KR20120055917A - Methylation Biomarker of Gastric Cancer Specific for Gastric Cancer Diagnosis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 위암 진단을 위한, 위암 특이적인 바이오마커의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 위암 세포에서 특정유전자의 CpG 섬 부위가 특이적으로 메틸화되는 위암 특이적 바이오마커의 메틸화를 검출하여 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for detecting gastric cancer-specific biomarker methylation for the diagnosis of gastric cancer, and more specifically, gastric cancer by detecting methylation of gastric cancer specific biomarker in which the CpG island region of a specific gene is specifically methylated in gastric cancer cells. The present invention relates to a method of providing information for diagnosis.
현대 의약분야의 발전에도 불구하고, 암의 대부분을 차지하는 고형암(혈액암외의 암)은 5년 생존율이 50%도 되지 않는다. 모든 암 환자의 3분의 2 가량이 암이 진행된 상태에서 발견되며, 이들 중 대부분이 암 진단을 받은 후 2년 안에 사망한다. 이러한 결과가 나타나는 것은 암 치료 방법의 문제뿐만 아니라, 초기 단계에서 암을 진단하거나, 진행된 암을 정확하게 진단하거나, 새로이 개발된 치료제에 대한 예후를 관찰하기가 쉽지 않기 때문이다.Despite advances in modern medicine, solid cancers, the majority of cancers (non-blood cancers), have a five-year survival rate of less than 50%. About two-thirds of all cancer patients are found with advanced cancer, most of whom die within two years of being diagnosed. This result is due not only to the problem of cancer treatment methods, but also to diagnose cancer at an early stage, to accurately diagnose advanced cancer, or to observe the prognosis for newly developed therapeutics.
최근 임상에서의 암 진단은 전형적으로 병력 조사, 물리적 검사 및 임상적 평가 후 조직 생검을 수행하여 확인하고 있다. 그러나 임상 실험에 의한 암 진단은 암 세포의 수가 10억 개 이상이고 암의 직경이 1cm 이상일 경우에만 가능하다. 이 경우, 상기 암 세포는 이미 전이능력을 가지고 있으며, 적어도 이들 중의 반은 이미 전이된 것이다. 반면, 암으로부터 직접 또는 간접적으로 생산되는 물질을 모니터링하기 위한 종양 마커가 암 스크리닝에 사용되고 있지만, 암이 존재하는 경우에도 반 이상이 정상으로 나타나고, 암이 없는 경우에도 자주 양성으로 나타나기 때문에, 정확성에 한계가 있어 혼란을 초래하고 있다. 게다가, 암 치료에 주로 사용되는 항암물질은 종양의 크기가 작을 때만 효과를 나타낸다는 문제가 있다.Recent diagnosis of cancer in the clinic is typically confirmed by performing a tissue biopsy after medical history examination, physical examination and clinical evaluation. However, cancer diagnosis by clinical trials is possible only when the number of cancer cells is 1 billion or more and the diameter of the cancer is 1 cm or more. In this case, the cancer cells already have metastatic capacity and at least half of them have already metastasized. On the other hand, although tumor markers for monitoring substances produced directly or indirectly from cancer are used for cancer screening, more than half of them appear normal even in the presence of cancer, and often positive in the absence of cancer. There is a limit that causes confusion. In addition, there is a problem that the anticancer substance mainly used for treating cancer is effective only when the tumor is small in size.
암의 진단 및 치료가 어려운 이유는 암세포가 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암세포는 과도하게 계속적으로 자라고, 주변 조직으로 침투하며, 말단 기관으로 전이하여 결국 죽음에 이르게 한다. 면역 체계나 항암 치료의 공격에도 불구하고, 암세포는 살아남아서, 계속해서 진화하며, 생존하기에 가장 알맞은 세포그룹으로 선택적으로 전파된다. 암세포는 수많은 유전자의 변이에 의하여 발생하는 고도의 생명력을 가지는 살아있는 생명체이다. 하나의 세포가 암세포로 형질 전환되고, 병원에서 진단가능한 악성의 암 덩어리로 발달하기 위해서는, 수많은 유전자 변이가 일어나야만 한다. 그러므로, 근원에서 암을 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준의 접근이 필요하다.Diagnosis and treatment of cancer is difficult because cancer cells are very complex and diverse. Cancer cells grow excessively continuously, penetrate into surrounding tissues, metastasize to terminal organs, and eventually lead to death. Despite the attack of the immune system or chemotherapy, cancer cells survive, continue to evolve, and selectively spread to the cell groups that are best suited to survive. Cancer cells are living organisms with a high degree of vitality that are caused by mutations in numerous genes. In order for a cell to be transformed into a cancer cell and develop into a malignant cancer mass that can be diagnosed in a hospital, numerous genetic mutations must occur. Therefore, a genetic level approach is needed to diagnose and treat cancer at the source.
최근, 유전자 분석이 암 진단에 적극적으로 시도되고 있다. 가장 간단하고 전형적인 방법은 PCR을 이용하여 혈액 내의 ABL:BCR 퓨전 유전자(백혈병의 유전적 특징)의 존재를 검출하는 것이다. 상기 방법은 95% 이상의 정확성을 가지고 있으 며, 간단하고 쉬운 이러한 유전자 분석을 이용하여 만성 골수성 백혈병을 치료하 고, 결과 평가 및 후속 연구에 사용된다. 그러나 상기 방법은 소수의 혈액 암에만 적용된다는 결점이 있다.Recently, genetic analysis has been actively attempted to diagnose cancer. The simplest and typical method is to use PCR to detect the presence of the ABL: BCR fusion gene (a genetic feature of leukemia) in the blood. The method is more than 95% accurate and uses this simple and easy genetic analysis to treat chronic myeloid leukemia and to evaluate outcomes and follow-up studies. However, there is a drawback that the method applies only to a few blood cancers.
최근에는, 혈청 또는 혈장의 DNA를 이용한 유전자 테스트가 적극적으로 시도되고 있다. 상기 방법은 암세포에서 분리되어 혈액으로 분비되고, 혈청에서 자유 DNA 형태로 존재하는 암 관련 유전자를 검출하는 것이다. Recently, genetic testing using DNA in serum or plasma has been actively attempted. The method is to detect cancer-related genes that are isolated from cancer cells and secreted into the blood and present in the form of free DNA in serum.
혈청에 존재하는 DNA의 농도는 정상인보다 실제 암 환자에서 5~10배 높게 나타난다는 것이 확인되었으며, 이러한 증가된 DNA는 대부분 암 세포에서 유래된 것이다. 암 세포로부터 분리된 DNA 등을 이용한, 돌연변이, 삭제 또는 종양유전자 및 종양-억제 유전자의 기능적 소실과 같은 암-특이적 유전자 이상을 분석하여 암을 진단할 수 있다. The concentration of DNA present in the serum was found to be 5 to 10 times higher in actual cancer patients than normal individuals, and this increased DNA is mostly derived from cancer cells. Cancer can be diagnosed by analyzing cancer-specific gene abnormalities such as mutations, deletions or functional loss of oncogenes and tumor-suppressor genes, such as DNA isolated from cancer cells.
혈청 내의 변이된 K-Ras 종양유전자, p53 종양-억제 유전자 및 p-16 유전자의 프로모터 메틸화와 마이크로세틀라이트의 표지 및 불안정성을 검토하여 폐암, 두경부암, 유방암, 대장암 및 간암을 진단하려는 적극적 시도가 있었다 (Chen, X. et al., Clin . Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes. M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin . Cancer Res., 5:2689, 1999).Active attempts to diagnose lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, colon cancer and liver cancer by examining the promoter methylation of the mutated K-Ras oncogenes, p53 tumor-suppressor genes and p-16 genes, and the labeling and instability of microsatellites (Chen, X. et al ., Clin . Cancer Res ., 5: 2297, 1999; Esteller, M. et al ., Cancer Res ., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes. M. et al ., Cancer Res ., 60: 892, 2000; Sozzi, G. et al ., Clin . Cancer Res ., 5: 2689, 1999).
혈액 외의 샘플에서도 암세포의 DNA는 검출될 수 있다. 폐암 환자의 객담 또는 기관지폐포 세척액에서 유전자 또는 항체 테스트를 이용하여 암세포의 존재를 검출하는 방법이 시도되었다 (Palmisano, W. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999). 덧붙여, 암 환자의 대장 및 직장 배설물에서 종양유전자의 존재를 검출하는 방법(ahlquist, D. et al., Gastroen terol., 119:1219, 2000) 및 뇨 및 전립선 액에서 프로모터 메틸화 이상을 검출하는 방법(Goessl, C. et al., Cancer Res., 60L:5941, 2000)이 시도되었다. 그러나, 수많은 유전자의 이상을 초래하고, 각 유전자의 다양한 변이 특징을 보여주는 암을 정학하게 진단하기 위해서는, 많은 수의 유전자를 정확하고 자동화된 방식으로 동시에 분석하는 방법이 요구되지만, 이러한 방법은 아직까지 수립되어 있지 않다.DNA from cancer cells can also be detected in samples other than blood. Attempts have been made to detect the presence of cancer cells using gene or antibody tests in sputum or bronchoalveolar lavage fluid of lung cancer patients (Palmisano, W. et. al ., Cancer Res ., 60: 5954, 2000; Sueoka, E. et al ., Cancer Res ., 59: 1404, 1999). In addition, methods for detecting the presence of oncogenes in the colon and rectal excretion of cancer patients (ahlquist, D. et. al ., Gastroen terol ., 119: 1219, 2000) and methods for detecting promoter methylation abnormalities in urine and prostate fluids (Goessl, C. et. al ., Cancer Res ., 60L: 5941, 2000). However, in order to precisely diagnose cancers that cause numerous gene abnormalities and show various mutation characteristics of each gene, a method of simultaneously analyzing a large number of genes in an accurate and automated manner is required. It is not established.
따라서, DNA 메틸화의 측정을 통하여 암을 진단하는 방법을 제안하고자 한다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 하이퍼-메틸화되면, 상기 유전자는 발현이 억제된다. 비록 생체에서 유전자의 단백질-코딩 서열에서 변이가 없더라도 상기 유전자의 기능이 손실되어 주된 메카니즘이 방해받게 된다. 또한, 인간 암에서 수많은 종양 억제 유전자가 기능을 잃는 것 또한 한 인자로 분석된다. 그러므로, 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검출하는 것이 암 연구에 있어서 절실히 요구된다. 최근에는, 암 진단 및 스크리닝을 위한 메틸화 특이적 PCR(이후, MSP라고 함) 또는 자동 DNA 시퀀싱과 같은 방법에 의하여 프로모터 메틸화를 결정하는 방법이 적극적으로 시도되고 있다.Therefore, we propose a method for diagnosing cancer by measuring DNA methylation. When the promoter CpG island of a particular gene is hyper-methylated, the gene is inhibited in expression. Even if there are no mutations in the protein-coding sequence of a gene in vivo, the function of the gene is lost and the main mechanism is disturbed. In addition, the loss of function of numerous tumor suppressor genes in human cancers is also analyzed as a factor. Therefore, detecting methylation of the promoter CpG island of tumor suppressor genes is urgently needed in cancer research. Recently, methods for determining promoter methylation by methods such as methylation specific PCR (hereinafter referred to as MSP) or automatic DNA sequencing for cancer diagnosis and screening have been actively attempted.
포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 시토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생성 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC는 자연적으로 탈아미노화하여 T가 되고, 포유동물 게놈의 CpG는 단지 1%의 확률로 나타나는데, 이는 정상적 확률(1/4×1/4=6.25%)보다 매우 낮은것이다.In genomic DNA of mammalian cells, in addition to A, C, G and T, there is a fifth base called 5-methylcytosine with a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring (5-mC). . 5-mC is attached only to C of CG dinucleotide (5'-mCG-3 '), called CpG. C in CpG is mostly methylated by the contact of methyl groups. Methylation of CpG inhibits the expression of alu or transposons and repeats of the genome. In addition, the CpG is a site where most epigenetic changes occur frequently in mammalian cells. The 5-mC of the CpG naturally deaminoates to become T, and the CpG of the mammalian genome appears with a 1% probability, which is much lower than the normal probability (1/4 × 1/4 = 6.25%). .
CpG가 예외적으로 모여 있는 부위를 CpG 섬이라 한다. CpG 섬은 C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. & Bird, A., Curr . Opin . Gene Develop., 5:309, 1995).The region where CpG is exceptionally collected is called CpG island. CpG islands are sites of 0.2-3kb in length with a C + G content of 50% or more and a CpG ratio of 3.75% or more. There are about 45,000 CpG islands in the human genome, most of which are found at promoter sites that regulate gene expression. Indeed, the CpG islands are found in promoters of housekeeping genes, about 50% of human genes (Cross, S. & Bird, A., Curr . Opin . Gene Develop ., 5: 309, 1995).
정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.In somatic cells of normal individuals, CpG islands of the housekeeping gene promoter region are unmethylated and genes that are not expressed during development, such as imprinted genes and genes on inactive X chromosome, are methylated.
암 유발 과정 동안, 프로모터 CpG 섬에서 메틸화가 발견되며, 해당하는 유전자의 발현이 억제된다. 특히, 세포 사이클 또는 세포자살(apoptosis)을 조절하고, DNA를 복구하며, 세포 부착 및 세포간의 상호작용에 관여하고, 세포 침입 및 전이를 억제하는 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬이 메틸화되면, 이러한 메틸화는 코딩 서열의 돌연변이와 같은 방식으로 상기 유전자의 발현과 기능을 억제하게 되고, 이에 의하여 암의 발달과 진행이 촉진되게 된다. 또한, 노화에 의하여 CpG 섬의 부분적 메틸화도 일어난다.During the cancer-causing process, methylation is found on the promoter CpG islands and expression of the corresponding genes is inhibited. In particular, the methylation of the promoter CpG island of the tumor suppressor gene, which regulates cell cycle or apoptosis, repairs DNA, is involved in cell adhesion and intercellular interactions, and inhibits cell invasion and metastasis, is methylated. Inhibits the expression and function of the gene in the same manner as mutation of the coding sequence, thereby promoting the development and progression of cancer. In addition, aging also causes partial methylation of the CpG islands.
흥미로운 사실은, 유전자의 돌연변이가 선천적 암의 발달에 영향을 미치고, 후천성 암에서는 돌연변이가 발생하지 않은 유전자의 경우, 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 돌연변이 대신에 일어난다는 것이다. 전형적인 예로, 후천적 신장암 VHL (von Hippel Lindau), 유방암 BRCA1, 대장암 MLH1 및 위암 E-CAD가 포함된다. 또한, 모든 암의 반 정도에서 p16의 프로모터 메틸화 또는 Rb의 돌연변이가 발생하며, 나머지 암들에서는 p53의 돌연변이나, p73, p14 등의 프로모터 메틸화가 나타난다.It is interesting to note that mutations in genes affect the development of innate cancers, and in acquired cancers, for genes that do not have mutations, methylation of the promoter CpG island occurs instead of mutations. Typical examples include acquired kidney cancer VHL (von Hippel Lindau), breast cancer BRCA1, colorectal cancer MLH1 and gastric cancer E-CAD. In addition, promoter methylation of p16 or mutation of Rb occurs in about half of all cancers, and mutation of p53 or promoter methylation of p73, p14, etc. occurs in the remaining cancers.
중요한 사실은 프로모터 메틸화에 의한 후생성 변화가 유전적 변화(예를 들면, 코딩서열의 돌연변이)를 일으키고, 암의 발달이 상기와 같은 유전적 및 후생적 변화의 조합에 의하여 진행된다는 것이다. 한 예로, MLH1 유전자의 경우, 대장암에서 MLH1 유전자의 하나의 대립유전자의 기능이 변이나 삭제에 의하여 손실되고, 나머지 하나의 대립유전자는 프로모터 메틸화에 의하여 기능을 수행하지 못하는 상황이 된 것이다. 또한, DNA 복구 유전자인 MLH1이 프로모터 메틸화에 의하여 기능을 수행하지 못한다면, 다른 주요 유전자에서 돌연변이가 발생해 암 발생을 더욱 촉진시킬 수 있는 것이다.An important fact is that epigenetic changes caused by promoter methylation cause genetic changes (eg, mutations in coding sequences), and cancer development proceeds by a combination of such genetic and epigenetic changes. For example, in the case of the MLH1 gene, the function of one allele of the MLH1 gene in colon cancer is lost by mutation or deletion, and the other allele is incapable of functioning by promoter methylation. In addition, if MLH1, a DNA repair gene, fails to function by promoter methylation, mutations may occur in other major genes to further promote cancer development.
대부분의 암은 CpG에 대하여 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 하이퍼메틸화, 나머지 CpG 염기 부위의 하이퍼메틸화 및 DNMT(DNA cytosine methyltrans ferase)라 불리는 메틸화 효소의 활성 증가라는 세가지 특징을 나타낸다 (singal, R. & Ginder, G., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. & Jones, P., Carcino gensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K., Brit . J. Cancer, 83:1583, 2000).Most cancers exhibit three characteristics of CpG: hypermethylation of the promoter CpG island of the tumor suppressor gene, hypermethylation of the remaining CpG base sites, and increased activity of a methylation enzyme called DNA cytosine methyltrans ferase (DNMT) (singal, R. & Ginder, G., Blood , 93: 4059, 1999; Robertson, K. & Jones, P., Carcino gensis , 21: 461, 2000; Malik, K. & Brown, K., Brit . J. Cancer , 83: 1583, 2000).
프로모터 CpG 섬이 메틸화될 때, 해당하는 유전자의 발현이 왜 억제되는지에 대해서는 아직까지 완전하게 밝혀지지 않았으나, MECP(methyl CpG-binding protein) 또는 MBD(methyl CpG-binding domain protein) 및 히스톤 디아세틸라아제가 메틸화된 시토신에 부착되고, 이에 의하여 염색체의 크로마틴 구조가 변화되어, 히스톤 단백질이 변화되기 때문일 것이라는 가설이 있다.It is not yet fully understood why the expression of the corresponding gene is inhibited when the promoter CpG island is methylated, but methyl CpG-binding protein (MECP) or methyl CpG-binding domain protein (MBD) and histone deacetylases. It is hypothesized that the azee is attached to methylated cytosine, thereby changing the chromatin structure of the chromosome, thereby changing the histone protein.
프로모터 메틸화를 이용하여 암 진단의 정확성을 극대화하고, 각 단계에 따른 암의 발달을 분석하고, 암과 노화에 따른 변화를 구별하기 위하여, 프로모터 CpG 섬의 모든 시토신 염기의 메틸화를 정확하게 분석할 수 있는 방법이 필요하다.Promoter methylation can be used to accurately analyze the methylation of all cytosine bases on the promoter CpG islands in order to maximize the accuracy of cancer diagnosis, to analyze cancer development at each stage, and to distinguish between cancer and aging changes. I need a way.
정통적인 방법은 CpG 섬을 포함하는 유전자 부위를 메틸화 특이적 PCR(MSP)에 의하여 증폭하는 것과 염기서열 분석 방법(바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법)을 함께 사용한다. 그러나 진단, 초기 진단 또는 임상 실험에서의 다양한 암의 각 단계를 평가하는데 사용할 수 있는, 많은 유전자의 프로모터 메틸화의 다양한 변화를 정확하고, 신속하게 자동화 방식으로 분석할 수 있는 방법은 아직 없다. Authentic methods use amplification of a gene region containing CpG islands by methylation specific PCR (MSP) and a sequencing method (bisulfite genome sequencing method). However, there is no way to accurately and quickly and automatically analyze various changes in promoter methylation of many genes that can be used to evaluate each stage of various cancers in diagnostic, early diagnosis or clinical trials.
메틸화와 관련된 새로운 종양 억제 유전자의 스크리닝 분야에 대한 많은 연구가 수행되어왔다. 지금까지의 스크리닝 방법으로는 주로 기존문헌을 참고하여 여러 가지 암에서 메틸화되어있다고 알려진 종양억제 유전자들을 대상으로 스크리닝 하는 방법이 이용되어 왔다. 최근에는 암세포주에 디메틸화제를 처리하여 디메틸화제를 처리하지 않은 세포주와 비교하여, 디메틸화제를 처리한 세포주에서 디메틸화에 의해 발현이 증가하는 유전자들을 스크리닝하는 방법이 개발되었다 (Suzuki et al., 2002., Nature Genetics, 31: 141-149). 그러나 이 방법은 조직 유래의 임상시료를 이용한 유전자 발현 분석을 수행하기 않고, 암세포주 대상의 디메틸화 현상만을 이용하여 메틸화 관련 종양 유전자를 스크리닝 하였기 때문에 정확도가 높은 메틸화 관련 유전자를 탐색하는데는 비효율적이다. 따라서 임상적용에서 민감도와 특이도가 높은 종양 관련 메틸화 유전자를 스크리닝 하기 위해서는 조직 특이적이고 암 특이적인 메틸화 관련 종양 억제 유전자를 스크리닝 하는 체계적인 방법의 개발이 필요하였다.
Much research has been done in the field of screening new tumor suppressor genes associated with methylation. Until now, screening methods for tumor suppressor genes known to be methylated in various cancers have been mainly used in reference to existing literature. Recently, a method has been developed for screening genes whose expression is increased by dimethylation in a cell line treated with a dimethylating agent, as compared to a cell line treated with a dimethylating agent in a cancer cell line (Suzuki et. al ., 2002., Nature Genetics, 31: 141-149). However, this method is inefficient in detecting methylation-related genes with high accuracy because screening for methylation-related tumor genes using only dimethylation phenomena in cancer cell lines is performed without performing gene expression analysis using tissue-derived clinical samples. Therefore, in order to screen tumor-related methylated genes with high sensitivity and specificity in clinical applications, it was necessary to develop a systematic method for screening tissue-specific and cancer-specific methylated tumor suppressor genes.
이에, 본 발명자들은 위암조직에서 특이적으로 메틸화되는, 정확도가 높은 메틸화 관련 종양 억제 유전자를 효과적으로 스크리닝하여, 위암진단을 위한 위암 특이적 바이오마커로서 제공하고자 예의 노력한 결과, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, recep tor, type 3) 및 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬 부위가 위암세포에서 특이적으로 메틸화되는 것을 확인하고, 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써, 위암을 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have diligently screened a highly accurate methylation-related tumor suppressor gene that is specifically methylated in gastric cancer tissues, and as a result of diligent efforts to provide a gastric cancer specific biomarker for gastric cancer diagnosis, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, recep tor, type 3) and AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) Confirmed that the CpG island region of the gene is specifically methylated in gastric cancer cells, and that gastric cancer can be diagnosed by measuring the degree of methylation using this as a biomarker. This invention was completed.
본 발명의 주된 목적은 위암 특이적 바이오마커 및 이를 이용하여 조기에 위암을 진단하기 위한 키트 및 칩을 제공하는 데 있다.
It is a main object of the present invention to provide a gastric cancer specific biomarker and kits and chips for early gastric cancer diagnosis using the same.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 함유하는 위암 진단용 바이오마커를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) Provided is a biomarker for diagnosing gastric cancer containing a CpG island of a gene.
본 발명은 또한, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 함유하는 위암 진단용 키트를 제공한다.The invention also relates to NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) A kit for diagnosing gastric cancer, comprising a primer pair for amplifying a fragment containing a methylated CpG island of a gene.
본 발명은 또한, 상기 바이오마커과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위암 진단용 핵산 칩을 제공한다. The present invention also provides a nucleic acid chip for diagnosing gastric cancer, in which a probe capable of hybridizing under the biomarker and stringent conditions is immobilized.
본 발명은 또한, DNA를 함유한 임상샘플로부터 상기 바이오마커의 메틸화를 검출하는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for detecting methylation of the biomarker from clinical samples containing DNA.
본 발명은 위암 특이적 마커 유전자의 CpG 섬을 포함하는 바이오마커를 제공함으로써, 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 위암 특이적 바이오마커와 키트, 핵산 칩 및 바이오마커의 메틸화 검출방법을 이용하면, 위암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 위암을 진단할 수 있어 유용하다.
The present invention has an effect of providing information for the diagnosis of gastric cancer by providing a biomarker comprising a CpG island of gastric cancer specific marker gene. Gastric cancer specific biomarkers and kits, nucleic acid chip and biomarker methylation detection method according to the present invention, the early cancer can be diagnosed in the early transformation stage, early diagnosis, accurate and faster than conventional methods It is useful to diagnose.
도1 은 위암 혈청과 정상인 혈청 DNA로부터 메틸화 DNA를 분리하여 CpG 마이크로어레이 분석과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 과메틸화된 프로브 및 과메틸화된 유전자를 선별하여 4종의 바이오마커 후보를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 위암세포주, 정상인 위조직 그리고 수술환자의 위암 조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직에서 4종 바이오마커 후보 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 4는 위암세포주, 정상인 및 위암환자 조직에서 AFF2 및 NTRK3 유전자의 파이로시퀀싱을 통한 메틸화 측정 결과이다.
도 5는 정상인 및 위암환자 위액세포 DNA에서 AFF2 및 NTRK3 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 6은 정상인 및 위암환자 혈청 DNA에서 AFF2 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 7은 정상인 및 위암환자 혈청 DNA에서 NTRK3 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 8은 정상인 및 위암환자 혈청에서 AFF2 및 NTRK3 유전자의 메틸화 상태를 나타낸 것이다. 1 is a schematic diagram showing a CpG microarray analysis process by separating methylated DNA from gastric cancer serum and normal serum DNA.
2 is a schematic diagram illustrating a process of selecting four biomarker candidates by selecting hypermethylated probes and hypermethylated genes.
Figure 3 shows the results of electrophoresis of the PCR product through the MSP of the four biomarker candidate genes in gastric cancer cell line, normal gastric tissue and surgery patients gastric cancer tissue and normal finding tissues in contact with it.
Figure 4 AFF2 in gastric cancer cell lines, normal and gastric cancer patient tissue And methylation measurement results through pyro sequencing of the NTRK3 gene.
FIG. 5 shows the results of electrophoresis of PCR products through MSP of AFF2 and NTRK3 genes in gastric juice DNA of normal and gastric cancer patients.
6 shows AFF2 in serum DNA of normal and gastric cancer patients. The result of electrophoresis of the PCR product through the MSP of the gene.
7 shows NTRK3 in serum DNA of normal and gastric cancer patients. The result of electrophoresis of the PCR product through the MSP of the gene.
8 shows AFF2 in serum of normal and gastric cancer patients And NTRK3 It shows the methylation status of the gene.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 발명은 일 관점에서, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 함유하는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 바이오마커 또는 조성물에 관한 것이다. The present invention in one aspect, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) The present invention relates to a biomarker or composition for diagnosing gastric cancer or gastric cancer progression stage containing a CpG island of a gene.
본 발명에 있어서, 상기 CpG 섬은 NTRK3 유전자의 프로모터 또는 5' UTR 부위와 AFF2 유전자의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위 중 어느 하나 이상의 영역에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the CpG island may be located in one or more regions of the promoter or 5 'UTR region of the NTRK3 gene and the 5' UTR, the first exon and the first intron region of the AFF2 gene.
본 발명에 있어서, 상기 NTRK3 유전자의 프로모터 및 5' UTR 부위를 포함하는 영역은 서열번호 1로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있고, AFF2 유전자의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위를 포함하는 영역은 서열번호 2로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the region containing the promoter and 5 'UTR region of the NTRK3 gene may be characterized in that the sequence represented by SEQ ID NO: 1, AFF2 The region including the 5 'UTR, the first exon and the first intron region of the gene may be characterized by the sequence represented by SEQ ID NO: 2.
이때, NTRK3 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, -250~-1nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. NTRK3 유전자의 5' UTR 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +1~+277nt까지의 서열로, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 NTRK3 유전자의 프로모터 및 5' UTR 부위를 포함하는 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, -250~+277nt까지의 영역으로, 서열번호 1로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있다. In this case, the promoter region of the NTRK3 gene may be characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a sequence from -250 to -1nt, based on the transcription start point. The 5 ′ UTR region region of the NTRK3 gene may be a sequence from +1 to + 277nt, based on the transcription start point, and may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. The region including the promoter and 5 ′ UTR region of the NTRK3 gene may be a sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a region from -250 to + 277nt, based on a transcription start point.
이때, AFF2 유전자의 5' UTR 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +479nt까지의 서열로, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 첫 번째 엑손 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +480~+526nt까지의 서열로, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 첫 번째 인트론 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +527~+800nt까지의 서열로, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 AFF2 유전자의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위를 포함하는 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +301~+800nt까지의 영역으로 서열번호 2로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있다. At this time, the 5 'UTR region region of the AFF2 gene may be characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 up to + 479nt, based on the transcription start point. The first exon region region may be a sequence from +480 to + 526nt, based on the transcription start point, and may include a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. The first intron site region is a sequence from +527 to + 800nt, based on the transcription start point, and may be characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. AFF2 above The region including the 5 'UTR, the first exon, and the first intron region of the gene may be characterized by a sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a region from +301 to + 800nt based on the transcription start point. .
본 발명은 다른 관점에서, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 함유하는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 키트에 관한 것이다.In another aspect, the invention provides NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) The present invention relates to a kit for diagnosing gastric cancer or gastric cancer advanced stage containing a primer pair for amplifying a fragment containing a methylated CpG island of a gene.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 8 및 9 또는 서열번호 12 및 13로 표시되는 서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, the primer pair may be characterized in that the sequence represented by SEQ ID NO: 8 and 9 or SEQ ID NO: 12 and 13.
본 발명은 다른 관점에서, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 핵산 칩에 관한 것이다. In another aspect, the present invention, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) The present invention relates to a nucleic acid chip for diagnosis of gastric cancer or gastric cancer progression, in which a fragment containing a CpG island of a gene and a probe capable of hybridization under strict conditions are immobilized.
본 발명에 있어서, 서열번호 24 내지 서열번호 33으로 표시되는 서열 중 어느 하나 이상의 서열이 프로브로서 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, any one or more of the sequences represented by SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 33 may be fixed as a probe.
gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg
서열번호 28
SEQ ID NO: 28
probe10
probe10
서열번호 33
SEQ ID NO: 33
본 발명에서는 NTRK3 또는 AFF2 유전자의 메틸화 상태를 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.In the present invention, by detecting the methylation state of the NTRK3 or AFF2 gene using a kit or a nucleic acid chip, cell growth abnormality (dysplasia) of gastric tissue present in the specimen can be diagnosed.
본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. By using the diagnostic kit or nucleic acid chip of the present invention, it is possible to determine the propensity for cell growth abnormality (dysplasia progression) of the tissue of the sample. The method includes determining the methylation status of one or more nucleic acids isolated from the sample, wherein the methylation step of the one or more nucleic acids is compared to the methylation step of the nucleic acid isolated from the sample without cell growth abnormality (dysplasia) of the tissue. It can be characterized by.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암 세포를 확인할 수 있다.In another embodiment of the present invention, gastric cancer cells can be identified by examining methylation of the marker gene using the kit or nucleic acid chip.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암을 진단할 수 있다.In another embodiment of the present invention, gastric cancer can be diagnosed by examining methylation of a marker gene using the kit or nucleic acid chip.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 소변, 대변, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the possibility of progression to gastric cancer can be diagnosed by examining the methylation of the marker gene using the kit or the nucleic acid chip using a sample showing a normal phenotype. The sample may use solid or liquid tissue, cells, urine, feces, serum or plasma.
본 발명은 다른 관점에서, DNA를 함유한 임상샘플로부터 NTRK3 (GenBank NM_001007156,neurotro phic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 함유하는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 바이오마커의 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides NTRK3 from clinical samples containing DNA. (GenBank NM_001007156, neurotro phic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) gene for detecting methylation of a biomarker for diagnosis of gastric cancer or gastric cancer advanced stage containing CpG island It is about.
본 발명에서는 위암세포에서 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자 중, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotroph ic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자가 위암 및 위암 진행단계 진단에 유용함을 확인하였다. In the present invention, among the genes specifically methylated in gastric cancer cells, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) gene was confirmed to be useful for the diagnosis of gastric cancer and gastric cancer progression stage.
본 발명에 따른 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA에 결합하는 단백질과 반응시켜 메틸화된 DNA를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 메틸화된 DNA를 증폭시킨 후, CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션한 다음, 형질전환 세포와 비형질전환 세포 간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계.The method for screening methylated marker genes according to the present invention comprises the following steps: (a) separating genomic DNA from transformed and non-transformed cells; (b) separating the methylated DNA from the separated genomic DNA by reacting with a protein that binds to the methylated DNA; And (c) amplifying the methylated DNA, hybridizing to a CpG microarray, and selecting a gene having the greatest difference in methylation degree between the transformed and non-transformed cells as a methylation marker gene.
상기 선별된 유전자는 위암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다. The selected genes can also be used for gastric cancer screening, risk assessment, prediction, disease identification, diagnosis of disease stages and selection of therapeutic targets.
위암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 위암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이타는 다른 비-메틸화 연관 바이오마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 위암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.Identifying genes that are methylated in gastric cancer and at various stages of abnormality enables early and accurate diagnosis of gastric cancer, and can identify new targets for establishing and treating methylation lists using multiple genes. In addition, methylation data according to the present invention will be able to establish a more accurate gastric cancer diagnosis system in conjunction with other non-methylated associated biomarker detection methods.
본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 위암 진행을 진단할 수 있다. 위암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 위 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 위암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.With the methods of the present invention, the progression of gastric cancer at various stages or stages can be diagnosed, including determining the methylation stage of one or more nucleic acid biomarkers obtained from a sample. Comparing the methylation step of the nucleic acid isolated from the sample of each stage of gastric cancer with the methylation step of one or more nucleic acids obtained from a sample having no cell proliferative abnormality of the gastric tissue, the specific stage of gastric cancer of the sample can be identified. The step may be hypermethylation.
본 발명에 있어서, 상기 메틸화 측정방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the methylation measurement method is PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR, pyro sequencing and Bisulfite sequencing may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 소변 및 대변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the clinical sample may be selected from the group consisting of tissues, cells, blood, urine, and stool derived from a suspected cancer patient or a diagnosis target.
본 발명의 일 실시예에서는, 다음의 단계를 포함하여 상기 유전자의 CpG 섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있다:In one embodiment of the present invention, whether the methylation of the CpG island of the gene can be detected, including the following steps:
(a) 임상샘플로부터 분리된 DNA를 NTRK3 또는 AFF2 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및 (a) NTRK3 or AFF2 DNA isolated from clinical samples Amplifying using a primer pair capable of amplifying a fragment comprising a methylated CpG island of a gene; And
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 결과물이 생성되는 경우 임상샘플 유래 위암 특이적 메틸화 마커 유전자의 CpG 섬이 메틸화된 것으로 결정하는 단계. (b) determining that the CpG island of the clinical sample-derived gastric cancer specific methylation marker gene is methylated when the result amplified in step (a) is produced.
본 발명의 실시예에서 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 위암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 위암 특이적 유전자가 메틸화된 것을 확인함으로, 위암을 조기 진단할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the methylation gene marker can be used for early diagnosis of cells likely to form gastric cancer. When a gene identified to be methylated in cancer cells is methylated in cells that appear clinically or morphologically normal, the cells that appear to be normal are in progress of cancer. Therefore, gastric cancer can be diagnosed early by confirming that the gastric cancer specific gene is methylated in cells that appear normal.
본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 위조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.Using the methylation marker gene of the present invention, it is possible to detect cell growth abnormality (heterogeneous progression) of gastric tissue in a sample. The method includes contacting a sample comprising one or more nucleic acids isolated from a sample with an agent capable of determining one or more methylation states. The method comprises identifying the methylation status of one or more sites in one or more nucleic acids, wherein the methylation status of the nucleic acid is determined by the methylation status of the same site in the nucleic acid of the sample that does not have cell growth abnormalities (progressive dysplasia) of the tissue. It may be characterized by a difference.
본 발명의 실시예에서는 위암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 위암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 위암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.In the embodiment of the present invention, by examining the methylation frequency of the gene specifically methylated in gastric cancer, by determining the methylation frequency of the tissue having the possibility of gastric cancer progression, the possibility of the development of the tissue into gastric cancer can be evaluated.
본 발명에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, "조기 확인"은 세포가 암화되기 전에 초기 단계에서 세포형태의 변화가 일어날 가능성 높은 것을 말한다In the present invention, "early identification" of cancer is to discover the possibility of cancer before metastasis, preferably before morphological changes are observed in sample tissue or cells. In addition, "early identification" refers to the likelihood that a change in cell morphology occurs at an early stage before the cell becomes cancerous.
본 발명에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다."Hypermethylation" in the present invention means methylation of CpG islands.
본 발명에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 샘플을 포함하는 폭넓은 범위의 샘플을 의미한다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 위의 생검(biopsy)이다
In the present invention, "sample" or "sample sample" means a wide range of samples including all biological samples obtained from individuals, body fluids, cell lines, tissue culture, etc., depending on the type of assay being performed. Methods for obtaining body fluids and tissue biopsies from mammals are commonly known. Preferred source is a biopsy of the stomach
메틸화 조절 바이오 Methylation regulation bio 마커의Of marker 스크리닝 Screening
본 발명에서는 세포 또는 조직이 암화되거나 세포의 형태가 다른 형태로 형질전환될 때에 메틸화되는 바이오마커 유전자를 스크리닝하였다. 여기서, "형질전환" 세포는 정상형태가 비정상형태로, 비종양성이 종양성으로, 미분화형태가 분화형태로 바뀌는 등의 세포 또는 조직의 형태가 다른 형태로 변화되는 것을 의미한다.In the present invention, a biomarker gene that is methylated is screened when the cell or tissue is cancerized or when the cell is transformed into another form. Herein, "transformed" cells mean that the normal form is abnormal, the non-neoplastic is neoplastic, and the undifferentiated form is changed into a different form.
본 발명의 일 실시예에서는 정상인 및 위암 환자의 혈청 (serum)으로부터 부유 DNA (free DNA)를 분리하였다. 상기 분리된 메틸화 DNA를 증폭한 후, human CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션시켜 정상인과 위암 환자간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 4개의 유전자를 바이오마커 후보로 선택하였다.In one embodiment of the present invention, free DNA was isolated from serum of normal and gastric cancer patients. After amplifying the isolated methylated DNA, four genes with the largest difference in methylation degree between normal and gastric cancer patients were selected as a biomarker candidate by hybridization to a human CpG microarray.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 4개의 바이오마커 후보 유전자가 메틸화되었는지 추가로 확인하기 위하여, methylation-specific PCR (MSP)을 수행하였고, 그 결과, 상기 4개의 바이오 마커 유전자가 4개의 세포주 중 최소 1개 이상에서 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.In another embodiment of the present invention, to further confirm whether the four biomarker candidate genes were methylated, methylation-specific PCR (MSP) was performed. As a result, the four biomarker genes were at least 1 out of 4 cell lines. It was confirmed that methylation in more than two.
본 발명에서는 상기 4종의 유전자가 정상 위조직에서는 메틸화가 되지 않는지 확인하기 위하여, 위암환자가 아닌 정상인의 위조직 지노믹 DNA의 메틸화 여부를 확인하기 위한 MSP를 수행하였고, 그 결과 2종의 유전자(NTRK3, AFF2)는 정상 위조직에서 메틸화가 되어 있지 않음을 확인하여 이들 2종의 유전자는 바이오마커로서 유용성이 높음을 확인할 수 있었다. In the present invention, in order to confirm that the four genes are not methylated in normal gastric tissue, MSP was performed to determine whether methylation of gastric tissue genomic DNA of normal humans, not gastric cancer patients, was performed. ( NTRK3 , AFF2 ) was confirmed that the methylation in normal gastric tissue was not found that these two genes are useful as a biomarker.
본 발명에서는 상기 2종의 유전자가 바이오마커로서 위암 조기진단의 유용성을 판정하기 위하여, 암조직과 연접하는 정상소견 조직에서 메틸화가 되어있는지 확인하였다. 그 결과, 암조직과 연접하고 있는 정상조직에서도 분자수준에서의 암화가 일어나는 것을 확인하였으며, 이에 상기 2종의 유전자가 바이오마커로서 위암의 조기진단에 대한 유용성이 높음을 확인할 수 있었다. In the present invention, in order to determine the usefulness of the early diagnosis of gastric cancer as a biomarker, the two genes were confirmed to be methylated in normal-tissue tissues connected with cancer tissues. As a result, it was confirmed that cancerization at the molecular level occurs in normal tissues connected to cancer tissues, and thus the two genes were found to be highly useful for early diagnosis of gastric cancer as biomarkers.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 2종의 유전자가 위암 진단용 바이오마커로서 유용성을 판정하기 위하여, 정상인 및 위암환자의 위액을 이용하여 메틸화 여부를 측정한 결과, 정상인의 경우에는 NTRK3와 AFF2 유전자가 메틸화되어 있지 않은 반면, 위암환자의 경우에는 NTRK3는 위암환자의 100%, AFF2는 위암환자의 60% 에서 메틸화되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 상기 2종의 유전자가 위액을 이용한 위암 진단에 대한 유용성이 높음을 확인할 수 있었다. In another embodiment of the present invention to a gene of the two above determining the usefulness as a gastric cancer diagnostic biomarkers, as a result, in the case of the normal NTRK3 is a measure of whether the methylation using a normal gastric juice and gastric cancer in a patient AFF2 Gene On the other hand, in the case of gastric cancer patients, NTRK3 was methylated in 100% of gastric cancer patients and AFF2 was methylated in 60% of gastric cancer patients. Thus, the two genes were useful for gastric cancer diagnosis. It was confirmed that this is high.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 2종의 유전자가 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 판정하기 위하여, 위암환자 및 정상인의 혈청 DNA를 대상으로 메틸화 여부를 추가적으로 측정한 결과, 4종의 유전자중 NTRK3는 조기 위암환자의 70%, 진행형 위암환자의 90% 그리고 AFF2는 조기 위암환자의 90%, 진행형 위암환자의 90% 에서 메틸화되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 상기 2종의 유전자가 바이오마커로서 위암 조기진단에 대한 유용성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.
In another embodiment of the present invention, in order to determine the usefulness of the two genes as a biomarker for diagnosing gastric cancer, as a result of additionally measuring methylation of serum DNA of gastric cancer patients and normal humans, NTRK3 of the four genes is premature. 70% of gastric cancer patients, 90% of advanced gastric cancer patients and AFF2 were methylated in 90% of early gastric cancer patients and 90% of advanced gastric cancer patients. The usefulness for was found to be very high.
위암에 대한 바이오 Bio for Gastric Cancer 마커Marker
본 발명에서는 위암 진단을 위한 바이오마커로서, NTRK3와 AFF2 유전자의 CpG 섬을 제공한다.
In the present invention, as a biomarker for diagnosing gastric cancer, NTRK3 and AFF2 Provide the CpG island of the gene.
위암에 대한 바이오 Bio for Gastric Cancer 마커Marker -정상세포와의 비교를 위한 암세포에의 용도Use in cancer cells for comparison with normal cells
본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.In this example, "normal" cells refers to cells that do not exhibit abnormal cell morphology or changes in cytological properties. A "tumor" cell refers to a cancer cell, and a "non-tumor" cell refers to a cell that is part of the diseased tissue but is not considered to be a tumor site.
본 발명은 일 관점에서, 위암과 다음에 기재된 2개 유전자의 CpG 섬의 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다: NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3)와 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자.In one aspect, the present invention is based on the discovery of the relationship between gastric cancer and hypermethylation of CpG islands of the two genes described below: NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) and AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) gene.
본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교 용도인 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.For other uses of the diagnostic kits and nucleic acid chips of the present invention, the methylation stage of one or more nucleic acids isolated from a sample can be determined to early diagnose cell growth abnormalities of the stomach tissue of the sample. The methylation step of the one or more nucleic acids may be used for comparison with the methylation status of one or more nucleic acids isolated from a sample having no cell growth potential of the tissue. The nucleic acid is preferably a CpG-containing nucleic acid such as a CpG island.
본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3)와 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자 및 그 조합을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. For other uses of the diagnostic kits and nucleic acid chips of the present invention, one can diagnose abnormalities in cell growth of the stomach tissue of a sample comprising determining methylation of one or more nucleic acids isolated from the sample. The nucleic acid is NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) and AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) can be characterized by coding for the gene and combinations thereof, wherein the methylation step of the one or more nucleic acids is isolated from a sample that has no knowledge of cell growth abnormalities of the gastric tissue. Compared to the methylation status of one or more nucleic acids.
상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.The term “prescription” means a property that is susceptible to abnormal cell growth. A virulent sample is a sample that does not yet have cell growth abnormalities, but has or has increased cell growth abnormalities.
본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.In another aspect, the present invention provides a method for cell growth of gastric tissue of a sample comprising contacting a sample comprising the nucleic acid of the sample with an agent capable of determining the methylation status of the sample and confirming methylation of one or more sites of the one or more nucleic acids. It provides a method for diagnosing abnormalities. Here, the methylation of one or more sites of one or more nucleic acids can be characterized as different from the methylation step of the same site of the same nucleic acid of a sample having no cell growth potential.
본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA (peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다. The methods of the present invention comprise determining methylation of one or more sites of one or more nucleic acids isolated from a sample. Here, "nucleic acid" or "nucleic acid sequence" means oligonucleotides, nucleotides, polynucleotides or fragments thereof, single stranded or double stranded genomic origin or synthetic genomic origin or synthesis of DNA or RNA, sense or antisense strands. Refers to DNA or RNA of origin, peptide nucleic acid (PNA) or DNA quantity or RNA quantity material of natural or synthetic origin. If the nucleic acid is RNA, it is apparent to those skilled in the art that, instead of deoxynucleotides A, G, C, and T, it is replaced with ribonucleotides A, G, C, and U, respectively.
서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.
Any nucleic acid capable of detecting the presence of differently methylated CpG islands can be used. The CpG island is a CpG rich site in the nucleic acid sequence.
메틸화(Methylation ( methylationmethylation ))
본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다. Any nucleic acid in the purified or unpurified form of the present invention may be used, and any nucleic acid containing or suspected of containing a nucleic acid sequence containing a target site (eg, a CpG-containing nucleic acid) may be used. . A nucleic acid site that can be differentially methylated is a CpG island, which is a nucleic acid sequence having a high CpG density compared to other dinucleotide CpG nucleic acid sites. Doublet CpG is only 20% probable in vertebrate DNA when predicted by the ratio of G * C base pairs. At certain sites, the density of double CpG is ten times higher than at other sites in the genome. CpG islands have an average G * C ratio of about 60%, with the average DNA G * C ratio of 40%. CpG islands are typically about 1 to 2 kb in length and there are about 45,000 CpG islands in the human genome.
여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.In many genes, CpG islands start upstream of the promoter and extend to the transcriptional site downstream. Methylation of CpG islands in promoters usually inhibits expression of genes. CpG islands may also surround the 3 'region of the gene coding region, as well as the 5' region of the gene coding region. Therefore, CpG islands are found at several sites including the coding sequence upstream of the regulatory region comprising the promoter region, the coding region (eg exon region), downstream of the coding region, eg, the enhancer region and the intron. do.
통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.Typically, the CpG-containing nucleic acid is DNA. However, the method of the present invention may apply for example a sample containing DNA or RNA containing DNA and mRNA, wherein the DNA or RNA may be single stranded or double stranded, or DNA-RNA hybrids. It may be characterized by the contained sample.
핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.Nucleic acid mixtures may also be used. The specific nucleic acid sequence to be detected may be a fraction of a large molecule, and from the outset the specific sequence may exist in the form of isolated molecules that make up the entire nucleic acid sequence. The nucleic acid sequence need not be nucleic acid present in pure form, and the nucleic acid may be a small fraction in a complex mixture, such as containing whole human DNA. Nucleic acids included in the sample used to measure the degree of methylation of the nucleic acid contained in the sample or used to detect methylated CpG islands are described by Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989). It can be extracted by various methods described in.
검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 장암이나 장암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 장 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.The nucleic acid isolated from the sample is obtained by biological sample of the sample. If one wants to diagnose bowel cancer or the progression of bowel cancer, the nucleic acid should be separated from the intestinal tissue with a scrap or biopsy. Such samples may be obtained by various medical procedures known in the art.
본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.
In one embodiment of the invention, the degree of methylation of the nucleic acid of the sample obtained from the sample is measured in comparison to the same nucleic acid portion of the sample that is free of cell growth abnormalities of the intestinal tissue. Hypermethylation refers to the presence of methylated alleles in one or more nucleic acids. Samples without cell growth abnormality of the intestinal tissues do not show methylation alleles when the same nucleic acid is tested.
샘플(Sample( samplesample ))
본 발명은 위암의 조기 확인에 대하여 기술하고 있으며, 위암 특이적 유전자 메틸화를 이용하고 있다. 위암 특이적 유전자의 메틸화는 종양 부위의 부근 조직에서도 일어났다. 그러므로, 위암의 조기 확인 방법은 액체 또는 고체 조직을 포함하는 모든 샘플로 위암-특이적 유전자의 메틸화의 유무를 확인할 수 있다. 상기 샘플은 조직, 세포, 소변, 대변, 혈청 또는 플라즈마를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
The present invention describes early identification of gastric cancer and utilizes gastric cancer specific gene methylation. Methylation of gastric cancer specific genes also occurred in tissues near the tumor site. Therefore, the early identification method of gastric cancer can confirm the presence or absence of methylation of gastric cancer-specific genes in all samples including liquid or solid tissue. The sample includes, but is not limited to, tissue, cells, urine, feces, serum or plasma.
개별 유전자 및 패널Individual genes and panels
본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.
The present invention can be used individually as a diagnostic or predictive marker, or a combination of several marker genes in the form of a panel display, and several marker genes can be used to improve reliability and efficiency through an overall pattern or a list of methylated genes. It can confirm that it improves. The genes identified in the present invention can be used individually or as a set of genes in which the genes mentioned in this example are combined. Alternatively, genes can be ranked, weighted, and selected for the level of likelihood of developing cancer, depending on the number and importance of the genes methylated together. Such algorithms belong to the present invention.
메틸화 검출 방법Methylation Detection Method
메틸화 특이 Methylation specific PCRPCR ( ( methylationmethylation specificspecific PCRPCR ))
지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.
When bisulfite is treated with genomic DNA, cytosine at the 5'-CpG'-3 site remains cytosine as it is methylated and becomes uracil if unmethylated. Therefore, PCR primers corresponding to the sites where the 5'-CpG-3 'nucleotide sequence exists were prepared for the converted nucleotide sequence after bisulfite treatment. In this case, PCR primers corresponding to methylation and two types of primers corresponding to unmethylated were prepared. After converting the genomic DNA to bisulfite and PCR using the two kinds of primers, the PCR product is made by using the primer corresponding to the methylated sequence when methylated. In the PCR product is produced by using a primer corresponding to unmethylation. Methylation can be qualitatively confirmed by agarose gel electrophoresis.
실시간 메틸화 특이 Real time methylation specific PCRPCR ( ( realreal timetime methylationmethylation specificspecific PCRPCR ))
실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.
Real-time methylation-specific PCR converts the methylation-specific PCR method into a real-time measurement method. After treating bisulfite with genomic DNA, a PCR primer for methylation is designed and real-time PCR is performed using these primers. To do. At this time, there are two methods of detection using a TanMan probe complementary to the amplified base sequence and a method of detection using Sybergreen. Thus, real-time methylation specific PCR can selectively quantitate only methylated DNA. Where in Standard curves were prepared using in vitro methylated DNA samples, and genes without the 5'-CpG-3 'sequence in the nucleotide sequence were amplified with negative controls to quantify the degree of methylation.
파이로시퀀싱Pyro Sequencing
파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.
The pyro sequencing method is a method of converting the bisulfite sequencing method into quantitative real-time sequencing. As in bisulfite sequencing, genomic DNA was converted by bisulfite treatment, and then PCR primers corresponding to sites without the 5'-CpG-3 'sequence were prepared. After treating genomic DNA with bisulfite, it was amplified by the PCR primers, and real-time sequencing was performed using the sequencing primers. Quantitative analysis of cytosine and thymine at the 5'-CpG-3 'site indicated the methylation degree as the methylation index.
메틸화 Methylation DNADNA 특이적 결합 단백질을 이용한 Using specific binding proteins PCRPCR 또는 정량 Or quantitative PCRPCR 및 And DNADNA 칩 chip
메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다. In the PCR or DNA chip method using methylated DNA-specific binding proteins, when a protein that specifically binds to methylated DNA is mixed with DNA, only methylated DNA can be selectively separated because the protein specifically binds to methylated DNA. . After genomic DNA was mixed with methylated DNA specific binding proteins, only methylated DNA was selectively isolated. These isolated DNAs were amplified using PCR primers corresponding to intron sites, and then subjected to agarose electrophoresis to determine methylation.
또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.
In addition, methylation can also be determined by quantitative PCR.Methylated DNA separated by methylated DNA-specific binding proteins can be labeled with a fluorescent dye and hybridized to DNA chips having complementary probes to measure methylation. Can be. Wherein the methylated DNA specific binding protein is not limited to MBD2bt.
차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 Detection of Differential Methylation-Limiting Methylation Sensitivity 엔도뉴클레아제Endonuclease
차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.Detection of differential methylation can be accomplished by contacting the nucleic acid sample with a methylation sensitive restriction endonuclease that cleaves only unmethylated CpG sites.
별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다. In a separate reaction, the samples were contacted with isochimers of methylation sensitive restriction endonucleases that cleave both methylated and unmethylated CpG sites, thereby cleaving the methylated nucleic acids.
특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.Specific primers were added to the nucleic acid sample and the nucleic acid was amplified by conventional methods. If there is an amplification product in the sample treated with the methylation sensitive restriction endonuclease, and there is no amplification product in the isomerized sample of the methylation sensitive restriction endonuclease that cleaves both methylated and unmethylated CpG sites , Methylation occurred in the analyzed nucleic acid site. However, no amplification products were present in the samples treated with methylation sensitive restriction endonucleases, and the amplification products were also found in the samples treated with isosomeomers of methylation sensitive restriction endonucleases that cleave both methylated and unmethylated CpG sites. Existence means that no methylation occurs in the analyzed nucleic acid site.
여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.Here, a "methylation sensitive restriction endonuclease" is a restriction enzyme that contains CG at the recognition site and has activity when C is methylated compared to when C is not methylated (eg, Sma I). Non-limiting examples of methylation sensitivity limiting endonucleases include Msp I, Hpa II, Bss HII, Bst UI and Not I. The enzymes may be used alone or in combination. Other methylation sensitivity limiting endonucleotides include, but are not limited to, for example, Sac II and Eag I. Isochimers of methylation sensitive restriction endonucleases are restriction endonucleases that have the same recognition site as methylation sensitive restriction endonucleases, but cleave both methylated and unmethylated CGs, e.g., Msp. I can be mentioned.
본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.The primers of the present invention are designed to have "alternatively" complementarity with each strand of the locus to be amplified and, as described above, include the appropriate G or C nucleotides. This means that the primers have sufficient complementarity to hybridize with the corresponding nucleic acid strands under the conditions for carrying out the polymerization. The primer of the present invention is used in the amplification process, which is an enzymatic continuous reaction in which the target locus, such as PCR, increases to an exponential number through many reaction steps. Typically, one primer (antisense primer) has homology to the negative (-) strand of the locus and the other primer (sense primer) has homology to the positive (+) strand. When the primer is annealed to the denatured nucleic acid, the chain is stretched by enzymes and reactants such as DNA polymerase I (Klenow) and nucleotides, resulting in newly synthesized + and-strands containing the target locus sequence. The newly synthesized target locus is also used as a template, and the cycle of denaturation, primer annealing and chain extension repeats exponential synthesis of the target locus sequence. The product of the continuous reaction is an independent double stranded nucleic acid having an end corresponding to the end of the specific primer used in the reaction.
상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.
The amplification reaction is preferably a PCR that is commonly used in the art. However, alternative methods such as real-time PCR or linear amplification with isothermal enzymes can also be used, and multiplex amplification reactions can also be used.
차별적 메틸화의 검출-Detection of differential methylation 바이설파이트Bisulfite 시퀀싱 방법 Sequencing Method
메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.
Other methods of detecting nucleic acids containing methylated CpG include contacting a sample containing nucleic acid with an agent that modifies unmethylated cytosine and amplifying the CpG-containing nucleic acid of the sample using CpG-specific oligonucleotide primers. It includes. Here, the oligonucleotide primer may be characterized by detecting the methylated nucleic acid by distinguishing the modified methylated and unmethylated nucleic acid. The amplification step is optional and desirable but not necessary. The method relies on a PCR reaction that distinguishes between modified (eg, chemically modified) methylated and unmethylated DNA. Such methods are disclosed in US Pat. No. 5,786,146, which is described in connection with bisulfite sequencing for the detection of methylated nucleic acids.
기질 temperament
타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.Once the target nucleic acid site is amplified, the nucleic acid amplification product can be hybridized with a known gene probe immobilized on a solid support (substrate) to detect the presence of the nucleic acid sequence.
여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Here, a "substrate" is a mixture means comprising a substance, structure, surface or material, abiotic, synthetic, inanimate, planar, spherical or specific binding, flat surface material, hybridization or enzyme recognition site Or many other recognition sites beyond the vast majority of other recognition sites or numerous other molecular species composed of surfaces, structures or materials. Such substrates include, for example, semiconductors, (organic) synthetic metals, synthetic semiconductors, insulators and dopants; Metals, alloys, elements, compounds and minerals; Synthesized, degraded, etched, lithographic, printed and microfabricated slides, devices, structures and surfaces; Industrial, polymers, plastics, membranes, silicones, silicates, glass, metals and ceramics; Wood, paper, cardboard, cotton, wool, cloth, woven and non-woven fibers, materials and fabrics, but are not limited thereto.
몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREENTM, ZETAPROBETM(Biorad) 및 NYTRANTM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.
Some types of membranes are known in the art to have adhesion to nucleic acid sequences. Specific and non-limiting examples of such membranes are membranes for gene expression detection such as nitrocellulose or polyvinylchloride, diaotized paper and commercially available membranes such as GENESCREEN ™ , ZETAPROBE ™ (Biorad) and NYTRAN ™ . Can be mentioned. Beads, glass, wafers and metal substrates are also included. Methods of attaching nucleic acids to such objects are well known in the art. Alternatively, screening can also be performed in the liquid phase.
하이브리다이제이션Hybridization 조건 Condition
핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.In nucleic acid hybridization reactions, the conditions used to achieve stringent specific levels vary depending on the nature of the nucleic acid being hybridized. For example, the length of the nucleic acid region to be hybridized, degree of homology, nucleotide sequence composition (eg, GC / AT composition ratio), and nucleic acid type (eg, RNA, DNA) select hybridization conditions. Is considered. Further considerations are whether the nucleic acid is immobilized, for example, in a filter or the like.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
Examples of very stringent conditions are as follows: 2X SSC / 0.1% SDS at room temperature (hybridization conditions); 0.2X SSC / 0.1% SDS at room temperature (low stringency conditions); 0.2X SSC / 0.1% SDS at 42 ° C. (conditions with moderate stringency); 0.1X SSC at 68 ° C. conditions with high stringency. The washing process can be carried out using one of these conditions, for example a condition with high stringency, or each of the above conditions, each of 10-15 minutes in the order described above, all or all of the conditions described above. Some iterations can be done. However, as described above, the optimum conditions vary with the particular hybridization reaction involved and can be determined experimentally. In general, conditions of high stringency are used for hybridization of critical probes.
표지(sign( LabelLabel ))
중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
Important probes are labeled so that they can be detected, for example, with radioisotopes, fluorescent compounds, bioluminescent compounds, chemiluminescent compounds, metal chelates or enzymes. Proper labeling of such probes is a technique well known in the art and can be carried out by conventional methods.
키트(Kit ( KitKit ))
본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 메틸화된 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.According to the present invention, there is provided a kit useful for detecting cell growth abnormality of a specimen. Kits of the invention comprise one or more containers comprising a compartmentalized carrier means for holding a sample, a second container containing a PCR primer pair capable of amplifying a methylated 5'-CpG-3 'sequencing site.
캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
The carrier means is suitable for containing one or more containers, such as bottles, tubes, each container containing independent components used in the method of the invention. In the context of the present invention, one of ordinary skill in the art can readily dispense the required formulation in the container.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
위암 특이적 메틸화 유전자 발굴Discovery of gastric cancer specific methylation gene
위암에서 과메틸화된 유전자를 선별하기 위하여, 충남대학교 병원 조직은행으로부터 위암환자의 혈청과 정상인의 혈청 시료를 제공받아 아래와 같은 방법으로 과메틸화 유전자들을 선별하였다.In order to select hypermethylated genes from gastric cancer, serum samples of gastric cancer patients and serum samples from normal patients were obtained from tissue banks of Chungnam National University Hospital, and hypermethylated genes were selected as follows.
우선 각 혈청 시료로부터 DNA를 분리하고, 정상인 20명(남자:10명, 여자:10명), 조기 위암환자 20명(남자:10명, 여자:10명) 그리고 진행형 위암환자 20명(남자:10명, 여자:10명)의 DNA들을 동량 혼합한 500ng의 DNA를 준비하였다. 500 ng의 DNA로부터 MethylcaptureTM (Genomictree 사, 대한민국)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 정상인 및 위암환자 유래의 혈청에 존재하는 메틸화 DNA를 선택적으로 분리하였다.First, DNA was separated from each serum sample, and 20 normal persons (10 males and 10 females), 20 early gastric cancer patients (10 males and 10 females), and 20 advanced gastric cancer patients (male: Ten DNA and 10 females) were prepared with 500 ng of DNA mixed in the same amount. Methylcapture ™ (Genomictree, South Korea) was selectively isolated from 500 ng of DNA according to the manufacturer's instructions for methylated DNA present in serum from normal and gastric cancer patients.
분리한 메틸화 DNA를 Genome Plex Complete Whole Genome Amplification Kit (Sigma, 미국)를 사용하여 증폭한 후, 위암 유래 증폭 DNA는 Cy5-dUTP로 표지하고, 정상인 유래 증폭 DNA는 Cy3-dUTP로 표지하여 혼합한 다음, 인간 유전체에 존재하는 27,800 여개의 CpG 섬에 존재하는 CpG에 대한 프로브가 집적되어 있는 CpG 마이크로어레이 (Agilent 사, 미국)를 사용하여 하이브리다이제이션을 수행하였다 (도 1). After amplifying the isolated methylated DNA using Genome Plex Complete Whole Genome Amplification Kit (Sigma, USA), amplified DNA from stomach cancer was labeled with Cy5-dUTP, and normal amplified DNA was labeled with Cy3-dUTP and mixed. Hybridization was performed using a CpG microarray (Agilent, USA) in which probes for CpG present in about 27,800 CpG islands present in the human genome were integrated (FIG. 1).
상기 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음, Agilent scanner (Agilent 사, 미국)를 이용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 이미지로부터 시그날 값의 계산은 Feature Extraction 프로그램 v. 9.5.3.1(Agilent 사, 미국)을 이용하여 정상인과 위암환자 혈청 시료 간 시그날의 상대적인 강도 차이를 계산하고, 분석 프로그램인 GeneSpring GX (Agilent 사, 미국)를 이용하여 정상인과 위암 환자간 메틸화 정도의 차이가 큰 유전자를 선별하였다. 정상인 및 조기위암 그리고 정상인 및 진행형 위암의 비교 결과 얻어진 CpG 마이크로 어레이 데이터를 GeneSpring GX를 이용하여 정규화를 하고, 이로부터 2장의 어레이 전부에서 위암에서 정상인에 비하여 5배 이상 과메틸화된 프로브 1,107개를 선별하였다. 이로부터 2개 이상 연접한 프로브에서 동시에 암환자에서 과메틸화를 나타내는 52종의 유전자를 선별하였다. 52종의 유전자중 통계적 유의성이 높은 (p < 0.01) NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3), AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2), LHX8 (NM_001001933, LIM homeobox 8) 및 ZAR1 (NM_175619, zygote arrest 1) 유전자를 바이오마커 후보로 선별하였다 (도 2).
After the hybridization, a series of washing procedures were performed, followed by scanning using an Agilent scanner (Agilent, USA). The calculation of signal values from microarray images can be found in the Feature Extraction Program v. 9.5.3.1 (Agilent, USA) was used to calculate the difference in signal intensity between normal and gastric cancer serum samples, and the analysis program GeneSpring GX (Agilent, USA) was used to determine the degree of methylation between normal and gastric cancer patients. Genes with large differences were selected. CpG microarray data obtained from the comparison of normal and early gastric cancer and normal and advanced gastric cancer were normalized using GeneSpring GX, and from these two arrays, 1,107 probes hypermethylated more than five times as compared to normal in gastric cancer were selected from all two arrays. It was. From this, 52 genes showing hypermethylation in cancer patients were selected by two or more concatenated probes at the same time. NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3), AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2), LHX8 (NM_001001933, LIM homeobox 8) ) And ZAR1 (NM_175619, zygote arrest 1) genes were selected as biomarker candidates (FIG. 2).
메틸화 유전자의 위암 세포주, 정상 Gastric cancer cell line of methylated genes, normal 위조직Stomach tissue 및 위암 수술조직에서 메틸화 확인 Methylation in Surgical and Gastric Cancer Surgery
2-1: 메틸화 유전자의 위암 세포주에서 메틸화 확인2-1: Methylation of Gastric Cancer Cell Lines of Methylated Genes
실시예 1에서 확인된 4개의 유전자가 위암 세포주에서 메틸화되어 있는지 확인하기 위하여, 위암 세포주 AGS (ATCC CRL-1739), MKN1 (한국세포주은행 KCLB No. 80101), MKN28 (한국세포주은행 KCLB No. 80102) 및 SNU484 (한국세포주은행 KCLB No. 00484)로부터 전체 게놈 DNA를 분리하고, 200ng의 게놈 DNA에 바이설파이트 키트(EZ DNA Methylation-Gold kit( ZYMO Research,USA))를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 MSP를 수행하였다.To confirm whether the four genes identified in Example 1 are methylated in gastric cancer cell lines, gastric cancer cell lines AGS (ATCC CRL-1739), MKN1 (Korea Cell Line Bank KCLB No. 80101), MKN28 (Korea Cell Line Bank KCLB No. 80102) ) And SNU484 (Korea Cell Line Bank KCLB No. 00484), and the whole genomic DNA was isolated and bisulfite was prepared using a bisulfite kit (EZ DNA Methylation-Gold kit (ZYMO Research, USA)) on 200 ng of genomic DNA. Treated. Treatment of DNA with bisulfite leaves unmethylated cytosine modified with uracil and methylated cytosine remains unchanged. The bisulfite-treated DNA was eluted with 20 µl of sterile distilled water to perform MSP.
상기 4개의 유전자에 대한 MSP 수행하기 위한 PCR 프라이머는 MethPrimer 프로그램(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 MSP 프라이머는 표 3에 나타내었다.
PCR primers to perform MSP for the four genes were designed using the MethPrimer program (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html). MSP primers for methylation measurement of each gene are shown in Table 3.
/어닐링 온도Amplification Product Size (bp)
Annealing temperature
AFF2AFF2
NTRK3NTRK3
LHX8LHX8
ZAR1ZAR1
상기 바이설파이트가 처리된 게놈 DNA 20ng에 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase (Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP (Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 다음, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 5 μl of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), 5 units of Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 μl of 2.5mM dNTP (Solgent, Korea), 2 μl of PCR primer (10 pmole /) in 20ng of the bisulfite-treated genomic DNA Μl)) was treated at 95 ° C. for 5 minutes, followed by 45 times of 40 seconds at 95 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 40 seconds at 72 ° C., followed by reaction at 72 ° C. for 5 minutes.
상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤상에서 전기영동하여 확인하였다. 즉, 상기 증폭된 PCR 산물의 band 강도를 측정 (ImageAnalyzer, 코아바이오, 한국)하여 메틸화 특이적 PCR 산물의 band 강도가 비메틸화 특이적 PCR 산물의 band 강도보다 1/10 이상인 경우를 메틸화된 것으로 판정하였다. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis on 2.0% agarose gel. That is, the band intensity of the amplified PCR product was measured (ImageAnalyzer, Cobio, Korea) to determine that the band intensity of methylated specific PCR product is 1/10 or more than the band intensity of non-methylated specific PCR product. It was.
상기 4개의 유전자에 대하여 4종의 위암 세포주에서 메틸화 여부를 측정한 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 4종의 유전자가 최소 1개 이상에서 메틸화되어 있는 것으로 확인되었다.
As a result of measuring the methylation in four gastric cancer cell lines with respect to the four genes, as shown in FIG. 3A, it was confirmed that at least one of the four genes was methylated.
2-2: 메틸화 유전자의 정상 2-2: Normal of Methylated Gene 위조직에서In the stomach tissue 메틸화 확인 Methylation Confirmation
한편, 상기 유전자가 바이오마커로서 유용성을 가지려면 정상 위조직에서는 메틸화가 되어 있지 않아야 한다. 이를 확인하기 위하여 위암 환자가 아닌 정상인의 위조직 지노믹 DNA(Biochem 사, 미국)를 구입하여 메틸화 여부를 상기와 동일하게 MSP 방법으로 측정하였다.On the other hand, in order for the gene to be useful as a biomarker, it should not be methylated in normal gastric tissue. In order to confirm this, gastric tissue genomic DNA (Biochem Co., USA) of a non-gastric cancer patient was purchased and methylation was measured by the MSP method in the same manner as described above.
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, LHX8과 ZARI은 정상 위조직에서 메틸화가 검출되어 바이오마커로서 유용성이 없는 것으로 판단되어 제외시켰다. 반면에 NTRK3 유전자와 AFF2 유전자와는 정상위조직에서 메틸화가 되어 있지 않은 것을 확인하였다. 따라서 이들 2종의 유전자(NTRK3, AFF2)는 바이오마커로서 유용성을 가질 가능성이 있음을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 3B, LHX8 and ZARI were excluded because they were found to be not useful as biomarkers because methylation was detected in normal gastric tissue. NTRK3 gene and AFF2 on the other hand It was confirmed that the gene was not methylated in normal gastric tissue. Therefore, it was confirmed that these two genes ( NTRK3 , AFF2 ) may have utility as biomarkers.
2-3: 메틸화 유전자의 위암 수술조직에서의 메틸화 확인 2-3: Methylation of methylated genes in gastric cancer surgical tissues
상기 2종의 바이오마커 유전자에 대하여 위암 수술조직에서의 메틸화 상태를 MSP 방법으로 측정하였다. 5명의 위암환자 수술조직 (충남대학교병원 조직은행)으로부터 암 조직과 이와 연접하는 정상소견 조직의 DNA를 분리하여 메틸화 여부를 측정하였다. NTRK3 유전자는 5명 전부의 암조직에서 메틸화가 확인되었으며, AFF2 유전자는 5명 중 3명의 암조직(2T, 4T, 5T)에서 메틸화가 확인되어 위암 진단용 바이오마커로서 유용성을 암조직에서 확인하였다(도 3C). The methylation status of the two biomarker genes in gastric cancer surgical tissues was measured by the MSP method. DNA from cancer tissue and normal-tissue tissues in contact with the gastric cancer surgical tissue (Chungnam National University Hospital Tissue Bank) was measured for methylation. NTRK3 gene was methylated in all five cancer tissues. AFF2 Gene was identified in three of five cancer tissues (2T, 4T, 5T) of methylation confirmed the usefulness in cancer tissue as a biomarker for diagnosing gastric cancer (Fig. 3C).
또한 이들 2종의 유전자는 정상조직에서는 메틸화가 전혀 되어있지 않은 반면(도 3B), 암 조직과 연접하는 정상소견 조직에서는 메틸화가 확인되어(도 3C), 이는 전형적인 field cancerizationn 현상이 나타나는 것을 확인하였다. 통상적으로 field defect 현상은 암 조직과 연접하고 있는 정상조직에서도 이미 분자수준에서의 암화가 일어나는 것을 대변해주는 현상으로서 조기진단에 대한 유용성이 높음을 제시해 주는 증거라 할 수 있다.
In addition, these two genes were not methylated at all in normal tissues (FIG. 3B), while methylation was confirmed in normal-tissue tissues in contact with cancer tissues (FIG. 3C), indicating a typical field cancerization phenomenon. . In general, the field defect phenomenon represents the occurrence of cancer at the molecular level, even in normal tissues that are connected to cancer tissues, and suggests the high usefulness of early diagnosis.
파이로시퀀싱을Pyro Sequencing 이용한 메틸화 유전자의 메틸화 확인 Confirmation of methylation of methylated gene using
3-1. 위암 세포주 대상 메틸화 확인3-1. Confirmation of methylation of gastric cancer cell line
실시예 2에서 확인된 바이오마커 유전자의 메틸화 상태를 정량적으로 확인하기 위하여, 각각의 프로모터, UTR, 엑손 또는 인트론 부위에 대해 파이로시퀀싱을 수행하였다.In order to quantitatively confirm the methylation status of the biomarker gene identified in Example 2, pyro sequencing was performed for each promoter, UTR, exon or intron site.
바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 위암 세포주 AGS (ATCC CRL-1739), MKN-1 (한국세포주은행 KCLB No. 80101) 및 SNU484 (한국세포주은행 KCLB No. 00484)로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.To transform unmethylated cytosine into uracil using bisulfite, gastric cancer cell lines AGS (ATCC CRL-1739), MKN-1 (Korea Cell Line Bank KCLB No. 80101) and SNU484 (Korea Cell Line Bank KCLB No) 00484) was isolated, and bisulfite was treated with 200 ng of genomic DNA using the EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA). Treatment of DNA with bisulfite leaves unmethylated cytosine modified with uracil and methylated cytosine remains unchanged. The bisulfite-treated DNA was eluted with 20 µl of sterile distilled water to perform pyrosequencing.
상기 2개의 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 2 및 표 3과 같다.
PCR and sequencing primers for performing pyro sequencing for the two genes were designed using the PSQ assay design program (Biotage, USA). PCR and sequencing primers for methylation measurement of each gene are shown in Tables 2 and 3 below.
번호order
number
a Y = C 또는 T, R = A 또는 G a Y = C or T, R = A or G
b전사 개시점 (+1)으로부터의 거리(nucleotide): 메틸화 측정에 사용된 CpG 부위의 게놈 DNA 상의 위치
b nucleotide from transcription initiation point (+1): location on genomic DNA of CpG site used for methylation measurement
상기의 바이파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP(Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다. 20 ng of genomic DNA converted to the above-mentioned bipite was amplified by PCR. PCR reaction solution (20 ng genomic DNA converted to bisulfite, 5 μl of 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea), 5 units of Taq polymerase (Enzynomics, Korea), 4 μl of 2.5 mM dNTP (Solgent, Korea), 2 μl of PCR primer) 10 pmole / μl)) was treated at 95 ° C. for 5 minutes, followed by a total of 45 times of 40 seconds at 95 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 40 seconds at 72 ° C., followed by reaction at 72 ° C. for 5 minutes. Amplification of the PCR product was confirmed by electrophoresis using 2.0% agarose gel.
상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. After the amplified PCR product was treated with PyroGold reagent (Biotage, USA), pyro sequencing was performed using the PSQ96MA system (Biotage, USA). After the pyro sequencing, the degree of methylation was measured by calculating the methylation index. The methylation index was calculated by calculating the average rate of cytosine binding at each CpG site.
상기 바이오마커 후보 유전자의 장암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 4A에서 나타난 바와 같이, 상기 2개의 바이오 마커 유전자 모두가 최소 2개 이상의 세포주에서 약 50% 이상 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다. 상기 2개의 유전자는 위암 세포주에서 높은 메틸화 수준을 나타냄으로써, 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 가질 가능성을 보여주었다. 이에 다음과 같이, 이를 검증하기 위하여 조직시료를 이용한 메틸화 검증 실험을 추가로 진행하였다.
Quantitatively measuring the degree of methylation of the biomarker candidate gene in the intestinal cancer cell line using a pyro sequencing method, as shown in FIG. 4A, the two biomarker genes were approximately 50% in at least two cell lines. It confirmed that it was methylated to the high level above. The two genes showed high methylation levels in gastric cancer cell lines, demonstrating their potential as a biomarker for diagnosing gastric cancer. Therefore, to verify this, a methylation verification experiment using tissue samples was further performed.
3-2. 위암 조직 대상 메틸화 확인3-2. Confirmation of methylation of gastric cancer tissue
실시예 2로부터, 위암 조직 및 암세포주에서 과메틸화 되어 있으나 정상 위조직에서는 메틸화가 되어 있지 않음을 확인한 NTRK3 및 AFF2 유전자를, 조직시료를 대상으로 정량적인 메틸화 측정을 위하여 환자가 아닌 정상인의 위조직 (5예) 그리고 20명의 위암환자 수술조직으로부터 얻은 위암과 연접하는 정상소견 조직과 위암 조직 (충남대학교 병원 조직은행)을 이용한 암 진단용 바이오마커로 사용할 수 있는지 검증하기 위하여 정량적인 파이로시퀀싱 분석을 수행하였다. 메틸화 어세이는 실시예 3-1에 기재된 파이로시퀀싱 방법으로 수행하였다.From Example 2, NTRK3 confirmed that it was hypermethylated in gastric cancer tissues and cancer cell lines but not methylated in normal gastric tissue And Normal and gastric cancer tissues associated with gastric cancer obtained from 20 non-patient gastric tissues and 20 gastric cancer surgical tissues for quantitative methylation measurement of AFF2 gene (Tissue of Chungnam National University Hospital) Quantitative pyro sequencing analysis was performed to verify whether it can be used as a biomarker for cancer diagnosis using Ginkgo). Methylation assay was performed by the pyro sequencing method described in Example 3-1.
그 결과, AFF2 유전자의 경우, 환자가 아닌 정상 위조직에 비하여 20예의 위암 조직중 18예 (90.0%)에서 높은 수준의 메틸화를 나타내어 위암 특이적 과메틸화 유전자임을 확인할 수 있었다 (도 4B). 또한 NTRK3 유전자는 20예의 위암 조직중 20예 (100%)에서 높은 수준의 메틸화를 나타내는 것을 확인하였다 (도 5B). 이러한 결과는 이들 두 개의 유전자가 위암 진단을 위한 메틸화 바이오마커로서의 유용성을 갖는다는 것을 보여주는 증거이다. 그리고 MSP 결과와 마찬가지로 암과 연접한 정상소견 조직에서도 암환자가 아닌 정상인의 위조직에 비하여 높은 수준의 메틸화가 측정되어 전형적인 field defect 현상이 존재하는 것을 확인하였다. 통상적으로 field defect 현상은 암 조직과 연접하고 있는 정상조직에서도 이미 분자수준에서의 암화가 일어나는 것을 대변해주는 현상으로서 조기진단에 대한 유용성이 높음을 제시해 주는 증거라 할 수 있다. 그리고 조기위암 (병기 1, 2)에서도 높은 수준의 과메틸화가 관찰됨으로써 조기진단에 대한 유용성이 높음을 제시해 준다.
As a result, the AFF2 gene showed a high level of methylation in 18 (90.0%) of 20 gastric cancer tissues compared to non-patient gastric tissue, confirming that it is a gastric cancer-specific hypermethylated gene (FIG. 4B). In addition, the NTRK3 gene was confirmed to show a high level of methylation in 20 (100%) of 20 gastric cancer tissue (Fig. 5B). These results are evidence showing that these two genes have utility as methylated biomarkers for the diagnosis of gastric cancer. And, as in the MSP results, high levels of methylation were measured in normal tissues linked to cancer, compared to normal gastric tissues. In general, the field defect phenomenon represents the occurrence of cancer at the molecular level, even in normal tissues that are connected to cancer tissues, and suggests the high usefulness of early diagnosis. In addition, high levels of hypermethylation are observed in early gastric cancer (stages 1 and 2), suggesting high usefulness for early diagnosis.
위액에서의 In gastric juice 바이오마커Biomarker 유전자의 Gene 과메틸화Hypermethylation 측정 Measure
실시예 2 및 3으로부터, 위암 조직 및 암세포주에서 과메틸화 되어 있으나 정상 위조직에서는 메틸화가 되어 있지 않음을 확인한 NTRK3 및 AFF2 유전자를, 위내시경을 통하여 채취한 위액 (충남대학교 병원 조직은행)을 이용한 암 진단용 바이오마커로 사용할 수 있는지 검증하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 즉, 5명의 정상인 및 11명의 위암 환자의 위액을 이용하여 상기 바이오마커에 대하여 메틸화 어세이를 수행하였다. 메틸화 어세이는 실시예 2에 기재된 MSP 방법으로 수행하였다.From Examples 2 and 3, NTRK3 confirmed that it was hypermethylated in gastric cancer tissues and cancer cell lines but not methylated in normal gastric tissue And The following experiment was performed to verify whether the AFF2 gene can be used as a biomarker for cancer diagnosis using gastric juice (Chungnam University Hospital Tissue Bank) collected through endoscopy. That is, methylation assays were performed on the biomarkers using gastric juice from 5 normal and 11 gastric cancer patients. Methylation assay was performed by the MSP method described in Example 2.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, AFF2 유전자는 정상인의 위액에서는 전혀 메틸화가 되어 있지 않고, 11명의 위암환자중 7명 (63.6%)에서는 메틸화가 확인되었다. NTRK3 유전자는 정상인의 위액에서는 5명 중 1명에서 메틸화가 되어 있었으며, 위암환자에서는 11명 중 10명 (90.9%)의 위액에서 메틸화가 검출되었다. 이러한 결과는 상기 2종의 바이오마커 유전자는 위내시경을 통해 채취한 위액을 이용한 위암 진단의 경우에도 유용성이 있음을 보여주고, 특히 NTRK3 유전자는 11명 중 10명의 위암환자 전부에서 메틸화가 확인되어 위액을 이용한 위암 진단에 높은 유용성이 있음을 보여준다.
As a result, as shown in FIG. 5, the AFF2 gene was not methylated at all in normal gastric juice, and methylation was confirmed in 7 (63.6%) of 11 gastric cancer patients. NTRK3 gene was methylated in 1 of 5 patients in normal gastric juice, and methylation was detected in 10 (90.9%) of gastric juice in 11 patients with gastric cancer. These results show that the two biomarker genes are useful in the diagnosis of gastric cancer using gastric juice collected by gastroscopy. Especially, the NTRK3 gene is methylated in all 10 gastric cancer patients. Shows high usefulness for diagnosing gastric cancer.
2종 2 types 바이오마커Biomarker 유전자의 위암 환자 혈청 Gene Stomach Cancer Serum DNADNA 에서 메틸화 확인Methylation in
상기 2종의 바이오마커 유전자가 대표적인 비침습적 시료인 혈청에서의 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 검증하기 위하여 정상인 20명, 조기 위암환자 10명, 그리고 진행형 위암환자 10명의 혈청(충남대학교병원 조직은행) DNA를 대상으로 메틸화 여부를 측정하였다. 혈청 DNA를 이용한 메틸화 측정은 실시예 2와 동일한 MSP 방법으로 수행하였다.In order to verify the usefulness of the two biomarker genes as a biomarker for diagnosing gastric cancer in serum, a representative non-invasive sample, serum of 20 normal patients, 10 early gastric cancer patients, and 10 advanced gastric cancer patients (Chungnam National University Hospital Tissue Bank) DNA was measured for methylation. Methylation measurement using serum DNA was performed by the same MSP method as in Example 2.
그 결과, AFF2 유전자는 정상인 20명 중 4명 (시료번호 3, 6, 14, 17)에서만 메틸화가 검출되었고, 반면에 조기위암환자의 혈청에서는 10명 중 8명 (80%) 그리고 진행형 위암환자에서도 10명 중 9명 (90%)에서 메틸화가 검출되어 혈청을 이용한 위암 조기진단에 대한 유용성이 높음을 보여준다(도 6, 도 8). NTRK3 유전자는 정상인 (20명)에서는 메틸화가 전혀 검출되지 않았고, 반면에 조기위암에서는 10명 중 7명 (70%) 그리고 진행형 위암에서는 10명 중 9명 (90%)에서 메틸화가 검출되어 혈청을 이용한 위암의 조기진단에 대한 유용성이 높음을 보여준다(도 7, 도 8). 각 유전자의 메틸화 빈도는 표 4에 요약하였다.
As a result, AFF2 gene was detected in only 4 of 20 normal patients (Sample Nos. 3, 6, 14, 17), whereas in serum of early gastric cancer patients, 8 out of 10 (80%) and advanced gastric cancer patients In 9 out of 10 (90%) methylation was detected, showing the high usefulness for early diagnosis of gastric cancer using serum (Fig. 6, 8). The NTRK3 gene had no methylation at all (20 patients), whereas methylation was detected in 7 out of 10 (70%) in early gastric cancer and 9 out of 10 (90%) in advanced gastric cancer. It shows that the usefulness of the early diagnosis of the gastric cancer used is high (Fig. 7, Fig. 8). The methylation frequency of each gene is summarized in Table 4.
바이오마커
Biomarker
상기 위암 진단에 유용성을 확인한 위암 진단 바이오마커 유전자인 AFF2의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위를 포함하는 영역과 NTRK3의 프로모터 및 5' UTR 부위를 포함하는 영역의 서열은 표 5와 같다.
The sequence of the region including the 5 'UTR, the first exon and the first intron region of AFF2 , a gastric cancer diagnostic biomarker gene confirming its usefulness in gastric cancer diagnosis, and the region containing the promoter and 5' UTR region of NTRK3 are shown in Table 5 and same.
따라서, NTRK3 유전자는 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도가 각각 90% 와 80%로 확인되었고 AFF2 유전자는 민감도 및 특이도가 각각 90% 와 80%로 측정되어, 상기 2종의 바이오마커 유전자는 위암 환자 혈청을 이용한 위암 진단에도 유용함을 확인하였다.
Therefore, the NTRK3 gene was identified as 90% and 80% of the sensitivity and specificity for gastric cancer diagnosis, respectively, and the AFF2 gene was measured as 90% and 80%, respectively. It was found to be useful for diagnosing gastric cancer using patient serum.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those skilled in the art, such a specific description is only a preferred embodiment, which is not limited by the scope of the present invention Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Genomic Tree Incorporation <120> Methylation Biomarker of Gastric Cancer Specific for Gactric Cancer Diagnosis <130> P09-B256 <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 527 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actgcatctt ccttctcttc ctttcctcgg gctccgggtg tgtgtatgtg tgagagtgag 60 tgtgtgtgtt ttgcaggtgc gtggtgtgtc cgttttaatt ctgcccagta ggtgggactt 120 ggtgacttta gcaccatttt ttccttttcc tttttttttt ttgcctcccc accgtctgtt 180 gcaaccctgc aaagtctcgg agtcggagag cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg 240 gcgagtcagc gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc 300 tcgcggctcc cacccggcgg cggcggcggc ggcggcggcg tccgcgatgg tttcagacgc 360 tgaaggattt tgcatctgat cgctcggcgt ttcaaaggca gaggcccccc ctcccccttc 420 ccccctccct cgccgtcttt gtttccttcc ccccctgctc tccccactcc ccccacccca 480 cccccctctc ctctcctcct cctctttttt agaagcagcg atcggag 527 <210> 2 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acaggaccag acacctccag cgcccgctgc tgctgccgat gcggcccgga cacttttagc 60 tgggcgggag ggctggagag ccgggggccg ccgagaaccg 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<220> <223> primer <400> 8 ggagagtcgg gggtcgtcga gaatc 25 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gacgaacgaa cgcctatccc taatcgca 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tggagagttg ggggttgttg agaattgt 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aacaaacaaa cacctatccc taatcaca 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttttagagtt ttcggattcg gcgagttagc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ataaaaaccg cgaaaaacgc ctaataacgc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tagagttttt ggatttggtg agttagtga 29 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ataaaaacca caaaaaacac ctaataacac 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tttaatggtg gcgttttgcg ggttttc 27 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tcgcgtaata aacgaacact ttctcatcgc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atttttaatg gtggtgtttt gtgggttttt 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tcacataata aacaaacact ttctcatcac 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gttagggcga cgtttttggg acgt 24 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccgtacgatc aaaactaacc tatacgcc 28 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggttagggtg atgtttttgg gatgt 25 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 caaccataca atcaaaacta acctatacac 30 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 gcagcagtgg taggtgttga ttt 23 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 gcagcagtgg taggtgttga tttttgcctt ctc 33 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg 50 <210> 27 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 gcagtggtag gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct 60 gaggttttcg cctttgttaa 80 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 28 gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg 60 60 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 29 cgcgcctcgc ttccagagcc 20 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 30 cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg 30 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac 40 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 32 ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc 50 <210> 33 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg gcgagtcagc gatcgccgag ccggccacca 60 tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc cacccggcgg cggcggcggc 120 120 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gggatttgga gtagtagtgg tagg 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aatccrcatc cctccctctt cc 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttgttgtaat tttgtaaagt tt 22 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 atacaaaatc cttcaacrtc taaaaccat 29 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tgtttttttt tttgatgag 19 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ttgttgtaat tttgtaaagt tt 22 <110> Genomic Tree Incorporation <120> Methylation Biomarker of Gastric Cancer Specific for Gactric Cancer Diagnosis <130> P09-B256 <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 527 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actgcatctt ccttctcttc ctttcctcgg gctccgggtg tgtgtatgtg tgagagtgag 60 tgtgtgtgtt ttgcaggtgc gtggtgtgtc cgttttaatt ctgcccagta ggtgggactt 120 ggtgacttta gcaccatttt ttccttttcc tttttttttt ttgcctcccc accgtctgtt 180 gcaaccctgc aaagtctcgg agtcggagag cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg 240 gcgagtcagc gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc 300 tcgcggctcc cacccggcgg cggcggcggc ggcggcggcg tccgcgatgg tttcagacgc 360 tgaaggattt tgcatctgat cgctcggcgt ttcaaaggca gaggcccccc ctcccccttc 420 ccccctccct cgccgtcttt gtttccttcc ccccctgctc tccccactcc ccccacccca 480 cccccctctc ctctcctcct cctctttttt agaagcagcg atcggag 527 <210> 2 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acaggaccag acacctccag cgcccgctgc tgctgccgat gcggcccgga cacttttagc 60 tgggcgggag ggctggagag ccgggggccg ccgagaaccg ccagcgagct gtgccgagag 120 ccgcgccgac ccgctgcgat cagggacagg cgcccgcccg ccgccgccgc ctggccgcta 180 tggatctatt cgactttttc agagactggg acttggagca gcagtggtag gtgttgattt 240 ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg cctttgttaa 300 gaggagctga agctgtcgtg gggggcgccc cggactccct cccacttgct ctcagccacc 360 tctggccccg gccgcgctga ctcctaggtc ggatgccggg gtggggggag gtgcgggaag 420 agggagggat gcggacccga aagcgtcgct ttgcgctcca agtctaaaga gttgcatttg 480 gctcacatcg aattcggtgc 500 <210> 3 <211> 250 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 actgcatctt ccttctcttc ctttcctcgg gctccgggtg tgtgtatgtg tgagagtgag 60 tgtgtgtgtt ttgcaggtgc gtggtgtgtc cgttttaatt ctgcccagta ggtgggactt 120 ggtgacttta gcaccatttt ttccttttcc tttttttttt ttgcctcccc accgtctgtt 180 gcaaccctgc aaagtctcgg agtcggagag cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg 240 gcgagtcagc 250 <210> 4 <211> 277 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc 60 cacccggcgg cggcggcggc ggcggcggcg tccgcgatgg tttcagacgc tgaaggattt 120 tgcatctgat cgctcggcgt ttcaaaggca gaggcccccc ctcccccttc ccccctccct 180 cgccgtcttt gtttccttcc ccccctgctc tccccactcc ccccacccca cccccctctc 240 ctctcctcct cctctttttt agaagcagcg atcggag 277 <210> 5 <211> 179 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 acaggaccag acacctccag cgcccgctgc tgctgccgat gcggcccgga cacttttagc 60 tgggcgggag ggctggagag ccgggggccg ccgagaaccg ccagcgagct gtgccgagag 120 ccgcgccgac ccgctgcgat cagggacagg cgcccgcccg ccgccgccgc ctggccgct 179 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atggatctat tcgacttttt cagagactgg gacttggagc agcagtg 47 <210> 7 <211> 274 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gtaggtgttg atttttgcct tctcctttga tgagcgagtc tcctggcgaa gtctgaggtt 60 ttcgcctttg ttaagaggag ctgaagctgt cgtggggggc gccccggact ccctcccact 120 tgctctcagc cacctctggc cccggccgcg ctgactccta ggtcggatgc cggggtgggg 180 ggaggtgcgg gaagagggag ggatgcggac ccgaaagcgt cgctttgcgc tccaagtcta 240 aagagttgca tttggctcac atcgaattcg gtgc 274 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggagagtcgg gggtcgtcga gaatc 25 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gacgaacgaa cgcctatccc taatcgca 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tggagagttg ggggttgttg agaattgt 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aacaaacaaa cacctatccc taatcaca 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttttagagtt ttcggattcg gcgagttagc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ataaaaaccg cgaaaaacgc ctaataacgc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tagagttttt ggatttggtg agttagtga 29 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ataaaaacca caaaaaacac ctaataacac 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tttaatggtg gcgttttgcg ggttttc 27 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tcgcgtaata aacgaacact ttctcatcgc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atttttaatg gtggtgtttt gtgggttttt 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tcacataata aacaaacact ttctcatcac 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gttagggcga cgtttttggg acgt 24 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccgtacgatc aaaactaacc tatacgcc 28 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggttagggtg atgtttttgg gatgt 25 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 caaccataca atcaaaacta acctatacac 30 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 gcagcagtgg taggtgttga ttt 23 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 gcagcagtgg taggtgttga tttttgcctt ctc 33 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg 50 <210> 27 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 gcagtggtag gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct 60 gaggttttcg cctttgttaa 80 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 28 gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg 60 60 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 29 cgcgcctcgc ttccagagcc 20 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 30 cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg 30 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac 40 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 32 ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc 50 <210> 33 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg gcgagtcagc gatcgccgag ccggccacca 60 tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc cacccggcgg cggcggcggc 120 120 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gggatttgga gtagtagtgg tagg 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aatccrcatc cctccctctt cc 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttgttgtaat tttgtaaagt tt 22 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 atacaaaatc cttcaacrtc taaaaccat 29 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tgtttttttt tttgatgag 19 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ttgttgtaat tttgtaaagt tt 22
Claims (12)
NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) A biomarker for diagnosing gastric cancer containing a CpG island of the gene.
The method of claim 1, wherein the CpG islands are NTRK3 Biomarker for diagnosing gastric cancer, characterized in that located in the promoter or 5 'UTR of the gene.
3. The method of claim 2, wherein said CpG island is said NTRK3 Gastric cancer diagnostic biomarker, characterized in that located in the region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the gene.
The method of claim 1, wherein the CpG islands are AFF2 A biomarker for diagnosing gastric cancer, which is located in at least one region of the 5 'UTR, the first exon, and the first intron of the gene.
The method of claim 4, wherein the CpG islands are AFF2. Gastric cancer diagnostic biomarker, characterized in that located in the region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the gene.
NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) or AFF2 (GenBank NM_002025, AF4 / FMR2 family, member 2) A kit for diagnosing gastric cancer, comprising a primer pair for amplifying a fragment containing a methylated CpG island of a gene.
The method of claim 6, wherein the primer pair is SEQ ID NO: 8 and 9; Or a stomach cancer diagnostic kit comprising the sequences represented by SEQ ID NOs: 12 and 13.
A nucleic acid chip for diagnosing gastric cancer, in which a probe capable of hybridizing under strict conditions with the biomarker of claim 1 is fixed.
The gastric cancer diagnostic nucleic acid chip according to claim 8, wherein the probe represented by any one or more of the sequences represented by SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 33 is immobilized.
A method for detecting methylation of a biomarker of any one of claims 1 to 5 from a clinical sample containing DNA for the diagnosis of gastric cancer.
The method of claim 10, wherein the methylation detection method is PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR, DNA chip, And pyro sequencing and bisulfite sequencing.
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