-메틸-2-클로로-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(4-메틸-2-플루오르-벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 아미노인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-4-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-플루오르벤질)-4-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-4-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-4-디메틸아미노-1H-인다졸-3-카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 저급알킬인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-플루오르벤질)-4-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-4-메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-4-메틸-1H-인다졸-3-카복실산.
상기 이외에, 화학식 I에 따른 유도체는 카복실산인 R1 및 알콜인 R2를 포함할 수 있다: 1-(2,4-디플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디클로로벤질)-5-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2,4-디플루오르벤질)-5-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-5-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산; 및 1-(2-플루오르-4-클로로벤질)-5-히드록시메틸-1H-인다졸-3-카복실산.
생식력 제어( Modulating Fertility )
본 발명에서 기술된 화합물들은 남성 및 여성 생식력을 제어하는데 사용될 수 있다. 화합물은 당분간 동안 생식력을 억제하기 위해 또는 남성 또는 여성을 불임시키기 위해 1회 또는 그 이상의 투여량으로 투여될 수 있다.
신규 인다졸 카복실산 유도체인 H2-가멘다졸(즉, JWS-2-72 또는 GMZ)로도 언급되는 본 발명에서 사용된 가멘다졸은 남성 정자형성의 가역적 억제제인 것으로 나타났다. 가멘다졸은 동물 연구에서 내약성이 좋으며 25 mg/kg의 IP 투여량의 경우 임의의 기관에서 명확한 조직병리학을 나타내지 않는다. 가멘다졸을 투여받은 쥐의 경우 처리-후 5일에서 행동 또는 체중 변화의 흔적이 없었다. 최근 연구들은 가멘다졸이 쥐 세르톨리 세포에서 HSP90 억제제로 역할하는 것을 발견하였다. GMZ는 친화성 크로마토그래피 및 직접 결합 연구에 의해 나타난 바와 같이 직접 HSP90-베타, HSP90AB1, 및 진핵세포 신장 인자(EEF1A1)에 결합한다.
가멘다졸 6mg/kg의 단일 경구 투여 3주 이후 생식력이 있는 것으로 나타난 수컷 쥐 7마리 중에 7마리에서 100% 불임성이 달성된다는 것이 발견되었다. 7마리 중 4마리에서 생식력이 9주경에 되돌아왔으며, 정상으로-보이는 수태들(normal-appearing conceptuses)의 일반적인 수를 가진다. 가멘다졸 3 mg/kg의 단일 경구 투여량에서 불임성이 된 6마리 동물 중 4마리에서 100% 생식력이 되돌아왔다. 짝짓기 행동에서 가멘다졸-처리된 그룹 대 대조군(오직 부형제) 동물들의 차이점은 관찰되지 않았다. 가역적인 불임성을 나타내는 동물들에서, 가멘다졸의 투여 이후 순환하는 FSH 수준의 일시적인 증가는 인히빈 B 수준의 초기 감소와 일치하였지만, 다른 순환하는 재생 호르몬에서의 현저한 변화는 관찰되지 않았다. 가멘다졸은 6.8±3.0 x 10-10 M의 IC50을 가지는 인비트로 초기 세르톨리 세포에 의해 인히빈 B의 생산을 억제하였으며 세르톨리 세포가 제 1 표적이라는 것을 제안한다. 비오틴결합 가멘다졸 유사체는 초기 세르톨리 세포에서 가멘다졸의 세포질 및 핵 주위 결합을 밝혔다. 가멘다졸은 지금까지 가장 유력한 새로운 경구용 항-정자형성 인다졸 카복실산을 대표한다. 하지만, 우리의 결과들은 가역성을 향상시키기 위해 추가적인 투여량 발견 연구들이 필요하다는 것을 증명하였으며 이 가능성 있는 출현 가능한 비-호르몬성 남성 피임용 제제의 보다 구체적인 약물 개발 이전에 치료 범위(therapeutic window)를 확대하였다.
본 연구는 소형 분자의 남성 피임약 후보로서 임상전 경로에서 가멘다졸이 지속되어야 하는 초기 투여량 범위 결과를 제시한다. 이러한 목표를 지지하여, 우리는 가멘다졸이 지금까지 합성된 가장 유력한 LND의 유사체임을 보고하였으며, 단지 6 mg/kg의 단일 경구 투여 이후 쥐들에서 100%의 불임성을 제공하며 3 mg/kg의 단일 경구 투여 이후 67%의 불임성을 제공한다. 또한, 불임성이 된 동물에서 생식력의 회복은 3 mg/kg 투여에서 100%였으며 6 mg/kg 투여에서 57%였다. 또한 생식력을 다시 얻은 동물들에서 정상으로-보이는 수태의 수와 비율이 대조군 동물들과 동일하다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 그에 비해, LND의 이전 유사체들은 쥐에서 완전한 불임을 유도하기 위해 25-50 mg/kg에서 다중 투여가 필요하였다. 따라서, 가멘다졸은 다른 LND 유사체들에 비해 개선된 것으로 보인다; 하지만, 본 발명에서 보고된 단일 경구 투여 결과는 가망이 있지만, 또한 이상적인 100% 불임 및 투여 요법이 일단 종료하면 생식력의 100% 수율의 회복을 제공할 수 있는 만약 더 넓은 치료 범위(therapeutic window)가 존재한다면 이를 결정하기 위해 낮은 다중 투여-범위 실험들이 필요하다는 것을 제안한다. 생식력의 거의 100%의 회복이 아직 가족을 갖지 않은 남성들에게 판매하려는 남성 피임약에 필요할 것이라는 것이 또한 강조되어야 한다. 이들 목표들에 적절히 다가가기 위해 추가적인 투여-범위 실험들 뿐만 아니라 제형, 약물동태학, 약력학 등, 화합물들의 연구가 계획된다. 일반적으로, 경구 비호르몬성 남성 피임약은 현재 호르몬계 피임약에 비해 이점을 제공하는데 후자는 일반적으로 호르몬들의 조합이 필요하며 반복된 경구 투여와 추가적인 제제의 주사를 포함하는 투여의 다중 경로, 불임성의 개시 이전의 장기간의 투여, 및 생식력의 회복을 위한 긴 지연 기간이 필요하다. 또한 면역피임 접근법들은 주사가 필요하며 개인들의 상당한 아집단(subset)에서 면역반응의 부족을 포함하는 현저한 변동성을 나타낸다.
가멘다졸의 다른 주요 양태는 이전 LND 유사체들에서 알려진 부작용이 없다는 것이다. 본 발명에서 보고된 연구에서, LND 및 유사한 유사체들은 쥐에서의 투여 이후 무기력, 체중 증가에서의 일시적인 감소, 및 간 및 췌장의 조직병리학을 제공하였다. 하지만 불임을 유발하기에 충분한 투여량에서 가멘다졸 투여 이후 본 연구에서 이러한 관찰된 부작용들의 어떤 것도 눈에 띄지 않았다. 사망은 200 mg/kg의 가멘다졸에서 관찰되었다.
6 mg/kg에서의 가멘다졸의 단일 경구 투여 이후 가역성의 수준이 57%였다는 것이 주목되어야한다. 가멘다졸(3 mg/kg)의 단일의 낮은 경구 투여가 생식력에서 67% 감소를 제공하며 100%의 생식력 회복을 가진다는 우리의 발견은 기대를 하게 한다. 가역성과 결합된 효력은 낮은 투여량이지만 반복되는 간격으로 사용함으로써 개선될 수 있다. 정자형성 사이클의 기간을 고려해 볼 때, 다중의 낮은 투여 선택은 일주일에 한번 또는 한 달에 한번 남성 피임약이 선택적으로 정자형성의 정세포 단계를 막을 수 있으며, 또한 화합물의 투여 종료 이후 정소의 최종적인 재증식(repopulation)을 허용하는 것을 생각할 수 있다는 점에서 또한 매력적이다.
HSP90AB1 (이전에 HSP90베타로도 알려짐 [열충격 90 kDa 단백질 1, 베타]) 및 EEF1A1 (이전에 eEF1A로도 알려짐 [진핵세포 번역 신장 인자 1 알파 1])이 정소, 세르톨리 세포, 및 ID8 난소암 세포로부터 비오틴화된 가멘다졸(BT-GMZ) 친화성 정제에 의한 결합 표적으로 식별되었으며, MALDI-TOF MS 및 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. BT-GMZ은 정제된 이스트인 HSP82 (포유동물 HSP90AB1에 동족체) 및 EEF1A1에 결합하나, TEF3 나 HBS1에는 결합하지 않으며, 표지되지 않은 가멘다졸과 경쟁한다. 하지만, 가멘다졸은 EEF1A1에 의한 뉴클레오티드 결합을 억제하지 않는다. 정제된 사카로마이세스 세레비사에(Saccharomyces cerevisiae ) HSP82에 결합하는 가멘다졸은 루시페라제 재폴딩을 억제하며, HSP90 약물들인 겔다나마이신 또는 노보비오신 유사체, KU-1과 경쟁하지 않는다. 가멘다졸은 HSP90-의존 클라이언트 단백질인 AKT1 및 ERBB2의 분해를 이끌며 HSP90을 포함하지 않는 MCF-7 세포에서 항증식 효과를 가진다. 이들 데이터는 가멘다졸이 선택적 HSP90AB1 및 EEF1A1 억제제의 새로운 부류를 나타낼 수 있다는 것을 제안한다. 가멘다졸-처리된 쥐로부터의 정소 유전자 마이크로어레이 분석은 경구 투여 4시간 이후 세 개의 인터루킨 1 유전자들 및 Nfkbia (NF - kappaB 억제제 알파)의 현저하고 빠른 증가를 나타낸다. IL1A 전사에서 스파이크(spike)가 초기 세르톨리 세포에서 100nM의 가멘다졸에 노출 60분 이후 rt-PCR에 의해 확인되었으며, 세르톨리 세포 정세포가 표적인 것을 증명한다. AKT1, NFKB, 및 인터루킨 1은 세르톨리 세포 접합 복합체(junctional complexes)의 알려진 조절자이다. 가멘다졸 작용을 위한 현재 모델은 이 경로가 HSP90AB1 및 EEF1A1와의 상호작용을 정세포의 손실로 연결하며 불임의 결과를 나타낸다고 가정한다.
정의
용어 "마이크로"는 기호 "μ" 및 문자 "u"로 나타날 수 있다. 이와 같이, uL은 마이크로리터를 의미한다.
용어 "아미노"는 질소 원자를 통해 결합된 1차, 2차 또는 3차 아미노 그룹을 의미하며, 2차 아미노 그룹은 알킬 또는 시클로알킬 치환체를 가지며 3차 아미노 그룹은 두 개의 유사하거나 다른 알킬 또는 시클로알킬 치환체를 가지거나 또는 두 개의 질소 치환체는 함께 고리를 형성하며, 예를 들면, -NH2, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸-에틸아미노, 피롤리디노, 피페리디노, 피페라지노, 모폴리노 등과 같다.
용어 "알콜"은 하나 이상의 히드록시 치환체를 가진 선택적으로 치환된 탄화수소기를 나타낸다. 6-위치 또는 5-위치에서, 모노-알콜 뿐만 아니라 폴리히드록시 변형체들과 같은 1차, 2차, 및 3차 알콜들이 예상될 수 있다--예를 들어, 알칸디올, 알칸트리올, 알칸테트라올 등. 바람직한 알칸올은 약 1개부터 12개까지의 탄소 원자를 포함하는 것들이며, 1개 내지 6개의 탄소 원자를 가진 알칸올이 가장 바람직하다. 바람직한 지방족 알콜의 예들은 다음과 같다: 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-프로펜-2-올, 1-부탄올, 2-부탄올, 2-메틸-2-프로판올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1,2-에탄디올 (에틸렌 글리콜), 1,2,3-프로판트리올 (글리세롤), i-1,2,3,4-부탄테트라올 (i-에리스리톨), 및 2,2-디히드록시메틸-1,3-프로판디올 (펜타에리스리톨).
용어 "알킬"은 분지된 또는 분지되지 않은 1 내지 24 탄소 원자의 포화된 탄화수소기를 의미하며, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 옥틸, 데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등과 같다. 본 발명에서 바람직한 "알킬" 그룹은 1 내지 12의 탄소 원자를 포함한다. "저급 알킬"은 1 내지 6개, 보다 바람직하게는 1 내지 4개 탄소 원자의 알킬기를 의미한다.
용어 "알콕시"는 알킬기로 치환된 산소-함유 그룹을 의미한다. 예들은 제한 없이 메톡시, 에톡시, 및 tert-부톡시를 포함한다. 1개 내지 6개의 탄소 원자를 가진 "저급 알콕시" 그룹이 가장 바람직하다. 이러한 그룹의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 이소프로폭시, 및 tert-부톡시 알킬을 포함한다.
용어 "아릴"은 1, 2 또는 3개의 고리를 함유하는 카보사이클릭 방향족을 의미하며, 여기서 이러한 고리는 함께 펜던트 방식으로 부착되거나 또는 접합될 수 있다. 용어 "접합된"은 제 1 고리와 공동으로(즉, 공유된) 두 개의 인접 원자를 가짐으로써 제 2 고리가 존재(즉, 부착되거나 형성된다)하는 것을 의미한다. 용어 "접합된"은 용어 "축합된(condensed)" 과 동등하다. 용어 "아릴" 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인단 및 바이페닐와 같은 방향족기를 포함한다.
용어 "아랄킬" 아릴-치환된 알킬기를 포함한다. 바람직한 아랄킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가진 알킬기에 부착된 아릴기를 가진 "저급 아랄킬"기이다. 이러한 그룹들의 예들은 벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 페닐에틸 및 디페닐에틸을 포함한다. 용어 벤질 및 페닐메틸은 상호교환적으로 사용된다.
용어 "카보사이클릭"은 하나 이상의 공유결합으로 닫힌 고리 구조를 포함하는 알킬기를 의미하며, 고리의 백본을 형성하는 형성하는 원자는 모두 탄소 원자이다. 따라서 상기 용어는 고리 백본이 적어도 하나의 비-탄소 원자를 포함하는 헤테로사이클릭 고리로부터 카보사이클릭 고리를 구분한다.
용어 "헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클"은 3 내지 약 12개의 탄소 원자, 바람직하게는 약 5 내지 약 6개를 가진 포화된 또는 불포화된 사이클릭 탄화수소기를 의미하며, 여기서 1 내지 약 4개의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황에 의해 교체된다. 바람직한 헤테로사이클은 벤즈이미다졸, 디히드로티오펜, 디옥신, 디옥산, 디옥소란, 디티안, 디티아진, 디티아졸, 디티오란, 퓨란, 에폭시드, 이미다졸, 모폴린, 옥사졸, 옥사디아졸, 옥사티아졸, 옥사티아졸리딘, 옥사진, 옥사디아진, 피페라진, 피페라딘, 피란, 피라진, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리딘, 테트라히드로퓨란, 테트라진, 티아디아진, 티아디아졸, 티아트리아졸, 티아진, 티아졸, 티오모폴린, 티오펜, 티오피란, 트리아진, 및 트리아졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
용어 "카복실"은 -R1C(==O)O-R2를 의미하며, 여기서 R1은 치환된 또는 비치환된 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭, 또는 아릴이며 또는 R1은 추가적으로 공유결합일 수 있으며 및 여기서 R2는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭, 아릴, 아랄킬이며, 및 여기서 R2는 선택적으로 히드록실 또는 아미노기로 치환될 수 있다.
용어 "카복실산"은 카복실기를 의미하며, 여기서 R2는 수소이다. 이러한 산은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티릭산, 발레릭산, 2-메틸 프로피온산, 옥시란-카복실산, 및 사이클로프로판 카복실산을 포함한다.
용어 "카복실산 에스터" 또는 "에스터"는 카복실기를 의미하며, 여기서 R2는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬이며, 및 여기서 R2는 선택적으로 히드록실 또는 아미노기로 치환될 수 있다.
용어 "사이클로알칸" 또는 "사이클릭 알칸" 또는 "사이클로알킬"은 카보사이클릭기이며, 여기서 고리는 선택적으로 치환된 사이클릭 지방족 탄화수소, 예를 들어, 바람직하게는 3 내지 12개 고리 탄소를 가지는 사이클릭 알킬기이다. "사이클로알킬"은 예로써 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 또는 사이클로옥틸 등을 포함한다. 사이클로프로필이 가장 바람직하다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 플루오르, 클로로, 브로모 또는 아이오도를 의미하며, 일반적으로 유기 화합물에서 수소 원자에 대한 할로 치환에 대한 것이다. 할로 중에서 클로로 및 브로모가 일반적으로 바람직하며 플루오르가 일반적으로 가장 바람직하다.
용어 "히드록실"은 -OH를 의미한다.
용어 "할로알킬"은 적어도 하나의 할로겐을 가진 알킬 또는 사이클로알킬기를 의미한다. 상기 용어는 모노할로알킬, 디할로알킬, 및 트리할로알킬기를 포함한다. 할로알킬기의 예는 플루오르메틸, 디플루오르메틸, 트리플루오르메틸, 플루오르에틸, 펜타플루오르에틸, 2,2,2-트리플루오르에틸, 및 2,2,3,3,3-펜타플루오르프로필을 포함한다. 바람직하게, 할로알킬은 디클로로메틸기를 포함하는 탄화수소, 또는 모노할로치환된 탄화수소와 같은 1 내지 3개의 할로 그룹을 포함한다.
용어 "할로알콕시"는 적어도 하나의 할로겐을 가진 알콕시 또는 사이클로알콕시기를 의미한다. 상기 용어는 모노할로알콕시, 디할로알콕시, 및 트리할로알콕시기를 포함한다. 할로알콕시기의 예들은 플루오르메톡시, 디플루오르메톡시, 트리플루오르메톡시, 및 플루오르에톡시를 포함한다. 바람직하게, 할로알킬은 디클로로메틸기를 포함하는 탄화수소, 또는 모노할로치환된 탄화수소와 같은 1 내지 3개 할로기를 포함한다.
용어 "아크릴"은 에텐에서 4개의 수소 원자 중 하나가 다른 작용기로 교체된 것을 포함한다. 상기 용어는 치환된 및 비치환된 아크릴산 및 아크릴산 에스터, 뿐만 아니라 아크릴산 히드라지드를 포함한다. 비-제한적인 예들은 알킬 (메트)아크릴레이트, 히드록시알킬 (메트)아크릴레이트, 알킬 (메트)아크릴아마이드, 알킬 디(메트)아크릴레이트, 에틸렌성 불포화된 카복실산, 에폭시 (메트)아크릴레이트 (예를 들어, 글리시딜 (메트)아크릴레이트), 사이클로프로필(메티)아크릴레이트, 에톡실화된 (메트)아크릴레이트, 시아노아크릴레이트 등을 포함한다. 아크릴릭-, (메트)아크릴아미도-, 및 (메트)아크릴로니트릴이 또한 포함된다. 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭 (특히 아릴 및 아랄킬) 아크릴레이트 및 메트아크릴레이트, 예를 들어, 사이클로헥실 아크릴레이트, 이소보닐 아크릴레이트가 또한 포함된다. 예시적인 아크릴기는 메틸아크릴레이트, 에틸아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 이소부틸아크릴레이트, tert-부틸아크릴레이트, 디(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸아크릴레이트("HEA"), 히드록시프로필아크릴레이트, 디메틸아미노에틸아크릴레이트, 글리시딜아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, 부틸(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필(메트)아크릴레이트("HEMA"), 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 글리시딜(메트)아크릴레이트, 아크릴로니트릴 , (메트)아크릴로니트릴, 아크릴아미드 또는 메트아크릴아미드, N-메틸올 (메트)아크릴아미드, N-에탄올 아크릴아미드, N,N-디메틸 (메트)아크릴아미드, N-t-부틸 아크릴아미드, 옥틸-아크릴아미드 등이다. 일 실시태양에서, 아크릴기는 테트라졸기로 치환된 에텐을 포함한다. 또 다른 양태에서, 아크릴기는 옥사디아졸론, 설폰아민, 설포네이트, 또는 포스페이트기로 치환된 에텐을 포함한다.
"아크릴산"은 -(CR1==CR2)n-COOH 그룹을 의미하며, 여기서 R1 및 R2 는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 또는 아랄킬이며, n은 예를 들어, 1, 2, 3, 4 사이의 정수이며, 바람직하게는 10 미만이다.
"아크릴산 에스터"는 -(CR1==CR2)n-COOR3 그룹을 의미하며, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 또는 아랄킬이며, R3는 알킬 또는 사이클로알킬이다. 아크릴산 에스터의 예들은 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, n-부틸 아크릴레이트, 2-메틸 아크릴레이트, 및 2-에틸헥실 아크릴레이트, 등을 포함하며, n은 예를 들어, 1, 2, 3, 4 사이의 정수이며, 바람직하게는 10 미만이다.
"아크릴산 히드라지드"는 -(C R1==C R2)n-CONR3NR4R5 그룹을 의미하며, 여기서 R1, R2, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 또는 아랄킬 수소 또는 알킬이며, n은 예를 들어, 1, 2, 3, 4 사이의 정수이며, 바람직하게는 10 미만이다.
"카복실산 히드라지드"는 --C(O)NR1NR2R3 그룹을 의미하며, 여기서 R1, R2, 및 R3는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 또는 아랄킬이다.
용어 "에폭시드"는 적어도 하나의 에터를 포함하는 선택적으로 치환된 포화 또는 불포화 지방족 화합물을 의미하는 것으로 이해되며 산소 원자가 세 원자 고리의 일부이다. 본 발명에 따른 예시적인 에폭시드는 옥시란 (에틸렌 옥사이드), 옥시란 카복실산, 에폭시프로판, 에폭시부탄, 2-메틸에폭시프로판, 2-메틸에폭시부탄, 글리시돌 및 에피클로로히드린, 2-메틸-2,3-에폭시부탄을 포함한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 일어나거나 일어나지 않을 추후 설명되는 사건 또는 상황, 및 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함하는 설명을 의미한다. "선택적으로"는 기술된 조건이 존재하는 실시태양 및 기술된 조건이 존재하지 않는 실시태양을 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 페닐"은 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 페닐을 의미하며 상기 기술은 비치환된 페닐 및 치환된 페닐을 모두 포함한다. 상기 용어는 또한 페닐 고리에서 하나 이상의 헤테로 원자를 포함한다. "선택적으로"는 기술된 조건이 존재하는 실시태양 및 기술된 조건이 존재하지 않는 실시태양을 포함한다.
본 발명의 화합물로 치료할 "환자"는 임의의 동물일 수 있으며 바람직하게는 야생동물 또는 애완동물(예를 들어, 고양이 또는 개) 또는 가축(예를 들어, 말, 소, 돼지, 양 등) 또는 인간과 같은 포유동물이다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 본 발명의 화합물로 치료를 받아 일시적으로 또는 영구적으로 생식력이 억제되거나 생식 가능성이 억제된 환자를 의미한다. 이러한 치료는 억제된 생식력 및 억제된 생식 가능성을 야기하는 단일 치료 또는 임의의 통상적인 처방에 따른 정기적인 치료들일 수 있다. 포유동물(특히 인간)과 같은 환자의 치료는 다음을 포함할 수 있다: (a) 환자가 생식에 참여할 수 있는 정자 또는 난자를 생산하는 것을 억제 또는 예방, 즉 환자의 예방 치료; (b) 생식에 참여할 수 있는 정자 또는 난자를 생산하는 능력을 개량, 즉 정자 또는 난자를 생산하는 또는 만들어내는 환자의 능력의 제거 또는 퇴화를 일으킴; 또는 (c) 생식에 참여할 수 있는 정자 또는 난자를 생산하는 능력을 억제, 즉 환자에서 정자 또는 난자의 성장을 억제, 느리게하거나 또는 정지시킴.
용어 "억제하다" 또는 "억제"는 통계적으로 현저하고 주목할만한 활성에서의 감소를 의미하며, 바람직하게는 대조군에 비해 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 감소, 보다 더 바람직하게는 약 80% 이상의 감소이다. 정자형성 억제의 경우, 정자를 형성하는 능력은 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 약 50%, 및 가장 바람직하게는 75% 이상 감소될 수 있다. 유사하게, 난소 여포가 억제될 수 있다.
다른 양태에 따라, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 에스터 또는 전구약물의 유효한 양을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 유효한 양은 생식력을 억제하기에 충분하다.
본 조성물은 임의의 경로의 투여, 특히 구강, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내 또는 비강내 투여를 위해 제제화될 수 있다. 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플렛(caplet), 용액, 현탁액, 분산액, 시럽, 스프레이, 겔, 좌약, 패치 및 에멀전으로 제제화될 수 있다.
본 발명에서 사용된 문구 "약학적으로 허용가능한"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 의미하며, 합리적인 이익/위험 비에 적합하다.
본 발명에서 사용된 문구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 첨가제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 부형제를 의미하며, 대상 로니다민 유사체 또는 유도체를 하나의 기관, 또는 몸의 일부로부터 다른 기관, 또는 몸의 일부로 운반 또는 수송하는데 관여한다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 적합해야 하며 환자에게 유해하지 않다는 관점에서 "허용가능"해야만 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 역할할 수 있는 물질의 일부 예들은 다음을 포함한다: (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; (2) 옥수수 녹말 및 감자 녹말과 같은 녹말; (3) 셀룰로스, 및 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 이의 유도체; (4) 분말화된 트래거캔스; (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 활석(talc); (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 첨가제; (9) 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화씨 오일, 세사미 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 콩기름과 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스터; (13) 아가(agar); (14) 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 무발열원 물(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액(Ringer's solution); (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약학적 제제에서 사용되는 다른 비독성 적합 물질.
본 발명의 화합물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태로 투여될 수 있다. 이러한 염은 통상적인 방식으로 제조될 수 있으며 유리 화합물과 동일한 수준의 활성을 나타낸다. 본 발명에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 염을 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 하급 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 염을 의미하며, 합리적인 이익/위험 비에 적합하다. 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명에 참조로 포함된 S. M. Berge 등은 J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)에서 약학적으로 허용가능한 염을 상세히 기술한다. 염은 본 발명의 화합물의 마지막 분리 및 정제 동안 인시투 제조되거나 유리 염기를 적절한 유기산과 반응시킴으로써 개별적으로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 비독성 산첨가염의 예들은 염산, 브롬산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산과 함께 형성된 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산과 함께 형성된 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 이용한 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용가능한 염은 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캠포레이트, 캠포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로아이오다이드, 2-히드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토금속염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 또한 약학적으로 허용가능한 염은, 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 형성된 아민 양이온을 포함한다.
본 발명에서 사용된 대로, 용어 "약학적으로 허용가능한 에스터"는 모화합물(parent compound) 또는 이의 염을 남기기 위해 인비보 가수분해하며 인체에서 쉽게 분해되는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 에스터를 의미한다. 적합한 에스터기는 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 지방족 카복실산, 특히 알카노익, 알케노익, 사이클로알카노익 및 알칸디오익 산에서 유래한 것들을 포함하며, 여기서 각 알킬 또는 알케닐 모이어티는 바람직하게는 6개 이하의 탄소 원자를 가진다. 특정 에스터의 예들은 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아크릴레이트 및 에틸숙시네이트를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 전구약물(prodrugs)"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 인간 및 하급 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 본 발명의 화합물의 전구약물들을 의미하며, 합리적인 이익/위험 비에 적합하며, 가능하다면 본 발명의 화합물의 의도된 사용에 효과적이다. 용어 "전구약물"은 상기 화학식의 모화합물을 수득하기 위해 예를 들어, 혈액에서 가수분해에 의해 인비보에서 빠르게 전환되는 화합물을 의미한다. 충분한 논의는 T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series and in Edward B. Roche, ed., bioreversible Carriers in Drug Design , American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987에서 제공되며 모두 본 발명에서 참조로서 포함된다.
"유효한 양"은 남성 또는 여성 대상의 생식 가능성을 완전하게 또는 부분적으로 억제하는 본 발명의 화합물 또는 이와 같은 화합물의 둘 이상의 조합의 양이다. 유효한 양은 예방적으로 효과적인 양일 수 있다. 유효한 양은 환자의 크기 및 성별, 치료할 질환, 질환의 심각성 및 얻고자 하는 결과에 의존할 것이다. 소정의 환자의 경우, 유효한 양은 당업자들에게 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 생식력을 감소시키는 것과 관련하여, 생식에 참여할 수 있는 생존 가능한 정자 및/또는 난자의 형성을 억제하기 위해 본 발명의 화합물은 유효한 양으로 투여될 수 있다. 유효한 양은 남성 또는 여성 환자의 생식력을 일시적으로 또는 영구적으로 억제하기에 충분할 수 있다.
본 발명에서, 유효한 양은 생식에 참여할 수 있는 생존 가능한 정자 또는 난자의 형성을 억제하기에 효과적인 농도일 것이다. 예를 들어, RC-MC-110, JSW-2-72, 및 JSW-1-190의 경우, 체중의 약 25.0 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 바람직하게는 체중의 6.0 mg/kg 미만을 포함하는 제제가 정맥내 또는 경구 적용을 위한 유효한 양을 구성할 것으로 현재 여겨지며, 필요한 경우 통상적인 실험이 다른 경로의 투여를 위한 이들 농도들의 조정을 제공한다. 남성 생식력을 억제하기 위한 유효한 양의 특정 예들은 약 0.05 mg/kg 부터 200 mg/kg 미만 또는 150 mg/kg 미만 또는 100 mg/kg 미만, 보다 바람직하게는 약 0.5 mg/kg 부터 약 75 mg/kg, 보다 더욱 바람직하게는 약 1 mg/kg 부터 약 50 mg/kg, 또는 가장 바람직하게는 약 2 mg/kg 부터 약 25 mg/kg을 포함할 수 있다. 여성 생식력을 억제하기 위한 유효한 양의 특정 예들은 약 0.05 mg/kg 부터 200 mg/kg 미만 또는 150 mg/kg 미만, 보다 바람직하게는 약 1 mg/kg 부터 약 125 mg/kg, 보다 더욱 바람직하게는 약 2 mg/kg 부터 약 100 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 4 mg/kg 부터 약 50 mg/kg, 또는 가장 바람직하게는 약 6 mg/kg 부터 약 25 mg/kg을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 예시적인 합성이 일반적으로 아래 반응식에 나타나있다. 비록 예시적인 반응식은 본 발명의 카복실산 및 카복실산 에스터 유도체를 위한 것이나, 당업자는 유사한 반응식이 에스터, 히드라지드, 또는 카복실산 히드라지드 등 본 발명의 유도체들을 생산하기 위해 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00125
여기서 R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 사이클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며;
X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며; 및
Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다.
유사한 방식에서, 본 발명의 화합물은 아크릴 유도체를 가진다.
Figure pct00126
본 발명의 아크릴산 및 아크릴산 에스터로부터 다양한 유도체들이 합성될 수 있다. 예를 들어, 프로피온산 및 에스터 유도체들은 임의의 잘 알려진 수소화기술을 사용하여 제조될 수 있다. 또한 사이클로알킬 유도체, 가장 바람직하게 사이클로프로필, 및 헤테로사이클릭 유도체, 가장 바람직하게 에폭시드가 제조될 수 있다.
당업자는 본 발명의 화합물을 제조하기 위하여 시작 물질 및 다른 전구체들에 작은 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 6-위치에서 메틸, 트리플루오르메틸, 클로린, 또는 플루오린이 요구되는 경우 시작 물질은 예를 들어, 각각 4-클로로-3-니트로-메틸벤젠, 1-클로로-2-니트로-4-트리플루오르메틸-벤젠, 1,4-디클로로-2-니트로-벤젠, 1-클로로-4-플루오르-2-니트로벤젠이다. 유사하게, 5-위치에서 트리플루오르메틸이 요구되는 경우 시작 물질은 1-클로로-2-니트로-5-트리플루오르메틸-벤젠이다. 이들 시작 물질들의 모두는 Marshallton Research Lab (King, North Carolina)로부터 상업적으로 입수가능하다.
또한 할로겐화된 알콕시 치환체의 합성은 상업적으로 입수가능한 1-클로로-4-플루오르메톡시벤젠을 시작 물질로 이용하여 수행될 수 있다. 이를 50℃에서 약 3시간 동안 HNO3 및 H2SO4을 이용하여 니트로화한다. 얻어진 수율(2개의 이성질체)은 98% (반응식-1)이다. 2-클로로-4-트리플루오르메톡시 니트로벤젠은 본 발명에 참조로서 포함되는 Michel Dury의 미국특허 6,121,492로부터의 다음 반응식에 따라 쉽게 합성된다.
Figure pct00127
상기 두 이성질체는 K2CO3의 존재 하의 DMF에서 디메틸말로네이트와 120℃에서 약 8시간 동안 축합된다. 메탄올에서의 재결정에 의해 필요한 생성물이 얻어진다. 수율은 약 55%였다.
Figure pct00128
6원 고리에서 하나 이상의 질소를 가지는 것이 요구되는 경우, 적합한 시작 물질은 예를 들어, 2-클로로-3-니트로피리딘, 4-히드록시-3-니트로피리딘, 2-클로로-6-메톡시-3-니트로-피리딘, 5-트리플루오르메틸-2-피리돈올, 2,3-디클로로피라진, 4-클로로-3-니트로아닐린, 및 2-클로로-피리딘을 포함한다. 이들 시작 물질들 모두는 Sigma Aldrich로부터 상업적으로 입수가능하거나 쉽게 합성될 수 있다.
4-클로로-3-니트로피리딘은 Reich et al., J. Med Chem. 1989, 32, 2474-2485로부터의 다음 반응식에 따라 쉽게 합성될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
Figure pct00129
2-클로로-3-니트로-5-트리플루오르메틸-피리딘은 유럽특허출원 0272824에 따른 다음 반응식에 따라 쉽게 합성될 수 있다는 것이 이해될 것이다:
Figure pct00130
적절한 피라진 전구체가 또한 쉽게 합성될 수 있다. 예를 들어 2-아미노-3-클로로피라진은 본 발명에 참조로 포함되는 A. P. Komin et al., J. Het. Chem., Vol., 13, 13-22 (1976)의 다음 반응식에 따라 쉽게 합성된다.
Figure pct00131
S,S-디메틸-N-(3-클로로피라진-2-일)설필이민은 본 발명에 참조로 포함되는 Hartman의 미국특허 4,609, 659의 다음 반응식에 따라 쉽게 합성된다. MCPBA에 의한 설필아민의 산화는 니트로 유도체를 제공한다.
Figure pct00132
피리미딘 계열들은 상업적으로 입수가능한 5-니트로-4-클로로 피리미딘(Magical Scientific)을 이용하여 합성될 수 있다.
Figure pct00133
4-클로로-2-메틸-벤질 클로라이드는 T.S Osdene and et al, Journal of Medicinal Chemistry., 10, 431-434 (1967)의 다음 반응식에 따라 쉽게 합성된다.
Figure pct00134
본 발명을 설명하기 위해 다음 합성예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 의도로 해석되지 않는다.
실시예 1: 1-(2,4- 디클로로벤질 )-1H- 인다졸 -3- 카복실산 메틸 에스터 ( RC - MC -30)의 합성
RC-MC-30의 합성의 경우, 메틸 인다졸-3-카복실레이트를 첫번째로 형성한다. 아세틸 클로라이드(7mL, 과량)를 적하하여 얼음 냉각된 메탄올(20mL)에 첨가하고 용액을 10분간 동일한 온도에서 교반한다. 그런 다음 상업적으로 이용가능한 인다졸-3-카복실산(2.3g, 14mmol)을 용액에 단번에 첨가하고 혼합물을 실온까지 가열하고 하룻밤 동안 교반한다. 용매를 진공 하에서 제거한 다음 잔여 고체를 CHCl3 (100mL)에 용해하고, 표준 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 수용층을 CHCl3로 추출하고 결합된 유기 추출물을 소금물(brine)로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 제거한 후 밝은 노란색 고체인 생성물이 남았다. 수율 = 2.05g (85%); m.p. = 168o-170 oC; 1H NMR (400MHz, CDCl3) □8.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.10 (s, 3H).
Figure pct00135
메틸 인다졸-3-카복실레이트
다음으로, 아세톤(22mL)에서 메틸 인다졸-3-카복실레이트 (2.05g, 11.4mmol), 2,4-디클로로벤질 클로라이드 (3.35mL, 12.54 mml), 및 K2CO3 (7.0g, 50mmol)의 혼합물을 70 oC에서 하룻밤 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 잔류물을 아세톤으로 세척하였다. 결합된 여과액을 진공 하(rotovapor)에서 농축하였다. 얻어진 고체를 CH2Cl2에 용해하고 임의의 용해되지 않은 고체를 제거하기 위해 여과하였다. 그런 다음 용액을 농축하고 헥산으로 희석하고 냉장고에 하룻밤 동안 두었다. 그런 다음 침전된 고체를 여과하고, 헥산/에틸 아세테이트의 혼합물(9:1)로 세척하여 흰색 고체인 순수한 생성물을 수득하였다. 수율 = 3.5g (89%); m.p. = 144o-146 oC; 1H NMR (400MHz, CDCl3) □8.31 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.39-7.47 (m, 4H), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.81 (s, 2H), 4.11 (s, 3H).
Figure pct00136
메틸 1-(2,4-디클로로벤질)인다졸-3-카복실레이트
실시예 2: 3-[1-(2,4- 디클로로벤질 )-6- 트리플루오르메틸 -1H- 인다졸 -3-일]-아크릴산( RC-MC-110)의 합성
단계 1: 2-(2-니트로-4- 트리플루오르메틸페닐 )-말론산 디메틸 에스터.
Figure pct00137
디메틸 말로네이트(59.7 g, 0.44 mol)를 건조 t-부탄올 (500 mL)에서 칼륨 tert-부톡사이드 (51 g, 0.44 mol)의 교반된 용액에 적하하여 첨가하였다. 최종 현탁액에 t-부탄올 (100 mL) 내 2-클로로-5-트리플루오르메틸니트로벤젠 (50 g, 0.22 mol)의 따뜻한 용액을 첨가하고 혼합물을 6시간 동안 환류하였다(반응은 TLC에 의해 측정됨). 반응의 완결 이후 t-부탄올의 대부분을 진공 하에서 증류한 다음 냉각수를 반응 혼합물에 첨가하였다. 묽은 염산을 이용하여 pH를 중성으로 조정하여 생성물의 침전을 초래하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 생성물을 여과하였다(68 g, 95%). 이 물질을 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 분석을 위해 소량을 결정화(EtOAc/헥산, 4:6)하여 노란색 결정성 물질을 얻었다, mp 65-67℃. 1H NMR (CDCl3) 8.30 (s, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.37 (s, 1 H), 3.80 (s, 6 H). MS (FAB) m/z: 322.1 (M+ + 1).
단계 2: (2-니트로-4- 트리플루오르메틸페닐 )-아세트산 메틸 에스터.
Figure pct00138
2-(2-니트로-4-트리플루오르메틸페닐)-말론산 디메틸 에스터 (68 g, 0.21 mol)를 디메틸 설폭사이드(200 mL)에 용해하였다. 염화나트륨(34 g, 0.58 mol) 및 물(60 mL)을 첨가하고 혼합물을 120℃에서 16-20시간 동안 교반하였다(반응은 TLC에 의해 측정됨). 그런 다음 반응 혼합물을 실온으로 식히고 물에서 냉각시켜 생성물의 침전을 일으켰다. 30분 동안 교반한 이후, 생성물(45 g, 80%)을 여과를 통해 분리하였다. 생성물을 추가적인 정제 없이 다음 단계 반응에서 사용하였다. 분석을 위해 소량을 결정화(EtOAc/헥산, 2:8)하여 노란색 결정성 물질을 얻었다, mp 104-105℃. 1H NMR (CDCl3) 8.3 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.12 (s, 2 H), 3.60 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 275.2 (M+ + 1).
단계 3: (2- 아세틸아미노 -4- 트리플루오르메 틸페닐 )-아세트산 메틸 에스터.
Figure pct00139
톨루엔(200 mL)에서 5% Pd-C (2.5 g, 50% wet) 및 아세트산무수물 (38 g, 0.37 mol)의 존재 하에서 (2-니트로-4-트리플루오르메틸페닐)-아세트산 메틸 에스터(25 g, 0.095 mol)의 수소화 및 아세틸화를 실온 및 대기압에서 약 4-5시간 동안 격렬한 교반 하에서 수행하였다(반응은 TLC에 의해 측정됨). 여과를 통해 촉매를 제거하고 톨루엔으로 2회 세척하였다. 결합된 유기물을 진공내에서(in vacuo) 증발시켜 생성물을 얻고(24.8 g, 95%) 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 소량을 헥산으로 결정화하여 노란색 고체인 생성물을 얻었다, mp 92-94℃. 1H NMR (CDCl3) 8.86 (s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.36 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.31 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 3.74 (s, 3 H), 3.68 (s, 2 H), 2.23 (s, 3 H).
단계 4: 6- 트리플루오르메틸 -1H-인다졸-3- 카복실산 메틸 에스터.
Figure pct00140
아세트산(50 mL) 내 (2-아세틸아미노-4-트리플루오르메틸페닐)-아세트산 메틸 에스터 (16 g, 0.058 mol)의 용액에 t-부틸 니트라이트 (90%) (7.35 g, 0.063 mol)를 90-95℃에서 20분 동안 적하하여 첨가하였다. 그런 다음 혼합물을 95℃에서 0.5시간 동안 교반하고 차가운 물에 붓고 1시간 동안 교반하였다. 여과를 통해 침전물을 수집하고 물로 세척하였다. 미정제 물질을 에틸 아세테이트에서 용해하고 소듐 설페이트 상에서 건조하였다. 용매를 진공 내에서 제거하였다. 이 물질(13.4 g, 95%)은 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. 소량을 에틸 아세테이트로부터 결정화하여 흰색 고체를 얻었다, mp 240-242℃. 1H NMR (DMSO-d-6) 8.25 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 8.04 (s, 1 H), 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 3.95 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 245.1 (M+ + 1).
단계 5: 1-(2,4- 디 클로로벤질 )-6- 트리플루오르메틸 -1H- 인다졸 -3- 카복실산 메틸 에스터.
Figure pct00141
6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터(2.75 g, 0.0112 mol)를 아세토니트릴(50 mL)에 용해하고, 포타슘 카보네이트(10 g, 0.07 mol), 2,4-디클로로벤질 클로라이드(2.42 g, 0.01239 mol) 및 테트라부틸암모늄 아이오다이드(촉매)를 첨가하였다. 반응 혼합물 환류시키기 위해 가열하고 2시간 동안 충분한 교반 하에서 환류시켰다. 반응의 진행은 TLC에 의해 측정되었다. 반응의 완결 이후 포타슘 카보네이트를 뜨거운 동안 여과한 다음 아세톤으로 세척하였다. N1 및 N2 벤질화된 생성물의 미정제 혼합물을 얻기 위해 결합된 용매를 감압하에서 증류하였다. 이성질체는 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리되었다(실리카겔, 용리액은 헥산으로 시작한 다음 8:2의 헥산, 에틸 아세테이트로 변화되었다).
1-(2,4- 디클로로벤질 )-6- 트리플루오르메틸 -1H- 인다졸 -3- 카복실산 메틸 에스터. 수율: 3.62 g (80%), 흰색 결정 mp 118-120℃. 1 H NMR (CDCl3) 8.39 (d, J = 8.4 Hz, 1 H) 7.74 (s, 1 H), 7.57 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.12 (dd, J = 8.4 and 2.1 Hz, 1 H), 6.78 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.82 (s, 2 H), 4.07 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 403 (M+ + 1).
2-(2,4- 디클로로벤질 )-6- 트리플루오르메틸 -2H- 인다졸 -3- 카복실산 메틸 에스터. 수율: 680 mg (15%), 흰색 결정 mp 132-134℃. 1 H NMR (DMSO-d-6) 8.27 (s, 1 H), 8.20 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.76 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.30 (dd, J = 8.3 and 1.8 Hz, 1 H), 6.78 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.17 (s, 2 H), 3.96 (s, 3 H).
단계 6: [1-(2,4- 디플루오르벤질 )-6- 트리플루오르메틸 - 1H - 인다졸 -3-일]-메탄올.
Figure pct00142
CH2Cl2 (50 mL)에 용해된 1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터(3.0 g, 0.0075 mol)를 -78℃로 식혔다. DIBAL-H (8.18 mL, 0.00818 mol)를 전반적인 아르곤 하에서 15분 동안 주사기를 통해 천천히 적하하여 첨가하였다. DIBAL-H의 첨가 완료 이후, 반응 혼합물을 -78℃에서 또 2시간 동안 교반하였다(반응은 TLC에 의해 측정됨). 반응물을 -78℃에서 메탄올로 조심스럽게 냉각하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 조심스럽게 물로 붓고 층들을 분리하였다. 유기층을 물로 세척하고 소듐 설페이트 상에서 건조하였다. 용매의 제거를 통해 미정제 알콜(crude alcohol)(2.6 g, 93%)을 수득하였으며, 다음 단계에서 정제 없이 사용하였다. 알콜은 흰색 고체이었다, mp 137-139℃. 1H NMR (CDCl3) 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 7.44 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.42 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.12 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 5.65 (s, 2 H), 5.09 (s, 2 H). MS (FAB) m/z: 375 (M+ + 1).
단계 7: 1-(2,4- 디클로로벤질 )-6- 트리플루오르메틸 -1H- 인다졸 -3- 카브알데히드.
Figure pct00143
[1-(2,4-디플루오르벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-메탄올(3.75 g, 0.01 mol)을 CH2Cl2(100 mL)에 용해하고 망간(IV)옥사이드(8.7 g, 0.1 mol)를 첨가하고 실온에서 2-3시간 동안 교반하였다(반응은 TLC에 의해 측정됨). 여과에 의해 고체를 제거하고 진공 내에서 CH2Cl2를 제거하여 미정제 알데히드를 수득하였다. 알데히드는 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. 알데히드(3.54 g, 95%)는 흰색 고체이었다, mp 97-98℃. 1H NMR (CDCl3) 10.25 (s, 1 H), 8.45 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.79 (s, 1 H), 7.60 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.20 (dd, J = 8.3 Hz and 2.0 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 5.79 (s, 2 H). MS (FAB) m/z: 373 (M+ + 1).
단계 8: 3-[1-(2,4- 디 클로로벤질 )-6- 트리플루오르메틸 -1H- 인다졸 -3-일]-아크릴산 에틸 에스터.
Figure pct00144
1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-카브알데히드(2.0 g, 0.00536 mol)를 CH2Cl2(50 mL)에 용해하고 위티그 시약(Wittig reagent)(카브에톡시메틸렌)트리페닐포스포란(1.06 g, 0.0536 mol)을 용액에 첨가하였다. 균질한 반응 혼합물을 환류하기 위해 오일 수조에서 12시간 동안 가열하였다. 반응 진행은 TLC에 의해 측정하였다. 반응 혼합물을 실온으로 식힌 후 물에서 냉각시키고 유기층을 분리함으로써 워크업 하였다. CH2Cl2를 제거하여 미정제 생성물을 얻고, 이를 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 백색 고체인 순수한 생성물을 수득(2.25 g, 95%)하였다, mp 186-188℃. 1H NMR (CDCl3) 8.08 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.99 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 7.74 (s, 1 H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.47 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.16 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1 H), 6.84 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.82 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 5.72 (s, 2 H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3 H). MS (FAB) m/z: 443 (M+ + 1).
아크릴산 에틸 에스터가 RT 및 1기압에서 메탄올, DCM의 존재하에서 5% Pd-C을 이용하여 수소화되어 프로피온산 에스터 유도체를 제공할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 이러한 조건 하에서의 처리는 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 에틸 에스터(JWS-2-70)를 수득한다.
단계 9: 1-(2,4- 디클로로벤질 )-3-[6- 트리플루오르메틸 -1H- 인다졸 -3-일]-아크릴산.
Figure pct00145
1-(2,4-디클로로벤질)-3-[6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 에틸 에스터 (2.0 g, 0.0045 mol)를 테트라히드로퓨란(50 mL) 및 메탄올 (25 mL)의 혼합물에 용해하였다. 리튬 히드록사이드 용액(7.5 mL 물에서 0.33 g, 0.013 mol 리튬 히드록사이드)을 실온에서 충분한 교반 하에 천천히 첨가하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 40℃로 가열하고 이 온도에서 2시간 동안 유지하였다. 중성 불순물을 제거하기 위해 반응 혼합물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 층들을 분리하고 수용층을 0℃로 식힌 다음 20% 황산으로 pH2로 산성화하였다. 흰색 고체가 침전되고 항량(constant weight)까지 이를 여과하고 건조하였다. 미정제 생성물을 에틸 아세테이트 및 헥산(1:1)로 재결정화하여 흰색 고체인 순수한 생성물(1.68 g, 90%)을 얻었다, mp 186-188℃. 1H NMR (DMSO-d-6) 8.39 (s, 1 H), 8.36 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.79 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 7.66 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.35 (dd, J = 8.3 and 1.6 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.76 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 5.89 (s, 2 H). Anal. calcd. for C18H11Cl2F3N2O2: C, 52.02; H, 2.65; N, 6.74. Found: C, 50.63; H, 2.63; N, 6.63. HRMS (FAB +) m/z calcd. for C18H11Cl2F3N2O2 415.01, found 415.0233. MS (FAB) m/z: 415 (M+ + 1).
RC-MC-110과 같은 본 발명의 아크릴산 유도체의 프로피오닉 유도체는 RT 및 1기압에서 메탄올, DCM의 존재하에서 5% Pd-C을 이용한 수소화에 의해 원하는 생성물을 제공할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 이러한 조건 하에서의 RC-MC-110의 처리는 3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산(JWS-2-72)을 나타낸다.
유사하게, 3-원 사이클로알킬 헤테로사이클릭 고리 시스템은 본 발명의 아크릴산 및 에스터 화합물로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 시스- 및 트랜스-3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-옥시란-2-카복실산을 포함하는 화합물은 RC-MC-110 또는 이의 시스 이성질체를 실온에서 6시간 동안 소듐 히드록사이드, 메탄올, 및 물의 존재 하에서 30% 수소 퍼옥사이드로 처리함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 시스- 및 트랜스-2-[1-(2,4-디클로로-벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-사이클로프로판카복실산을 포함하는 화합물은 RC-MC-110 및 이의 시스 유사체를 메틸렌 아이오다이드 및 아연-구리쌍과 무수 에틸 에터에서 48시간 동안 환류함으로써 제조된다.
실시예 3: 1-(2,4- 디클로로벤질 )-1H- 피라졸로[3,4-b]피리딘 -3- 카복실산 ( RC -MC-86)의 합성
단계 1: 1-(2- 클로로피리딘 -3-일)에탄올.
Figure pct00146
건조 THF (400 mL) 및 n-부틸리튬 (헥산 내 1.6 M, 63 mL, 0.1 mol)이 -70℃ 질소 하에서 1L 플라스크에 첨가되었다. THF(25 mL) 내 건조 디이소프로필아민(10.1 g, 0.1 mol)의 용액을 -70℃에서 혼합물에 적하하여 첨가하였다. 그런 다음 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 유지한 다음 -70℃로 식혔다. THF(25 mL) 내 2-클로로피리딘(11.3 g, 0.1 mol)의 용액을 -70℃에서 혼합물에 적하하여 첨가하고 혼합물을 이 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 그런 다음 건조 THF(50 mL) 내 아세트알데히드(4.85 g, 0.11 mol)의 용액을 적하하여 첨가하고 혼합물을 -70℃에서 3시간 동안 유지하였다. 진한 염산 몇 방울로 산성화된 THF (40 mL) 내 물(4 mL)의 용액을 -40℃에서 혼합물에 첨가한 다음 물(200 mL)을 -10℃에서 첨가하였다. 디에틸 에터(3x150 mL)로 추출하여, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하고 증발시켜 미정제 생성물을 얻었으며, 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 오일(10 g, 64%)을 수득하였다. *1H NMR (CDCl3) 8.15 (dd, J = 5 and 2 Hz, 1 H), 7.95 (dd, J = 8 and 2 Hz, 1 H), 7.20 (dd, J = 8 and 5 Hz, 1 H), 5.15 (d, J = 7 Hz, 1 H), 3.90 (s, 1 H), 1.45 (d, J = 7 Hz, 3 H).
* NMR 값은 Journal of Chemical Society Perkin Trans 1: Organic and bio-organic Chemistry, 1990, 9, 2409-2415에서 보고되었다.
단계 2: 1-(2- 클로로피리딘 -3-일) 에탄온.
Figure pct00147
건조 아세톤(200 mL) 내 1-(2-클로로피리딘-3-일)에탄온(10 g, 0.0635 mol)의 용액이 아르곤 하에서 1L 플라스크에 첨가되었다. 혼합물을 -30℃로 식히고, 순수한 분상 무수크롬산(19 g, 0.19 mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 2-프로판올(100 mL)을 첨가하고 뒤이어 수용성 소듐 수소 카보네이트를 pH 8까지 첨가하였다. 여과 이후, 고체를 클로로폼으로 세척하였다. 그런 다음 유기 및 수성 층들을 분리하고 수성층을 클로로폼(2x100mL)으로 추출하였다. 결합된 유기물들을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 증발시켜 오일로서 미정제(crude) 피리딜 케톤을 수득하였다. 이 생성물을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다(8 g, 81%). *1H NMR (CDCl3) 8.44 (dd, J = 5 and 2 Hz, 1 H) 7.91 (dd, J = 7.5 and 2 Hz, 1 H), 7.34 (dd, J = 7.5 and 5 Hz, 1 H), 2.68 (s, 3 H).
* NMR 값은 Journal of Chemical Society Perkin Trans 1: Organic and bio-organic Chemistry, 1990, 9, 2409-2415에서 보고되었다.
단계 3: 3- 메틸 -1H- 피라졸로[3,4b]피리딘 .
Figure pct00148
에탄올 (300 mL) 내 1-(2-클로로피리딘-3-일)에탄온(22 g, 0.1415 mol) 및 히드라진 하이드레이트 98%(113 g, 2.21 mol)의 용액을 12시간 동안 환류하였다. 회전 증발기를 이용하여 약 80%의 에탄올을 감압 하에서 증류하였다. 잔여물을 실온이 되게 하였다. 침전된 고체를 여과하고 물로 세척하였다. 생성물을 90℃에서 항량으로 건조하였다(16 g, 85%) mp 152-154℃. 1H NMR (CDCl3) 8.62 (dd, J = 4.5 and 1.4 Hz, 1 H), 8.08 (dd, J = 8.0 and 1.4 Hz, 1 H), 7.15 (dd J = 8.0 and 4.5 Hz, 1 H), 2.64 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 133 (M+ + 1).
단계 4: 1H- 피라졸로[3,4b]피리딘 -3- 카복실산 .
Figure pct00149
소듐 히드록사이드(35 g, 0.88 mol)를 물(800 mL)에 용해한 다음 3-메틸-1H-피라졸로[3,4b]피리딘(16 g, 0.12 mol)을 소듐 히드록사이드의 용액에 첨가하고 실온에서 10분간 교반하였다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하였다. 충분한 교반하에서 과망간산칼륨 용액(300 mL 물 내 KMnO4의 68.5 g, 0.433 mol)을 천천히 적하하여 2시간 동안 첨가하고 오일 수조의 온도를 100℃에서 유지하였다. 과망간산칼륨의 첨가를 완료한 이후, 반응 혼합물을 추가로 1시간 동안 가열하였다. 반응의 진행은 TLC에 의해 측정되었다. 반응 혼합물을 70-80℃로 식히고 이산화망간 부산물을 여과하였다. 이산화망간 케이크를 뜨거운 물로 세척하였다. 주된 여과액 및 씻은액은 결합되었으며 진한 황산을 이용하여 pH 2로 산성화하였다. 그런 다음 감압 하에서 회전 증발기를 이용하여 물을 증류하였다. 얻어진 노란색 고체는 원하는 1H-피라졸로[3,4b]피리딘-3-카복실산, 소듐 설페이트 및 포타슘 설페이트(95 g)의 혼합물이었다. 이 고체의 혼합물을 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 소량의 샘플은 분석 목적을 위해 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 흰색 결정을 얻었다 mp 175-176℃. 1H NMR (CDCl3) 8.28 (dd, J = 4.9 and 1.6 Hz, 1 H), 7.82 (dd, J = 7.5 and 1.6 Hz, 1 H), 7.39 (dd J = 7.5 and 4.9 Hz, 1 H). MS 9FAB) m/z: 147 (M+ + 1).
단계 5: 1H- 피라졸로[3,4b]피리딘 -3- 카복실산 메틸 에스터
Figure pct00150
상기 단계 4로부터의 고체들의 혼합물(95 g)을 메탄올(500 mL)에서 현탁하고 황산(5 mL)을 조심스럽게 첨가하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 환류시키기 위해 6-8시간 동안 가열하였으며, 반응은 TLC를 이용하여 측정하였다. 반응 완결 이후, 무기 고체들을 반응 혼합물로부터 여과하고 고체 케이크를 뜨거운 메탄올로 세척하였다. 주요 여과액 및 씻은액은 결합되었으며, 그 다음 메탄올을 회전 증발기에서 감압 하에 증류하였다. 최종 고체를 5% 소듐 바이카보네이트 용액(300 mL)에서 현탁하고 5분간 실온에서 교반하였다. 흰색 고체가 여과되었으며 90-95℃의 오븐에서 항량으로 건조하였다(3-메틸-1H-피라졸로[3,4b]피리딘을 기준으로 8.07 g, 42%), mp 201-203℃. 1H NMR: (CDCl3) 14.4 (brs, 1 H), 8.74 (dd, J = 4.6 and 1.5 Hz, 1 H), 8.64 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1 H), 7.39 (dd J = 8.1 and 4.6 Hz, 1 H), 4.10 (s, 3 H).
단계 6: 1-(2,4- 디클로로벤질 )-1H- 피라졸로[3,4b]피리딘 -3- 카복실산 메틸 에스터.
Figure pct00151
아세토니트릴(200 mL)에서 1H-피라졸로[3,4b]피리딘-3-카복실산 메틸 에스터(8 g, 0.0452 mol)를 현탁하고 용액을 균질화하기 위해 최종 현탁액을 가열하면서 10분 동안 교반하였다. 그런 다음 포타슘 카보네이트(31.2 g, 0.226 mol)를 단번에 첨가하고, 이후 테트라부틸암모늄 아이오다이드(0.08 g, 촉매) 및 2,4-디클로로벤질 클로라이드(10.6 g, 0.0543 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류시키기 위해 2시간 동안 충분한 교반 하에서 가열하였다. 반응 진행은 TLC에 의해 측정되었다. 반응 완결 이후 혼합물을 실온으로 냉각하고 포타슘 카보네이트를 여과하였다. 아세토니트릴을 감압 하에서 증류하여 벤질화된 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 용리액은 헥산으로 시작하여 이후 8:2 헥산/에틸 아세테이트)를 이용하여 여과하여 흰색 결정인 순수한 생성물을 수득하였다(11 g, 73%) mp 135-136℃. 1H NMR (CDCl3) 8.04 (dd, J = 4. 5 and 1.6 Hz, 1 H), 8.58 (dd, J = 8.1 and 1.6 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.36 (dd, J = 8.1 and 4.5 Hz, 1 H), 7.10 (dd, J = 8.3 and 2.0 Hz, 1 H), 6.72 (d, J = 8.3 Hz, 1 H ), 5. 92 (s, 2 H), 4.06 (s, 3 H). MS (FAB) m/z: 336 (M+ + 1).
단계 7: 1-(2,4- 디클로로벤질 )-1H- 피라졸로[3,4b]피리딘 -3- 카복실산 .
Figure pct00152
벤질화된 메틸 에스터(4 g, 0.012 mol)를 테트라히드로퓨란(60 mL) 및 메탄올(30 mL)의 혼합물에 용해하였다. 리튬 히드록사이드 용액(1 g, 0.040 mol, 15 mL 물 내 리튬 히드록사이드)을 실온에서 충분한 교반 하에 천천히 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 이후 반응을 완결하였다(TLC에 의해 측정). 중성 불순물을 제거하기 위해 반응 혼합물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 층들을 분리하고 수성층을 0℃로 식히고 20% 황산으로 pH 2로 산성화하였다. 침전된 흰색 고체들을 여과하고 항량으로 건조하였다. 미정제 생성물을 에틸 아세테이트 및 헥산(6:4)으로 재결정화하여 순수한 생성물을 얻었다(3.48 g, 95%), mp 233-235℃. HPLC 순도 99.98%. 1H NMR (CDCl3) 9.12 (dd, J = 4.5 and 1.5 Hz, 1 H), 9.00 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1 H), 8.06 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.90 (dd J = 8.1 and 4.5 Hz, 1 H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.41 (2 H, s). 13C NMR (DMSO/아세톤-d-6) d 169.9, 152.0, 150.7, 136.6, 134.7, 134.5, 134.3, 132.4, 132.2, 130.0, 128.6, 120.4, 116.1, 48.8. Anal. calcd. for C14H10ClNO2: C, 52.17; H, 2.79; N, 13.04. Found: C, 51.94; H, 2.51; N, 13.06. HRMS (FAB) m/z calcd. for C14H10ClNO2 322.0150, found 322.0159.
실시예 4: 돌연변이 유발성에 대한 에임스 테스트( Ames Test )
본 발명의 화합물에 대해 에임스 테스트를 수행하였다. 과정은 다음 단계들을 수반한다:
1. 세균 배양(살모넬라 티피무리움 TA 100 균주)
뮤타-크로모플레이트 키트(Muta-Chromoplate Kit) 버전 3.0(Environmental Bio-Detection Products, inc. (EBIP), 14 Abacus Road, Brampton, Ontario, Canada, L6T 5B7로부터 입수)로부터의 S. typhimurium TA 100 잔재의 동결건조 디스크를 13x100 mm 무균 배양 튜브에서 5.0 ml의 디프코 영양 브로스(Difco Nutrient Broth)(2g/L, pH 7.40) 또는 옥소이드 브로스(Oxoid broth) No. 2에 놓았다. 뚜껑을 약간 느슨하게 하여 물질을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 탁도를 다음날 평가하였다.
상기 초기 준비 이후, 세균을 DMSO(1.0 ml 세균 배양 당 0.09 ml의 DMSO)와 혼합하고 무균 원심분리 튜브에서 500μl 분취량으로 나누어 -80oC에 보관하였다. 분석을 위해서, 분석을 수행하기 전날 밤 하나의 튜브를 해동하고 5.0 ml의 옥소이드 브로스에 놓았다. 다음날 rfa 돌연변이에 관한 측정을 수행하였다.
2. Rfa 돌연변이 테스트
탑 아가(top agar)를 준비하기 전에 두 개의 영양 아가 플레이트(nutrient agar plates)를 37 oC 배양기에 30분에서 1시간 동안 두었다. 단계 3에서 배양액을 첨가하기 바로 전에 플레이트를 제거하였다.
한 병의 탑 아가를 녹이고 2 ml를 13 x 100 mm 무균 배양 튜브에 놓았다. 튜브를 45 oC의 히팅 블럭(heating block)에 놓았다. 약 0.1 ml의 세균 배양액을 2 ml의 아가에서 하룻밤 동안 자라게 하였다. 배양액을 첨가한 이후 가능한 빨리 튜브를 와류(vortexed)하고 물질을 영양 아가 플레이트 상에 부었다. 탑 아가가 단단해지도록 하기 위하여 플레이트를 수분 동안 평평한 표면에 놓았다.
약 10μl의 무균 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)(0.1g/100 ml)을 위트만 1 필터 종이로 만들어진 무균 ¼인치 둥근 디스크에 놓았다. 디스크를 탑 아가로 부드럽게 눌렀다. 플레이트를 축축한 37 oC 배양기에 놓았다. 디스크 주위 억제 부위에 대해 플레이트를 매 12시간 내지 16시간마다 검사하였다.
본 테스트의 경우, 12 mm의 억제 부위는 제 1 플레이트에서 관찰되었으며 rfa 돌연변이를 가리키는 제 2 플레이트에서의 12mm는 원래대로였다.
3. 히스티딘 요구량( Histidine Requirement )
본 테스트는 His 돌연변이가 여전히 작동한다는 것을 보증한다. 냉동된 분취량으로부터 하룻밤 동안 자란 브로스 배양액을 사용하여, 배양액의 소량 샘플을 백금 20μl 루프를 이용하여 히스티딘/비오틴 플레이트 상에 엷게 발랐다. 플레이트를 거꾸로 하여 37 oC 배양기에 하룻밤 동안 두었다.
동시에, 소량의 배양 브로스를 제거하고 무균 500μl 원심분리 튜브에 놓았다. 튜브를 피셔 마라톤(Fisher Marathon) 13K 마이크로원심분리기에서 10분 동안 3000 rpm으로 회전시켰다. 브로스를 제거하고 세균을 pH 7.40의 무균 10 mM Tris에 재-부유(re-suspended)시켰다. 세균을 비오틴 플레이트에 놓고 하룻밤 동안 배양하였다.
히스티딘/비오틴 플레이트는 줄무늬가 있는(streaked) 부위를 따라 성장을 보이는 반면 비오틴 단독 플레이트는 성장을 보이지 않는다. 히스티딘/비오틴 플레이트로부터의 콜로니들은 냉동되고 -80℃에서 저장되는 것들을 포함하는 새로운 배양액을 만들기 위한 마스터 플레이트로 사용될 수 있다.
4. 돌연변이 유발성 분석을 위한 세균 배양
13 x 100 mm 배양 튜브에서 약 600μl의 배양액을 7.0 ml의 영양 브로스(옥소이드 브로스 No. 2)에 놓았다. 튜브를 37o C에서 대략 12시간 동안 배양하였다. 13 x 100 mm 배양 튜브에서 약 600μl의 배양액을 또 다른 7.0 ml의 영양 브로스에 두고 37o C에서 대략 12시간 동안 배양하였다. 사용하기 바로 전에 무균 15 ml 원뿔(conical)에서 두 개의 튜브를 혼합하였다. 이는 접종 플레이트에 사용되는 테스트 배양액이며 배양액 농도를 결정하는데 사용되는 희석액을 만든다.
상기 열거된 과정들을 사용하여 His-돌연변이에 대해 튜브들을 재검사하였다.
5. 세균 배양 밀도 검사
배양액들은 최적의 결과를 위해 대략 2 x 108 세균/플레이트를 함유한다. 테스트를 하기 위한 최적의 수단은 650 nm에서 탁도계를 이용하는 것이다. 일련의 희석액을 만들고 돌연변이 유발성 분석 때 이들을 두겹으로 플레이팅함으로써 농도를 측정하였다.
6. 돌연변이 유발성 분석
0.5 mM 히스티딘/비오틴 용액의 약 10 ml을 100 ml의 탑 아가에 첨가하였다. 아가를 60-70oC의 수조(water bath)에서 녹였다. 최소의 글루코스 플레이트를 37oC 배양기에 분석을 시작하기 전 30-45 분간 놓았다.
테스트 화합물을 DMSO(피셔 D128-500)에 용해하고 1 내지 10 및 1 내지 100 희석액을 만들었다. 예를 들어:
화합물 화합물의 wt .(g) DMSO 의 ml
RC-MC-110 0.1001 1.0 ml
RC-MC-86 0.1001 1.0 ml
용액을 0.22 μM 나일론 주사기 필터(Fisher, 09-719C)로 살균하였다. 그런 다음, 약 80 ml의 상기 100 mg/ml 용액을 피펫으로 720 ul의 무균 DMSO에 넣어 10 mg/ml 용액을 얻었다.
양성 뮤타젠(mutagens)을 다음과 같이 제조하였다:
소듐 아지드(15 mg/ml). 약 3 mg (실제 wt.=0.0030g, FisherBiotech BP922-500)을 2 ml의 멸균수에 용해한 다음 상기 1500 μg/ml 용액의 1 ml를 9 ml의 멸균수에 넣음으로써 희석하였다. 약 150 μg/ml 용액의 약 1 ml를 9 ml의 멸균수에 넣어 최종 15 mg/ml 용액을 수득하였다. 이 용액을 10 ml 주사기에 넣고 0.20 μm 나일론 필터(Fisherbrand 09-719C)를 통과시킴으로써 살균하였다.
아미노 안트라센(25 mg/ml). 약 5 mg의 아미노 안트라센(실제 wt.= 0.0050g, 2-안트라민, Sigma A-1381)을 2 ml의 에탄올(Fisher A-405-20)에 용해시켜 2500 μg/ml 용액을 얻었다. 약 0.5 ml의 2500 μg/ml 용액을 4.5 ml의 에탄올에 넣어 250 μg/ml 용액을 얻었다. 약 0.5 ml의 250 μg/ml 용액을 4.5 ml의 에탄올에 넣어 25 μg/ml 용액을 얻었다. 이 용액을 10 ml 주사기에 넣고 0.20 μm 나일론 필터(Fisherbrand 09-719C)를 통과시킴으로써 살균하였다.
S9 용액들을 다음과 같이 제조하였다:
Figure pct00153
S9은 몰톡스(Sprague-Dawley, 페노바르비탈-5,6-벤조플라본)로부터 얻었다. 용액을 지시된 순서로 첨가하고 탑 아가 용액에 첨가되기 이전 분석 동안에도 얼음 상에서 유지하였다.
6개의 13 x 100 mm 배양 튜브를 사용하기 전에 45o C에서 몇 분간 히팅블럭에 놓았다. 0.5 mM의 히스티딘/비오틴 용액을 함유하는 약 2 ml의 녹은 탑 아가를 피펫으로 각 튜브에 옮겼다. 세균 브로스 배양액을 제거하고 배양기로부터의 각 튜브에 대한 최소 글루코스 플레이트 상에 위치시켰다. 그런 다음 0.1 ml의 약물, 완충액 또는 용매를 탑 아가에 첨가하였다.
그런 다음 약 0.1 ml의 세균 배양액을 첨가하였다. 이후, 적절한 S9 용액을 튜브에 첨가하고 즉시 와류시켰다. 탑 아가를 미리 데워진 최소 글루코스 플레이트 상에 위치시키고 균일한 분포를 얻기 위해 휘저었다.
각각의 테스트 화합물은 (+)S9 혼합 및 (-)S9 혼합 모두와 함께 다음 예외들을 포함하여 수행되었다: (1) 소듐 아지드- (-)S9 단독 (세균 돌연변이에 대한 양성 대조군; 및 (2) 아미노 안트라센- (+)S9 단독 (S9 활성에 대한 양성 대조군).
모든 플레이트들을 48시간 동안 37 oC에서.배양하였다. 플레이트를 제거하여 콜로니 수를 검사하였다.
다음 표 1은 본 발명의 화합물에 대한 에임스 테스트의 결과를 요약한다.

화합물 		(+) S9
10 mg / pl . 		(+) S9
1 mg / pl . 		(+) S9
0.1 mg / pl . 		(-) S9
10 mg / pl . 		(-) S9
1 mg / pl . 		(-) S9
0.1 mg / pl .
RC-MC-30 통과 통과 통과 통과 통과 통과
RC-MC-60* 통과 통과 통과 통과 통과 통과
RC-MC-65 실패 실패 통과 실패 실패 통과
RC-MC-86 통과 통과 통과 통과 통과 통과
RC-MC-100 통과 통과 통과 통과 통과 통과
RC-MC-101 통과 통과 통과 통과 통과 통과
TH-2-178 통과 통과 통과 통과 통과 통과
TH-2-179 통과 통과 통과 통과 통과 통과
RC-MC-110 통과 통과 통과 통과 통과 통과
DD-MC-1 통과 통과 통과 통과 통과 통과
DD-MC-II 통과 통과 통과 통과 통과 통과
AD-1-115-21 통과 통과 통과 통과 통과 통과
AD-1-117-19 통과 통과 통과 통과 통과 통과
AD-1-131-14 통과 통과 통과 통과 통과 통과
AG-2-51* 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-110 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-112* 통과 통과 통과 실패 실패 통과
JWS-1-114 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-130 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-132 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-140 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-142 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-144 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-146* 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-158 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-160 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-162 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-170 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-190 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-228 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-230 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-232 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-254 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-258 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-260 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-268 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-270 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-274 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-276 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-280 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-282 실패 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-284 실패 실패 통과 실패 실패 통과
JWS-1-294 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-1-298 실패 실패 통과 실패 실패 통과
JWS-1-300 실패 실패 통과 실패 실패 통과
JWS-1-302 실패 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-2-1 통과 통과 통과 실패 경계 통과
JWS-2-10 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-2-12 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-2-14 실패 통과 통과 실패 실패 통과
JWS-2-18 실패 실패 통과 경계 통과 통과
JWS-2-20 실패 실패 통과 실패 실패 경계
JWS-2-22 통과 통과 통과 통과 통과 통과
JWS-2-36 통과 통과 통과 통과 실패 통과
JWS-2-40 통과 통과 통과 경계 통과 통과
RC-MC-156 통과 통과 통과 통과 통과 통과
RC-MC-158 통과 통과 경계 통과 통과 통과
RC-MC-200 실패 실패 통과 통과 통과 통과
RC-MC-205 실패 실패 통과 경계 실패 통과
TH-2-192 통과 통과 통과 통과 통과 통과
*표시된 화합물은 1 또는 그 이상의 높은 투여량에서 살균 활성을 나타내었다.
표 1에서, "통과"는 콜로니수에 있어서 대조군보다 현저하게 높지 않은 화합물을 가리킨다(p <0.05).
7. 컬러메트릭 에임스 테스트( Colormetric Ames Test ) 과정
다음 과정들을 무균적으로 수행하였다. 첫째, 분석 전날, 하루 중에서 가능한 한 늦게, "G" 영양 브로스로 표지된 바이알을 S. 티피무리움 TA100(동결건조됨)으로 표지된 바이알로 분배하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 37 ℃에서 16-18시간 동안 배양하였다.
적절한 바이알에서, 테스트 화합물의 약 50 mg을 계량하였다. 약 1 mL의 DMSO를 첨가하고 혼합물을 25mm 주사기 필터를 이용하여 살균 튜브로 필터 살균하였다. DMSO의 농도를 측정하였다.
무균 50 mL 튜브에, 약 15 mL의 무균 데이비스 밍기올리 염(Davis & Mingioli, Aromatic biosynthesis, VII. Accumulation of two derivatives of shikimic acid by bacterial mutants, J. Bacteriol. 1953. Aug;66(2): 129-36 참조)을 피펫으로 옮겼다. 이 염 용액(Muta 성분 "A")은 (1) Milli-Q, 600mL; (2) 디포타슘 포스페이트, 무수물, 38.5g; (3) 모노포타슘 포스페이트, 무수물 11.0g; (4) 암모늄 설페이트, 5.5g; (5) 트리이소디움 시트레이트, 1.375g; 및 (6) 마그네슘 설페이트, 0.55g으로 이루어졌다. 적절한 양의 Milli-Q 물을 첨가하여 전체 부피가 1L가 되도록 하였다. 각 성분을 한번에 하나씩 상기 순서대로 용해하였다. 약 7.3의 pH에서 용액을 0.22μm 필터로 여과하여 침전물을 제거하였다.
염 용액에 DMSO로 희석된 화합물의 소량들을, 500μl의 DMSO를 넘지 않도록 첨가하였다. 예를 들어, DMSO로 희석된 화합물의 약 100μl 분취량들을 여전히 용액 상태인 화합물에 의해 최고 농도에 다다를 때까지 첨가하였다. 화합물이 용액으로부터 빠져나오고 무균 DMSO의 첨가 및/또는 20분 내지 1시간 동안의 음파분쇄(sonication)를 이용하여 용액으로 돌아가지 않는 경우에, 소량의 DMSO 희석된 화합물로 반복될 필요가 있다는 것이 발견되었다. 전체 용액에서 DMSO 희석된 화합물의 부피를 측정하였다. 최고 농도의 화합물이 측정되었을 때, 적절한 부피의 무균 데이비스 밍기올리 염을 첨가하여 용액의 전체 부피가 17.5 mL가 되도록 하였다. 그런 다음 테스트 용액에서 화합물 및 DMSO의 농도를 측정하였다.
그런 다음 성분들을 반응 혼합물(Reaction Mixture)로 표지된 50mL 무균 튜브에서 다음과 같이 혼합하였다: 21.62mL의 A + 4.75ml의 B (D-글루코스, 40% w/v) + 2.38mL의 C (브로모크레졸 자주색, 5 mg/ml) + 1.19ml의 D (D-비오틴, 0.1 mg/ml) + 0.060ml (60μl)의 E (L-히스티딘, 0.1 mg/ml). 바이알을 와류시킨 다음 한쪽에 두었다.
S9 효소를 2.1mL의 멸균수에 섞어서 S9 혼합물을 제조하였다. 이를 "S9F"로 표지하였다. S9 혼합물로 표지된 50mL 튜브에서, 다음을 함께 혼합하였다(모두 EBIP로부터 입수 가능): 0.4mL의 S9A (MgCl2 , 0.4 M 및 KCl, 1.65 M) + 0.09mL의 S9B (글루코스-6-포스페이트, 1.0 M) + 0.81mL의 S9C (니코틴 아미드 디-뉴클레오티드 포스페이트, 0.1 M) + 9.98mL의 S9D (포스페이트 완충액, pH 7.4) + 6.72mL의 S9E (무균 증류수) + 2mL의 S9F (Rate 간 추출물). 바이알을 와류시킨 다음 한쪽에 두었다.
무균 튜브들을 다음과 같이 표지하였다: 블랭크, 백그라운드 I, 백그라운드 II, 표준 뮤타젠, 화합물 1 (-), 화합물 1 (S9+), 화합물 2 (-), 화합물 2 (S9+), 화합물 3 (-), 화합물 3 (S9+). 다음으로, 약 2.5mL의 반응 혼합물을 각 튜브에 첨가하였다. 그런 다음, 약 2mL의 S9 혼합을 백그라운드 II 및 S9+ 화합물에 첨가하였다. 다음, 화합물 바이알 각각에 약 8 mL의 제조된 화합물을 첨가하였다. 최종 용액에서의 화합물의 농도를 측정하였다. 그런 다음, 약 100μl의 표준 뮤타젠을 표준 뮤타젠 바이알에 첨가하였다. (비 S9 활성을 위한 NaN3 및 S9 활성을 가진 2-아미노안트라센). 다음으로 17.5mL의 최종 부피를 위해 적절한 부피의 멸균수를 첨가하였다. 그런 다음, 약 5μl의 세균을 블랭크를 제외한 각 튜브에 첨가하였다. 각 바이알을 와류시키고 무균 다중-채널 피펫 보트에 붓고, 다중-채널 피페터로 96 웰 플레이트에 웰 당 200μl를 부었다. 플레이트를 표지하고, 덮은 후 지퍼락 백(zip lock bag)에 넣어 37℃에서 5일 동안 배양하였다.
배양 5일째에, 플레이트를 배양기로부터 제거하고 층류 후드(laminar flow hood)에 놓았다. 블랭크를 먼저 분석하였다. 노란색인 어떤 웰이 있는 경우, 테스트는 오염된 것으로 여겨졌으며 결과를 무효로 하였다. 그런 다음, 플레이트를 다음 방식으로 시각적으로 기록하였다: (1) 전부 노란색, 부분적으로 노란색 또는 불맑은 웰들은 양성으로 기록하였다 또는 (2) 전부 자주색인 웰은 음성으로 기록하였다 (음성 대조군 플레이트와 비교하여). 각 플레이트에 대한 양성 웰들의 수를 기록하였다. 백그라운드 플레이트는 분석 유기체의 자연발생적인 또는 백그라운드 돌연변이의 수준을 보여주었다. 각 처리 플레이트의 결과들을 백그라운드 돌연변이에 대비하여 기록하였다. 각 처리-플레이트의 경우, 키트를 구비한 표 4.1을 이용한 차이의 통계적 유의성을 판단하였다. 본 발명에 참조로 포함되는 Gilbert, R.I., The Anslysis of Flucutation Tests , Mutation Research, at 283-289 (1980) 참조. 처리 플레이트가 모두 자주색 웰을 포함하는 경우, 테스터 균주에 대한 샘플의 급성 독성이 결과로 나타날 수 있다.
상기 언급한 에임스 테스트 프로토콜에 관해 본 발명에 참조로서 포함되는 다른 문헌들은 다음과 같다: Ames, B., F. Lee, and W. Durston. 1973. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 782-786; McCann, J., N. Spingarn, J. Kobori, and B. Ames. 1975a. Detection of carcinogens as mutagens: Bacterial tester strains with R Factor plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 979-983; McCann, J., E. Choi, E. Yamasaki, and B. Ames. 1975b. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella / microsome test : Assay of 300 chemicals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 5135-5139; and Mortelmans K, and E. Zeiger. 2000. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat Res. 455: 29-60.
분석의 결과는 다음과 같다:
Figure pct00154
실시예 5: 롱 에반스 쥐(Long Evans rats)에서 인비보 반정자형성 테스트( Antispermatogenic Testing )
생후 55일된 수컷 롱 에반스 쥐를 주문하고 접종 전 5일간 격리하였다. 물과 음식을 임의대로 주었다. 테스트 전날 모든 동물들의 무게를 측정하였다.
쥐들이 생후 60일이 될 때, 테스트 화합물을 냉장고에서 꺼내고 물질 480 mg을 측정하였다. 그런 다음 물질을 6.00 ml의 디메틸 설폭사이드("DMSO")(Fisher, Certified ACS, D128-500)에 용해하여 80 mg/ml의 용액을 얻었다. 이 용액을 200 mg/kg 범위에서 쥐에 주사하는데 사용하였다.
로니다민의 경우, 물질을 용해하고 부유시키기 위해 1% 진한 HCl을 첨가하고 대략 15분 동안 음파분쇄하는 것이 필요하다. 얼음을 음파분쇄기에 놓아 이 시간 동안의 과열을 방지하였다.
그런 다음 약 1.00 ml의 80 mg/ml 용액을 7 ml의 DMSO에 첨가하여 10 mg/ml의 최종 농도를 얻었다. 이 용액을 25 mg/kg 범위에서 쥐에 주사하는데 사용하였다.
80 mg/kg 및 10 mg/kg 용액 모두를 호일로 포장하여 사용 바로 전까지 보관하였다. 대조군의 경우, 동물들에게 DMSO를 단독으로(또는 로니다민의 경우 DMSO + 1% HCl) 주사하였다. 그런 다음 주사 직전에 쥐들의 무게를 측정하였다. 무게들을 킬로그램으로 변환하고, 처리 농도로 곱한 다음 그 그룹에 대한 용액의 농도로 나누었다. 예로써, 200 mg/kg 처리 그룹에서 250g은 다음과 같이 계산될 것이다:
(a) (0.250 kg)(200 mg/kg)/(80 mg/ml) = 0.625 또는 0.63 ml
(b) 대조군에 대한 주사는 그들이 처리 그룹들 중 하나에 있는 경우 그들이 투여받을 양을 계산함으로써 동일한 방식으로 이루어졌다. 즉, 250 g의 대조군 쥐는 또한 0.63 ml을 투여받을 것이다.
(c) 그런 다음 각 쥐에 대해 계산된 용액의 양은 21 게이지 바늘로 캡핑된 무균 1cc 투베르쿨린 주사기에 넣어지며 동물의 좌하복부의 위쪽 부분으로 복강내(i.p.) 주입된다. 바늘이 혈관 또는 기관에 있지 않도록 확실히 위하여 주사기는 주사 전에 뒤로 당겨진다.
동물을 케이지로 다시 들여보내고 이후 몇 시간 동안 면밀하게 관찰하고 이후 적어도 하루에 한 번씩 검사한다. 주사 이후 두 번째 날에 모든 살아있는 동물의 무게를 다시 측정하였다. 주사 이후 5일, 마지막으로 동물들의 무게를 다시 측정한 다음 이산화탄소 질식으로 안락사시켰다. 질식 바로 이후 동물을 정중시상 복부절개(mid-sagittal abdominal incision)로 개방하고 왼쪽과 오른쪽 정소를 모두 제거하였다. 임의의 관련없는 조직들을 정소에서 제거하고 무게를 측정하였다.
무게 측정 이후, 11번 메스날(scalpel blade)을 이용하여 백색막(tunica albuginea)에 약 7-10개 구멍들(puncture holes)을 위치시키고 그런 다음 정소들을6 ml의 보울린 정착액에 4℃에서 적어도 48시간 동안 둔다. 보울린 정착액은 다음을 함께 혼합함으로써 제조된다: 125 ml의 포화된 피크르산(Sigma), 25 ml의 빙초산(Fisher, A38-500), 375 ml의 37% 포름알데히드(Fisher F79-500). 선택적으로, 정소는 10% 포르말린에서 고정된다.
각 그룹에서 동물 중 적어도 두 마리에서, 췌장, 오른쪽 신장 및 간의 일부, 심장, 비장, 및 폐를 제고하고, 독성 효과를 평가하였다. 아래 실시예 6 참조.
48시간 이후, 정소를 제거하고 중간-관상 부위에서 반으로 자른 다음 보울린 정착액에 추가적인 48시간 동안 두었다. 포르말린에 고정된 정소에 대하여 10% 포르말린으로 유사한 과정을 수행하였다. 두 번째 48시간 이후, 조직들을 제거하여 임베디드 카세트(embedding cassettes)에 둔 다음 정착액의 일부를 제거하기 위하여 70% 에탄올로 두 번 세척하였다. 그런 다음 조직들을 다음 프로토콜을 이용하여 파라핀에 끼워 넣었다. (a) 70 % 에탄올, 1 시간, (b) 80 % 에탄올, 1 시간, (c) 95 % 에탄올, 40 분, (d) 95 % 에탄올, 40 분, (e) 95 % 에탄올, 40 분, (f) 100% 에탄올, 40 분, (g) 100% 에탄올, 40 분, (h) 100% 에탄올, 40 분, (i) 자일렌 subst., 1 시간, (j) 자일렌 subst., 1 시간, (k) 파라핀, 1.5 시간, (l) 파라핀, 1.5 시간. 그런 다음 5 um에서 단면들을 자르고 H&E로 염색하였다.
도면 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 2a, 2b (RC-MC-30), 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 4a, 4b (RC-MC-86), 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 6g (RC-MC-110)는 본 발명에 따른 화합물의 일부에 대한 체중의 변화, 왼쪽 및/또는 오른쪽 정소 무게, 스테이징, 관상 발달(tubular development), 및 조직학적인 정소 효과를 나타낸다. 이들 결과들은 본 발명의 화합물을 사용하여 대상의 체중에 불리한 영향을 끼치지 않고 정자형성이 억제되는 것을 나타낸다. J.M. Whitsett et al., Effect of Transitional Photoperiods on Testicular Development and Puberty in Male Deer Mice, J. Reprod . Fertil. 72 (2):277-286 (1984) 참조.
본 발명의 화합물에 대한 투여 반응이 다음 표 2에 나타나있다:
화합물 반응
25 mg / kg 		사망률 반응
200 mg / kg 		사망률 스테이징
25 mg / kg 		스테이징
200 mg / kg
로니다민 2/5 0/5 5/5 0/5 4.7 1.8
AF2785 1/5 0/5 3/4 2/6 5.5 3.4
AF2364 3/5 0/5 5/5 0/5 3.5 2.1
RC-MC-30 3/5 0/5 4/5 0/5 4.1 3.1
RC-MC-60 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
RC-MC-86 0/5 0/5 5/5 0/5 5.9 2.4
RC-MC-101 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
RC-MC-100 0/5 0/5 0/5 0/5 5.9 5.9~
TH-2-192 0/5 0/5 0/4 4/5 5.9 5.8
RC-MC-110 5/5 0/5 2/2 3/5 NA NA
DD-MC-1 0/5 0/5 2/5 0/5 NA NA
JWS-1-254 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-270 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-274 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-276 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-280 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-2-12 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
DD-MC-I 0/5 0/5 2/5 0/5 5.9 4.5
JWS-1-110 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-114 1/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-130 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-142 0/5 0/5 0/5 0/5 NA NA
JWS-1-144 0/5 0/5 불용성으로 인해 테스트되지 않음 N/A NA NA
JWS-1-146 0/5 0/5 불용성으로 인해 테스트되지 않음 N/A NA NA
JWS-1-158 4/5 0/5 5/5 0/5 NA NA
JWS-1-160 3/5 0/5 3/3 2/5 NA NA
JWS-1-170 3/5 0/5 3/3 0/5 3.7 2.8
JWS-1-190 5/5 0/5 0/0 5/5 NA
RC-MC-156 2/5 0/5 4/5 0/5 NA
RC-MC-158 2/5 0/5 5/5 0/5 NA
TH-2-178
리메이크
TH-2-193		 0/5 0/5 4/5 0/5 5.4 2.9
TH-2-179
리메이크
TH-2-194		 2/5 0/5 5/5 0/5 4.7 2.0
JWS-1-190 4/5 0/5 2/5 0/5 5/5 0/5
투여 반응의 경우, 분수는 다섯 마리 중에 반응한 동물 및 다섯 마리 중에 살아남은 동물의 수를 나타낸다. 사망률(mortality)의 경우, 분수는 주사된 다섯 마리 중에 죽은 동물의 수를 나타낸다.
실시예 6
본 발명의 화합물의 일부를 IP 및/또는 경구 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 희생시킬 때, 간, 췌장, 심장, 폐, 비장 및 신장 샘플들을 제거하여 눈으로 조사하고 최소 48시간 동안 보울린 용액에 담궈 고정시켰다. 그런 다음 모든 기관을 절단하고 괴사, 염증, 출혈, 및 잠재 종양의 흔적에 대해 조사하였다. 또한 각 조직에서 주요 정맥을 확장에 관하여, 특히 간 및 췌장에서 조사하고, 임의의 다른 이상들을 알려진 병리조직학적 상태들과 비교하였다. 상기 이외에, 심장은 근육벽에서 섬유증의 흔적에 대해 조사되었고 심실벽의 두께와 비교하였다. 췌장은 주로 칼슘 축적에 대해 조사된 반면 폐는 임의의 삼출 또는 출혈 징후에 대해, 특히 폐포 공간들(alveolar spaces)에서 검사되었다. 마지막으로, 신장은 피질의 사구체에서 주로 미세 출혈, 세뇨관 괴사 또는 변형에 대해 조사되었다.
실시예 6A: RC - MC -30 대 로니다민의 독성학 비교
본 실시예에서, 성적으로 성숙한 쥐에서 RC-MC-30의 효과를 로니다민의 것과 비교하였다. 상기에서 논의된 바와 같이 쥐들(총 8 마리)의 각각은 단일 주사를 투여받고 주사 5일 이후 희생시켜 조사하였다. 다음 표들(표 3a-3b)은 발견들을 예시한다.
Figure pct00155
Figure pct00156
실시예 6B: RC - MC -110에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, RC-MC-110의 독성학 결과를 조사하여 대조군과 비교하였다. RC-MC-110을 투여받은 2마리의 대조군 및 4마리의 동물들을 조사하였다.
두 대조군(동물 261 및 262)에서, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사 또는 출혈의 어떠한 징후도 분명하지 않았다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
또한 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 동물들을 조사하였다. 25 mg/kg (동물 266 및 267) 및 200 mg/kg (동물 271 및 274)을 투여받은 두 동물들에서 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
별개의 실험에서, 다섯 마리의 동물들이 200 mg/kg의 RC-MC-100을 투여받았다. IP 주사 대략 10분 후, 다섯 마리 동물 모두가 무기력해졌으며 움직임을 멈추었다. 주사 이후 15 내지 20분에서, 이 그룹의 모든 동물들이 양 뒷다리에서 약한 떨림을 시작하였으며 대략 30분 동안 지속되었다. 또한 동물들 중 두 마리는 젖은 나음(rales)을 가지며 이들의 숨소리는 이들 케이지의 5 피트 내에서 들을 수 있었다. 동물들 중 세 마리는 2-3시간 이후 죽은 반면 다른 두 마리는 회복하여 어떠한 다른 증상도 나타내지 않았다.
후속 실험에서, 6 mg/kg 및 12 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 동물들의 독성학을 조사하였다. 동물 286 (6 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 분리되고 흩어진 작은 괴사 조각들을 가졌다. 동물 287 (6 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 아급성 간 괴사(subacute hepatic necrosis)에서 종종 발견되는 것과 유사한 분리되고 흩어진 작은 괴사 조각들을 가졌다.
동물 291 (12 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 아급성 간 괴사(subacute hepatic necrosis)에서 종종 발견되는 것과 유사한 분리되고 흩어진 작은 괴사 조각들을 가졌다. 동물 292 (12 mg/kg)의 경우, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 아급성 간 괴사에서 종종 발견되는 것과 유사한 군데군데 있는 작은 괴사 부위를 포함한다. 또한 폐는 호흡 기관 및 종말세기관지 주위에 다중의, 작은 출혈 부위를 가진다.
실시예 6C: 로니다민과 비교한 RC - MC -110에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 다양한 양의 RC-MC-110 및 25 mg/kg의 로니다민을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 옥수수 오일 단독이었다.
옥수수 오일을 사용한 두 대조군(동물 326 및 327) 및 25 mg/kg의 로니다민을 투여받은 것들(동물 356 및 357)에서, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
RC-MC-110의 경구 6 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 4개의 투여 수준의 각각 중 두 동물(동물 331 및 332)에서, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 1.5 mg/kg의 RC-MC-110을 투여받은 한 마리 동물(동물 341)에서, 간이 작은 수의 무작위로 흩어진 작은 괴사 부분들을 나타내었지만 다른 것들은 정상이었다. 1.5 mg/kg을 투여받은 다른 동물은 정상으로 나타났다.
실시예 6D: JWS -1-110에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JWS-1-110을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 306 (25 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 비장은 종종 문맥압 항진증(portal hypertension)의 초기 지표인 확장된 정맥 및 백색 비수(white pulp)에 괴사를 가졌다. 동물 307 (25 mg/kg)의 췌장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 주위에 있는 간 괴사의 작은 부분들을 가진 확장된 문맥을 가졌다. 폐는 호흡 기관 및 종말세기관지 주위에 다중의, 작은 흩어진 출혈 부위들을 포함한다. 또한, 비장은 확장된 정맥 및 감소된 양의 괴사 세포를 포함하는 백색 비수를 가진다.
동물 311 (200 mg/kg)의 경우, 신장, 심장 및 췌장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났으며 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 확장된 흩어진 작은 괴사 부분들을 가지는 문맥을 나타내었다. 폐는 폐포, 및 말단 및 호흡세기관지 도처에 다중 출혈 부위들을 포함한다. 이들 출혈 부분들의 일부는 인접한 구획들 사이에 확장을 일으킨다. 마지막으로, 비장은 확장된 정맥, 및 괴사 세포를 가지는 감소된 백색 비수를 나타낸다. 동물 312 (200 mg/kg)의 경우, 신장, 심장 및 폐는 모두 정상 범위인 것으로 나타났으며 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 없었다. 심장은 쪼개져서 심실 확장이 존재하는지 측정하기가 불가능하였지만 심실벽의 어떤 비대가 있는 것으로 보이지 않았다. 간은 흩어진 작은 괴사 부분들을 도처에 가진 확장된 정맥을 가졌다. 췌장은 확장된 정맥을 가졌으나 다른 눈에 띌만한 이상은 없었다. 마지막으로, 비장은 확장된 정맥 및 괴사 세포를 가진 감소된 백색 비수를 나타내었다.
실시예 6E: JWS -1-114에 대한 독성 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JWS-1-114를 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 316 및 317 (25 mg/kg)은 정상 범위인 것으로 보이는 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장을 가졌다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
동물 321 (200 mg/kg)은 정상 범위인 것으로 보이는 췌장, 심장 및 신장을 가졌다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 세기관지 주위에 큰 폐출혈을 가졌으며 폐포 집단들 사이에서 울혈되고 확장된 부위를 가졌다. 간은 대체로 문맥주위 지역에서 중간 크기(5-10 세포 직경)의 괴사 부분들을 가졌지만, 정맥 확장의 흔적은 없었다. 이 동물에 대한 비장 샘플은 없었다. 동물 322 (200 mg/kg)는 정상 범위인 것으로 보이는 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장을 나타냈다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
실시예 6F: JWS -1-130에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JWS-1-130을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 옥수수 오일 단독이었다. 동물 366 (25 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 비록 심장이 심실로부터의 단면 절단으로 인한 일부 인위적인 상처를 가졌지만 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 흔적도 나타내지 않았다. 간은 확장된 정맥을 도처에 가진 것으로 보였으나, 다른 이상은 눈에 띄지 않았다. 동물 367 (25 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 징후를 가지지 않았다. 간은 확장된 정맥을 도처에 가졌으며, 대게 문맥주위 지역 주변에 위치한 작은 흩어진 괴사 부분들을 가졌다.
동물 371 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다. 동물 372의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다. 간은 확장된 정맥을 도처에 가졌으며, 대게 문맥주위 지역 주변에 위치한 작은 흩어진 괴사 부분들을 가졌다.
실시예 6G: JWS -1-142에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JWS-1-142를 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 옥수수 오일 단독이었다. 동물 376 및 377 (25 mg/kg) 모두의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다.
동물 381 (200 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다. 간은 유조직에 작고 한정된 림프구 집단을 포함하였다. 동물 382 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다.
실시예 6H: JWS -1-146에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg의 JWS-1-146을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 옥수수 오일 단독이었다. 동물 396 및 397 (25 mg/kg)은 정상 범위인 것으로 보이는 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장을 가졌다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다.
실시예 6I: JWS -1-144에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg의 JWS-1-144를 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 441 및 442 (25 mg/kg)는 정상 범위인 것으로 보이는 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장을 가졌다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다.
실시예 6J: JWS -1-170에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JWS-1-170을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 456 및 457 (25 mg/kg)은 정상 범위인 것으로 보이는 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장을 가졌다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다.
동물 462 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다. 동물 463 (200 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 간은 주로 문맥주위 지역에서 중간 크기(5-10 세포 직경)의 괴사 부분들을 가졌다.
실시예 6K: JWS -1-190에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg의 JWS-1-190을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 466의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대를 나타내는 어떠한 징후도 가지지 않았다. 폐는 폐포 집단들에서 다중의 흩어진 출혈 부분들을 가졌으며, 폐포의 다수가 에오신으로 살짝 염색하여 나타나는 맑은 삼출물로 채워져 있었다. 동물 467의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
실시예 6L: RC - MC -156에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-156을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 476 (25 mg/kg)의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 주로 폐포 및 종말세기관지 주위에서 흩어진 작은 출혈 부위들을 포함하였다. 동물 477 (25 mg/kg)의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 폐포 및 말단세기관지 도처에 넓게 퍼진 출혈 부위들을 나타냈으며 매우 적은 보다 작은 세기관지 주위에 작은 헤모시데린 축적을 나타내었다.
동물 481 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대의 징후를 나타내지 않았다. 동물 482 (200 mg/kg)의 경우, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 주로 폐포 및 작은 세기관지 주위에 작고 흩어진 출혈 부위들을 가졌다. 간은 아급성 괴사에서 일반적으로 발견되는 것과 유사한 유조직 도처에 흩어진 작은(4-5 세포 직경) 괴사 부위를 가졌다.
실시예 6M: RC - MC -158에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 RC-MC-158을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 동물 486 (25 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 징후는 없었다. 심장은 심실벽에서 확장 또는 비대의 징후를 나타내지 않았다. 동물 487 (25 mg/kg)의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 폐는 주로 폐포 및 말단세기관지 주위에 작고 흩어진 출혈 부위를 가졌다.
동물 491 (200 mg/kg)의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실벽에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 주로 폐포 부위에 여러 큰 출혈 부위와 일부 헤모시데린 축적을 가졌다. 동물 492의 경우, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 확장 또는 비대의 징후를 나타내지 않았다. 폐는 주로 폐포에서 여러 큰 출혈 부위를 포함하였다. 간은 일반적으로 문맥 주위에 작고 흩어진 괴사 부위를 포함하였다.
실시예 6N: JSW -1-158에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JSW-1-158을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 모든 대조군은 문맥주위 부위들 사이에 중간 크기의 괴사 지역을 가졌으며 여러 부위에서 세포질이 씻겨진 것으로 보였다. 동물 406 (25 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 동물 407의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 두꺼워진 폐포 및 세기관지 벽을 가졌으며 여러 인접한 폐포를 덮는 중간 크기 출혈의 흩어진 부분들을 가졌다.
동물 411 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 췌장은 주변부로부터 선방 세포들(acinar cells) 사이 안쪽으로 확장하는 림프구 침투 부위들을 가졌다. 동물 412 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
실시예 6O: JSW -1-160에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JSW-1-160을 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 모든 대조군은 문맥주위 부위들 사이에 중간 크기의 괴사 지역을 가졌으며 여러 부위에서 세포질이 씻겨진 것으로 보였다. 동물 416 (25 mg/kg)의 경우, 폐, 췌장, 비장 및 심장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 신장은 주변부보다 수질-피층 경계에 더 가까운 내부 피질에서 흩어진 작은 관상 괴사 부분들을 가졌다. 간은 여러 확장된 정맥을 가졌으나 다른 이상은 눈에 띄지 않았다. 동물 417 (25 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
동물 421 (200 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장 및 심장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 신장은 내부 피질에서 흩어진 작은 관상 괴사 부분들을 가졌다. 동물 422의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
실시예 6P: JSW -1-162에 대한 독성학 결과
본 실시예에서, 25 mg/kg 및 200 mg/kg의 JSW-1-162를 투여받은 동물의 독성학을 조사하였다. 대조군은 DMSO 단독이었다. 모든 대조군은 문맥주위 부위들 사이에 중간 크기의 괴사 지역을 가졌으며 여러 부위에서 세포질이 씻겨진 것으로 보였다. 동물 426 및 427 (25 mg/kg)의 경우, 간, 폐, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다.
동물 431 (200 mg/kg)의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 여러 작은 세기관지를 둘러싸는 흩어진 출혈 부분들과 일반적으로 바로 근처에 두꺼워진 폐포벽을 가졌다. 동물 432 (200 mg/kg)의 경우, 간, 췌장, 비장, 심장 및 신장은 모두 정상 범위인 것으로 나타났다. 조직의 어디에서도 괴사, 종양 또는 출혈의 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 심장은 심실에서 어떠한 확장 또는 비대의 징후도 나타내지 않았다. 폐는 두꺼워진 폐포벽을 나타내는 중간 크기 영역들과 폐포를 채우는 에오신에 의해 살짝 염색된 맑은 삼출물을 가졌다.
실시예 7: 화합물의 경구 투여 이후의 생식 실험
다음 표(표 4a)는 수컷 쥐에 경구적으로 6 mg/kg RC-MC-110을 단일 경구 투여한 결과를 설명한다. 화합물을 최소량의 10% 에틸알콜에 용해하였으며 옥수수 오일과 혼합하였다. 투여 전에 에틸알콜을 10% 증발시켰다. "정상 배아(embryos normal)" 및 "비정상 배아(embryos abnormal)"는 임신한 암컷 당 배아의 평균수를 나타낸다.
Figure pct00157
다음 표(표 4b)는 수컷 쥐에 경구적으로 6 mg/kg/day RC-MC-110을 단일 경구 투여한 결과를 설명한다.
Figure pct00158
1 임신한 암컷 당 정상 또는 비정상 배아의 평균수
2 임신한 암컷 당 정상 또는 비정상 배아의 평균수
다음 표(표 4c)는 수컷 쥐에 경구적으로 4개의 다른 양들의 RC-MC-110을 단일 경구 투여한 결과를 설명한다.
Figure pct00159
실시예 8: 정자형성을 억제하는 화합물
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명의 화합물 중 일부가 Hsp90 및 EF1-알파에 결합하여 정자형성을 억제한다는 것이 나타났다. 따라서 이들 단백질들의 둘 중 하나에 결합하는 다른 화합물들이 정자형성을 억제할 수 있을 것이라는 것이 고려된다. 따라서 본 발명은 넓게 Hsp90 및/또는 EF1-알파의 작용을 억제하는 치료적으로 유효한 양의 화합물을 투여함으로써 정자형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
여러 가지 알려진 Hsp90 억제제들은 위에서 열거하였다. HSP90의 경우, RC-MC-110이 N-말단 ATP 결합 위치 또는 Hsp90 상의 신규 위치의 새로운 억제제일 것으로 보인다. 초파리(과실파리)에서 Hsp90의 돌연변이가 불임 수컷 및 암컷을 생산한다는 것을 주목해야 한다. Yue L, Karr TL, Nathan DF, Swift H, Srinivasan S, Lindquist S. Genetic analysis of viable Hsp90 alleles reveals a critical role in Drosophila spermatogenesis. Genetics. 1999 Mar;151(3):1065-79 참조. 로니다민 및 RC-MC-110이 초파리에 제공되는 경우, 둘 다 생식을 억제한다. 하지만 RC-MC-110이 로니다민 보다 더 효력이 있다.
또한, 신장 인자 1-알파(EF1a)가 GTP 결합 단백질이기 때문에 GTP 결합 포켓의 특정 뉴클레오티드 유사체 또는 특정 억제제가 피임약으로 작용할 것이라는 사실이 고려된다. 또한 특정 펩티다아제의 억제제인 유비퀴틴-알데히드가 EF1a를 억제할 수 있을 것이다. Gonen H, Smith CE, Siegel NR, Kahana C, Merrick WC, Chakraburtty K, Schwartz AL, Ciechanover A. Protein synthesis elongation factor EF -1 alpha is essential for ubiquitin - dependent degradation of certain N alpha - acetylated proteins and may be substituted for by the bacterial elongation factor EF - Tu. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Aug 2;91(16):7648-52 참조.
실시예 9:
반-정자형성 활성(anti-spermatogenic activity)의 초기 선발 및 특성 해석을 위하여, 대조군 및 테스트 그룹들 각각은 생후 65-70일된(250-274 g) 5마리의 수컷 롱-에반스 쥐를 포함한다. 초기 선발은 25 mg/kg, 200 mg/kg, 또는 상당하는 부피의 부형제 대조군(2.5 ml/kg에서) 단일 IP 주사를 투여받은 세 그룹의 동물들에서 수행하였다. 그런 다음, 25 mg/kg 투여량에서 IP 투여에 의해 LND 보다 더 효력있는 화합물들을 경구 투여(단일 경구 위관 영양법(gavage))에 의해 테스트하였으며 짝짓기 실험을 포함하였다. 경구 투여의 경우, 가멘다졸을 10% 에탄올/세사미 오일에서 제제화하였다. 짝짓기 실험의 경우, 쥐들 중 한 그룹(그룹 당 7마리)을 부형제(5 ml/kg)로 처리하고 나머지 그룹들을 0.75, 1.5, 3.0, 또는 6.0 mg/kg의 단일 투여로 또는 7일 동안 6.0 mg/kg/day로 가멘다졸로 처리하였다.
조직학을 위해 조직들을 처리하였다. 로니다민을 표준으로 사용하는 실험에서, 생식 상피의 파괴가 단일 IP 주입 48시간 이후 현저하였다. 하지만, 정세관의 내강(lumens)은 정자형성 지표의 평가를 불가능하게 하는 방출된 세포들로 채워졌다. 단일 투여 5 내지 7일 이후, 내강으로부터 떨어진 세포 및 잔해의 제거는 정자형성 지표를 정량화하는 것을 가능하도록 안정시켰다. 초기 실험들은 7일째의 안락사를 이용하였지만 이후에는 5일이 결과 데이터에는 영향을 끼치지 않으며 비용을 감소시키기 위해 선택되었다. 동물들을 안락사시키고 정소를 제거하여 무게를 측정하였다. 조직학을 위해 조직을 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색하는 것을 제외하고는 정소를 이전에 [20] 기술한 대로 처리하였다. 짝짓기 실험 후 정소 단면들을 PAS-헤마톡실린으로 염색하였다. 상기 기술된 초기 선별 실험에서, 안락사에서 각 그룹으로부터의 두 마리 동물들을 조직 해부 실험(뇌, 폐, 위, 심장, 간, 비장, 신장, 및 창자 포함)을 위해 무작위로 선택하였다. 동물들이 죽거나 처리-후 스케줄 5일 이전에 안락사한 경우(AF2785의 경우 이는 200 mg/kg IP에서 6마리 동물 중 2마리였으며, 가멘다졸의 경우 이는 200 mg/kg IP에서 5마리 동물 중 3마리였음), 이들 쥐들 또한 해부 실험에 사용되었다. 잠재적 독성에 대한 초기 정보를 제공하기 위해 이 선별 실험으로부터의 조직을 포유동물 병리학자에 의해 평가하였다. 가멘다졸의 독성을 더 평가하기 위해서는 보다 자세하고 광범위한 독성 연구가 필요하다.
AF2785 및 AF2364 (도 2)를 합성하고 문헌에서 이미 보고된 LND 유사체와 비교하여 테스트하였다. 이전에 발표된 화합물들 중에서, 오직 AF2785 및 AF2364만을 LND에 대한 참조 기준으로서 선택하였으며 이는 모든 다른 이전의 인다졸 카복실산 유사체들은 효력이 적으며, 보다 독성이며, 및 또는 가역성이 부족하기 때문이다.
Figure pct00160
AF2785, AF2364, 및 새롭게 디자인된 화합물들을 로니다민(LND)에 상대적인 효과에 따라 분류하기 위해, 투여-반응 실험들을 먼저 수행하여 테스트된 동물들의 ~50%에서 반응을 나타내는 LND의 투여량를 다음과 같이 확인하였다: 동물에서 양성 반응은 단일 화합물 투여 5일 이후 정소 무게에서의 30%를 초과하는 감소뿐만 아니라 50% 이상의 세관(tubules)에서 정세포의 손실(세관 당 5 이하)을 기준으로 하였다. 반응을 유도하는 모든 화합물의 경우 정소 무게의 감소는 정세포의 손실과 항상 일치하였다. 이 기준들을 이용하여, 25 mg/kg LND가 다섯 마리 동물들의 반복되는 그룹들에서 평균 50% 반응(즉 그룹당 >2 동물)을 나타내는 것으로 확인되었다. 동일한 기준을 사용하여, 반-정자형성 효과를 가진 AF2785, AF2364 및 새로운 유도체들의 대부분의 경우 반응은 일반적으로 "전부 또는 아무것도 아님(all or none)"이다. 다시 말하면, 반응하지 않은 동물들은 대조군과 정소 무게가 거의 동일하며 정소의 조직학이 정상에 가까운 것으로 나타난다. 반응한 동물들에서, 정소는 대조군 보다 무게에서 일반적으로 30 내지 50% 적었으며, 조직학은 5개 또는 이보다 적은 정세포를 가지는 적어도 75%의 세관을 보여주었다. 유사한 발견들이 25 mg/kg에서 LND 또는 가멘다졸의 경구 투여 7일 이후 평가된 쥐에서 관찰되었다. LND- 및 가멘다졸-처리된 쥐에서 정소 무게가 각각 32% (p<0.02) 및 54% (p<0.0001)까지 감소하였다. 또한, 부형제-처리된 쥐(99 ± 1%; 평균 + SE, n=6, 순위에 대해 Kruskal-Wallis ANOVA에 기초 이후 SNK 테스트)와 비교하여 LND (32 ± 10%) 및 가멘다졸 (1 ± 1%)를 이용한 경구 처리에 의해 정상적인 형태를 나타내는 세관의 백분율이 현저하게 감소하였다(p<0.05). 반응 동물에서, 파괴된 생식 상피는 이전(도 7)에 발표된 것과 동일한 것으로 나타났다. 400 mg/kg의 투여량에서 LND는 보고된 LD50에 가까웠으며 40%의 사망률을 유발한 반면 LND의 낮은 투여량 모두에서는 동물 손실이 일어나지 않았다. 따라서, 일상적인 선별을 위하여 우리는 새로운 유사체들을 테스트하기 위해 두 가지 투여량을 사용하였다. LND에 상대적인 효력을 측정할 수 있도록 25 mg/kg의 낮은 투여량을 사용하였다: 및 독성에 대해 선별하고 증가된 사망률이 LND 및 두 개의 다른 유사체인 AF2785 및 AF2364와 관련하여 기인한 것인지를 측정하기 위해 200 mg/kg의 높은 투여량을 투여하였다.
표 5는 가멘다졸, LND, AF2785, 및 AF2364에 대한 결과를 요약한다. 25 mg/kg 투여량에서 임의의 LND 유사체 또는 가멘다졸을 이용한 사망은 관찰되지 않았다; 하지만 가멘다졸은 이 투여량에서 100% 효력을 가지는 유일한 유사체였다. 대조적으로 200 mg/kg 투여량의 AF2785 및 가멘다졸에서 사망이 관찰되었다.
LND 및 유사체들의 선택된 그룹의 단일 IP 투여 이후 쥐에서 반-정자형성 반응 및 사망률 데이터의 요약
화합물 *반응
(25 mg/kg IP 단일 투여로 처리-후 5일)		 25 mg/kg에서의 사망 *반응
(200 mg/kg IP 단일 투여로 처리-후 5일)		 200 mg/kg에서의 사망**
로니다민(LND) 2/5 (40%) 0/5 5/5 (100%) 0/5
AF2785 3/5 (60%) 0/5 3/4 (75%) 2/6
AF2364 3/5 (60%) 0/5 4/5 (80%) 0/5
가멘다졸 5/5 (100%) 0/5 2/2 (100%) 3/5
*반응의 경우, 분수는 정소 무게 >30% 감소로 반응한 동물의 수 / 그룹에서 테스트된 동물의 전체 수를 나타낸다. 사망의 경우, 분수는 감소된 동물들의 수 / 테스트된 동물들의 수를 나타낸다.
**LND의 경우, 5마리 동물 중에 2마리의 사망이 400 mg/kg의 단일 경구 투여에서 관찰되었다.
25 mg/kg의 최소 투여량이 피임 효과를 나타내며 치명적인 투여량보다 8배 낮기 때문에(아래 참조), 보다 자세한 LD50의 결정은 차후 보다 자세한 투여량-발견 및 독성학 연구로 미루었다. 테스트의 제 1 단계로부터 벗어나는 화합물들의 추가적인 투여 범위 연구들을 이어서 수행하였다. 따라서 경구 투여에 의한 실험들이 수행되었으며 가멘다졸이 낮은 복용량에서 피임약으로서 경구적으로 생물학적으로 이용할 수 있으며 효과가 있다는 것이 확인되었다(도 8).
가멘다졸이 후기 정자형성세포의 손실을 유발한다는 것이 발견되었다. 25 mg/kg의 선별 투여량에서 가멘다졸은 100%의 동물들에서 항-정자형성 효과를 나타낸(도 7 및 표 2) 반면 이 투여량에서 LND는 동물들의 50%에서 정자형성을 억제하였다. 25 mg/Kg에서 가멘다졸(도 7 패널 C 및 패널 D)의 반-정자형성 효과는 조직학적으로 LND(도 7 패널 E 및 패널 F)와 유사하였다. 대조군과 비교하여(도 7 패널 A 및 패널 B), LND 및 가멘다졸 모두 구조화된 정자형성세포 타입 레이어링의 손실과 생식 상피로부터의 정자 및 정세포 손실을 유발하였다. 조직학적 패턴은 가멘다졸이 LND와 비교할 때 정세포의 더 광범위한 손실을 제공한다는 것을 제안한다. 정자형성 지표 데이터는 이러한 관찰을 지지한다(표 6). 밀집한 염색질 패턴 및 높은 핵(high nuclear) 대 세포질 비(제 1 정모세포)를 가진 큰 세포들(larger cells) 및 덜 눈에 띄는 염색질 패턴을 가진 더 작은 덜 짙게 염색된 세포(제 2 정모세포)의 붕괴는 또한 이러한 높은 투여량의 LND 및 가멘다졸을 이용하여 관찰되었다. 다른 정자형성세포 타입의 공포화(vacuolation) 및 기저막층 상의 정원세포층의 파괴 또한 관찰되었다. 짝짓기 실험을 위해 사용된 가멘다졸의 낮은 경구 투여에서(3 및 6 mg/kg), 정세포 및 정자의 유사한 손실이 관찰되었다(도 7 패널 G-J). 하지만 낮은 세포 분리 및 공포화가 없는 정세관 상피 조직(3 mg/kg의 경우 96%의 정상적인 세관 및 6 mg/kg의 경우 85%의 정상적인 세관)의 높은 보존이 있었다. 큰 제 1 정모세포 및 작은 제 2 정모세포의 훨씬 적은 붕괴가 관찰되었다.
실시예 10: 정자형성 지표( Spermatogenic Index )
정자형성에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하기 위해 위트셋 등(Whitsett JM, Noden PF, Cherry J, Lawton AD. Effect of transitional photoperiods on testicular development and puberty in male deer mice (Peromyscus maniculatus). J.Reprod.Fertil. 1984; 72: 277-286)으로부터 변형된 쿡 등에 의해 사용된 방법(Cook CE, Wani MC, Jump JM, Lee YW, Fail PA, Anderson SA, Gu YQ, Petrow V. Structure-activity studies of 2,3,4,4a,5,9b-hexahydroindeno[1,2-c]pyridines as antispermatogenic agents for male contraception. J.Med.Chem. 1995; 38: 753-763)을 사용하였다. 평가는 정소 무게 뿐만 아니라 정자형성 지표(SI, spermatogenic index)를 포함한다. 정소의 중심을 통과하는 하나의 절단면에서 모든 세관들을 정원세포, 정모세포 및 정세포의 존재에 대해 조사하였다. 세관 당 각 세포 타입의 숫자에 기초하여, 표 6에 자세히 설명된 것과 같이 점수를 할당하였다.
정소 형태에 기초한 정자형성 지표의 평가 기준
스테이지 형태적 특징
1 오직 정원세포만 존재
2 정원세포 및 정모세포 존재
3 세관 당 5개 미만의 후기 정세포와 함께 정원세포, 정모세포, 및 둥근(초기) 정세포 존재
4 정원세포, 정모세포, 및 둥근 정세포 존재; 및 세관 당 25개 까지의 후기 정세포
5 모든 세포 타입 존재 및 세관 당 50-75개의 후기 정세포
6 모든 세포 타입 존재 및 세관 당 >75개의 후기 정세포
도 7로부터의 데이터는 정량화 정자형성 지표에 의해 확인되었다(표 7). 가멘다졸 대 LND의 증가된 효력은 단일 경구 투여 5일 이후 정소 무게에서 투여량-의존적인 감소에 의해 밝혀졌다(도 8): 대조군으로부터 높은 투약 농도로 처리된 그룹에서의 최종 정소 무게의 최소값까지의 정소 무게들에서 50% 감소에 기초하여 LND에 대한 약 25 mg/kg의 ED50이 추정되었다. 0 내지 3mg/kg 투여량 연구에 기초하여 가멘다졸에 대해서는 0.8 mg/kg의 ED50이 계산되었다.
LND 유사체의 단일 투여 5일 이후 정세관에서 정자형성 지표( SI )
화합물 3 mg/kg 경구투여에서의 SI (평균±SD) 6 mg/kg 경구투여에서의 SI (평균±SD) 25 mg/kg IP투여에서의 SI (평균±SD) 200 mg/kg IP투여에서의 SI (평균±SD)
대조군* 5.91±0.12 5.91±0.12 5.90±0.30 5.90±0.30
로니다민 테스트되지 않음 테스트되지 않음 4.66±1.78 1.76±0.50
AF2364 테스트되지 않음 테스트되지 않음 3.53±1.99 2.08±0.77
AF2785 테스트되지 않음 테스트되지 않음 5.45±0.94 3.41±1.78
가멘다졸 3.47±0.40 2.72±0.39 2.52±0.78 2.05±0.78
*대조군 동물들은 부형제만 단독으로 투여받았다.
실시예 11: 처리 이후 체중 및 생식 기관 변화
반-정자형성 활성에 사용하기 위한 동물들은 생후 60일이었으며, 부형체-처리된 쥐들은 실험 5일 동안 정상적인 무게 증가를 나타내었다(도 9a-9b). 25 mg/kg의 LND, AF-2785, 및 AF-2364에서, 2일 동안 체중 증가의 지연이 있었으며 이후 2일 동안 대조군 그룹과 유사하게 또는 약간 감소하여 증가하였으며, 이후 대조군 그룹과 유사하게 증가하였다. 200 mg/kg의 LND에서, 2일 동안 체중에서 큰 감소가 있었으며 이후 남은 3일 동안 동일한 무게를 유지하였다. AF-2785 및 AF-2364를 투여받은 동물들은 25 mg/kg 투여량을 사용하여 관찰되었던 것과 유사하게 체중 증가에서 지연을 나타내었다. 체중 증가에서 지연이 없었으며 가멘다졸-처리에서 체중 증가의 비율은 전체 5일 기간 동안 대조군의 것과 유사하였다. 비록 25 mg/kg 가멘다졸 그룹이 약간 더 높은 체중에서 사작하였지만 어느 시점에서도 대조군들과 현저하게 다르지는 않았다. 200 mg/kg 투여량에서, 살아남은 동물들은 체중 증가에서 2일 지연을 가졌으며 이후 대조군 동물들과 유사하게 증가하였다. 위의 IP 투여 실험과 대조적으로, 25 mg/kg에서의 유사한 단일 경구 투여 실험에서는 쥐들의 체중은 처리 그룹들 사이에서 다르지 않았다(p>0.05; 데이터는 도시되지 않음).
두 짝짓기 실험 연구들로부터의 쥐들은(표 9 및 10) 연구 종료시 해부하고(10 또는 27주) 생식 기관 및 정소 종점(endpoints)의 체중에 대한 데이터를 얻었다. 오직 3 및 6 mg/kg 단일 투여 그룹들 및 이들 각각의 부형제 대조군 그룹들에 대한 데이터가 표 8에 나타나있다. 3 mg/kg 처리 그룹에서 불임성이 된 동물들의 모두는 생식력을 회복하였으며, 대조군 동물들에서의 것들과 정소 또는 정소상체 무게에서 현저한 차이가 없었다. 비록 이들 동물들의 모두가 생식력이 있었지만 처리 10주 이후 정세포 수의 10% 감소 및 정상적인 정세관의 비율의 18% 감소가 있었다. 6 mg/kg 가멘다졸 그룹에서, 데이터는 모든 동물들에 대해 나타나 있을 뿐만 아니라 처리 27주 이후 생식력을 회복한 동물 대 불임으로 남아있는 동물로 그룹화되었다. 모든 처리된 동물들의 경우, 수컷의 모든 생식 파라미터들은 대조군 동물들과 비교하여 현저하게 낮았다. 하지만, 생식력을 회복 대 불임으로 하부 그룹화되는 경우, 이들 파라미터들의 모두는 여전히 부형제-처리된 쥐들에서의 것들보다 낮았지만 대조군 값들에 가까웠다.
가멘다졸의 단일 경구 투여 이후 신체, 정소, 및 정소상체 파라미터들
처리 그룹(해부한 주) N† 최종 체중
(g)		 한쌍의 정소 무게‡
(g)		 정세포 머리수‡
(정소 당 세포수x106)		 성숙한 정세포를 가진 세관
(%)‡		 한쌍의 정소상체 무게 평균‡
(g)
부형제 대조군
(10주)		 6 589±28 3.57±0.25 108.48±3.50 100+1 1.36±0.07
0일에 3.0 mg/kg의 가멘다졸
(10주)		 6 596±15 3.18±0.13 96.92±1.47* 82+2* 1.13±0.04*
부형제 대조군
(27주)		 7 691±21 3.82±0.13 117.58±4.22 100±1 1.45±0.06
0일에 6.0 mg/kg의 가멘다졸
(27주)		 7 746±18 2.10±0.30*
(2.47±0.43 대 1.60±0.23)		 40.59±16.43*
(66.56±20.43 대 5.97±2.26		 27±11*
(45±13 대 2±1)		 0.96±0.10*
(1.05±0.17 대 0.85±0.10)
† N = 수컷의 수
‡ 27주 연구의 경우(6 mg/kg 투여량), 괄호안의 값은 각각 생식력을 회복 대 불임 수컷에 대한 평균±SE를 나타낸다(n= 4 생식; 3 불임).
* Student's t test에 기초한 각각의 부형제 대조군 그룹으로부터의 현저한 차이(p<0.05)
단일 IP 투여 5일 이후 동물들을 안락사시키고 전부 해부를 수행하였다. 가멘다졸 또는 LND 유사체 처리 그룹당 적어도 하나의 임의로 선택된 동물에서 병리학을 조사하였다. 또한 이상 상태 또는 행동 효과를 보이는 임의의 동물들은 자세하게 조사하였다. 조직학을 위해 모든 조직들을 검사하였다; 오직 영향받은 조직들만 보고되었다. 200 mg/kg 투여량에서 LND 처리 이후 간의 일부 부위들은 혈액으로 울혈된 동맥 및 정맥을 포함한 반면 다른 부위들은 울혈된 것으로 나타나지 않았다. 신장의 경우, 동맥 및 부어오른 소동맥의 일부 울혈이 가끔 많은 혈액 양으로 근위 세뇨관들 사이에서 명확하게 관찰되었다. 또한 울혈된 동맥 및 정맥이 췌장에서 관찰되었다. LND의 200 mg/kg 투여량에서 이들 부작용은 일반적으로 다섯 마리 동물 중 적어도 한 마리에서 주목되었다. 이는 25 mg/kg이 투여된 동물에서는 관찰되지 않았다; 하지만 25 mg/kg에서 단지 약 50%의 동물들이 정자형성의 억제를 나타낸 것은 주목되어야 한다. 25 mg/kg의 AF-2785의 처리 이후, 간 및 췌장의 주변 근처 흩어진 부위들은 확장되고, 혈액으로 채워진 부비강을 포함하였다. 이 부위에서 남은 세포들의 괴사, 농축핵(pyknotic nuclei) 및 부종(swelling)의 흔적이 관찰되었다. 25 mg/kg의 AF-2364의 처리 이후, 작은 고립된 괴저성 소결절(necrotic nodules)이 간 및 췌장의 주변부 근처에서 관찰되었다. 200 mg/kg에서, 간 및 췌장 모두에서 대부분의 정맥 및 일부 동맥의 울혈 및 확장이 관찰되었다. 25 mg/kg의 가멘다졸 이후, 처리된 동물들의 모든 기관들에서의 조직병리학적 발견들은 현저하지 않았으며, 염증반응, 괴사, 출혈 또는 종양의 흔적이 없었다. 25 mg/kg 가멘다졸 처리된 동물들의 100%가 감소된 정자형성을 나타냈다는 것은 주목되어야 한다. 200 mg/kg의 높은 투여량에서, 가멘다졸은 5마리 동물 중 3마리의 사망을 야기하였다. 하지만, 살아남은 2마리 동물들에서, 모든 기관들은 주목할 만한 점이 없었으며, 염증반응, 괴사, 출혈 또는 종양의 흔적이 없었다. 이후 100% 불임을 부여하는 6 mg/kg (경구)로 낮춘 낮은 투여량에서의 테스트에서, 모든 기관들은 주목할 만한 점이 없었으며, 염증반응, 괴사, 출혈 또는 종양의 흔적이 없었다.
짝짓기 실험에서 사용된 동물들로부터의 정소들의 조직학(도 10)은 3 mg/kg 처리된 동물들의 전부의 생식력의 회복은 한쌍의 대조군(부형제) 동물들(도 10 패널 A-B)과 유사한 정상적인 정자형성(도 10 패널 C-D)의 회복과 일치하는 것을 밝혔다. 6 mg/kg 처리된 동물들에서, 생식력을 회복한 동물들은 또한 정상적인 세정관 조직의 회복을 보여주었다(도 10 패널 E-F). 반면 생식력 회복하지 못한 동물들은 생식 상피의 재증식의 실패뿐만 아니라 남은 정자형성 세포의 대부분의 손실을 나타냈으며, 대부분의 세관들이 세르톨리 세포 단독-유사 조직병리학을 보여주었다(도 10 패널 G-H).
실시예 12: 짝짓기 실험( Mating Trials )
쥐에서 가멘다졸의 투여량-의존적인 불임 효과를 평가하기 위해 두 짝짓기 실험 분석들을 수행하였다. 성숙한 수컷 Crl:CD (SD) 아웃브레드 쥐(outbred rats) (=300 g, =생후 9주; Charles River Laboratories, Kingston, NY)가 이들 짝짓기 실험 분석을 위해 사용되었다. 생식은 당업계에 알려진 것과 같이 설정하였다. 제 1 분석에서, 생식력이 증명된 수컷 쥐들(그룹당 6마리)은 부형제(5 ml/kg의 세사미 오일에서 10% 에탄올) 또는 0.75, 1.5, 또는 3.0 mg/kg의 가멘다졸(투여일 = 0주 의 0일)의 단일 경구 투여를 받았다. 1-9주에서 짝짓기 실험은 당업계에 알려진 대로 수행되었으며 10주에 수컷 쥐들을 안락사시켜 모두 해부하였다.
제 2 연구의 경우, 생식력이 증명된 수컷 쥐들(그룹당 7마리)은 다음을 경구투여 받았다: 7일 동안 (0-6일) 5 ml/kg/day의 부형제 대조군, 0일에 6 mg/kg (단일 투여) 가멘다졸, 또는 7일 동안 (0-6일) 6 mg/kg/day의 가멘다졸. 짝짓기 실험은 1-10주(각 주), 및 12, 14, 18, 및 26주에서 수행되었다. 27주에 수컷 쥐들을 안락사시켜 모두 해부하였다. 호르몬 분석을 위한 혈청 샘플을 얻기 위해 연구들 모두에서 혈액 샘플들을 수컷의 꼬리 정맥으로부터 수집하였다. 암컷들을 해부한 후 수태(conceptuses)의 수를 측정하였으며 수태를 모두 평가하고 정상으로-보임(normal-appearing) 또는 재흡수(resorbing)로 분류하였다. 두 그룹 사이에서 임신한 암컷 당 정상적인 수태의 수를 일원분산분석(ANOVA, one-way analysis of variance)에 의해 통계적으로 비교하였다. 해부에서, 정소, 배쪽 전립선 및 정낭(seminal vesicles)을 절단하고 무게를 측정하였다. 정소 상체(epididymides) 및 오른쪽 정소를 모두 절단하고, 무게를 측정한 후 보울린 용액에 보존하였다. 왼쪽 정소를 균질화하고 성숙한 정세포 머리의 수 측정에 사용하였다.
가멘다졸에 의한 정자형성의 효과적인 억제는 가멘다졸이 반정자형성 활성을 가지고 있을 것이라는 것을 제안한다. 생식력이 입증된 수컷 쥐들에서 투여범위 효과 짝짓기 실험은 1.5, 3.0 및 6.0 mg/kg의 단일 경구 투여가 쥐에서 불임을 유도하는데 효과적임을 입증하였다(표 9 및 10). 1.5 mg/kg의 단일 경구 투여에서, 가멘다졸은 6마리 중 2마리 쥐에서 9주의 짝짓기 실험 중 단지 1주 동안(3 또는 4주)만 불임을 유도하였다(표 4). 3.0 mg/kg의 단일 경구 투여에서, 4주경에 6마리 중 4마리가 불임성이 되었으며 4마리 수컷 모두가 5주경에 생식력을 회복하였다(표 9). 6.0 mg/kg 가멘다졸의 단일 경구 투여는 단일 경구 투여 4주 후 100% 불임을 제공한다(표 10). 6 mg/kg 투여량은 단일 경구 투여 이후 100% 불임성을 제공하는 테스트된 가장 낮은 투여량이다. 완전한 불임 기간은 2주 동안 지속되며 이후 완전한 생식력의 회복은 7마리 동물 중 4마리에서 6주경이었다. 그룹에서 나머지 3마리 동물들은 생식력을 회복하지 않았다. 6.0 mg/kg로 7일 연속 투여되는 경우, 유사한 불임의 시작이 관찰되었다; 하지만 7마리 중 단지 2마리의 동물들만이 26주 생식력 실험 구간 동안 생식력을 회복하였다. 모든 처리 그룹들에서, 생식력을 회복한 동물들의 경우, 수태의 수 및 비정상 수태의 비율을 부형제 대조군 그룹들과 현저하게 다르지 않았다.
가멘다졸은 성숙한 수컷 쥐에서 불임을 유도한다: 단일 경구 투여에 대한 반응
처리 그룹 불임 수컷의 수/처리된 수컷의 수 생식력을 회복한 수컷의 수/불임성이 된 수컷의 수 정상적으로 착상/임신된 쥐의 수
부형제 대조군 0/6 - 16±1
0.75 mg/kg의 가멘다졸 0/6 - 15±1
1.5 mg/kg의 가멘다졸 2/6 2/2 15±1
3.0 mg/kg의 가멘다졸 4/6 4/4 15±1
a 연구 9주(week 9)에 대한 평균±SE. 짝짓기 프로토콜 및 결과 분석에 대한 상세한 사항은 재료 및 방법(Materials and Methods) 참조. 처리 그룹들 사이에서 임신한 암컷 당 정상적인 착상 위치의 수에서 현저한 차이가 없었다(p=0.86)(ANOVA).
가멘다졸은 성숙한 수컷 쥐에서 불임을 유도한다: 단일 경구 투여 대 7일 투여의 비교
처리 그룹 불임 수컷의 수/처리된 수컷의 수 생식력을 회복한 수컷의 수/불임성이 된 수컷의 수 정상적으로 착상/임신된 쥐의 수 a
부형제 대조군
7일 동안 5 ml/kg/day
(0-6일)		 0/7 - 15±1
0일에 6 mg/kg의 가멘다졸
(단일 투여)		 7/7 4/7 14±1
7일 동안 6.0 mg/kg/day의 가멘다졸 (0-6일) 7/7 2/7 14±1
a 연구 18주(week 18)에 대한 평균±SE. 짝짓기 프로토콜 및 결과 분석에 대한 상세한 사항은 재료 및 방법(Materials and Methods) 참조. 처리 그룹들 사이에서 임신한 암컷 당 정상적인 착상 위치의 수에서 현저한 차이가 없었다(p=0.80)(ANOVA).
실시예 13: 투여 이후 행동
LND, AF-2785 및 AF-2364 (25 mg/kg 또는 200 mg/kg 투여량)의 투여 2-3시간 이후의 경우, 동물들은 무기력해졌다. AF-2785의 경우, 6마리 중 2마리의 동물들이 발작으로 40분 안에 죽었다. 가멘다졸 200 mg/kg 단독 투여의 경우, 3마리 동물들이 20분 경에 그친 초기 경련 이후 안락사하였지만 이후 부자연스러운 호흡 및 의식이 완전하지 않은 상태가 뒤따랐다. 25 mg/kg의 모두 및 200 mg/kg 가멘다졸 그룹의 나머지들뿐만 아니라 경구 투여 테스트된 모두에서, 25 mg/kg 또는 200 mg/kg 투여량에서 무기력(감소된 조심성 및 의식, 케이지 열림 시 흥미 부족, 대조군에 비해 무기력의 지속된 기간)의 흔적은 없었다. 표 4 및 5에 기술된 짝짓기 실험에서, 가멘다졸이 경구적으로 투여될 때 테스트된 투여량의 어디에서도 대조군과 가멘다졸 처리된 동물들 사이의 짝짓기 행동에서의 차이점은 관찰되지 않았다.
실시예 14: 혈청 호르몬 분석
연구들을 통해 수집된 혈청 샘플들을 ELISA 키트(Oxford Bio-Innovation Ltd, Oxfordshire, UK)를 이용하여 인히빈 B에 대해 분석하였다. 쥐에서 테스토스테론 및 FSH를 측정하기 위한 RIA's를 당업계에 알려진대로 수행하였다. 간단히 말하면, 추출되지 않은 혈청 샘플에서 Diagnostic Products Corp.(Los Angeles, CA)로부터의 키트(Coat-A-Count)를 사용하여 테스토스테론을 측정하였다. 쥐 FSH를 A. 파로우 박사(National Hormone and Peptide Program)에 의해 제공된 NIDDK (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases) 시약들을 이용하여 시약들과 함께 제공되는 절차들에 따라 측정하였다. 표준은 NIDDK-rFSH-RP-2였다.
분리된 세르톨리 세포들이 블랙 96-웰 접시에 플레이트되고 33℃에서 72시간 동안 배양되었다. 배양 배지(무혈청 보충된 DMEM/F-12)를 제거하고 에탄올 또는 DMSO(배지에서 최종 농도 0.1%)에 용해된 다양한 농도의 가멘다졸(10-10 M 내지 2 X 10-4 M)을 포함하는 새로운 배지로 교체하였다. 세포들을 다시 33℃로 하고 48시간 동안 배양하였다. 세포들의 ATP 함량은 포유동물 세포용해 완충액, 동결건조 기질, 및 재구성 완충액을 함유하는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) ATP-라이트 M 키트를 이용하여 키트 삽입물에 따라서 48시간에서 측정하였다. 발광을 섬광 계측기(Perkin Elmer TopCount (Boston, MA); 단위 cps)에서 측정하였다. 데이터를 도표화하였으며 IC50은 그래프패드(GraphPad) PRISM을 이용하여 예측하였다.
분리된 세르톨리 세포들이 상기에서 기술한 대로 플레이트되고 배양되고 다양한 농도의 가멘다졸(10-11 M to 10-6 M)을 포함하여 처리되고 72시간 동안 배양되었다. 세르토텍(Sertotec)의 키트를 이용하여 끓음(boiling) 단계를 뺀 것을 제외하고는 제조사의 지시에 따라 인히빈 B를 측정하기 위해 배지를 수집하였으며, 세르톨리 세포 배양 배지에서 표준 곡선(재조합 인간 인히빈 B)이 준비되었다. 검출한계(가장 낮은 표준)는 15.6 pg/ml였다.
대조군과 가멘다졸 처리된 동물들 사이에서 순환하는 테스토스테론 수준에서의 어떠한 현저한 차이도 관찰되지 않는다는 것을 주목하는 것이 중요하다(도 11c). 또한 가멘다졸은 정낭 및 복부 전립선, 두 개의 안드로겐-의존적인 기관들의 무게에서 현저한 차이를 만들지 않는다(데이터는 도시되지 않음). LND 유사체들에 대한 이전 연구들은 세르톨리 세포들이 정세포의 손실을 야기하는 약물의 제 1 표적이라는 것을 보여준다[33]. 6 mg/kg 가멘다졸로 처리된 동물들에서 추가적인 혈청 호르몬 수준의 분석(도 11a)은 FSH 수준의 순간적이지만 현저하지 않은 증가(도 11b)와 일치하는 순환하는 인히빈 B 수준의 일시적이지만 현저한 감소(P<0.05, ANOVA-RM 이후 Holm-Sidak 다중 비교)를 보여준다. 또한 가멘다졸 처리 이후 불임성으로 남아있는 동물들에서 인히빈 B 수준이 낮은 상태로 남아있지만 생식력을 회복한 동물들에서 인히빈 B 수준이 최초 감소 이후 다시 올라온다는 것이 주목되어야 한다. 혈청 FSH 수준은 인히빈 B 수준과 역비례하여 관련되지만 증가는 현저하지 않다.
혈청 인히빈 B 수준에 대한 가멘다졸의 효과는 가멘다졸이 또한 정소에서 세르톨리 세포[33]를 통해 역할한다는 것을 제안하며 이는 다양한 농도의 가멘다졸로 배양된 쥐 세르톨리 세포의 첫 번째 배양에서 인히빈 B 분비 측정에 의해 확인되었다(도 12a). 실제로, 세르톨리 세포에서 인히빈 B 생산은 단지 6.8±3.0 X 10-10 M의 IC50을 가지는 가멘다졸에 현저하게 민감하였다. 도 12a는 IC50을 측정하기 위해 사용된 1 내지 3번의 반복된 실험들로부터의 데이터를 나타낸다. 대조적으로, 세포 생존 가능성의 표지인 세르톨리 세포 ATP 레벨은 가멘다졸 농도가 10-5 M 또는 이보다 높기 전까지는 감소되지 않았다(도 12b). 따라서 세르톨리 세포에 대한 가멘다졸 작용의 생리학적으로 현저한 생물학적 표지 대 독성 효과 사이에는 5 로그 차이(log difference)가 있다. 가멘다졸은 암 치료제인 로니다민으로부터 유래하였기 때문에, 인비트로 독성의 추가적인 평가로서, MTT 분석을 이용하여 가멘다졸을 다양한 난소암 세포주의 성장 효과에 대해 조사하였다. ID8-T1, ID8, SKOV3, CAOV3의 성장은 각각 2.7x10-5 M, 2.9 x10-5 M,1,6 x10-4 M, 및 7.2 x10-5 M의 IC50을 가지는 가멘다졸에 의해 억제되었다. 이들 IC50 값들은 제 1 세르톨리 세포로부터 ATP 누출을 초래하는 가멘다졸 농도에 필적하였다. 인비트로 세포 상에서 생물학적 효과 대 독성 효과에 대한 이러한 투여량에서의 차이는 가멘다졸의 추가적인 개발을 기대하게 한다.
실시예 15: 제 1 세르톨리 세포에 대한 가멘다졸의 인비트로 결합
제 1 생쥐 세르톨리 세포를 상기에서 기술한 대로 분리하고 전-처리된 유리 커버슬립 상에 플레이트하였다. 과량의 배지를 제거하기 위해 세포들을 PBS로 세척한 다음 2% 파라포름알데히드에 고정하고 이후 1% NP-40을 이용하여 투과하였다. 세포들을 실온에서 1시간 동안 완충액 내 5% BSA를 이용하여 차단하고 완충액으로 세척한 다음 UV-교차결합된 비오틴결합 가멘다졸(BT-UV-GMZ)로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포들을 완충액으로 세척하여 결합하지 않은 약물을 제거하고 이후 어두운 곳에서 실온으로 20분간 플루오르세인-아비딘D(Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 배양하였다. 교차결합은 장파장에서 UV 미네랄 램프로 4℃에서 20분간 수행하였다. 커버슬립을 형광에 적합한 벡타쉴드TM 고정제(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 고정시켰다.
Figure pct00161
가멘다졸의 공간적인 결합은 배양된 제 1 생쥐 세르톨리 세포에서 가멘다졸의 UV-교차결합 비오틴화된 유사체(GMZ-BT-UV)를 이용하여 입증되었다. 염색은 대부분 핵 주위(인(nucleolar)일 수 있는 반점 염색)였으며 세포질 염색은 덜 뚜렷하였다(도 13 패널 A). 10배 몰 과량 가멘다졸(도 13 패널 B), 또는 LND(도 13 패널 C)의 존재하에서 GMZ-BT-UV를 이용한 대조군 배양은 패턴이 화합물 특이적인 것을 보여주는 국부화(localization)를 차단하였다. 또한 FITC-아비딘 단독을 이용한 비특이적인 결합은 매우 낮았다(도 13 패널 D). 이들 결과들은 세르톨리 세포가 가멘다졸 작용의 표적이라는 것을 제안한다.
실시예 15: 가멘다졸 결합 단백질의 친화성 정제( Affinity Purification )
TM -4 세르톨리 세포 및 ID8 난소암 세포:
친화성 정제를 위한 충분한 시작 물질을 확보하기 위해서, 제 1 세르톨리 세포 보다는 TM-4 세르톨리 세포를 사용하여 친화성 정제 및 정소 세포기질인 비교할만한 단백질의 양을 위한 충분한 단백질을 제공하였다. TM-4 세포들은 FSH 민감성을 보유하는 세르톨리 세포 기원의 비-종양형성 생쥐 세포주이다. TM-4 세포는 5%의 말 혈청 및 2.5% FBS와 함께 DMEM/F12 (50:50)에서 배양하여 두 개의 150 mm 플레이트에 합류시켰다. PBS로 한번 세척한 이후, 세포들을 플레이트 당 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 0.05 M NaCl, 0.001% NP-40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM 소듐 오르소바나데이트, 1 mM 소듐 피로포스테이트, 10 mM 벤즈아미딘, 0.05 mg/ml PMSF, 0.01 mg/ml TPCK, 0.3 μg/ml 아프로티닌, 및 0.3 μg/ml 대두 트립신 억제제를 포함하는 3 ml의 용해 완충액(lysis buffer)으로 용해하였다. 용해 완충액에서 세포들을 긁어내어서 다운스 유리 균질기(Dounce glass homogenizer)로 이동시키고 세포를 파괴하기 위하여 단단한 막대로 5-10회 쳐서 균질화하였다. 얼음에 30분 동안 둔 후에 파쇄액(homogenate)을 4℃에서 37,500xg로 10분간 원심분리하였다. 상청액 용해물(supernatant lysate)을 2 ml 아비딘-아가로스(테트라머 형태) 컬럼(50mM 트리스-HCl/0.001% NP-40으로 미리 균형을 맞춤(equilibrated), pH 7.4)에 적용하여 네이티브 비오틴결합 화합물을 제거하여 전-세척된(pre-cleared) 용해물을 얻었다. 전-세척된 세포 용해물(2.7ml)을 60μM의 비오틴결합된 가멘다졸(가멘다졸-BT)로 배양하였다.
Figure pct00162
전-세척된 용해물의 유사 대조군 2.7 ml 분취량을 60μM 가멘다졸-BT와 10배 몰 과량의 가멘다졸로 배양하였다. 로커 플랫폼(rocker platform) 상에서 4℃로 하룻밤 동안 배양한 후 샘플들을 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.1 %NP-40= TD 완충액)으로 미리-균형을 맞춘(pre-equilibrated) 아비딘-아가로스 컬럼 상에 로딩하고 TD로 백그라운드에 도착할 때까지 세척하였다. 컬럼을 0.6mg/ml 가멘다졸을 포함하는 2.5ml의 TD 완충액, 이후 250 mM NaCl, 및 최종적으로 600 mM NaCl으로 연속적으로 용출하였다. 각 2.5 ml의 용출액을 수집하고 센트리콘(Centricon) Y-10 (Millipore, Billerica, MA)으로 4℃에서 5000xg로 2시간 동안 100-200μl의 부피로 농축하였다. 단백질 측정을 위해 분취량들을 제거하고 SDS-PAGE 전기영동 샘플 버퍼를 첨가하였다. 전기영동을 5-20% 농도구배 겔 상에서 수행하였다. 겔들을 고정하고 MALDI-TOF에 적합한 방법을 이용하여 은-염색하였다.
이전에, 종양형성 생쥐 난소 표면 상피세포(ID8)가 가멘다졸에 반응하여 성장 억제를 나타내는 것이 주목되었다. ID8 세포들을 인비트로에서 자발적인 형질전환 사건에 따라 개발되었다. 무흉선(athymic) 및 동계(syngeneic) 생쥐의 복막강 내로의 ID8 세포의 주입은 복막 전체에 복수액 및 다중 종양 이식의 형성을 야기하였다. 종양의 병리조직학적 분석은 암성 및 육종성 성분을 포함하는 매우 악성인 신생물(malignant neoplasm)을 밝혀내었다.
37℃에서 5% CO2 및 공기의 습한 대기의 완전 배지[4% FBS, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml), 인슐린(5 μg/ml), 트랜스페린(5 μg/ml), 및 소듐 셀레나이트(5 ng/ml)로 채워진 DMEM]에서 표준 절차를 이용하여 ID8 세포들을 배양하였다. 세포들은 T75 플라스크에서 합류 지점 가까이로 자랐으며, 차가운 포스페이트 완충된 식염수로 두 번 세척하고, 위에서 기술한대로 용해 완충액에 위치시키고, 세포기질들을 준비하여 친화성 결합에 이용하고, 위에서 TM-4 세포들에 대해 기술한대로 전기영동하였다.
쥐 정소:
생후 60일된 쥐로부터의 정소 세포기질은 다음과 같이 준비하였다: 2마리의 쥐로부터의 디튜니케이티드(detunicated) 정소들(총 2.8 g)을 각각 얼음 상의 용해 완충액 6 ml에서 파워젠 균질기(PowerGen homogenizer)(Fisher, Pittsburgh, PA)로 균질화하였으며 10초 동안 3번의 파열이 있었으며(상기 참조), 그런 다음 소닉 디스멤브레네이터(Sonic Dismembranator)(Fisher, Pittsburgh, PA)를 사용하여 얼음 상에서 설정 5로 5초 동안 음파분쇄하였다. 샘플들을 얼음 상에 30분 동안 위치시킨 다음 4℃에서 37,500xg로 10분간 원심분리하였다. 최종 세포기질을 상기에 기술된 아비딘-아가로스 컬럼을 통해 전-세척한 다음 두 개의 2.7 ml 분취량으로 나누고 4℃에서 하룻밤 동안 60μM의 가멘다졸-BT 또는 60μM의 가멘다졸-BT와 10배 몰 과량 가멘다졸로 배양한 다음 아비딘-아가로스 컬럼을 통과시켰다. 이후 방법들은 상기에서 서술한 것들과 유사하며, 백그라운드에 도달하기 위해 컬럼들을 각각 먼저 완충액으로 세척한 다음 2.7 ml의 1.5 mM 가멘다졸, 이후 3.0 mM 가멘다졸, 및 최종적으로 600 mM NaCl로 단계적으로 용출하여 가멘다졸에 의해 용출되지 않은 남은 단백질들을 수집한다. 수집된 분획물을 농축하고 상기에서 기술한대로 5-20% SDS-PAGE 겔 상에서 수행한다. 정소 SDS-PAGE 겔을 고정하고 MALDI-TOF에 적합한 쿠마씨 블루 방법으로 염색한다.
가멘다졸이 인비보 순환하는 인히빈 B 수준에서의 극적인 감소를 일으킨다는 것과 6.8x10-10 M의 IC50을 가진 가멘다졸에 의해 세르톨리 세포의 첫 번째 배양액이 인히빈 생산의 인비트로 감소를 나타낸다는 것이 나타났다. 이는 특히 정소, 및 세르톨리 세포가 화합물에 대한 높은 친화성을 가진 표적 또는 표적들을 포함한다는 것을 제안한다. 이 가설을 테스트하기 위하여, 비오틴결합된 가멘다졸 유사체인 가멘다졸-BT를 아비딘-친화성 크로마토그래피에서 리간드로 사용하였으며(도 14) 이후 절단된 친화성 밴드에 포함된 단백질을 확인하기 위하여 MALDI-TOF MS를 사용하였다. 아래에서 지적된 바와 같이, 우리는 이전에 연구된 모든 조직 또는 세포로부터의 세포기질로부터 일관적으로 나오는 밴드에 주의를 집중하였으며 가멘다졸 처리에 의해 영향을 받은 것을 발견하였다: 세르톨리 세포(TM4 세포, 도 14 패널 A), 쥐 정소(도 14 패널 B),및 ID-8 난소암 세포(도 14 패널 C).
90 kDa 및 53 kDa 밴드의 단백질 밴드들이 각각 일관적으로 가멘다졸 및 이후 모든 3개의 세포기질원으로부터의 염 용출액에서 관찰되었다. 게다가, 각 90 kDa 및 53 kDa 밴드는 각각 동일한 가멘다졸 및 염 용출 프로파일 및 3개의 모든 세포기질원들로부터 과량의 가멘다졸-경쟁에 의한 신호에서 비교할만한 감소를 나타냈다. TM-4 세포 및 정소로부터의 90 kDa 밴드에 매칭되는 가장 높은 순위의 단백질은 모두 열충격 단백질 HSP90AB1 (MW 83229, P34058) (점수 37 및 78에 해당)이었다. 비록 정소 밴드에 대한 점수가 5%에서 마스코트 디폴트(Mascot default)에 의해 제공되는 유의한 수준(점수 50) 아래이지만 성공적인 확인에 대한 추가적인 증거는 단백질이 90k 겔 밴드로부터 절단된다는 것이었다. 또한 전체 HSP90AB1 서열의 14% 커버리지를 포함하는 7개의 펩티드 쌍들은 TM-4 90 kDa 밴드로 만들어지며 전체 서열의 18%를 포함하는 12개의 펩티드들은 정소 90 kDa 밴드와 일치하였다.
TM-4 세포 및 정소로부터의 53 kDa 밴드에 대한 가장 높은 순위의 단백질 매칭은 모두 EEF1A1-1 (MW 50082, P62630) (점수 54 및 36에 해당)이었다. 이 단백질의 확인에 대한 신뢰는 겔 전기영동에 의해 측정되는 50,000 근처의 예상되는 분자량으로부터 나온다. 또한 전체 서열의 14% 커버리지를 포함하는 4개의 펩티드 쌍들은 TM-4 53 kDa 밴드로 만들어지며, 전체 EEF1A1 서열의 17%를 포함하는 7개의 펩티드들은 정소 53 kDa 밴드와 일치하였다.
HSP90AB1 및 EEF1A1-함유 밴드들에 대한 친화성 정제 및 용출 프로파일은 이들 단백질들에 대한 직접적인 가멘다졸 결합 또는 이들 단백질을 포함하는 단백질 복합체에 대한 가멘다졸 결합과 일치하였다. 먼저, 높은 염 '범프(bumps)' 이전의 용출액에서 이 단백질들을 포함하는 밴드들은 가멘다졸-의존적인 방식으로 아비딘 컬럼에 결합한다. 과량의 가멘다졸 없이 및 과량의 가멘다졸로 처음에 배양된 세포기질로부터의 가멘다졸-용출 단백질 프로파일들의 비교는 가멘다졸에 의해 컬럼으로부터 선택적으로 용출된 90 kDa 단백질을 밝혀내었지만(도 14 패널 A, 레인 3) 과량의 가멘다졸에 의해 미리-차단된 가멘다졸 용출액에 없었다(도 14 패널 A, 레인 4). 이후 NaCl 용출액에서, 90 kDa이 또한 존재하였으나 컬럼에 대한 가멘다졸-의존적인 경쟁 결합을 보였다(도 14 패널 A, 레인 6 및 8). 이 밴드의 정체는 알려지지 않았다. 또한 가멘다졸 사전-차단된 용출액에서는 나타나지 않는 53 kDa의 밴드가 높은 염 용출액에서 관찰되었다(도 14 패널 A, 레인 5-8). 또한 이 밴드는 MALDI-TOF MS 및 서열 및 최소 17%의 서열 커버리지를 가진 36개의 최종 펩티드들 중 7 개의 최종적인 일치에 의해 EEF1A1로 확인되었다.
또한 생후 60일 된 쥐의 정소로부터의 세포기질을 이용한 유사한 친화성 정제 실험은 가멘다졸 결합 단백질들에서 HSP90AB1 및 EEF1A1을 밝혀냈다(도 14 패널 B). 가멘다졸 없이 및 과량의 가멘다졸로 배양된 정소 세포기질들로부터의 가멘다졸-용출 단백질 프로파일들의 비교는 가멘다졸에 의해 컬럼으로부터 용출된 90 kDa 단백질을 밝혀냈지만(도 14 패널 B, 레인 3-4), 과량의 가멘다졸에 의해 미리-차단된 가멘다졸 용출액에 없었다(도 14 패널 B, 레인 6-7). 용출된 샘플들의 웨스턴 블롯 분석은 90 kDa 쿠마씨-염색된 밴드와 일치하는 용출 패턴에서 HSP90의 존재를 확인하였다. 90 kDa 밴드 HSP90에 상응하는 웨스턴 신호가 미리 세척된 출발 세포기질에서 나타났으며(도 14 패널 B, 레인 1-2), 1.5 및 3.0 mM 가멘다졸에 의해 용출되었지만(도 14 패널 B, 레인 3-4), 10배 과량의 가멘다졸로 사전-배양된 세포기질로부터의 용출액에 없었다(도 14 패널 B, 레인 3-4). 또한 염 용출액에서 90 kDa 쿠마씨-염색 밴드에 해당하는 HSP90 웨스턴 신호가 있었고(도 14 패널 B, 레인 7), 이는 과량의 가멘다졸 결합 대조군에는 없었다(도 14 패널 B, 레인 8). 이들 결과들은 미리-높은 염 용출액에서의 90 kDa 밴드가 HSP90을 포함한다는 것과 밴드에서의 단백질(들)의 결합을 증명하였으며, 이들의 용출은 90 kDa 밴드 그 자체로 바로 또는 결합 파트너로의 가멘다졸 결합에 의존한다. 90 kDa 밴드의 MALDI-TOF 분석은 이 밴드가 HSP90AB1을 포함한다는 것을 확인하였다. TM-4 세포를 이용하여 관찰된대로, 또한 가멘다졸-의존적인 결합에 저항성인 90 kDa의 단백질 성분 및 컬럼으로부터 제거되기 위해 높은-염이 필요한 용출이 있었다(도 14 패널 B, 레인 6-7). 웨스턴 블롯 데이터는 HSP90이 600 mM 염 용출액에 존재하며(도 14 패널 B, 레인 7), 컬럼에 대한 이의 결합은 여전히 가멘다졸-의존적이라는 것을 제안한다(도 15 패널 B, 레인 8). 따라서 높은 염의 사용 이전에 컬럼으로부터 용출되기 위해 더 높은 수준의 가멘다졸 또는 경쟁 화합물에 대한 장기 노출이 필요할 수 있다.
과량의 가멘다졸에 의해서 차단되는 높은-염-용출액에서 EEF1A1을 포함하는 밴드가 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 또한 웨스턴 블롯은 높은 농도의 가멘다졸(3.0 mM)을 가진 컬럼으로부터 용출되는 가멘다졸이 미리-차단된 샘플에서 EEF1A1을 밝혀냈다. EEF1A1 신호에 대한 용출 패턴은 컬럼에 대한 가멘다졸-의존적인 결합이 HSP90에 대한 경우보다 더 단단하다는 것을 제안하며, 이는 EEF1A1 밴드가 1.5 mM 가멘다졸이 아니라 더 높은 농도이며 주로 가멘다졸이 이미 컬럼에 적용된 이후 컬럼으로부터의 높은 염 용출액에서 용출되기 때문이다. 과량의 가멘다졸로 미리-배양된 대조군으로부터의 6 mM 가멘다졸 용출액에서 EEF1A1에 대한 웨스턴 신호의 존재는 세포기질에서 많은 양의 EEF1A1 존재와 결합된 EEF1A1의 고친화성 결합 위치에 의해 설명될 수 있다.
HSP90 및 EEF1A1이 항암 치료제를 위한 약물 표적으로 제안되었다. 따라서 우리는 가멘다졸이 암세포에서 동일한 단백질 표적에 결합할 수 있는 가능성을 조사하였다. 이미 우리는 ID8 세포가 가멘다졸의 존재 하에서 배양되는 경우 성장 억제를 나타낸다는 것을 보여주었다. 도 14 패널 C에 도시된 바와 같이, 두 개의 매우 뚜렷하고 명확한 단백질 밴드가 컬럼으로부터 용출되었으며 각각 HSP90AB1 및 EEF1A1과 용출, 상대적인 분자량, 및 과량의 가멘다졸에 의한 결합의 경쟁 면에서 동일하게 행동하였다.
가멘다졸-BT를 이용한 정소 및 세르톨리 세포 세포기질로부터의 HSP90AB1 및 EEF1A1의 친화성 정제는 가멘다졸에 의한 HSP90 및 EEF1A1의 직접 또는 간접 결합을 제안한다. HSP90의 직접 결합은 정제된 재조합 S. 세레비시아에 HSP82 (HSP90AB1에 동족체) 및 가멘다졸-BT-UV를 이용하여 확인되었다(도 15 패널 A). 고정된 양의 HSP82의 존재에서, 가멘다졸-BT-UV의 농도가 증가하면 결합된 화합물의 신호도 증가하였다(도 15 패널 A, 상부 레인). 가멘다졸-BT-UV에 대한 신호는 특정한 가멘다졸 결합을 나타내는 경쟁 가멘다졸의 존재에서 감소하였다(도 15 패널 A, 중간 레인). LND에 의한 가멘다졸 결합의 경쟁은 10 mM LND 이상 전까지는 달성되지 않았다(도 15 패널 A, 하부 레인). 이는 가멘다졸에 의한 HSP82의 결합이 LND의 경우보다 훨씬 더 단단하다는 것을 제안한다. 이러한 결론은 비오틴결합된 UV-교차결합 LND를 이용한 정소로부터의 친화성 표적 정제(affinity purify target) 실험에 의해 뒷받침된다. 어떠한 LND-특이적 결합도 유사한 절차에 따라 달성될 수 없었다(데이터는 도시되지 않음).
HSP82로의 가멘다졸의 직접 결합이 HSP90의 알려진 억제제가 가멘다졸-BT-UV 결합에 대해 경쟁하는지 아닌지를 테스트함으로써 추가로 조사되었다(도 15 패널 B). HSP90 집단 구성원(family members)은 N-말단 및 C-말단 ATP 결합 위치를 포함한다. HSP90 기능의 두 알려진 억제제는 N-말단 ATP 위치의 억제제인 겔다나마이신 및 C-말단 ATP 위치의 억제제인 노보비오신이다. 우리는 최근 HSP90에 대한 노보비오신의 낮은 mM 친화성에 반대하여 HSP90에 대한 낮은 μM 친화성을 가진 노보비오신의 유사체인 A4를 합성하였다. 겔다나마이신과 A4 모두 HSP82에 의한 가멘다졸-BT-UV의 결합에 대해 경쟁하지 않았다. 이는 가멘다졸이 겔다나마이신 또는 A4 보다 HSP90에 훨씬 높은 친화성을 가지고 결합한다는 것 또는 HSP90 상에서 가멘다졸이 다른 화합물들과는 다른 위치에 결합한다는 것을 제안한다.
실시예 16: 가멘다졸의 정제된 세균 발현 효모 HSP82 ( HSP90 ) 및 정제된 효모 및 포유동물 EEF1A1 에 대한 인비트로 결합 및 UV -교차결합
정제된 재조합 사카로마이세스 세레비시아에 HSP82(20μl에서 5μg), S. 세레비시아에 TEF1, TEF3, HBS1, 또는 O. 카니쿨러스 EEF1A1을 가멘다졸-BT-UV로 4℃에서 1시간 동안 배양한 다음 4℃에서 20분 동안 장파장 UV로 교차결합하였다. UV-노출 전에 10배 몰 과량 가멘다졸, 로니다민 (LND), 겔다나마이신, 및 A4 (노보비오신 유사체)로 경쟁 배양하였다. 그런 다음 단백질을 7.5% SDS-PAGE 겔 상에서 영동하고 PVDF 막으로 옮기고, TTBS 내 0.1% BSA(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50mM NaCl, 5mM EDTA, 및 50mM NaF)로 차단하였다. 그런 다음 시트를 겨자무고산화효소(HRP)-아비딘으로 배양하고 TTBS로 세척한 다음 HRP에 대한 AEC 기질(Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA)로 20분 동안 배양하여 가멘다졸-결합 단백질을 시각화하였다.
또한 직접 결합 및 정제된 O. 카니쿨러스 EEF1A1(도 15 패널 C) 및 이의 동족체인 S. 세레비시아에 TEF1 (도 15 패널 D)에 대한 가멘다졸 결합의 경쟁이 유사한 절차들을 따라 확인되었다. 고정된 양의 TEF1의 존재에서, 54.9 nM 이상에서 가멘다졸-BT-UV 단독의 농도는 이들 농도에서 단백질의 포화를 나타내는 신호의 추가적인 증가를 나타내지 않았다(도 15 패널 D, 상부 레인). 가멘다졸-BT-UV의 서브-포화(sub-saturating) 농도에서, 10x 과량 가멘다졸 경쟁 결합과의 경쟁은 낮은 결합 신호로 표시되어 있다(도 15 패널 D, 하부 패널). TEF1에 대한 교차결합의 특이성을 조절하기 위하여, 가멘다졸-BT-UV를 이용한 반응들이 또한 두 개의 다른 정제된 효모 뉴클레오티드 결합 단백질, HBS1, GTP 결합 단백질, 및 TEF3, ATP 결합 단백질과 함께 수행되었다. TEF1에 대해 사용되는 BT-UV-GMZ에 대한 동일한 농도 및 비율에서, 어떠한 단백질으로의 교차결합은 관찰되지 않았다(도 15 패널 E).
실시예 17: MCF -7 세포에서 HSP90 클라이언트 단백질에 대한 가멘다졸의 효과 및 HSP90 - 매개성 루시페라제 재폴딩( Refolding )
친화성 정제 결과 및 상기 인비트로 HSP90 결합 연구들은 가멘다졸이 HSP90에 직접 결합하는 것을 증명하였다. 가멘다졸이 HSP90에서 기능 변화를 제공하는 지를 측정하기 위해 우리는 직접 약물 결합으로부터 기인한 HSP90에서 뚜렷한 기능적 변화를 측정하기 위해 이전에 사용된 일련의 세포-기반 인비트로 실험을 착수하였다. 억제제의 존재 하에서, 기질-결합 HSP90 헤테로 단백질 복합체는 불안정해졌으며 클라이언트 단백질은 유비퀴틴-프로테아좀 분해를 위한 표적이 되었다. 따라서, HSP90-매개성 단백질 폴딩 과정들의 붕괴는 HSP90-의존적인 클라이언트 단백질의 분해를 야기하였다. 우리는 HSP90 억제 활성의 가장 적합한 증거를 제공하기 위해 MCF-7 유방암세포주를 테스트하기로 결정하였으며 수 많은 HSP90 억제제를 분석하였다.
가멘다졸이 HSP90-매개성 단백질 폴딩 과정들에 영향을 미치는지 측정하기 위해 MCF-7 유방암세포 용해물의 웨스턴 분석을 수행하였다(도 16). ERBB2 (HER2) 및 AKT1가 형태적인 성숙에 HSP90이 필요한 알려진 HSP90-의존적인 클라이언트 단백질이다. 가멘다졸은 투여량-의존적인 방식에서 이들 두 HSP90 기질들의 분해를 야기한다(도 16). 액틴은 HSP90 단백질 폴딩 과정들을 위한 기질이 아니며, 가멘다졸의 존재 하에서 액틴의 수준은 동일하게 유지되며 가멘다졸의 효과가 HSP90 헤테로단백질 복합체에 결합된 기질의 불안정화와 관련되어 있다는 가설을 지지한다. 비록 가멘다졸이 AKT1 및 ERBB2의 감소를 제공할지라도 HSP90의 증가를 수반되지 않으며, 가멘다졸이 HSP90-HSF1 헤테로단백질 복합체를 분해하지 않으며 따라서 HSP90의 유도성 형태인 HSP90AA1의 발현을 유도하지 않는다는 것을 제안한다. 대부분의 HSP90 약물들이 HSP90AA1 합성을 유도하기 때문에 국지성 변화가 일어날 가능성을 조사하는 것이 중요한데, 이는 웨스턴 블롯이 MCF-7 세포에서 단백질 수준의 어떠한 변화도 나타내지 않기 때문이다. 또한 가멘다졸로 처리된 제 1 세르톨리 세포의 면역형광 분석은 HSP90AB1 또는 EEF1A1의 국지화 또는 수준에서의 어떠한 변화도 보여주지 않았다(도 17). 유사하게, EEF1A1 수준 또는 국지화에서의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(도 17). HSP90 및 EEF1A1에 대한 분포의 유사한 분산 세포질 패턴이 이전에 보고되었다.
실시예 18: 가멘다졸은 HSP90 -의존적인 루시페라제 인비트로 재폴딩 및 MCF -7 세포의 증식을 억제한다
토끼 망상적혈구 용해물(rabbit reticulocyte lysate)에서 열로 변성된 반딧불이 루시페라제의 재폴딩은 HSP90-의존적인 과정이다. 우리는 최근 이것이 N- 또는 C-말단에서 결합하는 HSP90의 억제제를 확인할 수 있는 견고하며(robust) 재현가능한 분석임을 증명하였다. 가멘다졸은 이 분석에서 변성된 루시페라제의 재폴딩을 억제하며(IC50 = 330±38 μM), 가멘다졸의 HSP90 활성을 기능적으로 억제하는 능력을 입증한다(도 18a). 노보비오신에 대한 IC50 값(552±12μM)은 우리의 고-효율(high-throughput) 선별(~400μM)에서 이전에 예측된 것보다 더 높았지만 용해물 집단들(batches) 및 실험 조건들에서의 약간의 차이가 이러한 효과를 설명할 수 있었다.
LND(LND로부터 가멘다졸이 디자인됨)는 항암 치료제로 처음 개발되었다. 가멘다졸이 다른 HSP90 항암제와 유사한 HSP90 클라이언트 단백질에 대해 억제 효과를 나타내기 때문에 우리는 가멘다졸이 MCF-7 세포의 인비트로 증식을 억제하는지를 조사하였다(도 18b). 가멘다졸에 의한 MCF-7 세포 증식의 억제에 대한 IC50 값은 101±4μM이었다. 반면 노보비오신의 경우 IC50은 224±5μM에서 2배 이상 높았다.
실시예 19: TEF1 에 대한 mant - GMPPNP 및 mant - GDP 결합 분석
가멘다졸의 존재 및 부존재 하에서 S. 세레비시아에 TEF1에 대한 2＇(또는 3＇)-O-N-메틸안트라닐로일 (mant)-GDP 및 mant-GMPPNP의 결합 친화성을 형광 적정 분석(fluorometric titration assay)에 의해 측정하였다. 가멘다졸이 TEF1의 뉴클레오티드 결합을 억제하는지를 조사하기 위하여 형광으로 표지된 뉴클레오티드를 첨가하기 전에 50μM의 가멘다졸을 TEF1-결합 완충액 혼합물과 30분 동안 25℃에서 배양하였다. mant-뉴클레오티드의 증가된 형광이 280 nm에서 TEF1의 트립토판 또는 티로신을 여기시키고, 뉴클레오티드의 mant 모이어티에 대한 440 nm의 방출 파장을 사용하는 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 의해 관찰되었다. 단백질 및 뉴클레오티드 복합체-의존적인 형광값이 mant-GMPPNP 또는 mant-GDP 농도에 대해 도표화되었으며 K d 값을 나타내는 쌍곡선 커브에 맞았다.
EEF1A1 및 TEF1의 두 가지 알려진 기능들은 단백질 합성 동안의 신장 및 액틴 번들링(bundling)이다. 정규 번역 기능은 단백질의 뉴클레오티드 결합 포켓에서 GDP 및 GTP의 교환을 필요로 하는 반면, 액틴 번들링은 뉴클레오티드에 독립적이다. 이들 두 기능들 중 후자는 단백질의 뉴클레오티드 결합 포켓에서 GDP 및 GTP의 교환을 필요로 한다. TEF1의 뉴클레오티드 결합 친화도에 대한 가멘다졸의 효과를 측정하기 위해 mant-GDP 및 mant-GMPPNP에 대한 TEF1의 (K d )의 평형 해리 상수를 50μM 약물의 존재 하에서 측정하였다(도 19a-19b). 약물의 부존재 하에서 mant-GDP에 대한 TEF1의 K d 값은 0.18μM이다. mant-GDP를 이용한 흐름-정지 동역학(Stopped-flow kinetics)은 가멘다졸의 존재 하에서 TEF1이 유사한 친화성(K d =0.12)을 가지고 mant-GDP에 결합하는 것을 나타내었다. 가멘다졸을 이용한 및 가멘다졸이 없는 mant-GMPPNP에 대한 TEF1의 K d 는 0.43μM 및 0.52μM로 각각 측정되었다. 유사한 K d 값들은 가멘다졸이 EEF1A1의 뉴클레오티드-결합 특성에 영향을 끼치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 20: 가멘다졸 -처리된 제 1 세르톨리 세포에서 HSP90AB1 및 EEF1A1 의 면역형광법
제 1 세르톨리 세포를 6-웰 플레이트에서 산으로 세척된 폴리-L-라이신 코팅된 글라스 커버슬립 상에 플레이트하였다. 세포를 37℃에서 20μM 가멘다졸로 처리하였다. 대조군을 용매 부형제로 처리하였다(0.2% DMSO의 최종 농도). 24시간 이후 매질을 흡입시키고 세포를 2ml의 TBS(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9% (w/v) NaCl)로 3번 세척하였다. 그런 다음 세포를 TBS에서 10% 포름알데히드로 실온(R.T.)에서 20분간 고정하고 TBS로 10분 동안 3회 세척한 다음 TBS에서 15분간 1% NP-40을 이용하여 투과성이 되었다. 그런 다음 세포를 TBS + 0.1% NP-40로 세척하고 TBS-NP-40에서 10% 염소 혈청으로 1시간 동안 R.T에서 차단하였다. TBS로 헹군 이후 세포들을 제 1 항체로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다: 2% 염소 혈청 및 TBS-NP-40에서 0.1% 소 혈청 알부민에서 생쥐 단일클론 IgG 항-EEF1A1(05-235, Upstate, Waltham, MA)의 1:1000 희석액, 또는 생쥐 단일클론 IgM 항-HSP90AB1(SPA-843, Stressgen Biotechnologies, San Diego, CA)의 1:1000 희석액. TBS-NP-40로 3회 세척 이후 세포들을 TRITC-태그된 제 2 항체(제 1 항체와 동일한 완충액에서)로 암흑에서 R.T로 1시간 동안 배양하였다: EEF1A1의 경우 1:200 염소 항-생쥐 IgG(115-025-003, Jackson Immunologicals, West Grove, PA), HSP90AB1의 경우 1:200 염소 항-생쥐 IgM(115-025-020, Jackson Immunologicals, West Grove, PA). TBS-NP-40로 최종 3회 세척(각 10 분) 이후 커버슬립을 형광에 적합한 벡타쉴드 하드셋 설치 미디어(Vectashield Hardset mounting media for fluorescence)(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 장착하였다.
실시예 21: 가멘다졸로 처리된 제 1 세르톨리 세포에서 초기 반응 유전자로서의 인터루킨 1-알파( Il1a )의 확인
Il1a는 세르톨리 세포-정세포 접합 통합성(junction integrity)의 알려진 교란물질(disruptor)이며 세르톨리 세포-정자형성 세포 상호작용의 중요한 조절자로 제안되었다. 3개의 인터루킨 1 유전자들은 가멘다졸에 반응하여 가장 빠르고 극적으로 증가된 유전자들이었다. 제안된 연구들을 이끄는 제 1 가설은 세르톨리 세포가 가멘다졸의 항-정자형성 효과에 대한 제 1 표적 세포라는 것이었다. 이 가설에 대한 추가적인 뒷받침을 제공하기 위하여 우리는 제 1 세르톨리 세포에서 가멘다졸에 대한 초기 반응 유전자로 Il1a를 확인하였다. 우리는 100 nM 가멘다졸의 부존재 및 존재 하에서 0, 30, 60, 120, 및 240분 동안 배양된 제 1 세르톨리 세포로부터 제조된 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 20). 가멘다졸의 이 투여량은 이전 연구에서 인비트로 로니다민 효과를 테스트하기 위해 사용된 농도 범위 안이었다. 가멘다졸 처리 60분에서, Il1a에 대해 예상되는 크기인 대략 500bp의 증폭된 생성물의 스파이크가 관찰되었다(도 20). 가멘다졸의 부존재 하에서는 어느 시점에서도 어떠한 증폭된 생성물도 검출되지 않았다. 역전사효소(각 양성 시점 옆의 레인에서 C로 표시됨)의 추가 없이 수행된 반응들에서 생성물이 또한 없었으며 신호가 증폭된 mRNA로부터 유래한 것을 확인하였다.
실시예 22: 암컷 생식력 제어
암컷 생식력을 제어하는 능력을 조사하였다. H2-가멘다졸을 성인 사이클 C57BI6 암컷 생쥐에 100mg/kg의 단일 경구 투여량으로 투여하였다. 총 무게, 난소 무게, 및 프로게스테론의 혈청 수준을 측정하였다. H2-가멘다졸의 투여 이후 난소 무게(도 21 패널 A) 및 스테로이드(예를 들어, 프로게스테론) 생산(도 21 패널 B)이 빠르게 감소하는 것이 6일 이후 발견하였다. 하지만 생쥐의 총 무게는 동일하게 유지되었고(데이터는 도시되지 않음) 단일 경구 투여 이후 변화하지 않았으며 투여가 독성이 아니라는 것을 나타내었다. 조직학(도 22)은 본 발명에서 기술된 부형제의 대조군과 비교하여 H2-가멘다졸이 난소 여포의 손상 및 사멸(예를 들어, 폐쇄증)을 일으킨다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 H2-GMZ의 단일 투여가 난소에 빠르고 현저한 효과를 가한다는 것을 가리킨다.
실시예 23: 화합물들의 효과의 가능성( Probabilty )
지금까지의 가멘다졸 테스트를 위한 모든 투여량을 이용한 쥐들에 대한 짝짓기 실험 데이터는 쥐에서 6 mg/kg 투여 시 정소 무게가 3.5%의 표준 편차를 가지며 대략 50%까지 감소하는 것을 나타낸다. 암컷 생쥐에서 난소 무게들의 변화는 각각 35% 및 8%(SD)였다. 투여량 수준을 이용한 기호 논리학 성공 예측 모델(불임성)은 6 mg/kg의 투여율에서 50% 성공률 및 12 mg/kg 내지 100 mg/kg 수준에서 100% 성공을 예측하는 데이터(도 23)에 맞았으며 이는 조사자가 기대하는 것이다. 가멘다졸(RC-MC-110) 및 H2-가멘다졸(JWS-2-72)의 생물학적 효과가 유사하기 때문에 모델은 각각의 화합물에 대한 12 mg/kg의 투여 수준에서 99.95%의 성공률을 예측하였다: 불임성 = e -7.5415+1.2569*투여량

Claims (24)

  1. 대상에서 생식력을 감소시키기 위하여 화학식 I에 따른 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터의 하나 이상의 투여량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 생식력을 가역적으로 감소시키는 방법:
    화학식 I
    Figure pct00163

    (여기서, R1은 카복실, 아크릴, 또는 카복실산 히드라지드이며;
    R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 시클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며;
    X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며;
    Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다).
  2. 제 1 항에 있어서,
    R2가 수소인 경우,
    Z1, Z2, Z3, 및 Z4의 적어도 하나가 질소이며 나머지는 독립적으로 탄소 또는 질소이거나; 또는
    R1이 -COOH, -CONHNH2, -CONHN(CH3)2, -CH=CHCOOH가 아닌 것인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    화합물은
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
    6-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드;
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터;
    6-플루오르-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-프로피온산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산; 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    화합물은
    가멘다졸(gamendazole);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 (JWS-2-72 또는 H2-가멘다졸);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]아크릴산 (TH 2-192);
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (TH 2-178);
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (TH 2-179);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS 1-190);
    1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 2-22);
    1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 1-282); 및
    이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 세르톨리 세포 기능을 손상시키기에 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 정자형성을 억제하기에 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 정소 무게를 감소시키기에 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 난소 무게를 감소시키기에 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 혈청 프로게스테론을 감소시키기에 치료적으로 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 난소 여포 기능을 손상시키기에 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 생식력을 되돌리기 위해 대상으로의 화합물의 투여를 중단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    여성 대상을 비가역적으로 불임시키기 위해 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    1회 투여로 여성 대상에서 불임을 유도하기 위해 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    대상에서 불임을 유도하기 위해 다중 투여 요법으로 화합물을 투여하는 방법.
  15. 정자형성을 억제하기 위하여 화학식 I에 따른 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터의 하나 이상의 투여량을 남성 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 남성 대상에서 정자형성을 억제하는 방법:
    화학식 I
    Figure pct00164

    (여기서, R1은 카복실, 아크릴, 또는 카복실산 히드라지드이며;
    R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 시클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며;
    X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며;
    Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다).
  16. 제 15 항에 있어서,
    화합물은
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
    6-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드;
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터;
    6-플루오르-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-프로피온산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산;
    가멘다졸(gamendazole);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 (JWS-2-72 또는 H2-가멘다졸);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]아크릴산 (TH 2-192);
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (TH 2-178);
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (TH 2-179);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS 1-190);
    1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 2-22);
    1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 1-282); 및
    이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    적어도 다음 중 하나에 부합하도록 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법:
    대상의 체중 유지;
    인히빈 B의 생산 억제;
    순환하는 여포-자극 호르몬(FSH) 증가;
    화합물-관련 독성 억제;
    구조화된 정자발생 세포-타입 레이어링 감소;
    정자 감소;
    정자세포 감소;
    정원세포 감소;
    생식 상피 감소;
    생식세포의 양 감소;
    정소 무게 감소;
    열충격단백질 HSP90AB1 억제;
    진핵세포 번역신장인자 1 알파 1(EEF1A1) 억제;
    인터루킨 1 단백질의 생산 증가; 또는
    NF-KappaB 억제제 알파(Nfkbia)의 생산 증가.
  18. 제 15 항에 있어서,
    대상에서 정자형성 가능성을 되돌리기 위해 대상으로의 화합물의 투여를 중단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 생식력을 감소시키기 위하여 화학식 I에 따른 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터의 하나 이상의 투여량을 여성 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 여성 대상에서 생식력을 감소시키는 방법:
    화학식 I
    Figure pct00165

    (여기서, R1은 카복실, 아크릴, 또는 카복실산 히드라지드이며;
    R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 시클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며;
    X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며;
    Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다).
  20. 제 19 항에 있어서,
    화합물은
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
    6-클로로-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드;
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-카복실산 메틸 에스터;
    6-플루오르-1-(2,4-디클로로벤질)-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-플루오르-1H-인다졸-3-일]-아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메톡시-1H-인다졸-3-일] 아크릴산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H- 인다졸-3-일]-프로피온산;
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산;
    가멘다졸(gamendazole);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-트리플루오르메틸-1H-인다졸-3-일]-프로피온산 (JWS-2-72 또는 H2-가멘다졸);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-일]아크릴산 (TH 2-192);
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 (TH 2-178);
    1-(2,4-디클로로벤질)-6-메틸-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (TH 2-179);
    3-[1-(2,4-디클로로벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-일]-아크릴산 (JWS 1-190);
    1-(2-클로로-4-플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 2-22);
    1-(2,4-디플루오르벤질)-6-클로로-1H-인다졸-3-카복실산 히드라지드 (JWS 1-282); 및
    이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    적어도 다음 중 하나에 부합하도록 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법:
    대상의 체중 유지;
    인히빈 B의 생산 억제;
    에스트라디올의 생산 억제;
    난소 무게 감소;
    혈청 프로게스테론 감소;
    프로게스테론 생산 억제;
    폐쇄 난소 여포 유도;
    생존 가능한 난소 여포의 수 감소;
    생식세포의 양 감소;
    배란 억제.
  22. 제 19 항에 있어서,
    대상에서 가역적인 불임을 일으키기에 유효한 양으로 화합물을 투여하며, 대상에서 생식 가능성을 되돌리기 위해 대상으로의 화합물의 투여를 중단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서,
    대상을 비가역적으로 불임시키기 위해 유효한 양으로 화합물을 투여하는 방법.
  24. 대상에서 생식력을 감소시키기 위한 의약을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스터를 가지는 화합물의 용도:
    화학식 I
    Figure pct00166

    (여기서, R1은 카복실, 아크릴, 또는 카복실산 히드라지드이며;
    R2는 수소, 할로겐, 알콜, 알킬, 알콕시, 아랄킬, 시클로알킬, 할로알킬, 할로알콕시, 아미노, 또는 카복실이며;
    X 및 Y는 동일하거나 서로 다르며 할로겐 또는 저급알킬이며;
    Z1, Z2, Z3, 및 Z4는 독립적으로 질소 또는 탄소이다).
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