KR20120017358A - Surface-enhanced raman scattering based microfluidic chip for immunoassay and on-chip immunoassay using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Sacattering; 이하, 'SERS'라고 함)에 기반을 둔 면역분석용 미세유체칩 및 이를 이용한 온-칩(On-Chip) 면역분석방법에 대한 것이다.
The present invention relates to a microfluidic chip for immunoassay based on Surface-Enhanced Raman Sacattering (hereinafter referred to as 'SERS') and an on-chip immunoassay method using the same. .
면역분석법은 임상 진단, 약물 전달, 식품 안전 및 환경 감시 등의 분야에서 중요한 역할을 수행한다. 전통적으로 형광 기반 검출 시스템이 면역분석의 진단 도구로 사용되어 왔으나, 좋지 않은 LOD값(limit of detection), 광표백(photobleaching), 및 복합적 검출 능력의 저하 등의 단점이 있다. 특히 LOD는 초기 질병 진단의 가능성과 직접적 관련성이 있기 때문에 매우 중요한 문제이다. Immunoassays play an important role in areas such as clinical diagnosis, drug delivery, food safety and environmental surveillance. Traditionally, fluorescence-based detection systems have been used as diagnostic tools for immunoassays, but have disadvantages such as poor limit of detection, photobleaching, and poor detection capability. LOD is particularly important because it is directly related to the possibility of early disease diagnosis.
표면 증강 라만 분석(SERS) 기반 검출은 특정 표적 마커를 고감도로 검출할 수 있는 기술로 각광받고 있다. 최근의 연구에서 할로우 금 나노입자(Hollow Goldnanosphere; 이하, 'HGN'이라고 함) 및 자성 비드를 이용한 SERS-기반 면역분석법이 보고된 바 있다(Chon, H.et al., Anal . Chem . 2009, 81, 3029-034). 상기 연구에서, HGNs와 자성 비드는 각각, SERS 프로브 및 지지(supporting) 기재로 사용되었다. Surface-enhanced Raman analysis (SERS) based detection is gaining popularity as a technique for detecting specific target markers with high sensitivity. Recent studies have reported SERS-based immunoassays using hollow gold nanoparticles (hereinafter referred to as 'HGN') and magnetic beads (Chon, H. et al., Anal . Chem . 2009, 81, 3029-034). In this study, HGNs and magnetic beads were used as SERS probes and supporting substrates, respectively.
그러나 위에서 언급된 면역분석법은 문제점이 있다. 이 방법은 실험 조건을 최적화기가 어려운데, 그 이유는 마이크로피펫을 이용한 세척 단계를 수작업으로 진행하여야 하고, 적합한 SERS 측정을 위해 자기장 강도를 변화시켜야 하고, 그리고 마이크로튜브 벽에 샌드위치 면역복합체가 균일하지 않게 부착되기 때문이다. 또한, 정량 분석을 위해서 특정 타겟 항원 마커의 농도를 변화시킬 때, 마커의 농도 변화 작업을 실험자가 손으로 직접 진행해야 하는 번거로움이 있다. 이 작업은 웰플레이트 또는 마이크로튜브를 이용하는데, 이러한 면역분석법은 시간이 많이 소요되는 단점이 있다. However, the immunoassay mentioned above is problematic. This method is difficult to optimize the experimental conditions because of the manual washing steps using micropipettes, the magnetic field strengths to be changed for proper SERS measurements, and the sandwich immunocomplexes on the microtube walls are not uniform. Because it is attached. In addition, when changing the concentration of a specific target antigen marker for quantitative analysis, there is a problem that the experimenter must directly perform the task of changing the concentration of the marker by hand. This work uses wellplates or microtubes, which have the disadvantage of being time consuming.
종래의 혈당 측정 모듈이나 응급실에서 활용되고 있는 심근경색 마커를 검출하는 모듈 또한 패널이나 칩을 이용하였다. 그러나 이러한 장비는 희석 배율을 실험자가 일일이 체크해야 하므로 수행 시간이 오래 걸리고 소형화된 모듈에서 오는 재현성의 오차가 크다는 문제점이 있다.Conventional blood glucose measurement modules or modules for detecting myocardial infarction markers used in emergency departments also used panels or chips. However, such a device has a problem that it takes a long time to perform the dilution factor and the error of reproducibility coming from the miniaturized module is large.
미세유체칩(Microfluidic Chip)은 미세유체공학(microfluidics) 기술을 토대로 미세유체 채널을 통해 유체를 흘려보내 여러가지 복잡한 실험을 한꺼번에 수행할 수 있는 기능을 가지고 있다. 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 기판을 이용하여 나노리터 이하의 미세 채널을 만들고, 이 채널을 통해 수 나노리터 이하의 적은 양의 액체 시료를 이동시켜서 실험이나 연구를 신속하게 수행할 수 있다.Microfluidic Chips have the ability to perform various complex experiments at the same time by flowing fluids through microfluidic channels based on microfluidics technology. Substrates, such as plastics, glass, and silicon, can be used to create microchannels of less than nanoliters, and to move small amounts of liquid samples up to several nanoliters, enabling rapid experiments or research.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속하여, 미세유체 채널과 솔레노이드를 이용한 SERS 기반 미세유체 센서를 개발하여 본 발명에 이르렀다.
The present inventors continued the research to solve the above problems, and developed the SERS-based microfluidic sensor using the microfluidic channel and the solenoid to reach the present invention.
본 발명의 목적은 농도 구배 미세유체 채널 및 솔레노이드를 SERS 기반 미세유체칩을 제공하기 위한 것이다. An object of the present invention is to provide a concentration gradient microfluidic channel and solenoid SERS-based microfluidic chip.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세유체칩을 한 온-칩 면역분석 방법을 제공하기 위한 것이다.
Another object of the present invention is to provide an on-chip immunoassay method using the microfluidic chip.
종래의 면역분석법을 수행하기 위해서는 정량분석 전에 다양한 농도의 마커 용액이 준비되어야만 한다. 이 과정은 시간이 많이 소요되고 그리고 때때로 서로 다른 농도의 타겟 샘플 용액을 준비하는 동안 심각한 실험상의 에러가 발생할 수도 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 솔레노이드가 결합된 농도구배 채널을 이용한 SERS 기반 미세유체칩을 제공한다.In order to perform conventional immunoassays, marker solutions of various concentrations must be prepared before quantitative analysis. This process is time consuming and sometimes serious experimental errors may occur during the preparation of different concentrations of the target sample solution. In order to solve this problem, the present invention provides a SERS-based microfluidic chip using a concentration gradient channel coupled to a solenoid.
본 발명은 SERS를 기반으로 하여 샘플 준비의 완전 자동화를 구현함으로써 오차를 줄이면서 고감도의 측정이 가능한 미세유체칩을 제공한다. 또한 이러한 자동화의 결과, 본 발명은 오차를 줄이면서 여러 희석 배율로 샘플을 준비하는 재현성이 우수한 미세유체칩을 제공한다. The present invention provides a microfluidic chip capable of high-sensitivity measurement while reducing errors by implementing full automation of sample preparation based on SERS. In addition, as a result of such automation, the present invention provides a microfluidic chip having excellent reproducibility for preparing samples at various dilution ratios while reducing errors.
구체적으로, 본 발명은 항원 및 버퍼 주입부; 농도구배(gradient) 미세유체 채널; 항체복합체 형성 미세유체 채널; 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널; 및 트래핑 미세유체 채널을 포함하는 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩을 제공한다(도 1). 구체적으로 상기 미세유체칩은 다음을 포함하여 구성된다:Specifically, the present invention comprises an antigen and a buffer injection unit; Gradient microfluidic channels; Antibody complex forming microfluidic channels; Sandwich immunocomplex forming microfluidic channels; And a microfluidic chip for SERS-based immunoassay comprising a trapping microfluidic channel (FIG. 1). Specifically, the microfluidic chip comprises:
각각 독립적으로 형성된 항원 및 버퍼 주입부;Each independently formed antigen and buffer injection unit;
상기 항원 및 버퍼 주입부에 연결되며, 상기 항원의 농도가 연속 희석(serial dilution)되는 농도구배(gradient) 미세유체 채널;A gradient microfluidic channel connected to the antigen and the buffer infusion unit, wherein the concentration of the antigen is serially diluted;
상기 농도구배 미세유체 채널 하단에 연결되며, 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체 및 자성 비드가 주입되어 흐르는 항체복합체 형성 미세유체 채널;An antibody complex-forming microfluidic channel connected to the bottom of the concentration gradient microfluidic channel and injected with hollow metal nanospheres and magnetic beads conjugated with an antibody specifically binding to the antigen;
상기 항체복합체 형성 채널 하단에 연결되며, 상기 항원과 상기 할로우 금속 나노구체 및 자성 비드가 서로 만나 항원-항체 반응을 하여 샌드위치 면역복합체를 형성하는, 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널; 및A sandwich immunocomplex forming microfluidic channel connected to a lower end of the antibody complex forming channel, wherein the antigen, the hollow metal nanospheres, and the magnetic beads meet with each other to form an sandwich immune complex by antigen-antibody reaction; And
상기 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널 하단에 연결되며, 자기장을 발생시키는 미니솔레노이드와 함께 배열되어 상기 샌드위치 면역복합체가 트래핑되는 트래핑 미세유체 채널.
A trapping microfluidic channel connected to a bottom of the sandwich immunocomplex forming microfluidic channel and arranged with a minisolenoid generating a magnetic field to trap the sandwich immunocomplex.
상기 농도구배 미세유체 채널에서는, 상기 항원 및 버퍼 주입부를 통해 주입된 상기 항원 및 버퍼의 흐름이 아래로 이동하면서 만나서 서로 혼합되어 상기 항원의 농도가 연속 희석(serial dilution)이 일어날 수 있다. In the concentration gradient microfluidic channel, a flow of the antigen and the buffer injected through the antigen and the buffer injector may move downward to be mixed and mixed with each other so that serial dilution of the antigen may occur.
상기 농도구배 미세유체 채널을 이용하면, 실험자가 마이크로파이펫 등을 이용하여 항원의 농도를 손으로 직접 번거롭게 희석하는 번거로운 작업을 거치지 않고, 항원 농도를 자동적으로 희석할 수 있다.Using the concentration gradient microfluidic channel, the experimenter can automatically dilute the antigen concentration without the cumbersome task of manually diluting the antigen concentration by hand using a micropipette or the like.
상기 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널에서는, 상기 농도구배 미세유체 채널을 따라 이동하면서 연속 희석된 항원과 상기 항체복합체 형성 미세유체 채널을 따라 이동하는 상기 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체 및 자성 비드가 서로 만나 항원-항체 반응을 하여 샌드위치 면역복합체가 형성될 수 있다.In the sandwich immunocomplex forming microfluidic channel, hollow metal nanospheres and magnetic beads conjugated with serially diluted antigens and the antibody moving along the antibody complex forming microfluidic channel move along the concentration gradient microfluidic channel. The sandwich immunocomplexes can be formed by meeting each other with an antigen-antibody reaction.
상기 농도구배 미세유체 채널; 항체복합체 형성 미세유체 채널 및 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널은 다층 구조를 가지는 다중 채널일 수 있으며, 상기 다중 채널은 S자형의 구조를 가지면서 다층 구조를 형성할 수 있다. The concentration gradient microfluidic channel; The antibody complex forming microfluidic channel and the sandwich immunocomplex forming microfluidic channel may be a multi-channel having a multi-layered structure, and the multi-channel may form a multi-layered structure while having an S-shaped structure.
상기 농도구배 미세유체 채널은 그 내부에 마이크로 믹서에 해당하는 그루브 믹서(groove mixer)를 이용한 미세 채널을 더 포함할 수 있다.The concentration gradient microfluidic channel may further include a microchannel using a groove mixer corresponding to the micromixer therein.
상기 할로우 금속 나노구체에 컨쥬게이션되는 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있으면, 상기 할로우 금속 나노구체에 컨쥬게이션되는 항체가 다클론(단클론) 항체라면, 상기 자성 비드에 컨쥬게이션 되는 항체는 단클론(다클론) 항체일 수 있다.If the antibody conjugated to the hollow metal nanospheres may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and if the antibody conjugated to the hollow metal nanospheres is a polyclonal (monoclonal) antibody, then the antibody conjugated to the magnetic beads is monoclonal. (Polyclonal) antibodies.
상기 농도구배 미세유체 채널; 상기 항체복합체 형성 미세유체 채널 및 상기 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널은 복수개로 형성될 수 있으며, 각 채널의 바람직한 개수는 2~8개이다.The concentration gradient microfluidic channel; The antibody complex forming microfluidic channel and the sandwich immunocomplex forming microfluidic channel may be formed in plural numbers, and a preferable number of each channel is 2 to 8.
상기 할로우 금속 나노구체는 이 기술분야에 널리 알려진 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면, 할로우 금 나노구체(hallow gold nanosphere: HGN)가 있으나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다. The hollow metal nanospheres can be used as long as they are well known in the art. For example, there are, but not limited to, hollow gold nanospheres (HGN).
상기 할로우 금속 나노구체 표면에 라만(Raman) 리포터 분자가 더 결합될 수 있다. 상기 라만 리포터 분자는 이 기술분야에 널리 알려진 것이면 어느 것이나 사용가능하다. 예를 들면, 상기 라만 리포터 분자는 크리스탈 바이올렛(CV) 또는 말라카이트 그린 이소티오시안산(MGITC)일 수 있다.Raman reporter molecules may be further bound to the hollow metal nanosphere surface. The Raman reporter molecule may be used as long as it is well known in the art. For example, the Raman reporter molecule may be crystal violet (CV) or malachite green isothiocyanic acid (MGITC).
상기 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩은 자기력 유도 장치를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 이 기술분야에서 사용하는 장치라면 제한없이 이용될 수 있다. 구체적으로 미니솔레노이드에 전류를 가하여 자기장을 유도하기 위해 전류 공급 장치를 사용할 수 있다.The SERS-based immunoassay microfluidic chip may further include a magnetic force induction device. Any device used in the art can be used without limitation. Specifically, a current supply device may be used to induce a magnetic field by applying a current to the minisolenoid.
상기 항체복합체 형성 미세유체 채널은, 각각 독립적으로 형성된 상기 할로우 금속 나노구체가 주입되는 할로우 금속 나노구체 주입부와 상기 자성 비드가 주입되는 자성 비드 주입부; 및 상기 주입된 상기 할로우 금속 나노구체와 자성 비드가 이동하면서 서로 만나는 접합부를 더 포함하여 구성될 수 있다.The antibody complex-forming microfluidic channel may include a hollow metal nanosphere injection unit into which the hollow metal nanospheres are independently formed, and a magnetic bead injection unit into which the magnetic beads are injected; And the junction where the injected hollow metal nanospheres and magnetic beads move and meet each other.
상기 트래핑 미세유체 채널의 상기 미니솔레노이드에 2 A의 전류를 가했을 때 27 mT의 자기장이 발생하면서, 상기 샌드위치 면역복합체 상기 트래핑 미세유체 채널의 내벽에 고정될 수 있다.A 27 mT magnetic field is generated when a current of 2 A is applied to the minisolenoid of the trapping microfluidic channel, and the sandwich immunocomplex may be fixed to an inner wall of the trapping microfluidic channel.
상기 미니솔레노이드는 요크(yoke) 형태일 수 있다.The mini solenoid may be in the form of a yoke.
상기 샌드위치 면역복합체는 상기 트래핑 미세유체 채널 내벽에 균일하게 고정될 수 있다.The sandwich immunocomplex may be uniformly fixed to the inner wall of the trapping microfluidic channel.
상기 주입되는 항원의 농도는 100 ng/mL 이하일 수 있다.
The concentration of the injected antigen may be 100 ng / mL or less.
다른 측면에서 본 발명은, 상기 언급한 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩을 이용하여, 다음 단계를 포함하는 온-칩 면역분석 방법을 제공한다:In another aspect, the present invention, using the above-mentioned SERS-based immunoassay microfluidic chip, provides an on-chip immunoassay method comprising the following steps:
항원 및 버퍼를 준비하는 단계;Preparing an antigen and a buffer;
상기 항원 및 버퍼를 항원 및 버퍼 주입부에 주입하는 단계;Injecting the antigen and the buffer into an antigen and a buffer injection unit;
상기 주입된 항원 및 버퍼의 흐름이 아래로 이동하면서 농도구배 미세유체 채널에서 상기 항원과 버퍼가 혼합되고 상기 농도구배 미세유체 채널을 따라 상기 항원의 농도가 연속 희석되는 단계;The antigen and the buffer are mixed in the concentration gradient microfluidic channel while the flow of the injected antigen and the buffer moves downward, and the concentration of the antigen is continuously diluted along the concentration gradient microfluidic channel;
상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체와 자성 비드가 항체 복합체 형성 미세유체 채널에 주입되는 단계;Injecting hollow metal nanospheres and magnetic beads conjugated with an antibody specifically binding to the antigen into an antibody complex-forming microfluidic channel;
상기 농도 구배 미세유체 채널을 따라 이동하면서 연속 희석된 항원과, 상기 항체 복합체 형성 미세유체 채널을 따라 이동하는 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체 및 자성 비드가 서로 만나 항원-항체 반응을 하여 샌드위치 면역복합체를 형성하는 단계; An antigen-antibody reaction is performed by antigen-antibody reactions between antigens that are serially diluted while moving along the concentration gradient microfluidic channel, hollow metal nanospheres conjugated with antibodies that move along the antibody complex-forming microfluidic channel, and magnetic beads to antigen-antibody reactions. Forming a complex;
상기 샌드위치 면역복합체를 자기장을 이용하여 미세유체 채널 내벽에 트래핑하는 단계; 및Trapping the sandwich immunocomplex on the inner wall of the microfluidic channel using a magnetic field; And
상기 트래핑된 샌드위치 면역복합체에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하는 단계.
Measuring the SERS signal by irradiating the trapped sandwich immunocomplex with laser light.
본 발명 "항원(antigen)"이란 용어는, 생체 내에서 이물질로 간주되는 물질을 총칭한다. 생체 내에 생긴 변이세포(암세포 등)도 상기 항원의 개념에 포함된다. 특히, 본 발명에서 상기 항원은 "바이오마커"로서의 기능도 포함하는 개념이다.The term "antigen" of the present invention refers to a substance that is considered as a foreign substance in vivo. Mutant cells (cancer cells, etc.) generated in vivo are also included in the concept of the antigen. In particular, in the present invention, the antigen is a concept including the function as a "biomarker".
본 발명의 "버퍼(buffer)는 "완충액(buffer solution)"을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.The term "buffer" of the present invention means "buffer solution" and is a term widely used in the art.
본 발명의 "할로우 금속 나노구체"란, 할로우 내부 구조를 가지는 금속 껍질을 가지는 나노구조체를 의미한다. 도 2(a)는 상기 할로우 금속 나노구체를 제조하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다(Schwartzberg et al. Anal. Chem. 2006, 78, 4732-4736). The "hollow metal nanosphere" of the present invention means a nanostructure having a metal shell having a hollow internal structure. Figure 2 (a) schematically shows the process of producing the hollow metal nanospheres (Schwartzberg et al. Anal. Chem. 2006, 78, 4732-4736).
본 발명의 "자성 비드"는 자성 재료로 구성될 수 있다. 상기 자성 재료로는, 이 기술분야에서 널리 사용하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면, Fe2O3, Fe3O4 또는 FePt 중 하나를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 자성 비드의 입자는 수 내지 수십 nm 크기일 수 있다.The "magnetic beads" of the present invention may be composed of a magnetic material. As the magnetic material, any one can be used as long as it is widely used in the art. For example, one of Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 or FePt may be used, but is not limited thereto. The particles of the magnetic beads may be several tens of nm in size.
본 발명의 "항체복합체"는 항체와 이 항체가 결합된 물질을 총칭하는 용어이다. 예를 들면, 금속 나노구체나 자성 비드에 항체가 컨쥬게이션된 경우, "금속나노구체-항체" 및 "자성비드-항체"를 항체복합체라고 부른다.The term “antibody complex” of the present invention is a term that collectively refers to an antibody and a substance to which the antibody is bound. For example, when an antibody is conjugated to metal nanospheres or magnetic beads, "metal nanosphere-antibody" and "magnetic bead-antibody" are called antibody complexes.
본 발명의 "샌드위치 면역복합체"란 항체-항원-항체 반응을 통해 결합된 면역복합체를 의미한다. 항원이 항체 중간에 삽입되어 샌드위치 모양을 나타내기 때문에 붙여진 이름이다. By "sandwich immunocomplex" is meant an immunocomplex bound through an antibody-antigen-antibody reaction. It is named because the antigen is inserted in the middle of the antibody to form a sandwich.
미세유체 채널 내에서 유체의 연속적 흐름 조건과 균일한 혼합 조건이 유지된다면, 매우 정확하고 재생가능성이 있는 분석을 수행할 수 있다. If a continuous flow condition and a uniform mixing condition of the fluid are maintained in the microfluidic channel, a very accurate and reproducible analysis can be performed.
본 발명에 따른 면역분석방법을 도 1에 나타내었다. 타겟 항원 마커 및 버퍼가 채널로 주입되면, 농도 구배 미세유체 채널을 통해, 타겟 항원 마커 분자의 연속 희석 작업이 자동적으로 수행된다. 즉, 실험자가 일일이 손으로 농도를 조절해 줄 필요가 없다. 상기 농도구배 미세유체 채널은, 버퍼를 이용하여 타겟 샘플을 연속적으로 희석하는 데 사용된다. 그리고 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체(HGNs)와 자성 비드를 채널 내로 넣어서 항체복합체를 형성하게 되고, 이 항체복합체가 상기 항원 마커와 결합하여 샌드위치 면역복합체를 형성한다. 그 다음, 미니솔레노이드가 결합된 미세유체 채널에 샌드위치 면역복합체가 이동해오면, 이 미니솔레이드는 서로 다른 농도의 면역복합체를 움직이지 못하게 고정시키는 데 이용된다. 이 미니솔레노이드는 각각의 미세유체 채널 가까이에 놓이고, 채널 내를 흐르는 유체에서 자성 비드를 붙잡기 위한, 즉 트래핑하기 위해 자기장 구배를 발생시킨다. 스위치를 켜거나 끄면서 자기장의 세기를 조절할 수 있고, 또한 원하는 만큼의 자기장의 세기를 구현할 수 있다. 마지막으로, 각 미세유체 채널 내부에 붙어 움직이지 않는 샌드위치 면역복합체의 SERS 신호를 공초점 라만 현미경으로 측정한다. 결과적으로, 미세유체 채널에서 SERS 기반 면역분석이 자동적으로 수행된다.
An immunoassay method according to the present invention is shown in FIG. 1. Once the target antigen marker and buffer are injected into the channel, serial dilution of the target antigen marker molecule is automatically performed via the concentration gradient microfluidic channel. In other words, the experimenter does not need to adjust the concentration by hand. The concentration gradient microfluidic channel is used to continuously dilute the target sample using a buffer. The antibody conjugates hollow metal nanospheres (HGNs) and magnetic beads into a channel to form an antibody complex, and the antibody complex binds to the antigen marker to form a sandwich immunocomplex. Then, when the sandwich immunocomplex moves to the microfluidic channel to which the minisolenoid is bound, the minisolde is used to immobilize the immunocomplexes of different concentrations. This minisolenoid is placed close to each microfluidic channel and generates a magnetic field gradient to trap, i.e., trap, the magnetic beads in the fluid flowing in the channel. You can adjust the strength of the magnetic field by turning the switch on or off, and you can also realize the strength of the magnetic field as much as you want. Finally, the SERS signal of the immobilized sandwich immunocomplex inside each microfluidic channel is measured under confocal Raman microscopy. As a result, SERS-based immunoassays are automatically performed on microfluidic channels.
본 발명을 이용하면, 타겟 항원 마커의 농도구배를 자동적으로 형성할 수 있으므로 종래와 같이 지루한 수작업을 통한 타겟 마커 용액의 희석을 수행할 필요가 없다. 본 발명에서 제시한 면역분석법은 종래에 연속 희석에 사용되던 마이크로튜브 세트나 마이크로파이펫을 대체할 수 있다. 이러한 자동화의 결과, 본 발명에 따른 미세유체칩은 실험자의 숙련도 부족이나 오류로 인해 재현성이 저해되는 요인을 봉쇄하여 재현성이 우수하다. 또한 면역분석-인큐베이션, 검출 및 세척을 포함-시간을 30분 이하로 단축할 수 있다.
With the present invention, it is possible to automatically form a concentration gradient of the target antigen marker, so that it is not necessary to perform dilution of the target marker solution through tedious manual work as in the prior art. The immunoassay presented in the present invention can replace the microtube set or micropipette that was conventionally used for serial dilution. As a result of such automation, the microfluidic chip according to the present invention is excellent in reproducibility by blocking a factor that inhibits reproducibility due to lack of skill or error of the experimenter. Immunoassay—including incubation, detection and washing—can be shortened to 30 minutes or less.
도 1은 본 발명의 SERS 기반 미세유체칩을 구성을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 할로우 금속나노구체의 제조 방법 및 이의 TEM 이미지 (b)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 할로우 금속 나노구체에 항체 및 라만 리포터가 부착된 것을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 할로우 금속 나노구체와 자성 비드가 샌드위치 면역복합체를 형성하고, 이를 이용하여 SERS 면역분석법에 수행하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 5 는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 칩의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩의 레이아웃(a), 미세유체 채널 내의 그루브 믹서(b), 샌드위치 면역복합체(c) 및 미세유체 채널 내에 샌드위치 면역복합체가 트래핑 되는 과정(d)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 채널 내에서의 온-칩 면역분석 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 미세유체 채널 내에 트래핑된 면역복합체의 현미경 사진이다: (a)는 미니솔레노이드가 작동하지 않을 때(전류가 가해지지 않음)의 채널을, (b)는 전류를 가해 미니솔레노이드의 작동(자기장 발생)이 시작되었을 때, (c)는 그로부터 10분 후, 그리고 (d)는 정상상태(steady state) 하에서의 모습을 나타낸다.
도9는 토끼 IgG의 농도 감소에 따른 SERS 스페트럼을 나타낸 것이다: (A) 0 ng/mL, (B) 4 ng/mL, (C) 8 ng/mL, (D) 10 ng/mL, (E) 40 ng/mL, (F) 80 ng/mL, 및 (G) 100 ng/mL.
도 10은 1616 cm-1에서 SERS 신호 세기 변화를 나타낸 것이다. 0에서 100 ng/mL의 전 농도 범위에 걸쳐 선형 관계를 나타낸다(R 2 =0.988). 오차 막대는 4번 측정한 값의 표준편차이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩의 사진(a), 레이아웃(b), 각 채널 분기점의 증폭 이미지(c) 및 각 채널을 가로지르는 형광 세기를 측정한 그래프이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 채널과 공지된 미세유체 채널 내에서의 면역복합체의 트래핑 정도를 비교한 사진이다.
도 13은 본 발명에 따른 온-칩 면역분석법과 공지된 ELISA 분석법을 비교한 결과이다.Figure 1 schematically shows the configuration of the SERS-based microfluidic chip of the present invention.
Figure 2 shows a method for producing a hollow metal nanospheres and a TEM image (b) thereof according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows that the antibody and the Raman reporter is attached to the hollow metal nanospheres according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 schematically shows a process in which hollow metal nanospheres and magnetic beads form a sandwich immunocomplex according to an embodiment of the present invention, and are subjected to SERS immunoassay using the same. FIG.
Figure 5 shows the structure of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
6 is a layout (a) of the SERS-based immunoassay microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, a groove mixer in the microfluidic channel (b), a sandwich immunocomplex (c), and a sandwich immunocomplex in the microfluidic channel. It shows the process of trapping (d).
7 shows an on-chip immunoassay process in a microfluidic channel according to an embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a micrograph of an immunocomplex trapped in a microfluidic channel, according to one embodiment of the invention: (a) shows a channel when the minisolenoid is inoperative (no current is applied), and (b) When (c) is 10 minutes after that, and (d) is under steady state when the minisolenoid starts to operate (magnetic field generation) by applying current.
9 shows SERS spectrum with decreasing concentrations of rabbit IgG: (A) 0 ng / mL, (B) 4 ng / mL, (C) 8 ng / mL, (D) 10 ng / mL, ( E) 40 ng / mL, (F) 80 ng / mL, and (G) 100 ng / mL.
Figure 10 shows the SERS signal strength change at 1616 cm -1 . A linear relationship is shown over the entire concentration range of 0 to 100 ng / mL ( R 2 = 0.988). Error bars are the standard deviation of the four measurements.
11 is a photograph (a) of the SERS-based immunoassay microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, the layout (b), the amplified image (c) of each channel branch point and measured the fluorescence intensity across each channel It is a graph.
12 is a photograph comparing the trapping degree of the immunocomplex in the microfluidic channel and the known microfluidic channel according to an embodiment of the present invention.
Figure 13 is a comparison of the on-chip immunoassay and known ELISA assay according to the present invention.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
Hereinafter, preferred examples are provided to aid the understanding of the present invention, but the following examples are merely illustrative of the present invention, and various changes and modifications can be made within the scope and spirit of the present invention. It is obvious to the skilled person, and it is natural that such variations and modifications fall within the scope of the appended claims.
실시예Example 1: 항체가 1: the antibody is 컨쥬게이셔된Conjugated 할로우Hollow 금 gold 나노구체와Nanospheres and 자성 magnetism 비드Bead 준비 Ready
SERS 프로브인 할로구 금 나노구체(HGNs)에 부착되는 항체 컨쥬게이션(conjugation)은 공지된 문헌에 기재된 방법에 따라 준비하였다(Lee, S. et. al., Biosens . Bioelectron . 2009, 24, 2260-263; Schwartzberg, A. M et. al., Anal. Chem . 2006, 78, 4732-736; Wang, H et. al., J. Phys . Chem . B 2005, 109, 11083-1087). 간단하게 설명하면, N2 퍼징(purging) 조건 하에서 NaBH4를 이용하여 COCl2 를 환원시킴으로써 코발트 나노입자를 합성하고, 이를 HGNs의 주형(template)으로 사용하였다. 50 ㎕ 알리코트(aliquot) 중에서 0.1 M HAuCl4 를 10 배로 첨가하였다. 여기서, 금 원자를 핵형성시키고 코발트 주형을 둘러싼 작은 껍질(shell)로 성장시켰다. N2 퍼징을 중단하여 상기 용액을 실온 조건에 노출시켰을 때, 코발트가 완전히 용해되고 할로우 내부구조가 형성되었다. 이 단계에서, 용액의 색상이 암갈색(dark brown)에서 진청색(deep blue)로 변화하였다. HAuCl4 의 농도를 변화시켜서 벽 두께를 제어할 수 있었다. 도 2(a)에서 HGN 의 제조 방법을 개략적으로 나타내었으며, 도 2(b)에서 HGN의 TEM 이미지를 나타내었다. 본 발명자들이 측정한 바에 따르면, HGN 의 직경 및 벽 두께는 각각 약 45±5 nm 및 15±3 nm 이었다.Antibody conjugation to the SERS probe, halo gold nanospheres (HGNs), was prepared according to methods described in the literature (Lee, S. et. Al., Biosens . Bioelectron . 2009, 24, 2260). Schwartzberg, A. M et. Al., Anal. Chem . 2006, 78, 4732-736; Wang, H et. Al., J. Phys . Chem . B 2005, 109, 11083-1087). In brief, cobalt nanoparticles were synthesized by reducing COCl 2 with NaBH 4 under N2 purging conditions, and used as a template of HGNs. 0.1 M HAuCl 4 was added 10-fold in 50 μl aliquot. Here, the gold atoms were nucleated and grown into small shells surrounding the cobalt template. When N 2 purging was stopped and the solution was exposed to room temperature conditions, cobalt dissolved completely and a hollow internal structure formed. At this stage, the color of the solution changed from dark brown to deep blue. The wall thickness could be controlled by varying the concentration of HAuCl 4 . 2 (a) schematically shows a method of manufacturing HGN, and FIG. 2 (b) shows a TEM image of HGN. As measured by the inventors, the diameter and wall thickness of the HGN were about 45 ± 5 nm and 15 ± 3 nm, respectively.
라만 리포터 분자와 항체의 HGNs으로의 컨쥬게이션(conjugation)은 공지된 문헌에 기재된 대로 수행하였다(Chon, H et. al., Anal . Chem. 2009, 81, 3029-034). 도 3에 HGN에 대한 라만 리포터 분자 및 항체 컨쥬게이션 방법을 나타내었다. 라만 리포터 분자인, MGITC(malachite green isothiocyanate)를 HGNs 표면에 흡착시켰다. MGITC (1.0 μL 의5 × 10-5 M)가 1 mL의 0.7 nM HGN에 첨가되었고, 상기 혼합물을 교반하면서 2 시간 동안 반응시켰다. 입자 당 흡수된 MGITC 분자의 수는 약 70이었다. Conjugation of Raman reporter molecules and antibodies to HGNs was performed as described in the literature (Chon, H et. Al., Anal . Chem . 2009, 81, 3029-034).
그 다음 항체 컨쥬게이션은 디하이드로리포익산(DHLA)을 사용하였다. DHLA 의 두 개의 -SH 말단 기가 절단되어 HGN 표면에 화학적으로 결합하였다. 2.5 ㎕ 의 5 ㎍/mL DHLA가 1mL의 0.7 nM 염료-흡착 HGN에 첨가되었고 1 시간 동안 반응시켰다. 잔존하는 비특이적 부위를 2.5 ㎕ 의 2.5 mM 메르캅토에탄올로 코팅하여 응집을 방지하였다. 상기 용액을 원심분리하여, 용액 내에서 과도하게 비특이적 결합을 한 메르캅토에탄올을 제거하고 침전물을 PBS 완충액으로 2회 세척한 후, 초음파분쇄기를 사용하여 재현탁시켰다. 그 결과, 나노 입자 응집 및 HGNs와 다른 단백질들 사이의 비특이적 반응을 효과적으로 막을 수 있다. -COOH 말단기의 활성화를 위하여, 1.0 ㎕ 의 1.0 mM1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 1.0 ㎕ 의 1.0 mM N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하고 1 시간 동안 반응시켰다. NHS의 EDC와의 에스테르화시의 공유결합에 의한 단백질을 안정적 고정화를 위해, 카르복실레이트-말단화된 HGNs을 사용하였다. 마지막으로, 1.0 ㎕ 의 10 μM 과다량(즉, 나노입자 표면의 COOH 관능기보다 많은 숫자의 항체의 양)의 항-토끼 IgG(Sigma-Aldrich, U.S.A.)를 NHS-활성화된 HGNs에 첨가하였고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 여기서, 항체의 리신 잔기에 의한 NHS 기의 전위(displacement)에 의하여 항체가 HGN 상으로 고정화되었다. HGNs 표면에서 반응하지 않은 NHS기는, 2 시간 동안, 1.0 μL의 1 mM 에탄올아민(ethanolamine)을 이용하여 불활성화(deactivation)시켰다. 원심분리에 의하여 비특이적 결합 화학물질 및 항체를 제거하고, PBS 버퍼로 최종 나노 프로브를 2회 세척하였다. Antibody conjugation was then used with dihydrolipoic acid (DHLA). Two -SH end groups of DHLA were cleaved and chemically bound to the HGN surface. 2.5 μl of 5 μg / mL DHLA was added to 1 mL of 0.7 nM dye-adsorbed HGN and reacted for 1 hour. The remaining nonspecific site was coated with 2.5 μl of 2.5 mM mercaptoethanol to prevent aggregation. The solution was centrifuged to remove excessively nonspecifically bound mercaptoethanol in the solution and the precipitate was washed twice with PBS buffer and then resuspended using an ultrasonic mill. As a result, nanoparticle aggregation and nonspecific reactions between HGNs and other proteins can be effectively prevented. 1.0 μl of 1.0 mM 1 -ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and 1.0 μl of 1.0 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) for activation of the -COOH end group. Was added and reacted for 1 hour. For stable immobilization of proteins by covalent bonds in esterification of NHS with EDC, carboxylate-terminated HGNs were used. Finally, terms of the 10 μ M excess amount (i.e., the amount of antibodies of the larger number than the COOH functional group in the surface of the nanoparticles) of 1.0 ㎕ - was added to the rabbit IgG (Sigma-Aldrich, USA) for NHS- activated HGNs, The reaction was reacted overnight at 4 ° C. Here, the antibody was immobilized onto HGN by displacement of NHS groups by lysine residues of the antibody. NHS groups unreacted in HGNs surface, for 2 hrs, followed by inactivation (deactivation) by using 1 mM ethanolamine (ethanolamine) of 1.0 μ L. Nonspecific binding chemicals and antibodies were removed by centrifugation and the final nano probe was washed twice with PBS buffer.
도 4에 모식적으로 나타낸 것과 같이, SERS 프로브인 자성 비드(Magnetic Bead, 직경 570 nm)에 다클론 항-토끼 IgG 항체를 컨쥬게이션 하는 방법은 공지된 문헌에 기재된 방법에 따라 수행하였다(도 4)(Chon, H.et al., Anal . Chem . 2009, 81, 3029-034).
As shown schematically in FIG. 4, the method of conjugating the polyclonal anti-rabbit IgG antibody to the magnetic beads (Magnetic Bead, diameter 570 nm), which is a SERS probe, was performed according to a method described in a known document (FIG. 4). (Chon, H. et al., Anal . Chem . 2009, 81, 3029-034).
실시예Example 2: 2: SERSSERS 기반 면역분석용 Based immunoassay 미세유체칩Microfluidic Chip 제작 making
다음 3 단계의 과정을 거쳐 미세유체칩을 제작하였다: 폴리디메틸실록산(PDMS) 레플리카(replica) 제작; PDMS에 솔레노이드 배치; 그리고 슬라이드 글래스에 칩 밀봉(Liu, Y. J et al., J. Appl . Phys. 2007, 102, 084911). The microfluidic chip was manufactured through the following three steps: polydimethylsiloxane (PDMS) replica preparation; Solenoid placement in PDMS; And chip sealing in slide glass (Liu, Y. J et al., J. Appl . Phys . 2007, 102, 084911).
먼저 미세유체 채널은 소프트 리소그라피와 PDMS 기술을 이용한 급속 프로토타이핑을 통해 제작하였다(D. Qin, et al., Adv . Mater. 1996, 8, 917). 간단히 언급하면, 몰딩을 위한 마스터는 다음과 같이 제작되었다: 고해상도 레이저 프린터로 패터닝된 투명 마스크를 이용하여, 실리콘 기판 위에 도 5와 같은 형태의 채널을 AZ960 포토레지스트를 이용하여 패터닝하였다. 도 5에 나타난 것과 같이, 항원 및 버퍼 주입부(10), 농도구배 미세유체 채널(20), 항체복합체 형성 미세유체 채널 (30), 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널(40) 및 트래핑 미세유체 채널 (50)의 패턴을 떴다. 도 5에는 구체적으로 도시하지 않았지만 샘플이 배출되는 배출부도 포함하였다. 상기 미세유체 채널의 모양은 구불구불한 S자형이고 각 채널은 선형 채널로 연결하였다. 채널은 복수개로 구성하였다. First, microfluidic channels were fabricated by rapid prototyping using soft lithography and PDMS techniques (D. Qin, et al., Adv . Mater . 1996, 8, 917). Briefly stated, a master for molding was fabricated as follows: Using a transparent mask patterned with a high resolution laser printer, a channel of the type as shown in FIG. 5 was patterned on a silicon substrate using an AZ960 photoresist. As shown in FIG. 5, the antigen and
고해상도 포토마스크(AutoCAD 2008/Auto Desk Inc., OR, USA)를 통해, 그루브 믹서(groove mixer)(도 6(b))을 포함하는 패턴을, 4-인 실리콘 웨이퍼(4-in silicon wafer)에 전사시켰다. Sylgradⓡ 184 PDMS와 경화제를 10:1(v/v)의 비율로 완전하게 혼합하고, 그 다음에 진공 펌프를 이용하여 가스를 빼냈다. 여기서, 그루브 믹서는 반응물의 혼합 효율을 향상시키 위해 채널에 결합되어 미세유체 채널 내에 별도의 채널을 형성한다. 미세유체 채널 내에 그루브 믹서가 형성되어 있으면, 그루브 믹서가 일종의 채널 내의 "방지턱" 역할을 하게 되고 층류(laminar flow: 양쪽에서 들어오는 두 유체의 경계를 의미함) 생성을 방해하는 역할을 한다. 도 6에 나타난 것과 같은 미세유체 채널 내에 주입된 반응물(항원과 버퍼)의 흐름이 합쳐지면서 형성된 합류(confluent stream)는, 채널을 따라가면서, 반복적으로 분기점(node)에서 갈라지거나 이웃하는 흐름과 합쳐져서, 구불구불한 채널 영역에서 확산에 의해 서로 효과적으로 섞일 수 있게 된다.Through a high-resolution photomask (AutoCAD 2008 / Auto Desk Inc., OR, USA), a pattern comprising a groove mixer (Fig. 6 (b)) was formed into a 4-in silicon wafer. Transcribed to Sylgrad ⓡ 184 PDMS and a curing agent of 10: and completely mixed in the ratio of 1 (v / v), the gas pulled using a vacuum pump to the next. Here, the groove mixer is coupled to the channel to form a separate channel in the microfluidic channel to improve the mixing efficiency of the reactants. If a groove mixer is formed in the microfluidic channel, the groove mixer acts as a "barrier" in the channel and interferes with the generation of laminar flow (meaning the boundary between two fluids coming from both sides). The confluent stream formed by combining the flows of reactants (antigens and buffers) injected into the microfluidic channel as shown in FIG. 6 is repeatedly combined at the branching point or neighboring flows along the channel. As a result, diffusion in the meandering channel region can effectively mix with each other.
그 다음, 4 개의 요크(yoke)형 솔레노이드가 미세유체 채널 말단의 배출부 주변에 배치되었다. 각각의 솔레노이드는, 직경 1 mm, 높이 9 mm, 넓이 4 mm 그리고 채널과 1 mm의 갭을 가지는 강유전성(ferroelectic) 요크 위에 구리 선(표면은 래커를 입혀 절연시켰고, 직경은 0.45 nm임)을 26회 감싸서(coiling) 준비하였다. 이 솔레노이드들은 자성 비드를 트래핑하기에 충분한 자기장을 발생시킨다. 이 솔레노이드 양쪽에 전선을 연결해 전류를 공급해 주면 자기장이 발생하고, 발생된 자기장은, 이 기술분야에서 널리 알려진 자기장 확인 기기를 통해 확인할 수 있다. Four yoke solenoids were then placed around the outlet of the microfluidic channel end. Each solenoid has a copper wire (surface lacquered, 0.45 nm in diameter) on ferrolectic yokes with a diameter of 1 mm, a height of 9 mm, a width of 4 mm, and a channel and a gap of 1 mm. Prepared by coiling ash. These solenoids generate a magnetic field sufficient to trap the magnetic beads. When a wire is connected to both sides of the solenoid to supply a current, a magnetic field is generated. The generated magnetic field can be confirmed by a magnetic field checking device which is well known in the art.
최적의 자기장을 발생시키기 위해, 직류와 유도 자기장의 관계에 대해 살펴보았다. 그 결과 유도 자기장은 직류와 선형 관계에 있고, 코일에 2 A의 직류를 가했을 때, 27 mT의 자기장 세기를 얻을 수 있었다. 이 자기장 세기는 본 발명의 온-칩 면역분석법에 가장 적합한 값으로 판단된다. 코일링 회수에 변화를 주면서 다양한 값의 전류 및 자기장 세기를 얻었고, 이러한 과정을 통해 상기 언급한 최적의 값을 알아낼 수 있었다. In order to generate an optimal magnetic field, the relationship between direct current and induced magnetic field has been discussed. As a result, the induced magnetic field was in a linear relationship with the direct current, and when the coil was subjected to a direct current of 2 A, a magnetic field strength of 27 mT was obtained. This magnetic field strength is judged to be the most suitable value for the on-chip immunoassay of the present invention. By varying the number of coilings, various values of current and magnetic field strengths were obtained, and through this process the optimum values mentioned above could be found.
상기 언급한 미니솔레노이드를 실리콘 기판에 장착한 후 PDMS를 부어서 75℃에서 2 시간 동안 경화시킨 후, 경화된 PDMS는 마스터에서 떼어내고 주입부와 배출부를 위한 구멍을 뚫었다. 그 다음, 산소 플라즈마 처리를 하여 PDMS 블럭이 글래스 위에 영원히 부착되도록 하였다. 이와 같은 산화 처리는 하이드록시-말단 표면을 만들어서 접착력을 증가시킨다. PDMS 블럭과 글래스 기판의 접합을 위해, 두 개의 플라스마 처리된 기판을 균일하게 붙였다(conformal contact). 이러한 처리는 Si-O-Si 결합을 형성하여 둘 사이의 간격을 비가역적으로 밀봉시킨다. 그 결과 도 6(a) 및 도 11(a)에 나타난 것과 같은 미세유체칩이 제작되었다After mounting the above-mentioned mini-solenoid on the silicon substrate and pouring the PDMS and curing at 75 ° C. for 2 hours, the cured PDMS was removed from the master and drilled holes for the inlet and outlet. Oxygen plasma treatment was then performed to allow the PDMS block to adhere forever onto the glass. This oxidation treatment creates a hydroxy-terminated surface to increase adhesion. For the bonding of the PDMS block and the glass substrate, the two plasma treated substrates were uniformly contacted (formal contact). This treatment forms a Si—O—Si bond to irreversibly seal the gap between the two. As a result, a microfluidic chip as shown in FIGS. 6 (a) and 11 (a) was produced.
농도구배 채널 네트워크를 이용하여 다양한 농도의 항원 용액을 자동적으로 만들 수 있다. 가지 구조의 채널은 첫 번째 채널의 유체의 농도를 두 번째 채널의 유체의 연속적 흐름(스트림)을 이용하여 연속적으로 희석시킬 수 있다. 결과적으로, 채널 내부의 유체의 층류(laminar flow)가 있더라도, 서로 다른 농도의 흐름을 가지면서 나란히 배열되어 용액들의 다중 스트림이 가능하도록 해 준다. 즉, 본 발명에 따른 채널 내의 반응물들은 서로 잘 섞이어서 다양한 농도를 형성할 수 있다. 개별 스트림의 화학적 조성을 조절하면 다양한 농도의 프로필이 발생될 수 있다. 본 발명에서 제시한 면역분석법은 종래에 연속 희석에 사용되던 마이크로튜브 세트나 마이크로파이펫을 대체할 수 있다.
A concentration gradient channel network can be used to automatically generate antigen solutions of varying concentrations. The branched channel can continuously dilute the concentration of fluid in the first channel using a continuous stream (stream) of fluid in the second channel. As a result, even if there is a laminar flow of fluid inside the channel, it is arranged side by side with different concentrations of flow, allowing multiple streams of solutions. That is, the reactants in the channel according to the invention can be mixed well with each other to form various concentrations. Adjusting the chemical composition of individual streams can result in profiles of varying concentrations. The immunoassay presented in the present invention can replace the microtube set or micropipette that was conventionally used for serial dilution.
실시예Example 3: 3: SERSSERS 신호 측정 방법 Signal measurement method
레니쇼 2000 라만 스펙트로미터(Renishaw 2000 Raman spectrometers, Renishaw, U.K.)가 멜레-그리옷 He-Ne 638 nm 레이저(Melles Griot He-Ne 633 nm laser)와 함께 사용되었다. 콜렉션 패스(collection path)에 위치한 할로그래픽 노치 필터를 사용하여 레일레이 선(Rayleigh line)을 제거하였다. 모든 스펙트럼이 모이기 전에, 521.01 cm-1에서 실리콘 레퍼런스 피크 위치를 측정하고 필요할때 마다 옵셋 보정을 수행하고, 각각의 스펙트로미터는 매일 계산하였다. 633 nm에서 30 mW 레이저 출력을 이용하여 1700-700 cm-1 영역에서 익스탠디드 스캔을 통해 레이저 방사선 스펙트럼을 수집하였다. 10 s의 수집시간과 20 x 대물렌즈를 사용하여 레이저 스팟에 초점을 맞추었다. 라만 산란은 CCD(charge coupled device) 카메라를 사용하여 스펙트럼 해상도 4 cm-1에서 수집하였다. 광학 이미지를 얻기 위해 광학 현미경에 CCD 카메라를 추가로 장착하였다. 모든 스펙트럼 데이터를 GRAM 소프트웨어로 처리하였다. 기준선은 이항 스무딩 알고리즘(binomial smoothing algorithm)을 이용한 스무딩 처리 후에, 750 및 1720 cm-1에서 2점값 기준선 보정(two point level baseline correction)에 의해 조절되었다.
Renishaw 2000 Raman spectrometers (Renishaw, UK) were used with the Meles Griot He-Ne 638 nm laser. The Rayleigh line was removed using a haloographic notch filter located in the collection path. Before all the spectra were collected, the silicon reference peak position was measured at 521.01 cm −1 and offset correction was performed as needed and each spectrometer was calculated daily. Laser radiation spectra were collected via an extended scan in the 1700-700 cm −1 region using a 30 mW laser power at 633 nm. The laser spot was focused using a 10 s acquisition time and a 20 x objective. Raman scattering was collected at a spectral resolution of 4 cm -1 using a charge coupled device (CCD) camera. A CCD camera was further mounted on the optical microscope to obtain an optical image. All spectral data were processed with GRAM software. The baseline was adjusted by two point level baseline correction at 750 and 1720 cm −1 after the smoothing process using a binomial smoothing algorithm.
실시예Example 3: 면역분석 3: immunoassay
도 6은 4개의 미니솔레노이드와 결합된 농도구배 미세유체 채널의 모식도를 나타낸다. 이 채널은 3 부분으로 구성된다. 첫번째 부분은 채널 네트워크를 사용하여 항원 마커를 연속 희석하는 농도구배 채널이다. 이 부분은 항원과 버퍼를 계속적으로 혼합하고 희석하여 일련의 서로 다른 농도의 용액을 만든다. 두 번째 부분은, 샌드위치 면역복합체 형성을 위해 HGNs과 자성 비드를 주입하고 혼합하는 항원복합체 형성 부분이다. 여기서 자성 비드와 HGNs은 채널 내로 주입되고, 흐름 조건 하에서, 서로 다른 농도의 항원 타겟과 혼합된다. 도 6(b)에 나타난 것과 같이, 그루브 형태의 믹서가 채널에 합체되어서 혼합 효율을 향상시킨다. 결과적으로, 도 6(c)에 나타난 것과 같은 항체-항원-항체 반응에 의해 샌드위치 면역복합체가 형성된다. 마지막 부분은 샌드위치 면역복합체를 트래핑하고 검출하는 부분이다. 흐르는 유체의 스트림에서 자성 비드를 빠르고 효율적으로 트래핑하기 위해, 도 6(d)에 나탄 것과 같이 각 채널의 말단부에 두 개의 미니솔레노이드가 배열된다. 면역복합체가 트래핑된 후, 각 미세유체 채널에 레이저빔을 조사하여 SERS 신호를 측정한다.Figure 6 shows a schematic of the concentration gradient microfluidic channel coupled with four minisolenoids. This channel consists of three parts. The first part is the concentration gradient channel which serially dilutes the antigen markers using the channel network. This section continuously mixes and dilutes the antigen and buffer to form a series of different concentration solutions. The second part is an antigen complex forming part which injects and mixes HGNs and magnetic beads to form a sandwich immunocomplex. Here magnetic beads and HGNs are injected into the channel and, under flow conditions, are mixed with different concentrations of antigen target. As shown in Figure 6 (b), a grooved mixer is incorporated in the channel to improve the mixing efficiency. As a result, a sandwich immunocomplex is formed by an antibody-antigen-antibody reaction as shown in Fig. 6 (c). The last part is the trapping and detection of sandwich immunocomplex. In order to trap magnetic beads quickly and efficiently in the stream of flowing fluid, two minisolenoids are arranged at the distal end of each channel, as shown in Figure 6 (d). After the immunocomplex is trapped, each microfluidic channel is irradiated with a laser beam to measure the SERS signal.
또한, 도 7은 온-칩 면역분석법을 개략적으로 나타낸 것이다. 먼저, 도면에는 나타내지 않았지만, 반응물(버퍼, 항원 및 나노입자 등)를 시린지에 옮기고 이를 시린지 펌프에 장착하여 미세하게 유속을 조절할 수 있도록 한다. 시린지와 칩은 10 cm 길이의 튜브로 연결한다. 면역분석법은 다음 단계로 수행되었다: (a) 토끼 IgG 항원(Sigma-Aldrich, U.S.A.)및 버퍼(0.05% PBS 용액)를 준비하여 항원 및 버퍼 주입부에 주입하였고, 상기 주입된 항원 및 버퍼의 흐름이 아래로 이동하면서 농도구배 미세유체 채널에서 상기 항원과 버퍼가 혼합되고 상기 농도구배 미세유체 채널을 따라 상기 항원의 농도가 연속 희석되면서 다양한 농도의 토끼 IgG 항원 용액을 만들었다; (b) 다클론 항토끼 IgG 항체(Sigma-Aldrich, U.S.A.)가 컨쥬게이션된 HGNs와 단클론 항토끼 IgG 항체(Sigma-Aldrich, U.S.A.)가 컨쥬게이션된 자성 비드가 항체 복합체 형성 채널에 주입되었다; (c) 상기 항체 복합체가 농도구배 채널에서 흘러 내려오는 다양한 농도의 연속 희석된 항체와 혼합되어 샌드위치 면역복합체가 형성되었다; (d) 상기 샌드위치 면역복합체를 자기장을 이용하여 트래핑 채널 내부에 고정화시키고 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 이를 버퍼 용액(PBS)으로 세척하여 항원, 자성 비드 및 HGNs의 비특이적 결합을 제거하였다; (e) 상기 트래핑 채널에 고정화된 면역복합체의 SERS 신호를 측정하였다. 이 과정에 소요된 시간은 총 30분 이었다.In addition, Figure 7 schematically shows an on-chip immunoassay. First, although not shown in the drawings, the reactants (buffers, antigens and nanoparticles, etc.) are transferred to a syringe and mounted on a syringe pump to finely control the flow rate. The syringe and chip are connected by a 10 cm long tube. Immunoassay was performed in the following steps: (a) Rabbit IgG antigen (Sigma-Aldrich, USA) and buffer (0.05% PBS solution) were prepared and injected into the antigen and buffer infusion, and the flow of the injected antigen and buffer Moving down this, the antigen and buffer were mixed in the gradient microfluidic channel and the concentration of the antigen was serially diluted along the gradient gradient microfluidic channel to produce rabbit IgG antigen solutions of varying concentrations; (b) HGNs conjugated with polyclonal anti-rabbit IgG antibody (Sigma-Aldrich, U.S.A.) and magnetic beads conjugated with monoclonal anti-rabbit IgG antibody (Sigma-Aldrich, U.S.A.) were injected into the antibody complex forming channel; (c) the antibody complex was mixed with various concentrations of serially diluted antibodies flowing down the concentration gradient channel to form a sandwich immunocomplex; (d) The sandwich immunocomplex was immobilized inside the trapping channel using a magnetic field and incubated for 10 minutes. It was then washed with buffer solution (PBS) to remove nonspecific binding of antigens, magnetic beads and HGNs; (e) The SERS signal of the immunocomplex immobilized on the trapping channel was measured. This process took a total of 30 minutes.
도 8에 나타난 것과 같이, 트래핑 채널의 측면에 위치한 4 개의 미니솔레노이드는 채널 내부의 샌드위치 면역복합체의 트래핑 효율을 높여준다. 적합한 자기장을 발생시키기 위해, 직류 및 유도 자기장의 관계를 조사하였다. 유도 자기장은 전류와 선형 관계에 있다. 코일에 2 A의 전류를 가했을 때 27 mT의 자기장을 얻을 수 있는데, 이는 재생가능 SERS 측정에 가장 적합한 수치이다. 도 7은 적정 자기장 하에서 4개의 평행한 채널의 자성 비드 캡쳐 상태를 보여준다. 솔레노이드 전원이 켜지면 채널 주위에 자기장이 유도되어 자성 비드가 채널에 트래핑된다. SERS 신호를 측정하기에 충분한 자성 비드를 모으기 위해, 트래핑된 자성 비드들을 모아서 10분 동안 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 이 자성 비드들을 버퍼 용액으로 세척하였다. 마지막으로 시린지 펌프를 멈추고 레이저 스팟을 각 채널로 이동시키면서 정적인 상태에서 SERS 신호를 측정하였다. As shown in FIG. 8, four minisolenoids located on the side of the trapping channel enhance the trapping efficiency of the sandwich immunocomplex inside the channel. In order to generate a suitable magnetic field, the relationship between direct current and induced magnetic field was investigated. The induced magnetic field is in linear relation with the current. Applying a current of 2 A to the coil results in a magnetic field of 27 mT, which is the best value for renewable SERS measurements. 7 shows magnetic bead capture states of four parallel channels under appropriate magnetic field. When the solenoid is powered on, a magnetic field is induced around the channel, causing magnetic beads to trap in the channel. To collect enough magnetic beads to measure the SERS signal, the trapped magnetic beads were collected and incubated for 10 minutes. These magnetic beads were then washed with buffer solution. Finally, the syringe pump was stopped and the SERS signal was measured in the static state while moving the laser spot to each channel.
라만 리포터 분자(MGITC)의 SERS 신호 강도-HGNs에 흡착된-는 다른 화학 조성물이나 항체에서 측정한 것보다 우월하다. MGITC가 표시된 HGNs 단독의 SERS 스펙트럼과 샌드위치 면역복합체의 SERS 스펙드럼이 서로 비교되었고, 모든 스펙트럼에서 MGITC로부터의 SERS 신호가 관찰되었다. 이것은 MGITC의 SERS 신호가 다른 것들보다 훨씬 강하고, 이 신호의 변화를 통해 항원 마커의 정량분석이 가능함을 의미한다.The SERS signal intensity of the Raman reporter molecule (MGITC), adsorbed to HGNs, is superior to that measured by other chemical compositions or antibodies. SERS spectra of MGNTC-labeled HGNs alone and SERS spectra of sandwich immunocomplexes were compared with each other, and SERS signals from MGITC were observed in all spectra. This means that MGITC's SERS signal is much stronger than others, and changes in this signal enable quantitative analysis of antigen markers.
7개의 서로 다른 토끼 IgG 항원 농도를 만들기 위해서, 2개의 농도 구배 미세유체 채널이 사용되었다(도 6). 도 9는 각각의 미세유체 채널의 샌드위치 면역복합체로부터 얻은 SERS 스펙트럼을 보여준다. IgG 항원이 없는 경우, 약한 SERS 신호가 검출되었다(0 ng/mL). 이것은 대부분의 HGNs이 세척을 통해 용액에서 제거되었어도 비특이적 결합에 의해 용액 내에 소량의 HGNs이 잔존함을 의미한다. 그러나 이 요소는 측정 과정에서 고려된다. 라만 피크의 강도는 항원의 농도가 증가함에 따라 증가한다. 1616 cm-1에 집중되어 있는 라만 피크는, 상기 항원의 정량적인 값으로 사용된다. 이 검정 곡선은 도 10에 나타나 있는데, 여기서 오차 막대는 4개 측정값의 표준 편차를 의미한다. 0에서 100 ng/mL 농도 범위 내의 명확한 선형 반응 곡선을 얻을 수 있다. 또한, 도 10을 통해 알 수 있는 것과 같이, 항원의 농도가 낮을수록 오차 막대의 범위가 작아서 정확한 분석이 가능함을 알 수 있다. To create 7 different rabbit IgG antigen concentrations, two concentration gradient microfluidic channels were used (FIG. 6). 9 shows SERS spectra obtained from sandwich immunocomplexes of each microfluidic channel. In the absence of an IgG antigen, a weak SERS signal was detected (0 ng / mL). This means that even though most HGNs were removed from the solution by washing, a small amount of HGNs remained in the solution by nonspecific binding. However, this factor is taken into account during the measurement. The intensity of the Raman peak increases with increasing antigen concentration. The Raman peak concentrated at 1616 cm −1 is used as a quantitative value of the antigen. This calibration curve is shown in Figure 10, where the error bars represent the standard deviation of the four measurements. Clear linear response curves can be obtained within a concentration range of 0 to 100 ng / mL. In addition, as can be seen through Figure 10, the lower the concentration of the antigen, the smaller the range of the error bar can be seen that accurate analysis is possible.
이를 통해 본 발명에 따른 SERS 기반 미세유체칩을 이용하여 고감도 및 고재현성의 면역분석이 가능함을 알 수 있다. 특히 농도 구배 채널 마이크로네트워크를 적용하면, 일일이 손으로 수행하는 단조로운 희석 작업을 피할 수 있다. 그리고 본 발명에 따른 면역분석 시간은 종래의 ELISA 기반 분석법과 비교하였을 때, 자성 비드가 가지는 높은 값의 부피 대 표면적의 비율 때문에, 매우 많이 단축된다. 토끼의 IgG 항원의 LOD는 1-4.5 ng/mL로 나타났다.
Through this, it can be seen that the immunoassay of high sensitivity and high reproducibility is possible using the SERS-based microfluidic chip according to the present invention. The application of concentration gradient channel micronetworks, in particular, avoids the monotonous dilution by hand. In addition, the immunoassay time according to the present invention is very shortened due to the high ratio of volume to surface area of magnetic beads when compared to conventional ELISA based assays. The LOD of the rabbit IgG antigen was found to be 1-4.5 ng / mL.
시험예Test Example : 항원 농도의 자동 희석 확인 : Automatic dilution confirmation of antigen concentration
농도구배 미세유체 채널에서의 혼합 효율 및 정확한 마커 농도 발생 여부를 측정하기 위해, 공초첨 현미경을 이용한 형광 측정을 수행하였다. 상기 형광 측정법은, 본 실시예에서 이용한 샘플의 위치에 샘플 대신 형광 염료를 넣고, 농도구배 채널을 지나면서 형광 염료가 희석되도록 한 다음, 솔레노이드 위치에서 형광의 세기를 측정하여 희석 배율을 측정하는 방법을 이용하여 수행하였다. 도 11은 붉은 퀀텀 도트(QD: 655 nm 형광 방출)를 사용한 혼합 테스트의 결과를 나타낸 것이다. 본 발명에서는 토끼 IgG를 타겟 항원으로 이용하였다. 형광 측정을 위한 적정 유속을 알아내기 위해, 항원을 주입하기 위해 사용하는 마이크로시린지 펌프를 조절하여 0.1에서 2.0 μL/min의 유속을 다양하게 변화시켰다. 그 결과, 1.0 μL/min (토끼 IgG 항원 및 0.05% PBS 버퍼) 및 1.5 μL/min(HGNs 및 자성 비드)의 유속의 경우에, 각각의 분기점 포인트에서 안정적인 층류를 발생시키는 것으로 나타났다(도 11(c)의 1-7). 층류는, 앞서 설명하였듯이, 두 용액의 경계를 의미한다. 두 용액이 같은 압력으로 들어오면 양쪽에서 같은 힘으로 두 용액을 밀어주게 되고, 마이크로 채널의 표면적이 부피의 비보다 매우 크기 때문에 두 용액이 잘 섞이지 못하고 대립하게 된다. 본 발명에서는 층류가 형성되는 위치를 통해 두 용액이 섞이는 비율을 예측할 수도 있다. 또한 안정적인 층류의 형성은 양쪽의 힘이 균일하다는 것을 의미하기 때문에 농도의 구배가 재현성 있게 발생되고 있다는 사실을 알 수 있다.Fluorescence measurements were performed using confocal microscopy to determine the mixing efficiency and correct marker concentration in the concentration gradient microfluidic channel. In the fluorescence measurement method, a fluorescent dye is placed in place of the sample used in the present embodiment, the fluorescent dye is diluted while passing through the concentration gradient channel, and the dilution ratio is measured by measuring the intensity of fluorescence at the solenoid position. It was performed using. FIG. 11 shows the results of a mixing test using red quantum dots (QD: 655 nm fluorescence emission). In the present invention, rabbit IgG was used as a target antigen. To determine the proper flow rate for fluorescence measurements, the microsyringe pump used to inject the antigen was adjusted to vary the flow rate from 0.1 to 2.0 μL / min. As a result, in the case of a flow rate of 1.0 μ L / min (rabbit IgG antigen and 0.05% PBS buffer), and 1.5 μL / min (HGNs and magnetic beads), it was found to generate a stable laminar flow in each of the fork points (Fig. 11 1-7 of (c). Laminar flow, as described above, means the boundary between two solutions. When the two solutions come in at the same pressure, they push both solutions with the same force on both sides, and the two solutions do not mix well because the surface area of the microchannel is much larger than the ratio of the volume. In the present invention, it is also possible to predict the ratio of mixing of the two solutions through the position where the laminar flow is formed. In addition, since the formation of stable laminar flow means that the forces on both sides are uniform, it can be seen that a gradient of concentration is generated reproducibly.
두 개의 주입부에서 들어온 항원과 버퍼의 흐름이 합쳐지면서 형성된 합류(confluent stream)는 채널을 따라 가면서, 반복적으로 분기점(node)에서 갈라지거나 이웃하는 흐름과 합쳐져서, 구불구불한 채널 영역에서 확산에 의해 서로 섞일 수 있었다. 여기서, 그루브 형태의 믹서가 채널과 합쳐져 있으므로 혼합 효율이 향상되었다. 결과적으로 항원 농도가 감소함에 따라 형광 강도는 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 감소한다. 도 11(c)의 아래 그림의 (A)-(D)의 프로필은 각 채널을 가로지는 형광 강도의 변화를 보여준다. 각 채널의 형광 강도는 (A)는 100%, (B)는 80%, (C)는 40% 및 (D)는 0%로 측정되었다. 따라서 본 발명에 따른 농도구배 채널을 이용하면, 항원의 농도가 기하급수적으로 감소한 일련의 용액을 자동적으로 만들 수 있다. 이 디자인을 이용하면 희석의 각 단계에서 항원과 버퍼를 1:1로 섞을 수 있다. 그리하여 각각의 희석 단계에서 항원의 농도는 1/2까지 감소한다.
The confluent stream formed by the confluence of the antigen and buffer flows from the two infusions merges along the channel and repeatedly merges with the neighboring flow or splits at the node, by diffusion in the serpentine channel region. Could mix with each other. Here, since the grooved mixer is combined with the channel, the mixing efficiency is improved. As a result, the fluorescence intensity decreases from left to right as the antigen concentration decreases. The profile of (A)-(D) in the lower figure of FIG. 11 (c) shows the change in fluorescence intensity across each channel. The fluorescence intensity of each channel was measured as (A) 100%, (B) 80%, (C) 40% and (D) 0%. Therefore, using the concentration gradient channel according to the present invention, it is possible to automatically create a series of solutions in which the concentration of the antigen is exponentially reduced. This design allows 1: 1 mixing of antigen and buffer at each stage of dilution. Thus, the concentration of antigen in each dilution step is reduced by half.
비교예Comparative example 1: 자성 1: magnetic 비드Bead 트래핑Trapping 비교 compare
도 12 (a)는 농도구배 미세유체 채널을 이용하지 않고, 항체가 컨쥬게이션된 자성 비드를 미세유체 채널 벽면에 고정시키고 항원 샘플을 채널 내로 도입하고, 일자형 솔레노이드를 적용하였을 때, 샌드위치 면역복합체의 트래핑 정도를 나타낸 것이다. 도 12(a)는 전류를 최대 3 A까지 흘려주었으나, 트래핑이 충분히 일어나지 않고 면역복합체가 한쪽으로 치우쳐서 불균일하게 트래핑됨을 알 수 있다. 이에 반해, 도 12(b)는 본 발명의 미세유체 채널 및 요크 형태의 미니솔레노이드를 이용하여 면역복합체를 트래핑한 모습이다. 2 A의 전류를 흘려주었는데도 면역복합체가 채녈 내에 매우 많이 그리고 균일하게 트래핑됨을 알 수 있다.
Figure 12 (a) shows that when the magnetic beads conjugated with the antibody is fixed to the microfluidic channel wall without using the concentration gradient microfluidic channel, the antigen sample is introduced into the channel, and the linear solenoid is applied, The degree of trapping is shown. 12 (a) shows a current flowing up to 3 A, but it can be seen that the trapping does not occur sufficiently and the immunocomplex is unevenly trapped to one side. On the contrary, FIG. 12 (b) shows the trapping of the immunocomplex using the microfluidic channel and the yoke type minisolenoid of the present invention. Even with a current of 2 A, the immunocomplex traps very much and uniformly in the channel.
비교예Comparative example 2: 2: ELISAELISA 분석법과의 비교 Comparison with the method
본 발명에서 사용한 토끼 IgG 항원의 면역분석을 샌드위치 ELISA 및 본 발명의 SERS 기반 미세유체칩을 이용하여 수행하였다. 샌드위치 ELISA의 경우 이 기술분야에 널리 알려진 방법이다. 간단하게 언급하면, 고분자로 구성된 ELISA 플레이트에 포획항체를 물리적 방법으로 부착하여 항원을 넣어 주고 항원-항체 반응을 진행한 다음, 검출항체를 도입하여 항체-항원-항체의 샌드위치 복합체를 형성하고, 이에 발색할 수 있는 2차 항체를 도입하여, 상업화된 ELISA 스캐너로 발색단의 흡광을 분석하였다. 그 결과를 도 13 및 하기 표 1에 나타내었다.
The immunoassay of the rabbit IgG antigen used in the present invention was performed using a sandwich ELISA and the SERS-based microfluidic chip of the present invention. Sandwich ELISAs are well known in the art. In brief, a capture antibody is attached to an ELISA plate composed of a polymer by a physical method, an antigen is introduced, an antigen-antibody reaction is performed, and then a detection antibody is introduced to form a sandwich complex of the antibody-antigen-antibody. A secondary antibody capable of developing color was introduced and the absorbance of the chromophore was analyzed with a commercialized ELISA scanner. The results are shown in FIG. 13 and Table 1 below.
본 발명에 따른 신규한 SERS 기반 미세유체칩 및 이를 이용한 온-칩 면역분석법은 빠르고 정확하게 질병을 진단할 수 있는 임상 도구로 활용될 수 있다.
The novel SERS-based microfluidic chip and on-chip immunoassay using the same according to the present invention can be utilized as a clinical tool for diagnosing diseases quickly and accurately.
Claims (12)
상기 항원 및 버퍼 주입부에 연결되며, 상기 항원의 농도가 연속 희석(serial dilution)되는 농도구배(gradient) 미세유체 채널;
상기 농도구배 미세유체 채널 하단에 연결되며, 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션된 할로우(hallow) 금속 나노구체 및 자성 비드가 주입되어 흐르는 항체복합체 형성 미세유체 채널;
상기 항체복합체 형성 채널 하단에 연결되며, 상기 항원과 상기 할로우 금속 나노구체 및 자성 비드가 서로 만나 항원-항체 반응을 하여 샌드위치 면역복합체를 형성하는, 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널; 및
상기 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널 하단에 연결되며, 자기장을 발생시키는 미니솔레노이드와 함께 배열되어 상기 샌드위치 면역복합체가 트래핑되는 트래핑 미세유체 채널;
을 포함하는 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 기반 면역분석용 미세유체칩.
Each independently formed antigen and buffer injection unit;
A gradient microfluidic channel connected to the antigen and the buffer infusion unit, wherein the concentration of the antigen is serially diluted;
An antibody complex-forming microfluidic channel connected to the bottom of the concentration gradient microfluidic channel and injecting hollow metal nanospheres and magnetic beads conjugated with an antibody specifically binding to the antigen;
A sandwich immunocomplex forming microfluidic channel connected to a lower end of the antibody complex forming channel, wherein the antigen, the hollow metal nanospheres, and the magnetic beads meet with each other to form an sandwich immune complex by antigen-antibody reaction; And
A trapping microfluidic channel connected to a bottom of the sandwich immunocomplex forming microfluidic channel and arranged with a minisolenoid generating a magnetic field to trap the sandwich immunocomplex;
Surface-enhanced Raman scattering (SERS) -based microfluidic chip for immunoassay comprising a.
상기 농도구배 미세유체 채널; 항체복합체 형성 미세유체 채널 및 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널은 다중 채널인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The concentration gradient microfluidic channel; Antibody complex forming microfluidic channel and sandwich immunocomplex forming microfluidic channel are multiple channels, SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 다중 채널은 S자형을 가지는 다중 채널인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 2,
The multi-channel is a multi-channel having an S-shaped, SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 농도구배 미세유체 채널은 그 내부에 그루브 믹서(groove mixer)를 이용한 미세 채널을 더 포함하는 것인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The concentration gradient microfluidic channel further comprises a microchannel using a groove mixer (groove mixer) therein, SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 농도구배 미세유체 채널; 상기 항체복합체 형성 미세유체 채널 및 상기 샌드위치 면역복합체 형성 미세유체 채널은 복수개로 형성되는 것인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The concentration gradient microfluidic channel; The antibody complex forming microfluidic channel and the sandwich immunocomplex forming microfluidic channel are formed in plural, SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩은 자기력 유도 장치를 추가적으로 더 포함하는 것인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The SERS-based immunoassay microfluidic chip further comprises a magnetic force induction device, SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 항체복합체 형성 미세유체 채널은, 각각 독립적으로 형성된, 상기 HGN이 주입되는 HGN 주입부와 상기 자성 비드가 주입되는 자성 비드 주입부; 및 상기 주입된 상기 HGN과 자성 비드가 이동하면서 서로 만나는 접합부를 포함하여 구성되는 것인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The antibody complex forming microfluidic channel may be formed independently of each other, the HGN injection unit into which the HGN is injected, and the magnetic bead injection unit into which the magnetic beads are injected; And the junction where the injected HGN and magnetic beads meet each other while moving, SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 트래핑 미세유체 채널의 상기 미니솔레노이드에 2 A의 전류를 가했을 때 27 mT의 자기장이 발생하면서, 상기 샌드위치 면역복합체 상기 트래핑 미세유체 채널의 내벽에 고정되는 것인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
A 27 mT magnetic field is generated when a current of 2 A is applied to the minisolenoid of the trapping microfluidic channel, and the sandwich immunocomplex is fixed to an inner wall of the trapping microfluidic channel. .
상기 미니솔레노이드는 요크(yoke) 형태인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The mini-solenoid is in the form of a yoke (yoke), SERS-based immunoassay microfluidic chip.
상기 샌드위치 면역복합체는 상기 트래핑 미세유체 채널 내벽에 균일하게 고정되는 것을 특징으로 하는 SERS 기반 면역분석용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The sandwich immunocomplex is SERS-based immunoassay microfluidic chip, characterized in that uniformly fixed to the inner wall of the trapping microfluidic channel.
항원 및 버퍼를 준비하는 단계;
상기 항원 및 버퍼를 항원 및 버퍼 주입부에 주입하는 단계;
상기 주입된 항원 및 버퍼의 흐름이 아래로 이동하면서 농도구배 미세유체 채널에서 상기 항원과 버퍼가 혼합되고 상기 농도구배 미세유체 채널을 따라 상기 항원의 농도가 연속 희석되는 단계;
상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체와 자성 비드가 항체 복합체 형성 미세유체 채널에 주입되는 단계;
상기 농도 구배 미세유체 채널을 따라 이동하면서 연속 희석된 항원과, 상기 항체 복합체 형성 미세유체 채널을 따라 이동하는 항체가 컨쥬게이션된 할로우 금속 나노구체 및 자성 비드가 서로 만나 항원-항체 반응을 하여 샌드위치 면역복합체를 형성하는 단계;
상기 샌드위치 면역복합체를 자기장을 이용하여 미세유체 채널 내벽에 트래핑하는 단계; 및
상기 트래핑된 샌드위치 면역복합체에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하는 단계.
On-chip immunoassay method using SERS-based immunoassay microfluidic chip according to any one of claims 1 to 10, comprising the following steps:
Preparing an antigen and a buffer;
Injecting the antigen and the buffer into an antigen and a buffer injection unit;
The antigen and the buffer are mixed in the concentration gradient microfluidic channel while the flow of the injected antigen and the buffer moves downward, and the concentration of the antigen is continuously diluted along the concentration gradient microfluidic channel;
Injecting hollow metal nanospheres and magnetic beads conjugated with an antibody specifically binding to the antigen into an antibody complex-forming microfluidic channel;
An antigen-antibody reaction is performed by antigen-antibody reactions between antigens that are serially diluted while moving along the concentration gradient microfluidic channel, hollow metal nanospheres conjugated with antibodies that move along the antibody complex-forming microfluidic channel, and magnetic beads to antigen-antibody reactions. Forming a complex;
Trapping the sandwich immunocomplex on the inner wall of the microfluidic channel using a magnetic field; And
Measuring the SERS signal by irradiating the trapped sandwich immunocomplex with laser light.
상기 자기장은 2 A의 전류를 가했을 때 유도되는 27 mT의 자기장인, SERS 기반 면역분석용 미세유체칩을 이용한 온-칩 면역분석 방법.
The method of claim 11,
The magnetic field is a 27 mT magnetic field induced by applying a current of 2 A, on-chip immunoassay method using a microfluidic chip for SERS-based immunoassay.
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