KR20120051638A

KR20120051638A - 알츠하이머 질환의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR20120051638A
Application number: KR1020127000492A
Authority: KR
Inventors: 디에고 마스트로에니; 조셉 로저스; 앤드류 글로버; 폴 디 콜먼
Original assignee: 배너 선 헬스 리서치 인스티튜트
Priority date: 2009-06-09
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2012-05-22
Also published as: AU2010258757A1; US20110086925A1; WO2010144634A1; US20160047801A1; CA2765163A1; EP2440927A4; US20140220572A1; JP2012529659A; EP2440927A1

Abstract

다양한 구현예가 백혈구 내 후성유전적 마커를 관찰함으로써 알츠하이머 질환의 발견, 진단 및/또는 진행 모니터링을 위한 방법을 제공한다. 알츠하이머 질환 상태의 결정 방법이 제공된다. 따라서, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다: 하나 이상의 혈액 구성성분을 포함하는 시료를 기판에 위치시키고, 상기 시료를 표지하여 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별하는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커의 양을 결정하는 단계; 상기 양을 기준값과 비교하는 단계; 및 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 단계.

Description

알츠하이머 질환의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템{METHOD AND SYSTEM TO DETECT, DIAGNOSE, AND MONITOR THE PROGRESSION OF ALZHEIMER'S DISEASE}

발명자: Diego Mastroeni (Surprise, AZ), Joseph Rogers (Glendale, AZ), Andrew Grover (Peoria, AZ), 및 Paul D. Coleman (New River, AZ)

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 Diego Mastroeni, Joseph Rogers, Andrew Grover, 및 Paul D. Coleman 에 의해, 2009 년 6 월 9 일자로 미국 특허 및 상표청에 출원된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 61/185,344 에 대한 우선권 및 권익을 청구하며, 상기 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다.

치매 및 노망은 한때 자연스런 노화 과정의 일부로 받아들여졌다. 1906 년에, Alois Alzheimer 박사는 노인성 치매를 앓는 환자의 검시 동안 발견한 병리조직학적 변화를 보고했다. 그러한 변화는 오늘날 알츠하이머 질환의 표식인 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 반으로 인식되고 있다. 알츠하이머 질환은 궁극적으로 치매 및 사망을 초래하는 진행성 신경퇴화를 특징으로 한다.

오늘날, 알츠하이머 질환의 궁극적 병리학은 상당히 잘 확립되어 있지만, 해당 질환의 병인학 및 발병에 대한 복잡한 생물학적 기반으로 인해 유효한 진단 방법 및 치료 세부원칙은 요원한 채 남아있다. 생물학적으로 특이적인 스크리닝 기법이 부재한 탓에 과학자 및 임상의학자들에게 신뢰성있는 진단 시험이 없다. 알츠하이머 질환에 대한 임상적인 진단 기법은 현재 우울증, 영양결핍, 여타 치매유발 조건 (예를 들어, 치매가 있는 파킨슨씨 질환) 또는 약물 상호작용과 같은 여타 가능성있는 원인들을 배제함으로써 치매의 개별적인 제시 병후를 스크리닝하는 것에 의존하고 있다. 그러한 정량적인 비특이적 방법은 종종, 치료가 덜 유효할 수 있는 더 늦은 상태에 이를 때까지 알츠하이머 질환이 오진되거나 또는 인식되지 못하도록 한다. 알츠하이머 질환의 조기 발견 및 치료는 병후를 지연시키고 환자의 삶의 질을 연장시킬 수 있는 성공적 치료를 위한 최선의 희망으로 존속한다. 유효한 생물학적 실험실 기반의 진단 세부원칙없이는, 초기 단계의 알츠하이머 질환을 발견하고 치료하는 능력은 요원한 채 남아 있게 될 것이다.

개요

다양한 구현예는 백혈구에서의 후성유전적 마커 관찰 관찰에 의한 알츠하이머 질환의 발견, 진단 및/또는 진행 모니터링을 위한 방법을 제공한다. 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 방법이 제공된다. 따라서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다: 하나 이상의 혈액 구성성분을 함유하는 시료를 기판에 위치시키는 단계; 해당 시료를 표지해 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별하는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커의 양을 결정하는 단계; 상기 양을 기준값과 비교하는 단계; 및 알츠하이머 질환 상태를 결정하는 단계.

본원에 제공되는 상세한 설명으로부터 추가적인 적용 영역이 명백해질 것이다. 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 오직 설명을 목적으로 하는 것을 의도로 하며, 본 교시내용의 범위를 한정하려는 의도는 아님이 이해될 것이다.

도면의 간단한 설명

본원에 기재된 도면은 오직 설명 목적의 것이고, 본 교시내용의 범위를 임의로 한정하려는 의도가 아니다. 본 교시내용은 상세한 설명 및 다음의 내용을 담고 있는 첨부된 도면을 통해 더욱 완전히 이해될 것이다:

도 1 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 다양한 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신의 존재와 관련된 생리학적 데이터의 현미경사진 제시이다;

도 2 는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 대조군과 비교한 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신 존재 하의 변화와 관련된 생리학적 데이터의 현미경사진 제시이다;

도 3 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 대조군과 비교한 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 DOC1 의 존재 하의 변화와 관련된 생리학적 데이터의 현미경사진 제시이다;

도 4 는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 대조군과 비교한 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 MBD2 의 존재 하의 변화와 관련된 생리학적 데이터의 현미경사진 제시이다;

도 5 는 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 대조군과 비교한 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 DNMT1 의 존재 하의 변화와 관련된 생리학적 데이터의 현미경사진 제시이다;

도 6 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 다양한 임상적으로 진단된 신경학적 상태에 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 HDAC1 의 존재 하의 변화의 정량과 관련된 임상적 및 생리학적 데이터를 설명하는 막대 그래프이다;

도 7 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 알츠하이머 질환의 임상적 진단에 대한 말초혈 백혈구에서의 다양한 예시적 후성유전적 마커의 존재 하에서의 연관된변화의 감응도 및 특이성과 관련된 임상적 및 생리학적 데이터를 설명하는 표이다;

도 8 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 경도 인지 기능장애, 알츠하이머 질환, 또는 치매가 없는 정상 노인 대조군 중 한가지를 나타내는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신의 존재 하의 변화와 관련된 임상적 및 생리학적 데이터의 현미경사진 제시이다;

도 9 는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 경도 인지 기능장애, 알츠하이머 질환, 또는 치매가 없는 정상 노인 대조군 중 한가지를 나타내는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 DNMT1 의 존재 하의 변화와 관련된 임상적 및 생리학적 데이터를 설명하는 막대 그래프이다;

도 10 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 메틸렌 블루에 대한 정량적인 도트 블롯 및 메틸렌 블루에 대한 보정 곡선을 도시하는 다이어그램이다;

도 11 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 5-메틸싸이토신에 대한 정량적 도트 블롯 및 5-메틸싸이토신에 대한 보정 곡선을 도시하는 다이어그램이다.

상세한 설명

하기의 설명은 본래 단지 예시적인 것이고, 본 발명의 교시내용, 적용 또는 용도를 한정하려는 의도가 아니다. 도면을 통틀어, 대응 참고 수치는 비슷하거나 또는 대응하는 부분 및 특징을 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 본 교시내용의 다양한 구현예에 나타난 구체적인 예시의 설명은 오직 설명을 목적으로 하는 것을 의도하고, 본원에 개시된 교시 범위를 한정하려는 의도는 아니다. 더욱이, 언급한 특징을 가진 여러 구현예의 인용은 언급한 특징의 상이한 조합을 포함하는 여타 구현예 또는 추가 특징을 가진 여타 구현예를 배제하려는 의도가 아니다.

다양한 구현예에서 알츠하이머 질환 (이후, "AD") 의 발견, 진단 및/또는 진행 모니터링을 위한 방법, 기구, 시스템 및 키트를 제공한다. 다양한 구현예, 즉 AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템의 상세한 설명은 본 발명의 다양한 구현예에 따른 개시된 방법 및 시스템의 임의의 적용에 보편적일 수 있는 구체적인 구현가능한 개시내용으로서 제공된다. 더욱이, 다양한 구현예의 상세한 설명은 본 출원의 출원 시점에 본 발명자에게 공지되어 있는 최선의 양태를 포함한다.

본 발명은 백혈구와 같은 혈액 구성성분에서의 후성유전적 변화를 통한 AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링에 관한 것이다. 백혈구는 림프구, 호중구, 호염구 및 대식세포와 같은 임의의 백혈구 서브타입을 함유할 수 있다. 본 발명의 대표적인 구현예에서, 상기 방법은 DNA 메틸화와 같은, 백혈구에서의 후성유전적 변화의 검출을 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예에 따라, DNA 메틸화 수준은 AD 가 있는 환자의 백혈구에서 감소될 수 있다. 예시 구현예에서, DNA 메틸화에서의 감소는 AD 의 초기 단계에 있는 환자의 백혈구에서 검출될 수 있는데, 여기서 상기 질환은 아직 통상적인 진단 방법을 이용해서 진단될 수 있는 수준으로 드러나진 않는 상태이다.

AD 와 같은 신경학적 질환의 차별적인 진단은 병후가 분명해졌을 때 정신적 부전의 원인을 설명하기 위한 다양한 통상적인 진단 방법의 수행을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통상적인 진단 방법은 뇌의 특정 영역에 대해 손상이 발생했는지 여부를 결정하기 위해, 환자의 문제 해결 기술, 주의 폭, 카운팅 기술, 및 기억의 평가와 같은 임상의에 의한 다양한 정량적 시험의 수행을 포함할 수 있다. 더욱이, 임상의는 환자의 의학적 이력, 예컨대 과거의 외상, 신경학적 장애의 가족력, 의약 투여 및 심리사회적 이력, 예컨대 결혼 상태, 생활 상태, 고용여부, 성적인 이력 및 심리적 원인을 나타낼 수 있는 중요한 생애 사건, 예컨대 우울의 징후를 조사함으로써 정신 부전의 원인을 조직적으로 도출해낼 수 있다. 정신 부전 또는 치매의 여타 원인 배제 프로세스를 통해, 임상의들은 AD 를 의심하기 시작할 수 있다.

AD 는 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 반의 존재에 대해 사망 후에 뇌 조직을 시험하기까지는 정의내려 진단될 수 없다. 살아있는 환자의 뇌 조직의 검사는 일반적으로 접근불가하거나 또는 윤리적인 문제가 있으므로, AD 의 말기 단계의 뇌에 대한 일부 현미경상의 변화는 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캐닝, 핵 자기공명 영상 (MRI), 및 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 과 같은 여타 통상적인 진단 방법을 이용해 검출될 수 있다. CT, MRI 및 PET 기법은 뇌의 위축, 뇌 활동 및 혈관 구조에서의 변화와 같은 말기 AD 의 특징인 뇌에서의 변화를 보여줄 수 있다. 결과적으로, 그러한 기법들은, 변화들이 뇌 조직의 신경 세포 내부에서의 생화학적 수준에 머물러 있는 질환의 조기 단계는 검출해내지 못한다.

다중적인 생물학적 경로를 포괄하는 수많은 유전자들에서의 발현 변화가 AD 뇌의 병적으로 허약한 영역에서 보고된 바 있다. 예를 들어, AD 의 발병에 기여하는 것으로 여겨지는 에너지 대사, 염증 및 세포 주기 조절을 위한 분자적 경로에 대한 변화가 보고된 바 있다. 유전자 발현에서의 그러한 변화들은 AD 에서 널리 퍼져 있으나, 겉보기에는 상관성이 없는 수많은 상이한 분자적 경로들 사이에서의 유전자 발현의 변경을 설명하는 일반적인 대단히 중요한 원칙의 해명은 부족하다.

후성유전적 메커니즘은 상이한 경로들 사이에서의 세포에서의 전반적인 유전자 발현을 변경시키는 것에 대해 설명하거나 또는 그에 기여할 수 있다. 예를 들어, 염색질 또는 DNA 발현에 대한 변화, 예컨대 히스톤 변경, 비-히스톤 단백질의 결합 또는 DNA 메틸화를 야기하는 후성유전적 메커니즘은 AD 에 특이적일 수 있는 유전자 발현에 대한 전반적인 변화를 야기할 수 있다. 후성유전적 메커니즘은 게놈을 통틀어 수많은 생물학적 경로에 관여된 유전자들의 전사를 변경시킴으로써 세포 표현형에서의 광범위한 변화를 조율할 수 있다.

후성유전적 메커니즘은 염색질의 거대 및 미세구조, DNA 의 복합체, 염색체 단백질 및, 히스톤 단백질 (히스톤 단백질은 이중가닥 DNA 가 감겨있는 구조 주변에 함께 묶여 있음) 에서의 변화들에 관여할 수 있다. 이어서, 히스톤 단백질에서의 입체배좌 변경 또는 DNA 가 히스톤 주변을 감는 방식의 변경은 전사 기구의 일부 유전자에 대한 접근을 구별하여 변경시키면서, 또다른 유전자의 접근은 온전하게 할 수 있다.

메틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 수모일화, 시트룰린화, ADP-리보실화 및 히스톤 단백질을 만드는 여타 번역후 아미노산 개질을 포함하는, 히스톤이 개질되는 여러가지 메커니즘이 있지만, 히스톤 아세틸화는 가장 흔하고 널리 연구된 것들 중 하나이다. 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 (HAT) 는 아세틸-코엔자임 A 유래의 아세틸기의 히스톤 단백질의 N-말단 상의 라이신 잔기로의 이동을 촉매한다. 아세틸화의 결과로서, 히스톤 단백질의 양전하는 중화되어, 히스톤 단백질 꼬리와 회합된 DNA 의 음으로 하전된 포스페이트기와의 상호작용을 감소시킨다. 염색질의 그러한 구조적 완화는 복합체 내부 유전자들에 대한 접근 및 전사를 허용한다. 역으로, 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 는 아세틸화 히스톤 단백질의 아세틸기를 코엔자임 A 로 되돌려 놓아, 더욱 응축된 염색질 상태를 제공하고, 유전자 전사를 감소 또는 침묵시킨다.

DNA 메틸화는 DNA 를 개질하여, 유전자 발현에서의 변화를 결과로서 제공하는 후성유전적 메커니즘의 한가지 유형을 포함한다. DNA 서열 내 근접 싸이토신-구아닌 디뉴클레오티드 (CpG) 는 DNA 메틸트랜스퍼라아제로 지칭되는 단백질에 의해 메틸화될 수 있다. 싸이토신-구아닌 디뉴클레오티드쌍 (CpG) 의 메틸화는 메틸화된 CpG 서열을 포함하는 유전자의 프로모터 영역에 대한 세포의 전사 기구들의 접근을 억제할 수 있다. 메틸화는 유전자의 코딩 영역 내에서 또는 유전자의 측면에 배치할 수 있는 반복적인 DNA 서열 내에서 일어날 수 있다. 그러한 메틸화는, 그것이 심지어 프로모터 영역으로부터 약간의 거리를 두고 있는 곳에서 일어나더라도, 유전자 발현을 변경시킬 수 있다.

고도로 메틸화된 유전자는 유전자 발현에서 감소 또는 억제를 나타낼 수 있다. 역으로, 하이포메틸화된 DNA 를 유도하는 CpG 를 탈메틸화하는 메커니즘은 유전자 발현의 상향조절을 유도할 수 있다. 그러나, 그러한 경향성은, 하이포메틸화된 유전자가 억제된 유전자 발현을 나타내기도 하고, 과대하게 메틸화된 유전자가 상향조절되기도 하는 예외적인 사실이 발견되어, 일반적인 것은 아니다. 결과적으로, 해당하는 특별한 유전자에 대한 메틸화의 영향을 밝혀내기 위해서는 특별한 유전자의 발현 및 단백질 수준에서 그 결과로 야기되는 변화를 검정해야만 한다.

DNA 메틸화는 히스톤 아세틸화 및 여타 히스톤-개질 메커니즘과 높은 수준으로 상호작용한다. DNA 내 근접 CpG 는 DNA 메틸트랜스퍼라아제, DNMT1, DNMT2, DNMT3a/b 및 DNMT4 의 작용에 의해 메틸화될 수 있다. 포유류에서, DNMT1 는 본래, DNA 복제 후 헤미메틸화 DNA 의 메틸화 유지에 관여하는 것으로 나타나는 한편, DNMT3a 및 DNMT3b 는 처음부터 메틸화에 관여한다. DNMT2 는, 5-싸이토신 DNA 메틸트랜스퍼라아제 활성을 갖고 DNA 와 변성-내성 복합체를 형성하기는 하지만, 통상적으로 RNA 메틸트랜스퍼라아제로 간주된다. DNMT 에 의해 싸이토신으로 이동되는 메틸기는 그의 S-아데노실메티오닌과의 상호작용을 통해, 그리고 더욱 상류에서는 호모시스테인-메티오닌 싸이클과의 상호작용을 통해 궁극적으로 폴레이트로부터 유도한다.

이러한 프로세스를 통해, 인간 게놈에서 약 70% 의 CpG 디뉴클레오티드가 메틸화되어 있다. 메틸화는 유전자 상의 임의의 CpG 부위에서 일어날 수 있지만, 이는 특히 프로모터 영역 내 CpG-풍부 스트렛치 (CpG 아일랜드) 와 관련하여 특히 중요할 수 있다. 상당한 50,267 개의 CpG 아일랜드가 인간 게놈 내에 존재하고, 이들 중 28,890 개는 마스킹되는 단순 반복성인 낮은 복잡도를 가진 서열 내에 있다.

DNA 메틸화가 유전자 발현을 변경시킬 수 있는 제 2 의 연관된 메커니즘은 메틸-싸이토신-결합 복합체 (MeCP), 예컨대 MeCP2 를 통한 것이다. 메틸화된 DNA 에 결합되는 경우, MeCP2 는 HDAC 를 동원하는 것으로 나타났는데, 이는, 먼저 언급한 바와 같이, 후속하여 더욱 응축된 염색질 상태 및 감소되거나 또는 침묵화되는 유전자 전사를 유도할 수 있다. MeCP2 유전자의 돌연변이는 Rett's 증후군을 유발하는데, 신경 발생의 조절불능, 정신 지체 및 운동 불능이 있게 된다.

DOC1 를 포함하는, 소정의 10 가지 상이한 펩티드로 이루어진 거대분자인 MeCP1 는 또한 메틸화 및 히스톤 아세틸화 사이의 매개자로서 작용할 수 있어, CpG 디뉴클레오티드를 인식하고 그에 결합하고, HDAC 를 동원하고, 전사 억제를 유도한다. 그러나, MeCP2 와는 달리, MeCP1 는 메틸화된 DNA 에는 직접 결합하지 않고, 단일한 메틸-CpG-결합 도메인 단백질, MBD2 에 결합한다. 히스톤 개질을 유도하는 것에 추가하여, MBD2-결합 MeCP1 은 DNMT1 를 동원함으로써 CpG 의 메틸화 상태 유지를 돕는다. 이어서, DNMT1 은 1 개의 DNA 가닥 상에서 메틸기를 상실했지만, 나머지 한 가닥에서는 메틸기를 상실하지 않은 CpG 를 인식하고 수리할 수 있다.

상기 논의된 후성유전적 메커니즘은 후성유전적 마커의 측면에서 고려될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 용어 "마커" 는 일반적으로 생화학적 시험 또는 분석 시험 또는 이들의 조합에 의해 검출될 수 있는 임의의 특이적인 특징으로서 받아들여진다. 예를 들어, 마커는 시료 내의 효소의 존재 또는 부재를 표시할 수 있고, 일부의 경우 마커는 시료 내 효소의 농도 결정에 사용될 수 있다. 또한, 마커는, 예를 들어 시료 내 생화학적 반응의 활성을 표시할 수 있다. 나아가, 마커는 예를 들어, 시료 내 단백질의 존재 또는 부재를 표시할 수 있고, 일부의 경우 마커는 시료 내 단백질의 농도 결정에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "후성유전적 마커" 는 DNA 메틸화 마커 및 히스톤 개질 마커 중 하나 이상으로 정의될 수 있다. DNA 메틸화 마커의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 5-메틸싸이토신, 5-메틸싸이티딘, DNMT1, DNMT2, DNMT3a/b, MeCP, DOC1, MBD2 및 MBD3 이 포함된다. 히스톤 개질 마커의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, HDAC1, HDAC2 및 HAT 가 포함된다.

DNA 메틸화는 세포 분열 동안 DNA 메틸화의 유지 맥락에서 연구된 바 있다. 그러나, DNA 메틸화의 역할은, 신경후성유전학 분야에서 신경세포를 포함하는 유사분열 후 세포에서 설명된 바 있다. DNA 메틸화의 신경후성유전학적 연구는, 초기 생애에서의 스트레스의 결과물로 초래된 마우스에서의 생리적, 기억 및 행동 변화를 야기하는 시상하부 신경세포에 대한 장기적으로 지속하는 개질과 같은, 신경세포 및 시냅스 가소성 매개에서의 그의 역할을 설명한다.

질환에 의한 손상에 취약한 것으로 공지된 알츠하이머 질환이 있는 환자의 뇌 조직, 예컨대 후각 뇌피질 층 II 신경세포는, DNA 메틸화의 마커 및 DNA 메틸화 유지 인자에 대한 면역반응성에 있어서 눈에 띄는 감소를 나타낸다. 예를 들어, 메틸화된 DNA 에 대한 마커인 5-메틸싸이토신 및 5-메틸싸이티딘에 대한 항체를 이용해 신경세포를 표지하는 것은, AD 가 있는 환자로부터의 뇌 조직 시료에서의 면역반응성에 있어서 해당 질환이 없는 환자로부터의 시료에 비해 극적인 감소를 나타낸다.

뇌 조직에서의 마커 발생 감소를 근간으로 하는 알츠하이머 질환에 대한 진단 방법의 개발은 여러가지 이유, 예컨대 뇌 조직 수득의 생체내 침입성 및 과정상의 위험성 및 그와 연관된 높은 비용 때문에 실용적이지 못하다. 상기 질환을 그의 가장 이른 시기에 발견하고자 할 때 그러한 접근법은 상당히 문제가 될 수 있는데, 이는 환자가 질환의 모호한 병후만 나타내거나 또는 아예 병후를 나타내지 않아, 과정상의 위험성 및 진단비용을 조정불가하게 할 수 있기 때문이다.

따라서, AD 의 후성유전적 변화 특징에 대한 평가를 위한 비침습적 진단 기법의 개발은 뇌 조직에서는 문제의 소지가 있고 실행불가능하다. 진단 기법이 일상적인 진료 방문시 수집될 수 있는 쉽게 수득가능한 생물학적 시료, 예컨대 혈액, 소변, 타액 또는 모발 시료를 근간으로 하는 것은 편의성, 비용 제어 및 과정상의 위험성 감소 측면에서 장점을 제시한다. 그러나, 문헌 및 여타 의학적 정보 공급원에 따르면, 그러한 진단 기법은 현재 존재하지 않는다.

본원에 개시된 바와 같이, 예상치 못한 놀라운 결과가 수득되었다. 본 발명자들은 환자로부터의 혈액 시료 분석에 의해 AD 의 질환 상태를 결정하는 방법론을 개발하게 되었다. 그러한 놀라운 예상치못한 결과는, 혈액 시료의 백혈구 내 전반적인 DNA 메틸화 수준이 환자에서의 AD 의 질환 상태와는, 여타 질환 또는 AD 가 아닌 상태에 비해 극히 높은 특이성으로 연관될 수 있다는 발견사실과 연관된다.

도 1 을 참조해 보면, 현미경사진 100 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 다양한 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신의 존재여부와 관련된 생리학적 데이터를 설명한다. 본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 인지적으로 정상인 고령 환자 유래의 말초혈 백혈구의 시료에서 면역검정이 수행될 수 있다. 면역검정은 단리된 백혈구를 예를 들어 현미경 슬라이드와 같은 기판에 적용한 후, 5-메틸싸이토신에 대한 1 차 항체로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 과량의 1 차 항체는 세척될 수 있고, 2 차 항체와 콘쥬게이션된 리포터 분자의 적용이 후속된다. 발색된 신호가 기판 상의 백혈구 세포에서 나타날 수 있고, 현미경을 이용해 관찰될 수 있다. 도 1 에 제시된 바와 같이 림프구 105, 호중구 110, 호염구 115 및 대식세포 120 이 항체에 대한 면역반응성을 나타낼 수 있고, 이는 5-메틸싸이토신의 존재여부를 나타낸다. 그러나, 호산구 125 는 그러한 조건 하에서 5-메틸싸이토신에 결합한 항체에 대한 면역 반응성을 나타내지 않을 수도 있다.

도 2 로 이동하면, 현미경사진 200 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 대조군과 비교해 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신의 존재 하에서의 변화와 관련된 생리학적 데이터를 설명한다. 다양한 구현예에 따라, 5-메틸싸이토신에 대한 1 차 항체를 이용한 면역검정은 인지적으로 정상인 90 세 환자 (우측 컬럼에 도시) 및 AD 로 진단된 90 세 환자 (좌측 컬럼에 도시) 유래의 말초혈 백혈구의 시료 상에서 수행될 수 있다. 도 2 에서 도시된 바와 같이, 마이크로그래프 200 은 AD 로 진단된 90 세 환자 유래의 백혈구 205 가 인지적으로 정상인 90 세 환자의 백혈구 210 에 비해 감소된 면역반응성을 나타낸다는 것을 보여준다. 패널 (a) 및 (b) 는 40 배 배율로 나타낸 염색된 백혈구를 설명하는 예시 마이크로그래프이고, 패널 (c) 및 (d) 는 100 배 배율에서의 동일한 예시 마이크로그래프를 나타낸다. 패널 (e) 및 (f) 는 추가로 각각 패널 (c) 및 (d) 에 나타낸 박스로 표시한 영역의 확대도를 제시한다.

도 3 을 참조하면, 현미경사진 300 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 대조군과 비교한 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 DOC1 의 존재 하의 변화에 관련된 생리학적 데이터를 도시한다. 도시된 바와 같이 다양한 구현예에 따르면, 통상적 진단 방법에 의해 AD 로 진단된 2 명의 환자 및 질환이 없는 2 명의 노인 대조군 환자 (ND) 로부터 분리한 백혈구의 후성유전적 마커 DOC1 에 대한 항체에 대한 면역반응성에 있어서의 차이가 관찰될 수 있다. DOC1 에 대한 1 차 항체를 이용한 면역검정은 각 환자로부터의 백혈구에서 수행될 수 있다. 도시된 바와 같이, AD 가 있는 환자로부터의 백혈구 310, 315 는, ND 환자로부터의 백혈구 300, 305 에 비해 DOC1 에 대한 항체에 대해 감소된 면역반응성을 나타냈으며, 이에 따라 AD 가 있는 환자에 대해서는 백혈구 세포에서 감소된 양의 DOC1 가 존재한다는 것을 의미한다.

도 4 를 보면, 현미경사진 400 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 대조군에 비해 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 MBD2 의 존재 하에 있어서의 변화에 관련된 생리학적 데이터를 도시한다. 후성유전적 마커 MBD2 에 대한 1 차 항체를 이용한 면역검정은 통상적인 진단 방법에 의해 AD 로 진단된 2 명의 환자 및 2 명의 ND 대조군 환자 각각으로부터의 백혈구에서 수행될 수 있다. 도시된 바와 같이, AD 가 있는 환자로부터의 백혈구 410, 415 는 ND 환자로부터의 백혈구 400, 405 에 비해 MBD2 에 대한 항체에 대해 감소된 면역반응성을 나타내, 이에 따라 AD 가 있는 환자에 대해서는 백혈구 세포에 감소된 양의 MBD2 가 존재함을 의미했다.

도 5 를 참조하면, 현미경사진 500 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 대조군과 비교해 알츠하이머 질환이 있는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 DNMT1 의 존재 하의 변화와 관련된 생리학적 데이터를 도시한다. 후성유전적 마커 DNMT1 에 대한 1 차 항체를 이용한 면역검정은 통상적 진단 방법에 의해 AD 로 진단된 2 명의 환자 및 2 명의 ND 대조군 환자 각각으로부터의 백혈구 상에서 수행될 수 있다. 도시된 바와 같이, AD 가 있는 환자로부터의 백혈구 510, 515 는 ND 환자로부터의 백혈구 500, 505 에 비해 DNMT1 로부터의 항체에 대한 감소된 면역반응성을 나타내, 이에 따라 AD 가 있는 환자에 대해 백혈구 세포에서는 감소된 양의 DNMT1 가 존재함을 의미한다.

도 6 을 참조하면, 본 발명의 다양한 구현예에 따라 다양한 임상적으로 진단된 신경학적 상태의 환자의 말초혈 백혈구 중의 후성유전적 마커 HDAC1 의 존재여부에서의 변화 정량과 관련된 임상적 생리학적 데이터를 보여주는 막대 그래프이다. 다양한 구현예에 따르면, 다양한 신경학적 상태의 환자 유래의 후성유전적 마커에 결합하는 항체에 대한 말초혈 백혈구의 면역반응성이 정량될 수 있다. 후성유전적 마커의 수준은, 세포의 단백질을 포함하는 백혈구 유래의 세포 용해물을 이용해 니트로셀룰로오스 멤브레인에 점을 찍은 단백질에 대한 도트 블롯 검정을 수행해 정량될 수 있다. 세포 용해물을 진공 도트 블롯 매니폴드를 이용해 멤브레인 상에서 건조시켰다. 멤브레인은 후성유전적 마커에 대한 1 차 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척한 후, 2 차 항체와 콘쥬게이션된 리포터를 이용해 처리했다. 착색된 신호가 발생할 수 있고, 그의 강도를 멤브레인 상의 착색된 기질의 광학 밀도를 측정할 수 있도록 배치된 농도계를 이용해 측정했다.

도 6 에 도시된 바와 같이, 다양한 신경학적 상태의 환자 유래의 후성유전적 마커 HDAC1 에 결합하는 항체에 대한 말초혈 백혈구의 면역반응성이 정량될 수 있다. HDAC1 의 수준은 본원에 논의된 바와 같이 단백질에 대한 도트 블롯 검정을 수행하여 정량될 수 있다. 상기 수준 또는 광학 밀도의 측정은 β-액틴 담지 대조군의 광학 밀도에 대해 정규화될 수 있다. AD 로 진단된 환자의 시료에서의 2 차 항체로부터의 신호의 정규화된 광학 밀도는 파킨슨씨 병으로 진단된 환자의 시료 유래 신호의 약 30% 이다. AD 로 진단된 환자의 시료의 강도는, 치매가 있는 루게릭병으로 진단된 환자 유래의 신호의 약 36%, ND 대조군 환자의 시료로부터의 신호의 약 40% 이다. 도시된 바와 같이, 여타 신경학적 상태가 있는 환자 또는 질환이 없는 환자로부터 유도된 백혈구 시료에 비해 AD 백혈구 시료에서의 HDAC1 항체에 대한 면역반응성에 대한 신호에서 현저한 감소가 관찰되는데, 이는 AD 를 여타 상태와 구분할 수 있다.

도 7 은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 알츠하이머 질환의 임상적 진단에 대해 말초혈 백혈구에서의 다양한 예시 후성유전적 마커의 존재 하의 관련된 변화의 감응도 및 특이성과 관련된 임상적 생리학적 데이터를 보여주는 표이다. 다양한 구현예에 따라, 말초혈 시료를, 51 명의 통상적 진단 방법에 의해 알츠하이머 질환으로 진단된 환자, 파킨슨씨병과 같은 여타 신경학적 상태가 있는 환자, 및 정상 노인 대조군으로부터 수득했다. 시료는 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신, 5-메틸싸이티딘, HDAC1 및 DNMT1 에 대한 1 차 항체를 이용한 면역검정을 사용해 항체에 대한 면역반응성에 대해 검정했다. AD 발견에 대한 100% 특이성이 관찰되어, 후성유전적 마커의 수준에서의 감소가 통상적인 진단 방법에 의해 AD 로 진단된 모든 환자에 대해 AD 의 결정을 결과로서 제공했다. 후성유전적 마커를 근거로 한 진단은 또한 AD 발견에 대해 75% 내지 100% 감응도를 보여줘, 후성유전적 마커 수준은 각 백혈구 시료에서 AD 가 있는 환자와 여타 신경학적 상태가 있는 환자를 구분한다. 본원에 제시된 바와 같이, 본 발명의 다양한 구현예는 환자 시료 유래의 백혈구 내 여러가지 후성유전적 마커를 분석하는 것을 포함할 수 있고, 나아가 결과로 제공된 여러가지 후성유전적 마커의 분석으로부터 질환 상태를 결정하는 것을 포함할 수 있다.

도 8 을 참조하면, 현미경사진은 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 경도 인지 기능장애, 알츠하이머 질환, 또는 치매가 없는 정상 노인 대조군 중 한가지를 나타내는 환자의 말초혈 백혈구 내 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신의 존재 하의 변화와 관련된 임상적 생리학적 데이터를 도시한다. 면역검정을 이용한 후성유전적 마커 5-메틸싸이토신에 결합하는 항체에 대한 면역반응성은 경도 인지 기능장애 (MCI) 또는 AD 중 하나로 진단된 환자에서 관찰될 수 있다. 환자의 일상 활동은 지장받지 않으나, 환자가 기억, 언어, 주의력, 추리, 판단, 읽기 및 쓰기에 있어서 부전을 겪을 수 있는 MCI 는 임상적으로 진단될 수 있다. MCI 가 있는 환자는 정상적 인지로부터 알츠하이머 질환의 치매로 진행될 높은 가능성이 있는 것으로 간주되고, 30 내지 40% 의 MCI 환자는 3 년 이내에 알츠하이머 질환으로 정식으로 진단되고, 특히 1 차적인 부전은 기억에 있다.

도 8 에 도시된 바와 같이, 정상적 인지를 가진 대조군 백혈구 800, 805 는 5-메틸싸이토신에 결합하는 항체에 대해 양성 면역반응성을 나타내, 정상적인 DNA 메틸화를 나타낸다. AD 가 있는 2 명의 환자 유래의 백혈구 810, 815 는 5-메틸싸이토신의 면역 반응성의 현저한 감소를 나타낸다. 그러나, MCI 로 진단된 2 명의 환자 유래의 백혈구 820, 825 는 5-메틸싸이토신 항체에 대해 중간 정도의 면역반응성을 나타낸다. 중간 정도 수준의 면역반응성은, AD 에서 관찰되는 감소된 수준의 DNA 메틸화에 결국 도달할 수 있는 DNA 메틸화의 억제 또는 비정상적 양의 표시이다.

도 9 를 참조하면, 막대 그래프는 본 발명의 다양한 구현예에 따라, 경도 인지 기능장애, 알츠하이머 질환 또는 치매가 없는 정상 노인 대조군 중 한가지를 나타내는 환자의 말초혈 백혈구에서의 후성유전적 마커 DNMT1 의 존재 하에서의 변화와 관련된 임상적 생리학적 데이터를 도시한다. MCI 로 진단된 환자에서의 후성유전적 마커 DNMT1 에 결합하는 항체에 대한 면역반응성이 관찰될 수 있다. 말초혈 백혈구는 통상적 진단 방법에 의해 MCI 또는 AD 로 진단된 환자로부터, 그리고 ND 대조군으로부터 분리했다. 면역검정은 DNMT1 에 대한 1 차 항체를 이용해 백혈구 시료 상에서 수행될 수 있다. DNMT1 항체에 대한 시각적인 면역반응성을 가진 세포의 총 갯수를 계수하여 현미경을 이용해 슬라이드를 맹검법으로 관찰했다. 상기 갯수를 슬라이드 상의 세포의 총 갯수로 나누어, 양성 면역반응성 세포의 분율을 제공했다. ND 대조군 시료 유래의 세포는 약 50% 가 면역반응성이어서, DNA 메틸화에 대한 정상적인 양의 DNMT1 를 표시했다. 그러나, AD 시료는 오직 약 16 내지 18% 만 면역반응성이어서, DNA 메틸화에 대해 가용한 DNMT1 의 양이 감소되어 있음을 표시했다. 중간 수준의 DNMT1 항체 면역반응성이 MCI 시료에 대해 관찰되어, 가용한 DNMT1 양의 감소를 나타냈지만, 그것이 AD 수준만큼 낮지는 않았다.

예시 구현예를 따라, 상기 논의된 도면을 참조하면, 2 가지 예시 개념이 나타난다. 첫번째로, AD, ND 및 MCI 환자에서의 DNA 메틸화 차이는 너무도 극명하여 육안으로도 식별이 가능하다. 두번째로, DNA 메틸화와 관련된 여러가지 마커들은 그러한 차이를 나타낸다. DNA 메틸화는 복잡한 프로세스이다.

이러한 발견사실은 DNA 메틸화 자체가 AD 에서 극심하게 변경될 뿐만 아니라, DNA 메틸화를 수행하고 유지하는 분자들에서 동등하게 극심한 결함이 있다는 점을 표시한다.

따라서, 다양한 구현예에서, 5-메틸 싸이토신 마커, DNMT1 마커, HDAC1 마커 및 5-메틸 싸이티딘 마커를 포함하는 임의의 후성유전적 마커 또는 이들의 조합은 AD 의 질환 상태 결정에 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 5-메틸 싸이토신 및 5-메틸 싸이티딘은 DNA 메틸화의 직접적인 측정을 제공할 수 있다. DNMT1 및 HDAC1 이 DNA 메틸화의 직접적인 측정은 아니지만, 이들 예시 마커들은 AD 의 질환 상태 결정에 사용될 수 있다. DNMT1 은 메틸화를 수행하는 분자이고, HDAC1 는 상기 메틸화를 유지하는데 관여하는 분자이다. 다양한 구현예에서, 후성유전적 마커는, 이에 제한되지 않으나, DOC1, DNMT2, DNMT3a/b, HDAC2, MBD2, MBD3, RPL26, p66, MTA2, RbAp48, 및 이들의 조합과 같은 마커들을 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예는 환자 시료에서 백혈구의 전체적인 DNA 메틸화의 현재 상태를 관찰함으로써 AD 의 발견, 진단 및/또는 진행 모니터링을 위한 방법을 제공한다. 다양한 구현예에 따라, 백혈구의 전반적인 DNA 메틸화의 현재 상태는, 전반적인 DNA 메틸화의 직접적인 측정 또는 전반적인 DNA 메틸화와 연관된, 히스톤-관련 마커를 포함하는 하나 이상의 후성유전적 마커의 측정에 의해 결정될 수 있다. 예시 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 혈액 시료 수집 단계; 혈액 시료로부터의 백혈구 또는 그의 일부분의 분리 단계; 항체를 백혈구 내에 위치한 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합시키는 단계; 후성유전적 마커에 결합되어 있는 항체를 염색하거나 또는 그렇지 않으면 표지하는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합된 표지로부터의 신호 또는 염색의 양을 관찰, 측정 또는 정량하는 단계; 및 정성적 또는 정량적 기준 시료에 대해 염색 또는 표지로부터의 신호의 양을 비교하는 단계.

방법의 예시 구현예에서, 염색 또는 표지는 예를 들어 메틸화된 DNA 부위와 같은 후성유전적 마커 또는, 예를 들어 이에 제한되지 않으나, 메틸화 프로모터, 메틸화 저해제, 메틸화 유지제 및 히스톤-관련 마커와 같은 DNA 메틸화의 후성유전적 메커니즘에 결합하는 항체에 콘쥬게이션할 수 있는 임의의 부분을 포함할 수 있다. 추가로, 방법의 여타 예시 구현예에서, 염색 및 표지는 후성유전적 마커에 결합하는 항체에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 더욱이, 다양한 구현예에서, 후성유전적 마커는 하나 이상의 DNA 메틸화 마커 및 히스톤 개질 마커이다. 하나 이상의 후성유전적 마커의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 5-메틸싸이토신, 5-메틸싸이토딘, DOC1, DNMT1, DNMT2, DNMT3a/b, HDAC1, HDAC2, HAT1, MBD2, MBD3, RPL26, p66, MTA2, RbAp48, 및 이들의 조합이 포함된다.

방법은 후속할 가시화 또는 관찰을 위한 검출용 2 차 항체에 콘쥬게이션된 육안으로 보이는 염료 또는 형광단과 같은 표지의 첨가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 표지는, 예를 들어 광학 현미경과 같은 확대를 이용해 또는 확대없이 육안으로 관찰될 수 있거나 또는 가시화될 수 있다. 또다른 예시에서, 상기 표지는 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 분광계, 형광계, 형광 검출기, 비색계, 밀도계, 유세포분석기, 면역흡착 검정 또는 당업자에게 익숙한 검독기 또는 장래 창조될 여타 기법의 이용으로 가시화 또는 관찰될 수 있다. 그러나, 임의의 가시화 또는 관찰 방법은 선택되는 염색 또는 표지에 크게 좌우될 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예에 따르면, 면역검정이 백혈구 또는 백혈구 유래의 단백질 또는 DNA 추출물을 함유하는 시료의 분석 및 하나 이상의 후성유전적 마커의 양 결정에 이용될 수 있다. 본 발명의 면역검정의 특정 포맷이 본 발명에서 중대한 것은 아니다. 그러한 포맷의 예시에는 ELISA, 방사-면역검정, 도트 블롯 검정, 슬롯 블롯 검정, 면역침강 및 단백질 정량, 면역-PCR, 및 웨스턴 블롯이 포함된다.

본원에 기재된 바와 같이, DNA 메틸화는 DNMT 효소의 패밀리에 의해 촉매되는, 메틸기의 CpG 디뉴클레오티드 중의 싸이토신의 5-탄소에 대한 공유결합 첨가를 지칭하는 후성유전적 사건이다. DNA 메틸화 분석 방법은 크게 두가지 유형으로 나뉠 수 있다: 전반적 및 유전자-특이적 DNA 메틸화 분석. 다양한 구현예에 따르면, 전반적 DNA 메틸화 분석을 위한 게놈 내 메틸 싸이토신의 전반적인 수준을 측정하는 방법에는 크로마토그래피 방법 및 메틸 수용 능력 검정이 포함될 수 있다. 유전자-특이적 DNA 메틸화 분석을 위해, 수많은 기법들이 개발되어 왔다. 대부분의 초기 연구들은 DNA 소화를 위해 메틸화 감응성 제한 효소를 이용한 후서던 탐침 또는 PCR 증폭을 이용했다. 최근에는, DNA 메틸화 특이적 PCR (MSP), 비설파이트 게놈 서열분석 PCR 과 같은 비설파이트 반응 기재 방법이 매우 대중적으로 되었다. 추가적으로, 게놈 내 미지의 DNA 메틸화 핫-스팟 또는 메틸화된 CpG 아일랜드를 식별하기 위해, 몇가지 게놈-와이드 스크리닝 방법이 개발되었는데, 예컨대 Restriction Landmark Genomic Scanning for Methylation (RLGS-M), 및 CpG 아일랜드 마이크로어레이가 있다.

추가로, 백혈구를 포함하는 시료는, 이에 제한되지 않으나 형광 탐지, DNA 서열분석 겔, 자동화된 DNA 서열분석기 상의 모세관 전기영동, 마이크로채널 전기영동 및 여타 서열분석 방법, 질량 분광계, 타임 오브 플라이트 (time of flight) 질량 분광계, 쿼드러플 (quadrupole) 질량 분광계, 마그네틱 섹터 질량 분광계, 전기 섹터 질량 분광계, 적외선 분광계, 자외선 분광계, 팔렌티오스태틱 전류법 (palentiostatic amperometry) 을 포함하는 하나 이상의 후성유전적 마커의 양을 결정하기 위한 다양한 방법 또는 서던 블롯, 블롯 블롯, 도트 블롯 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는 DNA 혼성화 기법 (여기서, DNA 절편은 "프로브 (probe)" 및 "표적 (target)" 의 양쪽 모두로 유용함), ELISA, 형광측정법, 형광 공명 에너지 이동 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) (FRET), SNP-IT, GeneChips, HuSNP, BeadArray, TaqMan 검정, 인베이더 (Invader) 검정, MassExtend, 또는 MassCleave.TM. (hMC) 방법을 포함하는 후성유전적 마커의 양을 결정하는 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다.

말초혈로부터의 백혈구 세포 (WBC) 또는 백혈구 분리는, 예를 들어 이에 제한되지 않으나, 기준 밀도 구배 분리, 시판되어 이용가능한 진공 분리관 시스템, 세포 분리 시스템 또는 당업자에게 익숙한 여타 기법과 같은 매우 다양한 방법론을 이용하여 실시될 수 있다.

당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 혈액은 분획화될 수 있고, 상이한 분획의 혈액이 상이한 의학적 필요에 따라 이용될 수 있다. 중력 또는 원심력의 영향 하에, 혈액은 자발적으로 3 개의 층으로 침전된다. 평형에서, 상부의 저밀도층은 혈장으로 지칭되는 짚풀 색의 맑은 액체이다. 바닥에 있는 고밀도층은 산소 수송에 특화된 핵이 없는 적혈구 세포 (적혈구) 를 포함하는 진한 적색의 점성질 액체이다. 중간층은 가장 작은데, 위쪽의 얇은 백색 밴드는 적혈구 층이고 아래쪽은 혈장층이다; 이는 버피 코트 (연막) 로 지칭된다. 버피 코트 자체는 2 가지 주된 구성성분인, 핵이 있는 백혈구 (백혈구 세포) 및 혈소판 (피띠) 으로 지칭되는 핵이 없는 더 작은 본체를 갖는다.

또한, 당업자에게 인식될 수 있는 바와 같이, 전혈로부터 백혈구를 수득하는 한가지 방법은, 전혈을 EDTA-혈액을 실리콘처리된 유리병에 단순히 정치시킨 후, 백혈구-풍부 상청액을 피펫으로 떠 내는 것이다. WBC 구성성분 또는 백혈구를 단리하기 위한 혈액의 분리는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그러나, 다양한 구현예에서, 전혈 또는 백혈구를 포함하는 혈액의 일부분으로부터 WBC 구성성분 또는 백혈구를 분리하지 않고도, 전혈 또는 백혈구를 함유하는 혈액 일부분을 본원에 기재된 방법으로 분석할 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 인간에서 AD 의 상태를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 예시 방법은 하기 단계를 포함한다: 하나 이상의 혈액 구성성분을 포함하는 시료를 기판에 위치시키는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별할 수 있도록 시료를 표지하는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커의 양을 결정하는 단계; 상기 양을 기준값과 비교하는 단계; 및 AD 의 상태를 결정하는 단계. 상기 예시 방법은 혈액을 하나 이상의 혈액 구성성분 및 여타 혈액 구성성분으로 분리하여 하나 이상의 혈액 구성성분을 함유하는 시료를 기판에 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

예시 방법의 다양한 구현예에서, 하나 이상의 혈액 구성성분은 백혈구를 함유한다. 시료는 환자 유래의 것일 수 있다.

추가로, 상기 예시 방법은 환자에 대한 치료 계획을 준비하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 상기 방법은 환자를 치료 물질로 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 추가로 하기 단계를 포함할 수 있다: 하나 이상의 혈액 구성성분을 함유하는 제 2 시료를 기판에 위치시키는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별하기 위해 상기 제 2 시료를 표지하는 단계; 하나 이상의 후성유전적 마커의 제 2 의 양을 결정하는 단계; 상기 제 2 의 수준을 기준값과 비교하는 단계; 및 추가로 AD 의 상태를 결정하는 단계. 제 2 시료의 분석은 해당 시료와 실질적으로 동시에 있을 수 있거나, 또는 제 2 시료의 분석을 시료의 분석 후 더 나중에 할 수도 있다. 상기 방법은 환자에 투여하기 위한 치료 물질의 투여량 결정 단계를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 기준값은 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합된 표지의 양을 달리하기 위한 보정 곡선을 포함할 수 있다. 상기 예시 방법은 표지의 정량적 양의 관찰 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 후성유전적 마커에 대한 항체의 결합 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 상기 방법은 항체에 대해 콘쥬게이션하기 위한 표지를 포함하는 항체를 도입하는 단계를 포함할 수 있다.

다양한 구현예에 따라, 본원에 논의된 임의의 방법은, 예를 들어 첫번째 시점에서의 하나 이상의 후성유전적 마커과 관련된 제 1 모임 환자의 결과를 두번째 시점에서의 하나 이상의 후성유전적 마커과 관련된 제 2 모임 환자의 결과와 비교하는 장기간의 연구와 같이, 시간을 두고 연장될 수 있다. 그러한 비교는 AD 발생의 예측 또는 가능성을 제공할 수 있다. 그러한 비교는 AD 발생 확률을 제공할 수 있다. 나아가, 그러한 비교는 치료 물질의 효능 평가 뿐만 아니라 그러한 치료 물질의 투여량 조정에 유용할 수 있다. 그러한 비교는 치료 계획의 일부일 수 있다. 그러한 결과가 단일 지점 측정으로부터의 외삽에 의해 계산된다고 해도, 장기간의 데이터와는 별도로 일정 시기에 취해진 적어도 2 회 이상의 측정이 단일 지점 외삽을 확인시켜주거나 또는 알츠하이머 질환의 새로운 상태를 제공한다. 예를 들어, 측정은 1 주 내지 2 년 간격으로 취해질 수 있다. 그러나, 측정 빈도는 대략 매 3 개월, 또는 매 6 개월, 또는 매년, 또는 대략 2 년일 수 있다. 다양한 구현예에서, 비교는 차이 (TO-T1) 또는 변화율 (TO-T 1)/Time 을 제공할 수 있는데, 여기서 T0 는 시점 0 에서의 양 또는 값이고, T1 은 시점 1 에서의 양, 그리고 Time 은 측정 사이의 시간 간격이다.

하기 표 1 에 수록된 것은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 유용할 수 있는, 시판하여 이용가능한 항체이다. 그러한 시판하여 이용가능한 항체는 백혈구에서의 후성유전적 마커에 대한 결합에서 유용할 수 있다. 그러한 시판하여 이용가능한 항체는 백혈구에서의 후성유전적 마커에 대한 결합에 유용할 수 있다. 그러한 시판되어 이용가능한 항체는 개별적인 후성유전적 마커에 특이적이다. 그러나, 수록되지 않은 다수의 그러한 시판되어 입수가능한 항체 또는 여타 유사 항체들도 다양한 구현예에 따른 키트에 포함될 수 있다.

표 1: 시판 항체

다양한 구현예에서, 본 발명은 인간 환자에서의 AD 의 상태 결정 방법을 제공한다. 따라서, 예시 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 환자로부터 혈액 시료를 제공받는 단계; 혈액 시료로부터 백혈구를 분리하는 단계; 제 1 항체를 백혈구 내 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합시키는 단계; 제 1 항체에 대한 표지를 포함하는 제 2 항체를 콘쥬게이션시키는 단계; 표지의 양을 결정하는 단계; 및 표지의 양을 근거로 환자에서의 AD 의 상태를 결정하는 단계.

이러한 방법은 추가로 EDTA 를 혈액 시료에 첨가하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 백혈구 분리는 중력에 의한 것일 수 있다. 그러나, 콘쥬게이션되지 않은 혈액에서, 백혈구의 분리는 원심분리에 의한 것일 수 있다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 혈액 시료에 첨가될 때 EDTA 는 하나 이상의 보존제 및 항응고제 중 하나 이상일 수 있다.

그러한 예시 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 제 3 항체를 백혈구의 제 2 분량 중의 제 2 후성유전적 마커에 결합시키는 단계; 제 3 항체에 대한 제 2 표지를 포함하는 제 4 항체를 콘쥬게이션시키는 단계; 제 2 표지의 양을 결정하는 단계; 및 표지의 양 및 제 2 표지의 양을 기준으로 환자에서의 AD 의 상태를 결정하는 단계. 그러한 예시 구현예는 표지의 양을 기준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 기준은 후성유전적 마커에 대한 보정 곡선을 포함할 수 있다. 더욱이, 다양한 구현예에서, 하나 이상의 후성유전적 마커는 하나 이상의 DNA 메틸화 마커 및 히스톤 개질 마커이다.

다양한 구현예에서, 질량 분광계를 이용한 프로테옴 기법이, 생물학적 시료로부터 유도된 단백질 추출물 중에서, 후성유전적 마커과 같은 특별한 단백질 또는 펩티드의 동정 및 정량에 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 후성유전적 마커는 질량 분광계를 이용하여 시료 중 이론 질량을 실험에서 획득한 단백질 또는 펩티드의 질량과 비교하여 식별될 수 있다. 단백질의 질량을 결정하기 위해, 그의 아미노산 서열을, 단백질, 펩티드 및 아미노산의 질량을 결정하는 프로테옴 소프트웨어 프로그램에 입력시킬 수 있다. 이어서, 그러한 질량은 질량 분광계 분석으로 생성되는 데이터와 비교할 수 있다. 또다른 구현예에서, 미지의 단리된 단백질의 서열은 Edman 분해와 같은 통상적인 아미노산 서열분석 기법을 이용한 단백질의 서열분석으로 수득될 수 있다. 이어서, 프로테옴 소프트웨어 프로그램은 예컨대 효소 트립신을 이용하여 알고 있는 아미노산 서열의 단백질을 절단하여 펩티드 절편을 제공하는 단백질의 가상적인 효소 소화를 수행할 수 있다. 결과로서 수득되는 펩티드 절편은, 액체 크로마토그래피 질량 분광계 (LC-MS) 시스템 상에서 가동시, 그것이 유도되어 나온 미지의 단리된 단백질을 특이적으로 식별하는 특이적 펩티드 질량 핑거프린트 (PMF) 를 제공할 수 있다. 한 구현예에서, 미지의 분리된 단백질의 PMF 는 소화된 단백질을 질량 분광계에 입력해 그의 구성 펩티드의 질량을 결정한 후, 펩티드 질량을 단백질 데이터 베이스 입력값과 비교하여, 서열분석없이 결정될 수 있다.

PMF 가 후성유전적 마커에 대해 일단 수득되면, 실제 생물학적 시료 유래의 후성유전적 마커의 양이 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물 시료 유래의 단백질 분획을 특정 위치에서 단백질을 절단하는 단백질가수분해 효소로 소화시킬 수 있다. 결과로서 생성되는 소화된 절편들은 매트릭스-보조 레이저 탈착 및 이온화 (MALDI) 또는 전자스프레이 이온화 (ESI-MS) 와 같은 기법에 의해 질량 분광계로 도입될 수 있다. 그러한 이온화 기법들은, 덩어리들을 골라내고 타임 오브 플라이트 (TOF), 쿼드러플 또는 이온 트랩과 같은 질량 분석기에 의해 분석될 수 있는 하전된 종들을 제공하고, 펩티드의 질량을 결정할 수 있다. 프로테옴 데이터 분석 소프트웨어 프로그램과 조합되어 질량 분광계에 의해 수득되는 데이터는, 추가되는 내부 기준 또는 스펙트럼 카운팅과 같은 기법과 사용될 때 시료 내 후성유전적 마커 수준을 정량할 수 있다.

다양한 구현예에서, 항체들은 면역형광 현미경을 이용해 세포, 조직 및 생물학적 유체, 예컨대 혈액 내 특별한 분자들을 식별할 프로브로서 사용될 수 있다. 특이적인 항원, 예컨대 후성유전적 마커에 결합하는 1 차 항체는 염료, 예컨대 형광 분자를 1 차 항체에 공유결합으로 결합시켜 직접 표지될 수 있다. 더욱 일반적으로는, 1 차 항체의 항원에 대한 결합은, 그의 항원이 임의의 여타 항체인 형광 분자로 표지된 2 차 항체에 의해 검출될 수 있다. 표지된 2 차 항체는 형광 항면역글로불린으로 지칭될 수 있다. 형광 분자는 특별한 파장의 빛, 예컨대 청색 또는 녹색에 의해 여기되어 검출을 위한 상이한 파장의 빛을 발광할 수 있다. 형광 분자는 임의의 갯수의 통상적인 형광 분자, 예컨대 해파리 Aequorea Victoria 로부터의 녹색 형광 단백질을 포함할 수 있다. 형광에 대한 대안적인 구현예에서, 1 차 또는 2 차 항체를 효소, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제에 화학적으로 커플링시켜, 무색 기질이 유색 반응 생성물로 제자리에서 변환되는 면역세포화학을 이용할 수 있다. 후성유전적 마커를 식별하는 유색 생성물은 예컨대 분광계 방법에 의해 관찰 또는 정량될 수 있다.

다양한 구현예에서, 웨스턴 블롯으로도 지칭되는 면역블롯은 세포 용해물에서 후성유전적 마커의 존재 식별 및 정량을 위해 사용될 수 있다. 백혈구와 같은 세포의 시료는 세제에 용해되어 유리된 가용화 단백질을 제공할 수 있다. 이어서, 단백질을 겔 전기영동을 위한 겔에 적용시켜 크기에 따라 단백질을 분리할 수 있다. 겔 내의 단백질은 니트로셀룰로오스 멤브레인과 같은 기판에 적용될 수 있다. 기판은, 항체가 멤브레인 상의 그의 특이적 항체에 결합하도록 항체로 처리될 수 있다. 이어서, 후성유전적 마커를, 예를 들어 플레이트 검독기를 이용하여 검토 및 정량할 수 있다.

웨스턴 블롯과 유사하게, 다양한 구현예에 따라, 단백질 도트 블롯 방법은 세포 용해물로부터 단리된 단백질 분획을 멤브레인, 예컨대 니트로셀룰로오스에 특별한 위치에 또는 "스팟" 으로 적용시킨다. 그러나, 단백질은 먼저 겔 전기영동으로 분리하지는 않는다. 단백질 스팟은 항체를 항원, 예컨대 후성유전적 마커에 혼성화하기 위한 표지된 1 차 또는 2 차 항체로 처리될 수 있다. 후성유전적 마커를 식별하는 형광 분자 또는 유색 생성물의 발생시, 정량적 측정은 플레이트 검독기와 같은 분광계를 이용해 스팟으로 할 수 있다.

추가로 다양한 구현예에 따라, 효소-연계 면역흡착 검정 (ELISA) 이 항체를 이용하여 항원, 예컨대 후성유전적 마커의 검출에 사용될 수 있다. 항원을 검출하기 위해, 시험할 시료, 예컨대 백혈구 유래의 단백질 분획은 플라스틱 웰의 표면 상에 코팅될 수 있다. 표지된 항체, 예컨대 1 차 또는 2 차 항체는 비특이적 결합이 방지 ("블로킹" 으로 지칭함) 되어, 오직 항원에 대한 결합만이 세척 후 웰 내에 잔류하도록 하는 조건 하에 웰에 첨가했다. 결합된 항체는 다중웰 플레이트 검독기와 같은 분광계로 관찰 및 정량될 수 있는 효소-의존적 색상 변화 또는 형광 반응에 의해 검출될 수 있다.

또한, 다양한 구현예에 따라, 환자의 혈액에서 분리한 백혈구와 같은 생물학적 시료 내의 후성유전적 마커의 양을 고속 정량하는 방법은 유세포분석, 예컨대 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 를 포함한다. 유세포분석은 유체, 예컨대 세포 배양 배지 또는 완충액의 스트림 내에 표지된 항체로 처리된 세포를 현탁시키고, 해당 세포를 형광 측정 시스템에 통과시켜 시료 내에 존재하는 면역활성 세포의 갯수를 계수하기 위해 사용될 수 있다. 각 세포의 형광 특성을 결정하여 그래프, 예컨대 시료 내 모든 세포의 다양한 형광 강도를 나타내는 히스토그램을 제공할 수 있다. 한 구현예에서, 역치값은 시료 내 면역활성인 세포의 백분율을 기준으로 질환 상태의 존재여부를 결정하기 위해 적용될 수 있다.

나아가 다양한 구현예에 따라, 후성유전적 마커는 면역형광 현미경을 이용해 후성유전적 마커에 결합된 표지된 항원의 가시화에 의해 세포의 시료, 조직 또는 생물학적 시료에서 밝혀질 수 있다. 시료는 1 차 항체, 예컨대 슬라이드가 잠겨질 완충액에 희석된 항체에 적용되는 현미경 슬라이드에 적용될 수 있다. 과량의 1 차 항체를 세척해버리고, 표지된 2 차 항체를 슬라이드에 적용시킬 수 있다. 슬라이드는 형광 현미경 또는 공초점 형광 현미경과 같은 현미경 하에서, 슬라이드 상에서 특정 파장의 광을 발광하여 형광을 제공하도록 배치되어 관찰될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광 강도는 대조군 시료와 비교하여 형광 강도를 정량하기 위해 현미경 상의 검출기에 의해 측정될 수 있다.

다양한 구현예에 따라, 방법은 시료 내 후성유전적 마커의 양을 정량하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 정량적 도트 블롯 검정을 이용하는 것은 후성유전적 마커의 정량적 분석에 유용할 수 있다. 도 10 을 참조하면, 메틸렌 블루에 대한 정량적 도트 블롯 1010 개를 도시하는 다이어그램은 1 μg, 0.8 μg, 0.6 μg, 0.4 μg, 0.2 μg 및 O.1 μg 의 도트 블롯을 포함한다. 추가로, 메틸렌 블루 기준 1020 에 대한 보정 곡선이 또한 도 10 에 제시된다. 정량적 도트 블롯 1010 의 니트로셀룰로오스 멤브레인은 혈액 백혈구로부터 추출된 여러가지 농도의 DNA (1 μg, 0.8 μg, 0.6 μg, 0.4 μg, 0.2 μg, 및 O.1 μg) 로 스팟팅한 후, 메틸렌 블루와 멤브레인을 인큐베이션하여 전체 DNA 를 검출했다. 신호는 기준 밀도계로 검독했다. 메틸렌 블루의 정량은 메틸렌 블루 1020 에 대한 보정 곡선을 생성했다.

이제 도 11 을 참조하면, 5-메틸싸이토신에 대한 정량적 도트 블롯 1030 을 도시하는 다이어그램은 1 μg, 0.8 μg, 0.6 μg, 0.4 μg, 0.2 μg 및 O.1 μg 의 도트 블롯을 포함한다. 추가로, 5-메틸싸이토신 1040 에 대한 보정 곡선이 또한 도 11 에 도시된다. 정량적 도트 블롯 1010 의 니트로셀룰로오스 멤브레인에 혈액 백혈구로부터 추출된 여러가지 농도의 DNA (1 μg, 0.8 μg, 0.6 μg, 0.4 μg, 0.2 μg 및 O.1 μg) 로 스팟팅한 후, 5-메틸싸이토신과 멤브레인을 인큐베이션하여 전체 DNA 를 검출했다. 5-메틸싸이토신 신호는 또한 기준 밀도계로 검독했다. 메틸렌 블루 신호의 정량은 후속 5-메틸싸이토신 검독값을 블롯 상에 담지된 DNA 의 양에 대해 정규화할 수 있게 한다. 신호 검독값의 분석은 1OO ng 내지 400 ng 의 DNA 농도가 시료의 DNA 및 5-메틸싸이토신 IR 함량 두가지 모두의 검출에 대한 선형에 근접한 (R²>99) 응답성을 제공한다는 점을 보여줬다. 여타 후성유전적 마커에 대한 도트 블롯 검정 개발에도 동일한 접근법이 사용될 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 환자에서의 AD 의 상태를 결정하기에 유용한 시스템 및 기구를 제공한다. 따라서, 예시 시스템 및/또는 기구는 하기를 포함할 수 있다: 상단 표면 및 하단 표면을 포함하는 기판; 기판의 상단 표면 상의 하나 이상의 디테일; 백혈구를 포함하는 시료 중의 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합하도록 조작되는 하나 이상의 항체, 적어도 하나의 항체가 하나 이상의 디테일 중에 위치함; 및 알고 있는 양의 하나 이상의 후성유전적 마커를 포함하는 기준값. 이러한 예시 시스템 및/또는 기구는 추가로 하기를 포함할 수 있다: 기판의 상단 표면 상의 제 2 디테일; 백혈구를 포함하는 시료 중의 제 2 후성유전적 마커에 결합하도록 조작된 제 2 항체, 상기 제 2 항체는 제 2 디테일에 위치될 수 있음; 및 알고 있는 양의 제 2 후성유전적 마커를 포함하는 제 2 기준값의 시료. 한 구현예에서, 하나 이상의 디테일은 스팟이고, 하나 이상의 항체가 기판의 상단 표면에 결합되어 있다. 또다른 구현예에서, 하나 이상의 디테일은 웰이고, 하나 이상의 항체가 웰 내에 위치되어 있다. 다양한 구현예에서, 시료는 환자 유래의 말초혈을 포함한다. 다양한 예시 구현예에서, 기준값은 기판의 표면 상에 위치되는 표준 디테일에 위치될 수 있고, 하나 이상의 디테일에 근접할 수 있다. 그러한 예시 시스템 및/또는 기구는 추가로 하나 이상의 후성유전적 마커를 밝혀내도록 조작가능한 표지를 포함할 수 있다. 나아가, 그러한 예시 시스템 및/또는 기구는 표지의 양을 측정하도록 조작가능한 검독기를 추가로 포함할 수 있다. 시스템 및/또는 기구는 기판의 상단 표면의 일부 이상을 밀봉하는 커버를 포함할 수 있다.

다양한 구현예는 여러 시료 부분으로부터 여러가지 상이한 후성유전적 마커를 검출할 수 있는 매트릭스를 포함하는 시스템 및/또는 기구를 포함한다. 예시 구현예에서, 시스템 및/또는 기구는 추가로 각각의 여러가지 상이한 후성유전적 마커에 대한 기준값을 포함할 수 있다. 그러한 구현예의 한 국면에서, 기준값은 매트릭스의 작용 영역에 근접하게 위치될 수 있다. 또다른 구현예에서, 다수의 상이한 후성유전적 마커 검출의 각 위치에 근접한 보정 곡선을 포함한다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 개별 가정용으로 또는 병실 또는 진료실에 채택될 수 있다.

다양한 구현예에서, 키트는 하기를 포함할 수 있다: 5-메틸싸이토신에 대한 항체, DNA 메틸화에 관여하는 펩티드, 또는 히스톤 아세틸화에 관여하는 펩티드, 항체에 대한 결합을 직접적으로 검출하는 방법 (예를 들어, 형광단, 효소 또는 착색제에 콘쥬게이션된 1 차 항체) 또는 간접적으로 검출하는 방법 (예를 들어, 형광단, 효소 또는 착색제에 콘쥬게이션된 2 차 항체), 및 AD 의 다양한 진단에 대한 각 역치에 대응하는 하나 이상의 기준값.

다양한 구현예에서, 키트는 후성유전적 마커에 결합하는 항체에 콘쥬게이션할 수 있는 임의의 부분을 포함할 수 있는 염색 또는 표지를 포함할 수 있다. 나아가, 키트의 여타 예시 구현예에서, 염색 또는 표지는 후성유전적 마커에 결합하는 항체에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 더욱이, 키트는 염색 또는 표지에 대한 보정 곡선을 제공하기 위한 재료를 포함할 수 있으나, 키트는 기준값으로 사용될 수 있는 기존에 제작된 표준 보정을 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 다양한 완충액 및 여타 시약들을 포함할 수 있다. 더욱이, 키트는 본원에 기재된 기구 또는 시스템을 포함할 수 있다. 최종적으로, 키트는 개별 가정용 또는 병실용 또는 진료실용 중 하나에 특히 유용하게 고안될 수 있다.

하기 내용은 본 발명의 다양한 구현예의 비제한적 예시이다. 이러한 비제한적 예시에서 논의되는 제재들의 임의의 조합이 본 발명의 다양한 구현예에 따라 키트에 포함될 수 있다는 점에 유의해야 한다.

실시예 1: 전반적 백혈구 DNA 메틸화 상태의 관찰. 7 내지 10 ml 의 전혈을 17 명의 생존 AD 및 19 명의 생존 ND 환자로부터 EDTA 관에 수집했다. 백혈구 세포 (WBC) 를 EDTA 전혈 유래의 연막으로부터 분리해 내고, RBC 는 용해시키고 (냉온, 1× 용해 용액; NH₄Cl), 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS) 로 2 회 후속하여 세척했다. 최종 세포 펠렛을 1 ml 의 차가운 PBS 에 재현탁시키고, 100 μl 를 SuperFrost Plus 슬라이드 상에 떨어뜨리고, 공기로 완전히 건조시킨 후, 면역세포화학 염색했다. 일부 슬라이드를 염색 1 주 전에 대기시켰는데, 이러한 과정은 건조시킨 슬라이드를 1 년까지 저장할 수 있게 한다.

5-메틸 싸이토신 염색을 위한 슬라이드는 각각 5 분씩 차가운 PBS 를 이용해 3 회 헹구었다. 이어서, 슬라이드를 2% 파라포름알데히드 (PBS 중) 용액으로 10 분간 고정시킨 후, PBS 로 1 회 헹구고, 그리고 PBS-0.1% TritonX-100 (PBST) 에서 각각 10 분씩 2 회 헹구어냈다. 슬라이드를 PBST 중 1% 과산화수소에서 30 분간 블로킹하고, 이전과 같이 PBST 로 3 회 헹구어낸 후, 3% BSA 블로킹 용액 (PBST 중 BSA) 에서 1 시간 동안 실온 (RT) 에 두었다. 이어서, 이전과 같이 1 회 헹구어냈다 (PBST, 10 분). 이어서, 슬라이드를 플라스틱 박스에 넣고, 0.25% BSA-PBST 중 1:500 으로 5-메틸 싸이토신 항체를 채워, 1 시간 동안 RT 에 두었다. 이어서, 박스를 4℃ 에서 수분 공급원과 함께 밤새 두었다. 이튿날 아침 슬라이드박스를 치우고 RT 로 승온시켰다. 슬라이드를 이전과 같이 PBST 로 3 회 헹구었다. 이들을 플라스틱 박스에 넣고, 0.25% BSA-PBST 중 1:1000 으로 바이오틴화된 말 항-토끼 IgG 를 채워, 2 시간 동안 RT 에 두었다. 슬라이드를 이전과 같이 PBST 로 행구어내고, 제조한 Avidin-Biotin 용액 (PBST 중) 으로 채웠다. 45 분간 RT 인큐베이션 후, 슬라이드를 PBST 로 1 회 헹군 후, 50 mM Tris (ph 7.6) 완충액으로 각 10 분간 2 회 헹구었다. 이들을 DAB 용액 (50 mM Tris 완충액 중) 을 포함하는 copland 용기에 10 분간, RT 에서 두었다. 이어서, 슬라이드를 이전과 같이 Tris 완충액으로 2 회 헹구고, 이어서 등급화된 알콜 (70%, 90%, 100%, 및 NeoClear 2 회) 로 각 5 분 동안 RT 에서 두었다. NeoClear 로부터의 제거 및 임의의 과량의 용액을 제거한 후, 2 내지 3 방울의 Permount 를 넣고, 커버슬립을 덮었다. 슬라이드를 2 시간 이상 건조시킨 후, 명시야 현미경관찰로 봤다.

명시야 현미경관찰 하에, 각 시료를 "실질적 염색" 또는 "성긴 염색" 으로 정량적으로 평가하는 한편, 임상 진단에 대해서는 맹검으로 했는데, 치매가 아닌 환자에서의 실질적 염색의 정량적 기준에 대비해 평가했다. 성긴 염색이 있는 시료의 것을 알츠하이머가 있는 것으로 간주했고, 실질적 염색이 있는 것은 치매가 아닌 것으로 간주했다. 모든 환자에 대한 임상적 진단의 제공 및 재검토시, 기준 범위에 대한 평가는, 17 례의 AD 케이스 중 16 례 (94% 감응도) 및 치매가 아닌 경우에 대해서는 19 례 중 19 례 (100% 특이성) 의 임상 진단과 일치했다.

실시예 2: 전반적 백혈구 DNA 메틸화 메커니즘의 관찰. 7 내지 10 ml 의 전혈을 17 명의 생존한 AD 환자 및 19 명의 생존한 ND 환자로부터 EDTA 관에 채취했다. 백혈구 세포 (WBC) 를 EDTA 전혈 유래의 연막으로부터 분리해 내고, RBC 는 용해시키고 (냉온, 1× 용해 용액; NH₄Cl), 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS) 로 2 회 후속하여 세척했다. 최종 세포 펠렛을 1 ml 의 차가운 PBS 에 재현탁시키고, 100 μl 를 SuperFrost Plus 슬라이드 상에 떨어뜨리고, 철저하게 공기로 건조시킨 후, 면역세포화학 염색했다. 일부 슬라이드를 염색 1 주 전에 대기시키는데, 이러한 과정은 건조된 슬라이드를 1 년까지 저장할 수 있게 한다.

DNMT-1 염색을 위한 슬라이드를 각 5 분씩 차가운 PBS 로 3 회 헹구어냈다. 이어서, 슬라이드를 2% 파라포름알데히드 (PBS 중) 용액으로 10 분간 고정시킨 후, PBS 에서 1 회, 그리고 PBS-0.1% TritonX-100 (PBST) 에서 각각 10 분씩 2 회 헹구어냈다. 슬라이드를 PBST 중 1% 과산화수소에서 30 분간 블로킹한 후, 이전과 같이 3 회 PBST 로 헹군 후, 3% BSA 블로킹 용액 (PBST 중 BSA) 에 1 시간 동안 실온 (RT) 에 두었다. 이어 이전과 같이 한 번 헹구었다 (PBST, 10 분). 이어서, 슬라이드를 플라스틱 박스에 놓고, 0.25% BSA-PBST 중 1:500 로 DNMT-1 항체를 채우고, 1 시간 동안 RT 에 두었다. 이어서, 박스를 수분 공급원과 함께 4℃ 에 밤새 두었다. 이튿날 아침에 슬라이드박스를 치우고, RT 로 승온시켰다. 슬라이드를 이전과 같이 PBST 에서 3 회 헹구었다. 이들을 플라스틱 박스에 넣고, 0.25% BSA-PBST 중 1:1000 로 바이오틴화된 말 항-토끼 IgG 를 채워, 2 시간 동안 RT 에 두었다. 슬라이드를 이전과 같이 PBST 로 헹구고, 제조된 Avidin-Biotin 용액 (PBST 중) 을 제공했다. 45 분 동안 RT 인큐베이션 후, 슬라이드를 PBST 로 1 회 헹군 후, 50 mM Tris (ph 7.6) 완충액으로 각각 10 분씩 2 회 헹구었다. 이들을 DAB 용액 (50 mM Tris 완충액 중) 을 포함하는 Copland 용기에 10 분간 RT 에 두었다. 이어서, 슬라이드를 이전과 같이 Tris 완충액으로 2 회 헹구고, 이어서 등급화한 알콜 (70%, 90%, 100%, 및 NeoClear 2 회) 에 각각 5 분간 RT 에서 취했다. NeoClear 로부터의 제거 및 임의의 과량의 용액을 닦아낼 때, 2 내지 3 방울의 Permount 를 적용하고, 커버슬립을 덮었다. 슬라이드를 2 시간 이상 건조시킨 후, 명시야 현미경관찰로 봤다.

실시예 3: 본 발명의 예시 구현예에 따라, 전반적 DNA 메틸화에 대한 도트 블롯 방법을 기재한다. Hybond-ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인을 6x SSC 완충액으로 미리 적셔놓고, DNA 시료를 0.4 M NaOH 를 첨가한 후 100℃ 에서 10 분간 가열하여 변성시켰다. DNA 용액의 중화는 2 M 암모늄 아세테이트, pH 7.0 의 첨가에 의한 것이다. 500 μl dH₂O 를 이용해 멤브레인을 다시 수화시키고 도트 블롯 매니폴드 (dot blot manifold) (Gibco) 에 위치시킨 후, 200 내지 500 μl 의 변성된 DNA 시료를 첨가하고, 가벼운 진공 또는 중력 여과에 의해 멤브레인을 통과시켰다. 이어서, 각 웰에 500 μl 의 2× SSC 완충액을 첨가하고, 진공을 걸었다. 시료 웰이 비었을 때, 멤브레인을 치우고, 1 시간 동안 RT 에서 공기-건조시키고, 2 장의 여과지 사이에 놓고, 진공 하에 80℃ 에서 2 시간 동안 베이킹했다. CpG 메틸화를 탐침하기 위해, 멤브레인을 2 시간 동안 도트 블롯 완충액 (20 mM Tris, 0.05% Tween-20) 중 5% 우유에서 블로킹한 후, 도트 블롯 완충액에서 1 회 세척했다. 1:1000 로 희석한 5-메틸싸이토신 마우스 모노클로날 1 차 항체 (Aviva Systems Biology) 와의 인큐베이션을 2 시간 동안 도트 블롯 완충액 및 5% 우유에서 RT 에서 두었다. 5 회 세척 (각 5 분) 후, 멤브레인을 1:5000 HRP-콘쥬게이션된 마우스 모노클로날 2 차 항체 (Jacksons Immuno) 와 1 시간 동안 RT 에서 도트 블롯 완충액 및 5% 우유에서 인큐베이션한 후, 5 회 세척했다 (각 5 분). 이어서, 멤브레인을 1 분 동안 RT 에서 Super Signal West Pico Chemiluminescence Substrate (Thermo Scientific) 와 인큐베이션하고, Alpha Innotech AlphaEase 기기 상에서 영상을 수득하고, Alpha Innotech FC 소프트웨어를 이용해 분석했다. 모든 검독값은, 멤브레인 (5-메틸싸이토신 데이터 수집 후) 을 dH₂O 로 세척해 Chemiluminescence 기질을 제거하고, 0.025% 메틸렌 블루와 1 분간 인큐베이션하고, dH₂O 로 1 회 세척하고, FC 소프트웨어를 이용해 AlphaEase 로 정량하여 제조한 메틸렌 블루 표준에 대해 정규화했다. DNA 기질을 이용해 전체적인 DNA 메틸화를 측정하는 이러한 신규한 방법에 추가하여, 펩티드 측정을 위한 기준 도트 블롯이 여타 후성유전적 마커, 예컨대 HDAC1 및 DNMT1 의 정량에 사용될 수 있다. 후자에 대해서는, 유사한 방법이 채용되나, 단 단백질 추출물이 DNA 대신 담지되며, 펩티드에 적절한 항체가 검출에 이용된다는 점을 예외로 한다.

상기 명세서에서, AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템이 특이적 구현예를 참조로 하여 기재되었다. 다양한 개질 및 변경이 있을 수 있으나, 이는 특허청구범위에 제시된 AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링 방법 및 시스템의 범위를 벗어나지 않는다. 명세서 및 도면은 제한이라기보다는 설명이며, 개질은 AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템의 범위내에 포함되는 것을 의도로 한다. 따라서, AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템은 단지 기재된 예시보다는 특허청구범위 및 그의 법적인 등가물에 의해 결정된다.

특별한 구현예와 관련하여 이익, 여타 장점 및 문제 해결법이 기재되었다; 그러나, 임의의 이익, 장점, 문제 해결법 또는, 임의의 특별한 이익, 장점 또는 해결법을 불러올 수 있거나 또는 더욱 두드러지게 될 수 있는 임의의 요소가 임의의 발행 중인 특허에서 중대하거나, 필수적이거나 또는 핵심적인 특질 또는 구성요소로 간주되지 않는다.

용어 "함유하다", "함유함", "가진", "포함함", "포함하다" 등은 비-배제적 포함을 지칭하여, 일련의 요소들을 포함하는 프로세스, 방법, 시스템, 물품, 조성물 또는 기구가 언급한 요소들을 포함할 뿐만 아니라, 해당 프로세스, 방법, 시스템, 물품, 조성물 또는 기구에 내재하거나 또는 표면적으로는 수록하지 않은 여타 요소들을 포함할 수 있다. AD 의 발견, 진단 및 진행 모니터링을 위한 방법 및 시스템의 실시에 사용되는 구조물, 배치물, 적용물, 비율, 요소, 재료 또는 구성성분들의 여타 조합 및/또는 변경은, 구체적으로 언급되지 않은 것들에 추가하여, 본원의 일반적인 원칙에 벗어나지 않으면서 특정한 환경, 제조 세부사항, 고안 파라미터 또는 여타 조작 필요조건에 특별하게 맞추거나 또는 변경될 수 있다.

이에 제한되지 않으나, 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 논문 및 인터넷 웹 페이지를 포함하는, 본 출원에 인용된 모든 문헌 및 유사물들은, 그러한 문헌 및 유사물의 포맷과 상관없이, 그 전체가 임의의 목적을 위한 참고문헌으로 분명히 포함된다. 이에 제한되지 않으나, 포함된 문헌 및 유사 문건들 중 하나 이상이, 정의된 용어, 정해진 용도, 기재된 기법 등을 포함하여 본 출원과 상이하거나 또는 상충한다면, 본 출원이 지배한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 방법:
하나 이상의 혈액 구성성분을 포함하는 시료를 기판에 위치시키는 단계;
시료를 표지하여 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별하는 단계;
상기 하나 이상의 후성유전적 마커의 양을 결정하는 단계;
상기 양을 기준값과 비교하는 단계; 및
알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 단계.
제 1 항에 있어서, 추가로 혈액을 하나 이상의 혈액 구성성분 및 여타 혈액 구성성분으로 분리하여, 하나 이상의 혈액 구성성분을 포함하는 시료를 기판 상에 제공하는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 하나 이상의 후성유전적 마커의 양을 결정하는 단계가 표지의 강도를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항체를 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 시료를 제공한 환자를 위한 치료 계획을 준비하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 환자를 치료 물질로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
하나 이상의 혈액 구성성분을 포함하는 제 2 시료를 기판에 위치시키는 단계;
상기 제 2 시료를 표지하여 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별하는 단계;
하나 이상의 후성유전적 마커의 제 2 의 양을 결정하는 단계;
상기 제 2 의 양을 기준값과 비교하는 단계; 및
치료 물질의 투여량을 결정하는 단계.
제 6 항에 있어서, 치료 물질의 효능 평가 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서, 치료 물질의 효능 평가 단계가 경시적으로 다수의 후성유전적 마커를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 환자가 특정 시간 내에 알츠하이머 질환의 임상적 신호를 발생시킬 가능성을 추정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 가능성 추정 단계가 경시적으로 환자의 다수의 후성유전적 마커의 양을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 환자의 알츠하이머 질환 진행의 대략적인 속도를 예측하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 추가로 하기 단계를 포함하는 방법:
하나 이상의 혈액 구성성분을 포함하는 제 2 시료를 기판에 위치시키는 단계;
제 2 시료를 표지하여 하나 이상의 후성유전적 마커를 식별하는 단계;
하나 이상의 후성유전적 마커의 제 2 의 양을 결정하는 단계;
상기 제 2 의 양을 기준값과 비교하는 단계; 및
추가로 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 환자에서의 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 방법:
환자로부터 혈액 시료를 입수하는 단계;
혈액 시료로부터 백혈구를 분리하는 단계;
항체를 백혈구 내 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합시키는 단계;
표지를 항체에 결합시키는 단계;
표지의 양을 결정하는 단계; 및
표지의 양을 기준으로 환자에서의 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 단계.
제 14 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
제 2 항체를 백혈구의 제 2 분량의 제 2 후성유전적 마커에 결합시키는 단계;
제 2 표지를 제 2 항체에 결합시키는 단계;
제 2 표지의 양을 결정하는 단계; 및
표지의 양 및 제 2 표지의 양을 기준으로 환자에서의 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 단계.
제 16 항에 있어서, 표지의 양을 기준으로 하고, 제 2 표지의 양을 기준으로 하여 알츠하이머 질환의 상태를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서, 표지의 양을 기준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 17 항에 있어서, 기준이 후성유전적 마커과 비교한 표지의 양에 대한 보정 곡선인 방법.
제 14 항에 있어서, 하나 이상의 후성유전적 마커가 하나 이상의 DNA 메틸화 마커 및 히스톤 개질 마커인 방법.
제 14 항에 있어서, 표지를 항체에 결합시키는 단계가 표지를 포함하는 항체를 상기 항체에 콘쥬게이션시키는 단계를 포함하는 방법.
하기를 포함하는 기구인, 알츠하이머 질환 상태 결정을 위한 시스템:
상단 표면 및 하단 표면을 포함하는 기판;
기판의 상단 표면 상의 하나 이상의 디테일 (detail);
백혈구를 포함하는 시료에서 하나 이상의 후성유전적 마커에 결합하도록 조작되는 하나 이상의 항체, 상기 하나 이상의 항체는 하나 이상의 디테일에 위치함; 및
하나 이상의 후성유전적 마커의 알고 있는 양을 포함하는 기준값.
제 21 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 시스템:
기판 상단 표면의 제 2 디테일;
백혈구를 포함하는 시료에서 제 2 후성유전적 마커에 결합하도록 작동되는 제 2 항체, 상기 2 항체는 제 2 디테일에 위치함; 및
알고 있는 양의 제 2 후성유전적 마커를 포함하는 제 2 기준 시료.
제 21 항에 있어서, 기준값이 기판의 상단 표면 상의 기준 디테일에 위치하고, 하나 이상의 디테일에 근접하여 위치하는 시스템.
제 21 항에 있어서, 하나 이상의 항체를 식별하도록 조작가능한 표지를 추가로 포함하는 시스템.