KR20120063377A - Method for isolating primary mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells using cell insert culture system - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 배아줄기세포로부터 중간엽 세포를 분리, 배양하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포배양 삽입체를 이용하여 다분화 능력을 가진 중간엽 세포를 효과적으로 분리, 배양하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리된 중간엽 세포에 관한 것이다. 본 발명의 분리 방법은 다른 물질의 첨가 없이 세포배양 삽입체만을 이용하여 배아 발생 중 일어나는 현상을 시험관 내에서 자연스럽게 유도하여, 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 포함한 중간엽 세포를 저비용으로, 단시간에 효과적으로 분리, 배양하는 방법이다.
The present invention relates to a method for separating and culturing mesenchymal cells from embryonic stem cells, and more particularly, to a method for effectively separating and culturing mesenchymal cells with multi-differentiation capacity using a cell culture insert and to the method. To mesenchymal cells separated by. The isolation method of the present invention naturally induces the phenomenon occurring during embryonic development in vitro using only cell culture inserts without the addition of other substances, and induces mesenchymal cells, including mesenchymal stem cells, from embryonic stem cells at low cost and in a short time Effectively separating and culturing.
중간엽이란 배아 발생 중에 일어나는 상피-중간엽 이행(Epithelial to Mesenchyme Transition, EMT)에 의해 형성된 중간층에 해당하는 중배엽의 조직을 통칭하며, 인간 배아줄기세포는 이러한 초기 발생을 시험관 내에서 설명할 수 있는 유일하며, 유익한 세포의 원천으로써 사용할 수 있다.Mesenchyme refers to the tissues of mesoderm corresponding to the mesenchyme formed by the Epithelial to Mesenchyme Transition (EMT), which occurs during embryonic development. Human embryonic stem cells can explain these early developments in vitro. It can be used as the only source of beneficial cells.
현재 성체 뿐만 아니라 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 혹은 중간엽 전구세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 성체에서 중간엽 줄기세포는 골수에 골을 형성할 수 있는 전구세포가 존재한다는 것이 최초로 알려졌으며, 이 후 여러 다른 그룹에 의하여 골수 이외에도 치밀골, 말초혈액, 지방조직, 그리고 제대혈과 양막 등 태아의 조직에서 모두 분리가 가능하다고 보고되었다. 이러한 성체 유래 중간엽 줄기세포는 세포치료에 유용하게 쓰일 수 있는 다양한 특성을 가지고 있기 때문에 실제 임상치료에 있어 골(Kadiyala S et. al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant 1997;6:125-34), 연골(Johnstone B et. al. Autologous mesenchymal progenitor cells in articular cartilage repair. Clin Orthop 1999;67:S156-S162), 힘줄(Young RG et. el. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J Orthop Res 1998;16:406-13) 등 근골격계와 심혈관계에서 심근재생(Orlic D et. al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium. Nature 2001;410:701-5), 폐섬유화의 치료(Lodie TA et. al. Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow derived stem cells reveals a lack of distinction. Tissue Eng 2002;8:739-51), 척추손상의 치료에까지 연장되어 많은 분야에서 세포치료가 시도되고 있다. 또한 성체 유래 중간엽 줄기세포가 시험관 또는 생체 내에서 신경계통의 세포로 분화한다는 발견은 뇌졸중, 뇌 외상, 파킨슨 병들에 중간엽 줄기세포를 쓸 수 있다는 기대를 불러 일으키고 있다(Shihabuddin LS et. al. Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus.t H Neuroscience 2000;20:8727-35, Mezey E et. al. Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains. Proc Nat'l Acad Sci 2003;100:1364-9).At present, there are active studies on mesenchymal stem cells or mesenchymal progenitor cells derived from human embryonic stem cells as well as adults. For the first time, adult mesenchymal stem cells are known to have progenitor cells capable of forming bone in bone marrow. Since then, several other groups have reported that in addition to the bone marrow, it is possible to separate all of the fetal tissues such as dense bone, peripheral blood, adipose tissue, and cord blood and amniotic membrane. Since adult-derived mesenchymal stem cells have various properties that can be useful for cell therapy, bone (Kadiyala S et. Al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant 1997; 6: 125-34), cartilage (Johnstone B et. Al. Autologous mesenchymal progenitor cells in articular cartilage repair.Clin Orthop 1999; 67: S156-S162), tendon (Young RG et. El. Use of mesenchymal Stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair.J Orthop Res 1998; 16: 406-13), and myocardial regeneration in the musculoskeletal system and cardiovascular system (Orlic D et. al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium.Nature 2001; 410: 701 5), treatment of pulmonary fibrosis (Lodie TA et. Al. Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow derived stem cells reveals a lack of distinction.Tissue Eng 2002; 8: 739-51), to the treatment of spinal cord injury. Extended to many fields The cell therapy has been attempted. In addition, the discovery that adult-derived mesenchymal stem cells differentiate into cells of the nervous system in vitro or in vivo raises the expectation that mesenchymal stem cells can be used for stroke, brain trauma, and Parkinson's disease (Shihabuddin LS et. Al. Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus.t H Neuroscience 2000; 20: 8727-35, Mezey E et. Al. Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains.Proc Nat'l Acad Sci 2003; 100: 1364-9).
그러나 일반적으로 얻어지는 성체 중간엽 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 시험관 내에서 장기간 동안 계대 배양을 할 경우 불규칙한 증식능력을 보이는데 한 세포의 분열능력은 40회를 넘지 못하는 것으로 알려져 있다(Digirolamo CM, Stokes D et. al. Propagation and senescence of human marrow stromal cells in culture: A simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate. Br J Haematol 1999;107:275-81). 또한, 확립된 세포 계통이 없어 성체로부터 반복적으로 세포를 준비해야 하는 점 때문에 연구에 어려움을 겪고 있다. However, adult embryonic mesenchymal stem cells, which are generally obtained, show irregular proliferation when passaged for a long time in vitro, unlike embryonic stem cells. The division capacity of one cell is known to not exceed 40 times (Digirolamo CM, Stokes D). et.al. Propagation and senescence of human marrow stromal cells in culture: A simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate.Br J Haematol 1999; 107: 275-81). In addition, there is a difficulty in research due to the lack of an established cell line and the necessity of repeatedly preparing cells from adults.
반면, 이러한 어려움을 극복하기 위해 인간 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하는 연구가 지속적으로 진행되고 있는데, 기존에 알려진 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 방법으로 원하는 표지인자(Marker)를 나타내는 세포를 유세포 분석기(Fluorescent activated cell sorter, FACS)를 이용하여 분리하는 것과 분화 유도를 위해 싸이토카인(Cytokine)을 처리하는 방법 등이 일반적으로 사용되고 있다. 하지만, 유세포 분석기를 이용하는 방법은 레이저를 사용하므로 세포의 생존률을 저하시킬 뿐만 아니라, 분리한 후 얻어지는 세포의 수가 적기 때문에 배양기간이 길어지는 단점이 있고, 싸이토카인 처리의 경우 지속적 처리에 의한 고비용 및 분화 후에도 배아줄기세포의 전분화능을 효과적으로 제거하기 어려운 단점이 있다.
On the other hand, in order to overcome these difficulties, researches for separating and culturing mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells have been continuously conducted. As a method of obtaining mesenchymal stem cells from known embryonic stem cells, a desired marker may be obtained. ) Is commonly used to isolate cells using a Fluorescent Activated Cell Sorter (FACS) and to treat cytokines for differentiation induction. However, the method using a flow cytometer does not only lower the viability of the cells because of the use of a laser, but also has a disadvantage in that the incubation period is long due to the small number of cells obtained after separation, and in the case of cytokine treatment, high cost and differentiation by continuous treatment It is difficult to effectively remove the pluripotency of embryonic stem cells afterwards.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 계대 배양의 제한이 없으면서도 중간엽 줄기세포를 포함하는 중간엽 세포를 분리, 배양할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 시험관 내에서 세포배양 삽입체를 이용한 자연스러운 상피-중간엽 이행 유도를 통해 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포가 분리가능하다는 점, 상기 중간엽 세포는 중간엽 줄기세포가 가지는 특성을 모두 갖고 있다는 점 및 골, 연골, 평활근, 골격근, 지방조직 등으로의 분화가 가능하다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have made diligent efforts to find a method for isolating and culturing mesenchymal cells, including mesenchymal stem cells, without restriction of passage culture. Mesenchymal cells derived from human embryonic stem cells can be separated through mesenchymal transition induction, and mesenchymal cells have all the characteristics of mesenchymal stem cells and bone, cartilage, smooth muscle, skeletal muscle, adipose tissue, etc. After confirming that differentiation is possible, the present invention was completed.
본 발명의 목적은, (a) 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체(embryoid body)를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계;An object of the present invention, the method comprising the steps of: (a) culturing embryonic stem cells or embryonic stem cells-derived embryonic body (embryoid body) on a cell culture insert having a porous membrane;
(b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 중간엽 세포를 분리하는 단계; 및(b) separating the mesenchymal cells that have migrated under the cell culture insert of step (a); And
(c) 상기 단계 (b)의 분리된 중간엽 세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 세포의 분리 배양 방법을 제공하는 것이다. (c) It provides a method for separating and culturing mesenchymal cells comprising the step of proliferating culture of the isolated mesenchymal cells of step (b).
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 분리된 중간엽 세포를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide mesenchymal cells isolated by the above method.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, (a) 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 중간엽 세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 분리된 중간엽 세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 세포의 분리 배양 방법에 관한 것이다.
As one aspect for achieving the above object, the present invention, (a) embryonic stem cells or embryonic stem cells derived from embryonic stem cells cultured on a cell culture insert having a porous membrane; (b) separating the mesenchymal cells that have migrated under the cell culture insert of step (a); And (c) propagating and culturing the isolated mesenchymal cells of step (b).
본 발명에서 용어, "배아줄기세포(Embryonic stem cells)"는 포유동물의 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(Inner Cell Mass, ICM)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로, 동물의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능(Pluripotency)을 가진 세포를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 인간, 영장류, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 가축을 포함하는 포유동물 유래의 모든 배아줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 인간 배아줄기세포일 수 있다.In the present invention, the term "Embryonic stem cells" is that cultured in vitro by extracting the inner cell mass (Inner Cell Mass, ICM) from the blastocyst embryo just before the embryo of the mammal implants in the mother's womb, Means cells having pluripotency capable of differentiating into all cells of an animal, including but not limited to mammals including humans, primates, cattle, pigs, sheep, horses, dogs, rats, rats, and livestock It includes all embryonic stem cells derived from animals, preferably human embryonic stem cells.
상기 인간 배아줄기세포는 예를 들면, H9(James A. Thomson et. al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998 Dec 4; 282(5395):1827) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 인간 배아줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다. The human embryonic stem cells may be used, for example, H9 (James A. Thomson et. Al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998 Dec 4; 282 (5395): 1827) and the like. Without limitation, human embryonic stem cells can be readily constructed by those skilled in the art.
본 발명에서 용어, "중간엽 세포"는 상기 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체에서 유래된 중간엽 세포를 의미하고, 중간엽 줄기세포, 중간엽 전구세포를 포함한다. 또한, 테라토마(Teratoma)가 제거된 고농도의 순수 중간엽 세포를 포함한다.As used herein, the term "mesenchymal cell" refers to mesenchymal cells derived from the embryonic stem cells or embryonic stem cells, and includes mesenchymal stem cells and mesenchymal progenitor cells. It also contains high concentrations of pure mesenchymal cells from which teratoma has been removed.
본 발명의 방법으로 분리된 중간엽 세포는 배아줄기세포를 정상산소 상태에서 배상체를 형성하거나 혹은 배상체 형성을 하지 않은 배아줄기세포를 세포배양 삽입체 위에 올려 아래로 분리되어 나온 세포를 포함한다. 이와 같은 중간엽 세포는 골, 연골, 힘줄, 인대, 심장근, 평활근, 골격근, 지방조직, 피부 뿐만 아니라 중간엽 줄기세포, 중간엽 전구세포, 피부아세포 등의 세포를 만들 수 있는 세포로, 세포 치료에 이용될 수 있다. The mesenchymal cells isolated by the method of the present invention include embryonic stem cells that form embryoid bodies in the normal oxygen state or cells which are separated down by placing embryonic stem cells that do not form embryoid bodies on the cell culture insert. . These mesenchymal cells are bone, cartilage, tendons, ligaments, heart muscle, smooth muscle, skeletal muscle, adipose tissue and skin, as well as cells that can make cells such as mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells and dermal cells. It can be used to.
본 발명에서 용어, "배상체(Embryoid body, EB)"는 미분화 상태를 유지하게끔 하는 필수 요소들을 제거하고, 미분화 상태의 배아줄기세포를 부유배양시키면 자연적으로 분화를 시작하는데, 이때 박테리아 배양용기와 같이 소수성을 갖는 배양용기에 키우게 되면 바닥에 붙지 못하고 배아줄기세포끼리 붙어 약 1㎜ 이하 크기의 세포덩어리가 생기는데 이를 배상체라 지칭한다. 이와 같은 배상체는 포유동물의 몸을 구성하는 삼배엽성(내배엽, 중배엽, 외배엽)으로 분화될 수 있는 능력을 지닌 세포덩어리를 의미한다. In the present invention, the term "embryoid body (EB)" is to remove the essential elements to maintain the undifferentiated state, the culture of undifferentiated embryonic stem cells start to differentiate naturally, wherein the bacterial culture vessel and When grown in a culture vessel having a hydrophobicity as described above, embryonic stem cells do not adhere to the bottom, and cell masses of about 1 mm or less are formed, which is called embryoid body. Such embryoid body refers to a mass of cells having the ability to differentiate into trigeminal (endoderm, mesoderm, ectoderm) constituting the body of a mammal.
또한, 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체로부터 중간엽 세포를 분리하는 방법에 있어서, 공지의 배지를 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 EGM2-MV, DMEM, MEM-α, STEMPRO-MSC, MesenCult-MSC 배지일 수 있으며, 바람직하게는 EGM2-MV, DMEM 또는 MEM-α일 수 있다. 이와 같은 배지는 각 단계에 따라 필요에 따라 자유롭게 선택할 수 있다. 아울러, 상기 공지의 배양액에 5% 이상의 FBS(Fetal bovine serum) 또는 5% 이상의 SR(Serum replacement)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5% FBS 또는 5% SR을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 5% FBS를 포함하는 EGM2-MV를 사용하였다.
In addition, in the method for separating mesenchymal cells from embryonic stem cells or embryonic stem cells derived embryonic stem cells, a known medium can be used without limitation, for example, EGM2-MV, DMEM, MEM-α, STEMPRO-MSC, MesenCult-MSC medium, preferably EGM2-MV, DMEM or MEM-α. Such a medium can be freely selected as necessary according to each step. In addition, the known culture medium may include 5% or more of FBS (Fetal bovine serum) or 5% or more (SR) replacement, preferably 5% FBS or 5% SR. According to one embodiment of the invention EGM2-MV containing 5% FBS was used.
바람직한 일 실시 태양으로, 상기 단계(a)에서 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체를 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에서 배양하는 단계에 있어서, 세포배양 삽입체는 정상산소 상태에서 6 내지 12㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체를 이용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 8㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체를 이용할 수 있다. In a preferred embodiment, in the step (a) of culturing embryonic stem cells or embryonic stem cells derived from embryonic stem cells on a cell culture insert having a porous membrane, the cell culture insert is 6 to 12 in the normal oxygen state It is preferable to use a cell culture insert having a porous membrane having a size of μm, and more preferably, a cell culture insert having a porous membrane having a size of 8 μm may be used.
본 발명에서 용어 "세포배양 삽입체"란 다공성 막을 가지는 기구로서 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체를 배양시, 배아 발생 중에 일어나는 상피-중간엽 이행이 자연스럽게 일어날 수 있도록 해주는 기구를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 8㎛ 크기의 다공성 막을 가지는 세포배양 삽입체 위에 인간 배아줄기세포 유래의 배상체를 올려서 약 1주일 간 배양한 결과, 아래로 이동한 세포에서 중간엽 세포의 특징인 피브로넥틴(Fibronectin)이 강하게 발현하는 반면 위부분에 남아 있는 세포에서는 상기 마커가 거의 발현되지 않는 것을 확인하였으며(도 1b), 이와 같은 결과는 본 발명의 세포배양 삽입체가 상피 중간엽 이행 현상을 통해 배아줄기세포로부터 중간엽 세포를 원척적으로 분리할 수 있다는 것을 증명하는 것이다.
As used herein, the term "cell culture insert" refers to a device having a porous membrane, and in the culture of embryonic stem cells or embryonic stem cell-derived embryonic bodies, an epithelial-mesenchymal transition occurs during embryonic development. . According to an embodiment of the present invention, the embryonic stem derived from human embryonic stem cells was placed on a cell culture insert having a porous membrane having a size of 8 μm, and cultured for about one week. While fibronectin was strongly expressed, it was confirmed that the marker was hardly expressed in the cells remaining in the upper part (FIG. 1B). Such a result shows that the cell culture insert of the present invention is embryonic through epithelial mesenchymal transition. It proves that the mesenchymal cells can be separated from the stem cells.
바람직한 일 실시 태양으로, 상기 단계(b)에서 삽입체 아래부분으로 이동한 중간엽 세포를 분리하는 단계에 있어서, 효소적 분리를 통해 단일 세포로 분리하는 방법, 또는 기계적 분리를 통해 단일세포화하지 않고, 상피세포 모양 시트로 분리하는 방법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 삽입체 아래부분으로 이동한 세포를 단일세포화하지 않고, 상피세포 모양 시트로 분리할 수 있다.In a preferred embodiment, in the step of (b) separating the mesenchymal cells that migrated to the lower part of the insert, the method for separating into single cells through enzymatic separation, or not single cell through mechanical separation. However, a method of separating into epithelial cell-like sheets may be used, but preferably, cells which have migrated to the lower part of the insert may be separated into epithelial cell-like sheets without single cells.
본 발명에서 용어, "효소적 분리"란 효소 처리를 통하여 세포 덩어리를 분리하는 것을 의미하며, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 콜라게네이즈 I, II, III, IV를 포함하는 콜라게네이즈(Collagense), 아큐타제(Accutase), 디스파제(Dispase) 또는 트립신-EDTA를 처리하여 분리하여 계대 배양할 수 있다.In the present invention, the term "enzymatic separation" means to separate the cell mass through the enzyme treatment, and methods known in the art can be used without limitation, preferably collagenase I, II, III, IV Collagenase (Collagense), Accutase (Accutase), Dispase (Dispase) or trypsin-EDTA containing and can be isolated and passage culture.
스크랩퍼를 이용하여 상피세포 시트 모양을 그대로 유지한 상태에서 옮겨 분리, 배양하는 것이 본 발명의 목적상 더 바람직하다.
It is more preferable for the purpose of the present invention to transfer, isolate and incubate the epithelial cell sheet in a state in which it is maintained using a scraper.
바람직한 일 실시 태양으로 상기 단계(c)에서 배아줄기세포 유래 중간엽 세포는 상기 단계(b)에서 분리한 상피세포 시트 모양을 그대로 유지된 상태에서 지속적으로 배양하여 얻을 수 있다. 상피세포 시트 모양세포 주위에 뻗어 나와 자라는 세포가 중간엽 세포인데, 이 세포를 얻기 위해 먼저 지속적으로 배양 후 남아 있는 상피세포 시트 모양의 세포를 스크랩퍼를 이용해 제거하고, 남아있는 중간엽 세포를 효소적 분리를 이용해 떼어낸 후 새로운 배양용기에 계대 배양하여 증식할 수 있다. 바람직하게는 상기 효소적 분리는 트립신-EDTA를 처리하여 분리하는 것일 수 있다. 이 때, 먼저 떼어낸 상피세포 시트 모양 세포는 버리지 않고 다음 계대를 위해 다시 이용할 수 있으며, 상기와 동일한 방법을 반복하여 중간엽 세포를 얻을 수 있다.In a preferred embodiment, the embryonic stem cell-derived mesenchymal cells in step (c) can be obtained by continuously culturing the epithelial cell sheet shape separated in step (b). The cells extending around epithelial sheet-like cells and growing are mesenchymal cells. To obtain these cells, the epithelial sheet-like cells are continuously removed using a scraper, and the remaining mesenchymal cells are removed by enzymes. It can be removed by redistribution and then propagated by passage in a new culture vessel. Preferably, the enzymatic separation may be separated by treating trypsin-EDTA. At this time, the epithelial cell sheet-like cells detached first can be used again for the next passage without discarding, and mesenchymal cells can be obtained by repeating the same method as described above.
본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명자들은 인간 배아줄기세포를 배양체 형성을 통해 초기 분화시킨 후 8㎛ 다공 크기를 가진 세포 배양 삽입체 위로 올려서 약 1주일 간 배양 후, 아래로 이동한 상피세포 모양 시트를 스크랩퍼를 이용해 긁어 낸 후 새로운 배양 접시에 옮겨 계대 배양하였으며, 지속적 배양을 통해 가장자리부터 중간엽 세포로 세포 모양의 변화가 일어나면서 뻗어나오는 것을 확인하였다. 뻗어나오는 중간엽 세포를 얻기 위해 뻗어나오지 않은 잉여의 상피세포 모양 시트를 걷어내고 남은 중간엽 세포를 트립신-EDTA를 이용해 계대 배양하였으며, 40계대 이상 배양해도 세포가 가지는 특징이나 염색체의 이상이 발견되지 않았다(도 2). 또한 염색체 분석을 통해 계대의 횟수와 기간에 상관 없이 정상적인 염색체의 특성을 갖는 것을 확인하였다(도 4). 이와 같은 결과는 성체 유래 줄기세포에 비해 배아줄기세포 유래 중간엽 세포가 계대의 제한성을 받지 않는다는 것을 입증하는 것이다. 또한 분리한 세포에 줄기세포 특이성을 가진 세포표면 항원들이 존재하는지 유세포분석을 실시한 결과, 중간엽 줄기세포 특이성을 지닌 CD90, CD73, CD105, CD44에 각각 70% 이상 양성반응을 보임으로써 분리된 세포가 중간엽 줄기세포임을 확인하였다(도 3a 및 도 3b). 이러한 세포표면 항원들의 발현은 몇 차례의 계대 배양을 한 후의 세포들에서도 동일하게 유지되는 특성을 보여 분리한 세포가 계대 배양을 하더라도 중간엽 줄기세포의 특이 항원들이 지속적으로 유지됨을 확인하였다. 아울러, 지방세포, 골아세포, 근육세포 등으로 분화하는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b). 또한 CD34, CD45등 조혈줄기세포 표지인자는 1% 미만으로 발현하지 않은 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b). 이와 같은 결과는 본 발명의 방법으로 분리한 중간엽 세포가 일반적인 중간엽 줄기세포가 가지는 다분화능을 가지는 것임을 뒷받침하는 것이다.
According to an embodiment of the present invention, the present inventors initially differentiated human embryonic stem cells through culture formation, and then placed on a cell culture insert having an 8 μm pore size and cultured for about one week, and then moved to the shape of epithelial cells. The sheet was scraped off using a scraper and transferred to a new culture dish for subculture, and it was confirmed that the cells were stretched from the edges to the mesenchymal cells through the continuous culture. In order to obtain outward mesenchymal cells, excess epithelial cells were not stretched out and the remaining mesenchymal cells were passaged using trypsin-EDTA. (FIG. 2). In addition, it was confirmed that the chromosome analysis had the characteristics of normal chromosomes regardless of the number and duration of passages (FIG. 4). These results demonstrate that embryonic stem cell-derived mesenchymal cells are not subject to passage limitations compared to adult stem cells. In addition, flow cytometry analysis of the presence of cell surface antigens with stem cell specificity in the isolated cells showed that the cells were isolated by showing more than 70% positive response to CD90, CD73, CD105, and CD44 with mesenchymal stem cell specificity. Mesenchymal stem cells were confirmed (Fig. 3a and 3b). The expression of these cell surface antigens remained the same in cells after several passages, confirming that specific antigens of mesenchymal stem cells were maintained even when the isolated cells were passaged. In addition, it was confirmed that the differentiation into adipocytes, osteoblasts, muscle cells and the like (Figs. 3a and 3b). In addition, it was confirmed that hematopoietic stem cell markers such as CD34 and CD45 were not expressed at less than 1% (FIGS. 3A and 3B). These results support that the mesenchymal cells isolated by the method of the present invention has the pluripotency that common mesenchymal stem cells have.
바람직한 일 실시 태양으로 본 발명의 방법은 상기 (b) 단계의 세포배양 삽입체 위에 있는 세포를 외배엽 세포 분화에 이용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the method of the present invention may further comprise using the cells on the cell culture insert of step (b) for ectoderm cell differentiation.
본 발명은 생체 내의 자연스러운 배아 발생 중에 일어나는 현상이 자연스럽게 유도되어, 세포배양 삽입체 아래로는 중간엽 세포가 분리되고, 삽입체 위에는 외배엽 세포가 남게 되어 이를 외배엽 세포의 분화에 이용될 수 있다.In the present invention, a phenomenon occurring during natural embryo development in vivo is naturally induced, so that the mesenchymal cells are separated below the cell culture insert, and the ectoderm cells remain on the insert, which can be used for differentiation of the ectoderm cells.
본 발명에서 용어 "외배엽 세포(Ectodermal cell)"란 상기 배아줄기세포 또는 배아줄기세포 유래의 배상체에서 유래된 외배엽 세포를 의미하고, 외배엽 줄기세포, 외배엽 전구세포를 포함한다. 또한, 테라토마가 제거된 고농도의 순수 외배엽 세포를 포함한다. 이와 같은 외배엽 세포는 표피, 신경계, 감각기관으로 분화할 수 있다.
As used herein, the term "ectodermal cell" refers to ectodermal cells derived from the embryonic stem cells or embryonic stem cells derived from embryonic stem cells, and includes ectoderm stem cells and ectoderm progenitor cells. Also included are high concentrations of pure ectoderm cells from which teratoma has been removed. Such ectoderm cells can differentiate into epidermis, nervous system and sensory organs.
바람직한 일 실시 태양으로, 본 발명의 방법은 분리된 중간엽 세포에 CD34 또는 CD45와 같은 조혈줄기세포 항원이 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one preferred embodiment, the methods of the present invention may further comprise detecting the presence of hematopoietic stem cell antigens such as CD34 or CD45 in the isolated mesenchymal cells.
이와 같은 검출은 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 유세포 분석이나 PCR 등을 이용해 분석할 수 있다. 이와 같이 조혈줄기세포 항원(1% 미만)이 검출되지 않는 것은 본 발명의 방법에 의해 분리된 중간엽 세포에 조혈줄기세포가 포함되지 않았음을 입증하는 것이다.
Such detection can use any known method without limitation, and can be analyzed using flow cytometry or PCR. Thus, the detection of hematopoietic stem cell antigen (less than 1%) is evidence that hematopoietic stem cells were not included in the mesenchymal cells isolated by the method of the present invention.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된 중간엽 세포에 관한 것이다.As another aspect, the present invention relates to mesenchymal cells isolated by the above method.
본 발명의 중간엽 세포에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.The mesenchymal cells of the present invention are as described above.
중간엽 세포는 바람직하게는 CD29, CD44, CD73, CD90 또는 CD105와 같은 중간엽 줄기세포의 표지인자인 세포표면 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다. 아울러, 상기 중간엽 세포는 배양 조건에 따라 중간엽 줄기세포, 중간엽 전구세포를 포함하는 중간엽 세포가 분화할 수 있는 다양한 세포로 분화가 가능하나, 그 예로 지방세포, 뼈, 연골, 근육세포, 골아세포로 분화할 수 있다.The mesenchymal cells are preferably characterized by the expression of cell surface antigens, which are markers of mesenchymal stem cells, such as CD29, CD44, CD73, CD90 or CD105. In addition, the mesenchymal cells can be differentiated into various cells capable of differentiating mesenchymal stem cells, including mesenchymal stem cells and mesenchymal progenitor cells, depending on culture conditions, for example, adipocytes, bone, cartilage, and muscle cells. Can differentiate into osteoblasts.
이와 같이 본 발명의 방법에 의해 분리된 중간엽 세포는 계대의 제한성 없이 중간엽 세포를 제조할 수 있으며, 이와 같은 중간엽 세포는 지방세포, 뼈, 연골, 근육세포, 골아세포로 분화될 수 있기 때문에 근골격계와 심혈관계의 심근재생, 폐섬유화 치료, 척추 손상, 뇌졸증, 뇌, 외상, 파킨스 병들의 치료에 적절한 세포 치료제로 사용될 수 있다.
As described above, the mesenchymal cells isolated by the method of the present invention can produce mesenchymal cells without restriction of passage, and such mesenchymal cells can be differentiated into adipocytes, bone, cartilage, muscle cells, and osteoblasts. Therefore, it can be used as a cell therapy for the treatment of musculoskeletal and cardiovascular myocardial regeneration, pulmonary fibrosis, spinal injury, stroke, brain, trauma and Parkinson's disease.
본 발명은 성체 유래 줄기세포인 중간엽 줄기세포의 새로운 세포 공급원인 인간 배아줄기세포로부터 중간엽 세포를 효율적으로 분리해 냄으로써, 세포공급원 및 세포 계대 배양의 제한성을 없앴으며, 기존의 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 분리방법보다 분리효율 및 분화능력을 크게 향상시키고, 비용을 절감하는 효과가 있다. 또한 다양한 질병의 세포 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.
The present invention efficiently isolates mesenchymal cells from human embryonic stem cells, a novel cell source of mesenchymal stem cells, which are adult stem cells, thereby eliminating the limitation of cell source and cell passage culture, and eliminating existing human embryonic stem cells. Compared to the derived mesenchymal stem cell separation method, the separation efficiency and differentiation ability are greatly improved and cost is reduced. It may also be used as a cell therapy for various diseases.
도 1a는 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 분리방법을 나타낸 도면으로, 세포배양 삽입체 사용 방법을 나타낸 모식도이다. 도 1b는 RT-PCR 실험으로 분화 세포 특이적 유전자 발현 유무를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 분리 배양한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 모양을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3a는 EGM2-MV 배양배지를 이용해 분리한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포를 유세포 분석기를 이용해 대표적인 중간엽 세포 혹은 중간엽 줄기세포 표지인자를 확인한 결과이다. 도 3b는 MEM-α 배양배지를 이용해 분리한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포를 유세포 분석기를 이용해 대표적인 중간엽 세포 혹은 중간엽 줄기세포 표지인자를 확인한 결과이다.
도 4는 20계대 이상 계대 배양한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 염색체를 확인한 결과이다.Figure 1a is a diagram showing a method for separating human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells, a schematic diagram showing a method for using a cell culture insert. Figure 1b is a diagram showing the results of observing the presence of differentiated cell-specific gene expression by RT-PCR experiment.
2 is a result of observing the shape of human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells isolated and cultured under a microscope.
Figure 3a is a result of confirming the representative mesenchymal cells or mesenchymal stem cell markers of human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells isolated using EGM2-MV culture medium using a flow cytometer. Figure 3b is a result of confirming the representative mesenchymal cells or mesenchymal stem cell markers of human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells separated using MEM-α culture medium using a flow cytometer.
Figure 4 is a result confirming the chromosome of human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells passaged more than 20 passages.
실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
The present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
<< 실시예Example 1> 인간 배아줄기세포 유래 1> derived from human embryonic stem cells 중간엽Intermediate lobe 세포의 분리 Isolation of Cells
인간 배아줄기세포를 정상산소 상태(37℃, 5% CO2 세포배양기)에서 배상체 형성을 통해 초기 분화시킨 후, 8㎛ 다공크기를 가진 세포배양 삽입체 위에 올렸다(도 1a). 올릴 때는 적어도 5%의 FBS가 혼입된 EGM2-MV 배양배지(LONZA, Clonetics EBM-2, Cat No.CC-3156, LONZA, Clonetics EGM2-MV Single Quotes Cat No. CC-4147)를 사용하였다.Human embryonic stem cells in the normal oxygen state (37 ℃, 5% CO 2 After initial differentiation through embryoid body formation in a cell culture phase), the cells were placed on a cell culture insert having an 8 μm pore size (FIG. 1A). When raised, EGM2-MV culture medium (LONZA, Clonetics EBM-2, Cat No. CC-3156, LONZA, Clonetics EGM2-MV Single Quotes Cat No. CC-4147) containing at least 5% FBS was used.
상기 올려진 초기 배상체를 약 일주일간 세포배양 삽입체 위에서 배양하였다. 이와 같은 배양으로 세포가 배양 삽입체 아래로 이동하였다. 이 때 상피 중간엽 이행의 패턴을 RT-PCR로 확인하였다. 각각의 유전자에 대한 프라이머 염기서열 및 RT-PCR 조건을 하기 표 1에 표시하였다.The raised initial embryoid bodies were incubated on the cell culture inserts for about a week. This culture caused the cells to move down the culture insert. At this time, the pattern of epithelial mesenchymal transition was confirmed by RT-PCR. Primer sequences and RT-PCR conditions for each gene are shown in Table 1 below.
번호order
number
30
30
30
그 결과, 위 아래 세포 모두 전분화능 표지인자인 Oct4, Nanog의 발현이 감소하였고, 상피 중간엽 이행 시 상피세포 표지인자인 E-cadherin은 세포배양 삽입체 위 아래 모두에서 분화와 동시에 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 중간엽 세포 표지인자인 Fibronectin은 삽입체 위 부분에 남아있는 세포에서는 발현하지 않는 반면 아래부분으로 이동한 세포에서는 강하게 발현하였다(도 1b). 이와 같은 RT-PCR 결과는 세포배양 삽입체에 의한 상피 중간엽 이행 현상을 통해 배아줄기세포로부터 중간엽 세포를 원천적으로 분리할 수 있다는 것을 증명하는 것이다.As a result, the expression of Oct4 and Nanog, which are pluripotent markers, was decreased in both the upper and lower cells, and E-cadherin, which is an epithelial cell marker, decreased simultaneously with differentiation both above and below the cell culture insert. It was. In addition, Fibronectin, a mesenchymal cell marker, was not expressed in the cells remaining above the insert, but strongly expressed in the cells moved downward (FIG. 1B). These RT-PCR results demonstrate that mesenchymal cells can be originally isolated from embryonic stem cells through epithelial mesenchymal transition by the cell culture insert.
이렇게 아래로 이동한 세포시트를 스크랩퍼를 이용해 조심스럽게 긁어낸 후 새로운 배양접시에 옮겨 계대 배양하였다(도 1a).
The cell sheet thus moved down was carefully scraped off using a scraper, and then transferred to a new culture dish and passaged (FIG. 1A).
<< 실시예Example 2> 인간 배아줄기세포 유래 2> derived from human embryonic stem cells 중간엽Intermediate lobe 세포의 배양 및 증식 Cell Culture and Proliferation
상기 실시예 1에서 옮긴 상피세포 모양 시트세포는 지속적 배양을 하면 가장자리부터 중간엽 세포로 세포 모양의 변화가 일어나면서 뻗어나오는데, 이러한 세포를 얻기 위해 우선 뻗어나오지 않은 잉여의 상피세포 모양 시트를 걷어내는 것이 중요하다. 걷어낸 후의 상피세포 모양 시트를 계대하면 지속적으로 중간엽 세포를 얻을 수 있으므로 제거하되 버리지 않고 사용할 수 있다. 이렇게 걷어내고 남은 중간엽 세포는 트립신-EDTA를 사용해서 세포를 떼어내어 계대 배양하였다. 계대 시 세포의 수는 2x104/cm2 정도가 적당하였다. 실제로 20계대 이상 배양해도 세포가 가지는 특징이나 염색체의 이상 등은 발견되지 않았다(도 2).The epithelial sheet cells transferred in Example 1 are stretched as the cell shape changes from the edge to the mesenchymal cells when the continuous culture is carried out, and in order to obtain such cells, first, the excess epithelial sheet is removed. It is important. Subsequent passage of the epithelial cell sheet after harvesting yields mesenchymal cells continuously and can be used without removal. The remaining mesenchymal cells were removed and passaged using trypsin-EDTA. At passage, the number of cells was about 2x10 4 / cm 2 . Indeed, even when cultured for 20 passages or more, the characteristics of the cells, abnormalities of chromosomes, and the like were not found (FIG. 2).
상기 결과는 본 발명에 사용된 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포가 성체유래 줄기세포에 비해 계대의 제한성을 받지 않으며, 기존에 보고된 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하는 방법보다 더욱 획기적이고 효과적이라는 것을 보여준다.
The above results indicate that the human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells used in the present invention do not have the restriction of passage compared to adult stem cells, and have been reported to separate and culture human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells. It is more innovative and effective.
<< 실시예Example 3> 분리한 3> Separated 중간엽Intermediate lobe 세포 특성 및 Cell properties and 다분화능Multiplicity 검증 Verification
유세포 분석기를 이용하여 표지인자의 발현을 확인하였다. 확인 방법은 다음과 같다. 1) 트립신-EDTA를 사용하여 떼어낸 세포들을 5×105 cells/㎖의 농도로 PBS(Phosphate buffered saline)에 부유시켰다. 2) 중간엽 줄기세포에 CD90, CD73, CD105, CD44, CD34, SSEA-4, HLA-ABC, HLA-DR, PDGF-alpha, PDGF-Beta 항체를 첨가하여 45분간 실온에서 반응시켰다. 3) 대조군으로 anti-mouse monoclonal 항체를 5X105 cells/㎖ 농도의 세포에 더하여 45분간 실온에서 반응시켰다. 4) 반응시킨 세포들은 FACS Calibur(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 상에서 분석하였다.Flow cytometry was used to confirm the expression of markers. The confirmation method is as follows. 1) Cells detached using trypsin-EDTA were suspended in PBS (Phosphate buffered saline) at a concentration of 5 × 10 5 cells / ml. 2) CD90, CD73, CD105, CD44, CD34, SSEA-4, HLA-ABC, HLA-DR, PDGF-alpha, PDGF-Beta antibody were added to mesenchymal stem cells and reacted at room temperature for 45 minutes. 3) As a control, anti-mouse monoclonal antibody was added to 5 × 10 5 cells / ml cells and reacted at room temperature for 45 minutes. 4) Reacted cells were analyzed on FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA).
그 결과, EGM2-MV, MEM-α 배양액을 이용하여 분리한 중간엽 세포는, 중간엽 세포가 갖는 일반적 특성인 CD90 표지인자의 경우 EGM2-MV 배양배지 조건과 MEM-α 배양배지 조건에서 발현 정도의 차이를 보였다. CD73, 105, 44 등의 표지인자는 강하게 발현되었고, 두 가지 배양조건 모두 지방세포, 골아세포, 근육세포 등으로 분화하였다(도 3a 및 3b). 또한 CD34, CD45 등 조혈 줄기세포 표지인자는 발현되지 않았다. 이것은 상기 방법으로 분리한 중간엽 세포가 일반적인 중간엽 줄기세포가 가지는 특성 및 다분화능을 포함하고 있음을 시사하는 것이다.
As a result, the mesenchymal cells isolated using EGM2-MV and MEM-α cultures were expressed in CD90 labeling factor, which is a general characteristic of mesenchymal cells, under EGM2-MV culture medium and MEM-α culture medium. Showed a difference. Markers such as CD73, 105, 44, etc. were strongly expressed, and both culture conditions differentiated into adipocytes, osteoblasts, muscle cells, and the like (FIGS. 3A and 3B). In addition, hematopoietic stem cell markers such as CD34 and CD45 were not expressed. This suggests that the mesenchymal cells isolated by the above method contain the characteristics and multipotentiality of general mesenchymal stem cells.
<< 실시예Example 4> 염색체의 확인 4> Identification of chromosomes
계대의 횟수와 기간에 상관없이 정상적인 염색체의 특성을 갖는 것인지 여부를 확인하기 위하여 염색체 분석을 하였다. 확인 방법은 다음과 같다. 1) 10 ㎖의 배양액이 담긴 각 배양 용기에 100 ㎍/㎕ 농도의 콜히친 용액 20 ㎕를 첨가하고 배양용기를 약하게 흔들어 잘 섞은 후, 37℃에 2시간 방치하였다. 2) 500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 3) 상층액을 제거하고 약간의 배양액만을 남겼다. 4) 5 ㎖의 저장액(0.075 M KCl)에 세포를 부유시킨 후 37℃ 항온수조에 25분간 방치하였다. 5) 각 튜브에 새로 준비한 고정액(methanol : glacial acetic acid=3:1, v/v)을 5방울씩 첨가하고 튜브를 1~2회 약하게 섞어준 후 1,200 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 6) 상층액을 제거한 후 5 ㎖의 고정액에 세포를 가볍게 두드려 부유시킨 후 상온에 10분간 방치하였다. 7) 5~6 과정을 2회 반복한 후 0.5 ㎖의 고정액에 부유시켰다. 8) 차가운 70% ethanol에 담가 둔 슬라이드 글라스 위에 세포 부유액을 한 방울 떨어뜨렸다. 9) 알코올 램프 위에서 슬라이드의 ethanol을 건조시킨 후 공기 중에서 물기를 말렸다. 10) 5% Giemsa 용액에 12분간 담가두었다. 11) 슬라이드 글라스를 뒤집은 후 증류수로 염색액을 씻어냈다. 12) 공기 중에서 건조한 후 커버슬립을 덮고 현미경으로 관찰하였다.The chromosome analysis was performed to determine whether the chromosome had normal chromosome characteristics regardless of the number and duration of passages. The confirmation method is as follows. 1) 20 μl of colchicine solution at 100 μg / μl concentration was added to each culture vessel containing 10 ml of culture solution, and the culture vessel was gently shaken well and left at 37 ° C. for 2 hours. 2) Centrifuged for 5 minutes at 500 rpm. 3) The supernatant was removed and only a slight culture left. 4) The cells were suspended in 5 ml stock solution (0.075 M KCl) and left in a 37 ° C. constant temperature water bath for 25 minutes. 5) 5 drops of freshly prepared fixatives (methanol: glacial acetic acid = 3: 1, v / v) were added to each tube, and the tubes were mixed gently once or twice, followed by centrifugation at 1,200 rpm for 8 minutes. 6) After removing the supernatant, the cells were suspended by gently tapping the cells in 5 ml of fixed solution and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. 7) After repeating the process 5-6 twice was suspended in 0.5 ml fixed solution. 8) A drop of cell suspension was added to the slide glass soaked in cold 70% ethanol. 9) The ethanol of the slides was dried on an alcohol lamp and dried in air. 10) Soak in 5% Giemsa solution for 12 minutes. 11) After flipping the slide glass, the dye solution was washed with distilled water. 12) After drying in air, the coverslip was covered and observed under a microscope.
그 결과, 계대의 횟수와 기간에 상관없이 정상적인 염색체의 특성을 갖는 것을 확인하였다(도 4).As a result, it was confirmed that the characteristics of the normal chromosome regardless of the number and duration of passages (Fig. 4).
<110> CHABIO&DIOSTECH CO., LTD. <120> Method for isolating primary mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells using cell insert culture system <130> PA100739KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Oct4 <400> 1 aactcgagca atttgccaag ctcc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Oct4 <400> 2 ttcgggcact gcaggaacaa attc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nanog <400> 3 caaaggcaaa caacccactt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nanog <400> 4 tctgctggag gctgaggtat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-cadherin <400> 5 attcagtaca acgacccaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-cadherin <400> 6 aaagtcctgg tcctcttctc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for fibronectin <400> 7 aagttcactc aggtcacacc caca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for fibronectin <400> 8 gttggatggt gcatcaatgg cagt 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 9 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 10 tccaccaccc tgttgctgta 20 <110> CHABIO & DIOSTECH CO., LTD. <120> Method for isolating primary mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells using cell insert culture system <130> PA100739KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Oct 4 <400> 1 aactcgagca atttgccaag ctcc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Oct 4 <400> 2 ttcgggcact gcaggaacaa attc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nanog <400> 3 caaaggcaaa caacccactt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nanog <400> 4 tctgctggag gctgaggtat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-cadherin <400> 5 attcagtaca acgacccaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-cadherin <400> 6 aaagtcctgg tcctcttctc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for fibronectin <400> 7 aagttcactc aggtcacacc caca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for fibronectin <400> 8 gttggatggt gcatcaatgg cagt 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 9 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 10 tccaccaccc tgttgctgta 20
Claims (16)
(b) 상기 단계 (a)의 세포배양 삽입체 아래로 이동한 중간엽 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 분리된 중간엽 세포를 증식 배양하는 단계를 포함하는, 중간엽 세포의 분리 배양 방법.
(a) culturing an embryonic stem cell or an embryonic body derived from an embryonic stem cell on a cell culture insert having a porous membrane;
(b) separating the mesenchymal cells that have migrated under the cell culture insert of step (a); And
(c) propagating and culturing the isolated mesenchymal cells of step (b).
The method of claim 1, wherein the cell culture insert has a porous membrane of 6 to 12 μm in size.
The method of claim 1, wherein the embryonic stem cells are mammalian.
The method of claim 1, wherein the mesenchymal cells comprise mesenchymal stem cells or mesenchymal progenitor cells.
The method of claim 1, wherein the method for separating mesenchymal cells of step (b) is to separate into single cells through enzymatic separation.
The method of claim 1, wherein the method of separating the mesenchymal cells of step (b) is to separate into epithelial cell-like sheets, without a single cell using a scraper.
The method according to claim 6, wherein the epithelial cell sheet is separated in step (b), and the epithelial cell sheet is first isolated in step (c), and then passaged and cultured by enzymatic separation.
8. The method of claim 7, wherein the first isolated epithelial cell sheet is used again for the next passage.
The method of any one of claims 1 to 8, further comprising using cells on the cell culture insert of step (b) for ectoderm cell differentiation.
The method of claim 1, wherein the cell culture comprises at least 5% Fetal bovine serum (FBS) or at least 5% Serum replacement (SR) in the culture medium.
The method of any one of claims 1 to 8, wherein the medium used for culturing the cell comprises EGM2-MV, DMEM or MEM-α medium.
The method of claim 1, wherein the method further comprises detecting whether hematopoietic stem cell antigen, CD34 or CD45, is present in the isolated mesenchymal cells.
A mesenchymal cell isolated by the method of any one of claims 1 to 8.
The cell of claim 13, wherein the mesenchymal cells comprise mesenchymal stem cells or mesenchymal precursor cells.
The mesenchymal cell of claim 13, wherein the isolated mesenchymal cell expresses a CD29, CD44, CD73, CD90, or CD105 cell surface antigen.
The mesenchymal cell of claim 13, wherein the isolated mesenchymal cell is differentiated into adipocytes, bone, cartilage, muscle cells or osteoblasts by culturing.
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