KR20120061081A - 새로운 노화 방지 물질 및 그 확인 방법 - Google Patents

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KR20120061081A
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Abstract

본 발명은 새로운 노화 방지 물질 및 그 확인 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 새로운 노화 방지 물질 감지 또는 확인 방법은 노화 세포 모델 시스템에 반하여(against) 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 노화 세포 모델 시스템(senescence model syste)에 반하여 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 그에 따른 노화 방지 활동을 관찰하는 것을 포함한다.
본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 미토콘드리아 생물 발생 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함한다. 뿐만아니라, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 AMPK 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함한다.

Description

새로운 노화 방지 물질 및 그 확인 방법{Novel Anti-aging Agents and Methods to Identify Them}
본 발명은 새로운 노화 방지 물질, 상기 물질을 감지 또는 확인하는 새로운 방법 및 상기 확인된 노화 방지 물질을 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지 및/또는 치료하기 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 새로운 생물학적 샘플 내의 노화 방지 물질의 노화 방지 생물학적 농도를 측정하기 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지 또는 치료하기 위한 칼로리 억제를 모방하는 노화 방지 물질로서, 다른 라파마이신 표적(target of rapamycin, TOR) 억제제 중, 적은 투여량의 라파마이신(rapamycin) 또는 그 상사 물질을 사용하는 것에 대해 소개한다.
노화된 사람에게는, 예를 들어 일부를 논하자면, 이 중 많은 병이 여전히 효과적인 예방법 또는 치료법이 없는, 암, 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중, 심부전 및 심장 마비 등, 많은 질병 또는 상태가 도드라지게 되기 때문에, 인간의 노화 과정에 대한 연구는 중요하다. 따라서, 동물의 노화 과정에 대한 연구를 통해 노화에 수반되는 질병 또는 장애에 대한 효과적인 예방법 또는 치료법을 탐색하는 것은 지난 세기에 걸쳐 과학 커뮤니티가 직면한 가장 중요한 노력 중 하나가 되었다. 비록 풍부한 문학 작품이 노화 과정에 대한 이해에 공헌하였음에도 불구하고, 이러한 과정에 대한 완전한 이해는 인간이 직면한 주요 과학적 도전 과제로 남아있다. 전 세계에 걸쳐 노년층의 인구가 증가하고 이에 따른 의료 서비스 부담 및 비용이 증가함에 따라, 노화에 수반되는 질병 또는 장에의 예방 또는 치료를 위한 노화 방지 물질의 효과적인 발견을 가져오는 노화 과정에 대한 체계적인 연구가 점점 더 중요해 지고 있다. 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애의 효과적인 예방 및/또는 치료로 발전 가능한 노화 방지 물질의 발견을 위하여 효율적인 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 체계적인 접근법을 제시한다.
노화 과정과 관련된 여러 가지 이론 및 노화에 수반되는 질병의 치료에 유용할 수 있는 이론으로부터 도출된 방법 중, 영양소 신호 경로(칼로리 억제, caloric restriction, CR), 미토콘드리아 경로(반응성 산소 종, reactive oxygen species, ROS) 및 말단소립 기능 장애 이론이 도드라진다.
영양소 신호 경로 (칼로리 억제) 및 노화. 칼로리 억제(CR)는 이스트에서 포유류에 이르기까지 이들의 노화 속도를 지연시키는 가장 실현 가능한 방법이다. 칼로리 억제는 또한 영장류 모델에서의 파킨슨 병, 알츠하이머, Dahl-SS 래트 모델에서의 고혈압 및 심장 문제, 섬유증 및 신장병과 같은, 노화에 수반되는 질병의 발병을 감소시키거나 상기 질병의 시작을 지연시키는 것으로 알려졌다. 칼로리 억제는 또한 다양한 종류의 자발적 종양 형성을 억제하고 유방암, 결장암 및 전립선암의 발병을 감소시킨다.
잘 보호된 키나아제 TOR(target of rapamycin)은 이화 및 동화 작용을 조절하기 위하여 영양소, 분열 촉진 인자, 에너지 및 스트레스로부터의 신호를 통합한다. 최적의 분열 촉진 인자 및 영양소에 대응하여, 포유류 TOR(mTOR) 세포의 합성 능력(예를 들면, 리보좀 생물 발생 및 단백질 번역 개시)을 촉진하여, 세표 질량 및 크기의 증가 및 그 확산의 가속화를 초래한다. 정반대로, 성장 인자 회수를 통한 TOR의 억제, 영양소 부족 또는 스트레스는 큰 에너지 소비 과정의 하향 조절 및 확산 억제를 유발한다.
TOR 경로는 출아 효모, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 및 초파리(Drosophila)의 수명 연장에서 중요한 역할을 차지할 수 있다. TOR의 기능이 잘 보호된다면, 노화에서 TOR이 차지하는 역할이 인간에게도 적용될 수 있다.
미토콘드리아/ ROS 및 노화. 미토콘리아는 산화성 인산화 과정을 통해 물질 대사 연료를(예를 들어, 포도당 및 지방산)을 유용한 형태의 에너지, 아데노신 5’-3인산염(ATP), 로 변환하는 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 또한 칼슘 항상성, 세포간 신호 형질 도입 및 아포프토시스(apoptosis)의 조절을 포함한 완전한 세포의 기능을 위해 중요한 다른 과정들에 관여한다.
미토콘드리아에서의 ATP 생성을 위한 산화성 인산화 과정은 세포 내의 반응성 산소 종(ROS)의 주 원료이기도 하다(세포내의 총 ROS의 약 90%). 통상의 생리학적 상태에서는, 산화성 안산화 도중 새어나온 ROS는 상기 과정 중 소비된 산소의 1-5%를 나타내는 것으로 추정된다. 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 제한적인 수리 능력과 산화제에의 근접성에 의해, 미토콘드리아는 손상이 축적되는 것에 특히 취약하다. 그리고 나서 mtDNA의 돌연변이가 산화성 인산화의 기능에 손상시키는 결과를 가져오고, 이로 인해 ROS 생성의 증가 및 추후 더 많은 돌연변이의 축적이 초래된다. ROS 분자의 반응성이 매우 크고 세포 내에서 여러가지 손상을 유발할 수 있는 바, ROS의 잔인한 사이클은 노화 중 노화 과정을 특징 짓는 점진적 기능 감소를 야기하는 산화성 손상의 기하학적인 증가에 책임이 있다고 여겨진다.
ROS는 예를 들어, 당뇨, 심장혈관계 질병, 암 및 파킨슨 병과 같은 많은 노화에 수반되는 질병과 관련되어 있을 수 있다. 진핵생물이 호스트 반-산화제 방어 시스템을 발전시킨다는 사실 또한 내생(內生)의 ROS 생산 및 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스의 오버익스프레션(overexpression)의 중요한 역할을 뒷받침하고, 카탈라아제는 노랑 초파리(Drosophila melanogaster)의 수명을 연장시킨다.
이전 연구는 미토콘드리아의 온전성(integrity)이 나이에 대한 함수로 감소하고, 이는 미토콘드리아 멤브레인 포텐셜, 미토콘드리아 수 및 ATP 생성/산소 소비의 감소로 관찰됨을 나타낸다. 미토콘드리아 기능의 돌연변이는 시력상실, 움직인 장애, 치매, 심장혈관계 질병, 근육 약화, 신장 기능 장애 및 내분비계 장애를 포함한 임상적 징후를 가진 많은 인간 유전적 질병을 유발한다. 이뿐만 아니라, (mtDNA 폴리머라아제 PolgA에서의 교정 결핍(proof-reading-deficient) 돌연변이에 의한) 미토콘드리아 DNA 돌연변이의 극적인 증가를 보이는 마우스는, 특정한 시기상조의 노화 표현형을 동반한, 더 짧은 수명을 보이는 것이 보고되었다. 게다가, C. Elegans에서의 포도당 제한을 통한 TOR1의 삭제에 따른 이스트의 수명(chronological life span) 연장은 미토콘드리아 호흡을 통하여 이루어지는 것으로 보고되었다. 이러한 결과들은 포유류의 노화 및 노화에 수반되는 질병에서의 미토콘드리아 기능의 중요한 역할을 나타낸다. 그러나, 모순된 결과도 보고된 바 있다. 예를 들어, 출아 효모의 CR 유발형 수명 연장은 미토콘드리아 기능과 관계가 없는 것으로 보고되었다. 따라서, 노화 과정에서의 미토콘드리아의 역할은 명확하지 않은 것으로 남아있다.
말단 소립 , 노쇠, 노화 및 암. 말단 소립(telomeres)은 하나의 가닥에 G가 자주 반복되는 DNA 염기 순서로 구성된 염색체의 끝단이다. 이러한 말단 소립은 두 가닥의 DNA가 자연적으로 갈라진 것(DSBs)으로 인식되는 것으로부터 보호하기 위하여 말단 소립 결합 단백질로 결합되어 있다.
기능 장애 말단 소립은 DNA 폴리머라아제에 통한 DNA 복제의 내부적인 문제에 기인한 점진적인 단축 및 인간의 대부분의 신체 세포 내의 말단소체복원효소(telomerase) 활동의 결핍에 의해 초래될 수 있다. 결국에는, 임계적으로 단축된 말단 소립은 말단 소립 단백질에 의해 결합 될 수 없고 따라서 DNA 손상 반응을 활성화시키고 RB-의존 세포 및 p53-의존 세포 사이클의 진행을 막는 현상을 초래하는 자연적인 DSBs 처럼 노출된다. 또한, 노쇠는 상기 DNA 손상 반응을 통한 종양 유전자(oncogene) 활성화에 의하여 초래될 수 있으며, 이는 종양 억제를 야기한다. 더불어, DNA 손상 물질 또한 노쇠를 촉발시킨다고 보고되어 왔다.
말단 소립 기능 장애는 말단 소립 결합 단백질에 결함이 있는 때에도 발생한다. 예를 들어, 말단 소립 1(POT1)의 단백질의 녹다운(knockdown)뿐만 아니라 주요-네거티브 TTAGGG 반복 결합 인자 2(TRF2)의 표출 또한 말단 소립 기능 장애 및 DNA 손상 신호를 야기한다.
긴 말단 소립은 인간의 장수와 관련되지만, 짧은 말단 소립은 암, 특발성의 폐 섬유증 및 다양한 조직 증식 기능 장애와 관련된다. 예를 들어, 인간의 말단 소립 돌연변이는 선천성 각하 이상증(Dyskeratosis congenital)를 유발하며 전형적인 골수 부전(不全)으로 환자들이 일찍 사망한다.
암 세포는 무제한의 복제 잠재력을 필요로 하는 바, 복제 노쇠는 종양 진행의 장벽으로서 보여져 왔다. 정말로, 마우스 모델 및 인간 암에서, 노화 세포 마커(marker)는 악성이 되기 전의 병소에서는 두드러지지만 진행된 암에서는 감지되지 않았다. 모든 암은 말단소체복원효소의 활성화 또는 이를 대체하여 재합성을 통해 말단 소립을 늘리는 것을 통하여 노쇠를 비켜간다. 초기 전립선 암의 악성으로의 진행은 노쇠로 인해 차단된다. 더불어, 말단 소립 돌연변이 마우스 Terc의 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 자연발생적인 종양형성은 p53-중재(mediated) 노쇠에 의해 억제된 것으로 보여졌다. 노쇠는 세포 사이클을 멈추게 하고 수리를 가능하게 함에 따라, 초기 병소의 발전을 차단하는 것으로 추측된다.
노쇠는 노화에 대한 주요 공헌자로 여겨진다. 예를 들어, 노쇠한 세포는 표유류 조직에서 나이와 함께 증가한다. 노쇠한 세포는 골관절염 및 아테롬성 동맥 경화증과 같은 노화에 수반되는 병리학에서 발견되어 왔다. 또한, 만성적으로 활성화된 p53은 마우스에서 세포의 노쇠를 촉진하고 또한 노화 표현형을 가속화한다. 더불어, 노쇠한 세포는 종양 진행 및 염증 반응을 가능하게 하는 비밀 단백질을 갖는 것으로 보여져 왔다. 프로그램된 노쇠는 노화에 수반되는 질병 및 제한된 수명을 초래한다고 제안되어 왔다. 따라서, 말단 소립의 관점으로부터의 노화 방지 연구는 현재 노쇠를 예방하는 것에 초점이 맞춰져 있다.
이러한 모든 연구에도 불구하고, 노화 과정에서의 말단 소립의 역할은 불명확하게 남아있다. 예를 들어, 마우스가 사람보다 더 긴 말단 소립을 갖지만 짧은 수명을 갖는 이유를 설명할 수 없다. 체세포 분열 후의 노화 과정에서 말단 소립이 작동하는지 여부 또는 어떻게 작동하는지가 명확하게 밝혀지지 않았다.
예를들어, 단백질 손상 축적 이론, DNA 돌연변이 축적 이론 및 줄기 세포 고갈 이론과 같은 다른 노화 이론들 또한 제안된 바 있다. 이 중에, 어떠한 이론들이 노화 과정의 진실을 나타내는지 및 상기 이론들이 관계되었는지 여부 및/또는 상기 이론들이 서로 어떻게 연관되는지는 여전히 명확하게 밝혀지지 않았다. 따라서, 적어도 어느 정도 까지는, 인간의 노화 과정은 미스터리로 남아있다.
암, 심장혈관계 질병 및 신경학적 퇴화 질병과 같은 노화에 수반된 질병 또는 장애는 인간의 사망을 초래하는 주된 원인이다. 이러한 노화에 수반되는 병 또는 장애를 치료하기 위한 약리학적 물질은 상기 노화 과정에 대한 제한적인 이해로 인해, 특정한 질병에 대한 현재 이해에 따라 탐색되고 있다. 그 결과, 오늘날까지도, 이러한 질병들은 서로 독립적으로 연구되어 왔고 노화 과정에서 분리되어 있었다. 따라서, 이러한 노화에 수반된 질병 또는 장애의 예방 및 치료를 위한 새로운 노화 방지 물질의 발견에 노화 과정에 기초를 둔 체계적인 접근을 발전시킬 필요가 있다.
본 발명이 해결하려는 과제는 노화 과정의 새로운 메커니즘 및 노화에 수반되는 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 위용한 노화 방지 물질을 확인 또는 감지하는 새로운 메커니즘에 기초한 새로운 방법을 개시하여 전술된 필요에 제공하는 것이다.
일 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 노화 세포 모델 시스템(senescence model syste)에 반하여 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 그에 따른 노화 방지 활동을 관찰하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 미토콘드리아 생물 발생 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 AMPK 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 노화 세포 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함하며, 상기 물질은 체세포분열 이후의 세포에서 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태를 유지하거나 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포 퇴화에 뒤따르는 세포 사망을 방지한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에 본 발명의 다른 견해중 어느 것에 설명된 어느 실시예에 따라 확인된 상기 물질을 포함한 구성 요소, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 말단 소립 및/또는 미토콘드리아의 퇴화와 관련된 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에 5’-아데노신 1인산염-활성화 단백질 키나아제(AMPK) 활성물을 포함하는 구성 요소, 또는 AMPK를 직접적 또는 간접적으로 활성화하고, 미토콘드리아 생물 발생을 증가시키며, 상기 대상의 노쇠 또는 체세포분열 이후 세포의 세포 사이클 정지 상태를 유지하는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에 라파마이신 표적(TOR) 억제제를 포함하는 구성 요소, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그를 투여하는 것을 포함하며, 상기 TOR 억제제는 (a) 복제 잠재력을 늘리거나, (b) 체세포분열 이후 세포의 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태를 유지하거나, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포 퇴화에 따라오는 세포 사망을 방지한다. 본 견해에 따른 바람직한 실시예에서는, 상기 TOR 억제제는 적은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질이다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플에서 노화 방지 물질을 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이스트 노화 세포 모델을 사용하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플에서 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이스트 노화 세포 모델 및 상기 노화 방지 물질의 기 수립된 표준 공식 또는 곡선을 사용하는 것을 포함한다.
또 다른 견해에 따르면, 본 발명은 미토콘드리아 기능이 말단 소립 기능 장애에 의해 유발되는 노쇠를 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것, 및 칼로리 억제(CR)은 TOR/AMPK/미토콘드리아 경로를 통하여 노쇠 상태의 퇴화를 방지한다는 것을 개시한다. 상기 메커니즘은 말단 소립 기능 장애의 이스트 및 인간 모델 모두에서 보존된다. 상기 보존된 메커니즘은 따라서 미토콘드리아의 기능을 촉진할 수 있고 따라서 노쇠의 퇴화를 방지 또는 치료할 수 있는 약을 탐색하기 위해 이스트 및 인간 모델에서 말단 소립 기능 장애의 사용을 허용한다.
본 발명의 다른 견해들 및 바람직한 구체적인 실시예들은 후술되는 실시예 및 청구항에 더 상세하게 기재된다.
본 명세서에서 개시된 새로운 방법은 여러 가지 잘 알려진 이스트 돌연변이 모델을 사용하여 높은 처리량 스크리닝을 통해 신속하게 새로운 노화 방지 물질을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 여러 가지 노화에 수반되는 질병 또는 장애의 효율적인 예방 및/또는 치료를 위해, 상기 개시된 방법을 이용하여 확인된 많은 다른 노화 방지 물질 중, 낮은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질의 사용을 설명한다.
많은 노화에 수반되는 질병들이 마토콘드리아 기능 장애 및/또는 말단 소립 기능 장애와 연결되어 있기 때문에, 상기 방법에 의해 확인된 물질은 잠재적으로 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 노쇠를 노화 과정에 주요한 공헌자로서 여김으로써 노쇠를 억제함에 주로 초점을 맞추는 현재 일반적으로 널리 퍼져있는 노화 방지 전략과 반대로, 본 발명은 노쇠를 유지하는 것을 통해 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 새로운 전략을 제시한다.
도 1은 영양소 신호를 제한하는 것은 cdc13-1p 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 억제함을 보여준다. (A) 포도당 제한 및 2-데옥시-포도당 치료는 집락형성능측정(colony formation assay)을 통해 측정되는바와 같이, cdc13p 비활성화에 의해 유발되는 세포 감소를 억제한다. 말단 소립 기능 장애를 유발하기 위해서, 신선한 하룻밤 동안 배양한 cdc13-1 배양균이 표시된 포도당 또는 2-데옥시포도당의 농도로 YEPD 배양액에 희석되고 24시간 동안 섭씨 37도로 배양되었다. 집락형성능측정을 위해, 처리된 세포는 그리고 나서 H2O에 10배로 연속으로 희석되고 5μL를 보통의 YEPD 판 위에 떨어뜨렸다. 상기 판은 생존한 세포들이 군집을 형성할 수 있도록 섭씨 24도에서 배양되었다. 살아있는 세포의 시작 개수 또한 상기 집락형성능측정을 통해 측정되었다. (B) 질소 억제는 집락형성능측정을 통해 관찰되는바와 같이, cdc13-1p 비활성화에 의해 유발되는 세포 사망을 억제한다. 세포는 합성된 배양액 (SC) 또는 SC-N(질소의 원천으로서의 아미노산 alc (NH4)2SO4가 없는 SC)에서 24시간 동안 섭씨 37도로 배양되었다. 1A에 설명된 바와 같이 집락형성능측정을 이용하여 살아 남은 세포의 개수가 측정되었다. (C-D) 적은 투여량(성장 억제 농도보다 적은)의 라파마이신(Rapa라고 표시됨)을 통한 TOR의 억제는 cdc13-1p 비활성화에 의해 유발되는 세포 사망을 방지할 수 있다. 세포는 YEPD 배양액에서 24시간동안 섭씨 37도로 표시된 농도의 라파마이신과 함께 배양되었다. 1a에서 볼 수 있듯이 집락형성능측정을 통해 살아 남은 세포의 수가 측정되었다. 성장 곡선을 위해, 신선한 하룻밤 동안 배양한 배양균이 YEPD 배양액에 희석되었고 표시된 농도의 라파마이신을 넣어 섭씨 24도에서 배양되었다. 세포 밀도(OD595)는 표시된 시간 지점에서 측정되었고 시간에 대하여 그래프가 그려졌다. (E) 집락형성능측정을 사용하여 생존한 세포의 수를 셈에 따라 측정된것과 같이, 성장이 정지된 dcd13-1 세포의 퇴화는 적은 투여량의 라파마이신(1nM) 및 포도당 제한(0.5%)에 의해 지연될 수 있다. 데이터는 세번의 실험의 평균을 나타낸다.
도 2는 영양소 신호가 G2/M에서의 세포 사이클 정지와 간섭하지 않지만, G2/M 정지 상태를 유지하고 cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 방지함을 보여준다. (A) 세포는 섭씨 37도에서 비활성화된 cdc13-1p로, YEPD 배양액, YEPD+1 nM 라파마이신 또는 0.5% 포도당과 함께한 YEPD, 에서 배양되었다. 표시된 시간 지점에서, 세포의 부분 표본이 꺼내지고 50% 에탄올로 섭씨 -20도에서 약 4시간 동안 고정(fixed)되었고, 그리고 나서 50mM Tris pH7.6내의 0.2mg/mL RNase A로 십씨 37도에서 하룻밤 동안 소화(digested)되었다. 세포들은 다음으로 50mN Tris pH7.6으로 세척되고 40μg/mL 프로테이나아제 K로 섭씨 55도에서 2시간 동안 처리되었다. 다시 한번 세척되고 난 후, 세포들은 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter) 분석에 앞서 100μg/mL 프로피디움(propidium) 요오드화물(iodide)로 20분 동안 어둠 속에서 착색되었다. (B) 세포 생존 측정은 2시간 동안 cdc13-1p의 비활성화에 의하여 유발된 G2/M 세포의 사망이 여전히 라마파이신 및 포도당 제한을 통해 방지될 수 있음을 보여준다. 세포는 먼저 2시간 동안 섭씨 37도로 배양된 후, 포도당 없이 최종적으로 0.5% 포도당을 만들도록, 37℃-YEPD 배양액, 1nM의 최종 농도를 만들기 위해 라파마이신을 넣은 YEPD, 또는 37℃-배양액에 희석되었다. 세포들은 22시간 동안 섭씨 37도에서 계속적으로 배양되었다. 생존한 세포들은 집락형성능측정을 이용하여 세어졌다.
도 3은 디하이드로로다민(dihydrorhodamine) 123 (Invitrogene) 착색을 뒤따르는 FACS 분석을 통해 측정된바와 같이 라파마이신(1nM) 및 감소된 포도당(0.5%)이 cdc13-1p의 비활성화를 통해 ROS 생성을 감소시키고 (A) 아넥신(annexin) V-FITC 결합을 뒤따르는 FACS 분석을 통해 측정된바와 같이 세포 괴멸(apoptotic) 마커 PS가 플립(flipping)을 감소시킴을 보여준다 (B). 세포는 도 1a 및 도 1c에서 설명된 것과 같은 환경에서 처리되었다. ROS 레벨을 측정하기 위해, 처리된 세포는 FACS 분석 전에 YEPD내의 5μg/mL 디하이드로로다민(dihydrorhodamine) 123와 1시간 동안 배양되었다. 각 샘플 당 10,000개의 세포가 분석되었다. PS 플립을 측정하기 위해, 처리된 세포는 1.1M의 소르비톨 및 2mg/mL의 지몰리아제를 포함하는 PBS 버퍼에 재부유(resuspended)되었고, 섭씨 37도에서 20분 동안 배양되었다. 그리고 나서 상기 세포는 1.1M 소르비톨을 포함한 PBS(Phosphate Buffered Saline)에서 아넥신(annexin) V-FITC 및 프로피디움(propidium) 요오드화물 (PI) (BD Biosciences Pharmingen)으로 착색되었고, FACS 분석이 이를 뒤따랐다. 각 샘플 당 10,000개의 세포가 분석되었다. 이러한 환경에서, PI-네거티브 개체수(population)는 온전한 세포를 나타내고, PI-포지티브-FITC 네거티브 세포는 세포 괴멸(apoptotic) 개체수를 나타내며, 그리고 PI-포지티브-FITC 포지티브 세포는 늦은 세포 괴멸 또는 괴사(necrosis) 개체수를 나타낸다.
도 4는 라파마이신 및 포도당 제한이 AMPK를 통한 cdc13-1p 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 방지함을 보여준다. (A) AMPK를 규제하는 서브유닛인 Sip2p의 제거는 포도당 제한의 방지 효과를 없앤다. (B) AMPK에 촉매작용을 하는 서브유닛인 Snflp 및 AMPK를 규제하는 서브유닛인 Sif4p의 제거는 라파마이신(1nM)의 방지 효과를 상당히 감소시킨다. Cdc13-1sip2::Kan, cdc13-1snf1::Kan 및 cdc13-1snf4::Kan 중복(double) 돌연변이 소질은 제거 라이브러리(Invitrogen, Carlsbadn CA)로부터의 싱글 제거 돌연변이(deletion mutant)를 cdc13-1과 짝짓는 것으로부터 생성되고, 이후 2배체를 형성하고 온도에 민감하고 G418(200μg/mL)-저항성을 지닌 군집을 선택하는 과정이 뒤따른다. 세포들은 도 1a 및 도 1c에서와 같이 처리된다. 생존한 세포들은 집락형성능측정에 의해 관찰되었.
도 5는 cdc13-1 세포 사망에 영양소 제한의 방지 효과에 미토콘드리아가 중요한 역할을 함을 보여준다. (A) 미토콘드리아 결핍은 라마파이신 및 포도당 제한의 방지 효과를 상당히 억제한다. 미토콘드리아가 결핍된 돌연변이 ρo는 cdc13-1에서 설명된 것과 같이 이틀 동안 로그 기(log phase)로 YC 배양액을 포함한 에티듐에서 세포를 길러 생성되었다. 세포들은 도 1a 및 도 1c에 표시되고 설명된 것과 같이 처리되었다. 생존한 세포들은 집락형성능측정에 의해 관찰되었다. (B-C) 포도당 제한 및 라파마이신 처리는 미토콘드리아의 질량을 증가시킨다. YEPD, YEPD+ 라파마이신 (B) 또는 YEPD, 0.5% 포도당 YEPD (C)에서 신선하고 희석된 하룻밤동안 배양된 배양균이 로그 기로 4시간 동안 섭씨 24도에서 배양되었다. Mito Tracker Green FM을 이용하여 60% 에탄올이 고정된 세포들을 착색하여 미토콘드리아 질량이 측정되었고, FACS 분석이 이를 뒤따랐다.
도 6은 세포 사이클 정지 상태를 유지하고 cdc13-1 모델에서 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 세포 사망을 방지하기 위한 TOR, AMPK, 및 미토콘드리아를 통한 영양소 신호의 메커니즘을 나타낸다.
도 7은 노화 세포 WI-38(인간의 주된 섬유아 세포)의 상실이 50pM 라파마이신, 250μM AICAR, 20μg/mL EGCG, 1.6μg/mL GSE, 감소된 포도당(0.4% 에서 0.2%), 20μg/mL 빌베리 추출물(BE), 1μM AITC 및 12.5μM 2-데옥시포도당의 처리로 인해 방지됨을 보여준다. AICAR 및 감소된 포도당 처리는 2일-온/8일-오프 사이클로 세포와 함께 배양되었고, 반면 다른 물질들은 3일-온/7일-오프 사이클로 배양되었다. 상기 처리는 패시지(passage) 29에서 시작하였다. 배양액은 3일 마다 교체되었다. 패시지 31로부터 56일 후(노쇠), 세포들은 2% 포름알데하이드/0.2% 글루타르알데히드에 간단히 고정되었고 1 mg/mL 5-브로모-4-클로로-3-인도릴β-D-갈락토시드(X-gal)로 (40mM 구연산/인산 나트륨, pH 6.0, 5mM 칼륨 페로시안 화합물, 5mM 칼륨 페리시안 화합물, 150mM NaCl, 및 2mM MgCl2를 포함하는 버퍼에서) 18시간 동안 섭씨 37도에서 노화 세포 마커, 세포의 β-갈락토시다아제 활동(컬러 사진에서는 파란색이고 흑백 사진에서는 진한 회색)을 위해 착색되었다. 생존한 세포들은 현미경을 통해 관찰되었다.
도 8은 적은 투여량의 라파마이신이 미토콘드리아 질량을 증가시키고, 미토콘드리아 세포막 포텐셜을 향상시키며 인간 섬유아세포에서 ROS 레벨을 감소시킴을 보여준다. (A) 패시지 24의 WI-38 세포가 배양균 배양액에서 2일 동안 다양한 투여량의 라파마이신과 함께 처리되었다. 미토콘드리아 질량을 측정하기 위해서, 상기 세포들은 섭씨 -20도에서 60% 에탄올로 고정되었고, 그리고나서 FACS 분석 전에 30분 동안 Mito Tracker Green FM (Invitrogene)으로 착색되었다. (B) 인간 림프모세포(lymphoastoid cells) L40가 이틀 동안 다양한 투여량의 라파마이신과 함께 처리되었다. 미토콘드리아 세포막 포텐셜 측정을 위해서, 상기 처리된 세포들은 5μg/mL JC-1(Invitrogen)로 어둠속에서 15분동안 착색되었다. 그리고 나서 세포들을 PBS로 한번 씻어낸 후, FACS 분석이 수행되었다. 광전자 배증관(photomultiplier)은 필터 1(FL-1 감지기)를 이용하여 JC-1 단량체의 녹색 형광물질(λem=525nm)을 감지하고 필터 2(FL2 감지기)를 이용하여 JC-1 중합체(aggregates)의 적색 형광물질(λem=590nm)을 감지하도록 세팅되었다. JC-1 중합체/단량체 비율 (적색/녹색 또는 FL2/FL1)은 세포막 포텐셜을 나타낸다. 데이터는 각 샘플 당 보통의 세포 개체수로부터 수집되었으며, 상기 보통의 세포 개체수는 앞서있는 소수(scatters) 및 옆에 있는 소수에 기초하여 비-처리 조절(non-treatment controls)에 따라 조절(gated)되었다. (C) ROS 측정을 위해, L40 처리된 세포들이 FACS분석 전에 2μg/mL 디하이드로로다민(dehydrorhodamine) 123으로 30분 동안 착색되었다. 위의 각각의 실험에서, 적어도 10,000개의 사건이 분석되었다. 데이터는 중복-실험의 평균을 나타낸다.
도 9는 오직 적은 투여량의 라파마이신(성장 억제 투여량 이하) 만이 노화 세포 WI-38의 손실을 방지함을 보여준다. (A) WI-38 세포들은 도 7에서 표시된 농도의 라파마이신으로 처리되었다. 상기 처리는 패시지 29에서 시작되었다. 세포들은 패시지 31에서 노쇠에 돌입한다. 노쇠에 돌입하고 65일 후, 생존한 세포들의 수가 MTT(3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브롬화물, 테트라졸) 착색을 통해 측정되었다. 미토콘드리아 환원 효소에 의해 생성된 MTT의 보라색은 마이크로플레잇 리더(microplate reader)를 통해 570nm로 읽혀졌다. 데이터는 세 개의 독립적인 중복-실험을 대표한다. (B) WI-38 세포의 성장에 라파마이신이 미치는 영향. 세포들은 도 7에서와 같이 배양되었다. 화사표는 라파마이신이 추가된 시점을 나타낸다. 25pM 라파마이신은 성장 속도에 거의 영향을 주지 않지만, 개체수 더블링(population doubling, PD)을 5.18에서 6.82로 높인다. 개체수 더블링은 다음과 같은 공식을 이용하여 계산되었다. PD=log(Nf/No)/log2, 여기서 Nf는 최종 세포 수이고 N-o는 처음에 심어진 세포의 수이다. 데이터는 두 개의 독립적인 중복-실험을 대표한다. (C) 적은 투여량의 라파마이신은 p53, p21 및 pRB의 단백질 레벨을 증가시킨다. 마지막 분열 이후 20일째 되는 날 (노쇠) 의 WI-38 세포들은 18시간 동안 라파마이신과 함께 처리되었다. 그리고나서 세포 용해물은 p53, p21 또는 pRB에 명확히 특정된 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통해 분석되었다.
도 10은 인간 림프모세포(lymphoastoid cells) L4를 (A) 10μM LY294002 (PI3K 억제제), 2μM 다이알릴 3황화물 (DATS), 1μM 벤질 아이소타이오사이안산염 (BITC), 1μM 페닐 아이소타이오사이안산염 (PITC), 2μg/mL 레스베라트롤 (RSV) 및 0.03μM 리코펜, 및 (B) 6.7μM PEITC, 5mM 실리비닌(silibinin), 1.25μM 아셀렌산염, 2.5mM 제니스테인, 250μg/mL 포도씨 추출물 (GSE), 50μg/mL EGCG, 3mg/mL 빌베리 추출물 (BE), 1μM AITC 50pM 라파마이신 250μM AICAR 및 감소된 포도당(0.4%에서 0.2%)와 함께 2일 동안 처리함으로써 그 미토콘드리아 질량이 증가되었음을 보여준다. 미토콘드리아 질량은 FACS 분석 전에 Mito Tracker Green FM으로 60% 에탄올로 고정된 세포를 착색함으로써 관찰되었다.
도 11은 많은 화학적 질병 예방(chemopreventive) 물질 또는 노화 방지 물질이 cdc13-1p의 비활성화에 의해 촉발된 세포 사망을 억제함을 보여준다. 6.7μM PEITC, 5mM 실리비닌(silibinin), 1.25μM 아셀렌산염, 2.5mM 제니스테인, 250μg/mL 포도씨 추출물 (GSE), 50μg/mL EGCG, 3mg/mL 빌베리 추출물 (BE)가 세포와 함께 30시간 동안 섭씨 37도에서 배양되었다. 생존한 세포가 허용 온도인 섭씨 24도에서 집락형성능측정을 통해 측정되었다.
도 12는 적은 투여량의 라파마이신 및 AICAR가 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA)에 의해 유발된 미토콘드리아 질량 감소를 뒤집음을 보여준다. NIH3T3 세포들은 DMEM 배양액 (10% FCS, 100units/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 2mM 글루타민이 추가된 DMEM)으로 DMSO, 10μM TPA, 1nM 라파마이신, 10μM TPA+1nM 라파마이신, 40μM AICAR, 또는 10μM TPA+40μM AICAR를 축혀 이틀동안 95%의 공기 및 5% CO2를 포함하도록 가습된 대기의 섭씨 37도에서 배양되었다. 그리고나서 세포들은 트립신에 의하여 채취되고 60% 에탄올로 고정되었다. 상기 세포들은 FACS 분석 전에 Mito Tracker Green FM으로 어둠 속에서 30분 동안 착색되었다. 데이터는 3배(triplica)-실험의 평균을 나타낸다.
도 13은 적은 투여량의 라파마이신 및 AICAR이 TPA에 의해 유발된 NIH3T3 종양 변환을 방지함을 보여준다. (A) 현미경으로 군집을 세기에 앞서 TPA(10μM)는 NIH3T3 세포와 함께 0.39% 소프트 세균 배양액(soft agar)에서 DMSO, 1nM 라파마이신 또는 250nM AICAR를 추가하여 7일 동안 배양되었다. (B) 데이터는 4번의 실험의 평균을 나타낸다.
도 14는 적은 투여량, 0.2 및 2pM, 의 라파마이신은 (A) 배양된 CGN 세포의 수명을 연장하고, (B) CGN 세포의 ROS 레벨을 감소시킴을 보여준다. 소뇌 그래뉼 뉴론 (cerebellar granule neuron, CGN) 배양균은 7일 된 래트 새끼로부터 준비되었다. 간단히 말해서, 뇌로부터 소뇌를 분리하여, 고운 조각으로 갈아. 15분 동안 섭씨 37도에서 트립신화하고, 40-μm 채를 통해 필터하고, 원심분리기를 통해 작은 알갱이로 뭉쳤다. 소뇌 그래뉼 뉴론은 포함한 상기 작은 알갱이들은 25mM KCl을 포함한 B27 신경기반 보강 배지에 재부유(resuspend) 되었다. 배양균에서의 수명을 위하여, 세포들은 24-웰 플레이트(1 플레이트/소뇌)에 심어졌고 B27, 20mM KCl, 0.5mM 글루타민, 100units/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신이 보강된 Neurobasal medium (Invitrogen)에서 배양되었다. 7일 후에 플레이트에 라파마이신이 추가되었다. 31일 후에, MTT 측정을 이용하여 뉴론 세포의 생존이 결정되었다 (A). ROS 분석을 위하여, Neurobal 완전 배양액 내의 부유(suspension) 배양균 내의 새로이 분리된 CGN 세포가 12x75mm 튜브에 1백만 세포/mL/tube의 밀도로 심어졌다. 상기 세포들은 20시간 동안 라파마이신과 함께 처리되었고 그리고나서 FACS 분석 전 2μg/mL 디하이드로로다민(dehydrorhodamine) 123으로 30분 동안 착색되었다 (B).
도 15는 적은 투여량의 라파마이신이 뇌졸중의 래트 모델에서 뇌경색 부피를 감소시킴을 보여준다. (A) 라파마이신 (10μg/kg)가 뇌 손상을 감소시켰다. 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)의 중간 뇌 동맥(middle cerebral artery, MCA) 혈관 폐색 모델이 사용되었다. SHR-SP 래트가 랜덤하게 두 그룹(각 그룹에서 n=8)으로 분리되었다: 적절한 조절 DMSO 그룹 및 라파마이신 그룹. 라파마이신 및 조절 DMSO는 MCA 폐색 후 10분 뒤 투여되었다. MCA 폐색 24시간 후 뇌 샘플이 채취되었다. 코로날(coronal) 부위(2mm 두께)는 즉시 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화물 (TTC)로 착색되었다. 사망한 세포를 포함한 경색 부위는 착색될 수 없어 옅은 색인 반면, 살아있는 세포를 포함한 정상인 부분은 적색이다. 경색 부분 및 각 부위(양쪽 모두)의 반구 부분은 이미지 분석 시스템 (Microsystems Type DM LB2, Leica, Germany)을 통해 추적되고 정량화되었다. 경색 부피를 평가하는데 있어 나타날 수 있는 뇌 부종(edema)의 방해는 허혈성이 아닌(nonischemic) 동측 반구의 부피를 반대쪽 반구의 부피에서 빼는 표준 방법을 사용하여 보정되었다. 상기 경색 부분은 상기 반대쪽 반구의 퍼센테이지로 표현되었다. (B) 적은 투여량의 라파마이신은 허혈성 경색(ischemic infarction)에 의해 유발된 뇌 손상을 방지한다. 0, 0.3, 1, 3 및 10 μg/kg 라파마이신이 MCA 폐색 전에 SHR-SP 래트각 그룹 당 n=8)에게 20일 동안 투여되었다.
도 16은 적은 투여량의 라파마이신이 인간의 초기 섬유아세포(primary fibroblast) WI-38 세포(200μM MPP+가 사용됨)에서 MPP+에 의해 유발된 ROS 레벨을 감소시킴을 보여준다. 다양한 농도의 라파마이신이 추가된 MPP+ WI-38 세포와 함께 3일 동안 배양되었다. 세포는 FACS 분석 전 디하이드로로다민(dehydrorhodamine) 123으로 어둠 속에서 30분 동안 착색되었다.
도 17은 적은 투여량, 10μg/kg이지만 100μg/kg는 아닌, 의 라파마이신이 래트 모델에서 심근 경색(myocardial infarction, MI) 부피를 감소시킴을 보여준다. 200에서 250g의 수컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley, SD) 래트들이 사용되었다(각 그룹 당 n=10~12). MI 실험 전 3일 동안 0, 10 및 100μg/kg/day 투여량의 라파마이신이 투여되었다. 에테르 마취를 한 후, 심장이 꺼내어졌고, 왼측 앞쪽의 하향 동맥들이 폐로 유출되는 관과 좌심방 사이에 결찰되었다. 그리고나서 뛰고 있는 심장이 재빨리 통상의 위치로 되돌려지고, 흉곽이 닫혀지고, 그리고 공기가 제거되었다. 래트들은 우리 안으로 되돌려졌다. 관상 동맥 결찰 5시간 후, 래트들은 희생되었다. 좌심실이 분리되어 심장의 긴 축에 수직 방향으로 4에서 5 조각으로 잘려졌다. 상기 조각들은 니트로 블루 테트라졸륨 인산염 버퍼에서 착색되었다. 정상 조직은 파란색으로 착색된 반면, 괴저성 조직은 착색되지 않았다. 상기 착색된 조직 및 착색되지 않은 조직을 분리하여 따로 무게를 재었다. MI 크기는 좌심실 총 무게에 대한 비율로 표현되었다.
도 18은 포도당 또는 TOR이 다양한 조직에서 AMPK/ROS/미토콘드리아 경로를 통하여 노화에 수반되는 장애를 초래하는 노화 과정을 통제하는 모델을 보여준다.
도 19는 이스트에서 세포 생존 측정을 이용하여 노화 방지 집단을 확인하고 감지하기 위해 높은 처리량을 갖는 스크리닝을 하는 방법을 도시한다.
도 20은 이스트에서 ROS를 이용하여 노화 방지 집단을 확인하고 감지하기 위해 높은 처리량을 갖는 스크리닝을 하는 방법을 도시한다.
도 21은 이스트 돌연변이 cdc17-1 또는 cdc17-2를 이용하여 노화 방지 물질을 감지하는 실시예를 보여준다. 상기 돌연변이 세포들은 0, 1 및 3nM의 라파마이신을 포함한 신선한 YEPD 배양액, 또는 0.5％ 포도당 YEPD 배양액에 희석되고 22시간 동안 섭씨 37도에서 배양되었다. 그리고나서 세포들은 연속적으로 10배 희석되고 YEPD 플레이트에 떨어트려졌다. 상기 플레이트는 생존한 세포들로부터 형성되는 군집을 위하여 허용 온도인 섭씨 24도에서 배양되었다.
본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 및 치료하기 위하여 노화 방지 물질을 확인, 추적, 및 정제하는 새로운 방법 및 상기 물질의 용도에 대한 것이다. 본 발명은, 그 중에서도, 다음 발견에 기초한다: (1) 영양소 신호의 억제는 AMPK 및 차후의 미토콘드리아 경로를 통해 이스트의 말단 소립 기능 장애로 인해 유발된 세포 사이클 정지 상태를 연장시킴; (2) 적은 투여량의 라파마이신, 포도당 제한 및 AMPK 활성물은 미토콘드리아 기능을 촉진하고 인간의 초기 섬유아세포(primary human fibroblast)의 노쇠를 연장시킴; (3) 몇몇의 노화 방지 및 암 화학적 질병 예방(chemopreventive) 물질들은 미토콘드리아 기능을 촉진하고 이스트 및 인간 세포 모두에서 노화 세포의 손실을 억제함; (4) 많은 노화에 수반되는 질병 또는 장애가 미토콘드리아 및/또는 말단 소립의 기능 장애와 연관되어 있음; (5) 적은 투여량의 라파마이신은 소뇌 및 심근의 허혈성(ischemic) 경색을 방지하고, MPP+에 의해 촉발된 ROS를 감소시키며, 배양된 초기 뉴론 세포의 수명을 연장시키고 종양 세포 변환을 억제함.
제1 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 노화 세포 모델 시스템(senescence model syste)에 반하여 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 그에 따른 노화 방지 활동을 관찰하는 것을 포함한다.
상기 제1 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 방지 활동은 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정기 상태의 퇴화(deterioration)를 방지하는 것이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 방지 활동은 미토콘드리아 기능을 촉진, 향상 또는 유지하는 것이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 방지 활동은 미토콘드리아 또는 말단 소립 기능의 손실과 연관된 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지하는 것이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 방지 활동은 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 또는 세포자멸사(apoptotic death) 증가를 방지하는 것이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 기능 장애를 갖는 말단 소립을 포함하는 돌연변이 이스트이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 불충분한 말단 소립 활동은 보이는 인간의 초기 세포 라인(primary human cell line)이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 말단 소립 결합 단백질 또는 말단소체복원효소(telomerase)의 돌연변이 또는 결핍에 의한 말단 소립 기능 장애를 보이는 인간의 초기 세포 라인(primary human cell line)이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 화학 물질에 의해 초래되는 말단 소립 기능 장애 모델이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 종양 유전자(oncogene) 활성화 및/또는 DNA 손상 반응의 활성화에 의해 만들어진 모델이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 말단 소립 기능 장애를 보이는 마우스(mouse), 래트(rat) 또는 폼베(S. Pombe)의 세포 라인이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 이스트 세포의 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의해 세포 사이클이 정지한 상태에서 상기 이스트 세포를 포함한 화합물 또는 구성 요소를 배양하는 단계;
(b) 세포자멸(apoptotic) 분석을 이용하여 사망한 이스트 세포의 개체수를 측정하는 단계, 또는 대체적으로;
(c) 세포 사이클이 정지한 상태를 제거하고 생존한 세포의 수를 측정하는 단계; 및
(d) (b)단계로부터 얻은 죽은 세포의 개체수 또는 (c)단계로부터 얻은 생존한 세포의 수를 상기 화합물 또는 구성 요소를 제외한 채 (a)단계와 동일한 환경 아래의 통제 실험으로부터 얻은 죽은 세포의 개체수 또는 생존한 세포의 수와 각각 비교하는 단계를 포함하고,
통제 실험과 비교하여 (b)단계로부터 얻은 죽은 이스트 세포의 감소된 개체수 또는 (c)단계로부터 얻은 생존한 세포의 증가된 수는 상기 배양된 화합물 또는 구성 요소가 노화 방지 물질의 후보임을 나타낸다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 일정 기간 동안 포유류의 노화 세포가 포함된 화합물 또는 구성 요소를 배양하는 단계;
(b) 생존한 노화 세포의 개체수를 측정하는 단계; 및
(c) (b)단계의 상기 생존한 포유류 노화 세포의 개체수를 통제 실험으로부터 얻은 생존한 노화 세포의 개체수와 비교하는 단계를 포함하고,
통제 실험과 비교하여 생존한 노화 세포의 증가된 개체수는 상기 배양된 화합물 또는 구성 요소가 노화 방지 물질의 후보임을 나타낸다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 일정 기간 동안 정상 성장하는 인간 세포를 포함하는 화합물 또는 구성 요소를 배양하는 단계;
(b) 미토콘드리아 질량, 미토콘드리아 DNA 내용 또는 미토콘드리아 전사 요소의 표현을 측정함으로써 인간 세포의 미토콘드리아 생물 발생(biogenesis)을 측정하는 단계; 및
(c) (b)단계로부터 얻은 결과를 통제 실험으로부터 얻은 결과와 비교하는 단계를 포함하고,
통제 실험과 비교하여 (b)단계로부터 얻은 향상된 미토콘드리아 생물 발생은 상기 배양된 화합물 또는 구성 요소가 노화 방지 물질의 후보임을 나타낸다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 위 세가지 실시예에서 묘사된 단계의 어떠한 조합이든 모두 포함한다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 cdc13-1, cdc13-2, stn1-1, cdc17-1, cdc17-2, hdf1, hdf2, est1, est2 및 est3으로부터 선택된 기능 장애를 갖는 말단 소립을 포함한 돌연변이 이스트이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 불충분한 말단 소립 활동을 보이는, 섬유아세포(fibroblast), 내피 세포(endothelial cell) 및 상피 세포(epithelial cell) 중 적어도 하나를 포함하는 인간의 초기 세포 라인이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 말단 소립 기능 장애를 보이는, TRF2, POT1, TERT, TERC 또는 WRN의 돌연변이를 포함하는 인간의 초기 세포 라인이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 모델 시스템은 블레오마이신(bleomycin), 아드리아마이신(adriamycin) 및 G-4중 리간드(G-quadruplex ligands)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 물질에 의해 초래된 말단 소립 기능 장애 모델이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적으로 증식하는 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-퇴행성 장애이다.
상기 제1 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 각각 포함된다. 따라서, 본 발명의 더 바람직한 실시예는 복수의 화합물 또는 구성 요소를 높은 처리량(high throughput)으로 스크리닝 하는 것을 포함한다.
제2 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함하며, 상기 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 체세포분열 이후의 세포에서 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태의 퇴화를 뒤따르는 미토콘드리아의 퇴화 또는 세포 사망을 방지한다. 본 견해는 상기 노화 방지 활동이 노화 세포를 유지하는 효과를 가진 TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로의 어느 구성요소에 관한 것이라는 점에서 제1 견해와 연관된다.
상기 제2 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 퇴화, 노화 세포 및 체세포분열 후의 세포의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화에 뒤따른 세포 사망, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관이 있다.
상기 제2 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로의 구성 요소는 인슐린/IGF, 인슐린/IGF 수용기, PI3K, PDK1, PTEN, TSC1, TSC2, AKT, Rheb, 랩터(raptor), GβL, S6K, TOR, AMPK, STRAD, MO25, LKB1, 포도당 흡수(uptake), 아미노산 흡수, CaMKKβ, PGC-1α, PGC-1β, NRF-1, NRF-2, TFAM, TFB1M, TFB2M, ERRs (예를들어, ERRα, ERRβ 및 ERRγ), PPARs (예를 들어, PPARα, PPARδ 및 PPARγ), SIRT1, RIP140, PRC, POLRMT, ATM, p53, p21, p19ARF, WAF1, P16INK4a, pRB, E2F, PTEN 및 p27KIP1을 포함한다.
상기 제2 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제2 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속한다.
제3 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 미토콘드리아 생물 발생(biogenesis) 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한(against) 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함하고, 상기 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지한다. 본 견해는 상기 노화 방지 활동이 노화 세포를 유지하는 효과를 갖는 미토콘드리아 생물 발생 경로의 어느 구성 요소에 반한(against) 것이라는 점에서 제1 견해와 연관된다
상기 제3 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 및 체세포분열 후의 세포의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화에 뒤따른 세포 사망, 노화 세포 퇴화, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관이 있다.
상기 제3 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 미토콘드리아 생물 발생 경로의 구성 요소는 AMPK, STRAD, MO25, LKB1, CaMKKβ, PGC-1α, PGC-1β, NRF-1, NRF-2, TFAM, TFB1M, TFB2M, ERRs (예를들어, ERRα, ERRβ 및 ERRγ), PPARs (예를 들어, PPARα, PPARδ 및 PPARγ), SIRT1, RIP140, PRC 및 POLRMT를 포함한다.
상기 제3 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제3 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속한다.
제4 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 AMPK 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한(against) 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함하며, 상기 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 체세포분열 이후의 세포에서 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태의 퇴화를 뒤따르는 미토콘드리아의 퇴화 또는 세포 사망을 방지한다. 본 견해는 상기 노화 방지 활동이 노화 세포를 유지하는 효과를 갖는 AMPK 경로의 어느 구성 요소에 반한(against) 것이라는 점에서 제1 견해와 연관된다
상기 제4 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 퇴화, 노화에 수반되는 세포 손실, 또는 종양 형성 및 암의 악성 발전과 연관이 있다.
상기 제4 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 AMPK 경로의 구성 요소는 AMPK, ATM, LKB1, STRAD, MO25 및 CaMKKβ를 포함한다.
상기 제4 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제4 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속한다.
제5 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소들을 스크리닝하는 것 및 노화 세포 경로 중 적어도 하나의 요소에 반한(against) 상기 합성물 또는 구성 요소들의 활동을 감지하는 것을 포함하며, 상기 물질은 체세포분열 이후의 세포에서 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태를 유지하거나 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포 퇴화에 뒤따르는 세포 사망을 방지한다. 본 견해는 상기 노화 방지 활동이 노화 세포를 유지하는 효과를 갖는 노화 세포 경로의 어느 구성 요소에 반한(against) 것이라는 점에서 제1 견해와 연관된다
상기 제5 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 퇴화, 노화 세포 및 체세포분열 후의 세포의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화에 뒤따른 세포 사망, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관이 있다.
상기 제5 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화 세포 경로의 구성 요소는 ATM, p53, p21, p19ARF, WAF1, p16INK4a, pRB, E2F, PTEN 및 p27KIP1를 포함한다.
상기 제5 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제5 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속한다.
제6 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에 전술된 것과 같은 본 발명의 제1 내지 제5 견해중 어느 실시예에 따라 확인된 상기 물질을 포함한 구성 요소, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그를 투여하는 것을 포함한다. 본 견해는 따라서 본 명세서에 설명된, 본 개시에 포함된 노화에 수반되는 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약제의 준비 또는 제조 방법에 의하여 확인된 노화 방지 화합물 또는 구성 요소의 용도를 모두 아우른다.
상기 제6 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 물질은 유기 분자, 무기 분자, 천연물(natural products), 펩티드, 단백질, DNA, RNA 및 그 대사 중간 생성물(metabolic intermediates)로부터 선택된다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 물질은 AICAR, 적은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질, EGCG, 포도씨 추출물, 빌베리 추출물, 아셀렌산염(selenite), 제니스테인(genistein), 다이알릴 3황화물(diallyl trisulfide), 벤질 아이소타이오사이안산염(benzyl isothiocyanate), 페닐 아이소타이오사이안산염(phenyl isothiocyanate), 페네틸 아이소타이오사이안산염(phenethyl isothiocyanate), 레스베라트롤(resveratrol), 리코핀(lycopene) 및 알릴 아이소타이오사이안산염(allyl isothiocyanate)로부터 선택된다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 산화방지제(antioxidant), 항고혈압제(antihypertensive agent), 지질저하제(lipid lowering agent), 항-뇌졸중 물질(anti-stroke agent), 항암 물질(anti-cancer agent) 및 상이한 노화 방지 물질로부터 선택된 제2 물질을 더 포함한다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 비타민 C, 비타민 E, 베타 카로틴 및 다른 카로티노이드, 셀렌, 리포산, 루테인, 제아잔틴, 코엔자임 Q10, 글루타티온, N-아세틸 시스테인, 멜라토닌, 제니스테인, 에스트라디올(estradiol), 차(tea) 추출물 및 포도씨 추출물로부터 선택된 산화방지제를 더 포함한다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 약학적으로 수용가능한 캐리어(carrier)를 더 포함한다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 경구적으로, 비경구적으로, 피부를 통해서(topically, transdermally) 또는 좌약형 또는 에어로졸 형태를 통해서 투여된다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 경화증, 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애로부터 선택된다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 대상은 포유류이다.
상기 제6 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 대상은 인간이다.
제7 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에 AMPK 활성물(activator), 또는 직접 또는 간접적으로 AMPK를 활성화시키고, 미토콘드리아 생물 발생(biogenesis)을 증가시키며, 상기 대상의 노화 세포 또는 체세포분열 후 세포의 세포 사이클 정지 상태를 유지하는, 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그를 포함한 구성요소를 투여하는 것을 포함한다. 본 견해는 따라서 본 명세서에 설명된, 본 개시에 포함된 노화에 수반되는 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약제의 준비 또는 제조 방법에 의하여 확인된 노화 방지 화합물 또는 구성 요소의 용도를 모두 아우른다. 본 견해는 상기 물질이 AMPK 활성물이라는 점에서 상기 제6 견해와 연관된다.
상기 제7 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 미토콘드리아 기능 손실, 말단 소립 기능 장애, 노화 세포 퇴화 및 수명-의존적(age-dependent) 세포 손실, 또는 미토콘드리아 퇴화 또는 체세포분열 후 세포의 세포 사이클 정지상태와 연관된다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 AMPK 활성물은 AICAR, 메트포르민(metformin), A-769662, 티아졸리딘디온(thiazolidinediones), 덱사메사손(dexamethasone), 스타틴, 렙틴, 아디포넥틴(adiponectin), 실로스타졸(cilostazol), EGCG, 아셀렌산염(selenite), 알릴 아이소타이오사이안산염(allyl isothiocyanate) 및 페네틸 아이소타이오사이안산염(phenethyl isothiocyanate)으로부터 선택된다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 산화방지제(antioxidant), 항고혈압제(antihypertensive agent), 지질저하제(lipid lowering agent), 항-뇌졸중 물질(anti-stroke agent), 항암 물질(anti-cancer agent) 및 상이한 노화 방지 물질로부터 선택된 제2 물질을 더 포함한다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 약학적으로 수용가능한 캐리어(carrier)를 더 포함한다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 경구적으로, 비경구적으로, 피부를 통해서(topically, transdermally) 또는 좌약형 또는 에어로졸 형태를 통해서 투여된다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 경화증, 쇼그렌 증후근, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애로부터 선택된다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 대상은 포유류 동물이다.
상기 제7 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 대상은 인간이다.
제8 견해에 의하면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에 라파마이신 표적(TOR) 억제제를 포함하는 구성 요소, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그를 투여하는 것을 포함하며, 상기 TOR 억제제는 (a) 복제 잠재력을 늘리거나, (b) 체세포분열 이후 세포의 노화 세포 또는 세포 사이클 정지 상태를 유지하거나, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포 퇴화에 따라오는 세포 사망을 방지한다. 본 견해는 따라서 본 명세서에 설명된, 본 개시에 포함된 노화에 수반되는 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약제의 준비 또는 제조를 위한 TOR 억제제, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 그 프로드러그의 사용을 모두 아우른다. 본 견해는 상기 물질이 TOR 억제제라는 점에서 상기 제6 견해와 연관된다.
상기 제8 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 미토콘드리아 기능 손실, 말단 소립 기능 장애, 노화 세포 퇴화 및 수명-의존적(age-dependent) 세포 손실, 또는 미토콘드리아 퇴화 또는 체세포분열 후 세포의 세포 사이클 정지상태와 연관된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 TOR 억제제는 적은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질이다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 TOR 억제제는 디포롤리머스(Deforolimus), AP-23675, AP-23841, 조타롤리머스(Zotarolimus), CCI779/템시롤리머스(Temsirolimus), RAD-001/에버롤리머스(Everolimus), 7-에피-라파마이신(7-epi-rapamycin), 7-티오메틸-라파마이신(7-thiomethyl-rapamycin), 7-에피-트리메톡시-라파마이신(7-epi-trimethoxy-rapamycin), 2-데스메틸-라파마이신(2-desmethyl-rapamycin) 및 42-O-(2-하이드록시)에틸-라파마이신(42-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin), 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화합물 또는 그 프로드러그로부터 선택된 적은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질이다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 TOR 억제제는 적은 투여량의 라파마이신, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화합물 또는 그 프로드러그이다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 TOR 억제제 라파마이신은 혈청(serum) 배양액에서 약 0.1부터 약 10000 pM까지, 또는 동물에서 0.1부터 약 10000ng/kg/day까지의 적은 투여량으로 사용된다. 전통적으로 라파마이신은 치료상의(therapeutic) 투여량(1mg/day부터 5mg/day)에서 세포 사이클의 G1 단계에서 세포 성장을 억제하고 또한 다른 기능적 단백질 복합체를 겨냥할 수 있는 면역억제제의 하나로서 알려져왔음에도 불구하고, 이러한 적은 투여량의 라파마이신이 단백질 세포 성장을 억제하기보다 새로운 기능을 보인다는 것은 놀라운 발견이다. 그 결과, 치료상의 투여량의 라파마이신은 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 증가, 신장 기능 결핍, 빈혈증, 부상 회복기능 손상(impaired wound healing), 설사, 무기력증, 저혈압, 고통, 체내 신생물의 악성 발전(malignant neoplasm progression), 간 신생물 악성 발전(hepatic neoplasm malignant), 복수, 성장 장애, 정신 상태 변화, 비장 경색(splenic infarction) 및 대장염 등을 포함한 다양한 부작용을 보인다. 본 발명에 따라 적은 투여량의 라파마이신을 사용하는 경우 상기 부작용들을 피할 수 있다.
라마파이신 또는 그 상사 물질의 효과적인 투여량은 이용되는 특별한 화합물, 투여 모드, 치료되는 특정한 장애뿐만 아니라, 치료되는 개개인에 관련된 다양한 신체적 요인들에 따라서도 달라질 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 경우, 라파마이신이 매일 경구적으로 치료되는 특정한 조직 질병 또는 장애에 따라 약 0.01부터 약 50μg/day의 투여량, 치료상의 투여량(1mg/day에서 5mg/day)의 약 0.001％에서 약 5％로 추정되는 투여량, 으로 투여되는 경우 만족스러운 결과가 얻어질 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 경우, 라파마이신을 2일에서 4일까지 투여 후 2일에서 5일까지 라파마이신을 투여하지 않는 투여 스케줄이 가장 적은 부정적 효과를 갖는 최상의 결과를 내었다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 적은 투여량의 라파마이신, 또는 그 상사 물질은 입증된 치료상의 투여량(approved therapeutic dose)의 약 10％ 이하, 약 8％ 이하, 약 6％ 이하, 약 4％ 이하, 약 2％ 이하, 약 1％ 이하, 약 0.1％ 이하, 약 0.01％ 이하, 또는 약 0.001％ 이하이다.
상기 제8 견해의 바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 8％부터 약 10％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 6％부터 약 8％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 4％부터 약 6％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 2％부터 약 4％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 1％부터 약 2％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 0.1％부터 약 1％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 0.01％부터 약 0.1％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 0.001％부터 약 0.01％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 라파마이신, 또는 그 상사물질은 입증된 치료상의 투여량의 약 0.0001％부터 약 0.001％까지의 범위의 투여량으로 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 적은 투여량의 라파마이신은 단일의(isolated) 화합물로써 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 적은 투여량의 라파마이신은 미가공의(crude) 추출물로써 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 적은 투여량의 라파마이신은 라파마이신을 포함하는 미정제된(unpurified) 미생물로써 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 적은 투여량의 라파마이신은 라파마이신은 포함하는, 미정제된 미생물 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)로써 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 산화방지제(antioxidant), 항고혈압제(antihypertensive agent), 지질저하제(lipid lowering agent), 항-뇌졸중 물질(anti-stroke agent), 항암 물질(anti-cancer agent) 및 상이한 노화 방지 물질로부터 선택된 제2 물질을 더 포함한다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 세포 및 미토콘드리아 레벨 모두에서 ROS를 조절하기 위한 산화방지제를 더 포함한다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 비타민 C, 비타민 E, 베타 카로틴 및 다른 카로티노이드, 셀렌, 리포산, 루테인, 제아잔틴, 코엔자임 Q10, 글루타티온, N-아세틸 시스테인, 멜라토닌, 제니스테인, 에스트라디올(estradiol), 차(tea) 추출물 및 포토씨 추출물로부터 선택된 산화방지제를 더 포함한다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 구성 요소는 경구적으로, 비경구적으로, 피부를 통해서(topically, transdermally) 또는 좌약형 또는 에어로졸 형태를 통해서 투여된다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식(abnormal proliferative) 질병, 퇴행성 질병 또는 기능-감소 장애이다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 경화증, 쇼그렌 증후근, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애로부터 선택된다.
상기 제8 견해의 바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 물질은 적은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질이며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 경화증, 쇼그렌 증후근, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애로부터 선택된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 물질은 적은 투여량의 라파마이신 또는 그 상사 물질이며, 상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 파킨슨병, 뇌졸중, 소뇌 경색, 및 심근 경색으로부터 선택된다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 수명-의존적(age-dependent) 말단 소립 기능 장애, 종양유전자 활성화, 또는, DNA 손상 반응을 통하여 다음와 같은 과정들에는 노쇠와 같은 메커니즘이 관여되기 때문에, DNA 손상 물질 (예를들어, ROS, 항암 약품, UV 또는 이온화 조사)에 의해 유발된 노쇠를 연장시키는 데 작은 농도의 라파마이신 사용을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 다양한 양성 종양을 치료하고 이들이 악성으로 발전하는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 따라서 노화 인구와 같이 높은 암 발생 확률을 갖는 인구 및 돌연변이 유발요인과 자주 접하는 사람, 또는 UV 또는 이온화 조사에 자주 노출되는 사람에게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 호르몬 대체제(hormone replacements)를 복용하는 여성과 같이, 암을 유발할 가능성이 높은 약을 복용하는 환자들에게 사용될 수 있다. 더불어, 본 발명의 방법은 2차 암을 유발할 수 있는 화학 요법 치료를 받는 암 환자에게도 사용될 수 있다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 뇌졸중에 의해 유발된 뇌 손상을 방지하는 데 작은 농도의 라파마이신 사용을 제공한다. 따라서, 적은 투여량의 라파마이신은 허혈성(ischemic) 및 출혈성(hemorrhagic) 뇌졸중 모두를 포함한 뇌졸중을 치료하기 위한 응급 약품으로 사용될 수 있다. 최상의 결과를 내기 위해서는, 본 발명은 또한 응고된 혈액을 녹이는(clot-dissolving) 약품인, 조직 플라스미노젠 활성제(tissue plasminogen activator, t-PA)와 같은 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위한 응급 약품과 조합한 적은 투여량의 라파마이신 사용을 제공한다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 뇌졸중 및 뇌줄중의 재발을 방지하는 데 작은 농도의 라파마이신 사용을 제공한다. 최상의 예방 효과를 갖기 위해서는, 본 방법의 또 다른 실시예에 따라, 본 발명은 또한 뇌졸중이 발생할 확률을 줄이는 다른 메커니즘의 약품과 조합한 적은 투여량의 라마파이신 사용을 제공한다. 상기 약품은 항혈소판(antiplatelet) 약품(예를들어, clopidogrel, Agrrenox), 혈액응고방지제(anticoagulants)(예를들어, 와파린, 헤파린), 지질 감소(lipid lowering) 약품(예를 들어, 스타틴) 및 혈압 약품(예를 들어, 안지오텐신전환효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 Ⅱ 수용기 차단제(ARBs), 베타-차단제, 이뇨제 및 칼슘 채널 차단제)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병을 포함한, 그러나 이에 제한되지는 않는, 신경 퇴행성 질병을 예방하는 데 작은 농도의 라파마이신 사용을 제공한다.
상기 제8 견해의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 심근 경색에 의해 유발된 심장 손상을 방지하는 데 작은 농도의 라파마이신 사용을 제공한다. 따라서, 본 발명은 심근 경색 또는 심장 마비를 방지하는 데 적은 투여량의 라파마이신 사용을 제공한다. 최상의 결과를 얻기 위해서는, 상기 라파마이신은 심장 마비 확률을 방지하기 위해 다른 메커니즘을 갖는 약품과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 약품은 항혈소판(antiplatelet) 약품(예를들어, clopidogrel, Agrrenox), 혈액응고방지제(anticoagulants)(예를들어, 와파린, 헤파린), 지질 감소(lipid lowering) 약품(예를 들어, 스타틴), 혈압 약품(예를 들어, 안지오텐신전환효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 Ⅱ 수용기 차단제(ARBs), 베타-차단제, 이뇨제 및 칼슘 채널 차단제) 및 혈당 조절 약품(예를들어, 메트포르민 및 피오글리타존(pioglitazone)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
당업자는 상이한 조직 또는 세포 종류에서 라파마이신의 분배는 일정하다는 것, 및 노화 방지 스크린으로부터 확인된 각 화합물 또는 구성 요소는 상이한 조직 또는 세포 타입에서 특정한 분배 패턴을 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 방법의 일 견해에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 다른 노화 방지 물질과 조합한 적은 투여량의 라파마이신 사용을 제공하며, 상기 노화 방지 물질은 AICAR, 2-데옥시포도당(2-deoxyglucose), ly294002, 메타포르민, EGCG, GSE, 세넬라이트(senelite), 제니스테인(genistein), 실리비닌(silibinin), 알릴 아이소타이오사이안산염(allyl isothiocyanate), 페네틸 아이소타이오사이안산염(phenethyl isothiocyanate), 빌베리 추출물, 다이알릴 3황화물(diallyl trisulfide), 벤질 아이소타이오사이안산염(benzyl isothiocyanate), 레스베라트롤(resveratrol), 및 리코핀(lycopene)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 적은 투여량의 라파마이신은 경구적, 임플란트를 통해, 비경구적(정맥 주사, 복강내 주사 및 피하 주사 포함), 피부를 통한(topical), 직장의(rectal), 비강내의(intranasal), 질 동맥으로(vaginally), 마시는, 에어로졸의, 및 피부를 통한(transdermal) 형태를 포함한 어느 유용한 방식으로든 투여될 수 있다. 피부를 통한 투여는 상피 미 점막 조직을 포함한 신체의 표면 및 신체 통로의 내벽을 가로지르는 모든 투여를 포함한다. 상기 투여는 본 발명의 화합물 또는 그에 대한 약리학적으로 허용가능한 염을 로션, 크림, 폼, 패치, 서스펜션, 용액 및 좌약(직장 및 질 삽입)으로 사용하여 수행될 수 있다.
상기 제8 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 적은 투여량의 라파마이신을 고체음식의 재료, 물, 와인 및 주스등과 같이 알코올이 포함되거나 또는 포함되지 않은 것을 포함한 음료 또는 액체 음식의 형태로 사용하는 것을 제공한다.
제9 견해에 의하면, 본 발명은 생물학적 샘플 안에서 노화 방지 물질을 감지하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a) 선택적으로(optionally) 용매에 상기 생물학적 샘플을 희석시키는 단계;
(b) 상기 희석된 샘플을, 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의하여 이스트 세포의 세포 사이클이 정지한 환경에서, 상기 돌연변이 이스트 세포와 배양하는 단계;
(c) 세포 사이클이 정지한 환경을 제거하고 생존한 이스트 세포의 수를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 얻은 생존 세포의 수를 상기 대상 생물학적 샘플의 부재를 제외하고 상기 배양 단계 (b)에서와 동일한 환경 아래의 통제 실험에서의 생존한 세포의 수와 비교하는 단계를 포함하되,
상기 통제 실험의 생존 세포 수와 비교하여 단계(c)에서 얻은 생존 세포 수의 증가는 상기 생물학적 샘플이 노화 방지 물질을 포함함을 나타낸다.
제10 견해에 의하면, 본 발명은 생물학적 샘플 안에서 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a) 선택적으로(optionally) 용매에 상기 생물학적 샘플을 희석시키는 단계;
(b) 상기 희석된 샘플을, 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의하여 이스트 세포의 세포 사이클이 정지한 환경에서, 상기 돌연변이 이스트 세포와 배양하는 단계;
(c) 세포 사이클이 정지한 환경을 제거하고 생존한 이스트 세포의 수를 측정하는 단계;
(d) 선택적으로(optionally) 상기 (c)단계에서 얻은 생존 세포의 수를 상기 대상 생물학적 샘플의 부재를 제외하고 상기 배양 단계 (b)에서와 동일한 환경 아래의 통제 실험에서의 생존한 세포의 수와 비교하는 단계; 및
(e) 상기 생존 이스트 세포의 수를 노화 방지 물질의 농도 및 생존 이스트 세포 수의 사이에서 기 정립된 표준 공식 또는 곡선에 적용하여 상기 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 계산하는 단계를 포함한다.
상기 제10 견해의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플 안에서 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 계산하는 데 사용하기 위한 표준 공식 또는 곡선을 준비하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(f) 상기 대상 생물학적 샘플을 배양하기 위해 사용되는 용매를 이용하여 정제된 노화 방지 물질의 서로 다른 알려진 농도를 갖는 복수개의 표준 용액을 준비하는 단계;
(g) 상기 표준 용액을, 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의하여 이스트 세포의 세포 사이클이 정지한 환경에서, 상기 돌연변이 이스트 세포와 배양하는 단계;
(h) 세포 사이클이 정지한 환경을 제거하고 배양된 각각의 표준 용액에서 생존한 이스트 세포의 수를 측정하는 단계; 및
(i) 표준 곡선 및/또는 표준 공식을 얻기 위하여 단계(h)에서 얻은 생존 세포의 수로 대응하는 노화 방지 물질의 농도에 대하여 그래프를 그리는 단계를 포함한다.
본 견해는 전술된 기 정립된 공식 또는 곡선을 이용하여 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 계산함으로써 양적인 분석이 관여된다는 점에서 제9 견해와 연관된다. 따라서, 본 발명은 전술된 두 견해에서 설명된 단계들의 합리적인 조합이라면 이를 포함한 방법을 모두 아우른다.
상기 제10 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플 안에서 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 노화 방지 물질은 전술된 본 발명의 일 견해에 대한 일 실시예에 따라 확인되거나 사용된 화합물 또는 구성 요소이다.
상기 제10 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플 안에서 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 노화 방지 물질은 라파마이신 또는 그 상사 물질이다. 더 바람직한 실시예에 따르면, 상기 라파마이신 또는 그 상사 물질은 적은 투여량을 갖는다.
상기 제10 견해의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플 안에서 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 돌연변이 이스트는 cdc13-1, cdc13-2, stn1-1, cdc17-1, cdc17-2, hdf1, hdf2, est1, est2 및 est3으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 견해 또는 바람직한 실시예들은 본 명세서에서 개시된 실시예들의 어떠한 적합한 조합이든 포함할 수 있다. 다른 견해 및 실시예들은 여전히 본 명세서에서 제공된 설명의 다른 부분에서 발견될 수 있다.
용어 정의
본 명세서에서 사용된, "선택적(optional)”또는 "선택적으로”는 차후에 설명된 사건 또는 환경이 다르게 발생할 수 있으며, 상기 설명은 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 모두 포함함을 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "노화에 수반된 장애”또는 "노화에 수반된 질병”은 노화가 주 위험 요소로 작용하는 장애 또는 질병을 가리킨다. 질병의 종류에 기초하여, 노화에 수반된 질병 또는 장애는 세 가지 주요 종류를 포함한다: (1) 암과 같은, 비정상적 증식 질병; (2) 뉴론 퇴행성 질병(알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중), 심근 경색, 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 고관절염, 골다공증, 근육감소증, 골수의 손실, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증, 노화에 수반되는 시력 감퇴와 같은, 퇴행성 질병; 및 (3) 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IGF-I의 감퇴, 감소된 에너지 생성 등과 같은, 기능 감소 장애. 관여된 세포의 종류에 기초하여, 노화에 수반된 질병 또는 장애는 두 가지 주요 분류로 분류될 수 있다: (1) 체세포분열 후의 세포에서: 뉴론 퇴보(알츠하이머, 파키슨병, 뇌졸중), 근육감소증(근육의 손실), 심혈관의 질병(심부전, 심근 경색); 및 (2) 유사 분열 세포에서: 골수 손실, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증, 노화에 수반되는 시력 감퇴, 류머티스성 관절염, 고관절염, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증 및 고혈압. 더 구체적으로, 미토콘드리아 기능 장애 또는/및 말단 소립 기능 장애와 연관된 노화에 수반된 질병 또는 장애는 암, 골관절염, 노화에 수반된 시력 감퇴, 특발성 폐섬유증, 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅튼병, 피부 노화, 백내장, 다중 경화증, 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 심근 경색, 심부전, 고혈압, 뇌졸중, 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 골다공증, 비만, 백모, 탈모 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 전술된 모든 질병 또는 장애를 아우른다.
바람직한 일부 실시예에 따르면, 용어 "노화에 수반되는 질병 또는 장애”는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 심근 경색(심장 마비), 소뇌 경색, 뇌졸중, 파킨슨병, 심부전, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 백내장, 노화에 수반되는 시력 감퇴, 근육감소증, 골관절염, 골다공증, 골수 손실, 다중 경화증, 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증, 및 신경퇴행성 질병, 알츠하이머, 헌팅튼병, 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IGF-I, 또는 에너지 생성의 감소로 초래된 장애를 가리킨다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "노화 방지 효과”는 증가된 미토콘드리아 생물발생 및 기능, 감소된 ROS 레벨, 노화 세포 및 뉴론 세포와 같은 체세포분열 후 세포의 연장된 수명, 종양 형성, 암의 악성 발전, 소뇌 경색 및 심근 경색과 같은 노화에 수반되는 장애의 방지를 포함하는 표현형을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방”하는 것은 그것이 발생하는 경우를 줄이고, 노화에 관련된 질병을 지연시키거나 뒤집는 것을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "노쇠” 또는 "노화 세포”는 말단 소립 기능 장애, DNA 손상, 또는 종양유전자(oncogene) 활성화에 의해 유발될 수 있는, 유사 분열 세포에서의 세포 사이클 정지 상태를 가리킨다. 출아효모에서, 말단 소립 기능 장애에 의해 초래된 노화 세포가 세포 사이클의 G2/M기에 정지되어 있다. 포유류 세포에서는, 노화 세포가 세포 사이클 외부의 비-분열기인 G0기에 정지되어 있다. WI-38 섬유아세포에서의 노쇠는 현미경으로 관찰 시 패시지 이후 10일 동안 그 수가 증가하지 않으며 β-갈락토시다아제(galactosidase) 양성 착색을 보이는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "체세포분열 이후 세포”는 세포 사이클 외부의 비-분열기인 G0기에 정지되어 있지만, 나머지 생물의 생명을 위해 그 주요 기능은 수행하는 세포의 그룹을 가리킨다. 체세포분열 이후 세포는 뉴론 세포, 심장 근육 세포, 및 근육 세포를 포함한다. 간 및 신장의 조직질실(parenchymal) 세포와 같이, 성숙한 생물의 일부 세포 종류는 반-영구적으로 G0기에 들어가고 매우 특별한 환경에서만 다시 분열을 시작하도록 유발될 수 있다. 이러한 종류의 세포들은 그들이 G0기에 있을 때 체세포분열 이후 세포로 고려된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "cdc13-1”은 CDC13유전자에 점 돌연변이를 포함하는 이스트 돌연변이 세포를 가리킨다. 용어 "cdc13-1”은 또한 점 돌연변이 유전자를 가리키며, 반면에 cdc13-1p은 점 돌연변이 유전자 cdc13-1에 의해 생성된 단백질을 가리키고, Cdc13p는 와일드(wild) 종류의 단백질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "cdc13-2”, "stn-1”, "cdc17-1” 및 "cdc17-2”는 이스트 돌연변이 세포 또는 그에 대응하는 돌연변이 유전자를 가리킨다. 용어 "est1”, "est2”, "est3”, "hdf1” 및 "hdf2”는 각각 EST1, EST2, EST3, HDF1 또는 HDF2 유전자의 삭제를 포함하는 이스트 돌연변이 세포를 가리키거나, 또는 그에 각각 대응하는 유전자 삭제를 가리킨다. 당업자는 문맥 속에서 상기 용어들의 사용을 순조롭게 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "TOR 억제제”는 노화 세포를 유지하는 능력을 갖는, 라파마이신 및 그로부터 화학적 또는 생물학적으로 변경된 파생물을 포함하는, 기본 라파마이신 핵을 갖는 면역억제성 화합물의 한 분류를 가리킨다. 따라서, 용어 "TOR 억제제”는 에스터, 에테르, 히드라존, 수산화아민, 또는 라파마이신의 옥심 파생물(derivatives)의 형태일 수 있다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 전자첨가(reduction) 또는 산소화(oxidation) 반응을 통하여, 라파마이신 핵의 기능기를 변경한 라파마이신의 상사 물질을 포함한다. 따라서, 용어 "TOR 억제제”는 라파마이신 및 AP23573(Deforolimus), AP-23675, AP-23841, ABT-578(Zotarolimus), CCI779(Temsirolimus), RAD-001(Everolimus), &에피-라파마이신, 7-티오메틸-라파마이신, 7-에피-트리메톡시페닐-라파마이신, 7-에피-티오메틸-라파마이신 및 7-디메톡시-라파마이신, 32-디메톡시-라파마이신, 2-데스메틸-라파마이신 및 42-O-(2-하이드록시)에틸 라파마이신과 같은 그 상사 물질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "치료용 투여량의 라파마이신”은 0.1mg/day에서 15 mg/day의 범위로 늘어날 수는 있지만, 치료시 40 mg/day를 넘지 않는, 약 1 mg/day 에서 약 mg/day 범위 투여량의 라파마이신을 의미한다. 상기 투여량으로는, 라파마이신은 자기 작용(autophagy)를 유발할뿐만 아니라, 단백질 전사 및 G1기에서의 세포 사이클 진행을 억제한다. 동물 및 조직 배양균에서는, 각각 치료용 투여량은 마린(marine) 모델에서 0.1 mg/kg/day 이상, 인간 세포에서 10ng/mL 이상, 및 해양 세포에서 100ng/mL를 의미한다. 정확한 치료용 투여량은 특정한 세포 라인 또는 동물에 따라 변할 수 있다는 것이 당업자에게는 이해 가능하다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "적은 투여량의 라파마이신”은 "치료용 투여량의 라파마이신” 아래의 투여량을 의미한다. 예를 들어, 상기 적은 투여량은 세포를 위한 혈청 배양액에서는 0.1 에서 1000pM, 마린 모델에서는 0.01 에서 100μg/kg/day, 또는 인간에게는 0.01 에서 100 μg/day일 수 있다. 구체적인 농도는 구체적인 세포 또는 치료될 질병의 종류 및 투여 경로에 따라 결정된다. 상기 적은 투여량은 치료용 투여량의 라파마이신의 약 0.001％에서 약 10％까지 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 화합물 또는 구성 요소의 "노화 방지 생물학적 농도”는 화합물 또는 구성 요소의 농도와 반대로, 생물학적으로 노화 방지가 활성화된 화합물 또는 구성 요소의 농도를 의미한다. 상기 노화 방지 생물학적 활동은 cdc13-1 세포의 노화 연장에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "암”은 정상적인 세포가 처음에 DNA 손상, 종양유전자 활성화, 말단 소립 기능 장애와 같은 초기 병변을 갖는 비정상적 세포가 되고, 그리고나서 인접한 조직, 지역적 림프절 및 멀리 떨어진 장소에 급격히 퍼지게 되는 질병 상태를 설명한다. 암은 노화에 수반된 암, 돌연변이 유발요인(mutage)에 의해 유발된 암, 항암 치료 또는 호르몬 교체와 같은 독립적인 장애 또는 질병에 대한 치료로 인해 유발되거나, UV, 이온화 조사 및 흡연과 같은 환경으로 인해 유발된 2차적인 암일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "종양형성 방지”는 정상적인 세포가 비정상적 세포로 변화하는 것을 억제하거나, 또는 양성 종양의 변환을 억제하는 것을 의미한다. 용어 "악성 발전 방지”는 양성 종양이 악성 종양 또는 암으로 발전하는 것을 억제하는 것을 의미한다. 용어 "암 예방”은 방지 및/또는 악성 발전 억제를 의미한다.
본 명세서에서 사용된, "암의 화학적 예방(chemopreventitive) 물질”은 종양 성장을 억제하는 데 사용될 수 있는 자연적인 또는 실험실에서 만들어진 물질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된, "약리학적으로 허용가능한 케리어”는 생물학적으로 활성화된 물질을 동물, 특히 포유류, 에게 전달하기 위해 상기 기술 분야에서 통상적으로 허용되는 캐리어 매개체를 가리키며, 예를 들어, 투여 모드 및 투여량 형태의 성격에 따라 희석액, 보존액, 필터, 유량 조절제, 붕해제, 습윤제, 에멀션 화제, 서스펜션화제, 감미제, 착향료, 방향제, 항세균제, 항매제, 윤활제, 및 투여제와 같은 보조물, 첨가물 또는 전파체(vehicle)를 포함한다. 약리학적으로 허용가능한 케리어는 다양한 고체 및 세미-고체 형태뿐만 아니라 수분 함유(aqueous) 및 비-수분 함유(non-aqueous) 액체 매게체를 모두 포함한다. 상기 케리어는 활성화 물질에 더하여 많은 다른 재료 및 첨가제를 포함할 수 있으며, 상기 추가적인 재료들은 당업자들에게 잘 알려진 것처럼, 예를 들어, 활성화 물질의 안정화, 바인더 등과 같은 다양한 이유를 위하여 포함된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "약리학적으로 허용가능한 염”은 염 또는 화합물의 양성 이온(zwitterionic) 형태를 포함하며, 이는 물 또는 기름에서 용해되거나 분산되며, 타당한 의학적 결정의 범주 내에서, 독성, 과민증, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 합병증 없이 환자의 조적에 접촉하여 사용되기에 적합하고, 또 의도된 용도에 효과적이다. 대표적인 산 첨가염(acid addition salts)은 아세트산염, 알긴산염, 구연산염, 아스파르트산염, 벤조산염, 벤젠설폰산염, 중황산염, 낙산염, 캠퍼설폰산염, 헤미황산염(hemisulfate), 헵타논산염, 헥사논산염, 포름산염, 푸마르산염, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 젖산염, 말레인산염, 메시틸렌술폰산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌술폰산염, 니코티네이트, 2-나프탈렌술폰산염, 수산염, 팔메이트(palmate), 펙티네이트(pectinate), 과황산염, 피발산염, 프로피온 에스테르, 숙신산, 타르타르산염, 트리클로로초산염, 트리플루오르초산염, 인산염, 글루타메이트, 중탄산염, p-톨루엔술폰산염을 포함한다. 약리학적으로 허용가능한 추가적인 염을 형성하도록 쓰일 수 있는 산의 예는 염화수소산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산, 및 수산, 말레산, 숙신산 및 구연산과 같은 유기산을 포함한다.
약리학적으로 허용가능한 염의 양이온은 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 테트라뷰틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민, 트리뷰틸아민, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민과 같은 무독성의 4개의 요소를 갖는 아민 양이온뿐만 아니라, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄도 포함한다. 기초의 추가 염 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민은 에딜렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 및 피페라진을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "용매화합물”은 유기 또는 무기분자를 불구하고, 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하나에서 세개, 의 용제 분자를 이용하여 본 발명에 따라 확인된 화합물의 물리학적 결합물(association)을 의미한다. 상기 물리학적 연상은 수소 결합을 포함한다. 특정한 경우에 상기 용매화합물은 분리(isolation) 가능하며, 그 예로 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하나에서 세개, 의 용제 분자가 크리스탈 고체의 크리스탈 래티스에 포함되었을 때를 들 수 있다. 용매화합물 내의 용제 분자들은 규칙적인 배열 및/또는 비규칙적인 배열로 존재할 수 있다."용매화합물”은 용액 단계 및 분리가능한 용매화합물들을 모두 어우른다. 본보기 용매화합물은 하이드레이트(hydrate), 에탄올레이트(ehanolate), 메탄올레이트(methanolate) 및 아이소프로판올레이트(isopropanolate)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 용매화 방법은 상기 기술 분야에서 통상적으로 알려져 있다.
이에 더하여, 본 발명에 포함되는 화합물은 프로드러그 형태를 가질 수 있다. 본 발명의 범주 내에서 생물체에 작용하는 물질을 제공하기 위하여 생체 내에서 변환되는 모든 화합물은 프로드러그이다. 상기 기술 분야에서 다양한 형태의 프로드러그가 널리 알려져 있다. 이러한 프로드러그 파생물의 예시를 위해서는, 프로드러그 디자인(Design of Prodrugs), H.Bundgaard (Elsevier, 1985) 저, 및 효소학의 방법(Methods in Enzymology), Vol. 112, pp. 309-396, K. Widder 외 (Academic Press, 1985) 저; 및 약품 설계 및 발전 (A Textbook of Drug Design and Development), Krosgaard-Larsen and H.Bundgaard 저, Chapter 5, "프로드러그의 설계 및 응용 (Design and Application of Prodrugs)” H.Bundgaard 저, at pp. 113-191(1991) 를 참조할 수 있다.
실례로서, 라파마이신 및 그 상사 물질과 같이 수산기(hydroxyl group)를 갖는 화합물들은 생리학적으로 가수분해 가능한 에스터, 탄산염 또는 체내에서 부모 화함물을 만들기 위하여 가수분해됨으로써 프로드러그로 기여하는 카보메이트(carbomates)를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 노화 방지 물질로서 라파마이신 및 그 상사 물질 또는 대응되는 에스터, 탄산염, 또는 카보메이트 파생물을 사용하는 것을 모두 포함한다. 상기 프로드러그는 상기 기술분야에서 알려진 통상의 합성 방법을 사용하여 당업자에 의해 합성될 수 있다. 예시를 들자면, 상기 에스터는, 예를 들면 무수 아세트산, 염화아세틸, 아세트산, 프로피오닐 염화물, 벤조일 염화물, 부티릴 염화물, 숙신산 무수물 등과 같은, 당업자에게 알려진 아실화(acylating) 물질과 함께 수산화기의 아실화로부터의 파생물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 탄산염은 수산화기를 X-C(O)OR의 구조식을 갖는 화합물과 반응시켜 얻은 파생물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 이 때 상기 X는 할로겐화물이고 R은 알킬, 아릴, 아릴알킬 등과 같이 산소 원자에 탄소가 결합되어 잇는 어떠한 그룹이든 될 수 있다. 카보메이트는 이와 비슷한 방법으로 합성될 수 있다.
이에 더하여, 라파마이신의 프로드러그는 미국특허공보 4,650,803 및 미국특허공보 5,151,413, 또는 발간되었거나 발간될 다른 어떤 문헌에 설명된 것과 같은 다른 형태일 수도 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에서 참조에 의해 그 전체가 포함된다. 본 명세서에서 설명된 대부분의 프로드러그들은 바람직하게는 경구적으로 투여되는데, 이는 많은 경우에 가수 분해가 소화 효소의 영향 아래에서 주로 일어나기 때문이다. 프로드러그 자체가 활성화된 경우, 또는 가수 분해가 피 속에서 일어하는 경우에는 비경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 생성물은 상기 기술 분야에서 알려진 어떠한 적합한 루트를 통해서도 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구적, 피부를 통한, 비경구적 (피하적, 근육 내의, 정맥을 통한 및 피부 내의 루트를 포함) 및 폐를 통한 루트가 있다. 일부 실시예에 따르면, 생성물은 유닛 투여량 형태로 편리하게 존재할 수 있으며 약학 기술 분야에서 알려진 일 방법을 통해 준비될 수 있다. 일반적으로, 상기 생성물은 활성화된 재료(예를 들어, 라파마이신 또는 그 상사 물질)을 액체 케리어 또는 조밀하게 나누어진 고체 케리어 또는 둘 다와 함께 균일하고 직접적으로 합침으로써 준비된다.
본 발명의 활성화된 화합물을 포함하는 경구적 생성물은 정제(tablets, troches), 캡슐, 바컬 형태(buccal form), 마름모꼴 정제 및 경구용 액체, 서스펜션, 또는 용액, 또는 가루분말 또는 과립(granules), 수분 함유(aqueous) 또는 수분 비함유 액체에의 서스펜션 용액, 오일-인-워터(oil-in-water) 에멀젼, 또는 워터-인-오일(water-in-oil) 액체 에멀젼을 포함한 관습적으로 사용되는 경구 형태를 포함할 수 있다. 캡슐은 비활성의 필터 및/또는 희석액을 갖는 활성화된 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 유용한 정제 생성물은 전통적인 압축, 습식 또는 건식 과립화 방법을 통해서 만들어질 수 있으며, 약리학적으로 허용가능한 희석액, 결합(binding) 물질, 붕괴제(disintegrants), 윤활제, 표면 변경 물질(계면활성제 포함), 또는 서스펜션화제 또는 안정제를 활용할 수 있다. 경구적 생성물은 상기 활성화된 화합물을 변경하기 위해서 표준 지연(standard delay) 또는 지속적으로 방출하는(time release) 생성물을 활용할 수 있다.
일부의 경우에는 상기 화합물을 기도, 귀, 피부 또는 목구멍에 직접적으로 에어로졸의 형태로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 적은 투여량의 라파마이시은 피부를 통해서(topically)도 투여될 수 있다. 상기 피부를 통한 형태는 크림, 연고, 에멀젼, 젤, 로션 및 스프레이를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 피부를 통해 투여되는 생성물(topical formulations)의 일 실시예에 따르면, 상기 피부를 통해 투여되는 생성물은 비활성 재료(기름과 같은)를 포함한다. 본 발명의 피부를 통해 투여되는 생성물(topical formulations)의 일 실시예에 따르면, 상기 피부를 통해 투여되는 생성물의 재료는 모이스쳐라이징 크림 베이스안에서 제공된다. 본 발명의 피부를 통해 투여되는 생성물에는 방부제도 제공될 수 있으며, 이는 상기 생성물의 유통 기한을 느리기 위함이다. 본 기술 분야의 당업자는 추가적인 화성화된 재료 또는 비활성 물질을 첨부함으로써 상기 피부를 통해 투여되는 생성물을 변경하는 방법을 알 것이다. 본 발명의 피부를 통해 투여되는 생성물은 피부 노화를 방지하고 암과 같은 장애를 초기에 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
일부 실시예에 따르면, 정제(tablets)는 적어도 하나의 활성화된 재료를 포함하고, 선택적으로(optionally) 각각의 물질을 압축 또는 틀어 넣음으로써 만들어진 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용가능한 케리어를 포함한다. 더 바람직한 실시예에 따르면, 압축 정제(compressed tablets)는 활성화된 재료를 가루 분말 또는 과립과 같이 자유롭게 흐르는 형태로 적절한 기계에 넣어 압축함으로써 준비되고, 이때 선택적으로 바인더(binder, 예를 들어, 메디카 포비돈, 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 비활성 희석액, 방부제, 붕괴제(예를 들어, 용성 녹말 글리콜산염(sodium starch glycolate), 크로스 링크(cross-linked) 메디카 포비돈, 크로스 링크 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성 또는 분산 물질과 함께 섞일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 구성 요소는 단독으로 또는 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 한가지에서 세가지, 의 추가적인 치료용 물질과 조합하여 투여될 수 있다. "조합하여 투여되다” 또는 "조합 치료”는 본 발명의 화합물 또는 구성 요소 및 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하나에서 셋, 의 추가적인 치료용 물질들이 치료되는 포유류에 함께 투여됨을 의미한다. 조합하여 투여되는 경우, 각 구성 요소는 동시에 투여되거나 어떠한 순서로든 다른 시간 지점에서 순서대로 투여될 수 있다. 따라서, 각 구성 요소는 분리되어 투여되지만 희망하는 치료 효과를 제공하기 위하여 제 시간에 충분히 가까울 때 투여될 수 있다.
본 명세서에서 범위는 "약” 하나의 특정한 값으로부터, 및/또는 "약” 다른 하나의 특정한 값까지로써 표현될 수 있다. 위와 같은 범위가 표현된 경우, 또 다른 견해는 상기 하나의 특정한 값으로부터 및/또는 상기 다른 하나의 특정한 값까지를 포함한다. 유사하게, 수치들이 선행하는 "약”의 사용을 통해 근사값으로 표현된 경우, 상기 특정한 수치는 또 다른 견해를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 이에 더하여, 각 범위의 종점은 다른 종점과의 관계에서, 및 다른 종점과 독립적으로 모두 중요하다고 이해될 것이다. 또한 본 명세서에서는 많은 수치가 개시되어 있으며, 각 수치는 본 명세서에서 상기 수치 자체에 더하여 "약” 그 특정한 수치로써 개시되어 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 만약 수치 "10”이 개시되었다면, "약 10” 또한 개시되었다. 출원 전반적으로 다양한 형식의 많은 데이터가 제공되며, 상기 데이터는 종점 및 시점 및 상기 데이터 점의 어떠한 조합을 위한 범위든 모두 나타낸다는 것 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 특정한 데이터 점 "2%”및 특정한 데이터 점 "4%”가 개시된 경우, 2％에서 4％ 사이의 값뿐만 아니라, 2％ 및 4％ 초과, 이상, 미만, 이하 및 동일한 값이 개시된 것으로 이해될 것이다. 또한 두 특정한 유닛 사이의 각 유닛도 개시되었다고 이해될 것이다. 수치를 표시하는 투여량 앞에 용어 "약”이 나타나는 경우, 이는 상기 수치가 적어도 ±30％, 바람직하게는 ±20％ 이내에서, 그리고 더 바람직하게는 ±10％ 이내에서, 달라질 수 있다는 것을 의미하며; 상기 용어가 수치를 표시하는 온도 앞에 나타나는 경우, 이는 상기 수치가 적어도 ±섭씨 2도, 더 바람직하게는 ±섭씨 1도 이내에서, 달라질 수 있다는 것을 의미하고; 시간을 표시하는 경우, 이는 상기 수치가 적어도 15％, 바람직하게는 10％ 이내에서, 그리고 더 바람직하게는 5％ 이내에서, 달라질 수 있다는 것을 의미한다.
노화 방지 물질을 확인, 감지 및 정제하는 방법
본 발명은 아래에서 논의되는 다양한 발견에 기초한다.
A. 영양소 신호 억제는 AMPK 및 차후의 미토콘드리아 경로를 통하여 말단 소립 기능 장애로 인해 유발되는 세포 사이클 정지 상태를 연장시킨다 .
A-1. 영양소 신호 억제는 세포 사이클 정지 상태를 유지하고 따라서 말단 소립 기능 장애로 인해 유발되는 차후의 세포 사망을 방지한다.
출아효모 cdc13-1은 다양한 이유로 인해 말단 소립 기능 장애의 중요한 모델이다. 예를 들어, 첫째로, cdc13-1p의 비활성화로 인해 유발된 말단 소립 기능 장애는 말단소체복원효소(telomerase)의 비활성화에 의한 것과 같은 후속 경로를 초래한다: G2/M에서의 Mecl(ATEM 및 ATR 동족체)-의존 세포 사이클 정지, 이를 세포의 대량 사망이 뒤따르고, 상기 세포의 대량 사망은 확대된 세포 크기, 상당하게 증가된 ROS 생성, 세포자멸 마커(apoptotic markers), 및 반수체 세포의 2N DNA 이상의 컨텐트(content)를 동반한다. 라파마이신을 통한 TOR의 억제는 cdc13-1의 비활성화 또는 말단소체복원효소의 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 방지한다. 흥미롭게도, 라파마이신은 cdc13-1p의 비활성화에 의해 촉발된 G2/M 정지에는 영향을 미치지 않으나, G2/M 정지 상태를 유지하고 따라서 >2N DNA 컨텐트, 노화 세포의 퇴화 및 세포 사망의 지표, 가 나타나는 것을 방지한다 (Qi, H., et al, PLoS ONE, 3, e3520 (2008)). 둘째로, 말단 소립 구조 및 기능은 이스트로부터 사람까지 보존된다. 인간 세포에서, 말단 소립 기능 장애는 cdc13-1에서와 유사하게, ATM-/ATR-의존 세포 사이클 정지를 초래하며, 이를 확대된 세포 크기, 세포자멸 마커 및 다배수성(polyploidy)을 통해 나타나는 대량의 세포 사망이 뒤따른다. 따라서, cdc13-1은 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 후속 캐스캐이드(cascade)를 연구하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은, 라파마이신 치료와 유사하게, 이스트 배양균 배양액 내의 포도당을 감소 또는 200μM 2-데옥시포도당(포도당의 상사 물질)을 상기 배양액에 추가를 통한 포도당 제한, 및 질소 제한 또한 cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 방지하였고, 이는 집락형성능측정을 통하여 관찰되었다. 도 1a에 도시된 바와 같이, cdc13-1 세포(반수체)를 비-허용(non-permissive) 온도(섭씨 37도)에서 22시간 동안 보통 YEPD 배양액(1％ 펩톤, 2％ 이스트 추출물, 및 2％ 포도당)에서의 배양은 집락형성능측정을 통해 측정된 바와 같이 독자로 생존 가능한 세포의 대량 손실을 초래하였다. 그러나, YEPD 배양액에서 포도당을 감소시키는 것(2％에서 1％, 0.5％ 및 0％로)과 YEPD에 2％ 포도당과 함께 200μM 2-데옥시포도당을 추가하는 것은 세포 사망을 효과적으로 방지하였다: 즉, 포도당이 적을수록, 더 많은 세포가 생존하였다. 이에 더하여, SC-N 배양액(아미노산이 배제된 0.67％ 이스트 질소 베이스 및 (NH4)2SO4, 2％ 포도당, 및 상기 이스트 변형(strain)을 위한 각 100mg/L의 히스티딘, 류신, 트립토판 및 우라실의 혼합물)은 세포 사망을 방지하였다(도 1b). 뿐만 아니라, cdc13-1 세포 사망은 라파마이신의 농도가 0.3 에서 1nM 사이일 때 투여량 의존적인 방식으로 방지되었다(도 1c). 상기 세포 사망을 방지한 0.5 및 1nM의 라파마이신은 세포 성장을 지속적으로 억제하지는 않았으며, 약간 촉진시켰으며(도 1d), 이는 적은 투여량의 라파마이신의 새로운 기능을 나타낸다. 도 1e는 라파마이신 및 포도당 제한이 cdc13-1 세포 사망을 지연시킴을 보여준다. 섭씨 37도에서 20시간 후 상당한 세포가 손실되는 것과 반대로, 적은 투여량의 라파마이신 및 포도당 제한은 세포의 더딘 감소를 초래하였다. 섭씨 37도에서 60시간 동안 배양 후, 세포 생존율은 처리를 하지 않은 경우보다 적어도 100배 더 컸다.
또한 상기 결과는 포도당 제한이, 라파마이신 처리와 유사하게, G2/M-정지 상태를 유지하고 cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발된 차후의 세포 사망을 방지함을 입증한다. 도 2a에 도시된 바와 같이, cdc13-1 세포를 비-허용온도(섭씨 37도)에서 2시간 동안 배양 후, 포도당 제한(0.5％ 포도당) 및 통제군(control)에서와 같이 라파마이신(1nM)이 포함된 YEPD 배양액 내의 95％ 이상의 세포가 세포 사이클의 G2/M기로 들어섰다. YEPD 배양액에서 2％부터 0.5％까지의 포도당 제한은 >2N DNA 컨텐트의 증가를 억제하였고, 이는 라파마이신 처리(1nM)에서와 같이 세포 사이클 정지 상태를 유지시킴을 시사한다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 95％ 이상의 세포가 세포 사이클의 G2/M기에 돌입하도록 하는, 2시간 동안 섭씨 37도에서 cdc13-1 세포를 전(pre)-배양하는 것은 포도당 제한 및 라파마이신이 세포 생존율에 미치는 방지 효과에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 라파마이신을 통한 TOR 억제와 유사하게, 영양소 제한은 세포 사이클 정지 상태(노쇠 상태)를 유지하고, 따라서 노화 세포의 퇴화 및 말단 소립 기능 장애에 의해 초래되는 세포 사망을 방지한다.
A-2. 라파마이신을 통한 TOR 억제와 마찬가지로, 포도당 제한은 ROS 의 생성을 방지하고 cdc13-1 세포 사망에서의 세포자멸 마커의 발생을 억제한다.
도 3a는 cdc-1 세포 사망은 ROS 방출의 상당한 증가와 연관이 있음을 보여준다. 라파마이신(1nM) 처리와 유사하게, 포토당을 2％에서 0.5％로 감소시키는 것(0.5％ Glc)은, ROS 증가를 동일한 온도에서의 와일드 타입(WT)의 레벨과 비교가능한 레벨로 효과적으로 감소시킨다. 도 3b는, 포스파티딜세린(PS) 플립(flipping) 및 포도당 감소 (0.5％ Glc) 또는 라파마이신(1nM)이 세포자멸 사망을 효과적으로 억제함을 통해 관찰되는 것과 같이, cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발된 세포 사망 또한 세포자멸의 증가와 연관이 있음을 보여준다.
A-3. AMPK 및 미토콘드리아 기능은 라파마이신 및 포도당 제한이 cdc13 -1 세포 사망 방지 효과에 있어 중요한 역할을 한다.
본 발명은 또한 cdc13-1 세포 사망 방지 효과를 위해 AMPK가 갖는 중요한 역할을 개시한다. 도 4a는 Sip2p, 이스트 AMPK의 규제성 베타 서브유닛(regulatory beta subunit), 의 삭제가 포도당 제한의 방지 효과를 상당히 억제하였음을 보여준다. 뿐만 아니라, Snf1p 및 Snf4p, 각각 촉매성 알파 서브유닛(catalytic alpha subunit) 및 규제성 베타 서브유닛, 의 삭제는 라파마이신의 방지 효과를 크게 감소시켰다(도 4b).
본 발명은 또한 AMPK 활성화 및 후속의 미토콘드리아 생물발생을 통해 향상될 수 있는 기능을 갖는 미토콘드리아가, cdc13-1 세포 사망을 방지하는 효과에 있어 중요한 역할을 함을 개시한다. 미토콘드리아 결핍 돌연변이는 기 간행된 문헌(Qi, H., J. Biol. Chem., 278:15136-15141 (2003))에 설명된 바와 같이 브롬화 에티듐을 포함하는 배양액에서의 세포 배양을 통해 cdc13-1 세포내에 만들어진다. 도 5a는 미토콘드리아 결핍이 포도당 감소 및 라파마이신(1nM 및 5nM의 농도)에 의한 방지 효과를 상당히 폐지하였음을 보여준다. 포도당 감소(0.5％ 포도당) 및 라파마이신(1nM)을 통한 미토콘드리아 생물방생의 상향조절 또한 미토콘드리아 질량 증가를 측정함으로써 입증되었다(도 5a 및 도 5c).
도 6은 위 결과의 요약을 보여준다. 미토콘드리아는 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 성장 정지 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 하고, 포도당 제한 및 라파마이신을 통한 TOR 억제는 AMPK 활성화를 통해 미토콘드리아 기능을 자극하며, 그 결과 노화 세포의 퇴화 및 차후의 세포 사망을 방지한다.
B. 적은 투여량의 라파마이신 , 포도당 제한 및 AMPK 활성물은 , 유사한 방법으로 미토콘드리아 기능을 자극하고 인간의 초기 섬유아세포에서 노쇠를 연장한다.
본 발명은 CR 또는 라파마이신 또한 인간 세포에서 노쇠를 연장하고 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 세포 사망을 방지함을 개시한다. 초기 인간 배아의 폐 섬유아세포 WI-38이 사용되었다. 상기 세포에는 말단 소립 활동이 부족하고 상기 세포는, 보통 통상의 배양 환경 아래의 패시지 31에서, 복제 잠재력에 도달할 때 말단 소립 기능 장애를 나타낸다. 패시지 29에서의 세포들이 50nM 라파마이신으로 처리되었다. 상기 처리는 3일은 라파마이신을 넣고 7일은 라파마이신을 넣지 않는 10일 사이클(또한 3일 온(on)/7일 오프(off) 사이클에 따른 기간으로 진행)에 따랐다. 세포들은 패시지 31에서 분열을 중단하였고 (현미경으로 관찰됨) 1 mg/mL 5-브로모-4-클로로-3-인도릴 β-D-갈락토시드(X-gal), 40 mM 구연산/인산나트륨, pH 6.0, 5 mM 칼륨 페로시안화합물, 150 mM NaCl, 및 2 mM MgCl2를 포함하는 버퍼에서 X-gal을 이용하여 시토졸 β-갈락토시다아제 활동을 측정을 통해 노쇠를 드러내었다. 시토졸 β-갈락토시다아제 활동 증가로 인해서, 노화 세포는 파란색(흑백사진에서는 진회색으로 나타남)으로 착색되었다. 도 7은 노쇠에서 56일 후, DMSO 조절에서 대량의 세포 손실이 발생하였음을 보여준다. 세포 손실은 50nM 라파마이신을 통해 크게 억제되었다. 노쇠 마커가 여전히 존재하고 세포 성장이 관찰되지 않은 바, 라파마이신은 세포들을 변형시키지 않았다. 더불어, 배양액에서의 감소된 포도당(0.4％에서 0.2％) 또는 2-데옥시 포도당(12.5μM)의 첨가 또한 노화 세포의 손실을 방지하였다(도 7).
이스트에서 관찰한 것과 유사하게, AMPK 또한 라파마이신- 또는 포도당 제한- 영향을 받은 인간 세포의 말단 소립-사망의 방지에 있어 중요한 역할을 한다. 도 7에 도시된 바와 같이, AMPK 특정 활성물 5-아미노이미다졸-4-카르복사미드-1-베타-D-리보푸라노시드 (AICAR, 250μM) (독성을 피하기 위하여 2일은 AICAR와 함께, 8일은 AICAR 없이 10일의 사이클)은 노화 세포 WI-38의 손실을 방지하였다. 게다가, 라파마이신(50pM)은, Thrl72에서 인산화된 AMPK를 감지하기 위하여 사용된, 웨스턴 블랏분석법(Western blotting)을 통해 관찰된 바와 같이 AMPK 키나아제 활동을 활성화하였다(데이터는 도시되지 않음). 더불어, 라파마이신, 감소된 포도당, 2-데옥시포도당, 및 AICAR는 미토콘드리아 질량을 증가시키고 인간의 미토콘드리아 기능을 자극하였다(도 8 및 도 10). 적은 투여량의 라파마이신은 림프아세포 L40뿐만 아니라(데이터 도시되지 않음), 인간 섬유아세포(도 8a)에서 미토콘드리아 질량을 증가시켰다. 적은 투여량의 라파마이신은 또한 미토콘드리아 막 포텐셜을 증가시키고 섬유아세포 및 L40 세포 내의 ROS를 감소시켰다(도 8b, 도 8c 및 데이터 도시되지 않음).
놀랍게도, 도 9a에서 볼 수 있듯이, 오로지 적은 투여량의 라파마이신(10에서 100pM)만이 노화세포 WI-38의 손실을 방지하였다. 오히려, 500pM보다 높은 농도의 라파마이신은 세포 손실을 촉진시켰다. 예를 들어, 25pM 라파마이신은 세포 손실을 방지하였지만(도 9a), 세포 성장을 억제하지는 않았다(도 9b). 대신에, 상기 라파마이신은 5.12에서 6.8로 배로 증가한 개체수를 통해 측정된 바와 같이 복제 잠재력을 증가시켰다. 게다가, 적은 투여량의 라파마이신(50pM 및 100pM)은 주요한 노화 단백질 p53, p21 및 pRB의 수치를 증가시켰으나, 높은 투여량(2000pM) 그러하지 않았다(도 9c). 더불어, 오로지 적은 투여량의 라파마이신만이 인간 세포에서 미토콘드리아 질량 및 세포막 포텐셜을 증가시키고 ROS 수치를 감소시켰으며, 반면 10nM를 넘는 라파마이신은 이러한 효과를 잃는 것으로 나타났다(도 8). 따라서, 적은 투여량의 라파마이신은 치료용 투여량과 다르게 기능하고, 상기 적은 투여량의 라파마이신은 단백질 번역 및 세포 사이클 G1기에서 세포 성장을 억제하기보다는, 미토콘드리아 기능을 자극하며 노화 세포의 퇴화를 방지한다.
요약하자면, 1) 노화 세포내의 세포 사이클 정지 상태의 유지는 이스트에서 인간으로 보존되고; 2) CR, 포도당 제한 또는 적은 투여량의 라파마이신은 AMPK를 통해 미토콘드리아 기능을 자극하고, 노화 세포를 연장하여 그 결과 차후의 세포 사망을 억제하며; 3) 오직 적은 투여량의 라파마이신만이 인간 세포에서 노쇠 상태를 유지하는 측면에서 칼로리 제한을 모방한다.
C. 일부 노화 방지 및 화학적 항암( cancer chemopreventive ) 물질은 이스트 및 인간 세포 모두에서 미토콘드리아 기능을 자극하고 노화 세포의 손실을 억제한다.
본 발명은 여러 가지 노화에 수반되는 질병을 예방하는 것으로 알려진 두가지 물질, 녹차 추출물(GTE)로부터 얻은 EGCG 및 포도씨 추출물(GSE), 이 미토콘드리아 질량을 증가시키고 노쇠를 연장시킬 수 있음을 개시한다.
GTE는 여러 가지 암을 예방하는 것으로 보고되어 왔다(미국특허공보 7,192,612 및 7,384,655, 및 미국특허공개공보 20040142048 및 20040047921, 및 Shimizu, M., et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 17:3020-3025 (2008); Nakachi, K., et al, Jpn. J. Cancer Res., 89:254-261 (1998)). 에피갈로카테킨 갈레트(epigallocatechin gallate, EGCG)는 GTE의 가장 효율적인 구성 요소이다. EGCG는 선충류 C(C. elegans)의 수명을 연장시키는 것으로 보고되어 왔다(Abbas, S. and Wink, M., Planta. Med., 75:216-221 (2009)). EGCG는 또한 아밀로이드 전구체 단백질 분열을 조절하고 알츠하이머 이식유전자를 가진 마우스의 뇌 아밀로이드증을 감소시키며(Rezai-Zadeh, K., et al, J. Neurosci., 25(38):8807-8814 (2005)), 래트의 일시적인 중대뇌동맥폐색 후 뇌 손상을 방지하고(Choi, Y.B., et al, Brain Res., 1019:47-54 (2003)), 국소성빈혈/혈관재연결(reperfusion)에 의해 유발된 세포자멸로부터의 심장 마이오사이트(cardiac myocytes)를 보호하며, 분리된 래트의 심장에서 미토콘드리아 K(ATP) 채널 활성화를 통해 경색 크기를 제한하는 것으로 보고되어 왔다(Townsend, P.A., et al, FASEB J., 18:1621-1623 (2004); Song, D.K., et al, J. Korean Med. ScL, 25(3):380-386 (2010)). 더불어, EGCG는 분리된 섬(islets)에서 세포자멸을 방지하고(Hara, Y., et al, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg., 14:493-497 (2007)), 마우스에서 스트렙토조토신의 중복된 적은 함량에 인해 유발된 자가면역성 당뇨를 방지 하며(Song, E.K,, et al, Arch. Pharm. Res., 26:559-563 (2003)), 인간 쇼그렌 신드롬의 쥣과(murine) 모델에서 자가면역성 질환을 감소시키고(Hsu, S. D., et al, Autoimmunity, 40:138-147 (2007)), 래트 모델에서 셀레나이트를 통해 유발된 백내장(cataractogenesis)을 방지하는 것으로 입증되어 왔다(Gupta, S. K., et al, Ophthalmic Res., 34:258-263 (2002)). 흥미롭게도, EGCG는 AMPK 또한 활성화시킨다(Huang, C.H., et al, MoI Nutr. Food Res., 53(9):1156-1165 (2009)).
GSE 또한 암 방지 활동을 갖는 것으로 보여져 왔다(미국특허공개공보 20040047921 및 20050013880). 예를 들어, 몰식자산(gallic acid), GSE의 주요 구성요소, 는 TRAMP 마우스 모델에서 전립선 암의 진행을 감소시키고(Raina, K., et al, Cancer Res., 67:5976-5982 (2007)), GSE는 또한 NNK에 의해 유발된 암 발명 전의 인간의 유방 상피 세포의 발망을 방지한다(Siriwardhana, N, et al, Breast Cancer Res. Treat., 109:427-441 (2008)). 게다가, GSE는 에스트로겐이 고갈된 동물 모델에서 동맥 혈압 및 염에 민감한(salt-sensitive) 고혈압을 감소시키는 것으로 보여져 왔다. 또한 GSE는 인간 표피세포의 3차원 조직 배양균 모델에서 UVB에 의해 유발된 피부 손상을 효과적으로 방지하고(Tomaino, A., et al, Toxicol. In Vitro., 20:1395-1402 (2006)), 알츠하이머병의 마우스 모델에서 Aβ 올리고머화를 방지하고 인지의 퇴화를 약화시키며(Wang, J., et al, J. Neurosci., 28:6388-6392 (2008)), 마우스 및 햄스터에서 높은-지방 식단에 의해 유발된 비만을 방지하고(Park, S.H., et al, Nutr. Res. Pract, 2:227-233 (2008); Decorde, K., et al, MoI. Nutr. Food Res., 53:659-666 (2009)), 래트 모델에서 척수 및 뇌의 노화로 인해 산화하여 손상된 DNA가 축적되는 것을 억제하며(BaIu, M., et al., Brain Res. Bull., 68:469-473 (2006)), 나이가 드는 동안 적혈구 세포막의 온전성을 유지할 수 있다(Sangeetha, P., et al., Exp. Gerontol. , 40:820-828 (2005)).
도 10에서 볼 수 있듯이, 250 μg/mL GSE 및 GTE로부터의 50μg/mL EGCG 모두가 인간 세포, 예를 들어, 림프아세포 L40, 에서의 미토콘드리아 질량을 증가시킨다. 이들은 또한 이스트 및 인간 초기 섬유아세포 WI-38에서 말단 소립 사망을 방지하였다(도 11 및 도 7).
도 10은 여러 가지의 화학적 항암 물질이 인간 림프아세포에서 미토콘드리아 질량을 증가시킴을 보여주며, 이러한 화학적 항암 물질의 예로는, 10μM LY294002(PI3K 억제제), 2 μM 다이알릴 3황화물(DATS), 1 μM 벤질 아이소타이오시안산염(BITC), 1 μM 페닐 아이소타이오시안산염(PITC), 2 μM 레스베라트롤(RSV) 및 0.03 μM 리코펜, 6.7 μM 페네틸 아이소타이오시안산염(PEITC), 1 μM 알릴 아이소타이오시안산염, 5 mM 실리비닌, 1.25mM 아셀렌산염(Na2SeO3), 2.5 mM 제니스테인, 및 3mg/mL 빌베리 추출물이 있다. 도 7 및 도 11은 페네틸 아이소타이오시안산염(PEITC), 실리비닌, 아셀렌산염(Na2SeO3), 제니스테인 및 빌베리 추출물을 포함한, 많은 화학적 항암 물질이 이스트 및/또는 인간 세포에서 말단 소립 사망에 다양한 수준의 보호 효과를 나타냄을 보여준다.
D. 많은 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 미토콘드리아 또는/및 말단 소립의 기능 장애와 연관되어 있으며, 동물 모델 또는 조직 배양균 모델에서 적은 투여량의 라파마이신은 몇몇의 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지한다.
암. 대부분의 암 세포는 제대로 발휘되지 못하는 미토콘드리아 기능을 보인다. 이러한 현상을 바르부르크 효과(Warburg effect)라 칭하며, 이는 암 세포에서 ATP의 60％가 호기성 환경 하에서 해당 작용을 통해 생산되는 반면, 정상 세포에서는 ATP의 대부분이 미토콘드리아의 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 통해 생성된다는 것을 의미한다. 종양 원소 변환(oncogenic transformation)은 산화적 인산화의 억제 및 당분해를 증가를 초래하는 것으로 보여져 왔던 반면, 종양 억제 단백질 p53은 호흡을 상향조절하고 당분해를 억제한다. 그러나, 제대로 발휘되지 못하는 미토콘드리아 기능이 암의 원인인지 결과인지는 명확하지 않다.
말산 소립이 점차적으로 짧아지기 때문에, 말단 소립 기능 장애가 나이-의존적임은 알려져 있으며, 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 노화 세포를 유지하는 것이 노화에 수반되는 암의 진행을 막는 데 주요 메커니즘이다. 종양유전자 활성화 및 돌연변이 유발 요인에 의해 초래된 노화 세포는 DNA 손상 반응을 통해서도 말단 소립 기능 장애에 의한 것과 같을 수 있으며, 다양한 암을 방지하기 위한 본질적인 메커니즘은 노화 세포 유지일 수 있다. 본 발명은 미토콘드리아 기능이 노화 세포 유지에서 주요한 역할을 함을 개시한다. 따라서, 미토콘드리아 기능은 노화 세포를 유지함으로써 암 방지에 중요하고 제 기능을 발휘하지 못하는 미토콘드리아 기능은 노화 세포 퇴화 및 암 진행을 촉진하는 초기 단계이다. 그 결과, 말단 소립 기능 장애 모델은 미토콘드리아 기능을 자극하고, 노쇠를 연장하며 암을 예방하기 위한 후보(candidate)를 확인하는 데 사용될 수 있다. 정말로, 많은 알려진 화학적 항암 물질이 노쇠를 연장하고 미토콘드리아 질량을 증가시킴이 보여졌다(e도 7, 10 및 11). 더불어, 도 7에서 볼 수 있듯이 노쇠를 연장하는, 적은 투여량의 라파마이신 및 AICAR는 NIH3T3 세포에서(실시예 15 참조) 미토콘드리아 질량 감소를 뒤집고 돌연변이 유발 요인 TPA(12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트)에 의해 유발된 종양 형성을 방지하였다(도 12 및 도 13).
뉴론 퇴행성 질병. 광대한 연구에도 불구하고, 뉴론 퇴행성 질병의 메커니즘은 명백하지 않다. 파킨(Pakin, 파킨슨병과 연결됨), 헌틴틴(Huntintin, 헌팅튼병 및 알츠하이머에서 노인성 반점을 초래하는 아밀로이드-β와 연결됨)이 미토콘드리아 기능과 관련이 있기 때문에, 미토콘드리아 기능 장애가 뉴론 퇴행성 질병에서 일 역할을 할 수 있다. 최근의 연구는 자기 소모(autophagy, 단백질 저하)가 상기 질병에서 일 역할을 한다고도 제안한다.
본 발명은 큰 투여량의 라파마이신이 아닌 적은 투여량의 라파마이신이 ROS 수치를 감소시키고, 배양균 내의 래트 소뇌 그래뉼 뉴론(CGN) 세포 수명을 증가시키고(도 14a 및 도 14b), 래트 뇌졸중 모델에서 소뇌 경색에 의한 뇌 손상을 방지함(도 15a 및 도 15b)을 개시한다(실시예 16-18 참조). 적은 투여량의 라파마이신은 또한 해양(marine) 모델에서 200 μM MPP+에 의해 유발된 ROS 수치와 파킨슨병을 유발하기 위해 사용되는 도파뉴릭(dorpaneuric) 독소를 감소시킨다(도 16). 더불어, 뉴론 퇴행성 질병을 방지하거나 치료한다고 보고되어온 EGCG 또한 노쇠를 연장할 수 있다(도 7 및 도 11). 따라서, 적은 투여량의 라파마이신 및 EGCG는 체세포분열 후의 세포 및 노화 세포의 수명을 연잘할 수 있으며, 이는 G0기의 체세포분열 이후의 뉴론 세포를 유지하는 것이 G0기의 노화 세포의 메커니즘과 유사한 메커니즘을 공유한다는 것을 시사한다. 그 결과, 일 견해에 따르면, 본 발명은 노화 세포 모델이 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머 및 헌팅튼병을 포함하는, 그러나 이에 제한되지는 않는, 뉴론 퇴행성 질병 또는 장애를 방지하는 약품 후보를 확인하고 감지하는 데 사용될 수 있다는 발견에 기초한다.
심부전, 아테롬성 동맥 경화증 및 심근 경색. 말단 소립 기능 장애는 만성적인 심부전에서 중요한 역할을 하는 것으로 보여져 왔다. 배양된 심근세포에서, TRF2 기능과의 간섭이 말단 소립 짓무름(erosion) 및 세포자멸을 촉발하였음이 보여져 왔다. 반대로, 외인성의 TRF2 산화 스트레스로부터 보호를 부여하였고, 이는 세포 사망이 체세포분열 이후의 세포, 비순환 세포, 에서조차 말단 소립 기능 장애를 통해 발생할 수 있음을 나타낸다(Oh, H., et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 100:5378-5383 (2003)). 생체조건하에서, 노화한 5번째 세대 TERC-결핍 마우스(G5TERC-KO)(TERC 유전자에 의해 암호화된 말단소립복원효소 RNA의 결핍에 인한 말단소립복원효소 돌연변이 모델)는 심장근세포에서 과도하게 짧은 말단 소립, 심실 팽창, 심근이 가늘어지는 현상, 심장 기능 장애 및 급작스런 사망을 나타내었다. G5TERC-KO 마우스의 심장 절단면은 와일드-타입 마우스와 비교해보았을 때 좌심실 근세포의 50％ 감소뿐만 아니라, DNA 손상 반응 단백질 p53의 증가된 표현 및 증가된 세포 자멸을 드러내었다(Leri, A., et al., EMBO J., 22:131-139 (2003)).
아테롬성 동맥 경화증은 보통 동맥이 단단해지는 것을 의미한다. 이는 동맥 내부에의 다중 플라크 형성에 의해 초래된다. 아테롬을 발생시키는 자극에 의해 촉발된 혈관 내피 세포(ECs)의 기능 장애는 아테롬성 동맥 경화증의 발병에서 중심적인 중요성을 차지한다. 가속화된 말단 소립 짓무름 및 미성숙한 노화 세포가 인간 아테롬성 동맥 경화증 병변에서 관찰되었으며(Ogami, M., et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 24:546-550 (2004); Minamino, T., et al., Circulation, 105:1541-1544 (2002)), 이는 나이-의존적인 말단 소립 짓무름에 기인한 기능 장애 또는 EC 손실이, 플라크 형성의 초기 단계일 수 있음을 시사한다.
관상 동맥의 아테롬성 동맥 경화증은 관상 동맥 순환의 차단을 초래하며, 이는 심근 경색(MI, 일반적으로 심장 마비로 알려짐)의 원인이 된다. MI는 체세포분열 후의 심장근세포의 손실, 순응성이 없는 리모델링(maladaptive remodeling), 심장 수축성 기능 장애를 초래하고 결과적으로 충혈성 심부전을 초래한다.
본 발명은 100 μg/kg이 아닌, 10 μg/kg의 적은 투여량의 라파마이신이 래트 모델에서 허혈성 심근 경색을 크게 감소시킴을 개시한다(도 17 및 실시예 19). 더불어, AMPK 활성물인 메트포르민 또한 해양(marine) 모델에서 심근 경색을 감소시키고 미토콘드리아-영향을 받은 세포 사망으로부터 심근 세포를 보호할 수 있다는 것이 보고되어 왔다(Calvert, J.W., Diabetes, 57:696-705 (2008)). 이러한 결과는 노화 세포에서와 유사하게, 체세포분열 후의 심근 세포를 유지하는데 있어 TOR/AMPK/미토콘드리아 경로가 갖는 중요성을 입증한다. 따라서, 말단 소립 기능 장에에 의해 유발된 노화 세포 모델은 심근 경색 예방 또는 치료를 위한 약품 후보를 선택하는 데 사용될 수 있다.
노화에 따른 시력 감퇴. 노화에 따른 시력 감퇴(AMD)는 노년층(>50세)이 시력을 잃는 주요 원인이다. 이는 망막 색소 상피 세포(RPE)의 퇴행으로부터 시작되며 시야의 중심(망막 황반)에서 시력의 손실을 초래한다. 말단 소립 짓무름, 미토콘드리아 기능 손실 및 세포 손실이 상기 질병과 연관되어 있다는 것이 보고되어 왔다(Matsunaga, H., Invest. Ophthalmol. Vis. ScL, 40:197-202 (1999); Liang, F.Q., et al , Exp. Eye Res. , 76:397-403 (2003)). 따라서, 말단 소립 짓무름에 의해 유발된 세포 손실을 방지하기 위한 미토콘드리아 기능 향상은 상기 질병을 방지하거나 그 초기 단계를 안정화할 수 있다. 흥미롭게도, 50pM의 적은 투여량의 라파마이신이 상기 질병을 위해 특허를 획득한 바 있다(미국특허공보 7,083,802). 따라서, 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 노화 세포 모델은 AMD를 예방 또는 치료하기 위한 약품 후보를 선택하는 데 사용될 수 있다.
골관절염. 골관절염(OA), 관절 연골의 점진적인 손실, 은 노년층에게 발생되는 가장 흔한 만성적 관절 질병이며, 이는 매우 큰 고통과 장애를 초래한다. 온전한 연골 기질의 유지를 위해서는 연골 세포의 기능이 필수적이다. 말단 소립 기능 장애, 연골 세포에서의 미토콘드리아 돌연변이 및 세포자멸 세포 사망이 OA와 연관되어 있는 것이 보여져 왔으며(Martin, J. A., et al, J. Bone Joint Surg. Am., 85-A Suppl. 2:106-110 (2003); Ruiz-Romero, C, et al., MoI. Cell Proteomics., 8:172-189 (2009); Dave, M., et al. , Arthritis Rheum. , 58:2786-2797 (2008)), 이는 연골 세포에서의 말단 소립 기능 장애에 의한 세포 손실이 상기 질병이 발병하는 데 있어 근본적인 메커니즘이라는 것을 시사한다. 따라서, 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 세포 손실을 방지하기 위한 미토콘드리아 기능 향상이 상기 질병을 예방하거나 상기 질병의 초기 단계를 안정화할 수 있다. 그 결과, 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 노화 세포 모델은 OA를 예방 또는 치료하기 위한 약품 후보를 선택하는 데 사용될 수 있다.
특발성 폐섬유증. 특발성 폐섬유증(IPF)은 만성적, 점진적인 침입형 폐 질병으로, 폐 간극에서의 비정상적이고 섬유 조직의 과도한 축적을 특징으로 한다. 이는 보통 50세 이상의 환자에게서 나타난다. 근래에, 말단 소립에서의 돌연변이가 성인기 발증형 폐섬유증을 초래한다고 보여져 왔다(Tsakiri, K.D., et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:7552-7557 (2007)) and short telomeres are associated with IPF (Alder, J.K., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:13051-13056 (2008); Armanios, M.Y., et al., N Engl. J. Med., 356:1317-1326 (2007)). 폐 상피 세포 내의 미토콘드리아 및 세포자멸의 관여 또한 IPF에서 입증되어 왔다(Kuwano, P., Intern. Med., 47:345-353 (2008)). 상기 결과는 말단 소립 기능 장애에 의해 유반된 폐 상피 세포의 손실이 노화에 수반되는 IPF의 최초 계기일 수 있음을 시사한다. 따라서, 폐 상피 세포에서 말단 소립 짓무름에 의해 유발된 세포 손실을 방지하기 위한 미토콘드리아 기능 향상은 상기 질병을 예방하거나 상기 질병의 초기 단계를 안정화할 수 있다. 그 결과, 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 노화 세포 모델은 AMD를 예방 또는 치료하기 위한 약품 후보를 선택하는 데 사용될 수 있다.
피부 노화. 섬유아세포의 노화는 주름살과 같은 피부 노화의 표시에 있어 중요한 역할을 한다. 점진적인 말단 소립 단축 및 ROS 또는 UV에 의한 DNA 손상의 섬유아세포 노화를 초래하며, 이는 섬유아세포 노쇠 및 차후의 세포 손실을 포함한다. 섬유아세포 노화는 기능 손실을 초래하고, 이는 증식 잠재력의 손실(Mine, S., et al., PLoS ONE, 3(12):e4066 (2008); Hayflick, L., /. Invest. Dermatol., 73:8-14 (1979)), 세포 형태 및 신진 대사 변화, 타입 Ⅰ및 Ⅲ 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질의 생성 감퇴(Varani, J., et al., Am. J. Pathol., 168:1861-1868 (2006)), 및 세포외기질의 저하와 관련된 단백질 분해 효소의 오버익스프레션(overexpression)을 포함한다(West, M.D., et al., Exp. Cell Res., 184:138-147 (1989)). 상기 생체 밖에서의 변화는 모두 더 많이 또는 더 적게 생체 내에서의 노화에 수반되는 피부 변화에 참여할 수 있다. 기능적 미토콘드리아 개체수를 유지하는 것은 말단 소립 단축을 느리게할 뿐만 아니라(도 9b), 여전히 기능하는 노화한 섬유아세포의 손실을 방지하기도 하며(도 7 및 도 9a), 그 결과, 피부 노화를 지연시키고 피부 암을 예방한다.
류머티스성 관절염( RA ). 기능 장애를 갖는 말단 소립 및 미토콘드리아 돌연변이는 RA의 잠재적인 발병 요소이다. RA환자의 조혈 전구 세포(HPCs)) 및 척수 간엽 줄기 세포(MSCs)는 미성숙한 말단 소립 단축 및 감소된 복제 포텐셜을 나타낸다는 것이 보여져 왔다(Colmegna, I., et al, Arthritis Rheum. , 58:990-1000 (2008); Kastrinaki, M.C., et al., Ann. Rheum. Dis., 67:741-749 (2008)). 더불어, HLA-DRB 1*04 대립 형질 유전자, 본 질병에 주요하게 민감한 유전자, 는 말단 소립 단축의 과정을 조절하는 것으로 보여져 왔다(Sch?nland, S. O., et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 100:13471-13476 (2003)). 몇몇의 연구 또한 RA에서 염증이 생긴 관절 윤활액 막의 일부 구성 요소 및 구조 변화 특성이 관절 윤활액 세포의 달라진 세포자멸 반응과 연결된다고 보여 왔다(Korb, A., et al., Apoptosis, 14:447-454 (2009)). 또한, RA로부터의 윤활막세포의 mtDNA의 돌연변이가 통제군과 비교하여 크게 증가하였다 Da Sylva, T.R., et al., Arthritis Res. Ther., 7:R844-851 (2005)). 따라서, 미토콘드리아 기능을 향상시키고 말단 소립 단축에 의해 유발된 세포 사망을 방지하는 약품 후보가 본 질병을 치료하도록 발전될 수 있다.
진성 당뇨병. 진성 당뇨병은 인슐린 생성 감소(타입 1) 또는 인슐린 효과에의 저항성(타입 2 및 임신기간)로 인해 높은 혈당 포도당 수치를 초래하는 질병의 그룹을 가리킨다. 말단 소립 기능 장애 또는 미토콘드리아 기능 장애에 기인한 β-세포의 시기 상조의 손실은 당뇨병의 초기 단계일 수 있다. mtDNA 결함이 당뇨의 병인학에서 통상적인 요인이라는 점 및 mtDNA 재배열(Ballinger, S.W., et al, Nat. Genet. , 7:458-459 (2004); Ballinger, S.W., et al, Nat. Genet., 1:11-15 (1992)) 및 tRNA 돌연변이(van den Ouweland, J.M., et al, Diabetes, 43:746-751 (1994))가 당뇨와 연결된다는 점이 잘 알려져 있다. 이에 더하여, 마우스의 췌장 β-세포에서, 미토콘드리아 생물발생에서 주요 단백질 중의 하나인 미토콘드리아 전사 요소 TFAM의 비활성화는 세포자멸에 의한 β-세포 질량의 점진적인 감퇴를 초래하고, 이는 혈청 인슐린의 급격한 감소 및 단식 상태 및 비 단식 상태 모두에서 혈중 포도당 증가를 초래한다(Koster, J.C., et al, Cell, 100:645-654 (2000); Wallace, D.C., Am. J. Med. Genet., 106:71-93 (2001)). 인간의 이자섬에서의 β-세포가 말단 소립 짓무름 및 생체 밖에서의 말단 소립에 의해 유발된 노쇠를 겪는다는 것 또한 알려져 왔다(Halvorsen, T.L., /. Endocrinol, 166:103-109 (2000)). 따라서, 미토콘드리아 기능을 향상시키고 말단 소립 짓무름에 의해 유발된 세포 사망을 방지하는 약품 후보가 본 질병을 치료하도록 발전될 수 있다.
위에서 언급된 노화에 수반된 질병들은 미토콘드리아 퇴화 및/또는 말단 소립 기능 장애와 연관된 일부 예시이다. 상기 카테고리에 드는 다른 많은 질병이 있으며, 이는 비만, 골다공증, 고혈압, 근육감소증, 백내장, 다중 경화증, 쇼그렌 증후군, 노화에 따른 난청, 고령화, 노화에 따른 면역 조절장애, 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IGF-I 또는 에너지 생성의 감퇴에 따른 장애를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명 또한 미래에 발견되는 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 어떠한 것이라도 모두 아우른다.
요약하자면, 본 발명은 미토콘드리아가 노화 세포 및 뉴론 및 심장 근세포와 같은 체세포분열 이후의 세포에서 성장 정지 상태를 유지하는 데 핵심적인 역할을 하고, 많은 노화에 수반되는 질병과 연관되어 있음을 개시한다. 이에 더하여, 미토콘드리아 기능 장애 및 말단 소립 기능 장애 또한 노화에 수반되는 질병에 연결되어 왔다. 상기 원리들은 노화에 수반되는 질병에 대한 약품 후보를 위한 탐색에 노화 세포를 이용하는 데 기초가 된다.
도 18은 노화에 수반되는 질병의 메커니즘을 요약하고 영양소 억제/TOR 경로가 어떻게 노화에 수반되는 질병을 방지하는 지 도시한다. 간단하게 말하자면, 미토콘드리아는 다양한 세포 및 조직에서 노화에 수반되는 질병에서 핵심적인 역할을 한다. 뉴론 세포, 근육 세포 및 심장 근세포와 같은 체세포분열 이후의 세포들에게서는, 미토콘드리아가 상기 체세포분열 이후 상태를 유지하기 위해 작동하고, 따라서 상기 세포들의 세포 사이클에 재-입성 및 차후의 세포 사망을 방지한다. 증식하는 조직에서는, 미토콘드리아 기능 향상이 산화적 스트레스의 감소를 초래할 수 있고 그들의 복제 잠재력을 증가시킬 수 있다. 노화 세포에 돌입함에 있어, 미토콘드리아는 또한, 체세포분열 이후 세포에서와 같이, 노화 세포 상태를 유지하고 차후의 세포 손실을 방지한다. 세포 손실은 RA 및 IPF 질병의 섬유증에서의 염증 반응과 같은 보수(repairing) 케스케이드를 촉발할 수 있다. 세포 손실은 또한 조직의 기능 손실 및 골수 부전, 뉴론 퇴행 및 심부전과 같은 퇴행성 질병을 초래할 수 있다. 또 다른 상황에서는, 노화 세포 퇴화는 종양 형성 및 암 진행을 초래할 수 있다. 포도당 제한을 포함한 칼로리 제한 및 적은 투여량의 라파마이신은 미토콘드리아 기능을 자극하고 다양한 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지한다.
요약하면, 본 발명은 특히 (1) 노쇠 상태는 미토콘드리아 기능에 의하여 유지되고; (2) 체세포분열 이후의 상태 유지는 노화 세포 상태 유지와 유사하며; (3) 미토콘드리아 기능을 통한 CR은 노화 세포 및 체세포분열 이후의 세포를 유지하고, 따라서 노화 세포 모델이 미토콘드리아 기능을 자극하고 다양한 노화에 수반되는 장애를 방지하는 후보를 확인하기 위하여 사용될 수 있고; (4) 많은 화학적 항암 물질, 포도당 섭취 억제제 및 AMPK 활성물은 노쇠를 연장시킬 수 있고 따라서 노화에 수반되는 질병을 위한 약품 후포로 발전될 수 있으며; (5) CR의 모방으로서, 적은 투여량의 라파마이신이 노화 세포 및 체세포분열 이후의 세포를 유지하고 암, 뇌졸중에서의 뇌 손상, 허혈성 심근 경색 및 다른 노화에 수반되는 질병 또는 표현형을 방지할 수 있음을 개시한다.
매우 최근에, 본 출원의 우선권을 주장하는 가출원 이후, 몇몇의 연구원들이 라파마이신의 치료용 투여량 또한 단백질 번역 억제 및 저하 (자기 소모) 자극을 통해 노화 및 노화에 수반되는 질병에 일부 효과를 가질 수 있음을 보고하였다. 예를 들어, 치료용 투여량의 라파마이신(7.5 mg/kg)이 마우스 모델에서, 특별히 RTP801/REDD1/Ddit4, 파킨슨병 환자의 영향 받은 뉴론에서 유발되며 뉴론 사망을 초래하는 단백질, 에의 단백질 번역 억제를 통해 파킨슨병에 효과적이라는 것이 보고되었다(Malagelada, C, et al, J. Neurosci., 30(3): 1166-1175 (2010)). 또 다른 보고는 알츠하이머 병의 마우스 모델에서 라파마이신의 치료용 투여량(2.24mg/kg)이 자기 소모(autophagy)를 증가시켜 인지 결함을 구출하고 Aβ 및 토우 병리학을 개선시킴을 입증하였다(Caccamo, A., et al, J. Biol. Chem., Feb. 23, 2010). 더불어, 마우스 및 초파리에서 치료용 투여량의 라파마이신이, CR에 의한 수명 연장 효과(~30~40％)에 비교하여 보았을 때, 약간의 수명 연장 효과(~10％)를 유발함이 보여졌다(Harrison D.E., et al, Nature, 460(7253):392-395 (2009)),. 흥미롭게도, 이러한 초파리에서의 라파마이신을 통한 수명 연장은 AMPK/미토콘드리아 경로를 통하지 않고, 단백질 번역 억제 및/또는 자기 소모 자극을 통한 것이다(Bejdov, I., et al, Cell Afetafe., l l(l):35-46 (2010)).
상기 결과들은 치료용 투여량의 라파마이신도 단백질 번역/성장 억제 및 자기 소모 자극을 통하여 일부 노화에 수반되는 질병 및 수명 연장에 약간의 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 그러나, 다양한 부작용으로 인하여, 상기 치료용 토여량의 라파마이신은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지하기 위한 장기 사용에 적합하지 않다. 반면, 본 명세서에서 개시된 것과 같이 CR의 모방 (사실은, 최소의 부작용을 나타내기 때문에 CR보다 나음)으로서의 적은 투여량의 라파마이신은 AMPK/미토콘드리아 경로를 통하여 노화 및 노화에 수반되는 질병을 예방하는 데 사용될 수 있으며, 이는 치료용 투여량의 라파마이신 사용보다 다양한 가식적인 장점, 예를 들어, 더 높은 효과 및 더 적은 부작용,을 갖는다.
실시예
A. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 노화 방지 후보( candidates )를 확인 및 감지하기 위하여 높은-처리량 스크리닝을 하기 위한 말단 소립 기능 장애 모델의 사용.
본 발명의 일 견해에 따르면, 이스트 말단 소립 기능 장애 모델 cdc13-1은 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 방지 또는 치료하기 위한 유용한 노화 방지 물질의 발견을 위한 높은-처리량 스크리닝을 위해 사용된다. 상기 cdc13-1 모델은 많이 연구되어 왔으며 세포 사이클 정지가 cdc13-1p 비활성화 직후의 G2/M기에서 발생하고, 이를 세포 사망이 뒤따른다. 상기 모델을 사용함으로써, 본 발명은 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 세포 사망을 방지할 수 있는 후보를 확인하는 빠른 방법을 제공할 수 있다. 이러한 종류의 빠른 성장 정지 및 차후의 세포 사망을 나타내는 말단 소립 기능 장애와 연관된 다른 모델들도 사용될 수 있으며, 그 예로 Stn1p에서의 온도 민감 돌연변이 stn1-1(이스트 내에 말단 소립을 캐핑(capping)함 및 Cdc17p에서의 온도 민감 돌연변이 cdc17-1 및 cdc17-2(DNA 폴리머라아제 Ⅰ 알파-프리마아제 복합체의 이스트 촉매성 서브유닛)을 들 수 있다. 더불어, 말단 소리 기능 장애 및 세포자멸을 나타내는 이스트 세포들도 사용될 수 있으며, 이에는 Est1p, Est2p, Est3p, Hdf1p, Hdf2p 또는 cdc13-2 돌연변이가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 그리고나서 WI-38 인간 초기 섬유아세포가 약품 후보를 확정 또는 감지하기 위하여 인간 말단 소립 기능 장애 모델로서 사용될 수 있다. 하기의 실시예들(실시예 1-6)은 cdc13-1 모델을 사용한다.
실시예 1
세포 생존 분석법을 이용한
cdc13 -1 모델에서 세포 사망을 방지하는 물질의 확인 (도 19 참조)
cdc13-1모델에서 미토콘드리아 기능을 향상시키고, 세포 사이클 정지 상태를 연장하며 세포 사망을 방지하는 화합물 또는 구성 요소의 높은-처리량 스크리닝을 위하여, 먼저 신선한 YEPD 또는 이스트 컴플릿 배양액(YC) 플레이트에 cdc13-1 세포들을 스트리킹(streaking) 하고 그 후 단일의 군집이 형성될 때까지 3일에서 5일 동안 허용 온도(약 섭씨 24도)에서 배양함으로써 cdc13-1 세포들이 섭씨 -80도의 스톡으로부터 활성화된다. 적은 수의 이스트 군집들은 채집되어 동일한 배양액에서 허용 온도 섭씨 24도로 하룻밤동안 배양된다. 상기 하룻밤동안 배양된 배양균들은 신선한 배양액에 1:2에서 1:20(cdc13-1 스트레인(strain)을 위해서는 약 1:10이 최적)의 비율로 희석된다.
이스트 세포들은 96-웰(well) 플레이트 또는 다른 적합한 형태의 플레이트로 옮겨진다. 예상되는(prospective) 화합물 또는 구성 요소, 예를 들어, 연속적으로 희석된 약품, 화합물, 펩티드 라이브러리 또는 H2O, DMSO(디메틸 술폭시화물)에 의한 다른 라이브러리 또는 다른 유기 용제, 가 상기 세포 혼합물의 총 부피의 5％ 미만의 부피로 상기 세포들에게 추가된다. 상기 혼합물에는, 대응되는 용제가 음성 통제 집단(negative control)으로써 포함되고, 동일한 용제 내의 1nM 라파마이신 용액이 양성 통제 집단(positive control)으로써 포함된다. 이스트 세포들은 그리고나서 비-허용온도(약 섭씨 37도)에서 2일 동안, 또는 음성 통제 집단에서 생존한 세포가 발견되지 않을 때까지 배양된다.
작은 부피의 세포들이(예를들어, 5μl) 또 다른 96-웰 또는 다른 형태의 플레이트에 미리 만들어진 YEPD 한천 플레이트로 옮겨진다 (세포들은 또한 이동 전에 먼저 희석될 수도 있다). 플레이트들은 허용 온도(약 섭씨 24도)에서 적어도 3일 또는 양성 통제 집단에서 군집이 형성될 때까지 배양된다. 군집 형성을 촉진하는 화학물질이 주요 후보로 고려될 것이다. 그 대신에, 적은 마이크로-리터의 세포들이 또 다른 96-웰 플레이트 또는 다른 형태의 플레이트 내의 YEPD 액체 배양액으로 옮겨진다. 상기 플레이트들은 허용 온도(약 섭씨 24도)에서 배양되고, OD595(595nm에서 광학 밀도)가 주기적으로, 예를 들어 하루에 한번, 읽혀진다. 음성 통제 집단의 세포 밀도보다 크게 세포 밀도를 증가시키는 화학물질이 주요 후보로 고려된다. 상기 방법은 도 19에 도시되어 있다.
상기 주요 후보들은 실시예 2 및 3에 각각 설명된 것과 같은 세포자멸 분석법(apoptotic assay) 및 ROS 분석법을 통해 확정된다. 주요 후보들은 그들이 G1에서 세포 성장을 억제하는지 여부를 보기 위해 추가적으로 시험을 거칠 수 있으며, 이는 도 1d에서와 같이 허용 온도에서의 성장 곡선을 관찰함으로써 그리고 도 2a에서와 같이 FACS 분석을 사용하여 DNA 컨텐트 분포를 측정함으로써 이루어질 수 있다. 상기 후보들에 의하여 돌연변이 세포가 생성되고 그에 따라 비-허용온도에서 군집을 형성할 가능성을 제거하기 위하여, cdc13-1 세포들이 군집 형성을 위하여 약 섭씨 37도에서 상기 후보들과 함께 배양될 수 있다. 중요한 일 견해에 따르면, 상기 후보들은 그들이 미토콘드리아 기능을 향상시키고 WI-38 섬유아세포와 같은 포유류 노화 세포에서 세포 손실을 억제하는지 여부에 대하여 시험을 거칠 것이다. 그리고나서 그들이 특정한 노화에 수반되는 질병 방지에 효과적인지 여부가 구체적인 질병 모델에서 조사된다. 예를 들어, 동물 모델에서 상기 후보들이 종양형성 억제 및/또는 뇌 경색 크기 감소를 나타내는지에 대해 시험될 수 있다.
높은-처리량 스크리닝을 위한 다른 종류의 적절한 플레이트는 384-웰 플레이트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 방법은 상기 후보들을 감지하고 확정하기 위한 다른 종류의 플레이트, 예를 들어 6-웰 플레이트 등, 에 맞추어질 수 있다.
실시예 2
세포자멸 분석법을 이용한 cdc13 -1 세포 사망을 방지하는 물질의 확인
Cdc13-1에서의 세포 사망은 세포자멸 마커를 드러낸다. 상기 특징은 높은-처리량 스크리닝을 위해 이용될 수 있는데, 이는 실시예 1에 언급된 세포 생존 분석법에서보다 적은 시간이 걸리기 때문이다. 상기 특징은 또한 실시예 1의 높은-처리량 스크리닝으로부터 양성 확인된 것을 확정하는 데에도 사용될 수 있다. 더불어, 세포자멸 분석법은 세포자멸을 억제하는 물질을 스크리닝하는 데에도 사용될 수 있다.
비-허용 온도(약 섭씨 37도)에서 하루 동안(약 18-24시간) 배양 후, 화합물과 섞인 cdc13-1 세포들이 FITC-결합(conjugated) ㅋ-vad-RMK (활성화된 케스페이스(caspase)에만 결합하는 자살 기질), 또는 다른 적절한 세포자멸 감지 물질, 로 어둠 속에서 20분 동안 착색되었다. 세포들은 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 한번 씻겨질 수 있다. 플레이트들은 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescent microplate reader)에 의해 읽혀진다. 음성 통제 집단 (스크리닝 된 화합물 또는 구성 요소가 부재하는 세포들)은 세포 사망으로 인해 높은 FITC 신호를 갖는다. 상기 FITC 신호를 감소시키는 화합물 또는 구성 요소가 양성 물질 또는 주요 후보로 고려된다. 상기 주요 후보들은 실시예 1에서와 같이 생존 세포 분석법을 통해 확정되고, ROS를 감소시키고 미토콘드리아 기능을 향상시키는 능력을 나타낸지에 대해 추가적으로 시험된다. 이러한 능력들은 WI-38 노화 세포와 같은 인간의 말단 소립 기능 장애 모델에서도 시험될 것이다. 암 및 다른 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방하는 능력은 온전한 모델에서 추가적으로 시험된다. 포스파티딜세린 플립(flipping)을 측정하기 위한 아넥신(annexin) V 결합 분석법이 세포자멸 마커로서 도 3b에 도시되었다. 상기 분석법은 높은-처리량 스크리닝을 위해서도 사용될 수 있다.
실시예 3
ROS 측정을 통한 cdc13 -1 세포 사망을 방지하는 물질 확인(도 20 참조)
cdc13-1 세포 사망은 급격히 높아진 ROS 수치를 보인다. 상기 특징은 cdc13-1 세포 사망을 억제하는 분자를 탐색하는 데 사용될 수 있다. ROS 분석법은 실시예 1의 세포 생존 분석법보다 적은 시간이 걸리며, 실시예 1 및 2의 높은-처리량 스크리닝으로부터 확인된 주요 후보들을 확정하는 데뿐만 아니라, 높은-처리량 스크리닝에도 사용될 수 있다. 더불어, 상기 분석법은 산화방지제를 위한 스크리닝에도 사용될 수 있다.
도 20이 그 과정을 도시한다. 비-허용온도(섭씨 37도)에서 하루 동안 배양 후, 상기 처리된 세포들이 디하이드로로다마인(dehydrorhodamine) 123 (또는 다른 적합한 ROS 감지 물질)으로 어둠속에서 약 한시간동안 착색되었다. 플레이트들은 형광 마이크로플레이트 리더를 통해 읽혀진다. 음성 통제 집단(예를 들어, 스크린된 화합물 또는 구성 요소가 부재한 세포들)은 세포 사망 동안 높은 수치의 ROS를 가져야 할 것이다. ROS를 감소시키는 화합물 또는 구성 요소는 주요 후보로 고려되며, 상기 주요 후보는 이스트 및 인간 모델 모두에서 세포 사망 방지 및 미토콘드리아 기능 향상을 나타내는지에 대해 추가적으로 시험된다. 그리고나서 암, 뉴론 퇴행 및 다른 노화에 수반된 질병 또는 장애를 예방하는 활동이 온전한 모델에서 추가적으로 시험된다.
실시예 4
미토콘드리아 질량 측정을 통한
말단 소립 기능 장애 모델에서 노화 세포 퇴화를 방지하는 물질의 확인
Cdc13-1에서의 세포 사망은 미토콘드리아 질량의 급격한 증가를 동반한다. 상기 특징은 cdc13-1 세포 사망을 억제하는 분자를 탐색하는 데 사용될 수 있다. 미토콘드리아 질량 분석법은 실시예 1에서의 세포 생존 분석법보다 적은 시간이 걸리며, 실시예 1, 2 및 3의 높은-처리량 스크리닝으로부터 확인된 주요 후보들을 확정하는 데뿐만 아니라, 높은-처리량 스크리닝에도 사용될 수 있다.
비-허용온도(섭씨 37도)에서 하루 동안 배양 후, 상기 처리된 세포들이 미토트래커 그린(MitoTracker Green) (또는 다른 적합한 미토콘드리아 질량 착색 물질) 어둠속에서 20분동안 착색되었다. 플레이트들은 형광 마이크로플레이트 리더를 통해 읽혀진다. 사망 세포들이 막 포텐셜을 잃은 퇴화된 미토콘드리아를 더 많이 포함하기 때문에, 사망 세포들은 미토콘드리아 질량 착색에서 급격한 증가를 보인다. 미토콘드리아 기능을 향상시키고 세포 사망을 방지하는 화합물 또는 구성 요소는 미토콘드리아 퇴화를 감소시키고, 미토콘드리아 질량 신호를 감소시키며, 따라서 양성 물질로 고려된다. 상기 양성 물질들은 이스트 및 인간 모델 모두에서 노쇠를 연장하는 능력이 있는 지에 대해 추가적으로 시험된다.
실시예 5
노화 세포의 사망을 방지하는
DNA 및 핵산 라이브러리로부터의 생물학적 분자 확인
Li-PEG 트랜스펙션 방법이 본 실시예에서 설명된다. 그러나, 다른 트랜스펙션 방봅 또한 사용될 수 있다. 로그기(log phase)의 신선한 이스트 세포(cdc13-1)가 증류수로 광범위하게 세척된다. 그리고나서 세포들은 트랜스펙션 버퍼(2 mM tris pH7.5, 100 mM LiAC, 0.5 mM MgAC2, 0.1 mM CaAC2, 15％ 글리세롤, 40％ PEG-4000, 24 ug/mL ss DNA) 및 DNA 라이브러리와 함께 섭씨 24도에서 1-4시간 동안 배양된다. 상기 혼합물에는 약 섭씨 42도에서 15분 동안 열-충격이 가해진다(heat-shocked). 풍부한 배양액 YEPD의 세 볼륨이 상기 혼합물에 추가되고 상온에서(약 섭씨 24도) 한 시간 동안 배양된다. 액체를 제거하기 위한 원심분리 후, 세포들은 증류수에 재-서스펜드되고 특별한 라이브러리를 위한 선택 배양액 플레이트(selecting medium plates) 위에 놓여진다. 허용온도 섭씨 24도에서 적어도 4일 동안 배양 후, 형질 변환을 일으킨 세포들이 수확되고 액체 선택 배양액으로 허용온도(약 섭씨 24도)에서 배양된다. 로그 기의 세포들은 cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발된 세포 사방을 허용하기 위해 비-허용온도(약 섭씨 37도)로 옮겨지고 2일 동안 배양된다. 그리고나서 상기 세포들은 완전히 희석되고, YEPD 배양액 상에 놓여지며 약 섭씨 24도에서 4일 이상 동안, 또는 생존 세포들이 군집을 형성할때까지, 배양된다. 상기 군집들은 채취되고, 각 군집으로부터 DNA가 개별적으로 분리되어 PCR(DNA 폴리머라아제 연속 반응)에 의해 증폭된 후 DNA 서열을 확인하기 위해 배열된다. 그리고나서 정제된 DNA를 다시 cdc13-1 세포에 도입함으로써 cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 방지할 수 있는 DNA가 확정된다. 그 후 양성 물질들이 노화한 인간 섬유아세포의 퇴화 방지 및 미토콘드리아 기능과 산화적 스트레스의 조절을 나타내는지에 대해 검사된다.
실시예 6
중단( disruption ) 또는 유전자 삭제 라이브러리로부터의 세포를 촉진할 수 있는 단백질 확인
말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 세포 사망을 촉진하기 위한 기능을 갖는 단백질을 스크리닝 또는 확인하기 위하여, 유전자 중단 라이브러리, 예를 들면, 이스트 트랜스포슨 삽입 라이브러리, 는 cdc13-1 스트레인(strain)에 도입될 수 있다. 이와는 달리, cdc13-1가 이스트 삭제 스트레인 라이브러리로 도입될 수 있으며, 이 때 각 스트레인은 특정한 유전자 삭제를 갖는다. Cdc13-1p의 비활성화에 의해 유발되는 세포 사망을 방지할 수 있는 삭제 또는 중단을 갖는 단백질은 일 후보로 고려된다.
실시예 7
포유류 세포에서 미토콘드리아 생물발생을 자극하는 물질의 확인
본 실험은 인간 세포에 직접적으로 수행될 수 있다. 세포 라인은 특별한 노화에 수반되는 질병 또는 장애에 따라 선택된다. 96-웰 플레이트 내의 세포들은 미토콘드리아 막 포텐셜의 효과를 제거하기 위하여 약 하루 동안 처리되고 에탄올로 고정되며(최후에는 약 60％), 미토 트래커 염료(Mito Tracker dye, Invitrogen)으로 착색된다. 형광 신호가 형광 플레이트 리더에서 읽혀진다. 처리되지 않은 세포들과 비교하여 미토콘드리아 형광 신호의 20％의 증가는 양성 물질로 고려되며, 상기 양성 물질들은 cdc13-1 및 WI-38 모델에서 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 세포 손실 방지 효과를 갖는지, 및 미토콘드리아 막 포텐셜 및 ROS 수치에 효과를 갖는지에 대하여 시험된다.
미토콘드리아 생물발생을 자극하는 후보들을 스크리닝하기 위한 대체적인 방법은 미토콘드리아 생물발생을 위한 전사 요소의 mRNA가 상향 조정되었는지 여부를 시험하기 위하여 신시간-양적-리버스-전사 폴리머라아제 연속 반응(real-time-quantitative-reverse-transcription polymerase chain reation, 종종 qRT-PCR로 표기됨)을 이용하는 것이다. 미토콘드리아 생물발생을 위한 전사 요소는 TFAM, NRF-1, NRF-2, PGC-lα, PGC-lβ, TFBlM, TFB2M, ERRs (ERRα, ERRβ, ERRγ, PRC, POLRMT, PPAPs (PPAPα, PPAPγ, PPAPδ), 및 RIP140를 포함한다. 여기서 TFAM은 예시로써 사용되었고 인간 초기 세포가 사용되는 것이 더 바람직하다. 96-웰 플레이트(또는 다른 형태의 플레이트)에 심어진 WI-38 세포들은 원하는 기간 동안(예를 들어, 약 18시간) 화합물 라이브러리와 함께 배양된다. 세포들은 PBS로 세척되고 택맨 진 익스프레션 셀-투-CT 킷(TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit, Applied Biosystems 사)을 통해 플레이트에 용해되며, 상기 택맨 진 익스프레션 셀-투-씨티 킷은 DNA를 분리하고 RT-PCR을 통해 세포 용해물을 준비한다. 세포 용해물은 새로운 세트의 96-웰 플레이트에 퀴아진 원-스텝 qRT-PCR 킷(Qiagene's one-step qRT-PCR kits) 및 퀀티패스트 멀티플렉스 RT-PCR 킷(QuantiFast Multiplex RT-PCR Kits)으로부터의 시약과 함께 용해된다. TRAM을 위한 프라이머 세트 ACAGCTAACTCCAAGTCAGATTATGTC-3' 및 5'-GTAGACACTTGAGACT AACAACCGT-3', 및 β-액틴(통제 집단)을 위한 5'-CAAAGACCTGTACGCCAACACAGTS' 및 5'-TTGCTGATCCACATCTGCTGGAAG-3' 또한 사용될 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 50pM 라파마이신 및 다른 물질을 통하여 TFAM mRNA 증가를 감지하는 데 성공적으로 사용된 바 있다(데이터는 도시되지 않았으며, Fu X, et a\, PLoS ONE, 3(4): e2009, 2008에서 설명되 바와 같음). TFAM mRNA를 2배 이상 증가시키는 화합물 또는 구성 요소는 양성 물질로 고려되며, 상기 양성 물질은 cdc13-1 또는 WI-38 말단 소립 기능 장애 모델에서 노화 세포 유지를 보이는지 검사된다.
실시예 8
화합물 또는 구성 요소의 WI -38 섬유아세포에서의 노화 세포 손실 방지 활동 검사
알려진 약품, 자연에 존재하는 추출물 또는 자연적인 생성물, 알려진 펩티드, 또는 이스트 모델에서의 라이브러리 스크리닝으로부터 얻어진 후보와 같은 화합물 또는 구성 요소가 인간 세포에서 노화 방지 효과를 갖는지에 대해 검사될 필요가 있는 경우가 있다. 상기 희망되는 검사는 WI-38 섬유아세포를 이용하여 도 7에서 도시된 바와 같이 행해질 수 있다.
실시예 9
Cdc13 -1 이스트 세포를 이용한
라파마이신 및 그 파생물의 노화 방지 생물학적 농도 결정
라파마이신의 노화 방지 생물학적 농도(concentration of anti-aging-biologically active rapamycin) 또는 양이 결정되는 것이 필요한 경우가 있는데, 예를 들면, 정제된 라파마이신의 상이한 배치(batches)에서, 정제 과정 중의 샘플에서, 미가공의 추출물에서, 라파마이신 투여 후의 혈액 플라즈마에서, 또는 화학적으로 변경된 라파마이신 파생물에서이다. 다양한 원료로부터 라파마이신의 노화 방지 생물학적 농도를 결정하기 위해서는, 라파마이신을 포함하는 물질이 먼저 온전한 용제에 희망하는 연속 희석 횟수(3배 또는 10배 연속 희석)만큼 희석된다. 약 5％(부피로, 또는 이보다 적은)의 상기 희석된 물질이 그 후 YEPD 배양액에서 신선하게 10배 희석된 cdc13-1 세포들에게 추가된다. 세포 사망을 유발하기 위해 비-허용온도(약 섭씨 37도)에서 약 24에서 36시간 동안 배양 후, 생존한 세포의 수가 도 1에 도시된 집락형성능측정을 통해 측정된다. 활성화된 라파마이신의 표준 농도를 만들기 위하여, 정제된 라파마이신이 DMSO와 함께 1μM로 희석된다. 신선한 cdc13-1 하룻밤 배양균이 YEPD 배양앵게서 10배 희석된다. 상기 1μM 라파마이신은 세포 함유 배양액과 함께 10pM으로 3배 또는 2배 연속적으로 배양된다. 상기 혼합물은 그 후cdc13-1p 비활성화에 의해 유발된 세포 사망을 위하여 약 섭씨 37도에서 약 24-36시간 동안 배양된다. 표준 라파마이신 용액의 다양한 농도에서 생존한 세포의 개체수가 집락형성능측정을 통해 결정되고 표준 곡선을 얻기 위해 상기 개체수를 농도에 대하여 그래프로 도시한다. 다양한 라파마이신 원료에서 생존한 세포의 개체수가 그 후 상기 표준 곡선에 비교되고, 그에 따라 활성화된 라파마이신의 농도가 결정된다. 라파마이신 파생물을 위해서는, 먼저 상기 파생물에 대한 상기 표준 곡선이 생성된다. 집락형성능측정에 더하여, 세포자멸 분석법 및 cdc13-1 세포 사망에 의한 ROS 방출 또한 라파마이신의 노화 방지 생물학적 농도를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
본 방법은 다른 노화 방지 화합물 또는 구성 요소, 예를 들면, EGCG, 의 노화 방지 생물학적 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 더불어, 본 방법은 생물학적 샘플의 노화 방지 활동을 감지하는 분석법으로 사용될 수 있다.
실시예 10
Cdc17 -1 및 cdc17 -2 이스트 돌연변이를 이용한 노화 방지 물질 감지
라파마이신(1 및 3nM) 및 감소된 포도당이 노화 방지 물질의 예시로써 사용된다. 먼저 신선한 YEPD 또는 이스트 컴플릿 배양액(YC) 플레이트에 cdc17-1 및 cdc17-2 이스트 세포들을 스트리킹(streaking) 하고 그 후 단일의 군집이 형성될 때까지 5일 동안 허용 온도(약 섭씨 24도)에서 배양함으로써 cdc17-1 및 cdc17-2 이스트 세포들이 섭씨 -80도의 스톡으로부터 활성화된다. 적은 수의 이스트 군집들은 채집되어 YEPD 액체 배양액에서 허용 온도 섭씨 24도로 하룻밤동안 배양된다. 상기 하룻밤동안 배양된 배양균들은 0, 1 및 3nM의 라파마이신을 포함하는 신선한 YEPD 액체 배양액, 또는 0.5％ 포도당 YEPD로 희석(10배 희석)된다. DNA 폴리머라아제-알파의 비활성화에 의해 촉발된 성장 정지를 뒤따르는 세포 사망을 유발하기 위하여, 상기 혼합물은 그 후 비-허용 온도(약 섭씨 37도)에서 22시간 동안 배양된다. 생존한 세포의 개체수가 집락형성능측정을 통해 측정된다. 간단하게 말하자면, 상기 혼합물은 그 후 연속적으로 희석되고(10배), 그리고 작은 양의 세포(5μl)가 YEPD 플레이트 위에 놓여진다. 상기 플레이트는 생존 세포로부터 군집 형성을 허용하기 위하여 허용 온도(약 섭씨 24도)에서 적어도 4일 동안 배양된다. 도 21a에 도시된 바와 같이, 라파마이신은 cdc17-1 및 cdc17-2 이스트에서 DNA 폴리머라아제-알파의 비활성화에 의해 유발된 세포를 방지하였다.
실시예 11
est1 - ts 이스트 돌연변이를 이용한 노화 방지 물질 감지
본 모델에서 라파마이신이 노화 방지 물질의 예시로써 사용되었다. 본 출원인인의 이전 논문(Qi, H., et a, PlosOne, 2008)에 설명된 바와 같이 라파마이신은 ROS 유도 및 est1- ts 이스트 세포(estl- ts rad52::URA3)에서의 말단소립복원효소의 비활성화에 의해 유발된 사포자멸과 유사한 세포 사망을 방지할 수 있다. 상기 분석은 라파마이신-함유 플레이트 상에서 세포를 기름으로써 수행되었다. 상기 분석법은 높은-처리량 스크리닝을 적용하기 위해 액체 배양액에서 세포를 기름으로써 변형될 수 있다. 간단하게 말하자면, 먼저 신선한 YEPD 또는 이스트 컴플릿 배양액(YC) 플레이트에 estl- ts 세포들을 스트리킹(streaking) 하고 그 후 단일의 군집이 형성될 때까지 5일 동안 허용 온도(약 섭씨 24도)에서 배양함으로써 estl- ts 세포들이 섭씨 -80도의 스톡으로부터 활성화된다. 적은 수의 이스트 군집들은 채집되어 YEPD 액체 배양액에서 허용 온도 섭씨 24도로 하룻밤동안 배양된다. 상기 하룻밤동안 배양된 배양균들은 0 또는 1nM의 라파마이신을 포함하는 신선한 YEPD 배양액으로 약 100에서 300배 희석된다. 상기 혼합물은 비-허용 온도(약 섭씨 37도)에서 약 2일 동안 배양된다. 세포들은 1nM 라파마이신을 포함하는 신선한 YEPD 배양액 또는 통제 용제로 다시 한번 약 100에서 300배 희석되고 비-허용 온도(약 섭씨 37도)에서 약 2일 동안 배양된다. 비-허용 온도에서의 말단소립복원효소의 비활성화는 말단 소립의 점진적인 단축을 초래하고 결국은 말단 소립 기능 장애르 초래하며, 상기 말단 소립 기능 장애는 ROS 유도 및 세포자멸과 유사한 세포 사망을 초래한다. 세포 사망은 세포자멸 분석법 또는 ROS 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 ROS 유도는 상기 세포들을 디하이드로로다마인(dehydrorhodamine) 123 용액(PBS 버퍼 내에 약 5μg/mL)와 함께 어둠에서 배양하고 그 후 FACS 분석을 수행함으로써 측정될 수 있다. 세포 사망은 실시예 2에서의 케스페이스(caspase) 활동을 통해 측정된다.
B. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 및 치료하기 위한 영양소/ TOR / AMPK /미토콘드리아/노화 세포 겨냥
실시예 12
포유류 모델 시스템에서 노화 세포 경로의 구성 요소 측정
본 실시예는 노화 방지 물질에 의해 유발된 포유류 세포내에서의 노화 세포 경로 내의 주요 단백질의 증가를 결정하기 위하여 웨스턴 블라팅(Western blotting)을 사용하였다. 최후의 분열 후 20번째 날의 WI-38세포(노화 세포)가 표시된 투여량의 라파마이신과 함께 18시간 동안 처리되었다. 세포 용해물은 그 후 웨스턴 블라팅을 통해 분석되었다. 노화 세포 경로 내의 주요 단백질, p53, p21 및 pRB, 는 적은 투여량의 라파마이신(50 및 100pM)을 통해 증가되었으나, 2000pM의 높은 투여량을 통해서는 증가되지 않았다(도 9c).
실시예 13
노화에 수반되는 질병에 반하는 활동 또는 화학적 항암 물질 내의 활동을 나타내는 물질은 미토콘드리아 기능을 자극하고 노쇠를 연장한다
도 7, 10 및 11에 도시된것과 같은 실험들이 수행되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 50pM 라파마이신, 250μM AICAR, 20μg/ml EGCG, 1.6μg/ml GSE, 감소된 포도당(0.4％ 에서 0.2％), 20μg/ml 빌베리 추출물(BE), 1μM AITC, 및 12.5μM 2-데옥시포도당은 미토콘드리아 질량, 증가된 미토콘드리아 생물발생의 지표, 을 증가시켰고, 또한 노쇠한 WI-38 섬유아세포의 세포 손실을 방지하였다(도 7). 더불어, 미토콘드리아 질량을 증가시키는 페닐 아이소타이오시안산염(PEITC), 실리비닌, 아셀렌산염(Na2SeO3), 및 제니스테인 또한 이스트 세포 내에서 말단 소립 사망에 대한 다양한 수준의 보호 효과를 나타내었다(도 10 및 도 11).
실시예 14
AMPK 활성물은 TPA 에 의해 유발된 NIH3T3 세포의 변환을 억제한다
도 19에 도시된것과 같은 실험이 수행되었다. 간단하게 말하자면, 1500 NIH3T3 세포들이 배양균 배양액(소 태아 혈청(bovine fetal serum) 10％가 들어간 기저 배양액)내의 0.4％ 아가로스의 50μL와 함께 혼합되었고, 배양균 배양액 내의 0.8％ 아가로스의 50μL로 미리 덮힌 96-웰 플레이트 상에 펼쳐졌다. 그 후, 최종적으로 DMSO, 10μΜ TPA, 40μM AICAR, 또는 10μM TPA+40μM AICAR를 만들기 위한 약품들을 포함한 배양균 배양액의 100Μl이 상기 웰에 추가되었다. 상기 세포들은 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5％CO2와 7일 이상 동안 배양되었다. 신선한 배양액의 50μL가 매 5일 마다 추가되었다. 그 후 현미경 아래에서 군집들의 수가 세어졌다. 도 12에 도시된 바와 같이, TPA는 NIH3T3세포 내의 미토콘드리아 질량을 급격히 감소시켰다. AMPK 활성물 AICAR는 상기 감소를 뒤집었따(도 12). 더불어, AICAR는 또한 TPA에 의해 유발된 NIH3T3의 변환을 감소시켰따(도 13a 및 eh 13b).
C. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 및 치료하기 위한 TOR 억제제의 CR 모방으로서의 사용
TOR 억제제 및 라파마이신 . 특정한 TOR 억제제 라파마이신(시롤리머스, Sirolimus)는 대환식의(macrocyclic) 트리엔 분자의 분류의 원래 구성원이며, CCI779(Temsirolimus), RAD-001(Everolimus), AP-23573(Deforolimus), AP-23675, AP-23841, ABT-578(Zotarolimus), 7-에피-라파마이신, 7-티오메틸-라파아미신, 7-에피-트리메톡시페닐-라파마이신, 7-에피-티오메틸-라파마이신, 7-디메톡시-라파마이신, 32-디메톡시-라파마이신, 2-데스메틸-라파마이신, 및 42-O-(2-하이드록시)에틸 라파마이신을 포함한다. 라파마이신은 본래 항진균성(antifungal) 활동을 갖는 것으로 발견되었다(Vezina, C, et ah, J. Antibiot., 28:721 (1975); Sehgal, S.N., et ah, J. Antibiot., 28:727 (1975); Baker, H.A., et ah, J. Antibiot., 31:539 (1978); 미국특허공보 3,929,992, 및 미국특허공보 3,993,749).
라파마이신은 면역 억압제로서 사용된다(Santos, E. and Nebreda, A.R., FASEB, 3:2151-2163 (1989)): 전신 홍반성낭창(systemic lupus erythematosus)(미국특허공보 5,078,999), 폐 염증 (미국특허공보 5,080,899), 장기 이식 거부, 관절염(Carlson, et ah, J. Pharmacol. Exp. Ther., 266:1125-1138 (1993); Foroncewicz et al, Transpl. Int., 18:366-368 (2005)), 안구 염증(미국특허공보 5,387,589) 및 심장 염증성 질병(미국특허공보 5,496,832)을 예방 또는 치료하고, 평활근 세포 급증 및 혈관 부상을 뒤따라 내막이 두꺼워지는 것(미국특허공보 5,288,711 및 5,516,781)을 예방하며, 또한 레스티노시스(restenosis) (미국특허공보 6,585,764)를 예방하기 위한 스텐트로써 사용된다. 노화에 수반된 시력 감퇴(AMD) (미국특허공개공보 20060182771, 20060247265, 20060263409, 및 20070105761, 20060264453), 맥락막 신혈관형성(CNV), 및 젖은 AMD(미국특허공개공보 20050187241)를 포함한 안구 상태(미국특허공보 7,083,802)를 치료하기 위한 용도로 특허를 받았다.
라파마이신은 반-확산적 및 항암 활동을 갖는 것으로 보여져왔다. 라파마이신 그 자체, 또는 다른 약품과의 조합, 은 성인 T-세포 백혈병/림프종(미국특허공보 4,885,171 및 4,401,653; 유럽특허공개공보 525,960 Al), 악성 상피성 암(미국특허공보 5,206,018), 및 빈혈증 미국특허공보 5,561,138)에 반하는 항종양 활동을 갖는 것으로 보여져왔다. 라파마이신은 전이성 유방암(미국특허공개공보 20070104721), 종양(미국특허공개공보 20040176339 및 20060035904), 및 초기 B 세포로부터 파생된 급성 림프아구성 백혈병(미국특허공보 7,026,330)을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 라파마이신은 또한 결절성경화증 치료(미국특허공개공보 20050070567), 표유류에서 비정상적인 세포 성장 억제(미국특허공개공보 20060035907), 세포 증식 감소 및 종양 세포의 세포자멸 촉진(미국특허공개공보 20060094674), 및 세포 증식 및 염증성 장애 치료(미국특허공개공보 20060135549), 및 만성적 바이러스성 감염(미국특허공개공보 20070099844) 치료를 위한 용도로 특허를 받았다.
라파마이신/mTOR 억제제의 단독 또는 다른 물질과의 조합으로의 사용은 다양한 다른 질병 또는 상태를 치료하는 것으로 보고된 바 있으며, 이는 진성 당뇨병(미국특허공보 5,321,009), 피부 장애(미국특허공보 5,286,730), 창자 장애(미국특허공보 5,286,731), 신경 장애(미국특허공보 6,187,756), 신경퇴행성 질병(미국특허공개공보 20060173033), 뼈 손실 미국특허공개공보 20070059336), 반-혈관형성적 지속된 방출 안 내 삽입(anti-angiogenic sustained release intraocular implants) 및 자식작용의 유발에 의한 단백질 배좌성(conformational) 장애(미국특허공개공보 20070155771)를 포함한다.
라파마이신은 TOR 및 FKBP12 사이에 복합체를 형성하고 TOR 및 TOR-랩터 복합체(TORC1)와 같은 그 정상적 기질 사이의 복합체 형성을 억제하는 것이 발견되었다. TORC1 형성의 억제는 단백질 억제, 번역 및 리보좀의 생물발생을 초래하여, 그 결과 G1기에서 세포 사이클 억제를 초래하였다. TORC1 억제는 단백질의 퇴행을 위한 자식작용 증가 및 영양소를 위한 세포소기관의 증가를 초래하였다. 종래에 있어서, 다양한 질병에 대한 치료용 투여량에서의 라파마이신의 보고된 용도는 기본적으로 TORC1 중단 및 차후의 세포 사이클 G1 억제 및 자식작용에 기초한다. 이와는 반대로, 본 발명에서는, 라파마이신 및 그 상사 물질은 AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로를 통한 노화에 수반되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 칼로리 제한의 모방으로써 적은 투여량으로 사용된다.
실시예 15
적은 투여량의 라파마이신은 TPA 에 의해 유발된 NIH3T3 세포의 변환을 억제한다
NIH3T3 세포의 변환은 좋은 생체 밖의 종양 형성 분석법이며, 상기 종양형성 분석법은 부드러운 한천에서의 군집 형성(앵커리지-독립 성장이라 칭해짐)을 측정한다. 돌연변이유발요인 TPA(12-O-테트라디카노일포르볼 13-아세테이트)는 단백질 키나아제 C(PKC)를 자극하고, 종양유전자를 활성화시키며 마우스 배아 섬유아세포 NIH3T3를 변환하는 것으로 알려졌다. NHI3T3 세포의 TPA에 의해 유발된 앵커리지-독립 성장은 종양형성 분석법으로써 도입되었다. 흥미롭게도, 10μM TPA는 NIH3T3 세포에서 미토콘드리아 질량을 급격하게 감소시켰고, 도 2에 도시된 바와 같이, 1nM 라파마이신이 상기 감소를 뒤집었다. 더불어, 1nM 라파마이신은 또한 10 μM TPA에 의해 유발된 NIH3T3 세포 변환을 제거하였다. 1500 NIH3T3 세포들이 배양균 배양액(소 태아 혈청(bovine fetal serum) 10％가 들어간 기저 배양액)내의 0.4％ 아가로스의 50μL와 함께 혼합되었고, 배양균 배양액 내의 0.8％ 아가로스의 50μL로 미리 덮힌 96-웰 플레이트 상에 펼쳐졌다. 그 후, 최종적으로 DMSO, 10μΜ TPA, 1nM 라파마이신, 또는 10μM TPA+1nM 라파마이신을 만들기 위한 약품들을 포함한 배양균 배양액의 100Μl이 상기 웰에 추가되었다. 상기 세포들은 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5％CO2와 7일 이상 동안 배양되었다. 신선한 배양액의 50μL가 매 5일 마다 추가되었다. 그 후 현미경 아래에서 군집들의 수가 세어졌다. 도 13a 및 도 13b에 도시된 바와 같이, 1nM 라파마이신이 상기 과정을 완전히 차단하였다. 1nM 라파마이신이 NIH3T3의 성장율을 약간 느리게 하였는 바, 천천히 성장하는 군집들을 기다리기 위하여 배양 21일 후에도 군집들의 수가 세어졌다. 그러나, 동일한 결과가 도출되었다. 따라서, 1nM 라파마이신에 의한 느린 성장은 군집 형성의 제거 원인이 아니다. 상기 느린 성장은 오히려 노쇠 유지를 통해 앵커리지-독립 성장 또는 종양형성을 방지하는 기능을 하는 미토콘드리아의 역할을 지지한다. 이와는 반대로, 치료용 투여량의 라파마이신은 종양형성을 촉지하고 따라서 림프종, 피부 암 및 인간의 다른 암이 발생활 확률을 증가시키는 것으로 보고되어왔다. 최근에 발견된 치료용 투여량의 라파마이신의 항종양형성 활동은, G1 세포 사이클의 억제 및 단백질 합성 억제로부터 추측해 볼 때, 기 존재하는 종양의 성장을 제한하는 것이다.
더불어, AMPK를 활성화하고 인간의 노쇠한 초기 섬유아세포의 수명을 연장하는(도 7) AICAR(40μM)는 또한 앵커리지-독립 성장을 억제할뿐만 아니라(도 13a 및 13b), TPA에 의해 촉발된 미토콘드리아 질량 감소를 뒤집는다(도 12). 상기 데이터는 앵커리지-독립 성장 또는 종양형성을 방지하는 미토콘드리아 기능의 역학을 뒷받침한다. 결론적으로, 적은 투여량의 라파마이신 및 AICAR는, 적어도 돌연변이유발인자 TPA에 의해 유발된 경우에, 종양형성을 방지한다.
실시예 16
적은 투여량의 라파마이신은 ROS 를 감소시키고 배양된 GCN 뉴론 세포의 수명을 연장한다
소뇌 그래뉼 뉴론(CGN) 배양균은 7일 된 래트 새끼로부터 준비되었다. 간단하게 말하자면, 소뇌가 뇌로부터 분리되어 20Mm HEPES 버퍼 내의 BMEM(BMEM-HEPES)를 포함하는 페트리 접시에 놓여졌다. 소뇌는 뇌막이었고 혈관은 내피 세포로부터의 최소한의 오염을 보장하기 위하여 버려졌다. 소뇌 피질은 그 후 해부용 칼을 이용하여 조밀한 조각으로 다져지고 섭씨 37도에서 15분동안 트립신처리되었다. 트립신처리는 0.025％ 대두 트립신 억제제 및 0.05％ DNase Ⅰ을 포함하는 BME 1Ml를 추가함으로써 억제되었다. 상기 조직은 그것이 동종의(homogeneous) 서스펜션으로 흩어질 때까지 파이어폴리쉬된 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)으로 부드럽게 연마되었다. 상기 서스펜션은 에탄올로 살균된 40-μm 그물망으로 걸러졌고 원심분리법으로 작은 알갱이화되었다. 상기 소뇌 그래뉼 뉴론을 포함한 작은 알갱이들은 25mM KCl을 함유한 B27이 첨가된 뉴론기저 배양액(Neurobasal medium, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 재-서스펜드되었다. 세포들은 그 후 24-웰 플래이트(1 plate/cerebellum)에 심어지고 B27, 20mM KCl, 0.5mM 글루타민, 100units/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 뉴론기저 배양액(Neurobasal medium, Invitrogen)에서 배양되었다. 라파마이신은 그 후 상기 배양균에 7일 후, 31일 후에 추가되었고, 뉴론 세포의 생존율을 결정하기 위하여 MTT 분석법이 수행되었다. 도 14a에 도시된 바와 같이, CGN 세포의 많은 수가 31일 후 배양균에서 이미 사라졌다. 그러나, 적은 투여량의 라파마이신이 이러한 손실을 방지하고 배양균에서 GCN 세포의 수명을 연장하였으나, 높은 투여량의 라파마이신은 그러한 효과를 갖지 않았다.
ROS 분석을 위해서, 뉴론기저 완성 배양액(Neurobasal complete medium) 내의 서스펜션 배양균 내의 새롭게 분리된 CGN 세포들이 12X75mm 튜브 내에 1백만세포/mL/tube의 밀도로 심어졌다. 세포들은 20시간 동안 라파마이신으로 처리되었고 그 후 FACS 분석 전에 2μg/mL 디하이드로로다마인(dehydrorhodamine) 123으로 30분 동안 착색되었다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 라파마이신은 서스펜션 내의 CGN 세포의 통상의 ROS 수치를 감소시켰다.
실시예 17
적은 투여량의 라파마이신은 래트 뇌졸중 모델에서 소뇌 경색 크기를 감소시킨다
허혈성 뇌졸주의 중대뇌동맥(MCA) 폐색 모델이 본 실험에서 사용되었다. 자연 발증 고혈압 뇌졸중 경향(Spontaneously Hypertensive Stroke Prone, SHR-SP) 래트가 두 그룹(각 그룹 당 n=8)으로 랜덤하게 나누어졌다: 매치된 통제 DMSO 그룹 및 라파마이신 그룹. 그들은 15％ 클로랄 하이드레이트 (300mg/kg, i.p.)로 마취되었다. 영구적인 포컬 소뇌 국소성빈혈(Permanent focal cerebral ischemia)가 타무라 및 맥길에 의해 설명된 방법을 변경하여 사용함으로써 MCA의 말단 부분의 전기응고를 통해 유발되었다(Tamura, A., et al, J. Cerebral. Blood Flow Metab., 1:53-60 (1981). McGiIl, J.K., et ah, Stroke, 36:135-141 (2005)). 간단하게, 후각 번들(olfactory bundle) 및 하대뇌정맥 사이의 오른쪽 MCA의 한 조각이 전기응고되었다. 혈액 공급을 완전히 중단시키기 위하여 마이크로시저로 상기 응고된 동맥을 잘랐다.
라파마이신 및 조절 DMSO는 MCA 폐색 후 10분 뒤 투여되었다. MCA 폐색 24시간 후 뇌 샘플이 채취되었다. 코로날(coronal) 부위(2mm 두께)는 즉시 2％ 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화물 (TTC)로 착색되었다. 경색 부위는 옅은 색인 반면, 정상 부분은 적색으로 나타났다. 경색 부분 및 각 부위(양쪽 모두)의 반구 부분은 이미지 분석 시스템 (Microsystems Type DM LB2, Leica, Germany)을 통해 추적되고 정량화되었다. 경색 부피를 평가하는데 있어 나타날 수 있는 뇌 부종(edema)의 방해는 허혈성이 아닌(nonischemic) 동측 반구의 부피를 반대쪽 반구의 부피에서 빼는 표준 방법을 사용하여 보정되었다. 상기 경색 부분은 상기 반대쪽 반구의 퍼센테이지로 표현되었다. 경색 조직 및 상기 반구의 무게가 비슷한 방법으로 측정되었다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 적은 투여량의 라파마이신 10μg/kg은 MCA 폐색에 의해 유발된 경색 부피를 급격하게 감소시켰다. 반대로, 보통 투여량의 라파마이신 1mg/kg은 상기 효과를 가지지 않았으며, 이는 논문에서 보고되었다(Sharkey, JJ. and Butcher, S. P., Nature, 371:336-339 (1994)). 더불어, MCA 폐색 20일 전 0, 0.3, 1, 3 및 10 μg/kg 투여량의 라파마이신 투여 또한 뇌 손상을 방지하였다(도 15b).
실시예 18
적은 투여량의 라파마이신은 MPP +에 의해 유발된 ROS 를 감소시킨다
MPP+, 미토콘드리아 호흡 연쇄 내의 복합체 Ⅰ(NADH CoQ1 환원효소)의 억제제, 는 도파민작동성 신경독소이다. 이는 통상적으로 해양 모델에서 파킨슨병을 유발하기 위하여 사용된다. 인간의 초기 섬유아세포 WI-38이 200μM MPP+로 3일 동안 처리되었다. 도 14에 도시된 바와 같이 다양한 농도의 라파마이신이 추가된 MPP+ WI-38 세포와 함께 3일 동안 배양되었다. 세포들은 그 후 FACS를 통해 분석되었다. 디하이드로로다민(dehydrorhodamine) 123은 ROS 수치에 비례하여 (형광을 보이는) 로다민으로 산화될 수 있다. 도 16에 도시된 바와 같이, MPP+는 ROS 수치를 크게 증가시켰다. 피코몰(pM) 범위의 적은 투여량의 라파마이신은 상기 증가를 급격하게 감소시켰다.
실시예 19
적은 투여량의 라파마이신은 래트 모델에서 심근 경색 크기를 감소시킨다
래트에서 심근 경색(MI)를 결정하기 위해서, 200에서 250g의 수컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley, SD) 래트들이 사용되었다(각 그룹 당 n=10~12). MI 실험 전 3일 동안 0, 10 및 100μg/kg/day 투여량의 라파마이신이 투여되었다. 에테르 마취를 한 후, 왼쪽 개흉을 통해 심장이 꺼내어졌고, 왼측 앞쪽의 하향 동맥들이 폐로 유출되는 관과 좌심방 사이에 6-0 폴리프로필렌 봉합선으로 결찰되었다. 그리고나서 뛰고 있는 심장이 재빨리 통상의 위치로 되돌려지고, 흉곽이 닫혀지고, 그리고 공기가 제거되었다. 래트들은 전술된 상태로 우리 안으로 되돌려졌다. 관상 동맥 결찰 5시간 후, 래트들은 펜토바르비탈의 과다 복용으로 죽었다. 좌심실이 분리되어 심장의 긴 축에 수직 방향으로 4에서 5 조각으로 잘려졌다. 상기 조각들은 섭씨 37도에서 30분 동안 0.1％ 니트로 블루 테트라졸륨 인산염 버퍼에서 착색되었고 MI 크기가 참조 문헌에서 설명된 바와 같이 측정되었다(Lin, L.L., et al, J. Cardiovasc. Pharmaco., 50:327-332 (2007)). 정상 조직은 파란색으로 착색된 반면, 괴저성 조직은 착색되지 않았다. 상기 착색된 조직 및 착색되지 않은 조직을 분리하여 따로 무게를 재었다. MI 크기는 좌심실 총 무게에 대한 비율로 표현되었다. 도 16에 도시된 바와 같이, 적은 투여량의 라파마이신 10μg/kg/day은 심근 경색 크기를 급격하게 감소시켰지만, 높은 투여량 100μg/kg/day은 그러하지 않았다.
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Rapa 라파마이신
PI3K 억제제 LY294002
DATS 다이알릴 3황화물
BITC 아이소타이오시안산염
PITC 아이소타이오시안산염
RSV 레스베라트롤
PEITC 페네틸 아이소타이오시안산염
BE 빌베리 추출물
GSE 포도씨 추출물

Claims (73)

  1. 노화 세포 모델 시스템에 반하여(against) 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계; 및
    상기 화합물 또는 구성 요소의 노화 방지 활동을 추적 관찰하는 단계를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 노화 방지 활동은
    (a) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태의 퇴화 방지;
    (b) 미토콘드리아 기능 자극, 향상 또는 유지;
    (c) 미토콘드리아 또는 말단 소립의 손실과 연관된 노화에 수반되는 질병 또는 장애 예방; 및
    (d) 이스트에서 말단 소립 기능 장애에 의해 유발된 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 또는 세포자멸(apoptotic death)의 증가 방지 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 노화 세포 모델 시스템은
    (a) 기능 장애를 갖는 말단 소립을 포함한 돌연변이 이스트;
    (b) 불충분한 말단 소립 활동을 보이는 초기 인간 세포 라인(a primary human cell line);
    (c) 돌연변이, 또는 말단 소립 결합 단백질 또는 말단소립복원효소(telomerase) 결함에 의해 초래된 말단 소립 기능 장애를 보이는 인간 세포 라인;
    (d) 화학적 물질에 의해 초래된 말단 소립 기능 장애 모델;
    (e) 종양유전자(oncogene) 활성화 및/또는 DNA 손상 반응 활성화에 의해 생성된 모델; 및
    (f) 말단 소립 기능 장애를 보이는 마우스(mouse), 래트(rat) 또는 폼베(S. Pombe)의 세포 라인 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은
    (i) 화합물 또는 구성 요소를 이스트 세포와 함께 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의해 세포 사이클이 정지된 환경 아래에서 배양하는 단계;
    (ii) 세포자멸(apoptotic) 분석법을 이용하여 사망한 이스트 세포의 개체수를 측정하는 단계, 또는 대체적으로(alternatively);
    (iii) 세포 사이클 정지 환경을 제거하고 생존한 세포의 수를 측정하는 단계; 및
    (iv) 상기 (ⅱ)단계에서 얻은 사망한 세포의 개체수 또는 상기 (ⅲ)단계에서 얻은 생존한 세포 수를, 상기 화합물 또는 구성 요소를 제외한 채 상기 (ⅰ)단계와 동일한 환경 아래에서 수행된 통제 실험에서 얻은 사망한 세포의 개체수 또는 생존 세포 수와 각각 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 통제 실험에서 얻은 사망한 세포의 개체수와 비교한 상기 (ⅱ)단계에서 얻은 사망한 이스트 세포의 개체수 감소, 또는 상기 통제 실험에서 얻은 생존 세포 수와 비교한 상기 (ⅲ)단계에서 얻은 생존 세포 수의 증가는 상기 배양된 화합물 또는 구성 요소가 노화 방지 물질 후보(candidate)임을 나타내는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  5. 제4 항에 있어서,
    (v) 일정 기간 동안 상기 확인된 화합물 또는 구성 요소를 표유류의 노화 세포와 함께 배양하는 단계;
    (vi) 생존 세포의 개체 수를 측정하는 단계; 및
    (vii) 상기 (ⅵ)단계에서 얻은 생존한 포유류 노화 세포의 개체를 통제 실험에서 얻은 생존한 노화 세포 개체 수와 비교하는 단계를 더 포함하되,
    상기 통제 실험에서 얻은 생존 세포 수와 비교한 상기 (ⅵ)단계에서 얻은 생존 세포 수의 증가는 상기 세포와 함께 배양된 상기 화합물 또는 구성 요소가 노화 방지 물질 후보(candidate)임을 나타내는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  6. 제4 항 또는 제5 항에 있어서,
    (viii) 일정 기간 동안 상기 확인된 화합물 또는 구성 요소를 정상의 성장하는 인간 세포와 함께 배양하는 단계;
    (ix) 미토콘드리아 질량, 미토콘드리아 DNA 컨텐트(content) 또는 미토콘드리아 전사 인자의 표현(expression)을 측정하여 상기 인간 세포의 미토콘드리아 생물발생을 측정하는 단계; 및
    (x) 상기 (ⅸ)단계에서 얻은 결과를 통제 실험에서 얻은 결과와 비교하는 단계를 더 포함하되,
    상기 통제 실험에서 얻은 결과와 비교한 상기 (ⅸ)단계에서 얻은 미토콘드리아 생물발생의 향상은 상기 확인된 화합물 또는 구성 요소가 노화 방지 물질 후보(candidate)임을 나타내는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  7. 제3 항 내지 제6 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 돌연변이 이스트는 cdc13-1, cdc13-2, stn1-1, cdc17-1, cdc17-2, hdf1, hdf2, est1, est2 및 est3 중 어느 하나인 기능 장애를 갖는 말단 소립을 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  8. 제3 항 내지 제6 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 불충분한 말단 소립 활동을 보이는 초기 인간 세포 라인은 섬유아세포(fibroblasts), 내피 세포(endothelial cells) 및 상피 세포(epithelial cells) 중 적어도 하나를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  9. 제3 항 내지 제6 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 말단 소립 기능 장애를 보이는 초기 인간 세포 라인은 TRF2, POT1, TERT, TERC 또는 WRN 내 돌연변이를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  10. 제3 항 내지 제6 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 화학적 물질은 블레오마이신(bleomycin), 아드리아마이신(adriamycin) 또는 G-사중식 리간드(G-quadruplex ligand)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 각각 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  13. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    하나 이상의 합성물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계; 및
    TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로 중 적어도 하나의 요소(component)에 반한(against) 상기 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소의 활동을 감지하는 단계를 포함하되,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지하고,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 퇴화, 노화 세포 및 체세포분열 이후 세포에서의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화력 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    상기 TOR/AMPK/미토콘드리아/노화 세포 경로의 요소는 인슐린/IGF, 인슐린/IGF 수용기, PI3K, PDK1, PTEN, TSC1, TSC2, AKT, Rheb, 랩터(raptor), GβL, S6K, TOR, 포도당 흡수(uptake), 아미노산 흡수, AMPK, STRAD, MO25, LKB1, PGC-1α, PGC-1β, NRF-1, NRF-2, TFAM, TFB1M, TFB2M, ERRs (ERRα, ERRβ, ERRγ), PPARs (PPARα, PPARδ, PPARγ), SIRT1, RIP140, PRC, POLRMT, CaMKKβ, ATM, p53, p21, p19ARF, waf1, P16INK4a, pRB, E2F, PTEN 및 p27KIP1을 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  15. 제13 항 또는 제14 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  16. 제13 항 내지 제15 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 각각 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  17. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    하나 이상의 합성물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계; 및
    영양소 신호 경로(nutrient signaling pathway) 중 적어도 하나의 요소(component)에 반한(against) 상기 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소의 활동을 감지하는 단계를 포함하되,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지하고,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 및 체세포분열 이후 세포에서의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화력 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서,
    상기 영양소 신호 경로의 요소는 인슐린/IGF, 인슐린/IGF 수용기, PI3K, PDK1, PTEN, TSC1, TSC2, AKT, Rheb, 랩터(raptor), GβL, S6K, TOR, AMPK, STRAD, MO25, LKB1, 포도당 흡수(uptake), 아미노산 흡수 및 CaMKKβ를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  19. 제7 항 또는 제 18 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  20. 제17 항 내지 제19 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 각각 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  21. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    하나 이상의 합성물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계; 및
    미토콘드리아 생물발생 경로(mitochondrial biogenesis pathway) 중 적어도 하나의 요소(component)에 반한(against) 상기 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소의 활동을 감지하는 단계를 포함하되,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지하고,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 및 체세포분열 이후 세포에서의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망, 노화 세포 퇴화, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화력 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  22. 제21 항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 생물방생 경로의 요소는 AMPK, STRAD, MO25, LKB1, PGC-1α, PGC-1β, NRF-1, NRF-2, TFAM, TFB1M, TFB2M, ERRs (ERRα, ERRβ, ERRγ), PPARs (PPARα, PPARδ, PPARγ), SIRT1, RIP140, PRC, POLRMT, ATM 및 CaMKKβ를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  23. 제21 항 또는 제22 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  24. 제21 항 내지 제23 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 각각 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  25. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    하나 이상의 합성물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계; 및
    AMPK 경로(AMPK pathway) 중 적어도 하나의 요소(component)에 반한(against) 상기 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소의 활동을 감지하는 단계를 포함하되,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지하고,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 퇴화, 노화에 수반되는 세포 손실, 또는 종양형성(tumorigenesis) 및 암의 악성 발전과 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  26. 제25 항에 있어서,
    AMPK 경로의 요소는 AMPK, ATM, LKB1, STRAD, MO25 및 CaMKKβ를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  27. 제25 항 또는 제26 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  28. 제25 항 내지 제27 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 각각 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  29. 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    하나 이상의 합성물 또는 구성 요소를 스크리닝하는 단계; 및
    노화 세포 경로(senescence pathway) 중 적어도 하나의 요소(component)에 반한(against) 상기 하나 이상의 합성물 또는 구성 요소의 활동을 감지하는 단계를 포함하되,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질은 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지하고,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 퇴화, 노화 세포 및 체세포분열 이후 세포에서의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망, 가속화된 미토콘드리아 퇴화 및 증가된 산화력 스트레스(oxidative stress), 또는 말단 소립 기능 장애와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  30. 제29 항에 있어서,
    노화 세포 경로의 요소는 ATM, p53, p21, p19ARF, WAF1, P16INK4a, pRB, E2F, PTEN 및 p27KIP1을 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  31. 제29 항 또는 제30 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  32. 제29 항 내지 제31 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 하나 이상의 화합물 또는 구성 요소는 각각 화합물 및/또는 구성 요소의 라이브러리에 속하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 물질을 확인 또는 감지하는 방법.
  33. 제1 항 내지 제32 항 중 어느 하나에 따라 확인된 물질을 포함하는 구성 요소, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 상기 구성 요소, 상기 염 또는 상기 용매화학물의 프로드러그를 상기 구성요소, 상기 염, 상기 용매화학물 또는 상기 프로드러그를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포내의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화, 미토콘트드리아 기능 장애 또는 말단 소립 기능 장애와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  35. 제33 항 또는 제34 항에 있어서,
    상기 물질은 유기 분자, 무기 분자, 천연물(natural products), 펩티드, 단백질, DNA, RNA 및 상기 물질들의 대사 중간 생성물 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  36. 제33 항 내지 제35 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 물질은 AICAR, 적은 투여량의 라파마이신 또는 라파마이신의 상사 물질, EGCG, 포도씨 추출물, 빌베리 추출물, 아셀렌산염(selenite), 제니스테인(genistein), 다이알릴 3황화물(diallyl trisulfide), 벤질 아이소타이오사이안산염(benzyl isothiocyanate), 페닐 아이소타이오사이안산염(phenyl isothiocyanate), 페네틸 아이소타이오사이안산염(phenethyl isothiocyanate), 레스베라트롤(resveratrol), 리코핀(lycopene) 및 알릴 아이소타이오사이안산염(allyl isothiocyanate) 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  37. 제33 항 또는 제36 항에 있어서,
    산화방지제(antioxidant), 항고혈압제(antihypertensive agent), 지질저하제(lipid lowering agent), 항-뇌졸중 물질(anti-stroke agent), 항암 물질(anti-cancer agent) 및 상이한 노화 방지 물질 중 어느 하나인 제2 물질을 더 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  38. 제37 항에 있어서,
    상기 산화방지제는 비타민 C, 비타민 E, 베타 카로틴 및 다른 카로티노이드, 셀렌(selenium), 리포산(liopic acid), 리코핀(lycopine), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 코엔자임 Q10(coenzyme Q10), 글루타티온(glutathione), N-아세틸 시스테인(N-acetyle cysteine), 멜라토닌(melatonin), 제니스테인(genistein), 에스트라디올(estradiol), 차(tea) 추출물 및 포도씨 추출물 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  39. 제33 항 내지 제38 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 약리학적으로 허용가능한 케리어를 더 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  40. 제33 항 내지 제39 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 경구적으로(orally), 비경구적으로(parenterally), 피부를 통해서(topically, transdermally) 투여되거나, 좌약형(in a suppository) 또는 에어로졸 형태(aerosol form)로 투여되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  41. 제33 항 내지 제40 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  42. 제33 항 내지 제40 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 중복 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  43. 제33 항 내지 제42 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 대상은 포유류인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  44. 제33 항 내지 제42 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 대상은 인간인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  45. AMPK 활성물, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 상기 AMPK 활성물, 상기 염 또는 상기 용매화학물의 프로드러그를 상기 AMPK 활성물, 상기 염, 상기 용매화학물 또는 상기 프로드러그를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 AMPK 활성물, 상기 염, 상기 용매화학물 또는 상기 프로드러그는 직접 또는 간접적으로 AMPK를 활성화시키고, 미토콘드리아 생물발생을 증가시키며, 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포 내 세포 사이클 정지 상태를 유지하는,
    노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  46. 제45 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 미토콘드리아 기능 손실, 말단 소립 기능 장애, 노화 세포 퇴화 및 노화에 수반되는 세포 손실, 또는 미토콘드리아 퇴화 또는 체세포분열 이후의 세포내의 세포 사이클 정지 상태와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  47. 제45 항 또는 제46 항에 있어서,
    상기 AMPK 활성물은 AICAR, 2-데옥시포도당(2-deoxyglucose), 3-O-메틸포도당(3-O-methylglucose), LY294002, 베르베린(berberine), 펜포르민(phenformin), A-769662, 티아졸리딘디온(thiazolidinediones), 덱사메사손(dexamethasone), 스타틴(statins), 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 실로스타졸(cilostazol), EGCG, 아셀렌산염(selenite), 제니스테인(genistein), 알릴 아이소타이오사이안산염(allyl isothiocyanate) 및 페네틸 아이소타이오사이안산염(phenethyl isothiocyanate) 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  48. 제45 항 내지 제47 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 산화방지제(antioxidant), 항고혈압제(antihypertensive agent), 지질저하제(lipid lowering agent), 항-뇌졸중 물질(anti-stroke agent), 항암 물질(anti-cancer agent) 및 상이한 노화 방지 물질 중 어느 하나인 제2 물질을 더 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  49. 제45 항 내지 제48 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 약리학적으로 허용가능한 케리어를 더 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  50. 제45 항 내지 제49 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 경구적으로(orally), 비경구적으로(parenterally), 피부를 통해서(topically, transdermally) 투여되거나, 좌약형(in a suppository) 또는 에어로졸 형태(aerosol form)로 투여되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  51. 제45 항 내지 제50 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  52. 제45 항 내지 제50 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 중복 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  53. 제45 항 내지 제52 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 대상은 포유류인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  54. 제45 항 내지 제52 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 대상은 인간인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  55. 라파마이신 표적(target of rapamycin, TOR) 억제제를 포함하는 구성 요소, 또는 약리학적으로 허용가능한 염, 용매화학물 또는 상기 구성 요소, 상기 염 또는 상기 용매화학물의 프로드러그를 상기 구성요소, 상기 염, 상기 용매화학물 또는 상기 프로드러그를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 TOR 억제제는 (a) 복제 포텐셜을 연장하고, (b) 노화 세포 또는 체세포분열 이후의 세포에서 세포 사이클 정지 상태를 유지하고, 또는 (c) 미토콘드리아의 퇴화 또는 노화 세포의 퇴화를 뒤따르는 세포 사망을 방지하는,
    노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  56. 제55 항에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 미토콘드리아 기능 손실, 말단 소립 기능 장애, 노화 세포 퇴화 및 노화에 수반되는 세포 손실, 또는 미토콘드리아 퇴화 또는 체세포분열 이후의 세포내의 세포 사이클 정지 상태의 퇴화와 연관되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  57. 제55 항 또는 제56 항에 있어서,
    상기 TOR 억제제는 디포롤리머스(Deforolimus), AP-23675, AP-23841, 조타롤리머스(Zotarolimus), CCI779/템시롤리머스(Temsirolimus), RAD-001/에버롤리머스(Everolimus), 7-에피-라파마이신(7-epi-rapamycin), 7-티오메틸-라파마이신(7-thiomethyl-rapamycin), 7-에피-트리메톡시-라파마이신(7-epi-trimethoxy-rapamycin), 2-데스메틸-라파마이신(2-desmethyl-rapamycin) 및 42-O-(2-하이드록시)에틸-라파마이신(42-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin) 중 어느 하나인 적은 투여량의 라파마이신 또는 라파마이신의 상사물질(analog)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  58. 제57 항에 있어서,
    상기 적은 투여량의 라파마이신은 입증된 치료용 투여량(approved therapeutic dose)의 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 6% 이하, 약 4% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.01% 이하, 또는 약 0.001% 이하인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  59. 제57 항 또는 제58 항에 있어서,
    상기 적은 투여량의 라파마이신은 단일의 화합물(isolated compound), 미가공 추출물(crude extract), 또는 라파마이신을 포함하는 미정제된 미생물(unpurified microorganism)으로써 투여되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  60. 제59 항에 있어서,
    상기 미생물은 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  61. 제55 항 내지 제60 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 산화방지제(antioxidant), 항고혈압제(antihypertensive agent), 지질저하제(lipid lowering agent), 항-뇌졸중 물질(anti-stroke agent), 항암 물질(anti-cancer agent) 및 상이한 노화 방지 물질 중 어느 하나인 제2 물질을 더 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  62. 제61 항에 있어서,
    상기 산화방지제는 비타민 C, 비타민 E, 베타 카로틴 및 다른 카로티노이드, 셀렌(selenium), 리포산(liopic acid), 리코핀(lycopine), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 코엔자임 Q10(coenzyme Q10), 글루타티온(glutathione), N-아세틸 시스테인(N-acetyle cysteine), 멜라토닌(melatonin), 제니스테인(genistein), 에스트라디올(estradiol), 차(tea) 추출물 및 포도씨 추출물 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  63. 제55 항 내지 제62 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 약리학적으로 허용가능한 케리어를 더 포함하는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  64. 제55 항 내지 제63 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 구성 요소는 경구적으로(orally), 비경구적으로(parenterally), 피부를 통해서(topically, transdermally) 투여되거나, 좌약형(in a suppository) 또는 에어로졸 형태(aerosol form)로 투여되는, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  65. 제55 항 내지 제64 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 비정상적 증식 질병(abnormal proliferative disease), 퇴행성 질병(degenerative disease) 또는 기능-감소 장애(function-decreasing disorder)인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  66. 제55 항 내지 제64 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 신경 퇴행성(neurodegenerating) 질병, 심근 경색 (심장 마비), 심부전, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 골관절염, 근육감소증, 골수 손실, 백내장, 중복 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군, 류머티스성 관절염, 면역 기능 저하, 당뇨, 특발성 폐섬유증 및 노화에 수반된 시력 감퇴, 소뇌 경색, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅튼병 및 테스토스테론, 에스트로겐, 성장 호르몬, IFG-I 또는 에너지 생성(energy production) 감소로 초래된 장애 중 어느 하나인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  67. 제57 항 내지 제64 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화에 수반되는 질병 또는 장애는 종양 형성 및 암의 악성 발전, 파킨슨병, 뇌졸중, 소뇌 경색, 또는 심근 경색인, 노화에 수반되는 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  68. (i) 선택적으로(optionally) 용매에 생물학적 샘플을 희석시키는 단계;
    (ii) 상기 희석된 샘플을, 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의하여 이스트 세포의 세포 사이클이 정지한 환경에서, 상기 돌연변이 이스트 세포와 배양하는 단계;
    (iii) 세포 사이클 정지 환경을 제거하고 생존한 이스트 세포의 수를 측정하는 단계; 및
    (iv) 상기 (ⅲ)단계에서 얻은 생존 세포 수를, 상기 대상 생물학적 샘플을 제외한 채 상기 (ⅱ)단계와 동일한 환경 아래에서 수행된 통제 실험에서 얻은 생존 세포 수와 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 통제 실험에서 얻은 생존 세포 수와 비교한 상기 (ⅲ)단계에서 얻은 생존 세포 수의 증가는 상기 생물학적 샘플이 노화 방지 물질을 포함함을 나타내는, 생물학적 샘플에서 노화 방지 물질을 감지하는 방법.
  69. (i) 선택적으로(optionally) 용매에 생물학적 샘플을 희석시키는 단계;
    (ii) 상기 희석된 샘플을, 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의하여 이스트 세포의 세포 사이클이 정지한 환경에서, 상기 돌연변이 이스트 세포와 배양하는 단계;
    (iii) 세포 사이클이 정지한 환경을 제거하고 생존한 이스트 세포 수를 측정하는 단계;
    (iv) 선택적으로(optionally) 상기 (ⅲ)단계에서 얻은 생존 세포 수를, 상기 대상 생물학적 샘플을 제외한 채 상기 (ⅱ)단계와 동일한 환경 아래에서 수행된 통제 실험에서 얻은 생존 세포 수와 비교하는 단계; 및
    (v) 상기 생존 이스트 세포 수를, 노화 방지 물질의 농도와 생존한 이스트 세포 수 사이의 기 정립된 표준 공식 또는 곡선에 적용하여 상기 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 계산하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법.
  70. 제69 항에 있어서, 상기 기 정립된 표준 공식 또는 곡선은
    (vi) 정제된 상기 노화 방지 물질의 상이한 농도를 각각 갖는 복수개의 표준 용액을 상기 대상 생물학적 샘플 시 사용되는 용매를 이용하여 준비하는 단계;
    (vii) 상기 표준 용액을, 말단 소립 기능 장애 또는 DNA 손상에 의하여 이스트 세포의 세포 사이클이 정지한 환경에서, 상기 돌연변이 이스트 세포와 배양하는 단계;
    (viii) 세포 사이클이 정지한 환경을 제거하고 배양된 각각의 표준 용액 내 생존한 이스트 세포의 수를 측정하는 단계; 및
    (ix) 표준 곡선 및/또는 표준 공식을 얻기 위하여, 단계(ⅷ)에서 얻은 생존 세포 수와 각 세포 수에 대응하는 노화 방지 물질의 농도로 그래프를 그리는 단계를 포함하는 과정을 통해 준비되는, 생물학적 샘플 내 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법.
  71. 제69 항 또는 제70 항에 있어서,
    상기 노화 방지 물질은 제1 항 내지 제32 항 중 어느 하나에 따라 확인된 물질인, 생물학적 샘플 내 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법.
  72. 제69 항 내지 제71 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 노화 방지 물질은 라파마이신 또는 라파마이신의 상사 물질인, 생물학적 샘플 내 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법.
  73. 제69 항 내지 제72 항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 돌연변이 이스트는 cdc13-1, cdc13-2, stn1-1, cdc17-1, cdc17-2, hdf1, hdf2, est1, est2 및 est3 중 어느 하나인, 생물학적 샘플 내 노화 방지 물질의 생물학적 농도를 결정하는 방법.
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