KR20120050540A - 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용 - Google Patents

살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용에 관한 것으로 더욱 상세하게는 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 RNA 앱타머 및 그 앱타머를 이용한 식품 등에 존재하는 살모넬라 엔타라이티디스의 검출용 조성물 및 그 검출방법 등에 관한 것이다.

Description

살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용{Aptamer specific S.Enteritidis and use of the same}
본 발명은 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용에 관한 것으로 더욱 상세하게는 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 RNA 앱타머 및 그 앱타머를 이용한 식품 등에 존재하는 살모넬라 엔타라이티디스의 검출용 조성물 및 그 검출방법 등에 관한 것이다.
기존 바이오센서 분야에서 이용되는 다양한 감지방법 중 민감도가 탁월한 것은 항체를 이용한 타깃물질의 검출 방법이다. 항체는 생체의 면역시스템을 통해 만들어지기 때문에 cell culture와 동물이 필요하고 항체를 확보를 위해 정제 과정을 거치기 때문에 제작에 많은 비용과 시간이 요구되는 것이 문제점이라고 할 수 있다. 또한 타깃물질에 있어 제약이 거의 없는 앱타머에 비해 항원으로 사용할 수 있는 타깃물질이 제한적이어서 독성물질과 같은 저분자 화학물질들에 대한 항체의 제작에 어려움이 있다. 일반적으로 항체는 그 크기가 150K Da 내외의 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 등의 바이오센서로 응용 시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있고, 화학적 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 즉 기존의 혈중 바이오마커의 진단에 있어 항체를 이용한 기술은 비용과 시간 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다.
이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타깃물질에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다.
앱타머 (Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 'fitting'의 의미를 가지는 라틴어 'aptus'에서 그 어원이 유래했다. 앱타머는 1990년에 Colorado 대학의 Larry Gold 연구팀에 의해 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 346:818-822 (1990)), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 'chemical antibody'라 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다. 먼저 앱타머의 장점들을 살펴보면 다음과 같다.
1) 항체는 분자 구조가 크기 때문에 (~150 kDa) 생산하는데 어려움이 있고 변형 (modification)또한 용이하지 못한 반면, 앱타머는 약 20~60 mer 정도 길이의 핵산으로 구성되어 있는 작은 분자 구조이고, 여러 필요한 변형이 용이한 장점을 가지고 있다.
2) 앱타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 단백질이나 항체 의약품의 경우 실온에서 보관이나 운반이 불가능하지만 앱타머는 가능하고, 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있으며, 만약 변성 (denaturation)이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생 (regeneration)이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다.
3) 항체의 경우 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 생산하는데 많은 시간과 비용이 요구되며, 또한 만든 시기에 따라 기능성이 달라질 가능성도 있다(batch to batch variation). 하지만 앱타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며 또한 고순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다.
4) 항체나 다른 의약용 단백질의 경우에 쉽게 나타나는 생체내 면역거부반응이 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며, 이는 치료용으로의 개발연구에 매우 중요한 장점이 될 수 있다.
5) 항체를 만들기 어려운 독소 (toxin), 복잡한 단백질 복합체 또는 당과 단백질 복합체에 대한 앱타머를 만들 수 있으며, 또한 새로운 물질에 대한 결합 물질로의 변형이 용이하여 (flexibility) 새로운 앱타머 발굴에 활발히 응용될 수 있다.
전세계 항체 의약품 시장을 살펴볼 때, 2007년 FDA 승인을 받은 22개의 제품이 약 248억 달러 규모를 차지하였고, 2015년에는 635억 달러 규모로 확대될 전망이다. 국내 시장 또한 2006년 300억원 규모에서 2016년 3,000억원 규모로 급성장할 것으로 전망하고 있다. 항체를 이용한 진단 시장 또한 2005년 전세계에서 약 300억달러 규모이었고, 2020년경 약 800억 달러로 전망되고 있다(항체, 치료용 항체, 단세포군 항체, 2008년 12월, 기술평가정보유통시스템;2008 대덕특구 산업시장정보: 진단시약, 2008년 12월, 대덕연구개발특구지원본부). 이런 항체를 이용한 치료 및 진단시장에 비추어 앱타머의 시장성을 가늠해 본다면 항체보다 빠른 개발 시간, 낮은 생산 비용, 적은 면역 거부반응, 안정성 등의 장점을 가지고 있는 앱타머가 앞으로 항체 시장의 일부를 대체하거나 틈새시장을 충분히 개척할 수 있을 것으로 보인다. 실제 앱타머 시장 동향을 살펴 보면 2004년에 Macugen이 출시되어 2006년에만 1억 300만 달러의 매출을 기록하여 앱타머 시장의 가능성을 보여 주었고 이후 새로운 앱타머 치료제를 개발하기 위해 대형 제약사들의 공동연구 참여가 급격히 늘어나고 있는 추세이다.
새로운 앱타머 발굴 방법은 다음과 같다.
SELEX를 통해 새로운 앱타머를 선별하는 과정을 살펴보면 먼저 (i) DNA 합성 및 in vitro transcription 방법 (RNA인 경우) 을 이용하여 다양한 형태를 가지는 핵산 라이브러리 (>1015)를 만든다. (ii) 항체가 여러 종류의 항원과 결합하는 것처럼 핵산 구조체 라이브러리 안에 있는 다양한 핵산 구조체들 (앱타머 후보 분자들)은 다양한 표적물질과 결합할 수 있는 능력을 가지고 있고 따라서 다음 과정으로 원하는 표적분자와 결합할 수 있는 핵산 구조체만을 선별하는 과정을 거치게 된다. (iii) Affinity chromatography 와 같은 방법을 통해 결합하지 않은 핵산 구조체는 제거되고(washing) 표적분자에 결합하는 것만을 선택적으로 얻을 수 있게 된다. (iv) 마지막으로 표적분자로부터 핵산 구조체를 분리(elution)하게 되고 그 핵산을 증폭시킨 후 얻은 핵산 구조체를 이용하여 다시 이 과정들을 5~15번 정도 더 반복함으로써 매우 우수한 결합력과 특이성을 보이는 앱타머를 발굴할 수 있다.
위와 같이 SELEX를 통해 얻어진 초기의 앱타머들은 더 안정적이고 강력한 앱타머로 개량하고자 하는 post-SELEX 과정을 수행하기도 한다. 대표적인 예로 RNA 앱타머의 Ribose 2'-OH를 2'-F 나 2'-NH2, 2'-O-methyl group으로 치환하는 것이다. 이런 변화를 거치게 되면 핵산 분해효소에 대한 저항성이 우수하여 blood 내에서 안정성이 10,000배 이상 증가된 앱타머를 얻을 수 있게 된다. 이 외에도 앱타머를 polyethylene glycol (PEG)과 같은 고분자나 diacylglycerol 혹은 cholesterol 을 접합시켜 blood 내에서 빠르게 clearance 되는 것을 줄일수 있다. 그리고 5'말단이나 3'말단에 biotin을 결합시킨 앱타머를 만들어 streptavidin support에 부착시켜 바이오 센서/칩 분야에서 사용될 수 있다(Dausse E. et al. Aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline, Curr. Opin. Pharmacol, 2009).
앱타머의 진단 및 센서로의 응용 가능성에 대해서 살펴보면 다음과 같다.
항체에 버금가는 표적 친화력을 가지고 있고 항체에 비해 크기가 월등히 작고 또한 다양한 표적분자들과 높은 결합력으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있는 앱타머의 진단 및 분석으로의 응용은 어찌 보면 매우 당연하다 볼 수 있다. 1997년 형광표지된 앱타머를 이용한 Human-neutrophil elastase 를 광학적으로 검출하는 앱타머 센서(aptasensor)가 처음 개발된 이후(Charlton, J. et al., In viva imaging of inflammation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elastase. Chem. Biol. 4:809-816 (1997)) 크게 (i) 앱타머와 표적분자간의 결합 전후에 나타나는 전자 전달정도를 감응하여 반응하는 전기화학적 (electrochemical) 방식의 센서, (ii) 형광물질등의 형광측정을 통한 광학적 (optical) 방식의 센서, 그리고 (iii) 표적 물질과의 결합 전후에 나타나는 질량의 차이를 분석하여 측정하는 질량 분석 (mass-sensitive) 방식의 앱타머 센서 들이 주로 개발되고 있다(Song S et al. Aptamer-based biosensors. Trends Anal. Chem, 27:108-117 (2008);Cho EJ et al. Applications of aptamers as sensors. Annu. Rev. Anal. Chem. 2:241-264 (2009)). 전기화학적 방식의 예로서 Methylene blue (MB)로 표지된 앱타머를 전극에 고정화하고 나서 표적물질과 결합을 하게 되면 앱타머의 구조 변화를 유발하면서 앱타머에 표지된 MB가 전극으로부터 멀어지게 되고 결과적으로 MB로부터의 전기화학적 신호가 줄어들게 되어 표적물질 결합 전후의 전기화학적 신호를 감지하면서 앱타머와의 결합여부를 진단할 수 있게 된다. 또한 앱타머의 hairpin-loop 구조에 chelating 되어 있던 MB가 표적물질 결합 후 나타나는 변형구조로인해 MB가 앱타머로부터 빠져나가면서 신호의 감소를 주는 label-free 방식도 있다. 또한 전극 대신 탄소 나노튜브(CNT-FET)를 사용하는 방식은 표적물질 결합 전후에 나타나는 전기전도도 (conductance)의 변화를 감응함으로써 신호를 얻을 수 있는 방식이다.
현재 앱타머 센서 개발을 진행하고 있는 회사들을 살펴보면 미국의 SomaLogic사가 변형핵산을 이용한 고효율 SELEX 기술을 이용하여 진단용 aptamer를 개발하고자 연구하고 있고, LC Science사는 앱타머를 이용한 단백질 측정용 microarray 기술을 개발하고 있다. Promega사에는 광우병 진단에 이용될 수 있는 prion detection 앱타머 기술개발을 수행 중이다. 또한 말라카이트, ATP, 에스트라다이올 등의 저분자 대사물질, 환경 또는 식품 유해물질들에 대한 앱타머 개발 연구가 현재 진행되고 있고 특히 코카인과 같은 마약류를 검출하기 위한 앱타머 센서에 대한 연구도 보고되고 있다.
살모넬라(Salmonellae)는 전세계적으로 중요한 박테라아 병원균이고 식품 매개 질병의 주된 원인이다. 2,500 종 이상의 혈청형(serovara)의 Salmonella enterica가 보고되었고, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis(S. Enteritidis)가 설사 질환 환자, 동물, 식품 및 사료로부터 분리된 최고의 혈청형(serotype)의 Salmonella이다(Chung, Y. H., 등. 2004. J Food Prot 67:264-70;Kilic, A., 등. 2010. Intern Med 49:31-6). 인간 살모넬라증(salmonellosis)은 가금, 소고기 및 돼지고기를 포함하는 생육 및 육류 가공품과 같은 오염된 식품의 소비에 의하여 주로 야기된다(Bansal, N. S., 등 2006. J Food Prot 69:282-7). 따라서 식품으로부터 살모넬라의 신속하고 정확한 동정은 식품 매개 살모넬라증의 예방에 필수적이다.
식품으로부터 살모넬라의 검출 및 동정은 주로 미생물학적 및 생화학적 동정방법에 의하여 수행되었다(Velusamy, V., 등. An overview of foodborne pathogen detection: in the perspective of biosensors. Biotechnol Adv 28:232-54). 배양 기반 방법은 전통적인 검출 방법으로 노동집약적이고 시간이 많이 소요되는 결점에도 불구하고 표준 검출 방법으로 자리 잡고 있다(Lazcka, O., 등 2007. Biosens Bioelectron 22:1205-17;Velusamy, V., 등 An overview of foodborne pathogen detection: in the perspective of biosensors. Biotechnol Adv 28:232-54).
또한 면역학-기반 방법은 항원-항체 상호작용이 관여하고, 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법은 DNA 분석이 관여하며, 이들 방법은 배양 기반 방법에 비하여 신속하고 더 민감하고 정량 및 정성 정보를 제공한다(Velusamy, V., 등 An overview of foodborne pathogen detection: in the perspective of biosensors. Biotechnol Adv 28:232-54). 그러나 전형적으로 식품에 낮은 수로 존재하는 병원균을 검출하기 위하여 초기 증식(enrichment)이 필요하고 잔류 매트릭스-관련 저해제가 검출을 저해할 수 있다. 이러한 검출 방법의 한계를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 자성 비드를 사용하여 SELEX에 의한 새로운 진단 수단으로 RNA 앱타머를 개발하고 이를 S. Enteritidis의 검출에 적용하였다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 살모넬라를 특이적으로 검출하기 위한 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 살모넬라를 특이적으로 검출하기 위한 앱타머 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라를 특이적으로 검출하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라를 특이적으로 검출하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라를 특이적으로 검출하기 위한 고상담체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 S. Enteritidis에 대하여 특이적인 앱타머를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 앱타머는 하기 (a) 또는 (b) 중의 어느 하나인 앱타머:
(a)서열번호 1의 뉴크레오타이드 서열(단 티민은 우라실로 변경되어도 됨)을 포함하고,
앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 불소원자이거나, 또는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 히드록시기이거나, 또는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 앱타머;
(b) 서열번호 1의 뉴크레오타이드(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)에 있어서, 1개 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머로서,
앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 불소원자이거나, 또는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 히드록시기이거나, 또는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 앱타머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드가 변형되어 있는 것도 본 발명의 앱타머에 포함된다.
또한 본 발명은 a) 프라이머 결합 부위를 양끝으로 하여 가운데 임의의 염기로 구성된 랜덤 RNA 라이브러리를 S.Enteritidis이 고정되어 있는 자성 비드와 반응시킨 후 S.Enteritidis과 결합하지 못한 RNA를 제거하는 단계;
b) 상기 자성비드 표면에 고정된 S.Enteritidis과 결합한 RNA를 역전사하여 DNA로 증폭한 후 인 비트로 전사를 통하여 RNA로 전환하여 RNA를 정제, 농축하는 단계;
c) 상기 얻어진 RNA 풀을 다시 S.Enteritidis이 고정되어 있는 자성비드와 반응시키는 단계를 포함하는 S.Enteritidis에 특이적으로 결합하는 앱타머의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 결합 부위는 서열번호 6 및 서열번호 7에 기재된 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 앱타머를 포함하는 S.Enteritidis 검출 및 정량용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 앱타머가 고정화된 고상 담체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼, 또는 다공질재인 것이 바람직하고, 상기 기판은 마이크로어레이용 기판인 것이 더욱 바람직하며, 일반적으로 상기 기판은 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판,유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금 기판, 은 기판 또는 알루미나 기판인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 a) 검출 표지체와 결합된 S.Enteritidis에 선택적으로 결합하는 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머와 검체 시료를 접촉시키는 단계;
b) 검출 표지체와 결합된 S.Enteritidis에 선택적으로 결합하는 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머와 대조 시료를 접촉시키는 단계;
c) 상기 a) 및 b) 단계에서 수득된 복합체를 정량 검출하는 단계; 및
d) 상기 c)단계의 결과를 비교하는 단계를 포함하는 검체 시료 내의 S.Enteritidis 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 정량 검출 방법은 효소 면역 측정법(EIA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법, 면역조직 화학적 염색법, 셀소팅(cell sorting)법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 및 금입자(gold particle) 착물법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15~약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며,
본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 76 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, post-SELEX 과정을 통해 보다 효율적인 20-30 뉴클레오티드 크기로 modification 되어 사용될 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다.
본 발명의 앱타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예, -O-CHO기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한 적어도 1종(예, 1,2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 앱타머의 일례는, 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 인터널 루프 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 부분을 포함하는 잠재적 2차 구조를 가질 수 있다.
본 명세서에서 기재된 '잠재적 2차 구조'란, 생리 조건하에서 안정적으로 존재할 수 있는 2차 구조를 말하고, 예컨대 잠재적 2차 구조를 갖는지의 여부는, 실시예에 기재한 구조 예측 프로그램에 의해 결정할 수 있다. 스템 부분이란, 2 이상의 연속하는 뉴클레오티드에서의 염기쌍(예, G-C, A-U, A-T)에 의해, 2중쇄가 형성되는 부분을 말한다. 인터널 루프 부분이란, 2개의 상이한 스템 부분 사이에서 형성되는 비스템 부분을 말한다.
헤어핀 루프 부분이란, 하나의 스템 부분에 의해 형성되는 부분 구조로서, 앱타머쇄의 5' 말단 및 3' 말단에 대하여 반대측에 형성되는 루프 부분을 말한다. 단일쇄 부분이란, 폴리뉴클레오티드쇄의 말단 부분으로서, 상기한 스템 부분, 인터널 루프 부분 및 헤어핀 루프 부분에 해당하지 않는 부분을 말한다.
본 발명의 앱타머는 또한, (a) 서열 번호 1~8 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)을 포함하는 앱타머, (b) 서열 번호 1~8 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머, (c) 상기 (a)의 복수의 연결물, 상기 (b)의 복수의 연결물, 상기 (a) 및 (b)의 복수의 연결물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결물일 수 있다. 상기 (b)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는, 수개인 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 약 30개 이하, 바람직하게는 약 20개 이하, 보다 바람직하게는 약 10개 이하, 또한 보다 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 4개, 3개, 2개 또는 1개일 수 있다. 상기 (c)에 있어서 연결은 탄댐(tandem) 결합으로써 행해질 수 있다. 또한, 연결시에 링커를 이용하여도 좋다. 링커로서는 뉴클레오티드쇄(예, 1~약 20 뉴클레오티드), 비뉴클레오티드쇄[예,-(CH2)n-링커, -(CH2CH2O)n-링커, 헥사에틸렌글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S-결합을 포함하는 링커, -CONH-결합을 포함하는 링커, -OPO3-결합을 포함하는 링커]를 들 수 있다.
상기 복수의 연결물에서의 복수란, 2 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2개, 3개 또는 4개일 수 있다. 상기 (a)~(c)에서의 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 기(예, 수소원자, 불소원자 또는-0-Me기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 앱타머에서는 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 헤어핀 루프 부분에서, 수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가가 허용될 수 있다. 예컨대 본 앱타머에서는 단일쇄 부분에 대한 수개의 뉴클레오티드의 삽입, 제1 스템 부분에 대한 수개의 뉴클레오티드의 삽입, 3' 말단의 단일쇄 부분에 대한 수개의 뉴클레오티드의 부가가 허용될 수 있다.
본 발명의 앱타머는, S.Enteritidis에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예,리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화,O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예,-NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991)Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs etal., (1973)Biochemistry 12, 5138-5145 참조).
본 발명의 앱타머는 또한, S.Enteritidis에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다.
또한 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이도록, 본 발명의 앱타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다.
연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다.
변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, Myristoyl,Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, 그 외 지질, 스테로이드,콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조.
본 발명의 앱타머는, 본 명세서중의 개시 및 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.
앱타머는, 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합, 리보오스를 이용한 소수결합 및 수소결합, 핵산염기를 이용한 수소결합이나 스태킹(stacking)결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합은 강하게, 단백질의 표면에 존재하는 리신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관련되어 있지 않은 핵산염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 핵산 염기는, 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 앱타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프 구조 등 염기쌍을 만들지 않은 구조에서도,핵산 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다. 리보오스의 2'부위의 수식에 관해서는, 드물게 리보오스의 2'부위의 관능기가 표적 분자와 직접적으로 상호 작용하고 있는 경우가 있지만, 대부분의 경우 무관계이고, 다른 수식 분자로 치환 가능하다. 이와 같이 앱타머는, 표적 분자와의 직접적인 결합에 관련되어 있는 관능기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 유지하고 있는 경우가 많다.
또한, 전체의 입체 구조가 크게 변하지 않는 것도 중요하다.
앱타머는, 통상적으로 SELEX법, 그 개량법[예컨대 Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al.,(1990) Science, 249, 505-510]을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX법으로는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머가 농축되고, 선별된다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나, 및/또는 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.
SELEX에서 얻어지는 앱타머는 표적 물질에 대하여 친화성이 높은 핵산이고, 그것은 표적 물질의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX에서 얻어지는 앱타머는 반드시 표적 물질의 기능에 작용하는 것으로는 한정하지 않는다.
앱타머는 그 프라이머 설계에 의존하여, 그 후의 최소화 작업의 용이성이 변한다. 프라이머를 잘 설계하지 않으면, SELEX에 의해 활성이 있는 앱타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그 후의 개발이 불가능해진다.
그러나 앱타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 개변이 용이하다. 앱타머는 mfold 프로그램을 이용하여 2차 구조를 쉽게 예측할 수 있으며 보다 정확한 입체 구조 분석을 위해서는 X선 해석이나 NMR 해석이 필요하다. 이러한 구조분석과 여러 앱타머 시퀀스상에서 나타나는 동일 시퀀스 영역(conserved region) 분석을 바탕으로, 특정 염기가 치환 또는 결손된 앱타머 연구 (truncation study)를 통해 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또한 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입 가능한지 어느 정도 예측할 수 있다. 이러한 연구를 통해 보다 안정적이고 강력한 앱타머를 개발할 수 있으며 앱타머의 전체 염기서열 중 결합과 관련된 중요한 부위 (binding motif)를 찾아낼 수 있다. 예측된 새로운 서열의 앱타머는 용이하게 화학 합성할 수 있고, 그 앱타머가 활성을 유지하고 있는지의 여부를 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 앱타머의 표적 물질과의 결합에 중요한 부분이, 상기와 같은 시행 착오를 반복함으로써 특정할 수 있는 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하여도, 대부분의 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것이 아니다.
변형에 관해서도 서열과 마찬가지로 고도로 설계 또는 개변이 가능하다.
이상과 같이, 앱타머는 고도로 설계 또는 변형이 가능하다. 본 발명은 또한, 소정의 서열(예, 스템 부분, 인터널 루프 부분, 헤어핀 루프 부분 및 단일쇄 부분으로부터 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라서 고정 서열로 생략함)을 포함하는 앱타머를 고도로 설계 또는 개변 가능한 앱타머의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 S.Enteritidis의 검출에 사용될 수 있는 RNA 앱타머를 선택하여 평가하였다.
자성 비드를 사용한 지수증식에 의한 리간드의 계통적 진화(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment;이하,‘SELEX’라 함)는 랜덤(N40) 서열을 포함한 RNA 앱타머 라이브러리로부터 S. Enteritidis에 선택적으로 결합할 수 있는 RNA 앱타머의 선택에 적용되었다. 가장 높은 친화 앱타머는 형광 마이크로플레이트 리더를 사용한 검출을 위해서 5‘에 fluorescein maleimide로 표지하여서 선택되었다. The 10th 라운드 풀(pool)은 다른 라운드 풀에 비하여 S. Enteritidis에 대하여 더 높은 친화도를 가졌다. 그 10th 라운드의 고농도 RNA 풀로부터 동정된 25개 서열들을 RNA 서열의 호모로지에 기초하여서 6개 계열로 나누었다. S. Enteritidis에 대하여 특이적인 그룹 6의 RNA 앱타머가 가장 높은 형광 강도를 나타내었다. 가장 높은 친화도 및 특이성을 가지는 RNA 앱타머 서열과 식품으로부터 검출하기 위한 RNA 앱타머의 적용가능성을 연구하였다.
본 발명의 S. Enteritidis에 대하여 특이적인 앱타머는 여러 검출 방법에 적용될 가능성을 나타내었다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 앱타머는 SE 이외에 다른 살모넬라 또는 비-살모넬라 박테리아에 결합되지 아니하여 식품이나 환경 샘풀과 같은 시료 중에 오염된 SE를 선택적으로 검출할 수 있으며, 혈청타이핑에 대한 O 및 H 항혈청이 대안적인 수단일 수 있다.
도 1은 MEME 온 라인의 소프트웨어에 의하여 분석된 10th 라운드로부터 유래한 22개 서열의 공통 모티프(도 1a) 및 그 공통 모티프에 기반한 6개 그룹 (도 1b)을 나타낸 그림이다.
도 2는 각 라운드의 증가된 앱타머 풀(도 2a) 6 그룹들의 앱타머 후보들(도 2b), 및 Salmonella Enteritidis에 대한 7개 앱타머 후보들(도 2c)의 친화도를 나타낸 그림이다. Fluoro-표지된 앱타머(3μg) 및 음성 대조군으로 결합 버퍼를 상온에서 30분간 108 CFU 의 SE와 배양하였다. 형광은 형광 마이크로플레이트 리더로 검출하였다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에 사용된 박테리아 균주들
미국 Food and Drug Administration (FDA, College Park, MD, USA)으로부터 확보한 Salmonella enterica subsp. enterica serotype Enteritidis (S. Enteritidis,SE)의 10 균주의 스톡 배양물은 포지티브 선택을 위해서 tryptic soy broth (TSB, Difco laboratory, Detroit, MI, USA)에서 37℃에서 오버나잇 배양하여 준비하였다. 또한 S. Enteritidis를 제외한 Salmonella spp. 및 다른 주된 식품-매개 박테리아(표 1)를 카운터 선택을 위해서 사용하였다. 생존 S. Enteritidis를 인산 버퍼 식염수(PBS, pH 7.2)에서 오버나잇배양을 연속적으로 희석(10배)하고 100 ul의 그 희석물을 플레이팅하여서 얻었다. 그 후 그 플레이트들을 37℃에서 오버나잇 배양하고 생존 세포 카운트를 수행하였다 .
실시예 1:랜덤 RNA 라이브러리의 제조
Jang 등(Jang, K. J., 등 2008. Biochem Biophys Res Commun 366:738-44.)의 기존 연구에 기재된 것과 같이 인 비트로 전사에 의해서 RNA 라이브러리를 제조하였다. 40 랜덤 뉴크레오타이드를 포함하는 서열 5’-GATAATACGACTCACTATAGGGTTCAC TGCAGACTTGACGAAGCTT(서열번호 2)-N40-AATGGATCCACATCTACGAATTC3’(서열번호 3)를 가지는 단일 가닥 DNA로 DNA 주형을 합성하였다. 그 DNA 주형을 T7 프로모터를 포함하는 포워드 프라이머(밑줄 서열) (5’-GATAATACGACTCACTATAGGGTTCACTGCAGACTTGACGAA-3’)(서열번호 4) 및 리버스 프라이머(5’-GAATTCGTAGATGTGGATCCATT-3’)(서열번호 5)로 인비트로 전사를 위하여 증폭하였다. 랜덤 라이브러리 및 프라이머들은 COSMO (대한민국, 서울시, 성동구 소재)에 의하여 합성하였다. PCR 반응을 위해서, DNA 주형(0.5mM)을 PyrobestTMDNApolymerase(5U/μl,0.5μl), 10X PyrobestTM buffer II(TakaraBioInc.,Otsu,Shiga,Japan),1μM의 각 프라이머 및 dNTP 혼합물(각 2.5mM)로 구성된 100 μl의 PCR 혼합물에 첨가하였다 . 그 혼합물을 처음에는 98℃에서 5분간 변성하고, 다음 40 사이클의 98℃에서 10초간, 60℃에서 30 초간 그리고 72℃에서 1분간을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간의 연장을 수행하였다. 그 증폭된 DNA를 페놀과 클로로폼으로 정제하고 200 ul 반응 혼합물(10 ug DNA, 20 μl의 10 mM NTP, 10ul의 100 mM DTT, 5 X transcription 및 T7 RNA polymerase(50 U/μl, 4 μl) [Invitrogen Co. Carlsbad, CA, USA])에서 37℃에서 2시간 동안 T7 RNA 중합효소로 전사하였다. 그 생성된 RNA 주형은 10 % Urea-변성 젤에서 젤-정제하였다. 그 생성된 RNA의 서열은 5’-GGGUUCACUGC AGACUUGACGAAGCUU(서열번호 6)-N40-AAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC-3’(서열번호 7)이다. 그 DNA 및 RNA 주형을 UV 분광계, NanoDrop 2000 (Thermo scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여, 260 nm에서 정량하였다.
실시예 2:자성- 비드 기반 SELEX 방법
TSB에서 SE (approximately 109CFU/ml)의 오버나잇 배양물을 인산 버퍼 식염수(PBS,pH7.5)로 3회 세척하였다. SE를 제조업자(Dynal,LakeSuccess,NY,USA)의 지시에 따라 Dynabeadsanti-Salmonella에 컨쥬게이트시켰다. 요약하면, 1mL의 SE 배양물을 에펜도르프 튜브 내의 20μl DynabeadsSalmonella에 혼합하고 20분간 상온에서 배양하였다.
마그네틱 농축기(Dynal MPC®-S: Dynal)의 사용으로 분취량(aliquot)으로부터 분리한 후, 그 비드들을 0.05% Tween 20 (PBST)를 포함한 1ml의 PBS로 세척하고, 다시 분리한 다음 1 ml PBST에 재부유하였다. 그 분리 단계들을 3회 반복하였고 트리톤X100으 포함하는 1ml의 바인딩 버퍼(0.5M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5~7.6, 1mM MgCl2 with 0.1%)에서 재부유하였고, 마그네틱 농축기로 수집하였다. SE-마그네틱 비드들을 바인딩 버퍼에서 3회 이상 세척하고 사용시까지 4℃에서 저장하였다.
오리지널 랜덤 RNA 라이브러리(약 6 ㎍)을 동일 부피의 2X 바인딩 버퍼에 첨가하고 상온에서 30분간 SE-마그네틱 비드로 배양하였다. 그 후에 그 앱타머-SE-마그네틱 비드들을 마그네틱 농축기를 사용하여 1ml의 1X 바인딩 버퍼에서 3회 세척하였다. 앱타머-SE-마그네틱 비드들로부터 바인딩 버퍼를 완전하게 제거한 후, 역전사-PCR (RT-PCR)을 100 ㎕의 RT-PCR 혼합물을 첨가하여 그 마그네틱 비드 표면으로부터 직접 수행하였다. 그 RT-PCR 혼합물은 1μM의 각 프라이머들, 및 dNTP 혼합물(각 10 mM), 5X Qiagen®OneStep RT-PCR 버퍼 및 2㎕의 Qiagen®OneStep RT-PCR 효소 믹스 및 RNase-없는 물을 포함한다. PCR 후, 마그네틱 농축기로 분리된 PCR 산물들을 ㅍ페놀과 클로로포름으로 정제하고 다음 라운드를 위하여 T7 RNA polymerase로 전사하였다. 10 회 반복의 SELEX, 마그네틱 비드에 대한 카운터-SELEX, 중에서 SE를 제외한 Salmonella spp. 및 다른 식품매개 박테리아들(표 1)은 연속적으로 두번째 라운드로부터 수행되었다. 또한 SE-마그네틱 비드의 부피는 전체 10라운드의 SELEX를 통해서 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 및 1/50로 감소하였다.
Figure pat00001
표 1은 카운터 선택으로 사용된 S. Enteritidis를 제외한 Salmonella spp에 대한 RNA 앱타머의 배제성 결과를 나타낸 표이다.
Strains Result
Escherichia coli O157:H7 -
Listeria monocytogenes -
Cronobacter sakazakii -
Stapylococcus aureus -
Bacillus cereus -
Citrobacter freundii -
Proteus mirabilis -
Serratia marcescens -
Serratia odorifera I -
Enterobacter aerogenes -
Enterobacter agglomerans -
Enterobacter Cloacae -
표 2는 카운터 선택으로 사용된 비 -살모넬라 균주에 대한 RNA 앱타머의 배제성 결과를 나타낸 표이다.
실시예 3:후보 앱타머들의 클로닝 및 시퀀싱
fluoro-표지된 풀(pool) 결합 어세이 후, 10번째 라운드 풀의 cDNA를 pCRII-TOPO 벡터(Invitrogen co.)에 클로닝하였다. 서브클로닝과 대장균에 형질전환 후, 플라즈미드 DNA를 각 클론으로부터 분리하고 클론들의 DNA 서열을 COSMO에 의하여 분석하였다. 그 호모로지 및 공통 모티프를 MEME 온 라인의 소프트웨어(http://meme.sdsc.edu/meme/intro.html)로 분석하였다.
실시예 4: Fluoro - 표지된 앱타머 결합 분석
각 라운드의 풍부한 풀인 오리지널 라이브러리 시퀀싱된 앱타머 후보들을 제조업자의 지시(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 따라서 5'EndTagTM Nucleic Acid Labeling System에 의해서 fluoro-표지하였다. Fluoro-표지된 앱타머(3μg) 및 음성 대조군으로 바인딩 버퍼를 500 ml의 바인딩 버퍼에서 상온에서 30분간 108 CFU의 SE로 배양하였다. 원심분리 후, 박테리아 침전물을 1 ml의 PBS로 3회 세척하였다. 박테리아 펠렛을 200 ml의 PBS으로 재부유하고 Corning®96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates (Corning Korea Company, Ltd., Gangnam-Gu, Seoul, Korea)에 옮겼다. 형광을 495 nm 방출 파장 및 515 nm 여기 파장 세트에서 GeminiTM EM Fluorescence Microplate Reader (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 시퀀싱된 앱타머 후보들의 포괄성(inclusivity) 및 배타성(exclusivity)을 이 방법에 의하여 테스트하였다.
실시예 5: 유세포분석기 분석( Flow cytometry analysis )
fluoro-표지된 앱타머들(각 240nM)을 상온에서 30분간 500 ml의 스크리닝 버퍼에서 107 박테리아와 배양하였다. 그 후 박테리아를 1ml의 PBST로 세척하고 300 ml PBS에 재부유하였다. 박테리아의 형광 강도를 30 000 이벤트를 카운팅하여서 FACSCalibur cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)로 모니터하였다. FITC-표지된 원래 라이브러리는 네가티브 대조군으로 작용하였다. 그 결과들을 FCS 익스프레스 V3 소프트웨어에 의하여 분석하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
S. Enteritidis 에 대한 RNA 앱타머의 인 비트로 선택
SE에 대한 고 친화도 RNA 앱타머의 분리를 위한 SELEX 방법을 사용하기 위하여, 40-머의 랜덤 코어 서열을 포함하는 RNA 라이브러리 풀(~1014 분자들)을 만들었다. SE에 특이적으로 결합하는 앱타머들을 분리하기 위하여, 3번째 라운드에서 마그네틱 비드에 결합하는 RNA들 및 여섯번째 라운드로부터 다른 병원균을 제거하기 위해서 카운터-선택(negative-selections)을 수행하였고 그 농도는 5번째 라운드 후에 시켰다. 선택의 10 라운드를 수행하였다. 각 라운드의 SELEX 후, RT-PCR 산물의 크기는 109 bp이었고, 인 비트로 전사에서 RNA 산물은 90 bp이었다(데이터 도시 안함).
SE 에 대한 앱타머 후보의 친화도 결정
선택 풀들(pools)의 증식성(enrichment)는 fluoro-표지된 앱타머 결합 어세이에 의하여 모니터되었다. 4번째에서 6번째 라운드의 친화도는 SELEX 방법을 통해서 증가하였고, 7번째 라운드는 감소된 형광을 나타내었다(도 2a). 그러나 형광은 8번째 라운드 후에 점차적으로 증가하였고, 최종 10번째 라운드 풀에서 SE에 대하여 가장 높은 친화도를 나타내었다(도 2a).
10번째 cDNA 풀을 pCRII-TOPO 벡터로 클로닝하고 30 형질전환된 클론들을 선택하여서 그들의 서열을 결정하였다. 22 후보 서열들을 MEME 온 라인 소프트웨어에 공통 모티프에 기반한 6 그룹들로 나누었다(도 1). 6그룹들의 친화도를 fluoro-표지된 앱타머 결합 분석으로 결정하였다(도 2b). 그룹 6은 다른 그룹들의 약 15배 이상의 가장 높은 형광을 나타내었다. 또한 그룹 3은 다른 그룹들에 비하여 비교적 높은 친화도를 나타내었다(도 2b).
그룹 6의 앱타머들(S1, S6, S19, 및 S25) 및 그룹 3의 앱타머들(S11, S22, 및 S24)를 SE에 대한 그들의 친화도를 비교하고 더 조사를 위하여 선택하였다(도 2c). S24 및 S25 앱타머들이 더 높은 형광도를 나타내었고, 따라서 더 높은 결합 능력을 나타내었다. 실제 앱타머 RNA 서열은 서열번호 1과 같다.
선택된 앱타머들의 민감도 및 선택성의 결정
선택된 앱타머 후보인 S24 및 S25를 fluoro-표지된 앱타머 결합 어세이에 의하여 SE에 특이적인지를 결정하였다. S24 앱타머는 E. coli O157:H7에 교차반응을 보였으나(데이터는 도시 안함). S25 앱타머는 다른 Salmonella spp. 및 비-Salmonella 균주와 교차 반응성 없이 SE에 특이적으로 결합하였다(표 1 및 2 참조).
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Aptamer specific S.Enteritidis and use of the same <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 90 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer <400> 1 ggguucacug cagacuugac gaagcuugag agaugccccc ugaugugcau ucuuguugug 60 uugcggcaau ggauccacau cuacgaauuc 90 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 2 gataatacga ctcactatag ggttcactgc agacttgacg aagctt 46 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA <400> 3 aatggatcca catctacgaa ttc 23 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gataatacga ctcactatag ggttcactgc agacttgacg aa 42 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaattcgtag atgtggatcc att 23 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA <400> 6 ggguucacug cagacuugac gaagcuu 27 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA <400> 7 aauggaucca caucuacgaa uuc 23

Claims (9)

  1. 살모넬라 엔타라이티디스(S.Enteritidis)에 대하여 특이적인 앱타머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 앱타머는 하기 (a) 또는 (b) 중의 어느 하나인 앱타머:
    (a)서열번호 1의 뉴크레오타이드 서열(단 티민은 우라실로 변경되어도 됨)을 포함하고,
    앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
    (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 불소원자이거나, 또는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
    (ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 히드록시기이거나, 또는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 앱타머;
    (b) 서열번호 1의 뉴크레오타이드(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)에 있어서, 1개 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머로서,
    앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,
    (i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 불소원자이거나, 또는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,
    (ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 히드록시기이거나, 또는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 앱타머.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드가 변형되어 있는 것인 앱타머.
  4. a) 프라이머 결합 부위를 양끝으로 하여 가운데 임의의 염기로 구성된 랜덤 RNA 라이브러리를 S.Enteritidis이 고정되어 있는 자성 비드와 반응시킨 후 S.Enteritidis과 결합하지 못한 RNA를 제거하는 단계;
    b) 상기 자성비드 표면에 고정된 S.Enteritidis과 결합한 RNA를 역 전사하여 DNA로 증폭한 후, 인 비트로 전사를 통하여 RNA로 전환하여 RNA를 정제, 농축하는 단계; 및
    c) 상기 얻어진 RNA 풀을 다시 S.Enteritidis이 고정되어 있는 자성비드와 반응시키는 단계를 포함하는 S.Enteritidis에 특이적으로 결합하는 앱타머의 제조 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 프라이머 결합 부위는 서열번호 6 및 서열번호 7에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는 S.Enteritidis에 특이적으로 결합하는 앱타머의 제조 방법.
  6. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머를 포함하는 S.Enteritidis 검출 및 정량용 조성물.
  7. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머가 고정화된 고상 담체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼, 또는 다공질재인 고상 담체.
  9. a) 검출 표지체와 결합된 S.Enteritidis에 선택적으로 결합하는 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머와 검체 시료를 접촉시키는 단계;
    b) 검출 표지체와 결합된 S.Enteritidis에 선택적으로 결합하는 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머와 대조 시료를 접촉시키는 단계;
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 수득된 복합체를 정량 검출하는 단계; 및
    d) 상기 c)단계의 결과를 비교하는 단계를 포함하는 검체 시료 내의 S.Enteritidis 검출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101437492B1 (ko) * 2012-12-11 2014-09-12 한양대학교 산학협력단 살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
KR101448360B1 (ko) * 2012-12-11 2014-10-08 한양대학교 산학협력단 살모넬라 티피뮤리엄 특이적 검출용 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
KR101459547B1 (ko) * 2012-11-20 2014-11-12 대한민국 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법

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