KR20120034250A

KR20120034250A - Ｐａｋ 억제제를 포함하는 관절 질환 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20120034250A
Application number: KR1020127006010A
Authority: KR
Inventors: 세바슈띠엥 바라도; 에카르트 바르트니크; 요에르크 크체크; 안드레아스 알 클라트; 엑케하르트 레베러; 토마스 로이브
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2012-04-10
Also published as: AU2004260590A1; CA2532742A1; IL204861A; WO2005011721A3; RU2360696C2; AU2004260590B2; BRPI0412760A; EP1498133A1; HK1096854A1; IL198727A; JP4843487B2; JP2007537134A; NO20060808L; MXPA06000637A; IL173145A0; CA2532742C; CN1826130B; KR101299936B1; EP2275116A1; CN1826130A

Abstract

본 발명은, 관절 질환, 예를 들어 골관절염 또는 류마티스 관절염 치료용 또는 관절 통증 치료용 p21-활성화된 키나제(PAK) 억제제의 용도 및 관절 질환 치료용 약제로서 PAK 억제제를 발견하기 위한 표적 단백질로서의 PAK의 용도에 관한 것이다.

Description

ＰＡＫ 억제제를 포함하는 관절 질환 치료용 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition for the treatment of a joint disease comprising PAK inhibitor}

본 발명은 관절 질환, 예를 들어 골관절염 또는 류마티스 관절염 치료용 또는 관절 통증 치료용 p21-활성화된 키나제 (PAK) 억제제의 용도 및 관절 질환 치료용 약제로서의 PAK 억제제를 발견하기 위한 표적 단백질로서의 PAK의 용도에 관한 것이다.

골관절염은 서구 세계에서 가장 흔한 남성의 신체손상 질환이다. 집단의 고령화로 인하여, 우리는 삶의 질에 심각하게 영향을 받고 있는 점차 증가하고 있는 환자 집단에 직면해야만 한다. 또한, 상기 질환은 직접 및 간접적 고비용의 상당한 사회-경제적 부담을 수반한다. 현재의 치료 요법은 골관절염과 관련된 통증 치료에 집중되어 있지만, 상기 질환의 진행을 지연시키거나, 정지시키거나, 심지어 역전시킬 수 있는 약리학적 치료 요법은 아직도 완전히 전무한 상태이다.

골관절염은 활막성 관절의 구조적 및 기능적 부전을 야기하는 질환 범위의 임상적 및 병리적 결과로써 간주될 수 있다. 골관절염은, 관절 조직의 손상과 복구 사이의 동적 평형이 붕괴되어 발생한다. 관절 연골의 구조적 부전은 건강한 연골을 손상시키는 비정상적인 물리적 변형 뿐만 아니라 물리생리학적 손상의 영향을 받아 퇴행하는 병리학적으로 손상된 연골의 부전으로 인하여 발생할 수 있다. 골관절염에서 관찰된 형태학적 변화에는 연골 미란 뿐만 아니라 다양한 정도의 활막성 염증이 포함된다. 이들 변화는 연골 거대분자를 분해하는 단백질분해효소를 포함한 생화학적 인자들의 복잡한 네트워크로 인한 것이다. 활성화된 활막세포, 단핵 세포에 의해 또는 관절 연골 그자체에 의해 생성되는 사이토킨, 예를 들어 IL-1 및 TNFα는 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 사이토킨 유전자 발현 및 평활 보상 합성 경로를 상당히 상향조절한다. 예를 들면, IL-1 및/또는 TNFα에 의한 AP1-전사 인자 복합체의 활성화는 MAPK (미토겐 활성화된 단백질 키나제)-경로를 거치는 시그날 전달을 통해 골관절염과 관련된 마커 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을 한다.

연골 이화작용 및 염증성 통증의 발생과 관련된 추가의 생화학적 인자는 PGE2 (프로스타글란딘 E2)이다. 사이클로옥시게나제 (COX)-1 및 -2에 의해 합성된 에이코사노이드인 PGE2는 IL-1-매개된 프로테오글리칸 분해에 관여하고, PGE2의 의식있는 랫트 또는 마우스내로의 투여는 통각과민을 유도한다. IL-1β의 내인성 발현은 사람 골관절염 관절에서 COX-2 유도를 유도한다.

결과적으로, 골관절염은 관절 연골의 느린 진행성 퇴행을 특징으로 한다. 골관절염의 정확한 병인은 아직 알려지지 않았지만, 연골 매트릭스 성분의 분해는 일반적으로 세포외 프로테이나제, 주로 매트릭스 메탈로프로테이나제, 및 퇴행성 과정을 증폭시키는 사이토킨의 활성화 및 합성의 증가때문인 것으로 받아들여지고 있다. 골관절염을 치료하는 신규한 접근법이 요구되고 있고, 연골 질환에 대한 생물학적 이해가 진보하여 유전자 산물이 연골 매트릭스의 손상을 억제하거나 연골 복구를 자극하는 유전자를 사용하기에 이르렀다. 몇몇 연구에서는, 예를 들어 골관절염에서의 구조적 변화의 진행을 감소시키는 방법으로서 IL-1 활성을 조절하는 것과 관련된 잠재적 중요성을 설명하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 연골을 손상시키는 인자의 작용을 감소시키거나 피하는 신규한 치료적 방법을 발견하는 것이다.

놀랍게도, PAK, 특히 PAK1은 골관절염과 관련된 마커 유전자의 발현을 상향조절하는, IL-1 유도된 시그날 전달 경로 활성화의 중요한 매개인자로서 동정되었다.

PAK1은 세포의 형태형성, 운동성, 생존, 유사분열 및 혈관신생을 포함한 다양한 세포 기능에 중요한 진화론적으로 보존된 부류의 세린/트레오닌 키나제의 구성원에 속한다. PAK는 보다 큰 부류의 Ste20 단백질 키나제에 속한다. Ste20p는 에스. 세레비지에 (S. cerevisiae)에서 교배 (mating)-경로에 관련하는 추정상의 효모 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 키나제 키나제 (MAP4K)이다. 포유동물, 초파리, 꼬마 선충 (Caenorhabditis) 및 기타 유기체의 동족체는 사람에서의 구성원을 포함한 단백질 키나제의 거대한 신흥 그룹을 구성한다. Ste20 그룹 키나제는 추가로 p21-활성화 키나제 (PAK) 및 배아 중심 키나제 (GCK) 부류로 나뉜다. 이들은, 키나제와 세포골격의 조절 단백질 및 각종 시그날 전달 분자와의 상호작용을 가능하게 하는 상당한 구조적 다양성의 비촉매적 영역 및 보존적 키나제 도메인의 존재를 특징으로 한다.

몇몇 간행물에는 포유동물 세포에서 MAPK 활성의 조절에서의 PAK의 역할이 기재되어 있다[참조: 예를 들어 Dan, C. et al. (2002) Mol. Cell Biol., 22, 567-577]. MAPK 연쇄증폭반응은 성장 인자, 사이토킨 및 환경적 스트레스와 같은 세포외 자극으로부터 시그날을 전달하여 전사 인자를 활성화시키고, 이로써 유전자 발현을 조절하는, 광범위한 세포 반응에서 중요하다[참조: Johnson, G. L. and Lapadat, R. (2002) Science, 298, 1911-1912]. 시그날 전달은 MAP 키나제 키나제 키나제 (MAP3K), MAP 키나제 키나제 (MAP2K) 및 MAPK로 이루어진 삼중-키나제 모듈의 선형의 순차적 인산화에 의해 매개된다.

포유동물 세포에서, PAK는 Cdc42 및 Rac1의 하류 이펙터 표적으로서 동정되고, GTPase와 Pak1의 결합은 자가인산화를 통해 이의 키나제 활성을 자극한다. PAK는 활성화된 (GTP-결합된) p21과 특이적으로 복합체를 형성하여 p21 GTPase 활성을 억제하고, 키나제 자가인산화 및 활성화를 야기한다. 효모에서 사람까지 보존된 PAK 부류 키나제는 (PAK에서 잔기 71 내지 137에 상응하는) 보존적 N-말단 모티프와의 상호작용을 통해 Cdc42 또는 Rac1에 의해 직접 활성화된다. 자가인산화된 키나제는 Cdc42/Rac1에 대한 친화성이 감소되고, GTPase-활성화 단백질에 의한 하향조절 또는 추가의 자극적 활성를 위해 p21을 유리시킨다[참조: Manser, E. et al. (1994) Nature, 367, 40-46]. Rac1 및 Cdc42 이외에, Rho 부류의 GTPase의 신규하게 동정된 동족체, 예를 들어 Wrch-1 및 Chp도 또한 PAK를 활성화시키고, 사상위족 형성 및 스트레스 섬유 분해를 유도한다[참조: Aronheim, A. et al. (1998) Curr. Biol. 8, 1125-1128]. Rho 부류의 GTPase의 GTP-GDP 결합된 상태를 조절하는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 및 GTPase-활성화 단백질 (GAP)은 PAK1 키나제에 의해 활성화된 하류 시그날 전달의 중요한 결정 요소이다[참조: Zhou, K. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 16782-16786].

PAK1의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 제시되어 있다. Cdc42 및 Rac와의 단단한 결합에 필수적인 PAK1의 서열은 Cdc42와 WASP의 동종 절편과의 복합체의 용액 구조를 측정함으로써 뿐만 아니라 부위-지시된 돌연변이 및 절단된 단편의 특성을 분석함으로써 연구되었다[참조: Burbelo, P. D. et al. (1995) J. Biol. Chem., 270, 29071-29074; Rudolph, M. G. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 18067-18076; Abdul-Manan, N. et al. (1999) Nature, 399, 379-383]. PAK1의 PBD (p21-결합-도메인)와 중복되지만 일치하지 않는 것은 자가억제와 관련된 절편이다[참조: Zhao, Z. S. et al. (1998) Mol. Cell Biol, 18, 2153-2163; Lei, M. et al. (2000) Cell, 102, 387-397]. 이러한 자가조절 영역에는 키나제 자가활성화를 간섭하는 억제성 스위치 및 키나제 억제성 도메인이 포함된다[참조: Lei, M. et al. (2000) Cell 102, 387-397]. 자가조절 영역내 돌연변이로 구성적-활성 돌연변이를 수득한다[참조: 상기 Zhao, Z. S. et al. (1998); 상기 Lei, M. et al. (2000)]. 포유동물 세포에서의 PAK1의 아미노산 83 내지 149 (PAK 억제성 도메인에 대한 PID)를 포함한 자가조절 도메인의 발현은 PAK1을 통한 하류 이펙터의 활성화를 예방한다. 따라서, 상기 PAK 억제제와 PAK1의 활성화제인 구성적-활성의 GTPase Cdc42^G12V의 동시 발현은 예를 들어 상기 p21-단백질에 의해 정상적으로 유도된 스트레스 섬유의 관련 손실 및 말초 액틴 마이크로스파이크 (microspike)의 형성을 차단하였다[참조: 상기 Zhao, Z. S. et al. (1998)].

최근, 유방암 세포에서의 PAK1 활성의 억제는 c-Jun N-말단 키나제 활성의 감소, 전사 인자 AP-1의 DNA 결합 활성의 억제 및 유방암 침입과 관련된 것으로 공지된 AP-1 프로모터에 의해 유도된 생체내 전사의 억제와 관련있는 것으로 보고되었다[참조: Adam, L. et al. (2000) J. Biol. Chem., 275, 12041-12050]. 또한, 임질성 질염의 병인성 인자인 Ngo는 PAK를 포함한 세포 스트레스 반응 키나제의 연쇄증폭반응을 통해 염증 촉진 사이토킨의 활성화를 유도하고, 이는 Rho 부류의 소형 GTPase로부터 시그날을 JNK 및 AP-1 활성화로 지시한다[참조: Naumann, M. et al. (1998) J. Exp. Med., 188, 1277-1286]. 그러나, 골관절염과 같은 관절 질환에서 PAK 부류의 키나제에 대한 잠재적 역할에 대한 어떠한 보고도 없었다.

따라서, 본 발명의 하나의 주제는 관절 질환, 특히 퇴행성 관절 질환, 예를 들어 골관절염 및/또는 염증성 관절 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 치료용 PAK 억제제의 용도이다. 또한, PAK 억제제를 사용하여 특히, 퇴행성 관절 질환에서의 관절 통증을 감소시킴으로써 관절 통증을 치료할 수 있다. 또한, PAK 억제제를 사용하여 상기 상술된 바와 같이 관절 질환 치료용 및/또는 관절 통증 치료용 약제를 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "억제제"는 바람직하게는 PAK의 세린/트레오닌 키나제 활성 또는 PAK 유전자의 발현 또는 세포에서 PAK의 국소화를 억제하거나 감소시키는 생화학적 또는 화학적 화합물을 나타낸다[참조: 예를 들어 Kiosses, W. B. et al. (2002) Circ. Research, April 5, 2002, 697-702]. 세린/트레오닌 키나제 활성을 표준 프로토콜에 따라서, 예를 들어 HitHunter^TM 세린/트레오닌 키나제 분석 (Applied Biosystems, Inc.사, Foster City, CA, U.S.A.)을 사용하여 측정할 수 있다. PAK 유전자의 발현은 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이 RT-PCT 또는 웨스턴 블롯 분석으로 측정할 수 있다.

용어 "PAK"는 PAK1, PAK2, PAK3 및/또는 PAK4를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 세린/트레오닌 p21-활성화 키나제 부류를 나타낸다. 이들 단백질은 바람직하게는 상기 기재된 바와 같이 GTP 결합 소단백질 Cdc42 및 Rac에 대한 표적으로서 작용한다. 특히, 용어 "PAK"는 사람 PAK, 특히 사람 PAK1을 나타낸다. 사람 PAK1의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 제시되어 있다. 사람 PAK2, 3 및 4의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3, 4 및 5에 제시되어 있다. 이들 사람 PAK를 암호화하는 유전자 서열은 유전자 코드를 사용함으로써 용이하게 유도될 수 있다. 사람 PAK 1, 2, 3 및 4의 유전자 뱅크 수탁번호는 각각 NP_002567, Q13177, NP_002569 및 NP_005875이다. 사람 이외의 동족체는 당해 기술분야 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들어 엄격한 조건 (예, 2.5 x SSC 완충액에서 60℃에 이어 보다 낮은 완충 농도에서 37℃에서의 수회 세척 단계)하에서 예를 들어 표준 실험 방법에 따른 사람 PAK 서열로부터 유도된 적합한 프로브를 사용하여 PCR 증폭 또는 하이브리드화를 통해 사람 PAK 1, 2, 3 또는 4 유전자 서열의 방식으로 분리할 수 있다.

이러한 PAK 억제제의 예로는 아미노산 서열 HTIHVGFDAV TGEFTGMPEQ WARLLQTSNI TKSEQKKNPQ AVLDVLEFYN SKKTSNSQKY MSFTDKS (서열번호 6)를 갖는 PAK1 억제제 도메인, 아미노산 서열 KPPAPPMRNT STM (서열번호 7)을 갖는 PAK1 펩티드, 아미노산 서열 YGRKKRRQRR RGKPPAPPMR NTSTM (서열번호 8)을 갖는 Tat-PAK 융합 펩티드, PAK, 특히 PAK의 활성 부위에 대해 지시된 결합 단백질 또는 결합 펩티드, PAK 유전자 또는 PAK 그자체에 대해 지시된 핵산, 화학 분자, 바람직하게는 소분자 및/또는 천연 산물 추출물이다.

본 발명에 따라서, 용어 "화학 분자"는 비-중합체성 유기 화합물, 지질, 탄수화물, 펩티드, 바람직하게는 약 10 내지 약 80개 아미노산, 특히 10 내지 25개 아미노산을 갖는 펩티드 및 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10 내지 약 90개 뉴클레오티드, 특히 15 내지 25개 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특히 바람직하게는 실험실에서 합성되거나 천연에서 발견된 화학 소분자, 특히 비-중합체성 유기 화합물이고, 바람직한 분자량은 약 200g/mol 내지 약 1500g/mol, 특히 400g/mol 내지 1000g/mol이다.

대안적으로, 본 발명의 억제제는 조 형태 또는 정제된 형태의 천연 산물 추출물 형태일 수 있다. 상기 추출물은 동물, 식물 또는 미생물 공급원, 예를 들어 뱀의 독, 잎 또는 미생물 발효 액체배지로부터 표준 공정, 예를 들어 물 및/또는 알코올 및/또는 유기 용매 추출 및/또는 칼럼 크로마토그래피 및/또는 침전에 따라서 제조될 수 있다.

용어 "결합 단백질" 또는 "결합 펩티드"는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 항체 단편 및 PAK에 대해 지시된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 PAK에 대해 지시된 안티칼린을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 PAK와 결합하고 이를 억제하는 단백질 또는 펩티드 부류를 나타낸다.

항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법은 숙련가에게 익히 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 래빗을 경우에 따라서 예를 들어 프로운트 아쥬반트 및/또는 수산화알루미늄 겔의 존재하에 PAK로 면역시킴으로써 이루어진다[참조: 예를 들어, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349]. 포유동물에서 면역학적 반응의 결과로써 형성된 폴리클로날 항체를 후속적으로 익히 공지된 방법을 사용하여 혈액으로부터 분리하고, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피 방법으로 정제한다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌[참조: Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299]에 공지된 방법에 따라서 제조할 수 있다.

본 발명에 따라서, 용어 항체 또는 항체 단편은 또한 재조합적으로 제조되고, 경우에 따라서 키메라성 항체, 사람화 항체, 다중기능 항체, 이중특이적 항체 또는 올리고 특이적 항체, 단일쇄 항체 및 F(ab) 또는 F(ab)₂ 단편과 같이 변형된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 의미로서 이해된다[참조: 예를 들어, EP-B1-0　368 684호, US　제4,816,567호, US　제4,816,397호, WO　제88/01649호, WO　제93/06213호 또는 WO　제98/24884호].

전형적 항체의 대안으로서, 또한 PAK에 대한 단백질 스캐폴드, 예를 들어 리포칼린을 기초로 한 안티칼린을 사용할 수 있다[참조: Beste et　al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903]. 리포칼린의 천연 리간드-결합 부위, 예를 들어 레티놀-결합 단백질 또는 빌린-결합 단백질은 예를 들어 "배합적 단백질 디자인" 접근법에 의해 변형시킬 수 있고, 이러한 방식으로 이들은 선택된 합텐, 즉, 본원에서의 PAK에 결합한다[참조; Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50]. 기타 공지된 단백질 스캐폴드는 분자 인식을 위한 항체의 대안인 것으로서 공지되어 있다[참조: Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187].

용어 "PAK 유전자 또는 PAK 그자체에 대한 핵산"은 PAK 활성 또는 PAK 유전자의 발현을 억제하는 이본쇄 또는 일본쇄 DNA 또는 RNA를 나타내고, 예를 들어 안티센스 핵산, 압타머, siRNA (간섭성 소RNA) 및 리보자임을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

핵산, 예를 들어 안티센스 핵산은 포스포트리에스테르 방법에 따라서 화학적으로 합성할 수 있다[참조: 예를 들어, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584]. 압타머는 폴리펩티드, 여기서, PAK에 높은 친화성으로 결합하는 핵산이다. 압타머는 상이한 일본쇄 RNA 분자의 큰 풀 (pool)로부터 선별 방법, 예를 들어 SELEX[참조: 예를 들어, Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US　제5,582,981호]에 의해 분리될 수 있다. 압타머는 또한 이들의 거울-이미지 형태, 예를 들어 L-리보뉴클레오티드로서 합성되고 선별될 수 있다[참조: Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5]. 이러한 방식으로 분리된 형태는 천연 발생 리보뉴클레아제에 의해 분해되지 않는다는 이점이 있고, 따라서 보다 큰 안정성을 갖는다.

핵산은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제, 특히 세포에서 발견될 수 있는 DNase 및 RNase에 의해 분해될 수 있다. 따라서, 분해로부터 핵산을 안정화하기 위해서, 핵산을 변형시키는 것이 유리하고, 이로써 높은 농도의 핵산이 긴 기간에 걸쳐 세포에 확실하게 유지된다[참조: Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO　95/11910; WO　98/37240; WO　97/29116]. 전형적으로, 이러한 안정화는 하나 이상의 뉴클레오티드 상호간에 인 그룹을 도입함으로써 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 상호간에 비-인 그룹을 도입함으로써 수득될 수 있다.

적합한 뉴클레오티드 상호간의 변형은 문헌[참조: 상기 Uhlmann and Peyman (1990) 및 Beigelman et al. (1995) Nucleic acids Res. 23:3989-94; WO　95/11910; WO　98/37240; WO　97/29116]에 따른다. 본 발명에 따른 용도중 하나로 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드 상호간의 포스페이트 라디칼 및/또는 핵산내 비-인 브릿지는 예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트 및/또는 포스페이트 에스테르가 포함되는 반면, 비-인 뉴클레오티드 상호간의 유사체에는 예를 들어 실록산 브릿지, 카보네이트 브릿지, 카복시메틸 에스테르, 아세트아미데이트 브릿지 및/또는 티오에테르 브릿지가 포함된다. 또한, 이러한 변형은 본 발명에 따른 용도중 하나로 사용될 수 있는 약제학적 조성물의 지속성을 향상시키기 위해 의도된 것이다.

적합한 안티센스 핵산의 용도는 추가로 문헌[참조: Zheng and Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen and Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419-23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697-74 or Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142]에 기재되어 있다.

유전자 발현, 본원 PAK 유전자 발현을 하향 조절하거나 스위치 오프 (off)하는 공정에서 RNA 간섭에 대한 툴 (tool)로서 siRNA의 용도 및 제조는 문헌[참조: Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 or Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494]에 기재되어 있다.

리보자임은 mRNA에 특이적으로 결합하고 절단할 수 있으므로, 이들은 핵산, 본원 PAK 유전자의 해독을 억제하는 적합한 도구이다. 이들은 예를 들어 문헌[참조: Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2 or Couture and Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510-5]에 기재되어 있다.

따라서, 상기 기재된 핵산을 사용하여 생체 및 시험관내 둘다에서 세포에서의 PAK 유전자 발현을 억제하거나 감소시킬 수 있고, 결과적으로 본 발명의 의미에서 PAK 억제제로서 작용한다. 일본쇄 DNA 또는 RNA는 각각 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임으로서 사용하기에 바람직하다. 약제를 제조하기 위해서, 본 발명의 PAK 억제제는 통상적으로 투여 방식에 따라 상이하게 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 보조물질, 예를 들어 생리 완충 용액, 예를 들어 염화나트륨 용액, 탈염수, 안정화제, 예를 들어 프로테아제 또는 뉴클레아제 억제제, 바람직하게는 아프로티닌, ε-아미노카프론산 또는 펩스타틴 A 또는 격리화제, 예를 들어 EDTA, 겔 제형, 예를 들어 백색 바세린, 저점도 파라핀 및/또는 황색 왁스 등과 함께 제형화된다.

적합한 추가의 첨가제는 예를 들어 세제, 예를 들어 Triton X-100 또는 나트륨 데옥시콜레이트 및 폴리올, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤, 당, 예를 들어 슈크로스 또는 글루코스, 양쪽이온성 화합물, 예를 들어 아미노산, 예를 들어 글리신 또는 특히 타우린 또는 베타인 및/또는 단백질, 예를 들어 소 또는 사람 혈청 알부민이다. 세제, 폴리올 및/또는 양쪽성 화합물이 바람직하다.

생리 완충 용액은 바람직하게는 대략 6.0 내지 8.0의 pH, 특히 대략 6.8 내지 7.8의 pH, 특히 대략 7.4의 pH이고/거나 대략 200 내지 400 milliosmol/ℓ의 삼투압, 바람직하게는 대략 290 내지 310 milliosmol/ℓ의 삼투압이다. 약제의 pH는 일반적으로 적합한 유기 또는 무기 완충제, 예를 들어 바람직하게는 포스페이트 완충제, 트리스 완충제 (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충제 ([4-(2-하이드록시에틸)피페라지노]에탄설폰산) 또는 MOPS 완충제 (3-모르폴리노-1-프로판설폰산)을 사용하여 조절된다. 일반적으로 각각의 완충제의 선택은 목적하는 완충 몰농도에 따라서 상이하다. 예를 들어 주사 또는 주입 용액의 경우 포스페이트 완충제가 적합하다.

약제는 통상적인 방법, 예를 들어 경구 투여 형태, 예를 들어 정제 또는 캡슐제에 의해, 점막, 예를 들어 비강 또는 구강 (oral cavity)에 의해, 피부밑에 이식된 침적물 형태로, 주사, 주입 또는 본 발명에 따른 약제를 함유하는 겔을 수단으로 투여될 수 있다. 또한, 상기 기재된 특정 관절 질환을 치료하기 위해서, 적합하게는 리포좀 복합체 형태로 국소 및 국부적으로 약제를 투여할 수 있다. 또한, 약제의 일시적으로 조절된 방출을 가능하게 하는 경피 치료 시스템 (TTS)에 의해 치료할 수 있다. TTS는 예를 들어 EP　제0 944 398 A1호, EP 제0 916 336 A1호, EP　제0　889　723　A1호 또는 EP 제0 852 493 A1호로부터 공지되어 있다.

일반적으로 주사 용액제는 상대적으로 소량의 용액 또는 현탁액, 예를 들어 약 1 내지 약 20ml가 체내에 투여되는 경우에서만 사용된다. 일반적으로 주입 용액제는 보다 다량의 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1ℓ이상이 체내에 투여되는 경우에 사용된다. 주입 용액제와는 대조적으로, 주사 용액제의 경우에서는 오직 소량의 ml만이 투여되므로, 주사시 혈액 또는 조직액의 삼투압 및 pH와의 작은 차이는 그자체가 중요하지 않거나, 통증 감각 측면에서 비유의적 정도로 중요할 뿐이다. 따라서, 사용하기 전 본 발명에 따른 제형의 희석은 일반적으로 필요하지 않다. 그러나, 상대적으로 다량의 투여의 경우, 본 발명에 따른 제형은 적어도 대략 등장성 용액이 수득될 정도로 투여전 간단하게 희석되어야 한다. 등장성 용액의 예로는 0.9% 농도의 염화나트륨 용액이 있다. 주입의 경우, 예를 들어 멸균수를 사용하여 투여하는 동안, 예를 들어 소위 우회로를 통해 희석할 수 있다.

상기 기재된 핵산은 누출된 형태로, 유전자 전이 벡터 형태로 또는 리포좀 또는 금 입자와의 복합체 형태로 사용될 수 있다.

유전자 전이 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터가 있다[참조: Lindemann et al. (1997), Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al. (1988) Mol. Cell., 2, 549-58]. 일반적으로 리포좀과의 복합체는 특히 피부 세포의 형질감염에서 상당히 높은 효과를 달성한다[참조: Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4:2279-85]. 지질감염 (lipofection)에서, 양이온성 지질로 이루어진 작은 단일박막 소포는 리포솜 현탁액을 초음파처리하여 제조한다. DNA는 포지티브의 총 전하가 유지되고 모든 플라스미드 DNA가 리포솜에 의해 복합체화되는 정도의 비율로 리포솜의 표면상에 이온적으로 결합한다. 문헌[참조: Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 7413-7414]에 사용된 DOTMA (1,2-디올레일옥시프로필-3-트리메틸암모늄 브로마이드) 및 DOPE (디올레오일포스파티딜에탄올아민) 지질 혼합물 이외에, 다수의 지질 제형이 현재 합성되었고, 다수의 세포주를 형질감염시키는 이들의 효능에 대해서 시험되었다[참조: Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986; Gao and Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 2550-2561]. 지질 제형의 예로는 DOTAP N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트 또는 DOGS (디옥타데실아미도글리실스페르민)이 있다.

세포내로의 핵산의 이동을 증가시키는 보조 물질은 예를 들어 핵산을 세포의 핵내로 수송시킬 수 있는 DNA 또는 합성 펩티드-DNA 분자에 결합되는 단백질 또는 펩티드일 수 있다[참조: Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Branden et al. (1999) Nature Biotech., 17, 784]. 또한, 보조 물질에는, 핵산을 세포의 세포질내로 방출시킬 수 있는 분자[참조: Planck et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem., 8, 213] 또는 예를 들어 리포좀[참조: 상기 Uhlmann and Peyman (1990)]이 포함된다.

또 다른 특히 적합한 형태는 상기 기재된 핵산을 금 입자에 도포하고, 이들 입자를 "유전자 총 (gun)"이라는 것을 사용하여 조직 또는 세포내로 발사함으로써 수득될 수 있다[참조: Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:775-81, Tuting et al. (1998) J. Invest. Dermatol. 111:183-8].

본 발명의 또다른 주제는 관절 질환, 특히 퇴행성 관절 질환, 예를 들어 골관절염 또는 염증성 관절 질환, 예를 들어 류마티스 관절염을 치료하기 위한 및/또는 특히 퇴행성 관절 질환에서의 관절 통증을 감소시킴으로써 관절 통증을 치료하기 위한 PAK 억제제 발견용 표적으로서의 PAK 또는 PAK 유전자의 용도이다. 바람직하게는, PAK 억제제는 상기 기재된 약제 형태로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 PAK 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 당해 방법은:

(a) PAK 또는 PAK 유전자를 제공하는 단계,

(b) 시험 화합물을 제공하는 단계, 및

(c) PAK 또는 PAK 유전자에 대한 시험 화합물의 영향을 측정하거나 검출하는 단계를 포함한다.

일반적으로, PAK 또는 PAK 유전자는, 예를 들어 분석 시스템에 제공되고, 예를 들어 화학적 화합물 라이브러리 형태의 시험 화합물, 특히 생화학적 또는 화학적 시험 화합물과 직접 또는 간접적으로 접촉시킨다. 이어서, PAK 또는 PAK 유전자에 대한 시험 화합물의 영향을 측정하거나 검출한다. 이어서, 적합한 억제제를 분석하고/거나 분리할 수 있다. 화학적 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위해서, 숙련가에게 공지되거나, 시판중인 고-처리량 (high-throughput) 분석을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라서, 용어 "화학적 화합물 라이브러리"는 임의의 다중 공급원, 예를 들어 화학적으로 합성된 분자 및 천연 산물로부터 어셈블리되거나, 조합적 화학 기술에 의해 생성된 다수의 화학적 화합물을 나타낸다.

일반적으로, PAK 또는 PAK 유전자에 대한 시험 화합물의 영향을 이종 또는 동종 분석으로 측정하거나 검출한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이종 분석은 하나 이상의 세정 단계를 포함하는 분석인 반면, 동종 분석에서는 이러한 세척 단계를 필요로 하지 않는다. 시약 및 화합물만을 혼합하고 측정한다.

적합한 기능적 분석은 PAK의 유전자 발현, GTPase, 예를 들어 Cdc42, Rac1, Wrch-1 또는 Chp에 의한 PAK의 직접 활성화 또는 활성화된 (GTP-결합된) p21과의 복합체 형성을 기초로 할 수 있다. PAK 억제제로서 시험될 생화학적 또는 화학적 화합물의 존재하에, 예를 들어 상기 상술된 바와 같이 유전자 발현, 직접 활성화 또는 다른 단백질, 예를 들어 세포 단백질과의 복합체 형성을 숙련가에게 일반적으로 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 시판중인 키나제 분석 시스템은 기질에 혼입된 인산염의 양을 정량적으로 검출한다.

예를 들면, 말초 액틴 마이크로스파이크 및 관련 스트레스 섬유 손실의 예방을 문헌에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다[참조: 상기 Zhao, Z. S. et al. (1998)]

이종 분석은 예를 들어 ELISA, DELFIA, SPA 및 플래쉬플레이트 분석이다.

ELISA (효소 결합 면역 흡착 분석)-계 분석은 여러 회사에서 제공되고 있다. 당해 분석은 키나제, 예를 들어 PAK에 의해 인산화될 수 있는 무작위 펩티드를 사용한다. 키나제-함유 샘플을 일반적으로 예를 들어 ATP 및 필수 양이온을 함유하는 반응 완충액내로 희석시킨 후, 플레이트 웰에 첨가한다. 혼합물을 간단하게 제거함으로써 반응을 종결시킨다. 이후, 플레이트를 세척한다. 예를 들어, 비오틴화 기질을 키나제에 첨가함으로써 반응을 개시한다. 반응후, 특이적 항체를 첨가한다. 일반적으로 샘플을 미리-차단된 단백질-G 플레이트로 옮기고, 세척한 후, 예를 들어 스트렙타비딘-HRP를 첨가한다. 이후, 결합되지 않은 스트렙타비딘-HRP (서양고추냉이 퍼옥시다제)를 제거하고, 퍼옥시다제 유색 반응을 퍼옥시다제 기질을 첨가함으로써 개시하며, 광학 밀도를 적합한 밀도계로 측정한다.

DELFIA (분리 증강된 란탄족 플루오로 면역 분석)-계 분석은 고체상 분석이다. 항체를 일반적으로 유로퓸 또는 또다른 란탄족으로 표지하고, 결합되지 않은 유로퓸-표지된 항체를 세척 분리한 후, 유로퓸 형광을 측정한다.

SPA (신틸레이션 근접 분석) 및 플래쉬플레이트 분석은 방사선 표지된 기질을 포획하기 위해서 일반적으로 비오틴/아비딘 상호작용을 활용한다. 일반적으로, 반응 혼합물은 키나제, 비오틴화 펩티드 기질 및 γ-[P³³]ATP를 포함한다. 반응후, 비오틴화 펩티드는 스트렙타비딘에 의해 포획된다. SPA 검출에서, 스트렙타비딘은 비드를 함유하는 섬광체에 결합하는 반면, 플래쉬플레이트 검출에서, 스트렙타비딘은 섬광체 함유 마이크로플레이트의 웰의 내부에 결합한다. 일단 고정화시킨 경우, 방사선 표지된 기질을 섬광체와 충분하게 근접시켜 빛 발산을 자극시킨다.

대안적 동종 분석은 예를 들어 TR-FRET, FP, ALPHA 및 유전자 분석이다.

TR-FRET (시차성 형광 공명 에너지 전달)-계 분석은 일반적으로 유로퓸 및 APC사이의 형광 공명 에너지 전달, 변형된 알로피코시아닌 또는 Cy3/Cy5 또는 Cy5/Cy7과 같은 중복 스펙트럼을 사용한 기타 염색을 활용하는 분석이다[참조: Schobel, U. et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10, 1107-1114]. 예를 들어 유로륨을 337nm에서의 빛으로 여기후, 분자는 620nm에서 형광을 낸다. 그러나, 이러한 형광발색단이 APC에 충분히 근접한 경우, 유로퓸은 이의 여기 에너지를 APC에 전달할 것이고, 이는 665nm에서 형광을 낸다. 키나제 기질은 일반적으로 비오틴-표지된 기질이다. 키나제 반응후, 유로퓸-표지된-(P)-특이적 항체를 스트렙타비딘-APC와 함께 첨가한다. 인산화된 펩티드는 유로퓸-표지된 항체와 스트렙타비딘-APC를 근접하게 접촉시킨다. APC의 유로퓸 형광발색단으로의 가까운 근접으로 APC 형광을 위해 유로퓸 형광의 소멸이 야기될 것이다 (FRET).

형광 편광 (FP)-계 분석은 용액내 형광 기질 펩티드를 여기시키는 편광 빛을 사용하는 분석이다. 이들 형광 펩티드는 용액내 유리상태이고 텀블링되어 있으며, 빛의 발산을 야기하여 편광이 소멸된다. 기질 펩티드가 더 큰 분자, 예를 들어 (P)-Tyr과 결합하는 경우, 이의 텀블링 속도는 상당히 감소하고, 발산된 빛은 고도로 편광되어 유지된다. 키나제 분석에 있어서, 다음의 2개의 선택사항이 있다:

(a) 형광 포스포펩티드 추적자는 (P)-특이적 항체에 결합되어 있다. 인산화 된 산물은 항체로부터의 형광 포스포펩티드와 경쟁하고, 높은데서 낮은데로 편광 변화를 야기한다.

(b) 인산화 기질 펩티드는 포스포특이적 항체와 결합하여 낮은데서 높은데로 편광 변화를 야기한다.

ALPHA (증폭된 발광 근접 동종 분석)-계 분석은 인산화 펩티드에 의해 근접화된 공여체 및 수용체 비드 사이의 단일선 산소의 이동을 근거로 하는 분석이다. 680nm에서 여기시, 공여체 비드에서의 광민감제는 주위 산소를 단일선 상태의 산소로 전환시키고, 이는 200nm의 거리까지 확산한다. 수용체 비드에서의 화학발광 그룹은 에너지를 비드내 형광 수용체로 전달하고, 이어서 대략 600nm에서 빛을 발산한다.

EFC (효소 단편 상보성 분석)-계 분석 또는 상응 분석은 특히 화합물의 고처리량(high-throughput)스크리닝을 위해 사용될 수 있다. EFC 분석은 2개의 단편-효소 수용체 (EA) 및 효소 공여체 (ED)로 이루어진 가공된 β-갈락토시다제 효소를 기초로 하고 있다. 단편이 분리된 경우, β-갈락토시다제 활성은 없지만, 단편이 함께 있는 경우 이들은 상보적으로 연합하여 활성 효소를 형성한다. EFC 분석은 ED-분석물 접합체를 사용하고, 여기서, 분석물은 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 수용체에 의해 인지될 수 있다. 특이적 결합 단백질이 부재하는 경우, ED-분석물 접합체는 EA와 상호보완 작용하여 활성 β-갈락토시다제를 형성하고 포지티브 발광 시그날을 생성할 수 있다. ED-분석물 접합체가 특이적 결합 단백질에 의해 결합되는 경우, EA와의 상호보완 작용이 차단됨으로, 시그날은 없다. 유리 분석물이 (샘플내에) 제공되는 경우, 특이적 결합 단백질과의 결합을 위해 ED-분석물 접합체와 경쟁할 것이다. 유리 분석물은 EA와의 상호 보완 작용을 위해 ED-분석물 접합체를 방출하고, 샘플내 존재하는 유리 분석물의 양에 따라 상이한 시그날을 생성한다.

유전자 분석의 예는 2개의 하이브리드 시스템 분석이다[참조: Fields and Sternglanz (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas and Brent (1998) TIBTECH, 16, 355-363]. 이러한 시험에서, 세포를 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 Gal4 또는 LexA와 같은 전사 인자의 DNA-결합 도메인으로 이루어진 융합 단백질을 발현하고 있는 발현 벡터로 형질전환시킨다. 형질전환된 세포는 부가적으로 리포터 유전자를 함유하고, 이의 프로모터는 상응하는 DNA-결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유한다. 예를 들어 Gal4 또는 단순포진 바이러스 V16으로부터의 공지된 또는 비공지된 폴리펩티드 및 활성화 도메인으로 이루어진 제2 융합 단백질을 발현하고 있는 또다른 발현 벡터로 형질전환시킴으로써, 제2 융합 단백질이 폴리펩티드와상호작용하는 경우 리포터 유전자의 발현은 상당히 증가할 수 있다. 결과적으로 이러한 시험 시스템은 PAK와 예를 들어 GTPase, 예를 들어 Cdc42, Rac1, Wrch-1 또는 Chp, 또는 활성화된 (GTP-결합된) p21과의 상호작용을 억제하는 생화학적 또는 화학적 화합물에 대한 스크리닝을 위해 사용될 수 있다[참조: 예를 들어 Vidal and Endoh (1999) Trends in Biotechnology, 17, 374-81]. 이러한 방식으로, 관절 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 신규한 활성 화합물을 신속하게 동정할 수 있다.

대안으로, 시험 화합물이 단백질 또는 펩티드인 경우, 이러한 시험 화합물과 PAK의 존재하에 PAK의 활성화제로서의 GTPase, 예를 들어 Rac1, Wrch-1, Chp 또는 구성적으로-활성인 Cdc42와의 동시발현은 예를 들어 문헌[참조: 상기 Zhao, Z.S. et al. (1998)]에 기재된 바와 같이 PAK에 대한 시험 화합물의 효과를 측정하거나 검출하는데 사용될 수 있다.

유전자 분석의 또다른 예는, 키나제 활성이 성장, 성장 지연과 같은 기능적 세포 반응, 분화 또는 아폽토시스로 전환되는 기능적 분석이다. 이러한 유형의 스크리닝에 있어서, 효모는 특히 적합한 모델 시스템이다. 예를 들면, PAK 1-효모 기능적 분석에서, 글루코스를 함유하는 배지상에서 배양되는 경우, 예를 들어 PAK 1-효모 세포는 정상 효모 세포와 같이 성장한다. 그러나, 갈락토스에 노출되는 경우, PAK1의 세포내 발현이 유도되어 효모 세포의 사멸을 야기한다. PAK1 활성을 억제하는 화합물은 이러한 경우 세포사를 예방한다.

또다른 분석은 고체상-결합된 폴리펩티드, 예를 들어 PAK, GTPase, 예를 들어 Cdc42, Rac1, Wrch-1 또는 Chp, 또는 활성화된 (GRP-결합된) p21 및 시험될 당해 화합물과의 간섭을 기초로 한다. 따라서, 예를 들어 시험 화합물은 검출가능한 마커를 함유하고, 예를 들어 당해 화합물은 상기 이미 설명된 바와 같이 방사선활성 표지, 형광-표지 또는 발광-표지될 수 있다. 또한, 화합물은 예를 들어 발색성 기질을 사용하는 퍼옥시다제 분석을 사용하는 효소적 촉매화에 의하거나, 검출가능한 항체를 결합시킴으로써 직접 검출을 가능하게 하는 단백질과 커플링시킬 수 있다. 또다른 가능성은, 질량스펙트럼 (SELDI)에 의해 고체상-결합된 단백질 복합체를 연구하는 것이다. 상기 기재된 바와 같이 예를 들어 PAC 또는 기타 단백질이 시험 물질과 상호작용하여 야기되는 형태 변화를 예를 들어 폴리펩티드에서의 내인성 트립토판 잔기의 형광에서의 변화에 의해 검출할 수 있다.

고체상-결합된 폴리펩티드는 또한 분석의 일부분일 수 있다. 고체상 화학 물질 및 광불안정성 보호 그룹을 사용하여 당해 어레이를 제조하는 방법은 예를 들어 US　제5,744,305호에 기재되어 있다. 이들 어레이는 또한 시험 화합물 또는 화합물 라이브러리와 접촉되고 상호작용, 예를 들어 결합 또는 형태 변화에 대해 시험될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서, 당해 방법은 전체 세포를 사용하여 수행된다. 일반적으로 다중웰 플레이트의 바닥에서 성장하는 세포는 고정되고, 침투되며, 차단되고, 예를 들어 목적하는 기질에 대한 1차 (P)-특이적인 항체와 함께 배양된다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 특이적 화학발광 또는 발색 물질과 함께 예를 들어 유로퓸 표지되거나, HRP 접합된 2차 항체를 사용하여 시그날을 생성시킨다. 현미경 사용을 병행하여 (P)-특이적 항체의 양 뿐만 아니라 인산화-유도된 기질의 전위 또는 세포의 형태학적 변화를 단일 세포 수준에서 정량할 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 방법은 로보트 시스템, 예를 들어 로보트 플레이팅 및 로보트 액체 이동 시스템, 예를 들어 마이크로유체공학, 즉 채널 구조를 사용하여 수행된다.

본 발명의 또다른 양태에서, 당해 방법은 고처리량 스크리닝 시스템의 형태로 수행된다. 이러한 시스템에서, 유리하게는 스크리닝 방법은 자동화되고 소형화되며, 특히 이는 소형화된 웰 및 로보트 조정자에 의해 조절되는 마이크로유체공학을 이용한다.

본 발명의 또다른 양태는 관절 질환, 특히 퇴행성 관절 질환, 예를 들어 골관절염 또는 염증성 관절 질환, 예를 들어 류마티스 관절염 치료용, 및/또는 관절 통증의 치료, 특히 퇴행성 관절 질환에서의 관절 통증을 감소시키기 위한 약제를 제조하는 방법에 관한 것이고, 이때, 당해 방법은:

(a) 청구항 제13항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 수행하는 단계,

(b) 관절 질환 및/또는 관절 통증 치료에 적합한 측정되거나 검출되는 시험 화합물을 분리하는 단계, 및

(c) 측정되거나 검출된 시험 화합물을 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조 물질과 함께 제형화하는 단계를 포함한다.

다음의 도, 서열 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하지 않으면서 본 발명을 설명할 것이다.

도면의 설명

도 1A 내지 1C는 사람 원발성 연골세포에서 및 HEK293 세포의 추출물에서 PAK1의 발현을 나타낸다.

골관절염 환자의 연골 및 대조군 연골로부터 기원하는 사람 HEK293 세포 추출물 및 사람 원발성 연골세포를 2-차원의 겔 전기영동으로 분리하였다. 단백질을 웨스턴 블롯팅에 의해 PVDF 막으로 이동시키고, PAK1을 특이적 항체에 의해 검출하였다.

도 2는, PAK1-ID 과발현이 사람 SW1353 세포에서 IL-1β유도된 MMP13의 발현을 억제함을 나타낸다.

PAK1 억제성 도메인을 pCEP4 벡터내로 아클로닝하였고, SW1353 세포내로 형질감염시켰다. 제시되는 경우, IL-1β를 10ng/ml의 농도에서 24시간 동안 자극원으로서 사용하였다. 상등액을 수거하고, MMP13 단백질의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 값은 임의 단위로 제시되어 있고, 3개 이상의 독립적인 결과 ±SD를 나타낸다. 체크무늬의 칼럼은 벡터 pCEP4 (공벡터)를 사용한 실험을 나타내고, 검은색 칼럼은 벡터 pCEP4_PAK1-ID를 사용한 실험을 나타낸다.

도 3은, PAK1-ID의 과발현이 사람 SW1353 세포에서 IL-1β유도된 PGE2 발현을 억제함을 나타낸다.

PAK1 억제성 도메인을 pCEP4 벡터내로 아클로닝시키고, SW1353 세포내로 형질감염시켰다. 세포를 IL-1β 및 TNFα 둘다의 배합물로 10ng/ml의 농도에서 24시간 동안 자극하였다. 상등액을 수거하고, MMP13 단백질의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 임의 단위의 값은 2개 실험의 평균을 나타낸다. 펀치모양의 칼럼은 벡터 + IL1β및 TNFα를 사용하지 않은 실험을 나타낸다. 체크무늬의 칼럼은 벡터 pCEP4 (공벡터) + IL1β및 TNFα를 사용한 실험을 나타낸다. 검은색 칼럼은 벡터 pCEP4_PAK1-ID + IL1β및 TNFα를 사용한 실험을 나타낸다.

도 4는, PAK1-ID의 과발현이 사람 HEK293 세포에서 IL-1β유도된 IL-8의 발현을 억제함을 나타낸다.

pCDNA3.1 벡터내로 아클로닝된 PAK1 억제성 도메인을 HEK293 세포내로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 IL-1β로 10ng/ml의 농도로 제시된 시간 기간 동안 자극하였다. 상등액을 수거하고, IL-8 단백질 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 임의 단위의 값은 2개 실험의 평균을 나타낸다. 원모양은 벡터 pCDNA3.1_PAK1-ID + IL-1β를 사용한 실험을 나타내고, 사각형 모양은 벡터pCDNA3.1 (공벡터) + IL-1β를 사용한 실험을 나타낸다.

서열의 설명

서열번호 1은 PAK1의 핵산 서열을 나타낸다.

서열번호 2는 PAK1의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 3은 PAK2의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 4는 PAK3의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 5는 PAK4의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 6은 PAK1의 억제제 도메인 (PAK1-ID)의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 7은 문헌[참조: 상기 Kiosses, W. B. (2002)]에 따른 PAK1의 프롤린-풍부 억제제 서열의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 8은 문헌[참조: 상기 Kiosses, W. B. (2002)]에 따른 HIV tat 단백질로부터의 다염기 서열과 융합된 PAK1 프롤린-풍부 서열을 함유하는 합성 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열번호 9는 사람 및 마우스 PAK1 cDNA 사이의 보존된 서열의 표적화를 위한 제1 PCR 프라이머를 나타낸다.

서열번호 10은 사람 및 마우스 PAK1 cDNA 사이의 보존된 서열의 표적화를 위한 제2 PCR 프라이머를 나타낸다.

서열번호 11은 PAK1-ID의 증폭용 제1 PCR 프라이머를 나타낸다.

서열번호 12는 PAK1-ID의 증폭용 제2 PCR 프라이머를 나타낸다.

1. 방법

1.1 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)

총 RNA (1㎍)을 먼저 1유니트의 RNase-비함유 DNase I로 분해하여 게놈 DNA에 의한 도입을 피하였다. 이어서, DNase I-처리된 RNA를 제조사에 의해 공급된 방법에 따라서 올리고 (dT)20으로 프라이밍된 Thermoscript 역전사효소 (Life Technologies, Inc.사)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 사람 및 마우스 PAK1 cDNA사이의 보존된 서열을 표적화하는 프라이머로서 5'-TGGCTGGAGGCTCCTTGACA-3' (서열번호 9) 및 5'-GAGGGCTTGGCAATCTTCAGGA-3' (서열번호 10) (MWG Biotech AG, Germany사)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃/30초, 60℃/30초 및 72℃/45초의 25사이클 동안 50㎕의 반응당 2.6유니트의 Expand High Fidelity PCR DNA 폴리머라제 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용하였다.

1.2 벡터 작제물의 디자인

PAK1의 자가억제성 도메인으로서 동정된 PAK1 잔기 83 내지 149를 암호화하는 폴리펩티드[참조: 상기 Zhao, Z. S. et al. (1998)]를 PCR로 증폭시켰다. 증폭에 사용된 프라이머는 5'-ATCGCCACCATGTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCCACACAATTCATGTCGGTTTTG-3' (서열번호 11) (코작 서열은 밑줄그어져 있고, 헤마글루티닌 (HA) 태그는 굵게 되어 있음) 및 5'-ATCTTATGACTTATCTGTAAAGCTCATG-3' (서열번호 12) (MWG, Biotech AG, Germany)였다. PCR 조건은 95℃/30초, 60℃/30초 및 72℃/30초의 25사이클 동안 50㎕의 반응당 2.6유니트의 Expand High Fidelity PCR DNA 폴리머라제 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용하였다. PCR 산물을 pCR-TOPO2.1 벡터 (Invitrogen GmbH, Germany)내로 아클로닝하였다. HA 태그-PAK1를 포유동물 pcDNA3.1의 HindIII 및 XbaI 부위 (Invitrogen GmbH, Germany)내로 도입하였다. PAK1-ID를 5' HindIII 및 3' NotI 제한 부위를 통해 pCEP4 플라스미드 (Invitrogen GmbH, Germany)내로 삽입하였다. 모든 플라스미드를 서열분석을 통해 확인하였다.

1.3 세포 배양물

사람 SW1353 연골육종 배양물을 10% 소태아혈청 (FCS) 및 페니실린/스트렙토마이신 (37℃, 5% CO₂)을 함유하는 둘베코 (Dulbecco) 변형된 이글 (Eagle) 배지 (DMEM)에서 성장시켰다. 형질감염을 위해, 6 x 10⁴/웰을 밤새 배양하고, 다음날 2㎍의 DNA 및 10㎕의 GenePORTER^TM 형질감염 시약 (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA, U.S.A.)을 사용하여 형질감염시켰다. 3시간 후, 20% FCS를 함유하는 동일 용적의 배지를 첨가하고, 밤새 배양하였다. pCEP4 벡터 (Invitrogen GmbH, Germany)를 사용한 과발현의 경우, 형질감염 2일 후, 세포를 200㎍/ml 하이그로마이신 B (Invitrogen GmbH, Germany)을 사용하여 선별하였다. 형질감염 효과를 FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., Mountain View, CA, U.S.A.)으로 시험하고, 역위된 형광 현미경상에서 시험하였다. 대부분의 시험에서, 60000개 세포를 35mm의 6-웰 플레이트의 각 웰내로 옮겼다. 자극하기 전, 세포를 인산염 완충화된 염수 (PBS)로 세척하고, FCS를 함유하지 않은 DMEM에서 30분 동안 배양하였다. 실험에 있어서, 세포를 10ng/ml의 사람 IL-1β (Roche Diagnostics GmbH Germany)를 함유하거나 함유하지 않고, 10ng/ml의 TNFα (Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 함유하거나 함유하지 않은, 1ml의 무혈청 DMEM에서 24시간 동안 위치시켰다.

사람 배아 신장 (HEK) 293을 10% 소태아혈청으로 보충된 둘베코 변형된 이글 배지에서 유지시켰다. 형질감염 실험을 위해, 세포를 형질감염 24시간 전 6웰의 접시내로 5 x 10⁵세포로 씨딩하였다. 세포를 웰당 20㎕의 lipofectAMINE

(Life Technologies, Inc., U.S.A.) 및 5.0㎍의 총 DNA를 함유하는 1.0ml의 무혈청 배지에서 4시간 동안 배양하였다 (대조군으로서 pcDNA3.1-PAK1 (83-149) 플라스미드 또는 pcDNA.1 공벡터 사용). 세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 배지에서 회수기간후 (16시간) 처리하지 않고 정치시키거나, 인터루킨-1β (10ng/ml; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, U.S.A.)으로 자극하였다. 배양 상등액을 제거하고, IL-8(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, U.S.A.), PGE2(SpiBiom Inc.) 및 MMP-13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)의 발현을 제조사에 의해 공급된 과정에 따라서 ELISA로 모니터하였다.

1.4 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA

HA-태그 PAK¹⁸³ ^-149 펩티드의 발현을 평가하기 위해서, 세포를 100㎕의 용해 완충액 (20mM MOPS, 2mM EGTA, 5mM EDTA, 완전 EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 0.5% Nonidet P-40) (Roche Diagnostics GmbH, Germany)내로 용해시키고, 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL, U.S.A.)를 사용하여 측정하였다. 단백질을 PVDF 막 (Millipore Corp., U.S.A.)으로 옮기기전 4 내지 12%의 NuPAGE 겔 (Invitrogen GmbH, Germany)로 분리하였다.

골관절염에 걸린 사람 조직 및 정상 조직으로부터의 사람 원발성 연골세포로부터의 단백질 추출물을 표준 기술에 따라서 제조하였다. PAK1 발현을 2차원의 겔 전기영동으로 연구하고, 30㎍의 단백질을 사용하여 면역블롯팅하였다. 2D-겔 전기영동을 위해, 등전점 집속 (isoelectric focusing)을 단백질 IEF 세포 (Bio-Rad Laboratories, Inc., U.S.A.) 상에서 선형 7-cm 고정화시킨 pH 3 내지 10 구배 IPG 스트립 (Bio-Rad Laboratories, Inc., U.S.A.)을 사용하여 수행하였다. 최종 집속 단계는 4000V에서 8시간 동안이었다. 2차원은 NuPAGE Novex 4-12% ZOOM 겔 (Invitrogen GmbH, Germany)에서 수행되었고, 단백질을 PVDF 막 (Millipore Corp., U.S.A.)상에 옮겼다.

면역블롯팅에 있어서, HA-태그 PAK¹⁸³ ^-149 및 PAK1 단백질을 각각 HA-태그 폴리클로날 항체 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.) 및 αPAK (N-20) 폴리클로날 항체 (Santa Cruz)를 사용하여 검출하였다. 간단하게는, 막을 TBS-T (150mM NaCl, 20mM 트리스, pH 7.6, 5% 지방-비함유 분유를 함유하는 0.1% Tween 209)로 실온에서 1시간 동안 차단하고, HA-태그 항체의 1/500 희석액 또는 αPAK(N-20) 항체의 1/500 희석액을 함유하는 TBS-T에서 실온에서 1시간 동안 배양하고, 마지막으로 1/10000의 항-래빗 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항체 (Pierce)를 함유하는 TBS-T에서 1시간 동안 배양하였다. 막을 제조사 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)의 지시에 따라서 ECL을 사용하여 처리하였다.

MMP13 분석을 위해, IL-8 및 PGE2 단백질 수준, 세포 배양물의 상등액을 제조사에 의해 기재된 바와 같이 MMP13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), IL-8 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, U.S.A.) 및 PGE2 (SpiBio)에 대해 ELISA로 측정하였다.

2. 결과

2.1 사람 연골육종 세포주 및 마우스 원발성 연골세포에서의 PAK1 발현

RT-PCR을 사용하여, 레티노산으로 자극되거나 자극되지 않은 사람 SW1353 연골세포 세포주 및 마우스 원발성 세포에서의 PAK1 발현을 분석하였다.

이러한 실험에서 수득된 결과로, PAK1이 사람 SW1353 연골육종 세포주 뿐만 아니라 마우스 원발성 연골세포에서 발현됨이 명백하게 증명되었다. 추가의 실험 셋트에서, RT-PCR을 사용하여 사람 CH8 연골세포 세포주에서의 PAK1의 발현을 확인하였다.

RNA 수준상에 제시된 결과는 또한 PAK1에 대한 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 사용함으로써 단백질 수준상에서도 또한 확인되었다 (도 1).

이와 함께, RNA 및 단백질 수준상의 결과는, PAK1이 사람 및 마우스 연골세포 세포주 및 원발성 연골세포에서 발현됨을 확인한다.

2.2 IL-1 시그날 전달을 사용한 PAK1의 억제성 도메인의 발현 간섭:

MMP13 (매트릭스 메탈로프로테이나제 13)은 골관절염과 관련된 단백질의 IL-1 유도된 발현에 대한 중요한 마커 단백질을 나타낸다. IL-1로부터 MMP13 발현 유도를 야기하는 시그날의 전달에 대한 PAK1의 필요성을 연구하기 위해서 사람 연골육종 세포주 SW1353에서의 PAK1 억제성 도메인 (PAK1-ID)을 과발현시켰다 (도 2).

형질감염된 및 비-형질감염된 SW1353 세포에서, IL-1β에 대한 노출은 배지내 MMP13의 상당한 발현 증가 및 방출을 야기하였다. 이러한 실험 결과, PAK1-ID의 과발현이 사람 SW1353 연골세포 세포주에서의 IL-1β-유도된 MMP13의 발현을 ~55%까지 억제하는 것으로 명백히 증명되었다. 또한, 배지내로의 MMP13 분비의 기본 수준은 형질감염된 및 비형질감염된 SW1353 세포에서 관찰될 수 있었다. PAK1-ID의 발현은 이들 비-자극된 세포에서의 MMP13의 IL-1β-유도된 발현을 80% 초과로 억제할 수 있다. 이와 함께, 상기 결과는, PAK1이 IL-1β-유도된 MMP13의 발현에 필수적인 것임을 확증하였다.

또다른 중요한 마커 유전자는 프로스타글란딘 PGE2이다. SW1353 세포에서의 PGE2 발현의 조절은 각각 PAK1-ID의 존재 또는 부재하에 분석되었다 (도 3).

MMP13 발현의 억제에서 보여지는 바와 같이, 이들 결과로, PAK1-ID의 과발현을 통한 PAK1의 억제가 IL-1β유도된 시그날 전달 경로의 하향조절을 야기하는 것으로 확인되었다. IL-1β유도된 PGE2의 발현은 SW1353 세포주에서 50% 이상까지 억제되었다. 또한, PGE2의 조절은 골관절염에서 통증과 관련된 프로세싱에서의 PAK1에 대한 관련성을 나타낸다.

SW1353 세포에서의 이의 효과 이외에, PAK1-ID의 효과, 즉, 사람 배아 신장 HEK293 세포주에서도 이의 생물학적 억제제에 의한 PAK1의 활성의 간섭을 연구하였다 (도 4).

상기 실험의 결과로 SW1353 세포 연구에서 수득된 발견이 확증되었다. PAK1은 IL-1β에 의해 유도되고 IL-1R의 활성화로부터 골관절염 및 통증과 관련된 마커 유전자, 예를 들어 MMP13, IL-8 및 PGE2의 발현을 상향조절하는 전사 인자의 활성화의 감소를 야기하는 시그날 전달 연쇄증폭반응의 조절에 필수적인 역할을 한다.

<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> Use of a PAK Inhibitor for the Treatment of a Joint Disease <130> DEAV2003/0055 <150> EP 03016303.4 <151> 2003-7-18 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1638 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtcaaata acggcctaga cattcaagac aaacccccag cccctccgat gagaaatacc 60 agcactatga ttggagccgg cagcaaagat gctggaaccc taaaccatgg ttctaaacct 120 ctgcctccaa acccagagga gaagaaaaag aaggaccgat tttaccgatc cattttacct 180 ggagataaaa caaataaaaa gaaagagaaa gagcggccag agatttctct cccttcagat 240 tttgaacaca caattcatgt cggttttgat gctgtcacag gggagtttac cggaatgcca 300 gagcagtggg cccgcttgct tcagacatca aatatcacta agtcggagca gaagaaaaac 360 ccgcaggctg ttctggatgt gttggagttt tacaactcga agaagacatc caacagccag 420 aaatacatga gctttacaga taagtcagct gaggattaca attcttctaa tgccttgaat 480 gtgaaggctg tgtctgagac tcctgcagtg ccaccagttt cagaagatga ggatgatgat 540 gatgatgatg ctaccccacc accagtgatt gctccacgcc cagagcacac aaaatctgta 600 tacacacggt ctgtgattga accacttcct gtcactccaa ctcgggacgt 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1500 tgtctcgaga tggatgtgga gaagagaggt tcagctaaag agctgctaca gcatcaattc 1560 ctgaagattg ccaagcccct ctccagcctc actccactga ttgctgcagc taaggaggca 1620 acaaagaaca atcactaa 1638 <210> 2 <211> 545 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Asn Asn Gly Leu Asp Ile Gln Asp Lys Pro Pro Ala Pro Pro 1 5 10 15 Met Arg Asn Thr Ser Thr Met Ile Gly Ala Gly Ser Lys Asp Ala Gly 20 25 30 Thr Leu Asn His Gly Ser Lys Pro Leu Pro Pro Asn Pro Glu Glu Lys 35 40 45 Lys Lys Lys Asp Arg Phe Tyr Arg Ser Ile Leu Pro Gly Asp Lys Thr 50 55 60 Asn Lys Lys Lys Glu Lys Glu Arg Pro Glu Ile Ser Leu Pro Ser Asp 65 70 75 80 Phe Glu His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe 85 90 95 Thr Gly Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile 100 105 110 Thr Lys Ser Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu 115 120 125 Glu Phe Tyr Asn Ser Lys Lys Thr Ser Asn Ser Gln Lys Tyr Met Ser 130 135 140 Phe Thr Asp Lys Ser Ala Glu Asp Tyr Asn Ser Ser Asn Ala Leu Asn 145 150 155 160 Val Lys Ala Val Ser Glu Thr Pro Ala Val Pro Pro Val Ser Glu Asp 165 170 175 Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ala Thr Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro 180 185 190 Arg Pro Glu His Thr Lys Ser Val Tyr Thr Arg Ser Val Ile Glu Pro 195 200 205 Leu Pro Val Thr Pro Thr Arg Asp Val Ala Thr Ser Pro Ile Ser Pro 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Thr Thr Pro Pro Asp Ala Leu Thr Leu Asn Thr Glu 225 230 235 240 Lys Gln Lys Lys Lys Pro Lys Met Ser Asp Glu Glu Ile Leu Glu Lys 245 250 255 Leu Arg Ser Ile Val Ser Val Gly Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Thr Arg 260 265 270 Phe Glu Lys Ile Gly Gln Gly Ala Ser Gly Thr Val Tyr Thr Ala Met 275 280 285 Asp Val Ala Thr Gly Gln Glu Val Ala Ile Lys Gln Met Asn Leu Gln 290 295 300 Gln Gln Pro Lys Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met Arg 305 310 315 320 Glu Asn Lys Asn Pro Asn Ile Val Asn Tyr Leu Asp Ser Tyr Leu Val 325 330 335 Gly Asp Glu Leu Trp Val Val Met Glu Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Leu 340 345 350 Thr Asp Val Val Thr Glu Thr Cys Met Asp Glu Gly Gln Ile Ala Ala 355 360 365 Val Cys Arg Glu Cys Leu Gln Ala Leu Glu Ser Leu His Ser Asn Gln 370 375 380 Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Asn Ile Leu Leu Gly Met Asp 385 390 395 400 Gly Ser Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln Ile Thr Pro 405 410 415 Glu Gln Ser Lys Arg Ser Thr Met Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala 420 425 430 Pro Glu Val Val Thr Arg Lys Ala Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp 435 440 445 Ser Leu Gly Ile Met Ala Ile Glu Met Ile Glu Gly Glu Pro Pro Tyr 450 455 460 Leu Asn Glu Asn Pro Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly 465 470 475 480 Thr Pro Glu Leu Gln Asn Pro Glu Lys Leu Ser Ala Ile Phe Arg Asp 485 490 495 Phe Leu Asn Arg Cys Leu Glu Met Asp Val Glu Lys Arg Gly Ser Ala 500 505 510 Lys Glu Leu Leu Gln His Gln Phe Leu Lys Ile Ala Lys Pro Leu Ser 515 520 525 Ser Leu Thr Pro Leu Ile Ala Ala Ala Lys Glu Ala Thr Lys Asn Asn 530 535 540 His 545 <210> 3 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Asp Asn Gly Glu Leu Glu Asp Lys Pro Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Arg Met Ser Ser Thr Ile Phe Ser Thr Gly Gly Lys 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Asp Ser 115 120 125 Lys Glu Thr Val Asn Asn Gln Lys Tyr Met Ser Phe Thr Ser Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Ala His Gly Tyr Ile Ala Ala His Pro Ser Ser Thr Lys Thr 145 150 155 160 Ala Ser Glu Pro Pro Leu Ala Pro Pro Val Ser Glu Glu Glu Asp Glu 165 170 175 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asn Glu Pro Pro Pro Val Ile Ala 180 185 190 Pro Arg Pro Glu His Thr Lys Ser Ile Tyr Thr Arg Ser Val Val Glu 195 200 205 Ser Ile Ala Ser Pro Ala Val Pro Asn Lys Glu Val Thr Pro Pro Ser 210 215 220 Ala Glu Asn Ala Asn Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Asn Thr Asp Arg Gln 225 230 235 240 Arg Lys Lys Ser Lys Met Thr Asp Glu Glu Ile Leu Glu Lys Leu Arg 245 250 255 Ser Ile Val Ser Val Gly Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Thr Arg Phe Glu 260 265 270 Lys Ile Gly Gln Gly Ala Ser Gly Thr Val Tyr Thr Ala Leu Asp Ile 275 280 285 Ala Thr Gly Gln Glu Val Ala Ile Lys Gln Met Asn Leu Gln Gln Gln 290 295 300 Pro Lys Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Ile Leu Val Met Arg Glu Asn 305 310 315 320 Lys Asn Pro Asn Ile Val Asn Tyr Leu Asp Ser Tyr Leu Val Gly Asp 325 330 335 Glu Leu Trp Val Val Met Glu Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asp 340 345 350 Val Val Thr Glu Thr Cys Met Asp Glu Gly Gln Ile Ala Ala Val Cys 355 360 365 Arg Glu Cys Leu Gln Ala Leu Asp Phe Leu His Ser Asn Gln Val Ile 370 375 380 His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Asn Ile Leu Leu Gly Met Asp Gly Ser 385 390 395 400 Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln Ile Thr Pro Glu Gln 405 410 415 Ser Lys Arg Ser Thr Met Val Gly Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu 420 425 430 Val Val Thr Arg Lys Ala Tyr Gly Pro Lys Val Asp Ile Trp Ser Leu 435 440 445 Gly Ile Met Ala Ile Glu Met Val Glu Gly Glu Pro Pro Tyr Leu Asn 450 455 460 Glu Asn Pro Leu Arg Ala Leu Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Gly Thr Pro 465 470 475 480 Glu Leu Gln Asn Pro Glu Arg Leu Ser Ala Val Phe Arg Asp Phe Leu 485 490 495 Asn Arg Cys Leu Glu Met Asp Val Asp Arg Arg Gly Ser Ala Lys Glu 500 505 510 Leu Leu Gln His Pro Phe Leu Lys Leu Ala Lys Pro Leu Ser Ser Leu 515 520 525 Thr Pro Leu Ile Ile Ala Ala Lys Glu Ala Ile Lys Asn Ser Ser Arg 530 535 540 <210> 5 <211> 591 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Phe Gly Lys Arg Lys Lys Arg Val Glu Ile Ser Ala Pro Ser Asn 1 5 10 15 Phe Glu His Arg Val His Thr Gly Phe Asp Gln His Glu Gln Lys Phe 20 25 30 Thr Gly Leu Pro Arg Gln Trp Gln Ser Leu Ile Glu Glu Ser Ala Arg 35 40 45 Arg Pro Lys Pro Leu Val Asp Pro Ala Cys Ile Thr Ser Ile Gln Pro 50 55 60 Gly Ala Pro Lys Thr Ile Val Arg Gly Ser Lys Gly Ala Lys Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Leu Leu Leu Asp Glu Phe Glu Asn Met Ser Val Thr Arg 85 90 95 Ser Asn Ser Leu Arg Arg Asp Ser Pro Pro Pro Pro Ala Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Gly Met Pro Glu Glu Pro Ala Thr Thr Ala Arg Gly Gly 115 120 125 Pro Gly Lys Ala Gly Ser Arg Gly Arg Phe Ala Gly His Ser Glu Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Asp Arg Arg Arg Ala Gly Pro Glu Lys Arg Pro 145 150 155 160 Lys Ser Ser Arg Glu Gly Ser Gly Gly Pro Gln Glu Ser Ser Arg Asp 165 170 175 Lys Arg Pro Leu Ser Gly Pro Asp Val Gly Thr Pro Gln Pro Ala Gly 180 185 190 Leu Ala Ser Gly Ala Lys Leu Ala Ala Gly Arg Pro Phe Asn Thr Tyr 195 200 205 Pro Arg Ala Asp Thr Asp His Pro Ser Arg Gly Ala Gln Gly Glu Pro 210 215 220 His Asp Val Ala Pro Asn Gly Pro Ser Ala Gly Gly Leu Ala Ile Pro 225 230 235 240 Gln Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Pro Pro Thr Arg Ala Arg Gly Ala 245 250 255 Pro Ser Pro Gly Val Leu Gly Pro His Ala Ser Glu Pro Gln Leu Ala 260 265 270 Pro Pro Ala Cys Thr Pro Ala Ala Pro Ala Val Pro Gly Pro Pro Gly 275 280 285 Pro Arg Ser Pro Gln Arg Glu Pro Gln Arg Val Ser His Glu Gln Phe 290 295 300 Arg Ala Ala Leu Gln Leu Val Val Asp Pro Gly Asp Pro Arg Ser Tyr 305 310 315 320 Leu Asp Asn Phe Ile Lys Ile Gly Glu Gly Ser Thr Gly Ile Val Cys 325 330 335 Ile Ala Thr Val Arg Ser Ser Gly Lys Leu Val Ala Val Lys Lys Met 340 345 350 Asp Leu Arg Lys Gln Gln Arg Arg Glu Leu Leu Phe Asn Glu Val Val 355 360 365 Ile Met Arg Asp Tyr Gln His Glu Asn Val Val Glu Met Tyr Asn Ser 370 375 380 Tyr Leu Val Gly Asp Glu Leu Trp Val Val Met Glu Phe Leu Glu Gly 385 390 395 400 Gly Ala Leu Thr Asp Ile Val Thr His Thr Arg Met Asn Glu Glu Gln 405 410 415 Ile Ala Ala Val Cys Leu Ala Val Leu Gln Ala Leu Ser Val Leu His 420 425 430 Ala Gln Gly Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Ser Ile Leu Leu 435 440 445 Thr His Asp Gly Arg Val Lys Leu Ser Asp Phe Gly Phe Cys Ala Gln 450 455 460 Val Ser Lys Glu Val Pro Arg Arg Lys Ser Leu Val Gly Thr Pro Tyr 465 470 475 480 Trp Met Ala Pro Glu Leu Ile Ser Arg Leu Pro Tyr Gly Pro Glu Val 485 490 495 Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Met Val Ile Glu Met Val Asp Gly Glu 500 505 510 Pro Pro Tyr Phe Asn Glu Pro Pro Leu Lys Ala Met Lys Met Ile Arg 515 520 525 Asp Asn Leu Pro Pro Arg Leu Lys Asn Leu His Lys Val Ser Pro Ser 530 535 540 Leu Lys Gly Phe Leu Asp Arg Leu Leu Val Arg Asp Pro Ala Gln Arg 545 550 555 560 Ala Thr Ala Ala Glu Leu Leu Lys His Pro Phe Leu Ala Lys Ala Gly 565 570 575 Pro Pro Ala Ser Ile Val Pro Leu Met Arg Gln Asn Arg Thr Arg 580 585 590 <210> 6 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe Thr Gly 1 5 10 15 Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile Thr Lys 20 25 30 Ser Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu Glu Phe 35 40 45 Tyr Asn Ser Lys Lys Thr Ser Asn Ser Gln Lys Tyr Met Ser Phe Thr 50 55 60 Asp Lys Ser 65 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Pro Pro Ala Pro Pro Met Arg Asn Thr Ser Thr Met 1 5 10 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of a synthetic peptide containing the PAK1 pr oline-rich sequence fused to the polybasic sequence from the HIV tat protein <400> 8 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Pro Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Met Arg Asn Thr Ser Thr Met 20 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> first PCR primer for the targeting of conserved sequences between human and mouse PAK1 cDNAs <400> 9 tggctggagg ctccttgaca 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> second PCR primer for the targeting of conserved sequences betwee n human and mouse PAK1 cDNAs <400> 10 gagggcttgg caatcttcag ga 22 <210> 11 <211> 61 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> first PCR primer for the amplification of the PAK1-ID <400> 11 atcgccacca tgtaccctta tgatgtgcca gattatgccc acacaattca tgtcggtttt 60 g 61 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> second PCR primer for the amplification of the PAK1-ID <400> 12 atcttatgac ttatctgtaa agctcatg 28

Claims

(a) p21-활성화 키나제-1 (PAK1) 또는 PAK1 유전자를 제공하는 단계,
(b) 시험 화합물을 제공하는 단계, 및
(c) PAK1 또는 PAK1 유전자에 대한 시험 화합물의 영향을 측정하거나 검출하는 단계를 포함하여, 골관절염 또는 관절 통증을 치료하기 위한 PAK1 억제제를 스크리닝하는 방법.
제1항에 있어서, 관절 통증이 퇴행성 관절 질환과 관련되는 방법.
제1항에 있어서, 시험 화합물이 화학적 화합물 라이브러리 형태로 제공되는 방법.
제1항에 있어서, PAK1 또는 PAK-1 유전자에 대한 시험 화합물의 영향을 이종 또는 동종 분석으로 측정하거나 검출하는 방법.
제4항에 있어서, 이종 분석이 ELISA (효소 결합 면역 흡착 분석), DELFIA (분리 증강된 란탄족 플루오로 면역 분석), SPA (신틸레이션 근접 분석) 또는 플래쉬플레이트 분석인 방법.
제4항에 있어서, 동종 분석이 TR-FRET (시차성 형광 공명 에너지 전달) 분석, FP (형광 편광) 분석, ALPHA (증폭된 발광 근접 동종 분석), EFC (효소 단편 상보성) 분석 또는 유전자 분석인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이상에서 수행되는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 세포를 사용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 로보트 시스템으로 수행되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체공학을 이용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PAK1 억제제의 고처리량 스크리닝법인 방법.