KR20120014899A - Ｃｈｏ／ｃｅｒｔ 세포주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명은 CERT S132 A 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 포함하는 생산 숙주 세포주를 기재한다. 상기 세포주는 개선된 성장 특성 및 높은 CERT S132A 발현 수준을 갖는다. 본 발명은 특히 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 2개의 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 바람직한 생산 숙주 세포를 제조하는 방법 및 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 2개의 세포주를 사용하여 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포 배양 기술 분야, 구체적으로 세라미드 전달 단백질(CERT) 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 함유하는 생산 숙주 세포주에 관한 것이다. 상기 세포주는 비-유전자전이된 세포주와 비교하여 개선된 분비 특성을 갖는다.
사람 치료용 생물약제에 대한 시장은 계속 고속 성장을 하고 있고 임상 연구에서 900개 초과의 생물약제가 평가되고 있고 2010년에는 500억의 매출이 예상된다. 수년간, 증가하는 수의 생물약제가 포유동물 세포로부터 제조되고 있고 이는 상기 세포가 사람 단백질을 올바르게 가공하고 변형시키는 능력때문이다. 따라서 포유동물 세포로부터 생물약제의 성공적인 고수율의 생산이 중요하고 이는 상기 공정에 사용되는 재조합 모노클로날 세포주의 특성에 의존한다.
대부분의 생물약제 제품은 생산 공정 동안에 세포로부터 분비되는 단백질이기 때문에 생산 세포주의 분비 수송 기구가 신규 숙주 세포 가공 기술 전략을 위한 또 다른 흥미로운 표적이다.
단백질 분비는 복잡한 다단계 기작이다: 세포 외부 공간 또는 원형질막 외부로 수송되어야 하는 단백질은 먼저 해독과 동시에 소포체내로 진입한다. 여기에서 이들은 지질 소포체내에 패킹되고 골지체로 수송되며 최종적으로 트랜스-골지체 네트워크(TGN)로부터 원형질막으로 수송되어 여기서 이들은 배양 배지로 방출된다.
많은 가공 방법은 전사 및 해독과 같은 과정을 구동시키는, 날로 밝혀지고 있는 분자 네트워크에 대한 이해를 통해 단백질 생산에서 상기 단계의 수율을 증가시켰다. 그러나, 임의의 다단계 생산 공정과 관련하여, 상기 연쇄 과정의 조기 단계동안에 병목 확장은 추가의 다운스트림, 특히 해독후 과정에서 능히 병목을 생성시킨다. 특정 임계점까지 생산 세포의 비생산성(specific productivity)은 생성물 유전자 전사 수준과 선형 상관관계에 있는 것으로 보고되었다. 그러나 mRNA 수준에서 생성물 발현의 추가의 증진은 단백질의 합성, 폴딩 또는 수송 기구의 과부하를 유발하여 단백질 생성물이 세포내에 축적된다. 실제로 이것은 현재 제조 공정에서 흔하게 관찰될 수 있다.
따라서, 재조합 단백질 생산을 위해 숙주 세포의 분비 능력을 개선시킬 필요가 있다. 이것은 해독후 병목 및 단백질 생성물의 세포내 축적을 차단하기 위한 신규 전사 증진 기술과 결부되고 고 역가 공정에서 더욱 중요해졌다.
그러나, 해독후 기구를 표적화하기 위한 선행기술의 방법은 성공하지 못하였고 연구 또는 초기 생산성 수준에 사용되는 세포주 또는 생성물에 따라 모순된 결과를 유발하였다:
- ER-체류 분자 샤페론(chaperone) BiP(결합 단백질 BiP/GRP78)의 과발현은 예상치않게 분비를 감소시켰고;
- 효소 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)의 증진된 발현은 모순된 결과를 보여주었다.
전사 인자 X-박스 결합 단백질 1(XBP-1)를 사용한 분비 가공 기술은 어떠한 효과도 나타내지 않거나 분비를 증진시켜 이와 동시에 아폽토시스 세포 사멸이 증가되어 불안정한 표현형을 유발하고 XBP-1 고발현 클론의 분리를 차단하는 것으로 관찰되었다.
따라서, 현재, 분비 수송 기구의 표적화된 조작에 2개의 주요 장애가 있다: 근본적인 조절 기작에 대해 여전히 제한된 지식 및 생산자 세포의 수반되는 성장 억제 또는 아폽토시스 반응을 차단시키기 위한 요건.
본 발명은 2개의 특이적 신규 생산 숙주 세포주 CHO/CERT 2.20 및 CHO/CERT 2.41을 기재한다. 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 상기 2개의 세포주는 이들이 양호한 성장 특성 뿐만 아니라 개선된 분비 능력을 가지므로 재조합 단백질 생산을 위해 이상적인 숙주 세포주이다.
본 발명자는 최근에 스테로이드성 급성 조절 관련 지질 전달(START) 도메인 계열 기원의 단백질, 바람직하게는 세라미드 전달 단백질(CERT)의 과발현에 의한 분비 가공 기술이 진핵 세포로부터 분비 경로를 통해 수송되는 단백질의 생산을 효율적으로 개선시키는 방법을 제공함을 밝혔다[문헌참조: Florin et al, 2009 및 특허 출원 WO2008/107388, 본원에 참조로서 인용됨].
CERT (또한 굿파스쳐(Goodpasture) 항원 결합 단백질로서 공지됨)는 소포체(ER)에서의 생산 부위로부터 골지체 막(여기서, 스핑고마이엘린(SM)으로의 전환이 일어난다)으로의 세라미드의 비-소포성 전달에 필수적인 시토졸 단백질이다(문헌참조: Hanada et al., 2003). 본 발명자는 현재 Ser → Ala의 점 돌연변이를 갖고 단백질 키나제 D에 의해 더 이상 인산화되지 않는 CERT 돌연변이 S132가 분비를 증진시키는데 있어서 야생형 단백질보다 상당히 효과적임을 입증한다. 추가로, 본 발명자는 현재 CERT S132A 발현 수준이 이의 분비 증진 효과와 상호 관련이 있음을 보여주고 이는 이종성 CERT S132A의 수준이 세포에서 보다 높을수록 상기 세포의 분비 능력이 보다 높아짐을 의미한다(도 2):
CERT S132A 발현 수준과 항체 비생산성 간의 상호관계를 조사하기 위해 본 발명자는 세포내 FACS 염색에서의 시그널 강도에 의해 판단되는 바와 같이 2개의 클론 세포주는 CERT 돌연변이 발현 수준이 낮고 2개는 높음을 분석하였다(도 2A). 7일의 유가식 공정에서, 모의 형질감염된 대조군 세포주가 15pcd의 평균 생산성을 보여주었다(도 2B). 낮은 수준의 CERT SA 돌연변이를 발현하는 세포 클론의 비생산성은 단지 약간 상승한 반면 고수준의 CERT 돌연변이를 갖는 클론들은 약 23pcd의 IgG 생성물을 분비하였고 따라서 모의 대조군과 비교하여 명백히 증가된 비생산성을 보여주었다(도 2B). 이들 데이터는 재조합 단백질 분비와 CERT S132A 과발현 수준에 대한 양성 효과간에 상호관련성이 존재함을 보여준다.
추가로, 본 발명자는 선택된 세포 클론 CHO/CERT S132A 2.20 및 CHO/CERT S132A 2.41이 놀랍게도 다른 클론보다 현저히 양호하게 성장하고 심지어 모 CHO 야생형 세포주보다 양호하게 성장함을 보여준다(도 5A 및 B).
낮은 성장 능력이 하기 요인에 의해 생물약제 생산 공정의 여러 측면에 대해 음성 효과를 나타내기 때문에 우수한 성장 특성은 특히 생산 숙주 세포주를 위해 중요하다:
■ 세포의 지연된 세대 시간(이는 세포주 발육 시간을 지연시킨다)
■ 단일 세포 클로닝 후 보다 저하된 효율 및 이후 보다 느려진 성장
■ 특히 대규모의 생산 발효기에 대해 접종하는 경우에, 스케일 업 동안의 보다 긴 기간
■ 발효기 작동당 보다 저하된 생산 효율.
따라서, 본 발명에 의해 특정 문제를 해결하기 위해서는 하기의 특성을 나타내는 CERT S132A 가공된 숙주 세포주를 작제하는 것이다:
■ 고발현 수준의 CERT 돌연변이 S132A 및
■ 최적의 세포 성장.
본 발명은 분비가 최적화되고 성장 성질이 양호한 2개의 당해 가공된 CHO/CERT S132A 세포주의 제조를 기재한다. 본 발명에서 제공된 모노클로날 세포주는 재조합 단백질 생성물의 발현 및 제조를 위한 생산 능력이 증진된 최적화된 숙주 세포 시스템으로서 특히 유용하다.
상기 2개의 세포주는 CHO-DG44 숙주 세포주를 사람 CERT S132A 단백질을 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시키고 이어서 안정한 세포 풀을 제조하기 위해 선별함에 의해 제조하였다. 이들로부터 모노클로날 세포주는 FACS 기반 단일 세포 클로닝에 의해 수득하고 광범위 스크리닝에 적용하여 특성 분석되었다. 종합적으로, 100개 초과의 클론이 분석되었고 최종적으로 2개의 CHO/CERT S132A 세포주 2.20 및 2.41이 하기를 기준으로 선별되었다:
■ 세포내 염색 및 웨스턴 블롯팅에 의한 측정시 고수준의 CERT 발현,
■ 씨드 스톡 배양에서 양호한 성장 (생존성, 증식 시간) 및
■ 산업적 생산 공정을 반영하는 유가식 배양에서 최적의 성장(최대 세포 밀도, 시간 경과에 따른 전체 생존 세포(IVC), 생존성)
본 발명에 기재된 세포주는 분비 마커로서 단지 푸로마이신을 함유하고 있기 때문에 이들은 가장 광범위하게 사용되는 선별- 및 증폭 시스템 DHFR, 글루타민 신테타제(GS) 및 네오마이신(Neo)과 양립할 수 있고 따라서 발현 시스템의 디자인에서 적응/변화 없이 재조합 항체의 발현을 위해 사용될 수 있다.
생성된 100개 초과의 CHO/CERT S132A 클론으로부터, 본 발명자는 상기 기준에 따라 특히 2개의 신규 모노클로날 CHO-DG44 유래된 세포주, 즉 클론 2.20 및 클론 2.41을 선별하였고 상기 세포주는 기탁기관[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)]에 기탁되었다:
- 본 발명자가 "CHO/CERT 2.20"로 지정하고 수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ에 기탁된 세포주는 매우 높은 CERT S132A 발현 수준 및 심지어 모 CHO 야생형 세포의 성장보다 매우 양호한 성장 특성을 갖는다.
상기 세포주는 유일하게 세포주의 삽입된 DNA와 인접 염색체 DNA사이의 연결 단편을 확인함에 의해 기재될 수 있다. 예를 들어, 세포주의 DNA는 하나 이상의 제한 효소로 분해하고 상기 연결 단편을 예를 들어, 삽입된 DNA의 적합한 표지된 단편을 사용하는 서던 블롯 분석으로 확인함에 의해 특이적 밴드 패턴을 유발하여 게놈내 삽입 부위를 확인한다. 상기 제한 효소는 예를 들어, 하기에 기술되고 EcoRV, HindIII, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI, AvaII, BstXI, SalI를 포함한다.
- 본 발명자가 "CHO/CERT 2.41"로 지정하고 수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁된 세포주는 매우 높은 CERT S132A 발현 수준 및 심지어 모 CHO 야생형 세포의 성장보다 매우 양호한 성장 특성을 갖는다.
상기 세포주는 유일하게 세포주의 삽입된 DNA와 인접 염색체 DNA사이의 연결 단편을 확인함에 의해 기재될 수 있다. 예를 들어, 세포주의 DNA는 하나 이상의 제한 효소로 분해하고 상기 연결 단편을 예를 들어, 삽입된 DNA의 적합한 표지된 단편을 사용하는 서던 블롯 분석으로 확인함에 의해 특이적 밴드 패턴을 유발하여 게놈내 삽입 부위를 확인한다. 상기 제한 효소는 예를 들어, 하기에 기술되고 EcoRV, HindIII, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI, AvaII, BstXI, SalI를 포함한다.
본 발명은 따라서 특히 수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ에 기탁된 세포주 및 수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁된 또 다른 세포주를 기재한다. 본원의 목적을 위해 상기 2개의 세포주는 또한 "conCERT™" 세포주로 불린다.
모 CHO-DG44 세포주와 비교하여, 상기 2개의 세포주는 상응하는 발현 플라스미드로 형질감염 후 증가된 분비율의 치료학적 단백질 생성물 및 양호한 성장 특성을 나타낸다. 이들은 CHO-DG44 숙주 세포주의 이점(널리 특성 규명되고, FDA 승인되고 바이러스 위험 부담이 적고, 고생산성, 강건함, 형질감염력, 무혈청 배지에서 현탁 성장)과 생산 공정에서 증진된 분비 및 최적화된 수행능의 신규 성질을 통합한다.
본 발명에 예시된 특이적 conCERT™ 세포주는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인핸서 영역으로부터 유래된 업스트림 조절 서열(600bp), 132번 위치에서 점 돌연변이 (Ser 132 → Ala)를 함유하는 사람 CERT cDNA에 융합된 N-말단 Flag-에피토프 태그, 종결 코돈 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 3' 비해독 영역을 포함하는, 도 1A 및 B에 도시된 바와 같은 플래그 태그된 사람 CERT 돌연변이 S132A(서열번호 1)를 암호화하는 발현 카세트를 함유한다.
본 발명에 기재된 conCERT™ 세포주의 생산을 위해 사용되는 벡터 작제물은 도 1B에 나타내고 하기의 기능적 요소를 함유한다:
- 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터, 다중 클로닝 부위(MCS), 폴리아데닐화 시그널,
- CERT S132A 발현 카세트,
- 진핵 세포에서 선별 마커로서 푸로마이신 N-아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 발현 카세트,
- 복제 오리진, 및
- 세균에서 앰피실린 내성을 위한 베타-락타마제 발현 카세트.
conCERT™ 세포주내 항체 농도는 안정하게 형질감염된 야생형 세포에서 측정된 역가와 비교하여 상당히 높고 평균 차이는 1.5 내지 2.5배 범위이다(도 6). 따라서, conCERT™ 세포주는 병행 비교에서 야생형 CHO 세포보다 상당히 높은 생성물 역가를 나타낸다. 이들 데이터는 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 CHO/CERT S132A 세포가 모 DG44 세포주와 비교하여 재조합 단백질 생산을 위해 보다 우수한 숙주 세포임을 입증한다. 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포로서의 conCERT™ 세포의 특정 예는 IgG4- 및 IgG1-서브타입 항체, Fc-융합 단백질, 단일쇄-Fv (scFv) 분자 및 나노바디(nanobody)에 대해 주어진다. 그러나 conCERT™ 세포는 또한 효소, 사이토킨, 림포킨, 구조적 분자, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편, 및 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있고/있거나 치료학적 또는 진단학적 용도를 갖는 다른 폴리펩타이드와 같은 기타 단백질, 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 재조합 단백질 생산을 위해 바람직한 숙주 세포이다.
본 발명에 의해 제공된 세포주는 진핵 세포를 기반으로 하는 생산 공정에서의 단백질 수율을 증가시킬 수 있다. 이것은 상기 공정에서 제품의 비용을 절감시키고 동시에 연구, 진단, 임상학적 연구 또는 치료학적 단백질의 시판 공급을 위해 요구되는 물질을 제조하기 위해 생산될 필요가 있는 배치의 수를 감소시킨다.
본 발명의 conCERT™ 세포주는 흔히 임상전 연구를 위해 상당한 양의 물질 생산이 기간과 관련하여 중요한 작업 패키지이기 때문에 약물 개발을 가속화할 것이다.
본 발명의 상기 최적화된 conCERT™ 세포주는 진단 목적, 연구 목적(표적 확인, 선도 확인, 선도 최적화) 또는 시판중이거나 임상 개발중인 치료학적 단백질의 제조를 위한 하나 이상의 특이적 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다. 이들은 동일한 분비 경로를 공유하고 동등하게 지질 소포체내에서 수송되는 분비되거나 막 결합된 단백질(예를 들어, 표면 수용체, GPCR, 메탈로프로테아제 또는 수용체 키나제)을 발현하거나 생산하기 위해 동등하게 적용될 수 있다. 상기 단백질은 이어서 예를 들어, 표면 단백질의 생산 및 후속적 정제, 결정화 및/또는 분석을 위해, 세포 표면 수용체의 기능에 대한 특성 분석을 겨냥한 연구 목적을 위해 사용될 수 있다. 이것은 세포 표면 수용체가 주요 부류의 약물 표적이기 때문에 신규 사람 약물 치료제의 개발을 위해 매우 중요하다. 더욱이, 이것은 세포 표면 수용체와 관련된 세포내 시그널 전달 복합체의 연구 또는 가용성 성장 인자와, 동일하거나 또 다른 세포에 대한 이들의 상응하는 수용체의 상호작용에 의해 부분적으로 매개되는 세포-세포-소통의 분석을 위해 유리할 수 있다.
도 1 : CERT S132A 발현 작제물에 대한 도시
(A) 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)하에 DSMZ에 기탁된 세포주 및 수탁번호 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 세포주에 함유된 Flag-CERT S132A 발현 카세트의 도시. CMV = 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 영역의 인핸서/프로모터; Flag = Flag™ 에피토프 태그; CERT-S132A = 사람 CERT S132A 돌연변이체의 cDNA; 종결 = TGA 종결 코돈; 3'UTR = 3' 비해독 영역.
(B) 본 발명에 기재된 CHO/CERT S132A (conCERT™) 세포주를 생성하기 위해 CHO DG44 세포내로 형질감염된 벡터 작제물의 지도. 상기 플라스미드는 내부적으로 "pBIP-1/Flag-CERT_SA"로 명명되었고 크기가 7660 bp이다. 검정 화살표는 conCERT™ 세포주의 확인을 위해 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 결합 위치를 나타낸다. CMV = 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 영역의 인핸서/프로모터에 이어서 다중 클로닝 부위(지정 효소에 대한 독특한 인지 부위에 의해 나타냄); F1 ori = 세균내 복제 오리진; bla = 앰피실린 내성을 위한 베타-락타마제 유전자.
도 2: CERT S132A 발현과 분비 증진의 상호관계
(A) IgG 생산 세포주에서 이종성 CERT S132A 발현은 항-Flag 항체를 사용한 세포내 표지화에 의해 측정되었다. 시그널 강도를 기준으로, 클론 #1-2는 "낮은"(담회색 도트 막대)으로 분류되고 클론 #3-4는 "높은" CERT-S132A 발현(줄무늬 막대)을 갖는 세포주로서 분류된다.
(B) 유가식 배양에서 동일한 세포주의 항체 비생산성. 모든 세포주의 생산성은 공정 동안에 IVC(전체 생존 세포)로 나눈 생성물 농도로서 3개의 시점에서 계산하였다.
도 3: 웨스턴 블롯팅에 의한 CERT 발현의 검출
전세포 용해물을 14개의 CHO/CERT S132A 세포 클론으로부터 제조하였고 동등한 양을 Flag™ 에피토프 태그에 대해 생성된 항체를 사용한 후속적 면역학적 검출에 적용하였다. 14개의 세포 클론은 SDS-PAGE상에 나타난다. 개별 세포주는 이들의 클론 번호로 지정한다. M = 분자량 마커; (-) = 음성 대조군 (모의 형질감염된 세포주로부터의 용해물); (+) = 양성 대조군.
도 4: 접종 배양에서 CHO/CERT S132A (conCERT™) 세포주의 성장 성질
접종 배양동안에 15개의 CHO/CERT S132A 세포 클론의 성장 특성.
세포는 0.15 - 3 x lO6 세포/ml의 세포 밀도로 유지하고 2 - 3일마다 나눈다.
(A) 성장률에 따른 세포주의 등급화.
(B) 다수의 계대에 걸친 생존성; 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT S132A 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT S132A 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 세포주는 실선으로 나타내고 모든 다른 클론은 점선으로 나타낸다.
도 5: 발효 동안에 모노클로날 CHO/CERT S132A 세포주의 성장
15개의 모노클로날의 안정하게 형질감염된 CHO/CERT S132A 세포 클론은 6일에 걸쳐 유가식 발효에 적용하였다.
(A) CHO/CERT S132A 세포주 및 모 DG44 세포의 성장 프로필. 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 세포주는 실선으로 나타내고 모든 다른 클론은 점선으로 나타낸다.
(B) 6일 공정에 걸친 모든 세포주에 대한 전체 생존 세포 농도(IVC). 본 발명에서 선택된 CHO/CERT S132A 세포주의 IVC는 줄무늬 막대로 나타내고 다른 CHO/CERT S132A 클론의 IVC는 검정 막대로 나타내며 모 세포의 IVC는 빗금 막대로 나타낸다.
도 6: 모 CHO DG44 세포주와 대비되는, CHO/CERT S132A 세포로부터 분비된 항체 역가/단백질 생산의 비교
모 CHO-DG44 숙주 세포주(Classic) 뿐만 아니라 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 conCERT™ 세포주는 사람 IgG1형 모노클로날 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다.
유전자형당 10개이 최고 발현 세포 풀의 항체 역가는 중앙값 역가 및 박스로서 25 내지 75% 분위수를 나타내는 박스 플롯으로 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7: 모 CHO DG44 세포주와 대비되는, CHO/CERT S132A 세포로부터 분비된 항체 역가/단백질 생산의 비교
모 CHO-DG44 숙주 세포주(Classic) 뿐만 아니라 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 conCERT™ 세포주는 사람 IgG4형 모노클로날 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 유전자형당 10개의 최고 발현 세포 풀을 선별한다.
(A,B) 각각의 유전자형에 대해 세포 풀로부터 생성된 10개의 최고 발현 모노클로날 세포주의 비생산성 (A) 및 항체 역가 (B)는 중앙값 역가 및 박스로서 25 내지 75% 분위수를 도시하는 박스 플롯으로 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
(A) 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)하에 DSMZ에 기탁된 세포주 및 수탁번호 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 세포주에 함유된 Flag-CERT S132A 발현 카세트의 도시. CMV = 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 영역의 인핸서/프로모터; Flag = Flag™ 에피토프 태그; CERT-S132A = 사람 CERT S132A 돌연변이체의 cDNA; 종결 = TGA 종결 코돈; 3'UTR = 3' 비해독 영역.
(B) 본 발명에 기재된 CHO/CERT S132A (conCERT™) 세포주를 생성하기 위해 CHO DG44 세포내로 형질감염된 벡터 작제물의 지도. 상기 플라스미드는 내부적으로 "pBIP-1/Flag-CERT_SA"로 명명되었고 크기가 7660 bp이다. 검정 화살표는 conCERT™ 세포주의 확인을 위해 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 결합 위치를 나타낸다. CMV = 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 영역의 인핸서/프로모터에 이어서 다중 클로닝 부위(지정 효소에 대한 독특한 인지 부위에 의해 나타냄); F1 ori = 세균내 복제 오리진; bla = 앰피실린 내성을 위한 베타-락타마제 유전자.
도 2: CERT S132A 발현과 분비 증진의 상호관계
(A) IgG 생산 세포주에서 이종성 CERT S132A 발현은 항-Flag 항체를 사용한 세포내 표지화에 의해 측정되었다. 시그널 강도를 기준으로, 클론 #1-2는 "낮은"(담회색 도트 막대)으로 분류되고 클론 #3-4는 "높은" CERT-S132A 발현(줄무늬 막대)을 갖는 세포주로서 분류된다.
(B) 유가식 배양에서 동일한 세포주의 항체 비생산성. 모든 세포주의 생산성은 공정 동안에 IVC(전체 생존 세포)로 나눈 생성물 농도로서 3개의 시점에서 계산하였다.
도 3: 웨스턴 블롯팅에 의한 CERT 발현의 검출
전세포 용해물을 14개의 CHO/CERT S132A 세포 클론으로부터 제조하였고 동등한 양을 Flag™ 에피토프 태그에 대해 생성된 항체를 사용한 후속적 면역학적 검출에 적용하였다. 14개의 세포 클론은 SDS-PAGE상에 나타난다. 개별 세포주는 이들의 클론 번호로 지정한다. M = 분자량 마커; (-) = 음성 대조군 (모의 형질감염된 세포주로부터의 용해물); (+) = 양성 대조군.
도 4: 접종 배양에서 CHO/CERT S132A (conCERT™) 세포주의 성장 성질
접종 배양동안에 15개의 CHO/CERT S132A 세포 클론의 성장 특성.
세포는 0.15 - 3 x lO6 세포/ml의 세포 밀도로 유지하고 2 - 3일마다 나눈다.
(A) 성장률에 따른 세포주의 등급화.
(B) 다수의 계대에 걸친 생존성; 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT S132A 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT S132A 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 세포주는 실선으로 나타내고 모든 다른 클론은 점선으로 나타낸다.
도 5: 발효 동안에 모노클로날 CHO/CERT S132A 세포주의 성장
15개의 모노클로날의 안정하게 형질감염된 CHO/CERT S132A 세포 클론은 6일에 걸쳐 유가식 발효에 적용하였다.
(A) CHO/CERT S132A 세포주 및 모 DG44 세포의 성장 프로필. 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 세포주는 실선으로 나타내고 모든 다른 클론은 점선으로 나타낸다.
(B) 6일 공정에 걸친 모든 세포주에 대한 전체 생존 세포 농도(IVC). 본 발명에서 선택된 CHO/CERT S132A 세포주의 IVC는 줄무늬 막대로 나타내고 다른 CHO/CERT S132A 클론의 IVC는 검정 막대로 나타내며 모 세포의 IVC는 빗금 막대로 나타낸다.
도 6: 모 CHO DG44 세포주와 대비되는, CHO/CERT S132A 세포로부터 분비된 항체 역가/단백질 생산의 비교
모 CHO-DG44 숙주 세포주(Classic) 뿐만 아니라 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 conCERT™ 세포주는 사람 IgG1형 모노클로날 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다.
유전자형당 10개이 최고 발현 세포 풀의 항체 역가는 중앙값 역가 및 박스로서 25 내지 75% 분위수를 나타내는 박스 플롯으로 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7: 모 CHO DG44 세포주와 대비되는, CHO/CERT S132A 세포로부터 분비된 항체 역가/단백질 생산의 비교
모 CHO-DG44 숙주 세포주(Classic) 뿐만 아니라 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)하에 DSMZ에 기탁된 conCERT™ 세포주는 사람 IgG4형 모노클로날 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 유전자형당 10개의 최고 발현 세포 풀을 선별한다.
(A,B) 각각의 유전자형에 대해 세포 풀로부터 생성된 10개의 최고 발현 모노클로날 세포주의 비생산성 (A) 및 항체 역가 (B)는 중앙값 역가 및 박스로서 25 내지 75% 분위수를 도시하는 박스 플롯으로 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
정의
일반적인 양태 "포함하는" 또는 "포함되는"은 보다 구체적인 양태 "~로 이루어진"을 포괄한다. 추가로, 단수 및 복수 형태는 제한적인 방식으로 사용되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어는 하기의 의미를 갖는다.
용어 "CERT"는 세라미드 전달 단백질 CERT를 언급하고, 이는 또한 굿파스쳐 항원 결합 단백질로서 공지되어 있다. CERT는 소포체(ER)에서 이의 생산 부위로부터 골지막(여기서, 스핑고마이엘린(SM)으로의 전환이 일어난다)으로 세라미드의 비소포체 전달을 위해 필수적인 세포질 단백질이다(문헌참조: Hanada et al, 2003).
용어 "CHO/CERT", "CHO/CERT SA", "CHO/CERT S132A"는 상호교환적으로 사용된다. 추가로, 세포주 명칭 "CHO/CERT 2.20", "CHO/CERT SA 2.20", "CHO/CERT S132A 2.20"는 상호교환적으로 사용되고 이들 모두는 수탁번호 DSMZ DSM ACC2989하에 기탁된 동일한 세포주 클론 2.20을 나타낸다. 세포주 명칭 "CHO/CERT 2.41", "CHO/CERT SA 2.41", "CHO/CERT S132A 2.41"은 상호교환적으로 사용되고 이들 모두는 수탁번호 DSMZ DSM ACC2990하에 기탁된 동일한 세포주 클론 2.41을 나타낸다.
일반적으로 용어 "유도체"는 본 발명의 의도된 용도를 실현하기 위해 적합한 서열을 포함하고 이는 상기 서열이 세포내에서 분비 수송의 증가를 매개함을 의미한다.
본 발명의 의미에서 "숙주 세포"는 햄스터 세포, 바람직하게 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-Kl, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl, 및 CHO-DG44 세포 또는 상기 세포주 중 어느 하나의 유도체/후손과 같은 세포이다. CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-Kl, CHO-S 및 BHK21이 특히 바람직하고 CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 보다 더 바람직하다. 본 발명의 추가의 양태에서, 숙주 세포는 또한 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 상기 세포주 중 어느 하나의 유도체/후손을 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 쥐 및 햄스터 세포의 예는 또한 표 1에 요약되어 있다. 그러나, 상기 세포의 유도체/후손, 다른 포유동물 세포(사람, 마우스, 랫트, 원숭이 및 조류 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 또는 바람직하게는 설치류 세포주 또는 진핵 세포(효모, 곤충 및 식물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않음)가 또한 본 발명에서 특히 생물약제 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.
숙주 세포는 무혈청 조건하에서 및 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드가 부재인 배지에서 확립되고, 적응되고 완전히 배양된 경우에 가장 바람직하다. 상업적으로 시판되는 배지, 예를 들어, Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640(Sigma), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(MEM; Sigma), 이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invtirogen), 무혈청 CHO 배지(Sigma), 및 단백질 부재 CHO 배지(Sigma)가 예시적으로 적당한 영양 용액이다. 임의의 배지에는 필요한 만큼 다양한 화합물이 보충될 수 있고 이의 예로는 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제(예를 들어, HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 기타 균등 에너지원, 항생제, 미량 원소가 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서, 무혈청 배지의 사용이 바람직하지만 적합한 양의 혈청이 보충된 배지가 또한 숙주 세포의 배양을 위해 사용될 수 있다. 선별가능한 유전자를 발현하는 유전학적으로 변형된 세포의 성장 및 선별을 위해, 적합한 선별 제제가 배양 배지에 첨가된다.
상기 용어 "단백질"은 아미노산 잔기 서열 또는 폴리펩타이드와 상호교환적으로 사용되고 임의의 길이의 아미노산 중합체를 언급한다. 이들 용어는 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화 또는 단백질 프로세싱을 포함하지만 이에 제한되지 않는 반응을 통해 해독후 변형된 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어, 다른 단백질과의 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입이 폴리펩타이드의 구조에 가해질 수 있고 상기 분자는 이의 생물학적 기능 활성을 유지한다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩타이드 또는 이의 기본 핵산 암호화 서열에 가해질 수 있고 유사 성질을 갖는 단백질이 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 10개 이상의 아미노산을 갖는 서열을 의미하고 용어 "펩타이드"는 10개 이하의 아미노산 길이의 서열을 의미한다.
본 발명은 생물약제 폴리펩타이드/단백질의 생산용 숙주 세포를 제조하기 위해 적합하다. 본 발명은 특히 증진된 세포 생산성을 보여주는 세포에 의한 목적하는 다수의 상이한 유전자의 고수율의 발현을 위해 적합하다.
"목적하는 유전자" (GOI), "선별된 서열", 또는 "생성물 유전자"는 본원에서 동일한 의미를 갖고 목적하는 생성물 또는 "목적하는 단백질"(또한 용어 "목적하는 생성물"로 언급됨)을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 상기 선별된 서열은 전장 길이 또는 절단된 유전자, 융합 유전자 또는 태그된 유전자일 수 있고 cDNA, 게놈 DNA, 또는 DNA 단편, 바람직하게는, cDNA일 수 있다. 이것은 천연 서열, 즉, 천연적으로 존재하는 형태일 수 있거나 목적하는 바와 같이 돌연변이되거나 변형된 것일 수 있다. 이들 변형은 선별된 숙주 세포에서 코돈 용법을 최적화하기 위한 코돈 최적화, 사람화 또는 태그화를 포함한다. 상기 선별된 서열은 분비된 폴리펩타이드, 세포질 폴리펩타이드, 핵 폴리펩타이드, 막 결합 폴리펩타이드 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
"목적하는 단백질"은 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드를 포함하고 이 모두는 선별된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 목적하는 단백질은 예를 들어, 항체, 효소, 사이토킨, 림포킨, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편, 및 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있고/있거나 치료학적 또는 진단학적 용도를 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩타이드일 수 있다. 목적하는 단백질/폴리펩타이드에 대한 예는 또한 하기에 주어진다.
모노클로날 항체와 같은 보다 복잡한 분자의 경우에, GOI는 2개의 항체 쇄 중 하나 또는 둘다를 암호화한다.
"목적하는 생성물"은 또한 안티센스 RNA일 수 있다.
"목적하는 단백질(proteins of interest)" 또는 "목적하는 단백질(desired proteins)"은 상기 언급된 것들이다. 특히, 목적하는 단백질/폴리펩타이드(desired proteins/polypeptides) 또는 목적하는 단백질(proteins of interest)은 예를 들어, 제한없이, 인슐린, 인슐린형 성장 인자, hGH, tPA, 사이토킨, 예를 들어, 인터류킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론 (IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN tau, 종양 괴사 인자(TNF), 예를 들어, TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이다. 또한 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장 인자가 포함된다. 본 발명에 따른 방법은 또한 항체 또는 이의 단편을 생산하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 상기 단편은 예를 들어, Fab 단편(단편 항원-결합 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은 인접한 불변 영역에 의해 함께 연결되어 있는 2개 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상적인 항체로부터, 예를 들어, 파파인을 사용한 프로테아제 분해에 의해 형성될 수 있고 한편 유사한 Fab 단편은 또한 유전자 조작 기술에 의해 제조될 수 있다. 추가의 항체 단편은 펩신을 사용한 단백질분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편을 포함한다.
목적하는 단백질은 바람직하게 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수되거나 이것은 분비 시그널 없이 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 이것은, 실질적으로 균일하게 목적하는 단백질 제제가 수득되는 방식으로 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 목적하는 단백질을 정제할 필요가 있다. 제1 단계로서, 세포 및/또는 미립자 세포 잔해가 배양 배지 또는 용해물로부터 제거된다. 이후 목적하는 단백질은 오염 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터 면역친화성 또는 이온 교환 칼럼상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스 크로마토그래피, 실리카상에서 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상에서의 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일반적으로, 숙주 세포에 의해 발현되는 단백질을 정제하는 방법에 대해 당업자에게 교시하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다.
유전자 조작 기술 방법을 사용하여 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로만 이루어진 단축된 항체 단편을 제조할 수 있다. 이들은 Fv 단편(가변 단편 = 가변부의 단편)으로서 언급된다. 이들 Fv-단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 부재이기 때문에 상기 Fv 단편은 흔히 안정화된다. 이것은 예를 들어, 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 단축 펩타이드 단편에 의해 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 쇄가 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일-쇄-Fv(scFv)로 공지되어 있다. 이러한 종류의 scFv-항체 단백질의 예는 당업계에 공지되어 있다.
최근해에, 다양한 전략이 다량체 유도체로서 scFv를 제조하기 위해 개발되어 왔다. 이것은 특히 약동력학적 및 생물분포 성질이 개선되고 결합가가 증가된 재조합 항체를 유도하기 위해 의도된다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로부터 제조되었다. 상기 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG의 CH3 영역 또는 류신-지퍼 도메인과 같은 감긴 코일 구조(나선 구조)일 수 있다. 그러나, scFv의 VH/VL 영역간의 상호작용이 다량체화(예를 들어, 2가-, 3가- 및 5가 항체)를 위해 사용되는 전략이 또한 존재한다. 당업자에게 2가 항체란 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자에서 링커의 5 내지 10개 아미노산으로의 단축은 동종이량체의 형성을 유도하고 여기서, 쇄간 VH/VL 겹침이 발생한다. 2가 항체는 추가로 디설파이드 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있다. 2가 항체-항체 단백질의 예는 당업계에 공지되어 있다.
당업자에게 소형체(minibody)란 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. 이것은 힌지 영역(예를 들어, IgG1 기원) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결된 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 소형체-항체 단백질의 예는 당업계에 공지되어 있다.
당업자에게 3가 항체란 3가 동종3량체 scFv 유도체를 의미한다. VH-VL이 링커 서열 없이 직접적으로 융합된 scFv 유도체는 3량체를 형성시킨다. 당업자는 또한 2가, 3가 또는 4가 구조를 갖고 scFv로부터 유래된 소위 소형 항체에 대해 친숙할 것이다. 다량체화는 2량체성, 3량체성 또는 4량체성 감긴 코일 구조에 의해 수행된다.
당업자는 또한 라마 또는 낙타과 기원의 다른 동물로부터 유래된 단일쇄 항체의 하나 이상의 가변 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드 분자에 친숙할 것이다. 추가로, 당업자는 상기 낙타과 항체의 유도체 및 변이체를 알고 있다. 상기 분자는 또한 "도메인 항체"로서 언급된다. 도메인 항체 변이체는 펩타이드 링커에 의해 공유적으로 연결된 다수의 상기 가변 도메인을 포함한다. 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 항체 Fc-부분과 같은 폴리펩타이드 잔기 또는 알부민과 같이 혈청에 존재하는 또 다른 단백질과 융합된 도메인 항체가 제조될 수 있다.
당업자에게 "스캐폴드 단백질"은 유전자 클로닝 또는 동시 해독 과정에 의해 또 다른 기능을 갖는 또 다른 단백질 또는 단백질의 일부와 커플링된 단백질의 임의의 기능성 도메인을 의미한다.
숙주 세포에 도입된 임의의 서열 또는 유전자는, 도입된 서열 또는 유전자가 숙주 세포내 내인성 서열 또는 유전자와 동일할지라도 숙주 세포와 관련하여 "이종성 서열" 또는 "이종성 유전자" 또는 "전이유전자"를 지칭하는 것으로 정의된다.
따라서 "이종성" 단백질은 이종성 서열로부터 발현된 단백질이다. 상기 용어 "재조합"은 특히 단백질 발현과 관련하여 본원 명세서 전반에 기재된 용어 "이종성"과 상호교환적으로 사용된다. 따라서, "재조합" 단백질은 이종성 서열로부터 발현된 단백질이다.
이종성 유전자 서열은 "발현 벡터", 바람직하게 진핵 세포 발현 벡터 및 보다 더 바람직하게는 포유동물 발현 벡터를 사용함에 의해 표적 세포로 도입될 수 있다. 벡터를 작제하기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 다양한 문헌에 기재되어 있다. 특히, 프로모터, 인핸서, 종결(termination) 및 폴리아데닐화 시그널, 선별 마커, 복제 오리진 및 스플라이싱 시그널과 같은 기능성 성분의 기재를 포함하는 적합한 벡터를 작제하기 위한 기술은 당업계에서 검토되었다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/소형 염색체(예를 들어, ACE) 또는 바쿨로바이러스(baculovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 레트로바이러스(retrovirus), 박테리오파아지(bacteriophage)와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포 발현 벡터는 전형적으로 세균에서 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자와 같은, 세균에서 벡터의 증식을 촉진시키는 원핵 세포 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드가 작동적으로 연결되는 클로닝 부위를 함유하는, 다양한 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있고 일부는 제조원[예를 들어, Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI 또는 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA]으로부터 시판되고 있다.
바람직한 양태에서, 발현 벡터는 목적하는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 해독을 위해 필요한 조절 서열인 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 숙주 세포내 이종성 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 언급한다. 숙주 세포내 목적하는 생성물/목적하는 단백질의 발현 수준은 세포내 존재하는 상응하는 mRNA의 양, 또는 본 실시예에서와 같은 선택된 서열에 의해 암호화된 목적하는 폴리펩타이드/목적하는 단백질의 양을 근거로 결정할 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포성 RNA에 대한 원위치 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량될 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 다양한 방법, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블로팅, 방사선면역분석, 면역 침전, 단백질의 생물학적 활성에 대한 분석, 단백질의 면역염색에 이어서 FACS 분석 또는 균일한 시간-분리된 형광(HTRF) 분석에 의해 정량될 수 있다.
유전학적으로 변형된 세포 또는 유전자전이 세포를 유도하는, 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 사용한 진핵 숙주 세포의 "형질감염"은 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질감염 방법은 리포좀 매개 형질감염, 인산칼슘 공동 침전, 전기천공, 다가양이온(예를 들어, DEAE-덱스트란)-매개 형질감염, 원형질 융합, 바이러스 감염 및 미세주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 형질감염은 안정한 형질감염이다. 특정 숙주 세포주 및 유형에서 이종성 유전자의 최적 형질감염 빈도수 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 선호된다. 적합한 방법은 통상적인 과정에 의해 결정될 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해, 상기 작제물은 숙주 세포내 안정하게 유지되도록 하기 위해 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/소형 염색체에 통합되거나 에피좀에 위치한다.
본 발명의 실시는 달리 언급되지 않는 경우 당업계 기술 범위내에 있는 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등의 통상적인 기술을 사용한다. 이들 기술은 본원에 완전히 기재된다.
양태
본 발명은 수탁번호 DSM ACC2989 하에 기탁기관[DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)]에 기탁된 세포(CHO/CERT 2.20)에 관한 것이다. 본 발명은 대표적인 세포/세포주가 수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ에 기탁된 세포/세포주(CHO/CERT 2.20)에 관한 것이다. 상기 세포주는 유일하게 세포주 세포의 삽입된 DNA와 인접한 염색체 DNA 사이의 연결 단편을 확인함에 의해 기술될 수 있다. 예를 들어, 세포주의 DNA는 하나 이상의 제한 효소로 분해시키고 상기 연결 단편은 예를 들어, 삽입된 DNA의 적합한 표지된 단편을 사용하는 서던 블롯 분석에 의해 게놈내 삽입 부위를 확인하는 특이적 밴드 패턴을 유도하여 확인된다. 예를 들어, 상기 제한 효소는 이후에 기재되고 EcoRV, HindIII, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI, AvaII, BstXI 및 SalI를 포함한다.
본 발명은 추가로 수탁번호 DSM ACC2990 하에 DSMZ에 기탁된 세포(CHO/CERT 2.41)에 관한 것이다. 본 발명은 대표적인 세포/세포주가 수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁된 세포/세포주(CHO/CERT 2.41)에 관한 것이다. 상기 세포주는 세포주의 삽입된 DNA와 인접한 염색체 DNA 사이에 연결 단편을 확인함에 의해 유일하게 기재될 수 있다. 예를 들어, 세포주의 DNA는 하나 이상의 제한 효소로 분해시키고 연결 단편은 예를 들어, 삽입된 DNA의 적합한 표지된 단편을 사용한 서던 블롯 분석에 의해 게놈내로의 삽입 부위를 확인하는 특이적 밴드 패턴을 유도하여 확인된다. 예를 들어, 상기 제한 효소는 이후에 기재되고 EcoRV, HindIII, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI, AvaII, BstXI 및 SalI를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 세포(CHO/CERT 2.20 또는 CHO/CERT 2.41)는 추가로 목적하는 단백질을 암호화하는 목적하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 제2 벡터 작제물을 함유한다. 상기 세포는 바람직하게 목적하는 단백질 및 선별 및/또는 증폭 마커를 암호화하는 목적하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 제2 벡터 작제물을 추가로 함유한다. 제2 벡터 작제물상의 상기 선별 및/또는 증폭 마커는 바람직하게 글루타민 신테타제(GS) 또는 데하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)이고 가장 바람직하게는 DHFR이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 모든 벡터 작제물은 세포 게놈으로 안정하게 통합된다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기 세포는 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 경우, 이에 의해, 2373 bp PCR 생성물이 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 제조되어 특이적 PCR 밴드 패턴/핑거프린트를 특징으로 하거나,
주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 경우, 이에 의해 660bp PCR 생성물(서열번호 6)이 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 제조되어 특이적 PCR 밴드 패턴/핑거프린트를 특징으로 하거나,
하기의 제한 효소와 (a)의 CERT-특이적 2373 bp-PCR 생성물의 항온처리(여기서, HindIII와의 항온처리가 바람직하다)로부터 비롯되는 특정 수의 단편 및 단편 크기를 특징으로 한다:
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 세포는 주형으로서 게놈 DNA를 사용하고 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 제조된 CERT-특이적 2373 bp PCR 생성물과 하기의 제한 효소: EcoRV, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI 및 XhoI의 항온처리로부터 비롯되는 상기 표에 따른 크기를 갖는 2개의 특이적 단편을 특징으로 한다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에서, 상기 세포는, 주형으로서 게놈 DNA를 사용하고 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 제조된 CERT-특이적 2373 bp PCR 생성물과 제한 효소 HindIII의 항온처리로부터 각각 비롯되는 크기가 2176bp 및 197bp인 2개의 특이적 단편을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 양태에서 CERT S132A 발현 카세트는 서열번호 1로 이루어진다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 목적하는 단백질은 치료학적 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 융합 단백질이다.
본 발명은 추가로,
(a) 모 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 NSO 세포, 가장 바람직하게는 CHO DG44 세포를 제공하는 단계,
(b) CERT S132A 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 단계(a)의 세포에 도입하는 단계,
(c) 안정하게 형질감염된 세포 집단을 선별하는 단계,
(d) FACS 기반 단일 세포 클로닝에 의해 모노클로날 세포주를 분리하는 단계,
(e) - 고수준의 CERT S132A 발현,
- 씨드 스톡 배양에서 최적의 성장,
- 유가식 배양에서 최적의 성장
에 대해 스크리닝하는 단계,
(f) 단계(e)의 스크리닝 기준에 따른 단계 (d)의 세포 클론으로부터의 모노클로날 세포주를 선별하는 단계
를 특징으로 하는 숙주 세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 추가로
a) 모 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 NSO 세포를 제공하는 단계,
b) CERT S132A 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 단계(a)의 모 숙주 세포에 도입하는 단계,
c) 안정하게 형질감염된 세포 집단을 선별하는 단계,
d) FACS 기반 단일 세포 클로닝에 의해 모노클로날 세포주를 분리하는 단계,
e) i) 고수준의 CERT S132A 발현,
ii) 씨드 스톡 배양에서 최적의 성장,
iii) 유가식 배양에서 최적의 성장
에 대해 상기 모노클로날 세포주를 스크리닝하는 단계,
f) 단계(e)의 스크리닝 기준에 따른 단계(d)의 세포 클론으로부터의 모노클로날 세포주를, 숙주 세포주로서 선별하는 단계
를 특징으로 하는, 숙주 세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로,
a) 모 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 NSO 세포를 제공하는 단계,
b) CERT S132A 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 단계(a)의 모 숙주 세포에 도입하는 단계,
c) 안정하게 형질감염된 세포 집단을 선별하는 단계,
d) FACS 기반 단일 세포 클로닝에 의해 세포를 분리하는 단계,
e) i) 고수준의 CERT S132A 발현,
ii) 씨드 스톡 배양에서 최적의 성장,
iii) 유가식 배양에서 최적의 성장
에 대해 상기 세포를 스크리닝하는 단계,
f) 단계(e)의 스크리닝 기준에 따른 단일 클론 또는 세포 풀을, 숙주 세포로서 사용하기 위해 선별하는 단계
를 특징으로 하는, 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 단계 (a)의 상기 모 숙주 세포는 상기 정의하에 기재된 바와 같은 숙주 세포이다. 바람직하게 단계(a)의 모 숙주 세포는 마우스 또는 햄스터 세포, 가장 바람직하게는 CHO DG44 세포와 같은 설치류 세포이다.
바람직하게 단계 (b)의 벡터 작제물은 도 1B에 도시된 바와 같은 하기의 기능성 요소를 포함한다:
- 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터,
- 다중 클로닝 부위 (MCS),
- CERT S132A 발현 카세트,
- 진핵 세포에서 선별 마커로서 푸로마이신 N-아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 발현 카세트,
- 폴리아데닐화 시그널,
- 복제 오리진,
- 세균에서 암피실린 내성을 위한 베타-락타마제 발현 카세트.
최적의 성장을 위한 단계 (e) ii)에서 씨드 스톡 배양을 스크리닝하기 위한 특정 기준은 생존능, 증식 시간이다.
최적의 성장을 위한 단계 (e) iii)에서 유가식 배양을 스크리닝하기 위한 특정 기준은 최대 세포 밀도, 시간경과에 따른 총 생존 세포, 생존능이다.
유가식 배양에서 상기 스크리닝 기준은 이들이 산업적 제조 공정에서 환경적 조건을 반영하기 때문에 매우 중요하다.
바람직한 방법에서, 단계 (b)의 CERT S132A 발현 카세트는 서열번호 1로 이루어진다.
본 발명은 추가로 a) 상기된 바와 같은 세포를 제공하는 단계, b) 목적하는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 특징으로 하는 상기된 바와 같은 세포에서 목적하는 유전자에 의해 암호화된 목적하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 방법은 c) 목적하는 단백질을 수거하는 추가의 단계를 포함한다. 보다 더 특정 양태에서, 상기 방법은 d) 목적하는 단백질을 정제하는 또 다른 추가의 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로, a) 상기된 바와 같은 세포를 제공하는 단계, b) 세포의 증식 및 목적하는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 특징으로 하는 상기된 바와 같은 세포에서 목적하는 유전자에 의해 암호화된 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 방법은 c) 목적하는 단백질을 수거하는 추가의 단계를 포함한다. 보다 더 특이적인 양태에서, 상기 방법은 d) 목적하는 단백질을 정제하는 또 다른 추가의 단계를 포함한다.
본 발명은 구체적으로 (a) 본 발명의 세포를 제공하는 단계, (b) 세포의 증식 및 목적하는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, (c) 목적하는 단백질을 수거하는 단계 및 (d) 목적하는 단백질을 정제하는 단계를 특징으로 하는 본 발명의 세포에서 목적하는 유전자에 의해 암호화된 목적하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 제조 방법에서, 숙주 세포는 목적하는 유전자에 대한 선별 및/또는 증폭 마커로서 글루타민 신테타제 (GS) 또는 DHFR, 바람직하게는 DHFR을 포함한다.
본 발명은 추가로,
(a) 폴리머라제 연쇄 반응 PCR을 수행하고,
(b) 주형으로서 게놈 DNA를 사용하고,
(c) 서열번호 2 및 서열번호 3을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용함에 의해 2373 bp PCR 생성물을 제조함에 의해 CERT S132A(서열번호 1)로 유전자전이된 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다.
임의로, 상기 세포는 추가로 하기의 제한 효소와 CERT-특이적 2373 bp-PCR 생성물의 항온처리로부터 비롯되는 특정 수의 단편 및 단편 크기를 특징으로 한다:
본 발명은 구체적으로 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 경우 2373 bp PCR 생성물이 제조됨에 의해 CERT S132A(서열번호 1)로 유전자전이된 세포를 확인하고/특성 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우 2373 bp PCR 생성물이 제조되고 이에 의해 상기 세포가 하기의 제한 효소와 CERT-특이적 2373 bp-PCR 생성물의 항온처리로부터 비롯되는 특정 수의 단편 및 단편 크기를 특징으로 하는, CERT S132A(서열번호 1)로 유전자전이된 세포를 확인하고/특성분석하는 방법에 관한 것이다:
상기 방법의 바람직한 양태에서 상기 세포는 하기의 제한 효소, EcoRV, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI와, 주형으로서 게놈 DNA 및 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 제조되는 CERT 특이적 2373 bp PCR 생성물의 항온처리로부터 비롯되는 상기 표에 따른 크기를 갖는 2개의 특이적 단편을 특징으로 한다.
상기 방법의 가장 바람직한 양태에서, 상기 세포는 제한 효소 HindIII와, 주형으로서 게놈 DNA 및 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 제조되는 CERT 특이적 2373 bp PCR 생성물의 항온처리로부터 비롯되는 각각 2176 bp 및 197 bp의 크기를 갖는 2개의 특이적 단편을 특징으로 한다.
추가의 양태에서, 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 세포는 게놈 DNA를 사용하는 경우 이에 의해 상기 분석이 클론 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)에서 CERT 전이유전자/CERT S132A 발현 카세트의 게놈 통합 부위에 특이적인 유일한 핑거프린트를 생성하는 특이적 제한 분해 또는 특이적 PCR 밴드 패턴을 특징으로 한다. 상기 세포주 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)는 연결 단편에 의해 유일하게 기재되고/이를 특징으로 한다. 세포주 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)는 삽입된 DNA(= CERT 전이유전자/CERT S132A 발현 카세트)와 인접한 염색체 DNA 사이의 연결 단편에 의해 유일하게 기재되고/이를 특징으로 하고, 여기서 세포주의 DNA(바람직하게 게놈 DNA)는 EcoRV, HindIII, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI, AvaII, BstXI, SalI와 같은 하나 이상의 제한 효소로 분해시키고 상기 연결 단편은 예를 들어, 하나 이상의 적합한 임의로 표지된 DNA 단편을 사용한 서던 블롯 분석 또는 PCR에 의해 확인된다. 상기 DNA 단편(들)은 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)의 게놈에서 CERT 전이유전자/CERT S132A 발현 카세트의 유일한 삽입 부위를 특징으로 하는 특이적 밴드 패턴 또는 핑거프린트를 나타낸다.
추가의 양태에서 수탁번호 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 세포는 게놈 DNA를 사용하는 경우, 상기 분석이 클론 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)에서 CERT 전이유전자/CERT S132A 발현 카세트의 게놈 통합 부위에 특이적인 유일한 핑거프린트를 생성시키는 특이적 제한 효소 분해 또는 특이적 PCR 밴드 패턴을 특징으로 한다. 상기 세포주 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)는 연결 단편에 의해 유일하게 기재되고/이를 특징으로 한다. 상기 세포주 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)는 삽입된 DNA(= CERT 전이유전자/CERT S132A 발현 카세트)와 인접한 염색체 DNA사이의 연결 단편에 의해 유일하게 기재되고/이를 특징으로 하고, 여기서, 세포주의 DNA(바람직하게 게놈 DNA)는 EcoRV, HindIII, KpnI, NcoI, NdeI, PvuII, SpeI, XhoI, AvaII, BstXI, SalI와 같은 하나 이상의 제한 효소로 분해시키고 및 상기 연결 단편은 예를 들어, 하나 이상의 적합한 임의로 표지된 DNA 단편을 사용한 서던 블롯 분석 또는 PCR에 의해 확인된다. 상기 DNA 단편(들)은 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)의 게놈에서 CERT 전이유전자/CERT S132A 발현 카세트의 유일한 삽입 부위를 특징으로 하는 특이적 밴드 패턴 또는 핑거프린트를 나타낸다.
본 발명은 추가로 a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하고 b) 상기 세포의 증식을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 배양함을 포함하는 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 특정 양태에서, 상기 세포는 목적하는 단백질을 암호화하는 목적하는 유전자를 포함하는 하나 이상의(제2/추가의) 벡터 작제물을 추가로 함유한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 목적하는 단백질을 수거함을 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 상기 방법은 목적하는 단백질을 정제함을 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로 단백질을 제조하기 위한 본 발명의 세포 (CHO/CERT 2.2O=DSM ACC2989 또는 CHO/CERT 2.41=DSM ACC2990)의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 배지에서 본 발명의 세포를 함유하는 반응기/발효 용기에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 세포, 목적하는 유전자의 발현을 위한 발현 벡터 및 세포 배양을 위한 세포 배양 배지를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 특정 양태에서, 상기 키트는 목적하는 단백질을 암호화하는 목적하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 (제2) 벡터 작제물을 추가로 함유하는 본 발명의 세포를 포함하고, 이때, 세포는 반응기/발효 용기에서 상기 세포의 증식을 허용하는 배지에서 배양된다.
본 발명은 추가로 CERT S132A 발현 카세트를 포함하는 세포에 관한 것이고, 이때, 상기 세포는
f) 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 경우 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 2373 bp PCR 생성물이 제조되는 특이적 PCR 밴드 패턴/핑거프린트 또는
g) 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 경우 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 660bp PCR 생성물(서열번호 6)이 제조되는 특이적 PCR 밴드 패턴/핑거프린트 또는
h) 하기의 제한 효소와, (a)의 CERT 특이적 2373 bp-PCR 생성물의 항온처리로부터 비롯되는 특정 수의 단편 및 단편 크기를 특징으로 한다:
특정 양태에서, CERT S132A 발현 카세트는 서열번호 1로 이루어진다. 바람직하게, 상기 세포는 CHO 세포 또는 NSO 세포이다.
바람직한 양태에서, 상기 세포는 수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 세포(CHO/CERT 2.20)이다.
추가의 바람직한 양태에서, 상기 세포는 수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁된 세포(CHO/CERT 2.41)이다.
실시예
재료 및 방법
세포 배양
생산 및 개발 규모에서 사용되는 모든 세포주는 37℃의 온도 및 5% CO2를 함유하는 대기에서 배양기(Thermo, Germany)에서 표면 통기된 T-플라스크(Nunc, Denmark)에서 또는 진탕 플라스크(Nunc, Denmark)에서 연속 씨드스톡 배양물에 유지시킨다. 씨드스톡 배양물은 1-3E5 세포/mL의 씨딩 밀도로 2 내지 3일마다 계대배양하였다. 상기 세포 농도는 혈구세포측정기를 사용하여 모든 배양물에서 측정한다. 생존능은 트립판 블루 배제 방법에 의해 평가한다.
유가식 배양
세포를 항생제 또는 MTX(Sigma-Aldrich, Germany)가 없는 BI-독점 생산 배지 30ml 중에서 3 x 105 세포/ml로 125ml의 진탕 플라스크에 씨딩한다. 상기 배양물을 3일 후 2%로 감소되는 5% CO2 및 37℃에서 120rpm으로 진탕시킨다. BI-독점 공급 용액을 매일 첨가하고 pH를 필요한 만큼 NaCO3를 사용하여 pH 7.0으로 조정한다. 세포 밀도 및 생존능은 자동화 CEDEX 세포 정량 시스템(Innovatis)을 사용하는 트립판-블루 배제법에 의해 측정한다.
세포내 FACS 염색 및 웨스턴 블롯팅에 의한 CERT S132A 발현의 검출
세포내 염색을 위해, 1 x 1O6개의 세포를 20분동안 PBS중의 1% 파라포름알데하이드중에 고정시키고 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS중에서 투과화시켰다. 이어서, 세포를 1% BSA/PBS중에 재현탁시키고 항-Flag M2 모노클로날 마우스 항체(Sigma) 및 Alexa488-표지된 염소 항-마우스 항체(Invitrogen)를 사용하여 염색시켰다. 형광 시그널은 유동 세포측정기(FACScalibur, Coulter)로 정량적으로 분석한다. 웨스턴 블롯팅을 위한 전세포 추출물은 NP40-완충액 [1% (v/v) NP40, 5OmM HEPES pH 7.9, 15OmM NaCl, 1mM EDTA, 5 mM EGTA, 25mM NaF 및 40μL/mL 완전한 프로테아제 억제 용액 (Roche)]중에서 빙상에서 15분동안 5 x 106 세포를 용해시켜 제조한다. 용해물은 10분동안 16,000 x g에서 원심분리하여 투명하게 하고 샘플중 단백질 농도는 BCA1 분석 키트(Sigma)를 사용하여 측정한다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 동등한 단백질 양은 제조업자의 포르토콜에 따라 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)상에서 MOPS 완충액으로 분리한다. 단백질은 XCell II 블롯 모듈(Invitrogen)중의 전달 완충액을 사용하여 PVDF 막(Millipore)상으로 전달한다. 차단 제제(Invitrogen)를 사용하여 실온에서 1시간동안 차단시킨 후 막은 항-Flag M2 항체(Sigma)로 프로빙한다. 단백질은 ECL Plus 화학발광 검출 시스템(Amersham Pharmacia)을 사용한 퍼옥시다제 커플링된 2차 항체로 가시화한다.
항체-생산 세포의 생성
CHO-DG44 세포 및 conCERT™ 세포주는 IgG1형 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 플라스미드로 안정하게 형질감염시킨다. 선택 조건하에 후속 배양에 의해, 안정하게 형질감염된 IgG 생산 세포 집단을 DG44 모 세포주 및 conCERTTM 세포 둘다로부터 생성시킨다. 세포 풀을 추가로 표준 스톡 배양 방식에 따라 배양하고 2 내지 3일마다 계대 배양한다.
ELISA에 의한 재조합 생성물 농도의 측정
CERT S132A 돌연변이체를 발현하도록 조작된 CHO-DG44 세포 및 conCERT™ 세포주로부터 유래된 IgG 생산자 세포에서 재조합 항체 생산을 평가하기 위해, 세포 상청액 기원의 샘플을 3개의 연속 계대를 위한 각각 계대 말기에 표준 접종 배양물로부터 수거한다. 이어서 생성물 농도는 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)로 분석한다. 분비된 모노클로날 항체 생성물의 농도는 사람 Fc 단편 (Jackson Immuno Research Laboratories) 및 사람 카파 경쇄 HRP 접합체(Sigma)에 대한 항체를 사용하여 측정한다.
단일 세포 분류
펄스 프로세싱이 장착된 'FACS Vantage' (Becton Dickinson) 유동 세포 측정기 및 자동화 세포 침적 유닛을 분석 및 세포 분류를 위해 사용한다. 정방향 및 측면 스캐터(FSC/SSC)의 도트 플롯상에서 단일 생존 세포 주변에 게이트를 설치한다. 분류된 세포는 자동화 세포 침적 유닛을 갖는 웰당 하나의 세포에서 200μL의 성장 배지를 함유하는 96웰 미세역가 플레이트에 침적시킨다.
핵산 분리 및 RT-PCR
성장하는 세포로부터 게놈 DNA 및 총 RNA는 제조업자의 지침에 따라 TRIzol？ 시약(Invitrogen, Germany)을 사용하여 분리한다. 이어서 RNA를 37℃에서 30분동안 DNase I로 처리한다. 제1 가닥 cDNA 합성은 3㎍의 총 RNA 및 올리고(dT) 올리고뉴클레오타이드로 개시하여 Cloned AMV 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (Invitrogen, Germany)를 사용하여 수행한다. 사람 CERT 전사체의 정량 수준은 Absolute™ QPCR SYBR？ Green Fluorescein Mix(ABgene, Surrey, UK) 및 MyIQ Real Time Detection 소프트웨어(BioRad, Germany)에 의해 조절된 열 순환기를 사용하는 실시간 PCR에 의해 측정한다.
conCERT™ 세포의 확인을 위한 유일한 증폭물은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 게놈 DNA 상에서 PCR에 의해 검출된다:
CMV 센스: 5' GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG 3' (서열번호 2) 및
터미네이터 안티-센스: 5' CAACTAGAAGGCACAGTCGAGG 3' (서열번호 3).
주형으로서 DNA 또는 mRNA를 사용하여, CERT S132A 발현은 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 검출한다:
CERT-for: 5' GCGTTCTGATGGTGACTTCTTG 3' (서열번호 4) 및
CERT-rev: 5' TGTCCTGTGACGCCTTTAACTG 3' (서열번호 5), 이에 의해 660bp의 PCR 생성물(서열번호 6)이 생성된다.
실시예: CHOPPER？ 세포의 제조 및 특징 분석
실시예 1 : CHO/CERT S132A 세포주의 특징 분석 및 유일한 확인
CHO/CERT S132A 세포주(본원에서는 또한 "conCERT™" 세포주로서 언급됨)는 일반적으로 사람 CERT 돌연변이체 S132A의 이종성 발현을 갖는 세포로서 기술될 수 있다.
본 발명에서 기재된 CHO/CERT S132A 세포주는 도 1A에 도시된 바와 같이 다음을 포함하는 CERT 발현 카세트를 함유한다: CMV 인핸서/프로모터로부터 유래된 업스트림 조절 서열(0.6 kb), 세린 132번이 알라닌으로 변화된 돌연변이를 갖는 사람 CERT 유전자(GeneID 10087)의 암호화 영역에 선행하는 Flag™ 에피토프 태그 (서열번호 1); TGA 종결 코돈 및 폴리아데닐화 시그널을 함유하는 0.5kb의 3' 비해독 영역.
본 발명에 기재된 CHO/CERT S132A 세포주의 제조를 위해 사용되는 벡터 작제물은 도 1B에 도시하고 하기의 기능성 요소를 함유한다:
■ 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터
■ Flag™-태그된 CERT-SA를 암호화하는 발현 카세트
■ 소 성장 호르몬(bGH pA)으로부터의 폴리아데닐화 시그널
■ 푸로마이신 내성을 위한 발현 카세트
■ 복제 오리진
■ 세균에서 암피실린 내성을 위한 베타-락타마제 발현 카세트
수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 2개의 CHO/CERT S132A 세포주는 이들의 게놈으로 안정하게 통합된 CERT S132A 발현 작제물을 함유한다.
수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20)로 DSMZ에 기탁된 세포주 및 수탁번호 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 세포주와 같이, 상기 작제물을 함유하는 CHO/CERT S132A 세포주는 게놈 DNA상에서 PCR에 의해 확인할 수 있다. 특이적 세트의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (서열번호 2 및 3)는 상기된 CERT S132A 발현 작제물로 형질감염되지 않은 세포로부터 CHO/CERT 세포를 검출함에 따라서 이를 확인할 수 있게 해주는 상기 PCR 반응에서 2373 bp 크기의 구별되는 시그널을 생성한다. 프라이머의 결합 위치 및 배향은 도 1B(화살표 머리)에 도시한다.
CMV 센스: 5' GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG 3' (서열번호 2)
터미네이터 안티-센스: 5' CAACTAGAAGGCACAGTCGAGG 3' (서열번호 3)
2373 PCR 단편이 제한 효소로 분해되는 경우, 제한 단편의 패턴은 표 1에 요약된 바와 같이 생성될 것이다.
[표 1]
주형으로서 DNA 또는 mRNA를 사용하여, conCERT 세포주에서 CERT S132A 발현은 또한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 CERT-for: 5' GCGTTCTGATGGTGACTTCTTG 3' (서열번호 4) 및 CERT-rev: 5' TGTCCTGTGACGCCTTTAACTG 3' (서열번호 5)를 사용하는 PCR에 의해 하기의 서열(서열번호 6)을 갖는 660 bp의 PCR 생성물을 수득함에 의해 검출할 수 있다:
본 발명에 기재된 CERT S132A 세포주 CHO/CERT S132A 2.20 및 2.41은 추가로 Flag™ 에피토프 태그에 대해 생성된 항체 (예를 들어, 항-Flag M2 모노클로날 마우스 항체(Sigma)) 또는 사람 CERT 단백질에 대해 생성된 항체(예를 들어, CERT/GPBP 항체, 클론 BL2222, Bethyl Laboratories, Inc.)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 Flag-CERT S132A 융합 단백질의 이종성 발현에 의해 확인될 수 있다. 항체 둘다는 햄스터 CERT 단백질과 교차 반응하지 않는다. 따라서, CERT-특이적 시그널은 단지 CHO/CERT S132A 세포에서 검출되는 반면 이러한 시그널은 CERT S132A 발현 작제물을 함유하지 않는 CHO 세포주에서 부재이다. CERT 발현 카세트를 갖는 벡터 작제물은 또한 푸로마이신 내성 유전자를 함유한다. CHO/CERT S132A 세포는 따라서 배양 배지내 5-10 μg/ml의 푸로마이신의 존재하에 성장할 수 있다.
수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 본 발명에 기재된 CHO/CERT S132A 세포주는 CHO-DG44 세포주의 유도체이다. 따라서, 이들은 동등하게 성장 및 생존을 위한 배양 배지에서 보충물 하이포크산틴 및 티미딘을 필요로 한다(HT 보충).
실시예 2: 안정하게 형질감염된 CHO/CERT S132A 세포 풀의 제조
본 발명에 기재된 CHO/CERT S132A 세포주를 제조하기 위해, N-말단 FlagTM 에피토프 태그와 융합된, CHO-DG44 세포[문헌참조: Urlaub et al., Cell 33, 1983]를 사람 CERT 단백질의 돌연변이 변이체(CERT Ser132→Ala, 본원에서 "CERT-S132A"로서 언급됨)에 대한 발현 카세트를 함유한 발현 작제물로 형질감염시킨다(도 1).
상기 단백질 암호화 영역은 하기의 서열(서열번호 1; 서열은 5'에서 3' 배향으로 나타내고; 개시 및 종결 코돈은 밑줄 및 볼드체로 나타내고, FlagTM-태그 암호화 영역은 밀줄쳐져 있고 CERT 암호화 영역은 이탤릭으로 나타내고 Ser132→Ala로 변화하는 돌연변이된 코돈은 밑줄 및 볼드체로 나타낸다)을 갖는다:
적합하게 형질감염된 세포 풀은 항생제 푸로마이신의 존재하의 선별에 의해 제조한다. 수득한 안정한 세포 풀에서 CERT-S132A 전이유전자의 발현은 Flag™ 태그 또는 CERT-S132A 단백질 자체에 대해 생성된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 확인한다. 세포 생산성은 CERT 수준과 상호관련이 있기 때문에, 최고 CERT-S132A 발현 수준을 갖는 세포 풀은 후속적 단일 세포 클로닝을 위해 선별한다.
실시예 3: 모노클로날 CHO/CERT S132A 세포주의 제조 및 스크리닝
CERT-S132A를 과발현하는 안정하게 형질감염된 세포 풀을 FACS 기반 단일 세포 클로닝에 적용하여 모노클로날 conCERT™ 세포주를 제조한다. 이어서 CHO/CERT S132A 클론을 2개의 파라미터와 관련하여 광범위하게 스크리닝한다: a) 고수준의 CERT-S132A 발현, b) 접종 배양물 및 유가식 과정 둘다에서 최적의 세포 성장 성질. 제1 라운드의 선별에서, CERT-S132A 발현은 세포내 염색에 의해 >100 CHO/CERT S132A 클론에서 평가한다. 이들로부터, 최고의 세포내 CERT-S132A를 갖는 15개의 클론을 증대 및 추가의 분석을 위해 선별한다. 15개의 선별된 CHO/CERT S132A 클론에서 CERT-S132A 발현은 항-FlagTM 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 추가로 평가한다(도 3). CERT-SA 돌연변이체의 과발현은 클론 1.15, 2.20, 2.31, 2.41, 2.65, 2.67, 3.11 및 3.31에서 최고이다. 산업적 생산 숙주 세포주의 경우, 무혈청 화학적으로 합성된 배지에서의 유가식 공정에서 뿐만 아니라 씨드 스톡 배양 둘다에서 양호한 성장 특성은 매우 중요하다. 따라서, CHO/CERT S132A 클론은 표준 산업적 접종 계획에 따라 배양하고 증식 시간 및 생존성을 평가하였다. 도 4는 성장률(A) 및 이들의 여러 배양 계대에 따른 생존능(B)에 따라 15개 CHO/CERT 클론의 등급을 보여준다. 2개의 세포주 CHO/CERT S132A 2.20 (수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ에 기탁됨) 및 CHO/CERT S132A 2.41 (수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁됨)은 최고의 증식 시간을 갖는 4개의 클론중에 있고 80 내지 100%의 생존능을 보여준다(도 5A). 다음에, CHO/CERT S132A 세포 클론의 성장은 생물약제 생산 공정을 위한 소규모 모델을 나타내는 진탕 플라스크에서 유가식 발효에서 조사한다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, 모든 CHO/CERT S132A 클론은, 평형에 도달하고 발효 말기에는 감소하는 세포 농도를 증가시킴에 의해 특성화된 초기 성장기를 갖는 통상의 성장 프로필을 보여준다. 그러나, CHO/CERT S132A 클론의 수행능은 최대 세포 밀도 뿐만 아니라 초기 단계에서 성장 속도와 관련하여 다양하다. 이것은 생산 공정에 대한 총 통합 생존 세포(IVC)에서 차이로 환산한다(도 5B). 모든 분석된 CHO/CERT S132A 세포주에서, 클론 1.13, 2.20 및 2.41은 모 CHO-DG44 세포주에 비해 보다 높은 최고의 IVC를 보여준다(도 5 B). 그러나, 클론 1.13은 단지 낮은 CERT-S132A 발현을 갖고 따라서 배제된다. 따라서, 본 발명에 기재된 2개의 세포주 CHO/CERT 2.20 (수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ에 기탁됨) 및 CHO/CERT 2.41 (수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁됨)은 우수한 성장 성질 뿐만 아니라 고수준의 CERT-SA 발현을 갖는 세포로서 선택된다. 2개의 세포주는 재조합 단백질의 제조를 위해 최적화된 숙주 세포주로서 이상적인 후보물이다.
실시예 4: GS 시스템을 사용하는 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포로서 CHO/CERT S132A 세포
수탁번호 DSM ACC2989로 DSMZ에 기탁된 세포 (CHO/CERT 2.20) 및 수탁번호 DSM ACC2990으로 DSMZ에 기탁된 세포 (CHO/CERT 2.41)는 이들이 양호한 성장 특성 뿐만 아니라 개선된 분비 능력을 갖기 때문에 재조합 단백질 생산을 위해 이상적인 숙주 세포이다. 모 DG44 세포주로서, 이들은 dhfr-결핍이고 따라서 생물약제 산업에서 재조합 단백질에 대해 가장 광범위하게 사용되는 발현 시스템(즉, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR))과 양립할 수 있다. 이들은 추가로 네오마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신 및 제오진과 같은 다른 통상적으로 사용되는 선별 전략 뿐만 아니라 글루타민 신테타제(GS) 선별/증폭 시스템과 양립할 수 있다.
실시예 5: 재조합 IgG1 항체 생산을 위한 숙주 세포로서 CHO/CERT S132A 세포
이들의 우수한 성질을 입증하기 위해, 본 발명에 기재된 conCERT™ 세포 및 모 CHO-DG44 세포주를 사람 모노클로날 IgG1형 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 안정하게 IgG-생산 세포 집단은 HT 보충 없이 항생제 G418의 존재하에 무혈청 화학적으로 합성된 배지에서의 선별에 의해 생성시킨다. 후속적으로 이들을 표준 산업적 세포주 개발 프로그램의 일부로서 메토트렉세이트(MTX)를 사용하는 유전자 증폭에 적용한다. 이어서 수득한 적합한 세포 풀은 진탕 플라스크에서 유가식 발효 과정에 적용한다. 10일 후, 배양물을 수거하고 상청액중에 IgG 농도는 ELISA로 측정한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 모 CHO-DG44 세포로부터 유래된 10개의 최고의 생산 풀의 중앙값 수거 역가는 conCERT™ 세포주로부터 유래된 생산자 세포에 비해 현저히 낮다. 추가로, 25-75% 범위의 DG44 항체 생산자 세포는 400mg/L 미만인 반면, 이러한 범위는 CHO/CERT S132A IgG 생산자 세포에서 400을 초과하여 거의 1g/L까지이다. 따라서, CHO/CERT S132A 세포로부터 생산자 세포 풀과 함께 수득된 수거 역가는 모 세포주로부터 유래된 생산자 세포 풀에 비해 약 2배 높다.
이들 데이터는 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 CHO/CERT S132A 세포가 모 DG44 세포주와 비교하여 재조합 단백질 생산을 위해 우수한 숙주 세포임을 입증한다.
실시예 6: IgG4 항체의 재조합 생산을 위한 숙주 세포로서 CHO/CERT S132A 세포
이들의 보다 우수한 성질을 입증하기 위해, 모 CHO-DG44 세포주 뿐만 아니라 본 발명에 기재된 conCERT™ 세포를 사람 모노클로날 IgG4형 항체를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시킨다. 적합하게 IgG-생산 세포 집단은 HT 보충 없이 항생제 G418의 존재하에 무혈청 화학적 합성 배지에서 선별에 의해 생성시킨다. 후속적으로 이들은 표준 산업적 세포주 개발 프로그램의 일부로서 메토트렉세이트(MTX)를 사용하는 유전자 증폭에 적용한다. 이어서 수득한 안정한 세포 풀은 진탕 플라스크에서 유가식 공정에 적용한다. 10일 후, 상기 배양물을 수거하고 상청액중 IgG 농도는 ELISA로 측정한다.
모 CHO-DG44 세포로부터 유래된 10개의 최고의 생산 풀의 중앙값 수거 역가는 conCERT™ 세포주로부터 유래된 생산자 세포에 비해 현저히 낮다. 추가로, 25-75% 범위의 DG44 항체 생산자 세포는 400mg/L 미만인 반면, 이러한 범위는 CHO/CERT S132A IgG 생산자 세포에서 400을 초과하여 거의 1g/L까지이다. 따라서, CHO/CERT S132A 세포로부터 생산자 세포 풀과 함께 수득된 수거 역가는 모 세포주로부터 유래된 생산자 세포 풀에 비해 약 2배 높다.
생물약제 제조는 cGMP 생산에 사용하기 위한 모노클로날 세포주의 제조를 요구한다. 따라서, 다음 단계에서 세포 클론은 최고로 발현하는 유전학적으로 이종성인 세포 풀로부터 제조한다. 후속적으로 각각의 유전자형 중 10개의 최고로 발현하는 재조합 클론의 수행능은 상기된 바와 같은 유가식 공정에서 뿐만 아니라 접종 배양물에서 분석한다. 또한, 모노클로날 세포주 수준에 대해, conCERT™ 세포주로부터 기원하는 IgG4 생산자 클론은 상당히 보다 높은 비생산성을 보여준다(도 7A - DG44 세포(classic)으로부터 유래된 10개의 최상 클론과 비교하여 IgG4형 항체(conCERT™)에 대한 CHO/CERT 2.20 및 2.41 재조합체로부터 10개의 최고로 발현하는 모노클로날 세포주). 추가로, 이것을 유가식 공정에서 conCERTTM 세포를 사용하여 달성된 보다 높은 총 IgG4 역가로 환산한다(도 7B).
상기 실시예는 수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 CHO/CERT S132A 세포가 모 DG44 세포주와 비교하여 재조합 단백질 생산을 위해 보다 우수한 숙주 세포임을 나타낸다.
실시예 7: conCERT™ 세포주 기원의 Fc 융합 단백질의 증가된 생물약제학적 단백질 생산
수탁번호 DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 conCERT™ 세포 및 CHO DG44 세포를, 목적하는 유전자로서 IgG 항체의 Fc-부분에 공유적으로 연결된 치료학적 활성(폴리-)펩타이드를 의미하는, Fc 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 선별 후, 상청액을 4회의 후속 계대 기간에 걸쳐 모든 안정한 세포 풀의 씨드 스톡 배양으로부터 취하고 생성물 역가는 ELISA로 측정하고 평균 세포수로 나누어 비생산성을 계산한다. 대비하여, 생성물 역가는 Fc 융합 단백질을 발현하는 DG44 유래된 세포와 비교하여 conCERT™ 숙주 세포로부터 생성된 생산 세포에서 매우 높다.
또한, 유가식 배양에서, conCERT™-유래된 세포는 수거시 보다 높은 역가 뿐만 아니라 융합 단백질의 상당히 증가된 생산성을 갖는다.
이것은 세포주 개발에서 conCERT™ 숙주 세포의 사용이 연속 배양에서 또는 생물반응기 배치 또는 유가식 배양에서 보다 높은 역가 뿐만 아니라 증진된 비생산성 능력을 갖는 생산자 세포주의 생성을 가능하게 함을 입증한다.
실시예 8: conCERT™ 세포주는 단일-쇄-Fv (scFv) 분자 및 도메인 항체의 생물약제학적 생산을 위한 우수한 숙주 세포를 대표한다.
수탁번호 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2.20) 및 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)으로 DSMZ에 기탁된 conCERT™ 세포 및 CHO DG44는 목적하는 유전자로서, 단일-쇄-Fv(scFv) 또는 도메인 항체(라마 또는 낙타과 기원의 기타 동물로부터 유래된 단일-쇄 항체의 가변 영역의 하나 이상의 도메인을 포함함)를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 선별 후, 상청액을 4회의 후속 계대 기간동안 모든 안정한 세포 풀의 씨드 스톡 배양으로부터 취하고 생성물 역가는 ELISA로 측정하고 평균 세포 수로 나누어 비생산성을 계산한다. 대비적으로 생성물 역가는 scFv 단백질 또는 도메인 항체를 발현하는 DG44 유래된 세포와 비교하여 conCERT™ 숙주 세포로부터 생성된 생산자 세포에서 매우 높다.
또한, 유가식 배양에서, conCERT™-유래된 세포는 수거시 보다 높은 역가 뿐만 아니라 융합 단백질의 상당히 증가된 생산성을 갖는다.
이것은 세포주 개발에서 conCERT™ 숙주 세포의 사용이 연속 배양 또는 생물반응기 배치 또는 유가식 배양에서 보다 높은 역가 뿐만 아니라 증진된 비생산성을 갖는 생산자 세포주의 생성을 가능하게 함을 입증한다.
서열 표:
서열번호 1 Flag-CERT-SA 암호화 영역(프라이머 CMV 센스(서열번호 2) 및 터미네이터 안티-센스(서열번호 3)을 사용하여 제조된 2373 bp 단편)
서열번호 2 프라이머 CMV 센스
서열번호 3 프라이머 터미네이터 안티-센스
서열번호 4 프라이머 CERT-for
서열번호 5 프라이머 CERT-rev
서열번호 6 프라이머 CERT-for(서열번호 4) 및 CERT-rev(서열번호 5)를 사용하여 수득된 660bp PCR 생성물
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<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1919
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> FLAG-CERT SA fusion construct
<400> 1
gccagtgtgc tggaattcac catggcccca ctagccgact acaaggacga cgatgacaag 60
atgtcggata atcagagctg gaactcgtcg ggctcggagg aggatccaga gacggagtct 120
gggccgcctg tggagcgctg cggggtcctc agtaagtgga caaactacat tcatgggtgg 180
caggatcgtt gggtagtttt gaaaaataat gctctgagtt actacaaatc tgaagatgaa 240
acagagtatg gctgcagagg atccatctgt cttagcaagg ctgtcatcac acctcacgat 300
tttgatgaat gtcgatttga tattagtgta aatgatagtg tttggtatct tcgtgctcag 360
gatccagatc atagacagca atggatagat gccattgaac agcacaagac tgaatctgga 420
tatggatctg aatccagctt gcgtcgacat ggcgcaatgg tgtccctggt gtctggagca 480
agtggctact ctgcaacatc cacctcttca ttcaagaaag gccacagttt acgtgagaag 540
ttggctgaaa tggaaacatt tagagacatc ttatgtagac aagttgacac gctacagaag 600
tactttgatg cctgtgctga tgctgtctct aaggatgaac ttcaaaggga taaagtggta 660
gaagatgatg aagatgactt tcctacaacg cgttctgatg gtgacttctt gcatagtacc 720
aacggcaata aagaaaagtt atttccacat gtgacaccaa aaggaattaa tggtatagac 780
tttaaagggg aagcgataac ttttaaagca actactgctg gaatccttgc aacactttct 840
cattgtattg aactaatggt taaacgtgag gacagctggc agaagagact ggataaggaa 900
actgagaaga aaagaagaac agaggaagca tataaaaatg caatgacaga acttaagaaa 960
aaatcccact ttggaggacc agattatgaa gaaggcccta acagtctgat taatgaagaa 1020
gagttctttg atgctgttga agctgctctt gacagacaag ataaaataga agaacagtca 1080
cagagtgaaa aggtgagatt acattggcct acatccttgc cctctggaga tgccttttct 1140
tctgtgggga cacatagatt tgtccaaaag gttgaagaga tggtgcagaa ccacatgact 1200
tactcattac aggatgtagg cggagatgcc aattggcagt tggttgtaga agaaggagaa 1260
atgaaggtat acagaagaga agtagaagaa aatgggattg ttctggatcc tttaaaagct 1320
acccatgcag ttaaaggcgt cacaggacat gaagtctgca attatttctg gaatgttgac 1380
gttcgcaatg actgggaaac aactatagaa aactttcatg tggtggaaac attagctgat 1440
aatgcaatca tcatttatca aacacacaag agggtgtggc ctgcttctca gcgagacgta 1500
ttatatcttt ctgtcattcg aaagatacca gccttgactg aaaatgaccc tgaaacttgg 1560
atagtttgta atttttctgt ggatcatgac agtgctcctc taaacaaccg atgtgtccgt 1620
gccaaaataa atgttgctat gatttgtcaa accttggtaa gcccaccaga gggaaaccag 1680
gaaattagca gggacaacat tctatgcaag attacatatg tagctaatgt gaaccctgga 1740
ggatgggcac cagcctcagt gttaagggca gtggcaaagc gagagtatcc taaatttcta 1800
aaacgtttta cttcttacgt ccaagaaaaa actgcaggaa agcctatttt gttctagtat 1860
taacaggtac tagaagatat gttttatctt tttttaactt tatttgacta atatgactg 1919
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer CMV sense
<400> 2
gacgtcaatg ggagtttgtt ttg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer Terminator anti-sense
<400> 3
caactagaag gcacagtcga gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer CERT-for
<400> 4
gcgttctgat ggtgacttct tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer CERT-rev
<400> 5
tgtcctgtga cgcctttaac tg 22
<210> 6
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 660bp PCR product CERT
<400> 6
gcgttctgat ggtgacttct tgcatagtac caacggcaat aaagaaaagt tatttccaca 60
tgtgacacca aaaggaatta atggtataga ctttaaaggg gaagcgataa cttttaaagc 120
aactactgct ggaatccttg caacactttc tcattgtatt gaactaatgg ttaaacgtga 180
ggacagctgg cagaagagac tggataagga aactgagaag aaaagaagaa cagaggaagc 240
atataaaaat gcaatgacag aacttaagaa aaaatcccac tttggaggac cagattatga 300
agaaggccct aacagtctga ttaatgaaga agagttcttt gatgctgttg aagctgctct 360
tgacagacaa gataaaatag aagaacagtc acagagtgaa aaggtgagat tacattggcc 420
tacatccttg ccctctggag atgccttttc ttctgtgggg acacatagat ttgtccaaaa 480
ggttgaagag atggtgcaga accacatgac ttactcatta caggatgtag gcggagatgc 540
caattggcag ttggttgtag aagaaggaga aatgaaggta tacagaagag aagtagaaga 600
aaatgggatt gttctggatc ctttaaaagc tacccatgca gttaaaggcg tcacaggaca 660
Claims (17)
- 수탁번호 DSM ACC2989로 기탁기관[DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)]에 기탁된 세포(CHO/CERT 2.20).
- 수탁번호 DSM ACC2990으로 기탁기관[DSMZ]에 기탁된 세포(CHO/CERT 2.41).
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포가, 목적하는 단백질을 암호화하는 목적하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 제2 벡터 작제물을 추가로 함유하는, 세포.
- 제3항에 있어서, 모든 벡터 작제물이 상기 세포의 게놈내로 안정하게 통합되는, 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가
a) 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 경우, 2373 bp PCR 생성물이 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 생성되는, 특이적 PCR 밴드 패턴/핑거프린트 또는
b) 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 경우, 660 bp PCR 생성물(서열번호 6)이 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 생성되는, 특이적 PCR 밴드 패턴/핑거프린트 또는
c) 하기의 제한 효소와 상기 (a)의 CERT 특이적 2373 bp-PCR 생성물의 항온처리(여기서, HindIII와의 항온처리가 바람직하다)로부터 비롯되는 특정 수의 단편 및 단편 크기:
를 특징으로 하는, 세포. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CERT S132A 발현 카세트가 서열번호 1로 이루어진, 세포.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적하는 단백질이 치료학적 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 융합 단백질인, 세포.
- a) 모 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 NSO 세포를 제공하는 단계,
b) CERT S132A 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 상기 단계(a)의 모 숙주 세포에 도입하는 단계,
c) 안정하게 형질감염된 세포 집단을 선별하는 단계,
d) FACS 기반 단일 세포 클로닝에 의해 모노클로날 세포주를 분리하는 단계,
e) i) 고수준의 CERT S132A 발현,
ii) 씨드 스톡 배양에서 최적의 성장,
iii) 유가식 배양에서 최적의 성장
에 대해 상기 모노클로날 세포주를 스크리닝하는 단계,
f) 단계(e)의 스크리닝 기준에 따른 단계(d)의 세포 클론으로부터의 모노클로날 세포주를, 숙주 세포주로서 선별하는 단계
를 특징으로 하는, 숙주 세포주를 제조하는 방법. - a) 모 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 NSO 세포를 제공하는 단계,
b) CERT S132A 발현 카세트를 포함하는 벡터 작제물을 상기 단계(a)의 모 숙주 세포에 도입하는 단계,
c) 안정하게 형질감염된 세포 집단을 선별하는 단계,
d) FACS 기반 단일 세포 클로닝에 의해 세포를 분리하는 단계,
e) i) 고수준의 CERT S132A 발현,
ii) 씨드 스톡 배양에서 최적의 성장,
iii) 유가식 배양에서 최적의 성장
에 대해 상기 세포를 스크리닝하는 단계,
f) 단계(e)의 스크리닝 기준에 따른 단일 클론 또는 세포 풀을, 숙주 세포로서 사용하기 위해 선별하는 단계
를 특징으로 하는, 숙주 세포를 제조하는 방법. - 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 단계(b)의 CERT S132A 발현 카세트가 서열번호 1로 이루어진, 방법.
- a) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하는 단계, 및
b) 목적하는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계
를 특징으로 하는, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포에서 목적하는 유전자에 의해 암호화된 목적하는 단백질을 제조하는 방법. - 제11항에 있어서, 상기 방법이
c) 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계
의 추가의 단계를 포함하는, 방법. - 제12항에 있어서, 상기 방법이
d) 상기 목적하는 단백질을 정제하는 단계
의 추가의 단계를 포함하는, 방법. - a) 폴리머라제 연쇄 반응 PCR을 수행하고,
b) 주형으로서 게놈 DNA를 사용하고,
c) 서열번호 2 및 서열번호 3을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용함에 의해,
2373 bp PCR 생성물이 생성되는,
CERT S132A(서열번호 1)로 유전자전이된 세포를 확인하는 방법. - a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하고,
b) 상기 세포의 증식을 허용하는 조건하에서 상기 세포를 배양함
을 포함하는, 세포를 배양하는 방법. - 단백질의 제조를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
- 제1항 또는 제2항에 따른 세포, 목적하는 유전자의 발현을 위한 발현 벡터 및 상기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지를 포함하는 키트.
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