KR20120021391A

KR20120021391A - 골결손 재건용 세포치료제

Info

Publication number: KR20120021391A
Application number: KR1020100073366A
Authority: KR
Inventors: 한규범; 최용수; 이영준; 서정미; 황순정; 김인숙
Original assignee: (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2012-03-09

Abstract

본 발명은 골결손 재건용 세포치료제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 간엽줄기세포, 히알루론산 및 트리칼슘포스페이트를 포함하는 골결손 재건용 세포치료제에 대한 것이다.

Description

골결손 재건용 세포치료제{CELL THERAPY PRODUCT FOR BONE HEALING}

사고에 의한 골절, 노령화에 따른 골밀도 감소에 의한 골절 및 결손, 관절염에 의한 골파손 등 다양한 원인에 의한 골조직의 결손에 대한 효과적인 재건 방법이 요구되고 있으나, 현재까지 개발되고 사용되는 제품들은 모두 단점들을 가지고 있다. 전통적인 자가골 이식법은 골형성 측면에서 가장 효과적인 방법이나, 골채취 부위의 감염, 동통, 혈종 등과 같은 합병증이 발생할 수 있다. 또한, 동종골 이식은 공여자로부터 질병이 감염될 위험성이 있다. 이외에 탈석회화된 골기질, 골페이스트, 세라믹, 금속 등 다양한 재료들을 사용한 인공뼈 제품들이 있으나, 이식물 흡수여부, 조직부적합성, 강도, 구조변형 등 여러 단점들이 완전히 해결되지 못한 실정이다.

최근에는 세포, 스캐폴드 및 성장인자를 복합적으로 이용하여 조직공학 방법으로 자연골과 유사하게 골재건을 시키려는 시도들이 많이 진행되고 있는데, 특히 중간엽 줄기세포의 골세포 분화에 기초한 골조직 결손 재건용 제품 개발이 많은 관심을 끌고 있다. 새로운 바이오 기술에 의한 생명공학분야가 크게 확대되고 있고, 특히 최근 세포치료제 분야의 급속한 발전 속도와 더불어 노령화 사회 도래에 따라 재건 의료시장의 확대가 크게 일어나고 있는 현 상황에서, 골결손 재건용 세포치료제 개발은 기술, 경제 산업적 측면에서 매우 중요한 의미를 갖는다.

현재까지 전세계적으로 다양한 인공뼈들이 개발되었으며, 이들은 크게 동종이식, 세포치료제, 성장인자 사용, 세라믹 및 고분자를 기반으로 한 골 이식재로 나누어 볼 수 있다.

골결손 재생을 위한 동종이식제 제품으로는 탈미네랄화된 골 매트릭스(Accell DBM100, IsoTis OrthoBiologics), 탈미네랄화된 골 매트릭스와 칼슘설페이트 분말을 소디움카르복시메틸셀룰로오스에 반죽한 형태(ALLOMATRIX, Wight Medical Technology), 칼슘설페이트 분말과 생리식염수의 복합체(BonePlast, Interpore Cross Intl.), 탈미네랄화된 골 매트릭스 분말을 히알루론산에 반죽한 형태(DBX, Synthes), 탈미네랄화된 골 매트릭스 분말을 플루로닉 에프-127젤에 반죽한 형태(DynaGraft II, IsoTis OrthoBiologics), 80% 수산화아파타이트와 20% 트리칼슘포스페이트 복합체(OsSatura, IsoTis OrthoBiologics) 등이 있다.

세포치료제의 경우 중간엽 줄기세포의 분화를 통한 골세포형성을 위한 기술개발이 이루어지고 있다. 인간 골수 유래 줄기세포(Osteocel^？, Osiris Therapeutics), 소유래 콜라겐, 수산화아파타이트, 트리칼슘포스페이트를 생리식염수에 반죽한 복합재에 자가골수 유래 간엽줄기세포 이식물(Collagraft II and Neugraft, NeuColl), 수산화아파타이트 도포된 슈유래 콜라겐과 자가골수유래 간엽줄기세포 이식물(HEALOS, DePuy Spine), 트리칼슘포스페이트 블록 또는 조각에 자가유래 간엽줄기세포를 이식한 형태(VITOSS, Orthovita) 등이 있다.

그러나, 전술한 상업화된 제품들은, 골세포 형성에 요구되는 세 가지 조건, 즉 골조직신생(osteogenesis), 골재생지원(osteoconductivity) 및 골재생유도(osteoinductivity) 중 한두 가지만을 만족시킬 뿐이다.

본 발명자들은 전술한 종래 기술의 단점을 극복하고자 인간 간엽줄기세포, 히알루론산 및 트리칼슘포스페이트를 포함하는 골결손 재건용 세포치료제를 개발하였다. 본 발명의 골결손 재건용 세포치료제는 골조직신생(osteogenesis), 골재생지원(osteoconductivity) 및 골재생유도(osteoinductivity) 효과를 모두 보여 준다.

본 발명의 골결손 재건용 세포치료제에 사용되는 인간 간엽줄기세포는 탯줄, 골수, 제대혈, 말초혈액, 태반조직, 지방조직 등으로부터 대량으로 획득할 수 있고, 자가 및 동종 세포치료가 가능하다. 예를 들면, 출산시 태아의 탯줄에서 분리해 놓은 세포를 저장해 두었다가 차후에 골결손이 되었을시 자신의 줄기세포를 사용하여 골결손 재건용 세포치료제로 이식을 할 수 있다. 또한 간엽줄기세포의 낮은 면역원성으로 인하여 타인에게 사용하기에 적절한 세포치료제 자원으로 부각되고 있다.

또한, 히알루론산은 세포외기질의 주요 구성 물질로서 인체의 모든 조직에서 발견되는 매우 중요한 성분이고 점탄성을 지니는 천연 생체소재이다. 히알루론산은 발생학적 형태 형성(morphogenesis)과 상처 치료(wound repair), 염증 반응(inflammation) 및 세포의 이동(metastasis)에 관련된 생물학적 작용들에 관여하고 있다. 또한, 히알루론산은 혈관신생(angiogenesis)에 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다(Science, West et al ., 1985).

또한, 트리칼슘포스페이트는 뼈의 기본 구성 성분으로서, 골재생을 위한 세포치료제의 이식 후 빠른 칼슘 침착으로 골재생 촉진을 유도한다.

본 발명의 목적은 인간 간엽줄기세포, 히알루론산 및 트리칼슘포스페이트를 포함하는 골결손 재건용 세포치료제를 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 인간 간엽줄기세포, 히알루론산 및 트리칼슘포스페이트를 포함하는 골결손 재건용 세포치료제를 제공함으로써 달성될 수 있다.

상기 인간 간엽줄기세포는 인간의 탯줄, 제대혈 또는 태반조직으로부터 유래된 간엽줄기세포일 수 있다. 바람직하게는, 성체줄기세포 중에서도 획득과 분리가 용이하고 획득 가능한 수가 많은 자원으로서 제대혈, 태반/탯줄 또는 지방조직 등이 거론되고 있다. 보다 바람직하게는, 이들 중 태반/탯줄, 보다 정확하게는 탯줄의 세포외기질(Wharton's jelly)로부터 간엽줄기세포를 분리하여 본 발명의 세포치료제로 사용할 수 있다.

예를 들어, 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포의 장점은 다음과 같다. 첫째, 공여자(환자)에게 비침습적으로 세포를 획득할 수 있다. 둘째, 간엽줄기세포의 분리 성공률이 약 20%정도 되는 제대혈과 비교해 볼 때, 탯줄로부터 간엽줄기세포를 100% 분리가능하며, 탯줄 한 개로부터 제대혈과 비교하여 더 많은 양의 줄기세포를 획득할 수 있다. 셋째, 태아 출생시 얻어지는 줄기세포이므로 제대혈 줄기세포와 마찬가지로 지방조직, 골수 등에서 분리한 줄기세포보다 면역거부반응이 적다.

또한, 상기 인간 간엽줄기세포로서 미분화 세포를 사용할 수도 있고, 1일 내지 7일간 골세포로 분화시킨 것을 사용할 수도 있다.

더욱이, 본 발명의 골결손 재건용 세포치료제에는 상기 인간 간엽줄기세포가 10⁶ cells/defect size 내지 10⁸ cells/defect size로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 히알루론산은, 히알루론산을 가교하여 제조된 물질들과 같은 히알루론산 유도체를 포함한다. 예를 들면, 히알루론산 및 카르복시메칠셀룰로즈 복합체 유도체, 히알루론산의 에스테르화된 유도체 또는 히알루론산의 자기-가교된 유도체(WO 1997/07833) 및 히알루론산 에폭사이드 유도체(히알루론산을 2개 이상의 에폭사이드기를 갖는 에폭사이드 가교제를 사용하여 가교화시킨 것) 등, 종래의 히알루론산 유도체가 본 발명의 세포치료제에 포함되는 히알루론산으로서 사용될 수 있다.

보다 바람직하게는, 1,4-부탄디올디글라이시딜 에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하여 가교된 히알루론산 유도체가 본 발명의 세포치료제에 포함되는 히알루론산으로서 사용될 수 있다. 히알루론산은 체내 이식이 된 후 빠른 흡수로 인해 2주에서 4주 내에 완전히 소멸이 되기 때문에 분해되는 속도를 조절할 필요가 있기 때문에, 가교제 BDDE(butanediol diglycidyl ether)를 이용하여 가교화된 히알루론산 유도체를 사용하면 분해 속도를 현저히 줄일 수 있다. 따라서 골결손 조직의 골 재생에 필요한 시간을 충분히 확보할 수 있다.

본 발명의 골결손 재건용 세포치료제에 포함되는 트리칼슘포스페이트는 뼈의 기본 구성 성분으로 체내에 이식된 후 지속적인 뼈침착이 진행될 수 있도록 지원해주는 역할을 수행한다.

본 발명의 골결손 재건용 세포치료제는 인간 유래의 면역반응이 적은 간엽줄기세포를 사용하여 동종 유래 줄기세포의 대량 생산이 가능하며, 이식이 가능한 대상이 더욱 확대될 수 있다.

또한, 본 발명의 골결손 재건용 세포치료제는 하이드로젤 타입의 히알루론산 유도체를 사용하여 트리칼슘포스페이트사이의 빈 공간이 없이 채워주며, 가교결합에 의해 히알루론산이 서서히 분해됨에 따라 골조직이 생성되는 동안 세포의 이동 및 신생혈관 생성에 유리하여 궁극적으로는 골조직 재생에 보다 효과적이다.

더욱이, 본 발명의 골결손 재건용 세포치료제 성분 중 간엽줄기세포는 골조직신생(osteogenesis), 히알루론산 유도체는 골재생유도(osteoinductivity) 그리고 트리칼슘포스페이트는 골재생지원(osteoconductivity) 효과를 제공함으로써 결손된 골조직 재생을 위한 최상의 치료 효과를 보여 준다.

도 1은 인간 탯줄로부터 분리한 간엽줄기세포의 현미경 사진이다.
도 2는 (a) 본 발명에 따른 탯줄 유래 간엽줄기세포, 히알루론산 유도체 그리고 트리칼슘포스페이트 분말을 포함하는 세포치료제, 및 (b) 쥐의 머리 부분의 뼈를 제거하고 세포치료제를 이식하는 모습을 보여 준다.
도 3은 Rat calvarial surgery 시술 4주 후 그룹별 골재생 여부를 비교하기 위한 masson trochrome staining 결과로서, (a) 트리칼슘포스페이트만 넣어준 군; (b) 트리칼슘포스페이트와 히알루론산 유도체를 함께 넣어준 군; (c) 트리칼슘포스페이트, 히알루론산 유도체, 그리고 탯줄 유래 간엽줄기세포를 혼합하여 이식한 군; 및 (d) 트리칼슘포스페이트, 히알루론산 유도체, 그리고 탯줄 유래 간엽줄기세포를 체외에서 3일간 골분화 배양한 것을 혼합하여 이식한 군에 대한 결과를 보여 준다. 파란색으로 염색된 곳은 신생 골조직을 나타내며, 붉은색으로 염색된 곳은 칼슘이 침착하여 골조직으로 변화하기 시작한 것이다.
도 4는 Rat calvarial surgery 시술 4주 후 그룹별 골재생 여부를 확인한 결과이다(히알루론산 유도체와 트리칼슘포스페이트의 복합체에 탯줄 유래 줄기세포를 골세포로 3일간 분화하여 섞은 후 이식). 파란색이 신생 골재생이 되고 있는 조직, 빨간색은 칼슘이 침착되기 시작하면서 골화 되고 있는 부분을 나타낸다.

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 탯줄 유래 간엽줄기세포의 분리 및 분화

탯줄을 잘라 DPBS로 혈액이 제거될 때까지 세척하였다. 상기 세척된 탯줄로부터 2개의 동맥혈관과 1개의 정맥혈관을 제거한 후 DPBS로 여분의 혈액을 제거하였다. 상기 혈관이 제거된 조직을 잘게 조각을 낸 후, 1 mg/ml collagenase type I solution 20 ml(×1 PBS in HBSS)를 50 ml 튜브에 넣어 37℃의 진탕기(shaker)에서 175 rpm으로 3시간 동안 진탕 배양(shaking incubation)하였다. 끈적한 세포 현탁액에 20 ml의 HBSS와 4 ml의 FBS(최종 10%)를 첨가하였고 피펫팅(pipetting)하여 풀어주었다. 50 ml 튜브에 멸균 거즈 두 겹을 준비하고 상기 세포 현탁액을 거즈에 천천히 부어 조각으로 남아있는 조직을 제거하였다. 상기 세포 현탁액을 다 거른 후 거즈를 제거한 후, 상기 현탁액을 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여 가라앉은 세포를 회수하였다. 상등액을 제거한 후 세포 펠렛(cell pellet)을 1 ml HBSS에 잘 섞은 후 일부를 취해 세포수를 세고 기록하였다. 1,500 rpm에서 5분간 원심분리 후 세포 펠렛을 1 ml 배양배지(culture medium)로 잘 혼합한 후, 4 ml 배양배지를 넣은 T-25 배양 플라스크(culture flask)에 첨가하였다. 세포수를 1.25×10⁵cells/cm² 혹은 5×10³cells/cm²로 조절하여 접종하였다.

분리된 탯줄 유래 줄기세포(도 1 참조)를 50 nM 덱사메타손(Dexamethasone), 10 mM 베타-글리세롤포스페이트(β-glycerolphosphate), 50 μg/ml 아스코르브산(ascorbic acid), 10% FBS 가 함유된 DMEM 배지에서 3일간 배양하여 분화시켰다.

실시예 2. 히알루론산 유도체의 제조

200 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 200,000)을 0.25 N NaOH 용액에 녹여 10 ml 제조하였다. 상기 히알루론산 나트륨 용액에 부탄디올디글라이시딜에테르 (BDDE)를 960 ml를 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 100%). 1 시간 동안 교반시켜 준 상기 반응물을 100 ml의 미네랄 오일상에 입자형태로 떨어뜨린다. 일정한 속도로 교반을 시켜 주면서 실온에서 24 시간 동안 반응을 시켜 주었다. 반응을 하면서 오일 내에 분산되어 있는 물을 서서히 제거하여 주었다. 24 시간 후, 100 ml의 에탄올을 서서히 첨가시켜 주어 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 유도체 마이크로비드들을 침전시켜 주었다. 물이 제거된 미네랄 오일 내 침전되어 있는 히알루론산 유도체 마이크로비드를 회수 한 후, 에틸에테르, 에탄올 및 증류수로 여러번 세척 하였다. 세척된 히알루론산 유도체 마이크로비드의 일부는 생리식염수에 팽윤시킨 후 121℃에서 멸균하여 히알루론산 유도체 마이크로비드를 제조하고, 다른 히알루론산 유도체 마이크로비드 일부는 에탄올 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, 생리식염수 팽윤공정, 121℃에서의 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 유도체를 제조하였다.

실시예 3. 트리칼슘포스페이트 조성물 제조

트리칼슘포스페이트 분말을 3차 정제수와 1:0.7의 비율로 섞어서 반죽한 후에 상온에서 하루 이상 건조시켰다. 막자 사발을 이용해 트리칼슘포스페이트 덩어리를 작은 입자로 만든 후 메쉬 필터를 이용해 0.2 mm 내지 1 mm 크기의 입자를 선별하였다. 건열 멸균기를 이용해 200℃ 내지 250℃에서 1시간 동안 멸균하였다. 멸균한 입자를 3차 정제수에 3회 세척하였다. 다시 건열 멸균기를 이용해 200℃ 내지 250℃에서 1시간 동안 멸균하였다.

실시예 4. 탯줄 유래 간엽줄기세포와 히알루론산 유도체, 그리고 트리칼슘포스페이 트를 포함하는 세포치료제의 제조

실시예 3에서 제조한 트리칼슘포스페이트 입자와 히알루론산 겔을 1:1의 비율로 넣고 잘 혼합하였다. 트리칼슘포스페이트 입자와 히알루론산 겔의 혼합물의 1/10 용량의 RPMI 1640 배지에서 상기 트리칼슘포스페이트 입자와 히알루론산 겔의 혼합물을 섞은 후 g당 1×10⁶개의 세포를 첨가하여 고르게 섞었다.

실시예 5. Rat calvarial model 에 세포치료제의 이식 및 골 생성 확인

자일라진(xylazine, 10 mg/kg)과 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride, 40 mg/kg)의 혼합물을 쥐(Rat)의 복강내로 주사하여 마취하였다. 10% 베타딘(Betadine)으로 쥐의 calvarial skin을 소독하였다. 1:100,000 에피네프린이 함유된 2% 리도카인(lidocaine)을 쥐의 calvaria에 피하주사 하였다.　쥐의 시상봉합 (sagittal suture)을 따라 절개하였다. 골막(periosteum)을 들어올리고 관상톱(trephine bur)을 사용하여 경뇌막에 구멍(dura perforation)이 생기지 않도록 하면서 8 mm 지름의 calvarial bone defect를 만들었다(도 2 (b) 참조). 실시예 4에서 제조한 세포치료제(도 2(a) 참조)를 상기 defect에 채우고 calvarial skin을 봉합하였다. 4주 후 쥐의 두개골로부터 수술 부위를 떼어내어 10% 포르말린으로 하루 동안 고정하였고, 70% 에탄올로 탈수시킨 후에 파라핀 블록을 만들어 조직화학적 분석을 수행하였다. 세포와 골구조를 발견하기 위해 H&E와 Masson Trichrome(MT)로 염색하였다(도 3 및 도 4 참조).

Claims

인간 간엽줄기세포, 히알루론산 및 트리칼슘포스페이트를 포함하는 골결손 재건용 세포치료제.
제1항에 있어서, 상기 인간 간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈 및 태반조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 골결손 재건용 세포치료제.
제1항에 있어서, 상기 인간 간엽줄기세포가 탯줄로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 골결손 재건용 세포치료제.
제1항에 있어서, 상기 인간 간엽줄기세포가 미분화 세포인 것임을 특징으로 하는 골결손 재건용 세포치료제.
제1항에 있어서, 상기 인간 간엽줄기세포가 1일 내지 7일간 골세포로 분화시킨 것임을 특징으로 하는 골결손 재건용 세포치료제.
제1항에 있어서, 상기 인간 간엽줄기세포가 10⁶ cells/defect size 내지 10⁸ cells/defect size로 포함되는 것임을 특징으로 하는 골결손 재건용 세포치료제.
제1항에 있어서, 상기 히알루론산이 1,4-부탄디올디글라이시딜 에테르를 사용하여 가교된 것임을 특징으로 하는 골결손 재건용 세포치료제.