KR20120051002A - 자가면역 탈수초성 질환의 진단 및 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CLM-I 효능제에 의한 자가면역 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증 (MS)의 진단 및 치료에 관한 것이다.

Description

자가면역 탈수초성 질환의 진단 및 치료 {DIAGNOSIS AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DEMYELINATING DISEASES}

본 발명은 자가면역 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증 (MS)의 진단 및 치료에 관한 것이다.

골수 세포는 자가면역 탈수초성 질환에서 중요한 이펙터 세포이다 (문헌 [Barnett et al., Multiple Sclerosis 12, 121-132, 2006]; [Benveniste, Journal of Molecular Medicine 75, 165-173, 1997]). CNS-침윤성 골수 집단은 상주 소교세포, 대식세포, 염증성 수지상 세포, 형질세포양 수지상 세포 및 전통적인 수지상 세포로 이루어진다. MHCII 및 CD86 발현 골수계 수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 T-세포를 재활성화시키는 능력 (문헌 [Deshpande et al., J Immunol 178, 6695-6699, 2007]) 및 질환을 재발시키는 에피토프 확산에의 관여 (문헌 [Miller et al., J Immunol 178, 6695-6699, 2007])로 인해 특히 주목을 받아왔다. 항원 제시 세포로서 작용하는 것 다음으로, 염증성 DC는 염증유발 시토카인 및 반응성 산소 중간체를 분비하여 점진적인 탈수초화 및 축삭 손실을 야기함으로써 국소 세포외 환경을 직접 조절한다. TipDC라고도 명명되는 이들 TNF- 및 iNOS 생산 수지상 세포의 전구 세포 (문헌 [Serbina et al., Immunity 19, 59-70, 2003])는 순환계 중에 존재하고 CNS 염증 구역에 모여드는 염증성 단핵구이다. MS에 대해 승인받은 약물인 글라티라머 아세테이트에 의한 염증성 단핵구의 유형 II 항-염증성 단핵구로의 전환은 EAE 중증도를 회귀시켰고 (문헌 [Weber et al., Nature Medicine 13, 935-943, 2007]), 질환 중증도를 조절하는데 있어서 이들 골수 세포의 중요한 역할이 더욱 강조되었다.

CNS 침윤성 골수 세포의 다른 음성 조절자가 이전에 확인된 바 있다. 예를 들어, 상주 소교세포 및 침윤성 골수 세포 둘 모두에서 발현되는 TREM-2는 미엘린 파편의 식세포작용에 의해 CNS 염증을 해소시키는데 중요한 역할을 한다 (문헌 [Piccio et al., European Journal of Immunology 37, 1290-1301, 2007]; [Takahashi et al., PLoS Medicine 4, e124, 2007]; [Takahashi et al., The Journal of Experimental Medicine 201, 647-6572005, 2005]). 유사하게, 골수 세포 상의 IFNAR은 CNS에서의 염증 반응을 하향 조절한다 (문헌 [Prinz et al., Immunity 28, 675-686, 2008]). 그러나, 어떤 수용체도 CNS로 귀소되는 염증성 골수 유래 단핵구에 특이적이지 않다.

CLM-1 (MAIR-V, LMIR-3, DigR2)은 골수 기능의 음성 조절에 중요한 골수계 특이적 세포 표면 수용체에 대한 연구에서 확인되었다. CLM-1은 인간 염색체 17번 상의 다유전자 집단 (마우스 오르토로그는 염색체 11번 상에 위치함)인 CMRF 패밀리의 일족이다. 모든 패밀리 구성원은 세포외 IgV 도메인을 함유한다. 이러한 집단 내의 2종의 패밀리 구성원 (CLM-1 및 CLM-8)은 세포내 도메인 내에 ITIM 서열을 함유하며, 나머지는 막횡단 영역 내에 신호전달 어댑터를 모으는 작용을 할 수 있는 하전된 잔기를 갖는다. 인간 CD300f의 뮤린 오르토로그인 CLM-1 (문헌 [Clark et al., Trends in Immunology 30, 209-217, 2009])은 파골세포형성의 음성 조절자로서 먼저 기술되었다 (문헌 [Chung et al., J. Immunol 171, 6541-6548, 2003]). 후속 연구는 CLM-1이 Fc-수용체 매개 세포 반응에서 억제 역할을 함을 보여주었다 (문헌 [Alvarez-Errico et al., The Journal of Experimental Medicine 206, 595-606, 2004]; [Fujimoto et al., International Immunology 18, 1499-1508, 2006]). 자가면역 질환에서의 생물학적 역할은 지금까지 기술되지 않았다.

발명의 개요

본 발명은, 적어도 부분적으로는, 염증성 시토카인 및 반응성 산소 종의 방출을 억제하는 것에 의한 CNS에서의 염증성 DC 활성의 음성 조절자로서 CLM-1을 확인한 것에 기초한다. 따라서, CLM-1은 본원에서는 CNS 염증 및 탈수초화의 골수계 특이적 음성 조절자로서 확인되었다.

한 측면에서, 본 발명은 포유동물 대상체에게 유효량의 CLM-1 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 탈수초성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 부형제와 혼합된 유효량의 CLM-1 효능제를 포함하는, 탈수초성 질환을 치료하기 위한 제약 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 탈수초성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 유효량의 CLM-1 효능제의 용도에 관한 것이다.

추가 측면에서, 본 발명은 탈수초성 질환을 치료하기 위한 CLM-1 효능제에 관한 것이다.

추가 측면에서, 본 발명은 CLM-1 기능 결함을 검출하는 것을 포함하는 탈수초성 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

추가적 측면에서, 본 발명은 CLM-1 효능제 및 탈수초성 질환 치료에 대한 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

모든 측면에서, 본 발명은 특히 하기 실시양태를 포함한다:

한 실시양태에서, 포유동물 대상체는 인간이다.

또 다른 실시양태에서, 탈수초성 질환은 탈수초성 자가면역 질환이다.

또 다른 실시양태에서, 탈수초성 자가면역 질환은 중추신경계 (CNS)에 영향을 미친다.

추가 실시양태에서, 탈수초성 자가면역 질환은 다발성 경화증 (MS), 재발 완화형 MS (RRMS), 원발성 및 속발성 진행형 MS, 진행 재발형 MS, 뇌척수염, 백질뇌염, 횡단성 척수염, 시신경척수염 (데빅병), 및 시신경염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가 실시양태에서, 탈수초성 자가면역 질환은 MS이다.

상이한 실시양태에서, 탈수초성 자가면역 질환은 비제한적으로 급성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (AIDP; 길랑-바레 증후군); 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증; 항-MAG 말초 신경병증; 및 운동 및 감각 신경병증 (HMSN) (유전성 감각운동 신경병증 (HSMN), 또는 비골 근육 위축, 및 샤르코-마리-투스병이라고도 공지됨)을 포함하는, 말초 신경계에 영향을 미치는 것이다.

또 다른 실시양태에서, CLM-1 효능제는 효능제 항-CLM-1 항체이다.

도 1. CLM-1은 CNS 염증 병변 내의 염증성 수지상 세포에서 발현된다.
(a) 질환의 최고점에서 척수에서의 CLM-mRNA 전사체가 증가됨. (b) CNS 상주 CD11b+ 세포 상 CLM-1 발현의 부재. (c) CD11bCD11c+ 골수 세포 상 CLM-1 발현. (d) 질환 최고점에서 CNS 염증 병변에서 CLM-1 CD11c를 공동 발현하는 DC (흉부, 배측각). (e) CLM-1 발현 DC가 iNOS 및 TNFα를 발현함. 값은 평균 ± S.D로 나타냄. (d)에서의 축척 막대는 50 μm임.
도 2. CLM-1은 염증성 단핵구 및 수지상 세포에서 발현된다.
(a) CLM-1은 Cx3cr1^lo CD11c⁺ Ly6^hi 양성 염증성 단핵구에서는 발현되지만, Cx3cr1^hi 전통적인 DC 전구체 상에서는 그렇지 않음. (b) CLM-1은 방사선-감응성 골수 유래 세포에서는 발현되지만, 방사선 조사-내성 CNS 상주 소교세포에서는 발현되지 않음. (c) Cx3cr1^lo 염증성 DC의 CLM-1 발현, 그러나 Cx3cr1^hi 소교세포에서는 그러하지 않음. (d) 면역화 14일 후 척수 부분 (흉부)에서의 Cx3cr1 및 CLM-1 발현. 공동 염색은 뇌막 가장자리에서 관찰되었지만 (화살촉), Cx3cr1hi 대신경교세포 (화살표)는 CLM-1을 보유하지 않음. 축척 막대: b (100 μm), d (50 μm)
도 3. CLM-1 또는 CLM-1 융합 단백질에 의한 처리의 부족은 EAE를 증강시킨다.
(a) CLM-1 녹아웃 (ko) 마우스로부터 수득한 골수 유래 DC에서의 CLM-1 단백질 발현의 부재 (좌측 패널). 질환의 최고점에서 척수로부터 수득한 DC 상에서의 MHC II 및 CD86의 유사한 수준 (우측 패널). (b) ko 마우스에 비해 CLM-1 wt에서의 CLM-1 염색의 결여, 형태 보존 및 유사한 염증 세포 수. (c) CLM-1 ko 마우스 또는 (d) CLM-1-Fc 융합 단백질로 처리한 CLM-1 wt 마우스에서의 증가된 질환 중증도. (b)에서의 축척 막대는 50 ㎛임.
도 4. CLM-1 부재는 T-세포 프라이밍에 영향을 미치지 않는다.
(a) 재자극된 항원 특이적 말초 림프절 T-세포의 증식 및 시토카인 반응은 CLM-1 wt 및 ko 마우스에서 유사함. (b) CLM-1 ko 또는 wt 공여자 마우스로부터의 T-세포는 wt 수용자에서 유사한 질환을 유도함 (좌측 패널). CLM-1 wt 공여자로부터의 T 세포는 CLM-1 wt 수용자에 비해 CLM-1 ko 수용자에서 증가된 질환 중증도를 유도함 (우측 패널).
도 5. CLM-1은 골수 세포 특이적 염증성 매개자의 방출은 조절하지만 T-세포 특이적 염증성 매개자의 방출은 그렇지 않다.
(a) 면역화된 CLM-1 wt 및 ko 마우스로부터 수득한 MOG 반응성 척수 T-세포의 재활성화시, Th1, Th17 및 조절 T-세포의 수에서는 변화가 없음. (b) CNS 염증 병변으로부터 수득한 CLM-1 wt 및 ko 골수 세포에서의 증가된 DC 활성화. * p < 0.01.
도 6. CLM-1은 자가면역 탈수초화를 조절한다.
(a) CNS 병변에서의 CLM-1 양성 세포 및 MOG 양성 미엘린의 디컨볼루션 영상. (b) 및 (c): wt 마우스에 비해 CLM-1 ko에서의 증가된 탈수초화 (b에서는 백색 선으로 표시한 영역으로 나타내었고 c에서는 양으로 표시함).
도 7. 마우스 (서열 1) 및 인간 (서열 2) CLM-1 폴리펩티드의 아미노산 서열.
도 8. 마우스 Clm-1 유전자의 표적화된 파괴 전략.
Clm-1 엑손-1이 네오마이신 내성 유전자로 대체된 ES 세포를 상동성 재조합에 의해 생성시켰다. Clm-1 유전자의 표적화된 영역 구조를 나타낸다. E1 및 E2는 Clm-1 유전자의 엑손 1 및 엑손 2를 나타낸다. 서던 블롯팅에 의해 ES 클론을 스크리닝하는데 사용된 프로브의 위치 (5' 및 3')를 나타낸다.
도 9-10. CLM-1은 T-세포 증식에 영향을 미치지 않는다.
(도 9) OVA 트랜스제닉 T-세포로부터 수득한 T 세포를 CLM-1 wt 또는 ko 마우스로부터 수득한 골수 유래 수지상 세포와 함께 증가되는 농도의 OVA 펩티드의 존재하에서 인큐베이션함. (도 10) 혼합 림프구 반응. Balb/c 배경의 CLM-1 wt 또는 ko 마우스로부터 수득한 골수 수지상 세포를 C57B1/6 배경의 마우스로부터 수득한 T 세포와 함께 다양한 비율로 인큐베이션함. 증식은 H3 티미딘 혼입의 양에 의해 반영됨.
도 11. (a) Clm-1은 말초 림프절에서의 조절 T-림프구 생성에 영향을 미치지 않음. (b) Clm-1은 CNS에서 T-림프구의 극성화에 영향을 미치지 않음.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

I. 정의

용어 "CLM-1" 및 "Cmrf-유사 분자-1" (또한 MAIR-V, LMIR-3, DigR2 및 IgSF13이라고도 공지됨)은 구체적으로 서열 1의 마우스 CLM-1 폴리펩티드 (NCBI CAM21607) 및 서열 2의 그의 인간 오르토로그 (NCBI AAH28188, 또한 CD300f, IREM1, IgSF13, 35-L5, 및 CMRF-35A5로도 공지되어 있음), 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 비제한적으로 포함하는 천연 서열 포유동물 CLM-1 수용체를 지칭하기 위해 본원에서 교환 가능하게 이용된다. 추가의 상세사항 및 명명법에 대해서는 문헌 [Clark et al., 2009, 상기 문헌]을 참조한다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연 유래의 폴리펩티드 (예를 들어, ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이같은 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산할 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 아미노산 서열이 천연 서열 폴리펩티드와 약간 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 천연 ErbB 리간드의 적어도 하나의 수용체 결합 도메인과 또는 천연 ErbB 수용체의 적어도 하나의 리간드 결합 도메인과 적어도 약 70％의 상동성을 보유할 것이며, 바람직하게는 상기 변이체는 상기 수용체 또는 리간드 결합 도메인과 적어도 약 80％, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％ 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열내의 특정 위치에서 치환, 결실, 및/또는 삽입을 보유한다.

"상동성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우에는 퍼센트 상동성이 최대가 되도록 하기 위해 갭을 도입한 이후에, 아미노산 서열 변이체에서의 동일한 잔기의 백분율로서 정의된다. 이러한 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기와 같은 한 컴퓨터 프로그램은 저작자가 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)인 "Align 2"로, 이는 1991년 12월 10일자로 미국 저작권청(United States Copyright Office) (워싱턴 DC 20559 소재)에 사용자 문서로 파일링되었다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편이 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 이러한 집단을 포함하는 개개의 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며 고도로 특이적이다. 추가로, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않는 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유익하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득되었음을 표시하고, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)으로 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄 (들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서의 관심 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "프리마티제드" 항체가 포함된다.

"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.

"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (C_L) 및 중쇄 불변 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이것의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는 것이 바람직하다.

항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다.

무손상 항체는 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 여러 "클래스"로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 "서브클래스" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 공지되어 있다.

"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.

"인간 이펙터 세포"는 1종 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 PBMC 또는 혈액으로부터 단리될 수 있다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (문헌 [M. in Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 개관 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 항체)에 보체계의 제1 성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 다르다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)을 갖고, 그의 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성한다고 여겨진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하고 각각의 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성과 관련하여 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역이라 불리우는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.

용어 "초가변 영역"이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원 결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 형태에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면상의 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 유리 티올기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종으로부터 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv를 검토하기 위해서는 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. 항-ErbB2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458에 기재되어 있다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (V_L)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (V_H)을 포함한다 (V_H - V_L). 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

"단리된" 항체는 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 수거된 항체이다. 항체의 천연 환경의 오염물 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

관심 항원에 "결합하는" 항체는 이것이 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화도로 항원에 결합할 수 있는 것이다.

용어 "탈수초성 질환"은 본원에서 신경의 미엘린 수초가 손상된 신경계의 임의의 질환을 지칭하는데 사용된다. 이러한 정의에는 희소돌기아교세포의 온전성과 그의 미엘린을 생산하고 유지시키는 능력에 악영향을 미치는 질환 및 직접적으로 미엘린 수초를 손상시키는 질환 둘 모두가 포함된다. 이같은 질환은 미엘린화된 백질 경로에서의 전도를 방해하고, 중추신경계 (CNS)의 신경 및 말초 신경을 비롯하여 어떤 신경이 관여되는지에 따라 감각, 운동, 인지 및/또는 기타 기능에서의 손상을 비롯한 광범위한 운동, 감각, 및 인지 기능장애를 야기한다.

본원에서의 "자가면역 질환"은 개개인 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물로부터 유발되고 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물에 대항하여 유도된 질환 또는 장애, 또는 이로부터 비롯되는 증상이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예에는 관절염 (류마티스성 관절염, 유년형 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선 관절염 및 강직성 척추염), 건선, 피부염, 예를 들어 아토피성 피부염; 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역성 두드러기, 다발근육염/피부근육염, 독성 표피 괴사, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (크론병, 궤양성 결장염) 관련 반응, 및 괴저성 농피증과 함께 분리되는 IBD, 결절성 홍반, 원발 경화성 담관염, 및/또는 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, IgE-매개 질환, 예컨대 과민증 및 알레르기성 비염, 뇌염, 예컨대 라스무센 뇌염, 포도막염, 대장염, 예컨대 현미경적 대장염 및 교원성 대장염, 사구체신염 (GN), 예컨대 막성 GN, 특발성 막성 GN, 막 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 유형 I 및 유형 II, 및 급속 진행성 GN, 알레르기성 증상, 습진, 천식, T 세포 침윤 및 만성 염증성 반응을 수반하는 증상, 아테롬성 동맥 경화증, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 예컨대 피부 SLE, 루푸스 (신염, 뇌염, 소아, 비-신장, 원반, 탈모증 포함), 유년 발병 당뇨병, 다발성 경화증 (MS), 예컨대 시신경-척수 MS, 알레르기성 뇌척수염, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 베게너 육아종증을 비롯한 육아종증, 무과립구증, 혈관염 (대혈관염 (류마티스성 다발근통 및 거대세포 (타카야수의) 동맥염 포함), 중혈관염 (가와사끼병 및 결절성 다발동맥염 포함), CNS 혈관염, 및 ANCA 관련 혈관염, 예컨대 처그-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS) 포함), 재생불량성 빈혈, 쿰브스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈 (PRCA), 인자 VIII 결핍, 혈우병 A, 자가면역성 호중성백혈구감소증, 면역범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 다기관 손상 증후군, 중증근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병, 캐슬맨 증후군, 굿패스쳐 증후군, 램버트-이튼 근무력증 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 고형 기관 장기이식 거부 (고패널 반응성 항체 적정에 대한 예비치료, 조직에의 IgA 침착, 및 신장 이식, 간 이식, 창자 이식, 심장 이식 등으로부터 생긴 거부 포함), 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 수포성 유천포창, 천포창 (낭창, 천포창(foliaceus), 및 천포창 점막 유천포창 포함), 자가면역성 다중 내분비계 질환, 라이터병, 근육강직 증후군, 면역 복합성 신장염, IgM 다발신경병증 또는 IgM 매개 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), (예를 들어 심근경색 환자에 의해 발생하는 것과 같은) 혈소판감소증, 예를 들어 자가면역성 혈소판감소증, 자가면역성 고환염 및 난소염을 비롯한 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상샘저하증; 자가면역성 내분비계 질환, 예를 들어 자가면역 갑상샘염, 만성 갑상샘염 (하시모토 갑상샘염), 아급성 갑상샘염, 특발성 갑상샘저하증, 애디슨병, 그레이브병, 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)이라고도 불리는 제I형 당뇨병, 예를 들어 소아 IDDM, 및 쉬이한 증후군; 자가면역성 간염, 림프구 간질성 폐렴 (HIV), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식조직) vs NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르거병 (IgA 신장병증), 원발성 담즙성 간경변증, 비열대성 스프루우 (글루텐 장병증), 포진성 피부염과 함께 분리되는 불응성 스프루우, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측색경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역성 내이 질환 (AIED), 자가면역성 난청, 안간대근경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예컨대 불응성 다발연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 거대 세포 간염, 공막염, 불특정/의의불분명 단일클론성 감마병 (MGUS), 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병, 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병; 자폐증, 염증성 근질환, 및 국소성 분절성 사구체경화증 (FSGS)이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

용어 "자가면역 탈수초화를 특징으로 하는 질환" 및 "탈수초성 자가면역 질환"은 교환 가능하게 사용되며, 적어도 부분적으로는 자가면역 반응에 의해 야기되는 탈수초성 질환을 지칭한다. 탈수초성 자가면역 질환에는 재발성 또는 만성적 진행성 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증 (MS) 및 그의 변이형, 및 단상성 탈수초성 질환, 예컨대 시신경염, 급성 파종성 뇌척수염, 및 횡단성 척수염이 포함된다. 중추신경계 (CNS)의 탈수초성 자가면역 질환에는, 비제한적으로 MS 및 MS 변이형, 예컨대 재발 완화형 MS (RRMS) 및 원발성 및 속발성 진행 형태, 및 MS의 진행 재발성 형태, 뇌척수염, 백질뇌염, 횡단성 척수염, 시신경척수염 (데빅병), 및 시신경염이 포함된다. 말초 신경계에 영향을 미치는 탈수초성 자가면역 질환에는, 예를 들어 급성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (AIDP; 길랑-바레 증후군); 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증; 항-MAG 말초 신경병증; 및 유전성 감각운동 신경병증 (HSMN) 또는 비골 근육 위축, 또는 샤르코-마리-투스병으로도 알려져 있는 운동 및 감각 신경병증 (HMSN)이 포함된다.

"치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치를 둘 모두 지칭한다. 치료를 필요로 하는 자에는 이미 장애를 갖고 있는 자 뿐만 아니라 장애를 예방하고자 하는 자가 포함된다. 따라서, 본원에서 치료하고자 하는 포유동물은 장애가 있는 것으로 진단받았을 수 있거나, 또는 장애가 생길 수 있거나 장애에 취약할 수 있다. 예를 들어, 예방적 치료는 완전히 발생된 임상 형태 또는 보다 심각한 질환 형태의 방지, 예컨대 재발 완화형 MS (RRMS)로부터 MS 발생의 방지를 포함한다. 치유적 치료는 질환의 진행을 늦추고, 질환 에피소드 (발병)의 빈도를 감소시키고, 발병 이후에 기능을 회복시키고, 새로운 발병을 방지하고, 장애와 관련되거나 장애로부터 야기된 상해 발생을 방지하거나 늦추는데 도움이 될 수 있다.

용어 "CLM-1 효능제"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관내, 계내 또는 생체내에서 CLM-1의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 증강, 자극 또는 활성화시키는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어, 효능제는 수용체 활성화 또는 신호 전달을 야기하는 CLM-에 대한 그의 직접 결합의 결과로서, 시험관내, 계내 또는 생체내에서 CLM-1의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 증강, 자극 또는 활성화시키는 기능을 수행할 수 있다. 효능제는 또한 예를 들어 CLM-1 활성화 또는 신호 전달을 추후 야기하는 다른 이펙터 분자의 자극의 결과로서, 시험관내, 계내 또는 생체내에서 CLM-1의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 증강, 자극 또는 활성화시키는 기능을 간접적으로 수행할 수 있다. 본원에서의 생물학적 활성은 상기에서 정의한 바와 같은 탈수초성 질환, 예컨대 탈수초성 자가면역 질환의 음성 조절이다. 효능제에는 구체적으로 CLM-1 리간드 및 CLM-1에 대한 효능제 항체가 포함된다.

치료 목적의 "포유동물"은 인간, 비-인간 고등 영장류, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯한, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

용어 "치료 유효량"은 포유동물의 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 본 발명의 경우에서, 치료 유효량은 상기에서 정의한 바와 같은 탈수초성 질환, 예컨대 탈수초성 자가면역 질환을 치료 (예방 포함)하는데 효과적인 CLM-1 효능제의 양이다.

"리포솜"은 약물 (예컨대 본원에서 개시하는 항-ErbB2 항체, 및 임의로 화학요법제)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러가지 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 통상적으로, 리포솜의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다.

용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 용량, 투여, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하는데 사용된다.

II. 상세한 설명

다발성 경화증 (MS) 및 그의 전임상적으로 동등한 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 혈관주위 염증 및 탈수초화를 특징으로 한다. 순환 전구세포 유래의 골수 세포는 염증성 침윤의 두드러진 성분이고, 시토카인 생산, 탈수초화, 축삭 손상 및 운동-기능장애와 관련이 있는 궁극적인 이펙터 세포를 구성하는 것으로 여겨진다. 이들 골수 세포의 세포독성 활성이 어떻게 조절되는지는 거의 알려진 바 없다. 본 발명은, 적어도 부분적으로는, 자가면역 탈수초화의 음성 조절자로서 Cmrf-유사 분자-1 (CLM-1)을 확인한 것을 기초로 한다. CLM-1은 MOG 펩티드로 마우스를 면역화함에 따라 말초 혈액 내 염증성 단핵구 및 CNS의 탈수초 영역에 존재하는 염증성 수지상 세포 상에서 발현된다. CNS 침윤성 염증성 수지상 세포 상의 CLM-1의 부재는 T-세포 반응에는 영향을 미치지 않으면서 산화질소 및 염증유발 시토카인 생산을 현저히 증가시키는 한편 축삭 탈수초화를 증가시키고 임상 스코어를 악화시켰다. 따라서, CLM-1은 본원에서 골수 세포 활성화 및 자가면역 탈수초화의 음성 조절자로서 확인된다.

골수 세포는 자가면역 탈수초성 질환에서 중요한 이펙터 세포이다 (문헌 [Barnett et al., Multiple sclerosis (Houndmills, Basingstoke, England) 12, 121-132, 2006]; [Benveniste, Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany) 75, 165-173, 1997]). CNS-침윤성 골수 집단은 상주 소교세포, 대식세포, 염증성 수지상 세포, 형질세포양 수지상 세포 및 전통적인 수지상 세포로 이루어진다. MHCII 및 CD86 발현 골수계 수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 T-세포를 재활성화시키는 능력 (문헌 [Deshpande et al., J Immunol 178, 6695-6699, 2007]) 및 질환을 재발시키는 에피토프 확산에의 관여 (문헌 [Miller et al., Annals of the New York Academy of Sciences 1103, 179-191, 2007])로 인해 특히 주목을 받아왔다. 항원 제시 세포로서 작용하는 것 다음으로, 염증성 DC는 염증유발 시토카인 및 반응성 산소 중간체를 분비하여 점진적인 탈수초화 및 축삭 손실을 야기함으로써 국소 세포외 환경을 직접 조절한다. TipDC라고도 명명되는 이들 TNF- 및 iNOS 생산 수지상 세포의 전구 세포 (문헌 [Serbina et al., Immunity 19, 59-70, 2003])는 순환계 중에 존재하고 CNS 염증 구역에 모여드는 염증성 단핵구이다. MS에 대해 승인받은 약물인 글라티라머 아세테이트에 의한 염증성 단핵구의 유형 II 항-염증성 단핵구로의 전환은 EAE 중증도를 회귀시켰고 (문헌 [Weber et al., Nature Medicine 13, 935-943, 2007]), 질환 중증도를 조절하는데 있어서 이들 골수 세포의 중요한 역할이 더욱 강조되었다.

CNS 침윤성 골수 세포의 다른 음성 조절자가 이전에 확인된 바 있다. 예를 들어, 상주 소교세포 및 침윤성 골수 세포 둘 모두에서 발현되는 TREM-2는 미엘린 파편의 식세포작용에 의해 CNS 염증을 해소시키는데 중요한 역할을 한다 (문헌 [Piccio et al., European Journal of Immunology 37, 1290-1301, 2007], [Takahashi et al., PLoS medicine 4, e124, 2007], [Takahashi et al., The Journal of Experimental Medicine 201, 647-657, 2005]). 유사하게, 골수 세포 상의 IFNAR은 CNS에서의 염증 반응을 하향 조절한다 (문헌 [Prinz et al., Immunity 28, 675-686, 2008]). 그러나, 어떤 수용체도 CNS로 귀소되는 염증성 골수 유래 단핵구에 특이적이지 않다.

CLM-1 (MAIR-V, LMIR-3, DigR2)은 골수 기능의 음성 조절에 중요한 골수계 특이적 세포 표면 수용체에 대한 연구에서 확인되었다. CLM-1은 인간 염색체 17번 상의 다유전자 집단 (마우스 오르토로그는 염색체 11번 상에 위치함)인 CMRF 패밀리의 일족이다. 모든 패밀리 구성원은 세포외 IgV 도메인을 함유한다. 이러한 집단 내의 2종의 패밀리 구성원 (CLM-1 및 CLM-8)은 세포내 도메인 내에 ITIM 서열을 함유하며, 나머지는 막횡단 영역 내에 신호전달 어댑터를 모으는 작용을 할 수 있는 하전된 잔기를 갖는다. 인간 CD300f (서열 2; 문헌 [Clark et al., Trends in Immunology 30, 209-217, 2009])의 뮤린 오르토로그인 CLM-1 (서열 1)은 파골세포형성의 음성 조절자로서 먼저 기술되었다 (문헌 [Chung et al., J Immunol 171, 6541-6548, 2003]). 후속 연구는 CLM-1이 Fc-수용체 매개 세포 반응에서 억제 역할을 함을 보여주었다 (문헌 [Alvarez-Errico et al., 2004]; [Fujimoto et al., 2006]). 자가면역 질환에서의 생물학적 역할은 지금까지 기술되지 않았다. 본원에서는 염증성 시토카인 및 반응성 산소 종의 방출을 억제하는 것에 의한 CNS에서의 염증성 DC 활성의 음성 조절자로서 CLM-1을 확인하였다. 본 연구는 따라서 CNS 염증 및 탈수초화의 골수계 특이적 음성 조절자로서 CLM-1을 인식한다.

본 발명은 CLM-1 길항제로 탈수초성 질환, 예컨대 탈수초성 자가면역 질환을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

구체적 실시양태에서, CLM-1 효능제는 CLM-1에 대한 효능제 항체이다.

항체

본 발명의 항체에는 항-CLM-1 항체 또는 CLM-1의 항원 결합 단편, 또는 본원에서 기재하는 기타 항체가 포함된다. 예시적인 항체로는, 예를 들어 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 단편, 다중특이적, 이종접합, 다가, 이펙터 기능 등의 항체가 포함된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 효능제 항체이다.

폴리클로날 항체

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, CLM-1에 대한 폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 1회 또는 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물 또는 SOCl₂를 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 CLM-1, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 전형적으로는 동물을 동일 항원의 접합체로 부스팅하지만, 이것은 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 것이다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

모노클로날 항체

모노클로날 항체를 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 마카쿠 원숭이를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그 후, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).

이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 전형적으로 미융합 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.

전형적인 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고-수준 생성을 지지하고, 배지, 예컨대 HAT 배지에 감수성인 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 CLM-1에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)으로 결정할 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.

목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

또한, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 방법으로 제조될 수도 있다. 통상적인 절차 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 쉽게 단리하고 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣은 후, 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포를 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득할 수 있다. 항체의 재조합 생산은 하기에 더욱 상세하게 기술될 것이다.

또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체 단리를 각각 기재한다. 이후의 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 및 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)])을 기재한다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.

DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 이뮤노글로불린 코딩 서열을 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유 연결함으로써 변형시킬 수 있다.

전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인 대신 사용되거나 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

인간화 및 인간 항체

본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 1개 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 사용함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).

인간화하고자 하는 항체는 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하는 것이 또한 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 전형적인 방법에 따라 모 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념상 인간화 산물의 분석 공정에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 흔하게 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형상 구조를 묘사하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이 검토는 후보 이뮤노글로불린 서열이 기능하는데 있어서 잔기의 예상되는 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 중요한 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

대안적으로, 면역화시에 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이같은 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종 시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 [Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)])을 참조한다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)]).

인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)])를 비롯하여, 당업게에 공지되어 있는 다양한 기술을 이용하여 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자에 인프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이시킨다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 선택되게 한다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 예를 들어 문헌 [Johnson, K S, and Chiswell, D J., Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993)]에서 검토되는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. V-유전자 절편의 몇몇 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 단리해내었다. 비면역화된 인간 공여자로부터 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있으며, 다양한 어레이의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체를, 예를 들어 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리해낼 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다. 콜(Cole) 등 및 보에르네르(Boerner) 등의 기술은 또한 인간 모노클로날 항체를 제조하는데 이용가능하다 (문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerer et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991))]. 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포로 생성할 수 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).

항체 단편

항체 단편도 또한 본 발명에 포함된다. 항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편을 상기에서 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링시켜 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리해낼 수 있다. 항체 단편 생산을 위한 그 밖의 기술은 숙련된 당업자에게 분명할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이므로; 이들은 생체내 사용 동안 비특이적 결합을 감소시키는데 적합하다. SFv 융합 단백질을 구축하여 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에의 이펙터 단백질의 융합체를 수득할 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재되어 있는 바와 같은 예를 들어 "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체

본 발명의 항체는 또한 예를 들어 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적 항체를 포함한다. 이러한 분자들은 일반적으로는 오직 2종의 항원과만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 경우에는 이러한 표현에 포함된다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 생성법은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합체는 바람직하게는 힌지, CH2, 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하며, 이는 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및, 원하는 경우에, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비례관계를 조정하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 야기하거나 또는 비율이 특별한 중요성을 갖지 않는 경우에는, 하나의 발현 벡터에 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한 쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자에서 오직 1/2에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리를 제공하는 것과 같이, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이중특이적 화합물을 분리하는 것을 용이하게 하는 것으로 확인되었다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체 생성에 대한 추가의 세부사항은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

WO96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 1차 항체 분자의 경계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 2차 항체 분자의 경계면에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 가수분해적으로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

또한, 재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체를 류신 지퍼를 이용하여 생산한다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시킨다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성한다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이량체를 생산하는데 사용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 기재되어 있는 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 대안적 메카니즘을 제공한다. 단편은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍이 형성되도록 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 형성하게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 이용하는 것에 의해 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략이 또한 보고되어 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].

이종접합체 항체

이중특이적 항체는 본 발명의 항체인 가교 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.

다가 항체

본 발명의 항체는 다가 항체를 포함한다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서의 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.

이펙터 기능 조작

예를 들어 질환의 치료에 있어서의 항체의 유효성을 증진시키기 위해, 본 발명의 항체를 이펙터 기능에 대해 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성되도록 할 수 있다. 이에 따라 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 생체내 혈청 반감기 증가를 담당하는 상기 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

기타 항체 변형

본원에서는 항체의 다른 변형도 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결될 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 콜로이드성 약물 운반 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시되어 있다.

리포솜 및 나노입자

본 발명의 CLM-1 항체는 이뮤노리포솜으로서 제제화할 수도 있다. 폴리펩티드를 함유하는 리포솜은, 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 바와 같은 당업계 공지의 방법으로 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 일반적으로, 리포솜의 제제화 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 규정된 기공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 원하는 직경의 리포솜을 수득한다. 본 발명의 폴리펩티드는 디술피드 교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 항체의 Fab' 단편) 리포솜에 접합될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 봉입하는데 나노입자 또는 나노캡슐을 또한 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자를 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 추가적 세부사항을 하기하는 비제한적인 실시예에서 설명한다. 명세서 내의 모든 인용문헌의 개시내용은 본원에 참고로 분명하게 포함된다.

실시예

물질 및 방법

동물. 모든 동물을 멸균 병원체 유리 조건하에 유지시켰고, 동물 실험은 제넨테크의 동물 실험 윤리 위원회에서 승인받았다. Clm-1 녹아웃 (KO) 마우스 생성을 위해, 네오마이신 내성 유전자 (Neo^r)를 함유하는 선형화된 표적화 벡터를 C57Bl/6 기원의 C2 배아 줄기 (ES) 세포에 전기천공시켰다. 네오마이신 내성 ES 클론을 상동성 재조합 (도 8-11)의 서던 블롯팅 분석으로 선별하였다. Clm-1 엑손 1이 Neo^r 유전자로 성공적으로 대체된 ES 클론을 C57BL/6 미분화세포에 주사한 후 가임신 암컷으로 전달하여 키메라 자손을 생성하였다. 키메라를 C57BL/6 마우스와 함께 번식시켜 이형접합체를 생성하였다. 표적화된 대립유전자가 배선 전달된 이형접합체를 상호교배 전 적어도 10 세대 동안 C57BL/6과 역교배시켜 Clm-1 야생형 (WT) 및 KO 마우스를 생성하였다. C57BL/6 (CD45.1 또는 CD45.2 유사유전자 배경) 마우스를 더 잭슨 래버러터리(The Jackson Laboratory)에서 구입하였다. Cx3cr1^gfp/+ C57BL/6 리포터 마우스를 번식시키고, 제넨테크, 인크.의 병원체 유리 동물 보관소에서 보관하였다. 6 주령의 C57BL/6 (CD45.1)를 골수 수용자로서 사용하는 CD45.1/CD45.2 골수 키메라 실험의 경우를 제외하고, 모든 마우스는 8-12 주령의 것을 사용하였다. 모든 실험 프로토콜은 제넨테크 인크.의 동물 실험 윤리 위원회에서 승인받았다.

항체 및 재조합 단백질. 이하의 항체를 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)에서 구입하였다: 항-FcγRIII/II (CD32/16, 클론 2.4G2); PE-, APC-, APC-Cy7-표지된 항-CD11b (M1/70); 비오틴-, PE-, APC-표지된 항-CD11c (HL3); PE-, APC-표지된 항-CD4 (GK1.5); APC-표지된 항-CD3 (145-2C11); PE-Cy7-표지된 항-B220 (RA3-6B2); PE-표지된 항-I-A/I-E (M5/114.15.2); 비오틴-, PE-표지된 항-CD86 (GL1); APC-Cy7-표지된 항-Gr-1 (RB6-8C5); PE-표지된 항-CD45.1 (A20); 비오틴-, FITC-표지된 항-CD45.2 (104); 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488-표지된 항-FoxP3 (MF23); PE-표지된 항-IL-17 (TC11-18H10); FITC-표지된 항-IFNγ (XMG1.2); FITC-, PE-표지된 항-TNFα (MP6-XT22); 비오틴-, PE-, PerCP-Cy5.5-표지된 항-CD45 (30-F11); 폴리클로날 토끼 항-iNOS 유형 II 항체. 이하의 항체를 이바이오사이언스(eBioscience)에서 구입하였다: 퍼시픽 블루-표지된 항-CD11b (M1/70); PE-Cy7-표지된 항-CD11c (N418); PE-Cy5-표지된 항-I-A/I-E (M5/114.15.2); APC-알렉사 플루오르 750-표지된 항-F4/80 (BM8). 스트렙타비딘 퍼시픽 오렌지는 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였다. PE-표지된 당나귀 항-토끼 IgG 및 Cy3-표지된 항-햄스터 IgG는 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)에서 구입하였다. 모노클로날 항-액틴 항체 (AC-40)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 뮤린 Clm-1-Fc 융합 단백질 생성을 위해, 뮤린 Clm-1의 세포외 도메인 (ECD)을 뮤린 IgG1 Fc 단편을 코딩하는 변형된 pRK5 발현 벡터에서 클로닝하였다. 발현 벡터를 CHO 세포에 형질감염시키고, 세포 배양 상청액에 함유된 Clm-1-Fc 융합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 여과에 의해 정제하였다. 정제된 단백질의 식별은 질량 분광측정 분석에 의해 확인하였고, 내독소 수준은 0.05 EU/mg 미만이었다. 뮤린 항-gp120 항체 (IgG1)를 대조군으로서 사용하였다. 아르메니아 햄스터를 뮤린 Clm-1-ECD-His 융합 단백질로 면역화하여 뮤린 Clm-1의 ECD에 대한 모노클로날 항체를 생성하였다. 면역화된 동물로부터의 비장 B 세포를 골수종에 융합시켜 하이브리도마를 생성하였다. ELISA, FACS, 웨스턴 블롯팅 및 면역조직화학 분석에 의해 뮤린 Clm-1에 대한 반응성을 기초로 양성 클론을 선별하였다. 상기 기준에 기초하여 클론 3F6을 본 연구에 사용하기 위해 선별하였다. 알렉사 플루오르^® 단백질 표지 키트 (인비트로젠)를 이용하여 알렉사 형광색소 (488 또는 647)-접합된 Clm-1 항체를 생성하였다.

활발한 EAE 유도 및 임상 평가. PBS 100 ㎕ 및 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 100 ㎕를 함유하는 에멀젼 200 ㎕ 중의 MOG_35-55 펩티드 200 ㎍으로 마우스를 피하 면역화하였다. CFA는 불완전 프로인트 아주반트 (디프코 래버러토리즈(DIFCO Laboratories))를 8 mg/ml의 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37RA (생육 불가능하고 건조된 것; 디프코 래보러토리즈)와 혼합하여 제조하였다. 각 마우스에 또한 PBS 100 ㎕ 중의 페르투시스 독소 (칼바이오켐(Calbiochem)) 200 ng를 면역화 후 0일 및 2일 째에 복강내로 주사하였다. 이하의 등급 체계로 임상 징후를 평가하였다: 0, 이상 없음; 1, 꼬리를 흐느적거림 또는 뒷다리에 힘이 없음; 2, 꼬리를 흐느적거리고 뒷다리에 힘이 없음; 3, 부분적으로 뒷다리가 마비됨; 4, 뒷다리가 완전히 마비됨; 5, 빈사 상태. Clm-1-Fc 융합 단백질 실험의 경우, 면역화를 제0일에 시작하였고, 100 ㎕ PBS 중의 200 ㎍의 Clm-1-Fc 융합 단백질 또는 대조군 Fc 단백질 (항-gp120)을 주 3회 피하 처리하였다. 데이터는 평균 매일 임상 스코어 및 평균의 표준 편차 (SEM)로 보고하였다.

골수 키메라. 6 주령의 C57BL/6 (CD45.1) 수용자 마우스에 각각 500 rad의 2회 용량으로 치사적으로 방사선 조사하였다. 골을 5％ FBS를 함유하는 행크 평형 염 용액 (HBSS; 하이클론(Hyclone))으로 플러싱함으로써 시린지 및 27-게이지의 바늘을 이용하여 대퇴골 및 경골로부터의 골수 세포를 C57BL/6 (CD45.2) 공여자 마우스로부터 무균 수거하였다. ACK 용해 완충제로 적혈구를 용해시켰다. 세포를 400 g의 HBSS/FBS 중에서 5 분 동안 세척하고, 재현탁시키고, 나일론 메쉬 (BD 팔콘(BD Falcon))를 통과시켜 잔해를 제거하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세척하고, 10⁸ 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 방사선 조사된 수용자 마우스에 꼬리 정맥을 통해 2 x 10⁷ 세포/200 ㎕를 주사하였다. 재구성한 마우스를 병원체 유리 보관소에서 8주 동안 두어 공여자 골수가 완전히 혼입되게 하였다. 골수의 완전한 재구성은 림프양 및 골수계 구획에서 CD45.1 및 CD45.2 유사유전자 마커에 대해 말초 혈액을 FACS 분석하여 확인하였다. 상기에서 기재한 바와 같이, 재구성된 수용자 마우스에서 EAE가 유도되었다.

EAE의 입양 전이. 마우스에 페르투시스 독소를 주사하지 않는 것을 제외하고, Clm-1 WT 또는 KO 마우스를 활발한 EAE 유도에서 기재한 것과 같이 MOG_35-55 펩티드로 면역화하였다. 면역화한 지 10 내지 12일 후에, 배수 (서혜부 및 상완) 림프절을 수거하고, 70-μm 세포 여과기를 통해 으깨어 단세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 4일 동안 MOG_35-55 펩티드 20 ㎍/ml 및 재조합 뮤린 IL-2 (R&D 시스템즈(R&D Systems)) 20 ng/ml로 5 x 10⁶ 세포/완전 배지 (RPMI 1640, 10％ FBS, 2 mM 글루타민, 10 mM HEPES, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.05 mM β-메르캅토에탄올, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신) ml로 재자극하였다. 수용자 마우스의 꼬리 정맥을 통해 10⁷ 세포를 주사하였다. 같은날 및 이틀 후에, 수용자 마우스에 또한 상기에서 기재한 바와 같은 페르투시스 독소를 200 ng 주사할 것이다. EAE 질환에 대한 임상 평가를 상기한 바와 같이 수행하였다.

척수 및 림프절의 FACS 분석. EAE 질환의 최고점에 (면역화 후 제14일-제15일), 마우스를 마취시키고, 헤파린 10 U/ml를 함유하는 PBS를 심장을 통해 관류시켰다. 척수를 해부해내어 콜라게나제 D (2 mg/ml; 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics))로 소화시켰다. 조직을 70-μm 세포 여과기 (BD 바이오사이언시즈)에 통과시킨 다음 퍼콜(Percoll) 구배 (80％/70％/60％/30％) 원심분리하여 단핵 세포를 단리하였다. 30％/60％ 계면으로부터 세포를 수집하고 세척하였다. 또한, 상기한 바와 같이 배수 림프절 (DLN)로부터 세포를 단리해내었다. 세포를 FACS 염색 완충제 (PBS, 0.5％ 소 혈청 알부민, 2 mM EDTA) 중에서 30분 동안 4℃에서 항-FcγRIII/II로 Fc 차단시켰다. 세척한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 형광 접합된 mAb로 염색하였다. iNOS의 세포내 염색을 위해, 세포를 Clm-1 (3F6), CD45, CD11b 및 CD11c에 대한 항체로 염색한 후, PBS 용액 중의 3％ 파라포름알데히드로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 이어서 세포를 100 ㎕ 투과 용액 (PBS 중의 0.1％ 트리톤-X) 중에 재현탁시켰다. 세포를 투과 용액 중의 1 ㎍/ml 토끼 항-iNOS 항체로 실온에서 15분 동안 염색한 후, PE-표지된 당나귀 항-토끼 IgG로 실온에서 15분 동안 염색하였다. Treg 세포를 분석하기 위해, 상기한 바와 같이 척수 및 DLN으로부터 단리해 낸 단세포 현탁액을 CD45 및 CD4로 염색한 후, 시토픽스/시토펌 고정/투과 키트(Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization kit) (BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 FoxP3를 세포내 염색하였다. 시토카인의 세포내 염색을 위해, 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 37℃에서 18-20시간 동안 100 μg/ml MOG_35-55 펩티드로 4x10⁵ 세포/완전 배지 200 ㎕로 자극하였다. 자극하는 마지막 4시간 동안, 세포를 1:1000으로 희석된 골기플러스(GolgiPlug) (BD 바이오사이언시즈)로 처리하였다. IL-17 및 IFNγ의 세포내 염색은 본질적으로 FoxP3 염색과 같이 수행하였다. FACS칼리버 또는 LSRII 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 이용하여 염색된 세포를 분석하였다. 데이터는 플로우조 소프트웨어(FlowJo software) (트리 스타(Tree Star))를 이용하여 분석하였다.

웨스턴 블롯에 의한 Clm-1 발현. 골수 유래 수지상 세포 (BMDC)를 문헌 [Inaba et al., The Journal of Experimental Medicine 176, 1693-1702, 1992]에 기재된 바와 같이 생성하였다. BMDC를 10 ng/ml GM-CSF (R&D 시스템즈)의 존재하에 배양하였고, 배지는 매 3일마다 새롭게 하였다. 제7일 째에, 세포를 FACS에 의해 분석하였다. BMDC 순도는 90-95％ CD11c⁺, CD11b⁺이었다. BMDC로부터의 전체 세포 용해물을 표준 방법을 이용한 항-Clm-1 Ab (3F6)에 의한 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다.

Clm-1 발현의 실시간 PCR 분석. EAE의 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일 째에 척수 및 DLN을 상기한 바와 같이 마우스로부터 단리하였다. 전체 RNA는 알엔이지 프로텍트 미니 키트(RNeasy Protect Mini Kit) (퀴아젠(QIAGEN))를 이용하여 단리하였다. 고성능 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용하여 1 ㎍ RNA로 cDNA를 합성하였다. 택맥 유니버셜(TaqMan Universal) PCR 마스터 믹스 및 검증된 프라이머 및 프로브 세트, 각각 Mm00467508_m1 및 Hs03003631_g1 (어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 Clm-1 mRNA 및 18s rRNA를 측정하였다.

시토카인 및 산화질소 생산의 측정. EAE의 제15일 째에 상기한 바와 같이 척수로부터 단핵 세포를 단리하였다. 단세포 현탁액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 100 μg/ml MOG_35-55 펩티드를 함유하거나 함유하지 않는 완전 배지 중에서 (5x10⁵ 세포/200 μl) 37℃에서 배양하였다. 36시간 후에 배양물 상청액을 수거하였다. 바이오-플렉스(Bio-Plex) 마우스 시토카인 23-플렉스 패널 (바이오-래드(Bio-Rad))을 이용하여 루미넥스(Luminex)에 의해 시토카인 방출을 측정하였다. 산화질소 생산은 그리스(Griess) 검정 (프로메가(Promega))을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.

시험관내 항원-특이적 회상 반응. EAE의 제14일 째에 상기한 바와 같이 마우스로부터 배수 림프절을 수거하였다. 단세포 현탁액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 적정된 양의 MOG_35-55 펩티드를 함유하거나 함유하지 않는 완전 배지 중에서 (5x10⁵ 세포/200 μl) 37℃에서 3일 동안 재자극하였다. 이어서 배양의 마지막 6시간 동안 세포를 0.5 μCi/웰 [³H] 티미딘으로 감작시켰다. 탑카운트 마이크로플레이트 섬광 계수기(Topcount Microplate Scintillation Counter) (팩커드 인스트루먼츠(Packard Instruments))를 이용하여 검출된 [³H] 티미딘 흡수에 의해 증식을 결정하였다. 이와 달리, 시토카인 분석을 위해 상청액을 제3일째에 수집하였다. 시토카인 측정은 ELISA (BD 바이오사이언시즈)에 의해 수행하였다.

면역조직화학. 면역화 이후 지정된 날에, 마우스를 마취시키고, 상기한 바와 같이 30 ml PBS를 관류시킨 다음 10 ml 4％ 파라포름알데히드 (PFA)를 관류시켰다. 해부에 의해 척수를 떼어내고, 밤새 4％ PFA 중에서 고정시킨 다음, 후속하여 10％, 20％, 40％ 수크로스 용액 중에 침윤시켰다. 이어서, 척수를 드라이 아이스 상의 OCT 중에서 동결시키고, 플라스틱 백 내에서 -80℃에서 보관하여 탈수를 방지하였다. 7 마이크로미터의 두꺼운 단면을 절단하고, 슈퍼프로스트 플러스 슬라이드(Superfrost Plus slide) (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 상에 실장하였다. Clm-1 및 CD45.2 공동 염색을 위해, 햄스터 혈청 및 비오틴 차단 키트 (시그마(Sigma))를 이용하여 슬라이드를 차단시켰다. 조직을 햄스터 항-Clm-1 (3F6) 및 비오틴-접합된 항-CD45.2로 염색한 후, Cy3-항-햄스터 IgG 및 알렉사 플루오르 488-스트렙타비딘 (인비트로젠)으로 검출하였다. Clm-1 및 CD11c 공동 염색을 위해, 슬라이드를 먼저 항-Clm-1로 염색한 후, Cy3-항-햄스터 IgG로 검출하였다. 이어서 슬라이드를 비오틴-항-CD11c (HL3)로 염색하고, 알렉사 플루오르 488-스트렙타비딘으로 검출하였다. 미엘린 및 CD11c의 공동 염색을 위해, 슬라이드를 먼저 비오틴-항-CD11c로 염색하고, 알렉사 플루오르 594-스트렙타비딘 (인비트로젠)으로 검출하였다. 이어서 미엘린을 플루오로미엘린(FluoroMyelin)™ 녹색 형광 미엘린 염색 키트 (인비트로젠)를 이용하여 염색하였다. 절편을 DAPI를 함유하는 프로롱 골드 항변색 배지(Prolong Gold antifade medium) (인비트로젠)로 커버슬립하였다. 슬라이드를 조사하고, 올림푸스 BX61 형광 현미경을 이용하여 영상을 수득하였다. 탈수초화 정도를 결정하기 위해, 척수의 경부 및 흉부 절편을 플루오로미엘린™ 녹색 형광 미엘린 염색 키트로 염색하였다. 전체 절단 영역 및 각 절편의 탈수초화된 영역을 수작업으로 추적하여 탈수초화 영역을 평가하였다. 총 탈수초화를 전체 척수 영역의 백분율로 표현하였다.

통계적 분석. 분산이 다를 경우를 가정하여, 양측 쌍체 스튜던트 t 시험(two-tailed paired student's t test)에 의해 임의의 2 그룹의 마우스 사이의 EAE 임상 스코어, 탈수초화 또는 다른 세포 계수 및 시토카인 생산을 비교하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 논의

Clm-1은 CNS 염증 부위의 TNF 및 iNOD 생산 CD11c+ 세포 상에서 발현된다

Clm-1은 단일 막횡단, 면역-티로신 억제 모티프 (ITIM)-함유 Ig-슈퍼패밀리 구성원을 코딩하는 게놈 예측된 서열을 조사하는 바이오-인포매틱스 접근법을 통해 처음 확인되었다 (문헌 [Abbas et al., Genes and Immunity 6, 319-331, 2005]). 이에 이어 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 펩티드에 의한 면역화 이후 척수에서의 발현 수준에서의 변화에 기초하여 후보 ITIM-함유 유전자의 마우스 동족체가 선별되었다. 나이브 마우스에 비해, Clm-1의 발현은 질환의 최고점에서 100배를 초과하여 증가되었다 (도 1a, 좌측 패널). CLM-1 세포외 도메인에 대한 모노클로날 항체를 생성하여 CLM-1의 세포 공급원을 결정하였다. CLM-1은 나이브 마우스의 국소 소교세포 집단에서는 존재하지 않았다 (도 1b). MOG-면역화된 마우스로부터의 척수에서, CLM-1은 MHC 클래스 II 및 CD86이 고도로 발현되는 CD11b/CD11c 이중 양성 세포에서 발현되었다 (도 1c). 질환 개시시에, CLM-1 CD11c 이중 양성 세포는 뇌막 및 혈관을 따라 분포되었다 (결과는 나타내지 않음). 질환의 최고점에서, Clm-1+ 세포는 흉부 및 요추 척수의 배측각 및 복측각의 백질 내 클러스터에 위치하였다 (도 1d). 추가의 분석은 Clm-1+ 세포가 iNOS 및 TNF를 발현하였으며 (도 1e), 따라서 효율적인 병원체 제거에 요구되는 골수 세포의 하위세트로 처음에 기재되었던 (문헌 [Serbina et al., Immunity 19, 59-70, 2003]) Tip-DC와 표현형상 유사함을 보여주었다. EAE에서의 후속 연구로 EAE에서의 질환 발병기전에 기여하는 병원성 이펙터 세포로서 TipDC 및 그의 전구체를 확인하였다 (문헌 [King et al., Blood 113, 3190-3197, 2009]). CNS 내 염증성 골수 세포 상에서의 증가된 CLM-1의 발현은 따라서 EAE 질환 발병기전에서 조절 기능을 나타낼 수 있다.

CLM-1은 자가면역 탈수초성 질환 동안 CNS로 이동하는 순환 Ly6+ 골수계 전구체 상에서 발현된다

CLM-1 양성 세포가 유래되는 골수 계통을 추가로 결정하기 위해, 본 발명자들은 단핵구 및 대식세포/수지상 세포 계통의 세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 Cx3cr1+/gfp 리포터 균주를 이용하였다 (문헌 [Geissmann et al., Immunity 19, 71-82, 2003]). 말초 혈액에서, CLM-1은 MOG 면역화에 따라 Cx3cr1^lo Ly6C^hi CD115⁺CD62L⁺Ly6G^- 염증성 단핵구 상에서 발현되었지만, 나이브 및 면역화된 마우스 내 Cx3cr1 ^hiCD11c⁺ 공통 DC 전구체에서는 존재하지 않았다 (도 2a) (문헌 [Auffray et al., The Journal of Experimental Medicine 206, 595-606, 2009]; [Liu et al., Science, 324, 392-397, 2009]). 염증이 생긴 CNS 내의 CLM-1 양성 세포가 실제로 방사선 조사-감응성 골수 유래 세포에서 유래되었고, 방사선 조사-내성 CNS 소교세포에서 유래된 것이 아님을 추가로 결정하기 위해, CD45.1 동종이인자형을 갖는 마우스에 방사선을 조사하고 CD45.2 동종이인자형을 갖는 공여자 세포로 재구성시켰다. CLM-1 발현은 방사선 조사-내성 소교세포에서는 부재하였지만, CNS로 귀소되는 골수 유래 공여자 세포 상에서는 존재하였다 (도 2b). 이러한 결과를 확인시켜 주는 것으로, CLM-1은 나이브 척수의 Cxcr3^hi 상주 소교세포 상에서는 부재하였지만, 질환의 최고점에서 Cx3cr1⁺CD11c⁺ 세포의 하위집단에서는 고도로 발현되었다 (도 2c). CLM-1⁺Cx3cr1^lo 이중 양성 세포는 흉부 및 요추 척수의 배측각 및 복측각의 뇌막 뿐만 아니라 정중융기에 인접해서 발견되었지만, 척수의 배측각 및 복측각의 회백질 내에 위치하는 상주 소교세포 상에서는 여전히 존재하지 않았다 (도 2d). 종합하면, 이러한 결과는 CLM-1이 CNS 염증 병변 내의 염증성 단핵구 및 골수 유래 염증성 DC에서는 발현되지만, 순환 공통 DC 전구체 또는 CNS 상주 소교세포에서는 그렇지 않음을 나타낸다.

CLM-1의 부재는 MOG-유도된 EAE에서 질환 중증도를 증가시킨다

CLM-1이 그의 세포질 도메인 내에 2개의 ITIM 및 1개의 ITSM 모티프를 함유하고 (문헌 [Chung et al., J Immunol 171, 6541-6548, 2003]), 강제적 과다발현 시스템에서 활성화 수용체와의 가교 이후 SHP-1을 모을 수 있기 때문에 (문헌 [Izawa et al., The Journal of Biological Chemistry 282, 17997-18008, 2007]), 본 발명자들은 CLM-1이 MOG-유도된 EAE에서 염증성 반응을 억제하는 작용을 할 수 있는지 여부를 결정하였다. 상동성 재조합을 통해 CLM-1의 엑손 1이 결여되어 전사체 및 단백질이 존재하지 않게 한 마우스를 생성하였다 (도 8). CLM-1 ko 마우스를 생육하였고, 예상되는 멘델 비율로 번식되었다. 마우스는 6, 9 및 12 주령에 측정한 체중 또는 골 파라미터가 다르지 않았다 (결과는 나타내지 않음). 서혜부 림프절, 비장 및 혈액 내 골수계 및 림프양 세포 하위세트는 CLM-1 ko 및 wt 마우스에서 유사하였다 (결과는 나타내지 않음). ko 마우스에서의 CLM-1 유전자의 성공적인 절제는 유동 세포측정법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다 (도 3a, 좌측 패널). 항원 제시 및 공동 자극과 관련된 세포 표면 분자의 발현 수준은 CMRF 클러스터 내의 다른 구성원의 발현 수준과 마찬가지로 (결과는 나타내지 않음) CLM-1 wt 및 ko 마우스로부터의 골수 유래 DC (BMDC)에서 유사하였다 (도 3a, 우측 패널). 수지상 세포 형태 (도 3b, 좌측 패널) 및 질환의 최고점에서의 다양한 염증성 세포 집단의 개수 (도 3b, 우측 패널)는 CLM-1 wt 및 ko 마우스에서 유사하였다. MOG 면역화시에, CLM-1 wt 및 ko 마우스 둘 모두에서 질환이 유사한 유병률로 발병하였다. 그러나, 질환 중증도는 CLM-1이 결여된 마우스에서 유의하게 높았다 (도 3c). 이러한 표현형이 추정 리간드에 의한 CLM-1의 부착으로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해, 마우스를 CLM-1의 가용성 버전 (CLM-1-Fc 융합 단백질)으로 처리하였다. CLM-1 ko 마우스에서 얻은 결과와 일치하게, 질환 유병률은 여전히 유사하였지만, 질환 중증도는 대조군 융합 단백질로 처리한 마우스에 비해 CLM-1-Fc 처리 마우스에서 유의하게 증가되었다 (도 3d). 따라서, CLM-1 수용체 기능의 결여는 질환 중증도를 증가시키며, 이는 CNS 염증에서의 잠재적인 억제 역할을 시사한다.

Clm-1은 T-세포 프라이밍을 조절하지 않는다

CLM-1의 스플라이싱된 변이체, Digr1은 종전에 T-세포 반응의 음성 조절자로서 확인되었다 (문헌 [Shi et al., Blood 108, 2678-2686, 2006]). EAE가 항원-특이적 T-세포 프라이밍에 의해 유도될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 CLM-1이 T-세포 반응에 영향을 미치는지 여부를 추가로 결정하였다. CLM-1 wt 및 ko 마우스 유래의 비장 cDC 또는 BMDC를 동종이계 T-세포 또는 OVA 펩티드에 대해 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 증식 (도 9 및 10) 및 시토카인 반응 (결과는 나타내지 않음)은 CLM-1 상태에 의존적이지 않았다. CLM-1이 생체내에서 T-세포 프라이밍에 영향을 미치는지 여부를 추가로 결정하기 위해, MOG 면역화 7일 후에 말초 림프절로부터 단리한 T-세포를 단리해내고, MOG 펩티드로 재자극시켰다. CLM-1 상태는 말초 림프절 (PLN) 세포에서 T-세포 증식, 시토카인 반응 또는 Foxp3 조절 T-세포의 생성에 영향을 미치지 않았다 (도 4a 및 도 11a). 마지막으로, 생체내 T-세포 이펙터 기능을 조절하는데 있어서 CLM-1의 역할을 확립하기 위해, CLM-1 wt 및 ko 공여자로부터의 T 세포를 ko 및 wt 수용자에 각각 입양 전이시켰다. 질환 중증도는 T-세포 공여자의 CLM-1 상태에 의해 영향을 받지 않았지만, CLM-1이 결여된 T-세포 수용자에서는 유의하게 증강되었다 (도 4b). 이는 CLM-1이 이펙터 상에서는 질환 중증도를 조절하는 역할을 하며, MOG 면역화 이후 초기 T-세포 프라이밍 상에서는 그렇지 않음을 나타낸다.

다음으로, 본 발명자들은 CLM-1이 CNS 침윤성 CD4+ T-세포의 재활성화 및 염증성 DC의 세포독성 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. 질환의 최고점에서 척수로부터 수거하고, 항원 제시 세포의 존재하에서 MOG 펩티드로 재자극시킨 CNS 백혈구는, Th1, Th17 및 Foxp3 Treg 세포에 대해 유사한 극성화 및 유사한 T-세포 특이적 시토카인 반응을 나타내었다 (도 5a 및 도 11b). 대조적으로, CLM-1 ko 마우스의 척수로부터 수득한 백혈구는 wt 마우스에 비해 유의하게 상승된 수준의 산화질소 및 골수계-특이적 전염증성 시토카인을 생성하였다 (도 5b). 따라서, CLM-1은 MOG-유도된 EAE에서 T-세포 반응에 영향을 미치지 않고 골수계 이펙터 기능을 음성적으로 조절한다.

본 발명자들은 다음으로 MOG 펩티드로 면역화시킨 CLM-1 ko 마우스에서의 마비 증가가 척수에서의 골수 세포의 증강된 활성으로 인한 것인지 여부를 결정하였다. CLM-1 양성 세포는 경부 및 흉부 척수의 배측각 내 탈수초화 부위에서 클러스터화된 상태로 발견되었다. 세포는 미엘린 시트와 나란히, 종종 미엘린 시트 주변을 감싸고 있는 상태로 발견되었고 (도 6a), 일부 경우에서는 MOG-양성 미엘린의 나머지가 CLM-1 양성 세포 내부에 존재하였다 (결과는 나타내지 않음). CLM-1이 억제 수용체이며, 침윤성 골수 세포의 정도가 CLM-1 wt 및 ko 마우스에서 유사하기 때문에, 본 발명자들은 CLM-1의 부재가 세포에 대해 활성화 및 이펙터 활성을 증가시켜 탈수초화를 증가시킬 수 있는 것으로 판단하였다. CLM-1의 결여는 탈수초화를 증가시켰고 (도 6b 및 c), CLM-1이 결여된 CD11c+ 세포에서 증가된 세포독성 활성이 나타났다. 따라서, CLM-1은 척수에서의 축삭 탈수초화를 중단시켜 골수 세포 활성화를 음성적으로 조절한다.

세포내 도메인에 ITIM-서열을 함유하는 수용체의 수는 끊임없이 증가하고 있지만, 이러한 많은 수용체들의 생물학적 역할은 여전히 거의 이해되지 않고 있다. 본 연구는 처음으로 CLM-1을 CNS 침윤성 염증성 DC 상의 억제 수용체로서 확인하였다. 본 발명자들은 추가로 수용체의 가용성 버전이 질환 중증도를 악화시킬 수 있음을 보여주었고, 이는 세포외 도메인이 아직은 확인되어야 하는 리간드에 대한 디코이 수용체로서 기능함을 시사한다. 추정 리간드의 확인은 본 발명자들의 CLM-1 생물학에 대한 이해를 의심할 바 없이 높여줄 것이지만, 본 연구는 CLM-1이 골수 세포 활성화 및 CNS에서의 탈수초화를 제어하는데 불필요하지 않은 역할을 함을 분명하게 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> DIAGNOSIS AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DEMYELINATING DISEASES <130> GNE-0352 PCT <140> <141> <150> 61/223,511 <151> 2009-07-07 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met His Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Leu Phe Trp Ile Thr Gly Cys 1 5 10 15 Cys Thr Ala Glu Asp Pro Val Thr Gly Pro Glu Glu Val Ser Gly Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Ser Leu Thr Val Gln Cys Arg Tyr Thr Ser Gly Trp Lys 35 40 45 Asp Tyr Lys Lys Tyr Trp Cys Gln Gly Val Pro Gln Arg Ser Cys Lys 50 55 60 Thr Leu Val Glu Thr Asp Ala Ser Glu Gln Leu Val Lys Lys Asn Arg 65 70 75 80 Val Ser Ile Arg Asp Asn Gln Arg Asp Phe Ile Phe Thr Val Thr Met 85 90 95 Glu Asp Leu Arg Met Ser Asp Ala Gly Ile Tyr Trp Cys Gly Ile Thr 100 105 110 Lys Gly Gly Leu Asp Pro Met Phe Lys Val Thr Val Asn Ile Gly Pro 115 120 125 Ala Ile Gln Val Pro Ile Thr Val Pro Thr Met Pro Pro Ile Thr Ser 130 135 140 Thr Thr Thr Ile Phe Thr Val Thr Thr Thr Val Lys Glu Thr Ser Met 145 150 155 160 Phe Pro Thr Leu Thr Ser Tyr Tyr Ser Asp Asn Gly His Gly Gly Gly 165 170 175 Asp Ser Gly Gly Gly Glu Asp Gly Val Gly Asp Gly Phe Leu Asp Leu 180 185 190 Ser Val Leu Leu Pro Val Ile Ser Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 195 200 205 Val Ala Ser Leu Phe Ala Trp Arg Met Val Arg Arg Gln Lys Lys Ala 210 215 220 Ala Gly Pro Pro Ser Glu Gln Ala Gln Ser Leu Glu Gly Asp Leu Cys 225 230 235 240 Tyr Ala Asp Leu Ser Leu Lys Gln Pro Arg Thr Ser Pro Gly Ser Ser 245 250 255 Trp Lys Lys Gly Ser Ser Met Ser Ser Ser Gly Lys Asp His Gln Glu 260 265 270 Glu Val Glu Tyr Val Thr Met Ala Pro Phe Pro Arg Glu Glu Val Ser 275 280 285 Tyr Ala Ala Leu Thr Leu Ala Gly Leu Gly Gln Glu Pro Thr Tyr Gly 290 295 300 Asn Thr Gly Cys Pro Ile Thr His Val Pro Arg Thr Gly Leu Glu Glu 305 310 315 320 Glu Thr Thr Glu Tyr Ser Ser Ile Arg Arg Pro Leu Pro Ala Ala Met 325 330 335 Pro <210> 2 <211> 337 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Leu Thr Leu Tyr Leu Leu Leu Phe Trp Leu Ser Gly Tyr 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Gln Ile Thr Gly Pro Thr Thr Val Asn Gly Leu Glu 20 25 30 Arg Gly Ser Leu Thr Val Gln Cys Val Tyr Arg Ser Gly Trp Glu Thr 35 40 45 Tyr Leu Lys Trp Trp Cys Arg Gly Ala Ile Trp Arg Asp Cys Lys Ile 50 55 60 Leu Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Gln Glu Val Lys Arg Asp Arg Val 65 70 75 80 Ser Ile Lys Asp Asn Gln Lys Asn Arg Thr Phe Thr Val Thr Met Glu 85 90 95 Asp Leu Met Lys Thr Asp Ala Asp Thr Tyr Trp Cys Gly Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Gly Asn Asp Leu Gly Val Thr Val Gln Val Thr Ile Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Val Thr Gln Glu Glu Thr Ser Ser Ser Pro Thr Leu Thr Gly His 130 135 140 His Leu Asp Asn Arg His Lys Leu Leu Lys Leu Ser Val Leu Leu Pro 145 150 155 160 Leu Ile Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Ala Trp Arg Met Met Lys Tyr Gln Gln Lys Ala Ala Gly Met Ser Pro 180 185 190 Glu Gln Val Leu Gln Pro Leu Glu Gly Asp Leu Cys Tyr Ala Asp Leu 195 200 205 Thr Leu Gln Leu Ala Gly Thr Ser Pro Arg Lys Ala Thr Thr Lys Leu 210 215 220 Ser Ser Ala Gln Val Asp Gln Val Glu Val Glu Tyr Val Thr Met Ala 225 230 235 240 Ser Leu Pro Lys Glu Asp Ile Ser Tyr Ala Ser Leu Thr Leu Gly Ala 245 250 255 Glu Asp Gln Glu Pro Thr Tyr Cys Asn Met Gly His Leu Ser Ser His 260 265 270 Leu Pro Gly Arg Gly Pro Glu Glu Pro Thr Glu Tyr Ser Thr Ile Ser 275 280 285 Arg Pro 290

Claims (26)

1. 포유동물 대상체에게 유효량의 CLM-1 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 탈수초성 질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체가 인간인 방법.
3. 제2항에 있어서, 탈수초성 질환이 탈수초성 자가면역 질환인 방법.
4. 제3항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 중추신경계 (CNS)에 영향을 미치는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 다발성 경화증 (MS), 재발 완화형 MS (RRMS), 원발성 및 속발성 진행형 MS, 진행 재발형 MS, 뇌척수염, 백질뇌염, 횡단성 척수염, 시신경척수염 (데빅병), 및 시신경염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 MS인 방법.
7. 제3항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 말초 신경계에 영향을 미치는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 급성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (AIDP; 길랑-바레 증후군); 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증; 항-MAG 말초 신경병증; 및 운동 및 감각 신경병증 (HMSN) (또한 유전성 감각운동 신경병증 (HSMN), 또는 비골 근육 위축, 또는 샤르코-마리-투스병이라고도 공지됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CLM-1 효능제가 효능제 항-CLM-1 항체인 방법.
10. 제약상 허용되는 부형제와 혼합된 유효량의 CLM-1 효능제를 포함하는, 탈수초성 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
11. 제11항에 있어서, 탈수초성 질환이 탈수초성 자가면역 질환인 제약 조성물.
12. 제11항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 다발성 경화증 (MS)인 제약 조성물.
13. 탈수초성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 유효량의 CLM-1 효능제의 용도.
14. 제13항에 있어서, 탈수초성 질환이 탈수초성 자가면역 질환인 용도.
15. 제14항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 다발성 경화증 (MS)인 용도.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CLM-1 효능제가 효능제 항-CLM-1 항체인 용도.
17. 탈수초성 질환을 치료하기 위한 CLM-1 효능제.
18. 제17항에 있어서, 탈수초성 질환이 탈수초성 자가면역 질환인 CLM-1 효능제.
19. 제18항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 MS인 CLM-1 효능제.
20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, CLM-1 효능제가 효능제 항-CLM-1 항체인 CLM-1 효능제.
21. CLM-1 기능 결함을 검출하는 것을 포함하는 탈수초성 질환의 진단 방법.
22. 제21항에 있어서, 탈수초성 질환이 탈수초성 자가면역 질환인 방법.
23. 제22항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 MS인 방법.
24. CLM-1 효능제 및 탈수초성 질환 치료에 대한 지침서를 포함하는 키트.
25. 제24항에 있어서, 탈수초성 질환이 탈수초성 자가면역 질환인 키트.
26. 제25항에 있어서, 탈수초성 자가면역 질환이 MS인 키트.
    

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