KR20120034444A - Lactobacillus gasseri hy7021 having inhibitory activity against adipocyte-specific gene expression and adipocyte differentiation, and product containing thereof as an effective factor - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 3T3-L1 지방세포 분화 유도에 관여하는 대표적인 유전자인 PPARγ2(peroxisome proliferator activated receptor gamma 2), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-alpha), FAS(fatty acid synthase), FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 및 단백질 발현을 억제함으로써 궁극적으로 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품에 관한 것이다.
The present invention, Lactobacillus gasseri ( Lactobacillus gasseri ) having the effect of inhibiting the expression of genes involved in the induction of adipocyte differentiation ( Lactobacillus gasseri ) HY7021 and pharmaceutical compositions containing the same as an active ingredient, fermented milk, beverages, health functional foods More specifically, peroxisome proliferator activated receptor gamma 2 (PPARγ2), C / EBPα (CCAAT / enhancer binding protein-alpha), and FAS (fatty acid synthase), which are representative genes involved in inducing 3T3-L1 adipocyte differentiation , Lactobacillus gasseri HY7021 having the inhibitory effect of 3T3-L1 adipocyte differentiation by inhibiting the expression of mRNA and protein of FABP4 (fatty acid binding protein 4) and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient, fermented milk , Beverages and dietary supplements.
3T3-L1 세포는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)로서 지방 조직의 생물학적 연구에 많이 사용되는 세포 주(cell line)이다. 3T3-L1 마우스 배아 섬유아세포에 인슐린과 같은 호르몬을 처리하면 지방 합성 신호 경로가 활성화되면서 세포 내 지방량이 증가하고 세포의 모양이 원형으로 변한다. 이처럼 세포 내 신호경로와 세포의 모양이 변하는 과정을 분화(differentiation)라고 하고, 분화가 진행 중인 3T3-L1 세포를 '성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)', 분화가 완료된 3T3-L1 세포를 '성숙된 3T3-L1 지방세포(mature 3T3-L1 adipocyte)'라고 한다.3T3-L1 cells are mouse embryonic fibroblasts and are a popular cell line for biological studies of adipose tissue. Treatment of insulin-like hormones with 3T3-L1 mouse embryonic fibroblasts activates the fat synthesis signaling pathway, increasing intracellular fat mass and altering the shape of the cells. This process of changing the intracellular signaling pathway and the shape of the cells is called differentiation, and differentiation of 3T3-L1 cells into 'maturation 3T3-L1 pre-adipocyte', differentiation The completed 3T3-L1 cells are called 'mature 3T3-L1 adipocytes'.
이러한 3T3-L1 세포의 지방분화를 억제하는 물질을 탐색하는 연구가 각국에서 진행되고 있다. 예를 들어, 녹차 폴리페놀 성분인 epigallocatechin gallate (Obesity res. 2005;13:982-90), 적포도주 성분인 resveratrol(Phytother Res. 2008;22:1367-71), 마늘 성분인 ajoene(Phytother Res. 2009;23:513-8) 등이 3T3-L1 세포의 지방분화 억제 효능을 가지고 있다는 연구결과가 보고된 바 있다. 3T3-L1 세포의 지방분화를 억제하는 물질은 항비만 효능을 가진다고 볼 수 있기 때문에 식품, 의약 등의 분야에서 활용도가 매우 크다.Researches to search for substances that inhibit the differentiation of these 3T3-L1 cells are in progress in each country. For example, epigallocatechin gallate (Obesity res. 2005; 13: 982-90), a green tea polyphenol component, resveratrol (Phytother Res. 2008; 22: 1367-71), a red wine component, and ajoene (Phytother Res. 2009), a garlic component. ; 23: 513-8) and the like have been reported to have the effect of inhibiting the differentiation of 3T3-L1 cells. Substances that inhibit the differentiation of 3T3-L1 cells can be considered to have anti-obesity effects, so they are very useful in the fields of food and medicine.
비만은 아직도 원인이 명확히 밝혀지지 않은 여러 가지 요인들에 의해서 복합적으로 발생하는 만성적인 질환으로 알려져 있다. 비만은 고혈압, 당뇨, 심혈관 질환, 담석, 골관절염, 수면 무호흡증(sleep apnea), 호흡장애, 자궁내막, 전립선, 유방 또는 대장암 등을 유발하는 요인이 되고 있다.Obesity is still known as a chronic disease that is caused by a combination of factors that are still unclear. Obesity is a cause of hypertension, diabetes, cardiovascular disease, gallstones, osteoarthritis, sleep apnea, respiratory disorders, endometrium, prostate, breast or colon cancer.
비만의 치료방법은 크게 식이-운동요법, 수술 요법 및 약물 요법이 있다. 식이-운동 요법은 저칼로리-저지방 섭취와 산소를 소비하는 육체의 활동을 통한 치료 방법인데, 이는 인내심을 가지고 반복적, 지속적으로 수행되어야 하기 때문에 대중적인 효과를 보기는 어려운 것으로 인식되고 있다. 수술요법은 외과적 수술을 통해 체지방을 물리적으로 제거하는 방법으로서 단기간에 효과를 볼 수 있는 장점이 있지만, 수술을 해야 하는 점, 효과의 지속성이 없다는 점, 비용이 많이 든다는 점 등 때문에 제한적으로 활용되고 있다. 약물 요법은 식욕 감소를 유발하거나 지방 흡수를 억제하는 약제들을 이용해서 비만을 치료 또는 예방하고자 하는 방법이다. 현재까지 개발된 비만 예방 및 치료를 위한 약제는 다양한 생리학적 메카니즘을 가지고 있다.Treatments for obesity are largely diet-exercise therapy, surgical therapy and drug therapy. Diet-exercise therapy is a therapeutic method through low calorie-low fat intake and physical activity that consumes oxygen, and it is recognized that it is difficult to see the public effect because it must be carried out repeatedly and continuously with patience. Surgical therapy is a method of physically removing body fat through surgical surgery, which has the advantage of being effective in a short period of time, but it is limited in use due to the need for surgery, insufficiency of effect, and cost It is becoming. Drug therapy is a method to treat or prevent obesity using agents that cause decreased appetite or inhibit fat absorption. The drugs for preventing and treating obesity developed to date have various physiological mechanisms.
지방의 흡수 억제 약물로서는 췌장 지방 분해 효소 방해제(Orlistat)가 알려져 있는데, 췌장 지방분해 효소의 작용을 억제함으로 지방의 흡수를 감소시키는 약제이나 지용성 비타민의 흡수를 방해하며, 유방암 유발의 가능성이 있다.Pancreatic lipase inhibitors (Orlistat) are known as inhibitors of fat absorption, which inhibits the action of pancreatic lipase and thus inhibits the absorption of drugs or fat-soluble vitamins, which may cause breast cancer. .
식욕을 저해하는 약제는 주로 뇌에 존재하는 신경전달물질(catecholamines)에 작용하여 식욕을 저하시킨다. 그러나 덱스펜플루르아민, 펜플루르아민은 신경독성, 판막성 심장질환의 부작용이 있고, 시부트라민은 심박수와 혈압을 상승시키는 부작용이 있다.Appetizers that inhibit appetite mainly affect neurotransmitters (catecholamines) present in the brain, which reduces appetite. However, dexfenfluramine and fenfluramine have side effects of neurotoxicity and valve heart disease, and sibutramine has side effects of increasing heart rate and blood pressure.
이에 반해 안전한 미생물로 여겨져 온 유산균을 이용하여 비만을 예방 또는 치료하고자 하는 노력 역시 많이 이루어지고 있다. 유산균은 장내 정상균총의 유지, 장내 균총의 개선, 항당뇨 및 항고지혈증 효과, 발암 억제, 대장염 억제, 그리고 숙주의 면역체계의 비특이적 활성 등의 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 그 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래 전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다.
On the other hand, efforts to prevent or treat obesity have also been made using lactic acid bacteria, which have been considered safe microorganisms. Lactobacillus has been reported to show the effects of maintaining normal intestinal flora, improving intestinal flora, antidiabetic and antihyperlipidemic effects, inhibiting carcinogenesis, inhibiting colitis, and nonspecific activity of the host's immune system. Among them, the strain Lactobacillus is a major member of the normal microbial community in the intestine of the human body, which has long been known to be important in maintaining a healthy digestive system and the vaginal environment, and the US Public Health Service guidelines. ), All of the Lactobacillus strains currently deposited with the American Strain Deposit Agency (ATCC) are classified as 'Bio-safty Level 1', which is not known for any potential risk of causing disease in humans or animals. .
락토바실러스 균주의 항비만 효능 기전으로서 adiponectin 분비 촉진, 교감신경 자극에 의한 에너지 소비 촉진, 포만감 유발 등이 지금까지 알려져 있다. 하지만 락토바실러스 균주가 3T3-L1 지방 세포 내 지방 대사 관련 유전자들의 발현을 어떻게 조절하는지에 대한 연구는 미비한 실정이다.
The mechanism of anti-obesity of Lactobacillus strains is known to promote adiponectin secretion, to promote energy consumption by sympathetic stimulation, to induce satiety. However, studies on how the Lactobacillus strain regulates the expression of fat metabolism related genes in 3T3-L1 adipocytes are insufficient.
이에 본 발명자들은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021이 3T3-L1 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자들의 mRNA 및 단백질 발현을 억제함으로써 궁극적으로 3T3-L1 지방세포 분화를 억제한다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors have discovered that Lactobacillus gasseri HY7021 inhibits mRNA and protein expression of genes involved in inducing 3T3-L1 adipocyte differentiation, thereby ultimately inhibiting 3T3-L1 adipocyte differentiation. To complete.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 지방세포 분화 유도 유전자 발현을 억제함으로써 궁극적으로 지방세포 분화를 억제하는 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
The present invention has been made to solve the above problems, Lactobacillus gasseri ( Lactobacillus gasseri ) HY7021 having the effect of ultimately inhibiting adipocyte differentiation by inhibiting adipocyte differentiation induction gene expression and containing it as an active ingredient To provide a pharmaceutical composition, fermented milk, beverages, health functional food.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3T3-L1 지방세포 분화 유도에 관여하는 대표적인 유전자인 PPARγ2(peroxisome proliferator activated receptor gamma 2), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein-alpha), FAS(fatty acid synthase), FABP4(fatty acid binding protein 4)의 mRNA 및 단백질 발현을 억제함으로써 궁극적으로 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021을 제공하는 것을 특징으로 한다.
In order to achieve the above object, the present invention is a representative gene involved in inducing 3T3-L1 adipocyte differentiation, PPARγ2 (peroxisome proliferator activated receptor gamma 2), C / EBPα (CCAAT / enhancer binding protein-alpha), FAS (fatty) It is characterized by providing Lactobacillus gasseri HY7021, which ultimately inhibits 3T3-L1 adipocyte differentiation by inhibiting the expression of acid synthase), mRNA and protein expression of FABP4 (fatty acid binding protein 4).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 국내 가정에서 제조한 김치를 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양한 후, 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천 평판배지에 도말하고 37%에서 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 형성된 균락 중에서 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효능을 가지는 균주를 분리하였다.
In order to isolate the strain according to the present invention, kimchi prepared in domestic homes in a liquid medium containing MRS (MRS) containing 0.02% sodium azide (MRS) incubated for 24 hours at 37 ℃, 10μl platinum The culture medium was taken using and smeared again on MLS agar plate medium containing 0.02% sodium azide and incubated for 48 hours at 37%. A strain having 3T3-L1 adipocyte differentiation inhibitory effect was isolated from the colonies thus formed.
이렇게 분리한 균주의 관찰은 MRS 한천평판배지에서 37℃로 48시간 배양한 후 그람염색(Cowan, 1974)을 통하여 분리 균주의 크기와 형태를 광학 현미경(SAMWON, CSB-FEI)으로 관찰하였으며, 분리한 균주의 생화학적 특성은 Cowan과 Steel(1984) 그리고 Macfaddin(1984)의 방법에 따라 균주의 특성을 조사한 후 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology와 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology에 준하여 분류 및 동정하였다. 카탈라제(Catalase) 테스트는 3% 과산화수소를 첨가한 후 산소 발생유무를 관찰하였고, 옥시다제(Oxydase)테스트는 1% dimethyl-p-phenylenediamine gydrochloride를 넣고 변색 여부를 관찰하였다.
Observation of the isolated strains was incubated for 48 hours at 37 ℃ in MRS agar plate medium and the size and shape of the isolated strains were observed by light microscopy (SAMWON, CSB-FEI) through Gram staining (Cowan, 1974). The biochemical characteristics of a strain were classified and identified according to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology after the characteristics of the strains were investigated according to the methods of Cowan, Steel (1984) and Macfaddin (1984). Catalase test was used to observe the presence of oxygen after adding 3% hydrogen peroxide. Oxidase test was carried out by adding 1% dimethyl-p-phenylenediamine gydrochloride to observe discoloration.
따라서, 본 발명에 따른 신규의 유산균의 특성은 다음과 같다.Therefore, the characteristics of the novel lactic acid bacteria according to the present invention are as follows.
1)균의 형태1) Form of bacteria
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성Characteristics of Bacteria When incubated in MRS Agar Plate Medium at 37 ° C for 2 Days
①세포의 형태: 간균① Cell Type: Bacillus
②운동성: 없음② Mobility: None
③포자형성능: 없음③ Sporulation ability: None
④그람(Gram) 염색: 양성
④Gram staining: positive
2)생리적 성질2) physiological properties
①생육온도: 생장가능 생육온도: 20~45℃① Growth temperature: Growth possible Growth temperature: 20 ~ 45 ℃
최적 생장온도: 36~38℃Optimum growth temperature: 36 ~ 38 ℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH: 5.0~7.5② Growth pH: Growth possible Growth pH: 5.0 ~ 7.5
최적 pH: 6.0~6.5Optimum pH: 6.0-6.5
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
③ Effects on oxygen: anaerobic anaerobic
3)카탈라제: -3) Catalase:-
4)가스형성여부: -4) Whether gas is formed:-
5)15℃에서 생육: -5) Growth at 15 ℃:-
6)45℃에서 생육: +6) Growth at 45 ℃: +
7)인돌생산: -7) Indole Production:-
8)젖산생산: +8) lactic acid production: +
9)당 발효 실험 및 동정9) sugar fermentation experiment and identification
Biomerieux 사의 API 50CHL kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 표 1과 도 1에 나타내었다.
The results of the sugar fermentation experiment using the API 50CHL kit of Biomerieux are shown in Table 1 and FIG. 1.
10) 16s rRNA 동정10) 16s rRNA Identification
본 발명의 균주를 동정하기 위해 16s rRNA 유전자를 PCR 하였다. 이때 전진 프라이머 염기서열은 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 후진 프라이머 염기서열은 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'인 것을 사용하였다. 16s rRNA 유전자 염기서열에 근거하여 본 발명의 균주를 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)로 동정하였고, 본 발명자들은 이를 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021로 명명하고, 2010.07.05.자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(기탁번호: KCTC 11722BP)에 기탁하였다.
To identify the strain of the present invention, 16s rRNA gene was PCR. At this time, the forward primer base sequence was 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ', the reverse primer base sequence was used 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'. 16s rRNA gene was identified the strain of the present invention on the basis of the nucleotide sequence as Lactobacillus biasing Li (Lactobacillus gasseri), the inventors ended Li (Lactobacillus this Lactobacillus gasseri ) was named HY7021 and was deposited with Korea Biotechnology Research Institute (Accession No .: KCTC 11722BP), an international depository institution, on July 5, 2010.
한편, 본 발명의 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제재화하여 사용될 수 있다.On the other hand, the pharmaceutical composition containing Lactobacillus gaseri HY7021 having the effect of inhibiting adipocyte differentiation by inhibiting the expression of genes involved in the induction of adipocyte differentiation of the present invention as an active ingredient is an excipient used alone or pharmaceutically. It can be used by formulating together in the form of tablets, capsules and the like according to the method commonly used pharmaceutically.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.For humans, typical daily dosages can range from 1-30 mg / kg body weight, and can be administered once or in divided doses. However, the actual dosage should be determined in light of several relevant factors such as the route of administration, age, sex, weight, health status and severity of the disease.
물론, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
Of course, the pharmaceutical composition of the present invention is a drug that can be used with confidence even when taken for a long time because there is little toxicity and side effects.
또한, 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 발효유는 유산균 배양액, 락토바실러스 가세리 HY7021 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 제조한다.
In addition, the fermented milk containing Lactobacillus gaseri HY7021, which has the effect of inhibiting adipocyte differentiation by inhibiting the expression of genes involved in the induction of adipocyte differentiation, as an active ingredient, has a certain ratio of lactic acid bacteria culture medium, Lactobacillus gaseri HY7021 and mixed fruit syrup. After homogeneous at 150bar in combination with the cooling to 10 ℃ or less and prepared by packaging in a container.
또한, 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 가세리 HY7021 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조한다.
In addition, a beverage containing Lactobacillus fern HY7021 as an active ingredient, which inhibits the expression of a gene involved in inducing adipocyte differentiation, as an active ingredient, has a ratio of mixed juice syrup, Lactobacillus fern HY7021 and water at a constant ratio. The mixture is homogenized at 150 bar, cooled to 10 ° C. or lower, and then packaged in a small packaging container such as a glass bottle or a plastic bottle.
또한, 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 상기 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
In addition, a dietary supplement containing Lactobacillus gasteria HY7021 as an active ingredient, which inhibits the expression of genes involved in inducing adipocyte differentiation, as an active ingredient, is supplemented with nutrition other than the Lactobacillus gasteria HY7021. As ingredients, vitamins B1, B2, B5, B6, E and acetate esters, nicotinic acid amides, oligosaccharides and the like may be added, and other food additives may be added.
본 발명에 따른 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021은 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능이 매우 뛰어나므로 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021을 이용한 지방 대사에 영향을 미치는 기능성 식품 및 약학 조성물 등으로 이용될 수 있다.
Lactobacillus gasseri according to the present invention ( Lactobacillus gasseri ) HY7021 by inhibiting the expression of genes involved in the induction of adipocyte differentiation is very excellent in suppressing the effect of adipocyte differentiation, so Lactobacillus gasseri ( Lactobacillus gasseri ) for fat metabolism using HY7021 It can be used as a functional food, pharmaceutical composition and the like to affect.
도 1은 Biomerieux 사의 api 50 CH kit를 이용하여 락토바실러스 가세리 HY7021의 당 발효 실험을 한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 락토바실러스 가세리 HY7021에 의한 3T3-L1 세포 지방 축적 억제 효과를 AdipoRed assay 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 가세리 HY7021에 의한 3T3-L1 세포 지방 축적 억제 효과를 Oil-red-O staining 방법으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 3T3-L1 세포 내 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4 유전자의 상대적인 mRNA 발현량을 조사한 그래프이다.
도 5는 웨스턴 블랏팅 방법을 이용하여 3T3-L1 세포 내 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4 유전자의 단백질 발현량을 조사한 그래프이다.1 is a diagram showing the results of a sugar fermentation experiment of Lactobacillus gaseri HY7021 using api 50 CH kit of Biomerieux.
Figure 2 is a graph showing the results of measuring the inhibitory effect of 3T3-L1 cell fat accumulation by Lactobacillus gaseri HY7021 by the AdipoRed assay method.
Figure 3 is a diagram showing the results observed by the Oil-red-O staining method for inhibiting the accumulation of 3T3-L1 cell fat by Lactobacillus gaseri HY7021.
Figure 4 is a graph of the relative mRNA expression of PPARγ2, C / EBPa, FAS, FABP4 gene in 3T3-L1 cells using real-time PCR method.
5 is a graph illustrating the protein expression levels of PPARγ2, C / EBPa, FAS and FABP4 genes in 3T3-L1 cells using Western blotting.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are not intended to limit the scope of the present invention, and ordinary changes by those skilled in the art are possible within the scope of the technical idea of the present invention.
<실시예 1>≪ Example 1 >
락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조 분말 제조Preparation of lyophilized powders, including Lactobacillus gasteria HY7021
본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021은 식품원료용 Proteose peptone #3, Yeast Extract, Beef Extract, 그리고 포도당을 첨가한 액체배지를 제조하여 37℃에서 약 16시간 배양한 후 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음 멸균유에 분산하였다. 다시 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 1011cfu 균수를 얻었다. 이 동결건조 분말을 지방세포 분화 유도 유전자 발현 억제 및 지방세포 분화 억제 소재로 사용하였다.The Lactobacillus gasteria HY7021 of the present invention is a liquid medium containing Proteose peptone # 3 for food ingredients, Yeast Extract, Beef Extract, and glucose, and cultured at 37 ° C. for about 16 hours, followed by centrifugation of the culture solution and sterilization. Washed with brine and then dispersed in sterile oil. Freeze-drying again yielded about 10 11 cfu bacteria per gram (g) of lyophilized powder. This lyophilized powder was used as a material for inhibiting adipocyte differentiation inducing gene expression and adipocyte differentiation.
한편 본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021은 상기와 같이 동결 건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.
Meanwhile, the Lactobacillus fern HY7021 of the present invention may be provided in the form of a lyophilized powder or culture.
<실시예 2><Example 2>
락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조Preparation of a pharmaceutical composition containing Lactobacillus gaseri HY7021 as an active ingredient
본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
Although the formulation example of the pharmaceutical composition containing the Lactobacillus gaseri HY7021 of the present invention as an active ingredient will be described, the present invention is not intended to limit this, only intended to explain in detail.
정제의 제조Manufacture of tablets
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 폴리비닐피롤리돈 97㎎을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 2㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.
Lyophilized powder 100 mg, Lactobacillus 100 g, 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose, and 97 mg of polyvinylpyrrolidone were homogeneously mixed, granulated by wet granulation, and magnesium stearate 2 mg. After adding and mixing, one tablet was compressed to 400 mg.
캡슐제의 제조Preparation of Capsules
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After completely mixing the lyophilized powder 100mg, corn starch 100mg, lactose 100mg, magnesium stearate 2mg, including Lactobacillus gaseous HY7021 of Example 1, and filled into hard gelatin capsules according to the conventional method for preparing capsules To prepare a capsule.
<실시예 3><Example 3>
락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조Preparation of Fermented Milk Containing Lactobacillus Gaseri HY7021 as an Active Ingredient
유산균 배양액과 본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021 및 혼합과즙시럽으로 구성된 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.Method for producing a fermented milk consisting of the lactic acid bacteria culture medium, Lactobacillus gaseri HY7021 and mixed juice syrup of the present invention is as follows.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 × 109 cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.First, the lactic acid bacteria culture medium was stirred at 95.36% by weight of crude milk and 4.6% by weight of skim milk powder (or mixed milk powder), and the specific gravity at 15 ° C was 1.0473 to 1.0475, the titratable acidity was 0.200 to 0.220%, and the pH was 6.65 to 6.70, 20 ° C. Brix o was mixed to be 16.3 ~ 16.5%. After mixing, it was UHT heat-treated (sterilized at 135 ° C for 2 seconds) and cooled to 40 ° C. Then, Streptococcus thermophilus and Lactobacillus (Valley laboratory, USA) were each added 0.02% by weight and incubated for 6 hours to incubate BCP. Total lactic acid bacteria in the medium was 1.0 × 10 9 cfu / ㎖ or more, the titratable acidity was 0.89 ~ 0.91%, pH was prepared to be 4.55 ~ 4.65.
그 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.Next, the mixed fruit syrup is 13% by weight liquid fructose, 5% by weight white sugar, 10.9% by weight mixed juice concentrate 56Brix o , 1.0% by weight pectin, 0.1% by weight fresh fruit mix essence and 70% by weight purified water at 30 ~ 35 ℃ After mixing by stirring, UHT heat treatment (sterilized for 2 seconds at 135 ℃) and then prepared by cooling.
그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 실시예 1의 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유한 발효유를 제조하였다.
Then, 69.5% by weight of the lactic acid bacteria culture medium, 0.1% by weight of the lyophilized powder including Lactobacillus gaseri HY7021 of Example 1 and 30.4% by weight of the mixed fruit juice syrup were homogenized at 150 bar and then cooled to 10 ° C or less. By inhibiting the expression of genes involved in cell differentiation, fermented milk containing Lactobacillus gaseri HY7021 having the effect of inhibiting adipocyte differentiation was prepared as an active ingredient.
<실시예 4><Example 4>
락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조Preparation of Functional Drink Containing Lactobacillus Gaseri HY7021 as an Active Ingredient
본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021과 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.Method for producing a functional beverage consisting of Lactobacillus gastrius HY7021 and mixed juice syrup of the present invention is as follows.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
First, mixed fruit syrup is 13% by weight of liquid fructose, 2.5% by weight of white sugar, 2.5% by weight of brown sugar, 56% by weight of mixed juice concentrate 56Brix o , 1.0% by weight pectin, 0.1% by weight of fresh fruit mix essence and 70% by weight of purified water After mixing by stirring at 30 ~ 35 ℃ UHT heat treatment (sterilized for 2 seconds at 135 ℃) was prepared by cooling.
그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 실시예 1의 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
And after mixing the homogeneous at 150 bar and 30.4% by weight of the mixed fruit juice syrup prepared in the above method and 0.1% by weight of the lyophilized powder including the Lactobacillus gaseri HY7021 and 69.5% by weight of the remaining purified water and cooled to 10 ℃ or less. Then, by packaging the same in a small package container such as glass bottles, plastic bottles to suppress the expression of genes involved in the induction of adipocyte differentiation, a functional beverage containing Lactobacillus gaseri HY7021 having the effect of inhibiting adipocyte differentiation was prepared as an active ingredient.
<실시예 5>Example 5
락토바실러스 가세리 HY7021을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조Preparation of Health Functional Foods Containing Lactobacillus Gaseri HY7021 as an Active Ingredient
상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 1의 락토바실러스 가세리 HY7021을 포함한 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물 100중량부에 대하여 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
Lactobacillus HY7021 of Example 1 in the freeze-dried powder containing 0.1% by weight of nutritional supplements (vitamins B1, B2, B5, B6, E and acetate esters, nicotinic acid amide) and oligosaccharides To 100 parts by weight of the freeze-dried powder, including petroleum HY7021 was added to 10 parts by weight and mixed in a high speed rotary mixer. 10 parts by weight of sterile purified water was added and mixed with respect to 100 parts by weight of the mixture, and molded into granules having a diameter of 1 to 2 mm. The molded granules were dried in a vacuum dryer at 40 to 50 ° C., and then uniformly prepared granules were passed through 12 to 14 mesh. The granules prepared as described above were extruded by appropriate amounts into tablets or powders or filled into hard capsules to produce hard capsule products.
<시험예 1><Test Example 1>
3T3-L1 지방세포 분화 유도 및 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물 확보Induction of 3T3-L1 Adipocyte Differentiation and Acquisition of Lactobacillus Casey HY7021 Cell Extract
1-1. 3T3-L1 지방세포 분화 유도1-1. Induces 3T3-L1 Adipocyte Differentiation
American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 3T3-L1 세포를 10% fetal bovine serum(FBS)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 3T3-L1 세포를 지방 세포로 분화시키기 위한 절차를 나열하면 다음과 같다. 3T3-L1 세포가 confluent하게 자란 시점(day 0)으로부터 2일 후에 배양 배지를 10% FBS, 1μg/㎖ insulin, 0.5mM isobutylmethylxanthine(IBMX) 및 1μM dexamethasone가 포함된 DMEM 배지(분화 배지)로 교환하여 배양하였다. 이로부터 2일 후(day 2)에 10% FBS와 1μg/㎖ insulin이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 배양하였다. 이로부터 2일 후(day 4)에 10% FBS만 포함된 배지로 교환하여 배양하였다. 이로부터 4일 후(day 8)에는 3T3-L1 세포의 90%이상이 지방 세포로 완전히 분화된다. 3T3-L1 세포가 지방세포로 완전히 분화되기 전(day 0 ~ day 8)까지를 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)라고 명명하고 지방세포로 완전히 분화된 후(day 8 이후)에는 성숙된 3T3-L1 지방세포(mature 3T3-L1 adipocyte)라고 명명한다. 세포 배양 조건은 5% CO, 37℃이다.
3T3-L1 cells purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS). The procedure for differentiating 3T3-L1 cells into adipocytes is listed as follows. Two days after 3T3-L1 cells grew confluent (day 0), the culture medium was exchanged with DMEM medium (differentiation medium) containing 10% FBS, 1 μg / ml insulin, 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) and 1 μM dexamethasone. Incubated. After 2 days (day 2) and incubated with DMEM medium containing 10% FBS and 1μg / ㎖ insulin. Two days later (day 4), the culture was replaced with a medium containing only 10% FBS. Four days later (day 8), more than 90% of 3T3-L1 cells are fully differentiated into adipocytes. Before 3T3-L1 cells fully differentiate into adipocytes (
1-2. 락토바실러스 가세리 HY7021의 세포 추출물 확보1-2. Acquisition of Cell Extracts of Lactobacillus Gasteria HY7021
락토바실러스 가세리 HY7021을 MRS 배지에서 37℃, 24 시간 동안 배양하였다. 균체를 원심분리한 후 Phosphate Buffered Saline(PBS)로 헹궈서 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 락토바실러스 가세리 HY7021 균체를 동결건조해서 분말화 시킨 후 serial dilution 과정을 거쳐 균수를 측정하였다. 균체의 농도가 10 cfu/ml 이 되도록 PBS에 resuspension한 후 sonication하여 균체를 lysis 하였다. 이를 원심분리한 후 상층액을 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물로 시험에 사용하였다.
Lactobacillus fern HY7021 was incubated in MRS medium at 37 ° C. for 24 hours. The cells were centrifuged and then rinsed with Phosphate Buffered Saline (PBS) to remove the remaining media components. Lactobacillus gaseri HY7021 cells were lyophilized and powdered, followed by serial dilution. Cell concentration is 10 The cells were resuspensioned in PBS to cfu / ml and then sonicated to lyse the cells. After centrifugation, the supernatant was used for testing as a Lactobacillus fern HY7021 cell extract.
<시험예 2><Test Example 2>
락토바실러스 가세리 HY7021에 의한 3T3-L1 지방세포 분화 억제 능력 측정Determination of 3T3-L1 Adipocyte Differentiation Ability by Lactobacillus Gaseri HY7021
2-1. 3T3-L1 AdipoRed assay2-1. 3T3-L1 AdipoRed assay
96-well plate에서 배양한 미분화 3T3-L1 세포에 분화 배지를 처리하는 시점(day 0)에 상기 시험예 1-2의 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 1%(vo/vo)로 함께 처리하였다. 추가적으로 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 1/10, 1/100, 1/1000로 각각 희석한 후 역시 1%(vo/vo)로 처리하였다. 이로부터 6일 후(day 6) 생성된 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)를 PBS로 헹궈서 배지 성분을 제거하고 200μl PBS와 5μl AdipoRed Assay Reagent(Lonza)를 처리하였다. AdipoRed 시약은 지방 덩어리에 끼어 들어가서 형광을 나타내기 때문에 세포의 지방량을 측정하기에 매우 유용하다. 10분 동안 실온에서 반응시킨 후 형광검출기로 형광을 측정(excitation 485nm, emission 572nm)하였다.At the time of treatment of the differentiation medium to the undifferentiated 3T3-L1 cells cultured in a 96-well plate (day 0), the Lactobacillus gasteria HY7021 cell extract of Test Example 1-2 was treated with 1% (vo / vo) together. . Additionally, the Lactobacillus gaseri HY7021 cell extract was diluted to 1/10, 1/100, and 1/1000, respectively, and then treated with 1% (vo / vo). After 6 days (day 6), the mature 3T3-L1 pre-adipocytes (maturing 3T3-L1 pre-adipocytes) were rinsed with PBS to remove the media components and treated with 200μl PBS and 5μl AdipoRed Assay Reagent (Lonza). . AdipoRed reagents are very useful for measuring the amount of fat in a cell because they penetrate the fat mass and fluoresce. After reacting at room temperature for 10 minutes, fluorescence was measured by a fluorescence detector (excitation 485 nm, emission 572 nm).
그 결과를 도 2에 나타내었다.The results are shown in FIG.
도 2의 A는 PBS 처리한 군, B는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물 1/1000 희석 처리한 군, C는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물 1/100 희석 처리한 군, D는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물 1/10 희석 처리한 군, E는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물 그대로 처리한 군으로서 A에 대한 B, C, D, E 각각의 상대적인 지방 축적 정도를 나타낸다.
Figure 2 A is a group treated with PBS, B is a group of 1/1000 dilution of Lactobacillus gaseous HY7021 cell extract, C is a group treated with 1/100 dilution of Lactobacillus gaseous HY7021 cell extract, D is a Lactobacillus gasseri
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, A에 비하여 B는 5% 가량, C는 13% 가량, D는 34% 가량, E는 40% 가량 지방 축적량이 감소하였다. 이로써 본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021의 세포 추출물의 농도가 높아질수록 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)에 축적되는 지방의 양이 더욱 줄어든다는 결론을 내릴 수 있었다.
As can be seen in Figure 2, compared to A, B is about 5%, C is about 13%, D is about 34%, E is about 40% reduced fat accumulation. It was concluded that the higher the concentration of the cell extract of the Lactobacillus gasteria HY7021 of the present invention, the more the amount of fat accumulated in the maturing 3T3-L1 pre-adipocytes was reduced.
2-2. 3T3-L1 Oil-red-O staining2-2. 3T3-L1 Oil-red-O staining
Cover glass에서 배양한 3T3-L1 세포에 분화 배지를 처리하는 시점(day 0)에 상기 시험예 1-2의 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 1%(vo/vo)로 함께 처리하였다. 이로부터 6일 후(day 6) 생성된 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)를 PBS로 헹군 후 10% formalin을 30분 동안 처리해서 고정하였다. Oil-red-O 시약을 isopropanol에 3g/L의 농도로 녹인 후 filtering하고 이를 증류수와 6:4의 비로 혼합하여 세포에 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 세포를 증류수로 헹군 후 hematoxylin을 처리해서 5분 동안 반응 시키고 다시 증류수로 헹궜다. 다음으로 2% glacial acetic acid에 10번 담근 후 증류수로 헹궜다. 다음으로 30% NHOH 1.5㎖과 70% ethanol 98.5㎖ 혼합 용액에 10번 담근 후 증류수에 10번 담근다. 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)에 축적되어 있던 지방이 이 과정에서 적색으로 염색되었고 이를 현미경(AxioObser Z1, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.At the time of treatment of the differentiation medium to the 3T3-L1 cells cultured in the cover glass (day 0), the Lactobacillus fern HY7021 cell extract of Test Example 1-2 was treated with 1% (vo / vo) together. After 6 days (day 6), the resulting mature 3T3-L1 pre-adipocytes (maturing 3T3-L1 pre-adipocytes) were rinsed with PBS and fixed with 10% formalin for 30 minutes. Oil-red-O reagent was dissolved in isopropanol at a concentration of 3g / L, filtered, mixed with distilled water and a ratio of 6: 4, and treated with cells for 1 hour. The cells were rinsed with distilled water and then treated with hematoxylin for 5 minutes and rinsed again with distilled water. Next, immersed in 2% glacial acetic acid 10 times and rinsed with distilled water. Next 30% NH Dip 10 times in a mixture of 1.5ml OH and 98.5ml 70% ethanol, and then immerse in distilled water 10 times. Fat accumulated in maturing 3T3-L1 pre-adipocytes was stained red in this process and observed under a microscope (AxioObser Z1, Carl Zeiss).
그 결과를 도 3에 나타내었다.The results are shown in Fig.
도 3의 A는 분화 배지에서 배양한 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte), B는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 함유한 분화 배지에서 배양한 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)로서 각각 Oil-red-O 염색된 지방을 현미경으로 관찰한 것이다.
3A is maturing 3T3-L1 pre-adipocyte cultured in differentiation medium, B is maturing 3T3-L1 cultured in differentiation medium containing Lactobacillus fern HY7021 cell extract As fat precursor cells (maturing 3T3-L1 pre-adipocyte), Oil-red-O stained fat was observed under a microscope.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, A의 경우에는 분화 배지를 처리하여 지방 세포로 분화를 유도하였기에 상당량의 지방이 축적되었다. 그러나, B의 경우에는 분화 배지에 함유되어 있는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물에 의해 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)내 지방 축적 정도가 A에 비해 상당히 저해되었음을 확인할 수 있었다.
As can be seen in Figure 3, in the case of A treated with differentiation medium to induce differentiation into adipocytes, a significant amount of fat accumulated. However, in case of B, the accumulation of fat in maturing 3T3-L1 pre-adipocytes was significantly inhibited compared to A by Lactobacillus gasi HY7021 cell extract contained in differentiation medium. Could.
<시험예 3><Test Example 3>
락토바실러스 가세리 HY7021에 의한 3T3-L1 세포 내 비만 관련 바이오마커 유전자 발현의 유의적 차이 측정Determination of Significant Differences in Obesity-Related Biomarker Gene Expression in 3T3-L1 Cells by Lactobacillus Gaseri HY7021
3-1. 리얼타임 PCR 분석3-1. Real-Time PCR Analysis
3T3-L1 세포가 지방세포로 분화되는 과정에 관여하는 대표적인 유전자들로서 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4 등이 있다. 상기 시험예 2의 락토바실러스 가세리 HY7021의 3T3-L1 지방 세포 분화 억제 효능이 상기 유전자의 mRNA 발현을 억제함으로써 나타는 것인지 확인하기 위하여 리얼타임 PCR을 시행하였다. Representative genes involved in the process of differentiating 3T3-L1 cells into adipocytes include PPARγ2, C / EBPa, FAS, FABP4, and the like. Real-time PCR was performed to confirm whether the inhibitory effect of 3T3-L1 adipocyte differentiation of Lactobacillus gasery HY7021 of Test Example 2 is indicated by suppressing mRNA expression of the gene.
6-well plate에서 배양한 3T3-L1 세포에 분화 배지를 처리하는 시점(day 0)에 상기 시험예 1-2의 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 1%(vo/vo)로 함께 처리하였다. 이로부터 6일 후(day 6) 생성된 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)로부터 RNA를 추출하고 High Capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems, 4387406)를 이용하여 RNA에 대한 상보적인 DNA(complimentary DNA, 이하 'cDNA'라 함)를 확보하였다. 하기의 표 2와 같이 구입한 택맨프로브(Taqman probes, Applied Biosystems 사에서 구입)와 상기 cDNA를 이용하여 리얼타임 RCR(Applied Biosystems, 7500 Real time PCR)을 시행하였다.At the time of treatment of the differentiation medium to the 3T3-L1 cells cultured in 6-well plate (day 0), the Lactobacillus gasery HY7021 cell extract of Test Example 1-2 was treated with 1% (vo / vo) together. After 6 days (day 6), RNA was extracted from the maturing 3T3-L1 pre-adipocytes, which were produced using a High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, 4387406). Complementary DNA (hereinafter referred to as 'cDNA') for RNA was obtained. Real-time RCR (Applied Biosystems, 7500 Real time PCR) was performed using Taqman probes (purchased from Applied Biosystems, Inc.) and the cDNA purchased as shown in Table 2 below.
그 결과를 도 4에 나타내었다.The results are shown in FIG.
도 4의 A는 분화 배지에서 배양한 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte), B는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 함유한 분화 배지에서 배양한 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte), C는 미분화 3T3-L1 세포로서 A에 대한 B, C 각각의 상대적인 유전자 mRNA 발현 정도를 나타낸다.4A is maturing 3T3-L1 pre-adipocyte cultured in differentiation medium, B is maturing 3T3-L1 cultured in differentiation medium containing Lactobacillus fern HY7021 cell extract Adipocytes (maturing 3T3-L1 pre-adipocyte), C, are undifferentiated 3T3-L1 cells, indicating the relative gene mRNA levels of B and C, respectively, relative to A.
표 2의 GAPDH mRNA 발현은 internal control로 사용하였다.
GAPDH mRNA expression in Table 2 was used as internal control.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 3T3-L1 지방세포 분화 과정에 관여하는 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4 유전자들의 mRNA 발현량이 C에 비해 A에서 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. PPARγ2와 C/EBPα는 전사인자로서 3T3-L1 세포의 지방 분화를 유도하고 FAS와 FABP4는 불포화 지방산 합성 및 지방산 유입을 증가시킨다. 그러나, B의 경우에는 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4의 mRNA 발현량이 A에 비해 각각 30%, 36%, 23%, 32% 가량 저해되는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 락토바실러스 가세리 HY7021에 의해 지방 세포 분화를 유발하는 유전자의 mRNA 발현이 억제된 결과 3T3-L1 지방 세포 분화가 억제되는 것을 알 수 있었다.
As can be seen in Figure 4, it was confirmed that the mRNA expression of PPARγ2, C / EBPa, FAS, FABP4 genes involved in the process of 3T3-L1 adipocyte differentiation was significantly increased in A compared to C. PPARγ2 and C / EBPa induce adipose differentiation of 3T3-L1 cells as transcription factors and FAS and FABP4 increase unsaturated fatty acid synthesis and fatty acid influx. However, in the case of B, the mRNA expression levels of PPARγ2, C / EBPa, FAS, and FABP4 were inhibited by 30%, 36%, 23%, and 32%, respectively, compared to A. These results showed that 3T3-L1 adipocyte differentiation was inhibited as a result of inhibiting mRNA expression of a gene inducing adipocyte differentiation by Lactobacillus acetyl HY7021.
3-2. 웨스턴 블랏팅 분석3-2. Western blotting analysis
상기 3-1의 지방 세포 분화 관련 유전자들의 mRNA 발현이 본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021에 의해 억제된다는 사실과 더불어 이들 유전자들의 단백질 발현 역시 본 발명의 락토바실러스 가세리 HY7021에 의해 저해되는지 확인하기 위해 웨스턴 블랏팅 분석을 실시하였다.In addition to the fact that the mRNA expression of the 3-1 fat cell differentiation-related genes is inhibited by the Lactobacillus gasery HY7021 of the present invention, to confirm whether the protein expression of these genes is also inhibited by the Lactobacillus gasery HY7021 of the present invention. Western blotting analysis was performed.
6-well plate에서 배양한 3T3-L1 세포에 분화 배지를 처리하는 시점(day 0)에 상기 시험예 1-2의 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 1%(vo/vo)로 함께 처리하였다. 이로부터 6일 후(day 6) 생성된 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)로부터 단백질을 추출한 후 추출한 단백질들을 아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동 하였다. 겔 상에서 분자량에 따라 분리된 단백질들을 니트로셀룰로오즈 필름에 transfer하고 웨스턴 블랏팅 자동화기기(Benchpro 4100, Invitrogen)를 이용하여 표 3과 같이 구입한 항체들을 각각 반응시켰다.At the time of treatment of the differentiation medium to the 3T3-L1 cells cultured in 6-well plate (day 0), the Lactobacillus gasery HY7021 cell extract of Test Example 1-2 was treated with 1% (vo / vo) together. After extracting the protein from the maturation 3T3-L1 pre-adipocyte (maturation 3T3-L1 pre-adipocyte) produced after 6 days (day 6), the extracted proteins were electrophoresed on acrylamide gel. Proteins separated according to molecular weight on the gel were transferred to a nitrocellulose film, and the antibodies purchased as shown in Table 3 were reacted using Western blotting automation equipment (Benchpro 4100, Invitrogen).
그 결과를 도 5에 나타내었다.The results are shown in Fig.
도 5의 A는 미분화 3T3-L1 세포, B는 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte), C는 락토바실러스 가세리 HY7021 세포 추출물을 함유한 분화 배지에서 배양한 성숙 중인 3T3-L1 지방전구세포(maturing 3T3-L1 pre-adipocyte)로서 밴드 면적을 통해 단백질 발현량을 미루어 판단할 수 있다.Fig. 5A is maturation cultured in differentiation medium containing undifferentiated 3T3-L1 cells, B is maturing 3T3-L1 pre-adipocyte, C is Lactobacillus fern HY7021 cell extract As 3T3-L1 pre-adipocytes, the protein expression level can be determined through the band area.
표 3의 GAPDH mRNA 발현은 internal control로 사용하였다.
GAPDH mRNA expression in Table 3 was used as internal control.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 3T3-L1 지방세포 분화 과정에 관여하는 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4 유전자들의 단백질 발현량이 A에 비해 B에서 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, C의 경우에는 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4의 단백질 발현량이 B에 비해 모두 상당량 저해되는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 락토바실러스 가세리 HY7021에 의해 지방 세포 분화를 유발하는 유전자의 단백질 발현이 억제된 결과 3T3-L1 지방 세포 분화가 억제되는 것을 알 수 있었다.
As can be seen in Figure 5, it was confirmed that the protein expression of PPARγ2, C / EBPa, FAS, FABP4 genes involved in the process of 3T3-L1 adipocyte differentiation was significantly increased in B compared to A. However, in the case of C, the amount of protein expression of PPARγ2, C / EBPa, FAS and FABP4 was all significantly inhibited compared to B. These results showed that 3T3-L1 adipocyte differentiation was inhibited as a result of inhibition of protein expression of genes that induce adipocyte differentiation by Lactobacillus sp. HY7021.
Claims (6)
Lactobacillus gasseri HY7021 (Accession No .: KCTC 11722BP), which has the effect of inhibiting the expression of genes involved in inducing 3T3-L1 adipocyte differentiation.
상기 3T3-L1 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자는 PPARγ2, C/EBPα, FAS, FABP4인 것을 특징으로 하는 3T3-L1 지방세포 분화 유도에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) HY7021.
The method of claim 1,
The genes involved in inducing 3T3-L1 adipocyte differentiation are PPARγ2, C / EBPa, FAS, FABP4. Inhibiting 3T3-L1 adipocyte differentiation by inhibiting the expression of genes involved in inducing 3T3-L1 adipocyte differentiation. Lactobacillus gasseri HY7021 with potency.
Lactobacillus gasseri ( Lactobacillus gasseri ) of claim 1 or claim 2 containing a pharmaceutical composition for preventing or inhibiting obesity as an active ingredient.
Lactobacillus gasseri ( Lactobacillus gasseri ) according to claim 1 or 2 of the fermented milk for the prevention or inhibition of obesity containing as an active ingredient.
Lactobacillus gasseri ( Lactobacillus gasseri ) of claim 1 or claim 2 containing an anti-obesity beverage containing as an active ingredient.
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