KR20120013984A - 폴리머 펜 리소그래피에 의해 제조된 멀티플렉스 바이오분자 어레이 - Google Patents

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채드 에이. 머킨
펭웨이 후오
지지안 젱
루이스 알. 지암
웨스턴 엘. 다니엘
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노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 표면 상에 복수의 바이오분자를 패턴화하는 방법을 개시한다. 상기 방법은, 바이오분자를 포함하는 선택된 잉크가 팁에 묻게 되는 폴리머 펜 어레이에 잉크를 묻히는 단계 및 폴리머 펜 리소그래피 기법을 이용하여 상기 바이오분자를 표면에 이동시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 표면 상에 복수의 패턴화된 바이오분자를 사용하는 방법을 개시한다.

Description

폴리머 펜 리소그래피에 의해 제조된 멀티플렉스 바이오분자 어레이{MULTIPLEXED BIOMOLECULE ARRAYS MADE BY POLYMER PEN LITHOGRAPHY}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 61/172,481에 대해 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 개시 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
정부 이해 관계에 대한 진술
본 발명은 국립 과학재단 보조금 제 EEC-0647560호, DARPA 보조금 제 N66001-08-102044호, 국립 보건원(NIH)/국립 암 연구소/암 나노기술 센터 (NCI-CCNE) 보조금 제 1U54CA119341호에 따른 미국 정부의 지원으로 행해졌다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 소정의 권리를 가진다.
저비용 및 고처리율 방식으로 바이오분자(예, 단백질) 마이크로어레이와 나노어레이를 제작하는 역량은, 약물 스크리닝, 의학적 진단, 바이오센서 및 기초 생물 연구를 비롯하여, 매우 다양한 적용 분야들에 있어, 중요하다(1-3). 전통적인 마이크로어레이 제조 방법은 광 리소그래피와 잉크젯 인쇄이다. 최근에는, 고밀도의 단백질 나노어레이가 높은 검출 감도를 제공하고 한개의 칩으로 수백만개의 바이오마커를 스크리닝할 수 있기 때문에, 단백질 패턴을 나노미터 형태로 소형화하는데 연구가 집중되고 있다(4). 또한, 단백질의 나노패턴화를 통해 세포 부착과 같은 기초적인 생물학적 과정(5)에 대해 통찰력을 가질 수 있다(6, 7). 미세접촉 인쇄(8, 9), 나노임프린트 리소그래피(10) 및 특수 스캐닝 탐침 리소그래피 등(4, 11, 12)을 비롯하여, 단백질 구조체의 소형화를 지향하는 새로운 많은 기법들 중에서도, 딥-펜 나노리소그래피(DPN: dip-pen nanolithography)(13)는 나노스케일로 매우 복잡한 생활성 단백질 패턴을 작성할 수 있는 유일한 "직접 작성법(direct write)"이다(14, 15). 리 등(7, 16)은, 최초로, 원자력 현미경(AFM: atomic force microscopy) 캔틸레버를 이용하여, DPN에 의해 표면 상에 하나의 단백질 (또는 2개 이상의 상이한 단백질들을 2가지의 순차적인 단계로)의 나노어레이를 제작할 수 있음을 입증하였다. 이러한 연속 작성 방식의 처리율은, 1차원(1D)(17, 18) 및 2차원(2D)(19, 20) 평행 캔틸레버 어레이를 사용하거나, 또는 플랫 스탬프(flat stamp) 방법(12)으로 높일 수 있다. 중요한 점은, DPN의 "직접 작성"이라는 특징이 잉크의 교차 오염성을 최소화시킨다는 것이다.
DPN에 의해, 넓은 면적에 여러가지 유형의 단백질 패턴을 형성하는 방법들은 몇가지 이유로 해결 과제로 남아 있다. 먼저, Si 및 Si3N4 캔틸레버(cantilever)의 불투명성으로 인해, 잉크웰을 이용하여 복수의 단백질을 잉크로 표시하기 위해, 2D 캔틸레버 어레이를 정렬시키는 것은, 불가능하지는 않다고 해도 매우 어렵다. 두번째로, 여러가지 단백질들의 확산 속도는 그것의 분자량, 유체역학적 반경(hydrodynamic radii) 및 다른 요소들에 있어서의 차이로 인해 매우 다를 수 있다. 이러한 차이로, 팁-기질 접촉 시간을 일정하게 유지하더라도 여러가지 단백질들 간에 피처 크기(feature size)의 불균일이 발생할 수 있다. 세번째로, 단백질은 확산 속도가 통상 낮기 때문에, 광학적 검출 목적에 유용한 미크론 미만 또는 미크론 스케일의 단백질 패턴을 제작하는 과정에 시간이 많이 소요된다. 네번째로, 대규모의 병행되는 DPN 실험들에 필요한 2D Si3N4 캔틸레버 어레이는 비싸고 쉽게 파손된다. 따라서, 넓은 면적에 걸쳐 복수의 바이오분자를 재현가능한 방식으로 패턴화하여 증착시키는 방법이 필요하다.
Mirkin, ACS Nano 2007, 1, 79-83. Balboni, et al., Annu. Rev. Immuno. 2006, 24, 391-418. Jonkheijm, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9618-9647. Christman, et al., Soft Matter 2006, 2, 928-939. Chen, et al., Science 1997, 276, 1425-1428. Yousaf, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98, 5992-5996. Lee, et al., Science 2002, 295, 1702-1705. Bernard, et al., Adv. Mater. 2000, 12, 1067-1070. Duan, et al., Langmuir 2008, 24, 3621-3627. Hoff, et al., Nano Letters 2004, 4, 853-857. Pavlovic, et al., Nano Letters 2003, 3, 779-781. Kenseth, et al., Langmuir 2001, 17, 4105-4112. Piner, et al., Science 1999, 283, 661-663. Ginger, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 30-45. Salaita, et al., Nat. Nanotech. 2007, 2, 145-155. Lee, et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5588-5589. Lee, et al., Adv. Mater. 2006, 18, 1133-+. Hong, et al., Science 2000, 288, 1808-1811. Lenhert, et al., Small 2007, 3, 71-75. Salaita, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7220-7223. Zheng, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9951-9954. Wang, et al., Small 2008, 4, 1666-1670. Huo, et al., Science 2008, 321, 1658-1660. Park, et al., Nat. Mater. 2007, 6, 782-789.
본 발명은 폴리머 팁 어레이를 이용하여 기재(substrate) 표면 상에 바이오분자를 인쇄하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 각각 약 1 ㎛ 미만의 곡률 반경을 가진, 복수개의 비-캔틸레버형(non-cantilevered) 팁을 포함하는, 압축성 폴리머를 포함하는 팁 어레이를 사용하여, 기재 표면에 복수의 바이오분자를 인쇄하는 방법과, 2개 이상의 바이오분자의 인디시아(indicia)를 병렬 형성하는 방법을 개시한다.
즉, 일 측면에서, 본 발명은 기재 표면 상에 2종 이상의 상이한 바이오분자를 동시에 인쇄하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 팁 어레이를, 제1 바이오분자 및 제1 담체를 포함하는 제1 잉크를 포함하고 있는 제1 복수개의 웰과 제2 바이오분자와 제2 담체를 포함하는 제2 잉크를 포함하고 있는 제2 복수개의 웰이 구비된, 대응되는 잉크웰 어레이에, 상기 팁 어레이의 제1 복수개의 팁을 상기 제1 복수개의 웰에 넣어 상기 제1 잉크로 코팅시키고, 상기 팁 어레이의 제2 복수개의 팁을 상기 제2 복수개의 웰에 넣어 상기 제2 잉크로 코팅시키도록, 침지하므로써, 상기 팁 어레이를 2종 이상의 잉크로 코팅하는 단계로서, 상기 팁 어레이의 팁들은, 각각 1 ㎛ 미만의 곡률 반경을 가지며 압축성 엘라스토머 (elastomeric) 폴리머를 포함하는, 비-캔틸레버형 팁들을 포함하는 것을 특징으로 하는 코팅 단계; 상기 어레이의 코팅된 팁들 전체 또는 실질적으로 전체를 제1 접촉 시간 동안 제1 접촉 압력에서 기재 표면과 접촉시켜, 상기 제1 잉크를 상기 기재 표면 상의 제1 위치 세트에, 그리고 상기 제2 잉크를 상기 기재 표면 상의 제2 위치 세트에 증착(deposition)시켜, 제1 인디시아 세트와 제2 인디시아 세트를 모두 실질적으로 균일한 크기로 형성시키는 단계를 포함한다.
다양한 구현예들에서, 상기 팁 어레이는 제3 복수개의 팁을 더 포함하며, 상기 잉크웰 어레이는 제3 바이오분자와 제3 담체를 포함하는 제3 잉크가 구비된 제3 복수개의 웰을 더 포함하며, 상기 침지 단계 동안에 제3 복수개의 팁을 코팅하는 단계 및 상기 접촉 단계 동안에 상기 기재 표면 상에 상기 제3 바이오분자를 인쇄하여, 제3 위치 세트에 제3 인디시아 세트를 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 이때, 상기 제3 인디시아 세트 전체는 상기 제1 및 제2 인디시아 세트와 실질적으로 균일한 크기를 가진다. 일부 구체적인 구현예들에서, 상기 제3 인디시아 세트 전체는 상기 제1 또는 제2 인디시아 세트와 실질적으로 균일한 바이오분자 밀도를 가진다. 상기 제3 인디시아 세트 전체는 상기 제1 및 제2 인디시아 세트와 실질적으로 균일한 바이오분자 밀도를 가진다.
일부 경우에, 상기 팁 어레이의 각각의 팁들은 기재 표면에 동시에 접촉된다.
일부 경우에, 또한 인디시아는 잉크 밀도가 실질적으로 균일하다. 다양한 경우들에서, 각각의 팁들은 약 0.2 ㎛ 미만의 곡률 반경을 가진다. 각각의 팁들은 피라미드형 등의 동일한 형태를 가질 수 있다. 상기 팁 어레이의 상기 압축성 엘라스토머 폴리머는 약 10 MPa 내지 약 300 MPa의 압축 모듈러스 (compression modulus)를 가진다. 일부 경우에, 압축성 엘라스토머 폴리머는 폴리디메틸실록산(PMDS)을 포함하며, 특정 경우에, 상기 PMDS는 말단이 트리메틸실록시인 비닐메틸실록산-디메틸실록산 코폴리머, 메틸하이드로실록산-디메틸실록산 코폴리머 또는 이의 혼합물을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 잉크웰은, 상기 팁 어레이의 팁들의 팁 정점 간격(tip apex spacin), 팁 크기 또는 이들 2가지 특성과 각각 부합되는, 웰-간 간격 및/또는 웰 구조를 가진다. 일부 특정 경우에, 제1 복수개의 팁들 중 하나 이상의 팁 정점과, 제2 복수개의 팁들 중 하나 이상의 팁 정점은, 200 ㎛ 미만 또는 100 ㎛ 미만의 거리로 이격되어 있다. 다양한 경우들에서, 상기한 방법은, 상기 제1 복수개의 팁들이 제1 잉크로 오염되지 않거나 또는 실질적으로 오염되지 않게 팁 어레이를 코팅하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기한 방법은, 상기 제2 잉크로 오염되지 않거나 또는 실질적으로 오염되지 않게 하면서, 제1 인디시아 세트를 형성하는 것을 포함한다. 다양한 경우에, 상기 방법은, 피처 크기가 1 ㎛ 미만인, 제1 인디시아 세트 및/또는 제2 인디시아 세트를 형성하는 것을 포함한다.
다양한 구현예들에서, 본 발명의 방법은, 잉크젯 프린터를 이용하여 잉크의 액적(droplet)을 웰 안으로 분사시킴(jetting)으로써, 제1 복수개의 웰에 제1 잉크를, 제2 복수개의 웰에 제2 잉크를 적어도 부분적으로 충전하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 잉크젯 프린터는 전기유체역학적 잉크젯 프린터(electrohydrodynamic inkjet printer)이다. 다양한 경우들에서, 잉크웰 어레이의 적어도 한면은 불소화된(fluorinated) 표면을 포함한다. 일부 특정 경우에, 불소화된 표면은 불소화된 실란을 포함한다. 불소화된 실란은 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로르실란을 포함할 수 있다.
바이오분자는 항체, 항원, 단백질, 효소, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고당, 다당류 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 제1 잉크, 제2 잉크 또는 각각의 제1 잉크와 제2 잉크는, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 제1 바이오분자, 제2 바이오분자 또는 이 둘다는 표지물을 더 포함한다. 다양한 경우에, 제1 및 제2 바이오분자는 각각 다른 표지물을 포함한다. 상기 표지물은 형광 표지물일 수 있다. 상기 형광 표지물은, 플루오레세인 염료, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥사논산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 로다민 염료, 벤조페녹사진, Cyanine 2 (Cy2) 염료, Cyanine 3 (Cy3) 염료, Cyanine 3.5 (Cy3.5) 염료, Cyanine 5 (Cy5) 염료, Cyanine 5.5 (Cy5.5) 염료, Cyanine 7 (Cy7) 염료, Cyanine 9 (Cy9) 염료, 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 5(6)-카르복시-테트라메틸 로다민 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 상기 팁 어레이, 상기 기재 표면 또는 둘다를 서로 이동시키는 단계, 및 상기 제1 접촉 시간과 동일하거나 상이한 제2 접촉 시간 및 상기 제1 접촉 압력과 동일하거나 상이한 제2 접촉 압력에서, 상기 접촉 단계를 반복 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은, 도트를 포함하는 인디시아를 형성시키기 위해, 접촉 단계 동안에는 상기 팁 어레이와 기재 간의 측방향 이동을 제한한다. 일부 특정 구현예에서, 상기 방법은, 약 10 nm 내지 약 500 ㎛의 범위의 직경을 가진 도트가 형성되도록, 접촉 시간 및/또는 접촉 압력의 제어를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 방법은, 팁 어레이에 입사광을 역광 조사(backlighting)하여, 팁의 내부 표면으로부터 입사광의 내부 반사를 유발하는 단계; 상기 팁 어레이의 팁들과 기재 표면을, 팁들 일부(subset)와 기재 표면 간의 접촉 지점까지 z-축을 따라 접근시키는 단계로서, 이때 접촉은 상기 기재 표면과 접촉된 일부의 팁들로부터 반사되는 광의 강도 증가로 표시되지만, 다른 팁들로부터 반사되는 광의 강도 무변화는 비접촉 팁인 것으로 표시되는 단계; 및 상기 기재 표면과 상기 비접촉 팁들 간에 접촉이 이루어지도록, 상기 팁들의 내부 표면으로부터 반사되는 광의 강도 차이에 따라, 상기 팁 어레이와 상기 기재 표면 중 하나 또는 이들 모두를 서로에 대하여 틸팅(tilting)하는 단계에 의해, 상기 기재 표면에 대해 상기 팁 어레이의 팁들을 수평화(leveling)하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 틸팅 단계는 1회 이상 x축, y축 및/또는 z축에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 팁 어레이에 입사광을 역광 조사(backlighting)하여, 팁의 내부 표면으로부터 입사광의 내부 반사를 유발하는 단계; 상기 팁 어레이의 팁들과 기재 표면을, 서로 접촉되도록 z-축을 따라 접근시키는 단계; 상기 팁 어레이와 상기 기재 중 하나 또는 둘다를 서로를 향하여 z축을 따라 팁들 중 일부가 압축되도록 더욱 이동시키는 단계로서, 이때 상기 팁으로부터 반사된 광의 강도는 상기 기재 표면에 대한 상기 팁들의 압축 수준에 대한 함수로서 증가되는 단계; 및 상기 기재 표면과 팁들 간에 실질적으로 균일한 접촉이 이루어지도록, 상기 팁의 내부 표면으로부터 반사된 광의 강도 차이에 따라 상기 팁 어레이와 상기 기재 표면 중 하나 또는 둘다를 서로에 대하여 틸팅하는 단계에 의해, 기재 표면에 대해 팁 어레이의 팁들을 수평화(leveling)하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 틸팅은 x축, y축 및/또는 z축을 따라 1회 이상 수행된다.
다양한 구현예에서, 상기 방법은, 랜드(land)에 의해 이격된 기재 내 리세스(recess) 어레이를 포함하는 마스터를 형성하는 단계; 프리폴리머 및 선택적으로 가교제를 포함하는 프리폴리머 혼합물로 상기 리세스를 충전하고 상기 랜드를 덮는 단계; 상기 프리폴리머 혼합물을 경화시켜, 팁 어레이와 공통 기재를 포함하는 폴리머 구조를 형성하는 단계; 상기 마스터로부터 경화된 폴리머 구조물을 분리하는 단계; 및 상기 팁 어레이에 대한 잉크웰 어레이로서 사용하기 위해, 상기 마스터의 리세스에 하나 이상의 잉크를 적어도 일부 충전하는 단계를 더 포함한다. 상기 마스터의 표면은, 불소화된 실란(예, 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로르실란) 등의 불소화된 기재로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 리세스와 랜드를 가지고 있는 몰드를 제작하는 단계; 상기 몰드에서 팁 어레이를 제작하는 단계; 상기 제작된 팁 어레이를 상기 몰드에서 분리시키는 단계; 상기 몰드의 리세스에 하나 이상의 잉크를 적어도 일부 충전하여, 잉크웰 어레이를 제조하는 단계; 및 그 후 상기 팁 어레이를 상기 잉크웰 어레이에 넣어, 상기 팁 어레이에 상기 잉크를 코팅하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 마스터의 표면은 불소화된 실란(예, 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로르실란) 등의 불소화된 기재로 처리될 수 있다. 이러한 처리는 상기 마스터를 상기 프리폴리머 혼합물로 충전하기 전이나 후에 이루어질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 기재; 상기 기재의 표면 상의 제1 바이오분자를 포함하는 제1 인디시아 세트; 및 상기 기재의 표면 상의 제2 바이오분자를 포함하는 제2 인디시아 세트를 포함하며, 상기 제1 및 제2 인디시아 세트 모두 실질적으로 크기가 균일하며, 상기 제1 인디시아 세트의 하나의 인디시움과 제2 인디시아 세트의 하나의 인디시움이 상기 표면 상에 200 ㎛ 미만의 간격으로 이격되어 있는, 물품(article)을 제공한다. 일부 경우들에서, 상기 제1 인디시아 세트와 제2 인디시아 세트는 모두 밀도가 실질적으로 균일하다. 다양한 경우들에서, 상기 제1 인디시아 세트의 하나의 인디시움과 제2 인디시아 세트의 하나의 인디시움이 상기 표면 상에 100 ㎛ 미만의 간격으로 이격되어 있다. 일부 경우, 제1 인디시아 세트와 제2 인디시아 세트는 모두 100 ㎛ 미만의 피처 크기를 가진다. 다양한 구현예에서, 제1 바이오분자, 제2 바이오분자 또는, 각각의 제1 바이오분자 및 제2 바이오분자는 항체, 항원, 단백질, 효소, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고당, 다당류 또는 이의 혼합물을 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 물품은, 상기 기재 표면 상에 제3 바이오분자를 포함하는 제3 인디시아 세트를 추가로 포함하며, 이때, 상기 제3 인디시아 세트 전체는 제1 인디시아 세트 전체와 실질적으로 크기가 균일하다. 일부 특정 경우에, 제3 인디시아 세트 전체는 제1 인디시아 세트 전체와 실질적으로 밀도가 균일하다.
도 1은, (A) PPL에 의한 다중 단백질 어레이의 패턴화 공정을 예시한 개략도; (B) 잉크젯 인쇄에 의해 3가지 단백질이 포함된 잉크가 채워진 Si 잉크웰의 형광 이미지; (C) (B)의 Si 잉크웰에 침지된 폴리머 펜 어레이; (D) (C)의 폴리머 펜 어레이를 이용하여 PPL로 제작한 다중 단백질 어레이(1열: Alex Fluor 647 - 항-콜레라 독소 β (CTβ) 접합체; 2열: TRITC - 항-마우스 IgG 접합체; 3열: Alex Fluor 488 - 항-전립선 특이 항원 (PSA) 접합체)를 나타낸 것이다.
도 2는, (A) PPL의 Codelink 슬라이드 상에 패턴화된 CTβ/글리세롤의 탭핑(tapping) 모드의 AFM으로 수득한 토포그라피 사진; (B) (A)의 AFM 토포그라피의 확대 사진; (C) 팁-기재 접촉력의 함수로서의 패턴화된 단백질 어레이의 피처 크기; 및 (D) Alex Fluor 488 - 항-PSA 접합체로 표지된 PSA 어레이에 대한, 여러가지 팁-기재 접촉 시간 및 접촉력에 따른 형광 사진(삽입된 사진은 확대 사진임)를 나타낸 것이다.
도 3은 일 구현예에 따른 팁 접촉 시간(들)과 제조된 인디시아의 피처 크기 간의 상관성을 나타낸 것이다.
도 4는 일 구현예에서, 기재 표면에 대한 팁 어레이의 수평화에 사용되는 광원에 대한, 팁 어레이, 압전 스캐너(piezo scanner) 및 기질 표면의 조립을 예시한 개략도이며, 팁 정점의 위치를 팁 어레이 상에서 보여준다.
도 5A는 선택된 잉크 물질에 대한 팁-기재 접촉 시간과 도트 크기의 상관관계를 나타낸 것으로, 그래프의 기울기는 해당 잉크의 확산 상수(diffusion constant)이다.
도 5B는, 1:5 및 1:7.5의 잉크/PEG 비율에서, IgG 및 β-갈락토시다제의 잉크 확산 속도가, 팁-기재 접촉 시간 전 영역에서 서로 매우 근접하게 동조될 수 있음을 나타낸 것이다.
본 발명은 단백질 및 다른 바이오분자의 어레이를 패터닝하는 방법, 예컨대 단백질 및 다른 바이오분자의 패턴화된 어레이를 다양한 검출 분석에 이용하는 방법을 기술한다.
최근, 분자 기반의 물질로 구성된 나노 및 마이크로 구조체를 직접 작성할 수 있는 유일한 리소그래피 툴인, 폴리머 펜 리포그라피(PPL)가 보고되었다. 이에 대한 예로, 참조문헌 23과 WO 09/132321을 참조하며, 이 문헌들은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. PPL은, 경질의 Si3N4 캔틸레버 대신, 스캐닝 탐침 현미경으로 펜 어레이의 이동성을 제어함으로써, 작은 표면적 상에 많은 수의 팁들로 구성된 연질 폴리머 펜(예로, 3인치(7.6 cm) 직경의 웨이퍼 면적 상에 많게는 1,100만개의 작성용 펜) 어레이를 사용하여, 표면 상에 잉크를 이동시킨다. 본원에서는, 나노 및 마이크로 구조체를 제어하면서, 한번에 복수의 단백질과 그외 바이오분자 어레이들을 패턴화하기 위한 PPL의 사용 방법을 개시한다. 중요한 점은, 다양한 경우들에서, PPL로 제조한 단백질 어레이들은, 특이적인 항원-항체 인지를 보여주는 실험들에 의해 입증된 바와 같이, 자신의 생활성을 유지한다는 것이다.
본원에서, 용어 "바이오분자"는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 항원, 항체, 폴리펩타이드, 단백질, 효소, 올리고당, 다당류 등 중 임의의 한가지 이상을 지칭한다.
다양한 측면에서, 바이오분자는 표지물을 선택적으로 더 포함할 수 있다. "표지물"은 화학적 또는 물리적 수단 중 어느 한가지를 통해 신호를 발생시키는 표지물과 같이, 시각적 또는 장치적 수단에 의해 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는, 임의의 물질을 지칭한다. 이러한 표지물은 효소 및 기질, 발색단, 촉매, 플루오로포어(fluorophore), 화학발광 화합물, 및 방사능 표지물을 포함할 수 있다.
다양한 경우들에서, 표지물은 상기 바이오분자에 공유 결합으로 부착된다. 일부 경우에는, 상기 표지물은 바이오분자에 비공유 결합으로 부착된다. 표지물은 스페이서를 통해 바이오분자에 부착될 수 있다. 다양한 경우에, 스페이서는 수용성 폴리머와 같은 폴리머를 포함한다. 일부 구체적인 경우에, 폴리머는 올리고뉴클레오티드, 올리고당 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
일부 경우에, 표지물은, 플루오레세인 염료, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥사논산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 로다민 염료, 벤조페녹사진, Cyanine 2 (Cy2) 염료, Cyanine 3 (Cy3) 염료, Cyanine 3.5 (Cy3.5) 염료, Cyanine 5 (Cy5) 염료, Cyanine 5.5 (Cy5.5) 염료, Cyanine 7 (Cy7) 염료, Cyanine 9 (Cy9) 염료, 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 5(6)-카르복시-테트라메틸 로다민 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 플루오로포어(fluorophore)를 포함한다. 방사성 동위원소로는 35S, 14C, 125I, 3H, 131I 및 이의 조합이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
그외 적합한 표지물로는 미립자 표지물, 예컨대 금과 같은 콜로이드형 금속 입자, 셀레늄 또는 텔루르와 같은 콜로이드형 비금속성 입자, 염색되거나 착색된 입자, 예컨대 염색된 플라스틱 또는 염색된 미생물, 유기 폴리머 라텍스 입자 및 리포좀, 착색된 비드, 폴리머 마이크로캡슐, 낭(sac), 적혈구, 적혈구 고스트, 또는 직접 가시화가능한 물질이 포함된 그외 소낭(vesicle) 등이 있다. 일부 경우에, 가시적으로 검출가능한 표지물은 표지 시약의 표지 성분으로서 사용되며, 따라서 테스트 샘플내 분석물의 존재나 양을 직접 가시적으로 또는 장치를 통해 판독하기 위한 용도로 제공되며, 검출부에서 추가적인 신호를 발생시키는 구성 요소들은 필요하지 않다.
본 발명에서 특정 표지물의 선택이 매우 중요한 것은 아니지만, 표지물은 그 자체적으로 또는 장치로 검출할 수 있는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있거나, 또는 효소/기질 신호 발생 시스템과 같이 한가지 이상의 추가적인 신호 발생 요소들과 함께 사용하여 검출할 수 있는 신호를 발생시킬 수 있을 것이다. 표지물 시약의 표지물 또는 구체적인 결합 구성 요소들을 변경시킴으로써, 매우 다양한 여러가지 표지물 시약들을 만들 수 있으며, 당해 기술 분야의 당업자라면 선택시 바람직한 검출 수단과 검출할 분석물이 고려됨을 알 것이다.
예를 들어, 한가지 이상의 신호 발생 구성 요소들은 검출가능한 신호를 발생시키기 위해 표지물과 반응할 수 있다. 표지물이 효소라면, 효소를 하나 이상의 기질이나 추가적인 효소 및 기질들과 반응시켜 검출가능한 반응 산물을 발생시킴으로써, 검출가능한 신호를 증폭시킨다.
단백질, 탄수화물, 핵산 및 유기체 전체와 같은 생물학적 물질을 염색하기 위한 염료의 사용은 문헌에 기재되어 있다. 특정 염료는 염료와 리간드의 적합한 화학적인 특성을 우선적으로 기초로 하여 특정 물질을 염색시키는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 단백질용 코마시 블루 및 메틸렌 블루, 탄수화물용 페리오딕산(periodic acid)-Schiff 시약, 전세포 염색용 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet), 사프라닌(Safranin) O 및 트립판 블루, 핵산 염색용 에티듐 브로마이드 및 아크리딘 오렌지, 및 형광 현미경에 의한 검출을 위한 로다민 등의 형광 염료 및 Calcofluor White가 있다. 표지물의 추가적인 예들은 일부 미국 특허 4,695,554; 4,863,875; 4,373,932; 및 4,366,241에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 1A는 본원의 방법을 개략적으로 도시한 것이다. 한가지 실험에서, 폴리머 펜 어레이와 부합되는 웰-간 간격과 구조를 취하고 있는 잉크웰에 먼저 잉크젯 인쇄에 의해 단백질 잉크를 충전한다. 일부 구현예에서, 팁 어레이의 제조에 사용되는 몰드는 잉크웰로 사용한다. 이러한 구현예에서, 팁 어레이의 팁들은 잉크웰의 웰들의 웰-간 간격, 구조 또는 이 두가지 모두와 완벽하게 또는 실질적으로 완벽하게 일치되게 배열된다. 이 몰드 잉크웰은 잉크웰의 커터웨이 측면도(cutaway side view)로 나타낸, 아래 도해도에서 볼 수 있다. 처음에 폴리머 펜 어레이 팁용 몰드를 형성하고 있는 톱니 모양에 잉크를 채워, 이를 사용하여 특정 팁에 해당 잉크를 선택적으로 코팅할 수 있다.
도해도
Figure pct00001
몰드 및 잉크웰
그런 다음, 잉크가 묻은 팁을 사용하여 기재 표면 상에 인디시아를 만들 수 있으며, 인디시아의 간격과 배치는 PPL 기법을 이용하여 선택적으로 잉크가 묻혀진 팁과 팁의 접촉에 의해 조절된다.
본원에서는, 고처리율 및 저비용 방식으로 바이오분자(예, 단백질)의 나노 및 마이크로 어레이를 다중 패턴화함에 있어서의 PPL의 사용을 개시한다. 잉크웰을 이용하여 잉크를 묻힌 피라미드형 펜은, 우수한 어드레스 성능(addressability)을 나타내며 주변 펜들과의 교차 오염성이 없는 것으로 확인되었다. 단백질 및 그외 바이오분자 어레이는, 교차-오염없이, 본래의 생활성을 유지하면서, "직접 작성" 방법에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 이러한 방법은 바이오분자의 대규모의 다중 패턴화에 적용할 수 있는 포괄적인 접근법이다.
폴리머 펜 리소그래피
폴리머 펜 리소그래피를 정의하는 특징은, 시간- 및 압력-의존적인 잉크 이동이다. DPN에서와 같이, 폴리머 펜 리소그래피에 의해 제작되는 피처들은 팁-기재 접촉 시간의 제곱근과 선형적인 크기를 나타낸다. 잉크의 확산 특징과 작은 크기의 전달 팁으로 인해 생기는, 이러한 폴리머 펜 리소그래피의 특성은, 피처를 고도로 정확하고 재현가능한 방식으로 미크론 미만으로 패턴화할 수 있다(피처 크기의 편차는 동일한 실험 조건에서 10% 미만임). 폴리머 펜 리소그래피의 압력 의존성은 피라미드형의 엘라스토머 어레이의 압축 성질로 인한 것이다. 실제, 매우 작은, 바람직하게는 피라미드형의 팁들은, 수직 방향(Z-압전)으로 압전을 단순히 신장시켜 제어할 수 있는, 인가된 압력의 연속적인 수준 증가에 따라 변형되도록 제작될 수 있다. 이러한 변형은 (결과적으로 "지붕" 붕괴를 초래하여 피처 크기의 해상도를 제한할 수 있어) 접촉 인쇄의 주된 문제점으로 간주되어 왔지만, 폴리머 펜 리소그래피를 이용하면, 제어된 변형을 조정가능한 변수로서 사용할 수 있어, 팁-기재 접촉 면적과 그에 따라 생성되는 피처의 크기 제어가 가능해진다. 약 5 내지 약 25 ㎛의 z-압전 신장에 의해 허용되는 압력 범위 내에서, 1초의 고정된 접촉 시간에서, 압전 신장과 피처 크기 간의 거의 선형적인 관계를 관찰할 수 있다. 흥미롭게도, 이면(backing) 엘라스토머 층 상에 팁 어레이를 채용하는 PPL 어레이에 대한 구현예의 경우에, 최초 접촉 지점과 최대 상대 신장(relative extension) 0.5 ㎛에서, 도트들의 크기들은 유의하게 상이하지 않고 이들 모두 약 500 nm(특정 경우)이었는데, 이는 모든 피라미드를 연결하고 있는 상기 이면 엘라스토머 층이 피라미드형 팁들이 변형되기 전에 변형됨을 나타낸다. 이러한 타입의 완충 작용은, 팁을 변형시키지 않으면서 팁들 전부를 표면과 접촉시키고, 의도한 피처 크기를 유의하게 변화시킴에 있어, 추가적인 허용성(tolerance)을 제공하므로, 수평화에 뜻밖에도 도움이 된다. z-압전이 1 ㎛ 이상으로 신장되는 경우, 팁은 유의하고 제어가능하게 변형된다.
폴리머 펜 리소그래피의 압력 의존성으로 인해, 큰 피처들을 생성시키기 위해 시간이 많이 소요되는 메니스커스-매개(meniscus mediated) 잉크 확산 공정을 취하지 않아도 된다. 실제, 단순히 팁의 변형 정도를 조정함으로써, 단지 하나의 인쇄 사이클(printing cycle)로 나노미터 내지 마이크로미터 크기의 피처를 만들 수 있다. 개념 검증 과정(proof-of-concept)으로서, 일렬로 정렬된 각 정방형이 상이한 팁-기재 압력이지만 일정한 1초의 팁-기재 접촉 시간 하에 단일 인쇄 사이클로 작성되는, 6 x 6의 금 정방형 어레이를, 폴리머 펜 리소그래피와 후속적인 습식 화학 식각에 의해 제작하였고, 제작된 최대 및 최소 크기의 금 정방형은 각각 모서리에서 각각 4 ㎛ 및 600 nm이었다. 이 실험은 폴리머 펜 리소그래피 실험으로 수득가능한 피처의 크기 범위를 규정하기 위한 것이 아니라, 그보다는 고정된 팁-기재 접촉 시간(이 경우, 1초) 동안에, 폴리머 펜 리소그래피에 의해 만들어 낼 수 있는 다양한 크기들에 대한 한가지 예임을 유념하여야 한다.
폴리머 펜 리소그래피는, 종래 기술의 접촉 인쇄와는 달리, 피처 크기, 간격 및 형태에 대한 동적 제어와 더불어 분자-기반 및 고상 피처들의 조합적인 패턴화가 가능하다. 이는 폴리머 펜을 사용하여 제조하고자 하는 구조물의 도트 패턴을 형성시킴으로써 달성된다. PDMS 폴리머는 패턴화하는 동안에 잉크의 저장조로서 역할을 하기 때문에, PDMS 폴리머 팁 어레이는 펜 어레이에 여러번 잉크를 다시 묻히는 작업이 불필요하다. 여러가지 크기 범위의 패턴을 이렇듯 비교적 효율적으로 작업하는 생산성은, 전자 빔 리소그래피(EBL) 또는 DPN과 같은 다른 리소그래피 기법에서는, 불가능하지 않다면, 어려울 것이다.
폴리머 펜 리소그래피의 비차폐 특성(maskless nature)으로 인해, 작업을 지연시키는(throughput-impeded) 연속 공정을 통해 새로운 마스터를 설계해야 하는 번거러움 없이, 다양한 타입의 구조물을 임의로 제조 가능하다. 또한, 폴리머 펜 리소그래피는 폐회로 스캐너(closed-loop scanner)의 레지스트레이션 성능과 100 nm 미만의 해상도로 사용될 수 있다.
팁 어레이
본원에 기술된 리소그래피 방법은 엘라스토머 폴리머 재료로 만들어진 팁 어레이를 사용한다. 팁 어레이는 비-캔틸레버형(non-cantilevered)이며, 필요에 따라 임의의 형태 또는 팁 간 임의 간격을 가지도록 설계될 수 있는 팁들을 구비하고 있다. 각 팁의 형태는 어레이의 다른 팁과 동일하거나 상이할 수 있다. 고려되는 팁의 형태는 회전 타원체(spheroid), 반구 회전 타원체(hemispheroid), 환상면체(toroid), 다면체(polyhedron), 원추형, 원통형 및 피라미드형(삼각형 또는 정사각형)을 포함한다. 팁은 예를 들어 약 500 nm 미만의 미크론 미만의 패턴들을 형성하기에 적절하도록, 뾰족하다. 팁의 날카로움은 그것의 곡률 반경으로 정해지며, 본원에서 바람직한 팁의 곡률 반경은 1 ㎛ 미만이며, 예컨대 약 0.9 ㎛ 미만, 약 0.8 ㎛ 미만, 약 0.7 ㎛ 미만, 약 0.6 ㎛ 미만, 약 0.5 ㎛ 미만, 약 0.4 ㎛ 미만, 약 0.3 ㎛ 미만, 약 0.2 ㎛ 미만, 약 0.1 ㎛ 미만, 약 90 nm 미만, 약 80 nm 미만, 약 70 nm 미만, 약 60 nm 미만, 또는 약 50 nm 미만일 수 있다.
팁 어레이는 포토리소그래피 방법을 사용하여 만들어진 몰드로부터 만들 수 있으며, 상기 몰드는 본원에 기술된 폴리머를 이용하여 팁 어레이의 제작에 사용된다. 몰드는 임의의 바람직한 방식으로 배열된 많은 수의 팁을 포함하도록 제작할 수 있다. 팁 어레이의 팁의 갯수는 임의의 바람직한 수일 수 있으며, 고려되는 팁의 갯수는 약 1000개 내지 약 1500만개, 또는 그 이상일 수 있다. 팁 어레이의 팁의 갯수는, 약 1백만개 이상, 약 2백만개 이상, 약 3백만개 이상, 약 4백만개 이상, 약 5백만개 이상, 약 6백만개 이상, 약 7백만개 이상, 약 8백만개 이상, 약 9백만개 이상, 약 1000만개 이상, 약 1100만개 이상, 약 1200만개 이상, 약 1300만개 이상, 약 1400만개 이상, 또는 1500만개 이상일 수 있다.
팁 어레이의 팁은 임의의 원하는 두께를 가지도록 설계할 수 있으며, 통상적으로는, 팁 어레이의 두께(팁의 정점에서 팁의 기부(base)까지 측정)는 약 50 nm - 약 1 ㎛, 약 50 nm - 약 500 nm, 약 50 nm - 약 400 nm, 약 50 nm - 약 300 nm, 약 50 nm - 약 200 nm, 또는 약 50 nm - 약 100 nm이다.
폴리머는 리소그래피 방법에 사용가능한 압축성을 가진 임의의 폴리머일 수 있다. 팁 어레이에 사용하기 적합한 폴리머 재료는 선형 또는 측쇄형 골격을 가질 수 있으며, 개개 폴리머와 팁에 요구되는 압축성 정도에 따라 가교되거나 또는 가교되지 않을 수 있다. 가교제는 폴리머 분자들 간에 2개 이상의 공유 결합을 형성할 수 있는 다관능성 단량체를 지칭한다. 가교제의 비제한적인 예로는 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(TMPTMA), 디비닐벤젠, 디에폭시, 트리에폭시, 테트라에폭시, 디비닐에테르, 트리비닐에테르, 테트라비닐에테르 및 이들의 조합이 있다.
열가소성 또는 열경화성 폴리머가 가교된 엘라스토머로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 폴리머는 다공성 및/또는 비정질일 수 있다. 일반적인 실리콘 폴리머 및 에폭시 폴리머 종류의 폴리머를 포함하여, 다양한 엘라스토머 폴리머 재료가 고려된다. 예를 들어, 25℃ 미만, 또는 더 바람직하게는 -50℃ 미만 등의 낮은 유리 전이 온도를 가진 폴리머가 사용될 수 있다. 방향족 아민, 트리아진 및 환상 지방족 골격에 기초한 화합물에 추가하여, 비스페놀 A의 디글리시딜 에테르가 사용될 수 있다. 또 다른 예로 노볼락(Novolac) 폴리머를 포함한다. 그 외 고려되는 엘라스토머 폴리머로는 메틸클로로실란, 에틸클로로실란 및 페닐클로로실란, 폴리디메틸실록산(PDMS)이 있다. 그 외 재료로는 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리부타디엔, 폴리우레탄, 폴리이소프렌, 폴리아크릴 고무, 플루오로실리콘 고무 및 플루오로엘라스토머가 있다.
팁의 형성에 사용될 수 있는 적절한 폴리머에 대한 추가적인 예들은, 미국 특허 제5,776,748호; 미국특허 제6,596,346호; 및 미국특허 제6,500,549호에서 확인할 수 있으며, 이들 특허들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 그 외 적절한 폴리머로는 He 등의 Langmuir 2003, 19, 6982-6986; Donzel 등의 Adv. Mater. 2001, 13, 1164-1167; 및 Martin 등의 Langmuir, 1998, 14-15, 3791-3795에 개시된 것들을 포함한다. 폴리디메틸실록산과 같은 소수성 폴리머는, 예를 들어 강력한 산화제 용액이나 산소 플라즈마에 노출시켜, 화학적으로 또는 물리적으로 개질시킬 수 있다.
팁 어레이의 폴리머는, 잉크를 묻히거나(inking) 인쇄하는 동안, 폴리머의 붕괴를 방지하기 위해, 적절한 압축 모듈러스 및 표면 경도를 가지지만, 너무 높은 모듈러스 및 너무 큰 표면 경도는 인쇄 중에 기재 표면에 적합하지 않고 만족스럽지 않을 수 있는 약한 소재가 되게 할 수 있다. Schmid 등의 Macromolecules, 33:3042 (2000)에 개시된 바와 같이, 비닐 및 히드로실란 프리폴리머는 모듈러스 및 표면 경도가 다양한 폴리머를 제공하도록 맞춤 제작될 수 있다. 따라서, 일부의 경우, 폴리머는 비닐 및 히드로실란 프리폴리머의 혼합물이며, 이 때 비닐 프리폴리머 대 히드로실란 가교제의 중량비는 최소 약 5:1, 약 7:1 또는 8:1, 바람직하게는 최대 약 20:1, 15:1 또는 12:1이고, 예컨대 약 5:1 내지 약 20:1 또는 약 7:1 내지 약 15:1, 또는 약 8:1 내지 약 12:1의 범위이다.
팁 어레이의 폴리머는, (Schmid 등의 Macromolecules, 33:3042 (2000) 제 3044면에 기재된 바와 같이) 유리 표면의 저항과 비교하여, 직경 1 mm의 강체구(hard sphere)에 의해 표면의 침투 저항을 측정하였을 때, 유리의 약 0.2% 내지 약 3.5%의 표면 경도를 가지는 것이 바람직하다. 표면 경도는 약 0.3% 내지 약 3.3%, 약 0.4% 내지 약 3.2%, 약 0.5% 내지 약 3.0%, 또는 약 0.7% 내지 약 2.7%의 범위일 수 있다. 팁 어레이의 폴리머는 약 10 MPa 내지 약 300 MPa의 압축 모듈러스를 가질 수 있다. 바람직하게는, 팁 어레이는 약 10 MPa 내지 약 300 MPa의 압력 하에서 후크 탄성(Hookean)인 압축성 폴리머를 포함할 수 있다. 팁 어레이에 적용되는 압력과 피처 크기 사이의 선형적인 관계로, 본 발명의 방법과 팁 어레이를 사용하여 인쇄된 인디시아를 제어할 수 있다(도 2C 참조).
팁 어레이는 자체가 잉크 조성물의 조장소로서 기능하도록, 잉크 조성물에 대하여 흡착 및/또는 흡수 특성을 가지는 폴리머를 포함할 수 있다. 예를 들어, PDMS는 패턴화 잉크를 흡수하는 것으로 알려져 있다. 예로, 미국특허 공개번호 2004/228962, Zhang 등의 Nano Lett. 4, 1649 (2004), 및 Wang 등의 Langmuir 19, 8951 (2003)을 참조한다.
팁 어레이는, 공통 기재에 고정되어 있고 본원에 개시된 폴리머 등의 적합한 폴리머로 만들어진, 복수개의 팁을 포함할 수 있다. 팁은 무작위로 또는 규칙적이고 주기적인 패턴으로 (예로, 행렬 방식, 원형 패턴 등으로) 배열될 수 있다. 팁은 모두가 동일한 형태를 가질 수 있으며, 또는 상이한 형태로 구성될 수 있다. 공통 기재는 엘라스토머 층을 포함할 수 있으며, 이 층은 팁 어레이의 팁을 형성하고 있는 것과 동일한 폴리머를 포함하거나, 또는 팁 어레이와는 다른 엘라스토머 폴리머를 포함할 수 있다. 엘라스토머 층은 약 50 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 팁 어레이는 강성 지지체(예, 유리 슬라이드와 같은 유리)에 부착 또는 접착될 수 있다. 다양한 경우에서, 공통 기재, 팁 어레이 및/또는 강성 지지체는, 존재한다면, 반투명하거나 투명하다. 특정 경우에, 이들 각각은 반투명하거나 투명하다. 팁 어레이와 공통 기재의 조합체의 두께는 200 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 150 ㎛ 미만, 또는 더 바람직하게는 약 100 ㎛ 이상일 수 있다. 엘라스토머 층 공통 기재에 부착된 팁의 정렬의 예를 도 4에 나타낸다.
잉크웰
잉크웰은 본원에 개시된 방법에서 팁 어레이에 잉크를 묻히는데 사용한다. 이 잉크웰 어레이는 팁 어레이의 각 팁에 대해 대응되는 웰 갯수, 형태 및 배치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 잉크웰 어레이는 팁 어레이의 제조에 사용되는 몰드를 용도 변경한 것이다. 이러한 구현예에서, 그래서, 잉크웰의 웰들의 크기와 웰-간 간격은, 팁 어레이의 팁들과 실질적으로 또는 완벽하게 일치(alignment)된다. 이러한 실질적인 또는 완벽한 일치는, 잉크를 묻히는 한번의 단계에서, 잉크들 간의 또는 잘못된 팁 세트로의 누화(cross talk) 및/또는 교차 오염이 거의 없거나 없이, 팁을 선택된 잉크에 묻히는 과정을 완벽하게 제어할 수 있다.
표준 포토리소그래피 기법을 사용하여, 선정된 갯수의 팁을 선택된 배열로 가지고 있는 몰드를 식각할 수 있다. 팁 어레이는 몰드로부터 폴리머를 주조함으로써 만들 수 있다. 몰드로부터 팁 어레이를 형성시킨 다음, 몰드는 팁 어레이에 대한 잉크웰 어레이로 사용할 수 있다. 잉크웰 어레이의 웰들은, 팁 어레이에서 일부 팁에는 한가지의 잉크가 묻히고, 그외 팁들에는 다른 잉크가 묻히도록, 다양한 잉크들로 선택적으로 채워질 수 있다. 비제한적인 예로서, 잉크젯 프린터와 같이, 임의의 이용가능한 수단에 의해, 웰을 충전시킬 수 있다. 일부 경우에, 잉크젯 프린터는 전기유체역학 잉크젯 프린터이다. 또한, 예로, 미국 특허 7,326,439; 7,168,791; 6,997,539; 7,273,270; 및 7,434,912, 미국 특허 공개번호 2009/0133169를 참조한다.
다양한 구현예에서, 잉크웰 어레이 표면(예, 잉크와 접촉될 표면)은 불소화된 물질로 처리된다. 잉크웰 표면의 불소화는, 표면 소수성을 부여함으로써, 웰들 서로간 잉크의 교차 오염성을 줄일 수 있다. 소수성 표면은 잉크가 묻는 표면적을 축소시키고, 표면에서의 측방으로의 잉크 확산을 낮출 것이다. 일부 경우에, 잉크웰 표면은, 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데쿨트리클로로실란 등의 플루오로실란으로 처리된다. 다른 고려되는 불소화된 화합물로는 플루오로폴리머 및 하나 이상의 불소 그룹을 가지고 있는 실란(예, 하나 이상의 F 치환기, 바람직하게는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 F 치환기를 가지고 있는, 클로로실란, 메틸실란, 메톡시실란, 및 에톡시실란)이 있다. 그 예로는, 비스(트리플루오로프로필)테트라메틸디실록산 및 (헥타데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로데실)트리에톡시실란이 있다.
도 1C는, 잉크웰 어레이와 상보적인 구조(complimentary geometry)를 가지고 있는, 정렬되어 있고, 잉크가 묻어 있는, 폴리머 펜 어레이를 보여준다. 잉크는 피라미드형 펜의 상단부에 선택적으로 어드레싱(addressing)된다. 중요한 점은, z-압전에 의해 제공되는 정확한 제어로, 폴리머 펜 어레이의 이면층(backing layer)과 웰 사이의 잉크웰 어레이의 뱅크(bank) 간에 접촉이 방지된다는 것이다. 따라서, 잉크를 묻히는 과정 중에, 이웃한 펜들 간의 (물리적인 접촉 또는 모세관 력으로) 잉크의 교차-오염은, 잉크웰 어레이의 뱅크에 잉크가 다량 존재하더라도, 방지된다. "직접 작성" 방식으로 다중 단백질 어레이를 제조하기 위해, 이러한 폴리머 펜 어레이를 쉽게 사용할 수 있다. 개념의 입증 과정으로서, 어레이의 각 펜을 사용하여, 도트 사이의 간격이 4 ㎛인 5 x 5 단백질 도트 어레이를 만들 수 있다(도 1D). 또한, PPL의 한번에 위에서 아래로 쓰는 속성 때문에, 누화(crosstalk)가 발견되지 않았다.
피처의 크기는, 팁-기재 접촉 시간과 접촉력 둘다를 변경시켜, 100 nm 미만 내지 수 미크론으로 조절할 수 있다. 팁이 기재에 처음 접촉되었을 때, 65 nm의 피처는 접촉 시간 0.01초에 제조되었다(도 2A 및 B). 피처의 크기는 팁-기재 접촉 시간의 함수로서 증가한다(도 3). PPL의 고유한 부가적인 특징은, 팁-기재 접촉력을 변경시킴으로써 실현되는 피처의 크기 조절이다. 도 2C는, 고정된 팁-기재 접촉 시간(10초)에서의, z-압전 신장의 함수로서 패턴화된 단백질의 피처의 크기를 보여준다. (최초 접촉을 기준으로) 처음 500 nm 신장시, 단백질 피처들의 크기는 857 ± 40 nm이다. z-압전의 추가적인 신장시 피처 크기는 준-선형으로 증가한다. 예컨대, 13.32 ± 0.32 ㎛의 도트들은, 현재의 펜 어레이 배치에서 12 ㎛ z-압전 신장시, 만들어졌다. 다른 리소그래피 방법과 비교하여, 이러한 속성으로 인해, 단지 몇 초안에 대면적에 광학적 스크리닝 목적에 맞는 미크론(미만) 크기의 바이오분자(예, 단백질)를 유일하게 만들 수 있다.
중요하게도, PPL에 의해 패턴화된 바이오분자 구조물들은 자신의 생물학적 활성을 유지하고 있다. 개념의 입증 과정으로서, 팁-기재 접촉 시간과 접촉력을 증가시키면서, Codelink 슬라이드 상에 PPL에 의해, 5 x 5 PSA 어레이를 패턴화하였다. 이 단백질 칩을, 100 nM의 Alex Fluor 488 - 항-PSA 접합체가 포함된 PBS(pH = 7.4) 용액에 1시간 동안 침지한 다음, 헹구고, 건조 후, 형광 현미경으로 촬영함으로써, 이에 대응되는 항체로 표지하였다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, 항-PSA 항체는 PSA 영역에만 선택적으로 결합하고 백그라운드에서는 검출할수 없었는데, 이는 PSA가 폴리머 펜 리소그래피 전공정에서도 최소한 항-PSA 결합에 필요한 수준으로 본래의 생활성을 유지하고 있음을, 의미한다. 피처의 크기는 접촉력 증가에 따라 1.1 ㎛에서 3.2 ㎛로 커졌다. 흥미롭게도, 형광 강도는 팁-기재 접촉 시간의 증가에 따라 높아지는데, 이는 필시 보다 짧은 접촉 시간에는 PSA 밀도가 보다 낮게 전달되기 때문이다.
잉크 조성물
본원의 방법에 사용하기 적합한 잉크 조성물은 동질적인(homogeneous) 조성물과 이질적인(heterogeneous) 조성물 둘다를 포함하며, 이질적인 조성물은 2종 이상의 구성 성분을 포함하는 조성물을 지칭하며, 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오분자를 포함한다. 잉크 조성물은 팁 어레이 상에 코팅된다. 본원에서, 용어 "코팅"은 팁 어레이의 코팅과, 팁 어레이에 의한 잉크 조성물의 흡착 및 흡수 모두를 지칭한다. 팁 어레이를 잉크 조성물로 코팅할 경우, 잉크 조성물은 팁 어레이를 사용하여 기재 표면 상에 패턴화될 수 있다.
잉크 조성물은 액체, 고체, 반-고체 등일 수 있다. 사용하기 적합한 잉크 조성물은 분자 용액, 폴리머 용액, 페이스트, 겔, 크림, 글루(glue), 수지, 에폭시, 접착제, 금속 필름, 미립자, 땜납(solder), 식각제 및 이들의 조합을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다.
잉크 조성물은 단층 형성종(monolayer-forming species), 박막 형성종, 오일, 콜로이드, 금속, 금속 복합체, 금속 산화물, 세라믹, 유기종 (예, 저분자, 폴리머, 폴리머 전구체, 단백질, 항체 등과 같이 탄소-탄소 결합을 포함하는 모이어티), 폴리머 (예, 비생물학적 폴리머 및, 단일 및 이중가닥의 DNA, RNA 등과 같은, 생물학적 폴리머), 폴리머 전구체, 덴드리머, 나노입자, 및 이들의 조합과 같은, 물질을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 잉크 조성물의 한가지 이상의 구성 성분은, 예컨대, 화학적 결합의 형성에 의해, 이온성 상호작용에 의해, 반데르발스 상호작용에 의해, 정전기적 상호작용에 의해, 자기력에 의해, 접착에 의해, 및 이들의 조합에 의해, 기재와 조합(association)시키기에 적합한 작용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 잉크 조성물은 그 점도를 제어하도록 조제(formulation)될 수 있다. 잉크의 점도를 제어할 수 있는 파라미터로는, 용매 조성, 용매 농도, 증점제 조성, 증점제 농도, 구성 성분의 입자 크기, 폴리머 성분의 분자량, 폴리머 성분의 가교도, 성분의 자유 부피(즉, 다공도), 성분의 유체역학 반경, 성분의 팽윤성, 잉크 성분들 간의 이온성 상호 작용 (예, 용매-증점제 상호작용) 및 이들의 조합이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 잉크 조성물은 용매, 증점제, 이온성 화학종 (예, 양이온, 음이온, 양성 이온 등)과 같은 첨가제를 포함하며, 선택과 농도는, 잉크 조성물의 점도, 유전 상수, 전도도, 긴장성(tonicity), 밀도 등 중에 하나 이상을 조정하기 위해 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 잉크 조성물은 이의 확산 또는 증착 속도를 제어하도록 조제될 수 있다. 2종 이상의 잉크를 병렬 방식으로 기재 표면 상에 증착시키는 구현예에서, 확산 또는 증착 속도는, 기재 상의 각 위치에 증착되는 물질의 양의 표준화를 제어하는데 도움이 될 수 있다. 예컨대, 확산 또는 증착 속도를 조정하기 위해, 바이오분자에 대한 잉크 조성물내 첨가제의 양을 조정한다. 일부 경우에, 첨가제 대 바이오분자의 양은, 패턴화된 바이오분자의 확산 또는 증착 속도를 표준화하기 위해, 패턴화하는 바이오분자와 병행하여 패턴화하는 기타 바이오분자에 따라, 약 1:1 - 약 50:1, 약 1:1 - 약 40:1, 약 1:1 - 약 30:1, 약 1:1 - 약 250:1, 약 1:1 - 약 20:1, 약 1:1 - 약 15:1, 약 1:1 - 약 10:1 또는 약 1:1 - 약 5:1의 범위이다. 예로, WO 08/157550를 참조한다.
각 잉크 조성물은 자체 확산 속도를 가지고 있어, 복수의 잉크들을 동시에 패턴화하고 또한 팁-기재 접촉 시간 및/또는 접촉 압력을 통해 피처 크기를 제어함에 있어 문제가 될 수 있다. 잉크 확산 속도는 선택된 여러가지 잉크 재료에 따라 다르다. 예컨대, 도 5A는, 도트 크기와, DPN 리소그래피 기법들을 이용하여 패턴화한, 선택된 잉크 물질들의 팁-기재 접촉 시간 간의 상관 관계를 나타낸 그래프로서, 각 그래프의 기울기는 해당 잉크의 확산 상수이다. 순수한 IgG의 확산 속도는 거의 30.81로 높을 수 있지만, 항-유비퀴틴에 대해 측정된 최대 확산 속도는 11.30에 불과하다(도 5A 참조). 따라서, 동일한 팁-기재 접촉 시간(4초)에서의 확산 속도 차이 때문에, 생성되는 도트의 크기는, β-갈락토시다제는 439.0 nm이고, BSA는 144.7 nm이다. 바이오분자의 잉크 조성물의 확산 속도에 대해, 다양한 농도의 첨가제를 첨가한, 단순한 시행 착오 과정을 통해, 첨가제 대 바이오분자를 특정 비율로 포함하는 제2 잉크 조성물과 비슷한 확산 또는 증착 속도를 가지는, 첨가제 대 바이오분자를 적절한 비율로 포함하는 제1 잉크 조성물을 획득할 수 있다. 예로, IgG 및 β-갈락토시다제의 잉크 확산 속도는 각각 1:5 및 1:7.5의 바이오분자/PEG 비율에서, 매우 근접해지게 동조될 수 있음을 보여주는 차트를 도 5B에 나타낸다.
일부 구체적인 구현예에서, 잉크 조성물은 첨가제로서 글리세롤을 포함할 수 있다. 잉크 조성물내 글리세롤의 존재는 폴리머 펜 어레이의 팁 상에서의 잉크의 유동성(mobility)을 증가시키거나 및/또는 잉크 조성물의 확산 또는 증착 속도를 표준화하는데 일조할 수 있다. 글리세롤은, 임의의 적정 농도로, 예컨대 잉크 조성물의 약 0.1 중량% 이상, 약 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상 또는 약 2 중량% 이상, 및/또는 최대 약 0.1 중량%, 약 25 중량%, 약 15 중량% 또는 약 10 중량%로, 예컨대 잉크 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 50 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 25 중량%, 약 1 중량% 내지 약 15 중량%, 또는 약 2 중량% 내지 약 10 중량%의 범위로, 잉크에 존재될 수 있다.
적합한 증점제로는, 카르복시알킬셀룰로오스 유도체 (예, 소듐카르복시메틸셀룰로오스)의 금속염, 알킬셀룰로오스 유도체 (예, 메틸셀룰로오스 및 에틸셀룰로오스), 부분적으로 산화된 알킬셀룰로오스 유도체 (예, 히드록시 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스), 스타치, 폴리아크릴아미드 겔, 폴리-N-비닐피롤리돈의 호모폴리머, 폴리(알킬 에테르) (예, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리프로필렌 옥사이드), 한천, 아가로스(agarose), 잔탄검, 젤라틴, 덴드리머, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드(colloidal silicon dioxide), 지질 (예, 지방, 오일, 스테로이드, 왁스, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 아라키돈산과 같은 지방산의 글리세리드, 포스포콜린으로부터와 같은 지질 이중층) 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 증점제는 잉크 조성물의 약 0.5 중량% 이상, 약 1 중량% 이상 또는 약 5 중량% 이상, 및/또는 최대 약 25 중량%, 최대 약 20 중량% 또는 최대 약 15 중량%의 농도로, 예컨대, 잉크 조성물의 약 0.5 중량% 내지 약 25 중량%, 약 1 중량% 내지 약 20 중량% 또는 약 5 중량% 내지 약 15 중량%의 농도로 존재한다.
잉크 조성물에 적합한 용매로는, 물, C1-C8 알코올 (예, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), C6-C12 직쇄형, 분지형 및 고리형 탄화수소 (예, 헥산 및 시클로헥산), C6-C14 아릴 및 아랄킬 탄화수소 (예, 벤젠, 자일렌 및 톨루엔), C3-C10 알킬 케톤 (예, 아세톤, 메틸 에틸 케톤), C3-C10 에스테르 (예, 에틸아세테이트), C4-C10 알킬 에테르(예, 디에틸 에테르) 및 이들의 조합이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 용매는 잉크 조성물의 약 1 중량% 이상, 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 25 중량% 이상, 50 중량% 이상 또는 75 중량% 이상, 및/또는 최대 약 99 중량%, 최대 약 95 중량%, 최대 약 90 중량%, 최대 약 75 중량%, 최대 약 50 중량% 또는 최대 약 25 중량%의 농도로, 예컨대, 잉크 조성물의 약 1 중량% - 약 99 중량%, 약 5 중량% - 약 95 중량%, 약 10 중량% - 약 90 중량%, 약 15 중량% - 약 95 중량%, 약 25 중량% - 약 95 중량%, 약 50 중량% - 약 95 중량%, 또는 약 75 중량% - 약 95 중량%로 존재한다.
잉크 조성물은 식각제를 포함할 수 있다. 본원에서, "식각제"는 표면과 반응하여 표면의 일부를 제거할 수 있는 성분을 지칭한다. 따라서, 식각제는, 표면과 반응하여 표면으로부터 제거될 수 있는 휘발성 및/또는 가용성 물질, 또는 예를 들어 헹굼 또는 세정 방법에 의해 기재로부터 제거될 수 있는 잔류물, 또는 미립자, 또는 단편 중 적어도 하나를 생성시킴으로써, 차감된 피처(subtractive feature)을 형성하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 식각제는 잉크 조성물의 약 0.5 중량% 이상, 약 1 중량% 이상 또는 약 2 중량% 이상, 및/또는 잉크 조성물의 최대 약 95 중량%, 최대 약 90 중량%, 최대 약 85 중량% 또는 최대 약 10 중량%로 존재하거나, 예컨대, 잉크 조성물의 약 0.5 중량% - 약 95 중량%, 약 1 중량% - 약 90 중량%, 약 2 중량% - 약 85 중량%, 약 0.5 중량% - 약 10 중량%, 또는 약 1 중량% - 약 10 중량%로 존재한다.
본원의 방법에 사용하기 적합한 식각제로는 산성 식각제, 염기성 식각제, 불화물계 식각제, 및 이들의 조합을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명과 함께 사용하기에 적절한 산성 식각제로는 황산, 트리플루오로메탄설폰산, 플루오로설폰산, 트리플루오로아세트산, 불화수소산, 염화수소산, 카르보란산(carborane acid) 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명과 함께 사용하기에 적절한 염기성 식각제로는 소듐 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 암모늄 히드록시드, 테트라알킬암모늄 히드록시드 암모니아, 에탄올아민, 에틸렌디아민, 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명과 함께 사용하기에 적절한 불화물계 식각제로는 암모늄 플루오라이드, 리튬 플루오라이드, 소듐 플루오라이드, 포타슘 플루오라이드, 루비듐 플루오라이드, 세슘 플루오라이드, 프란슘 플루오라이드, 안티몬 플루오라이드, 칼슘 플루오라이드, 암모늄 테트라플루오로보레이트, 포타슘테트라플루오로보레이트 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 잉크 조성물은 반응성 성분을 포함한다. 본원에서, "반응성 성분"은 기재와 화학적 상호 작용을 가지는 화합물 또는 화학종을 지칭한다. 일부 구현예에서, 잉크 내의 반응성 성분은 기재 내로 침투되거나 확산된다. 일부 구현예에서, 반응성 성분은 기재 표면 상에 노출된 작용기를 변형시키거나 이와 결합하거나 또는 결합을 촉진시킨다. 반응성 성분은 이온, 자유 라디칼, 금속, 산, 염기, 금속염, 유기 시약 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되진 않는다. 반응성 성분은, 비제한적인 예로서, 티올, 히드록시드, 아민, 실란올, 실록산 등과 같은 단층-형성 화학종, 및 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다른 단층-형성 화학종을 더 포함한다. 반응성 성분은 잉크 조성물의 약 0.001 중량% 이상, 약 0.01 중량% 이상, 약 0.1 중량% 이상, 및/또는 최대 약 95 중량%, 최대 약 50 중량%, 최대 약 25 중량% 또는 최대 약 5 중량%의 농도로 존재할 수 있으며, 예컨대, 잉크 조성물의, 약 0.001 중량% - 약 95 중량%, 약 0.001 중량% - 약 50 중량%, 약 0.001 중량% - 약 25 중량%, 약 0.001 중량% - 약 10 중량%, 약 0.001 중량% - 약 5 중량%, 약 0.001 중량% - 약 2 중량%, 약 0.001 중량% - 약 1 중량%, 약 0.001 중량% - 약 0.5 중량%, 약 0.001 중량% - 약 0.05 중량%, 약 0.01 중량% - 약 10 중량%, 약 0.01 중량% - 약 5 중량%, 약 0.01 중량% - 약 2 중량%, 약 0.01 중량% - 약 1 중량%, 약 10 중량% - 약 100 중량%, 약 50 중량% - 약 99 중량%, 약 70 중량% - 약 95 중량%, 약 80 중량% - 약 99 중량%, 약 0.001 중량%, 약 0.005 중량%, 약 0.01 중량%, 약 0.1 중량%, 약 0.5 중량%, 약 1 중량%, 약 2 중량%, 또는 약 5 중량%의 농도로 존재할 수 있다.
잉크 조성물은 도전성 및/또는 반도전성(semi-conductive) 성분을 더 포함할 수 있다. 본원에서 "도전성 성분"은 전하를 전이 또는 이동시킬 수 있는 화합물 또는 화학종을 지칭한다. 도전성 및 반도전성 성분으로는 금속, 나노입자, 폴리머, 크림 땜납, 수지, 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 도전성 성분은 잉크 조성물의 약 1 중량% 이상, 약 5 중량% 이상 또는 약 50 중량% 이상, 및/또는 잉크 조성물의 최대 약 99 중량%, 최대 약 95 중량%, 최대 약 90 중량%, 최대 약 50 중량% 또는 최대 약 5 중량%의 농도로 존재하며, 예컨대 약 1 중량% - 약 99 중량%, 약 1 중량% - 약 10 중량%, 약 5 중량% - 약 99 중량%, 약 25 중량% - 약 99 중량%, 약 50 중량% - 약 99 중량%, 약 75 중량% - 약 99 중량%, 약 2 중량%, 약 5 중량%, 약 90 중량%, 또는 약 95 중량%로 존재한다.
잉크 조성물에 사용하기 적합한 금속으로는 전이 금속, 알루미늄, 실리콘, 포스포러스, 갈륨, 게르마늄, 인듐, 주석, 안티몬, 납, 비스무스, 이들의 합금 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 잉크 조성물은 반도전성 폴리머를 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기 적합한 반도전성 폴리머로는 폴리아닐린, 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)-폴리(스티렌설포네이트), 폴리피롤, 아릴렌비닐렌 폴리머, 폴리페닐렌비닐렌, 폴리아세틸렌, 폴리티오펜, 폴리이미다졸 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
잉크 조성물은 절연 성분을 포함할 수 있다. 본원에서 "절연 성분"은 전하의 전이 또는 이동에 저항하는 화합물 또는 화학종을 지칭한다. 일부 구현예에서, 절연 성분은 약 1.5 - 약 8, 약 1.7 - 약 5, 약 1.8 - 약 4, 약 1.9 - 약 3, 약 2 - 약 2.7, 약 2.1 - 약 2.5, 약 8 - 약 90, 약 15 - 약 85, 약 20 - 약 80, 약 25 - 약 75, 또는 약 30 - 약 70의 유전 상수를 가진다. 본원의 방법에 사용하기 적합한 절연 성분으로는, 폴리머, 금속 산화물, 금속 탄화물, 금속 질화물, 이들의 단량체성 전구체, 이들의 입자, 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 적절한 폴리머로는, 폴리디메틸실록산, 실세스퀴옥산(silsesquioxan), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이미드, 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 절연 성분은 잉크 조성물의 약 1 중량% 이상, 약 5 중량% 이상 또는 약 50 중량% 이상, 및/또는 최대 약 99 중량%, 최대 약 95 중량%, 최대 약 90%, 최대 약 50 중량%, 또는 최대 약 5 중량%의 농도로 존재하며, 예컨대, 잉크 조성물의 약 1% - 약 95 중량%, 약 1 중량% - 약 80 중량%, 약 1 중량% - 약 50 중량%, 약 1 중량% - 약 20 중량%, 약 1 중량% - 약 10 중량%, 약 20 중량% - 약 95 중량%, 약 20 중량% - 약 90 중량%, 약 40 중량% - 약 80 중량%, 약 1 중량%, 약 5 중량%, 약 10 중량%, 약 90 중량%, 또는 95 중량%의 농도로 존재한다.
잉크 조성물은 마스킹(masking) 성분을 포함할 수 있다. 본원에서, "마스킹 성분"은 반응시 주변 표면과 반응할 수 있는 화학종에 저항하는 표면 피처를 형성하는 화합물 또는 화학종을 지칭한다. 본 발명과 함께 사용하기 적합한 마스킹 성분은 전통적인 포토리소그래피법에서 "레지스트"로서 통상적으로 채택되는 물질 (예, 포토레지스트, 화학적 레지스트, 자기 조립형 단층 등)을 포함한다. 본원의 방법에 사용하기 적합한 마스킹 성분으로는, 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 폴리(에피클로로히드린-co-에틸렌옥사이드), 폴리스티렌, 폴리(스티렌-co-부타디엔), 폴리(4-비닐피리딘-co-스티렌), 아민말단 폴리(스티렌-co-부타디엔), 폴리(아크릴로니트릴-co-부타디엔), 스티렌-부타디엔-스티렌 블록 코폴리머, 스티렌-에틸렌-부틸렌 블록 선형 코폴리머, 폴리스티렌-블록-폴리(에틸렌-ran-부틸렌)-블록-폴리스티렌, 폴리(스티렌-co-말레산무수물), 폴리스티렌-블록-폴리(에틸렌-ran-부틸렌)-블록-폴리스티렌-그라프트-말레산무수물, 폴리스티렌-블록-폴리이소프렌-블록-폴리스티렌, 폴리스티렌-블록-폴리(에틸렌-ran-부틸렌)-블록-폴리스티렌, 폴리노르보넨, 디카르복시 말단 폴리(아크릴로니트릴-co-부타디엔-co-아크릴산), 디카르복시말단 폴리(아크릴로니트릴-co-부타디엔), 폴리에틸렌이민, 폴리(카보네이트 우레탄), 폴리(아크릴로니트릴-co-부타디엔-co-스티렌), 폴리(비닐클로라이드), 폴리(아크릴산), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리(메틸메타크릴레이트-co-메타크릴산), 폴리이소프렌, 폴리(1,4-부틸렌 테레프탈레이트), 폴리프로필렌, 폴리(비닐알코올), 폴리(1,4-페닐렌설파이드), 폴리리모넨(polylimonene), 폴리(비닐알코올-co-에틸렌), 폴리[N,N'-(1,3-페닐렌)이소프탈아마이드], 폴리(1,4-페닐렌에테르-에테르-설폰), 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리[부틸렌 테레프탈레이트-co-폴리(알킬렌글리콜)테레프탈레이트], 폴리(에틸렌글리콜) 디아크릴레이트, 폴리(4-비닐피리딘), 폴리(DL-락티드), 폴리(3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실 이무수물-co-4,4'-옥시디아닐린/1,3-페닐렌디아민), 아가로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 호모폴리머, 스티렌-부타디엔 코폴리머, 페놀 수지, 케톤 수지, 4,5-디플루오로-2,2-비스(트리플루오로메틸)-1,3-디옥산, 이들의 염, 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 마스킹 성분은 잉크 조성물의 약 1 중량% 이상 또는 약 2 중량% 이상, 및/또는 잉크 조성물의 최대 약 10 중량%, 최대 약 5 중량% 또는 최대 약 2 중량%의 농도로 존재하며, 예컨대, 잉크 조성물의 약 1 중량% - 약 10 중량%, 약 1 중량% - 약 5 중량%, 또는 약 2 중량%의 범위로 존재한다.
잉크 조성물은 도전성 성분 및 반응성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응성 성분은, 표면으로의 도전성 성분의 침투, 도전성 성분과 표면 간의 반응, 도전성 형상 및 표면 사이의 접착, 도전성 피처와 표면 사이의 전기 접촉의 촉진, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 촉진시킬 수 있다. 이러한 잉크 조성물을 반응시킴으로써 형성되는 표면 피처는, 부가 비침투성(additive non-penetrating), 부가 침투성(additive penetrating), 차감 침투성(subtractive penetrating), 및 등각 침투성(conformal penetrating) 표면 피처들로 이루어진 군으로부터 선택되는 도전성 피처를 포함한다.
예를 들어, 도전성 피처 삽입체(inset)를 내부에 가지는 차감형 표면 피처의 형성에 적합한 잉크 조성물은 식각제 및 도전성 성분을 포함할 수 있다.
잉크 조성물은 절연 성분과 반응성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응성 성분은 표면으로의 절연 성분의 침투, 절연 성분과 표면 간의 반응, 절연성 피처 및 표면 간의 접착, 절연성 피처와 표면 간의 전기적 접촉의 촉진, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 촉진시킬 수 있다. 이러한 잉크 조성물을 반응시킴으로써 형성되는 표면 피처는 부가 비침투성, 부가 침투성, 차감 침투성, 및 등각 침투성 표면 피처들로 이루어진 군으로부터 선택되는 절연성 피처를 포함한다.
예를 들어, 절연성 피처 삽입체를 내부에 가지는 차감형 표면 피처의 형성에 적합한 잉크 조성물은 식각제 및 절연 성분을 포함할 수 있다.
예를 들어, 표면 상에 전기적으로 전도성인 마스킹 피처의 형성에 적합한 잉크 조성물은 도전성 성분 및 마스킹 성분을 포함할 수 있다.
본원의 방법과 함께 사용하기 적절한 잉크 조성물에 있어 고려되는 다른 성분으로서, 티올, 1,9-노난디티올 용액, 실란, 실라잔, 알킨스(alkynes) 시스타민(cystamine), N-Fmoc 보호된 아미노티올, 바이오분자, DNA, 단백질, 항체, 콜라겐, 펩타이드, 비오틴 및 탄소 나노튜브를 포함한다.
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Chem., 10, 259 (2000) (SiO2에 대한 실라잔 부착); Dammel, Diazonaphthoquinone Based Resists (1st ed., SPIE Optical Engineering Press, Bellingham, Wash., 1993) (SiO2에 대한 실라잔 부착); Anwander 등의 J. Phys. Chem. B, 104, 3532 (2000) (SiO2에 대한 실라잔 부착); Slavov 등의 J. Phys. Chem., 104, 983 (2000) (SiO2에 대한 실라잔 부착)을 참조한다.
패턴화되는 기재
본원의 방법에서 사용하기 적합한 기재로는, 금속, 합금, 복합체, 결정성 물질, 비정질 물질, 도체, 반도체, 광학재료(optics), 섬유, 무기 재료, 유리, 세라믹 (예, 금속 산화물, 금속 질화물, 금속 규화물, 및 이들의 조합), 제올라이트, 폴리머, 플라스틱, 유기 재료, 미네랄, 생체 재료, 생체 조직(living tissue), 뼈, 이들의 필름, 이들의 박막, 이들의 라미네이트, 이들의 박편(foil), 이들의 복합체, 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 기재는, 비제한적인 예로서, 결정성 실리콘, 다결정성 실리콘, 비정질 실리콘, p-도핑된 실리콘, n-도핑된 실리콘, 실리콘 옥사이드, 실리콘 게르마늄, 게르마늄, 갈륨 비소, 갈륨 비소 인화물(gallium arsenide phosphide), 인듐 주석 산화물, 및 이들의 조합 등의 반도체를 포함할 수 있다. 기재는, 비제한적인 예로서, 도핑되지 않은 실리카 유리(SiO2), 불소화 실리카 유리, 보로실리케이트 유리, 보로포스포로실리케이트(borophosphorosilicate) 유리, 유기실리케이트 유리, 다공질 유기실리케이트 유리, 및 이들의 조합 등의 유리를 포함할 수 있다. 기재는, 열분해 탄소, 보강된 탄소-탄소 복합체, 카본-페놀성 수지 등과 이들의 조합과 같이 비-평면(non-planar) 기재일 수 있다. 기재는, 비제한적인 예로서, 실리콘 카바이드, 수소화 실리콘 카바이드, 실리콘 질화물, 실리콘 카보나이트리드(silicon carbonitride), 실리콘 옥시나이트리드, 실리콘 옥시카바이드, 고온 재사용가능한 단열재(high-temperature reusable surface insulation), 섬유상 내화물 복합체 절연체 타일, 강화된 단편 섬유상 절연체(toughened unipiece fibrous insulation), 저온 재사용가능한 단열재, 고급 재사용형 단열재(advanced reusable surface insulation) 및 이들의 조합과 같은, 세라믹을 포함할 수 있다. 기재는, 가요성 재료, 비제한적인 예로서, 플라스틱, 금속, 이들의 복합체, 이들의 라미네이트, 이들의 박막, 이들의 박편, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
팁 어레이의 수평화 및 기재 표면 상에 잉크 조성물의 증착
본원의 방법은 스캐닝 탐침 현미경에 기초한 리소그래피 방법 (예, 딥 펜 리소그래피)에 유사한, 인 시츄 이미지화(in situ imaging) 역량 뿐만 아니라, 미세-접촉 인쇄에 유사한 신속한 방식으로 형상을 패턴화하는 역량을 제공한다. 패턴화될 수 있는 형상은 크기가 100 nm 미만에서 1 mm 까지 또는 그 이상의 범위이며, 팁 어레이의 접촉 시간 및/또는 접촉 압력을 변경하여 제어할 수 있다. DPN과 마찬가지로, 기재 표면 상에 증착되는 (피처 크기에 의해 측정되는) 잉크 조성물의 양은 접촉시간과 비례하며, 구체적으로는 접촉 시간과 제곱근 상관 관계에 있다. DPN과는 달리, 팁 어레이의 접촉 압력을 이용하여, 기재 표면 상에 증착될 수 있는 잉크 조성물의 양을 다르게 할 수 있다. 접촉 압력은 압전 스캐너의 z-압전에 의해 제어할 수 있다. 팁 어레이에 더 강한 압력 (또는 힘)이 적용될수록, 피처 크기는 더 커진다. 따라서, 접촉 시간과 접촉 힘/압력의 임의의 조합은, 약 30 nm - 약 1 mm 또는 그 이상의 피처 크기를 형성하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 이처럼 다양한 범위의 크기의 형상을 밀리세컨드 안에 "직접 작성" 또는 인 시츄 방식으로 제조하는 능력 때문에, 기술된 리소그래피 방법은, 전자 장치 (예, 회로 패턴화) 및 바이오테크놀로지 (예, 생물학적 분석을 위한 표적의 배열) 등의 리소그래피 어플리케이션의 호스트(host)에 적응시킬 수 있다. 팁 어레이의 접촉 압력은 예로 약 10 MPa - 약 300 MPa일 수 있다.
본원의 바람직한 재료에 대한 약 0.01 - 약 0.1 g/㎠의 압력과 같이 매우 낮은 압력에서는, 형성되는 인디시아의 피처 크기는 접촉 압력과는 독립적이어서, 인디시아의 피처 크기의 변화 없이 기재 표면 상에 팁 어레이를 수평으로 할 수 있다. 이처럼 낮은 압력은 팁 어레이가 탑재되는 압전 스캐너의 z-압전의 0.5 ㎛ 이하의 신장에 의해 달성할 수 있으며, 0.01 g/㎠ - 약 0.1 g/㎠의 압력은 0.5 ㎛ 미만의 z-압전 신장에 의해 적용될 수 있다. 이러한 "완충" 압력 범위로, 팁을 압축시키지 않으면서 팁과 기재 표면의 최초 접촉을 달성하도록 팁 어레이 및/또는 기재를 조작할 수 있으며, 그런 다음, (팁의 내부 표면으로부터 나오는 광의 반사에서의 변화에 의해 관찰되는) 팁의 압축 정도를 이용하여 팁과 기재 표면 간의 균일한 접촉 수준을 달성할 수 있다. 팁 어레이의 팁들의 불균일한 접촉은 불균일한 인디시아로 이어질 수 있기 때문에, 이러한 수평화 능력은 중요한 사항이다. 팁 어레이의 팁의 많은 수(예, 1100만개)와 이의 작은 크기를 감안하면, 모든 팁들이 표면과 접촉했는지의 여부를 정확히 아는 것은, 실제적으로는 어렵거나 또는 불가능할 수 있다. 예를 들어, 팁 또는 기재 표면의 결함, 또는 기재 표면의 불규칙성은, 한개의 팁만 접촉되지 않고 다른 팁들은 모두 균일하게 접촉되는 결과를 초래할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 적어도 실질적으로 모든 팁이 기재 표면과 (예, 검출가능한 정도까지) 접촉할 수 있게 한다. 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 팁들이 기재 표면과 접촉되게 될 것이다. 예로, WO 09/132321을 참조한다.
투명하거나 적어도 반투명한 팁 어레이 및 공통 기재의 정렬을 사용하여, 팁 어레이의 최상부로부터 (즉, 팁의 기부 및 공통 기재의 이면에서) 기재 표면까지 향해지는 광의 반사에서의 변화를 관찰할 수 있다는 점은, 팁 어레이와 기재 표면을 서로에 대하여 수평화하는 것에 일조할 수 있다. 팁 어레이의 팁으로부터 반사된 광의 강도는 기재 표면과 접촉시 더욱 커진다 (예, 팁 어레이의 내부 표면은 접촉시 다르게 광을 반사한다). 각 팁에서의 광의 반사 변화를 관찰함으로써, 기재 표면에 팁 어레이의 모든 또는 실질적으로 모든 팁을 접촉시키도록 팁 어레이 및/또는 기재 표면을 조정할 수 있다. 따라서, 팁 어레이와 공통 기재는 반투명이거나 투명하여, 기재 표면과의 접촉시 팁의 광 반사에서의 변화를 감지할 수 있게 하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 팁 어레이가 적층되는 모든 강성 이면 재료도 적어도 투명 또는 반투명한 것이 바람직하다.
팁에 대한 접촉 시간은, 기재 표면 상의 임의의 특정 지점에서 요구되는 잉크 조성물의 양에 따라, 약 0.001초 - 60초일 수 있다. 접촉력은 압전 스캐너의 z-압전을 변화시키거나 또는 팁 어레이 전체에 대한 힘의 제어된 적용을 가능케 하는 다른 수단에 의해 제어될 수 있다.
기재 표면은 팁 어레이와 여러번 접촉시킬 수 있으며, 이 때 팁 어레이 및/또는 기재 표면은 기재 표면의 다른 부위에 접촉되도록 이동된다. 각각의 접촉 단계의 시간과 압력은 원하는 패턴에 따라 동일하거나 상이할 수 있다. 인디시아 또는 패턴의 형태는, 실제적인 제한이 없으며, 도트, 선(예, 개개 점으로 형성되었거나 연속적인 직선 또는 곡선), 미리 선택된 패턴 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법으로부터 수득되는 인디시아는, 고도의 동일성을 가지며, 따라서, 크기 면에서 그리고 바람직하게는 형태/밀도 측면에서 균일하거나 실질적으로 균일하다. 형상의 크기는, 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 도트 직경, 선폭, 가장 큰 점의 폭 또는 가장 작은 점의 폭으로 평가할 수 있다. 각 인디시아 형상의 크기 (예, 도트 직경 또는 선폭)는 매우 균일하여, 예를 들어 허용 오차는 약 5%, 또는 약 1% 또는 약 0.5% 이내이다. 허용 오차는 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%일 수 있다. 피처 크기 및/또는 형태의 불균일성은 서브-미크론 타입의 패턴화에 바람직하지 않을 수 있는 인디시아의 조도(roughness)를 초래할 수 있다.
피처 크기는 약 10 nm - 약 1 mm, 약 10 nm - 약 500 ㎛, 약 10 nm - 약 100 ㎛, 약 50 nm - 약 100 ㎛, 약 50 nm - 약 50 ㎛, 약 50 nm - 약 10 ㎛, 약 50 nm - 약 5 ㎛, 또는 약 50 nm - 약 1 ㎛일 수 있다. 피처 크기는 1 ㎛ 미만, 약 900 nm 미만, 약 800 nm 미만, 약 700 nm 미만, 약 600 nm 미만, 약 500 nm 미만, 약 400 nm 미만, 약 300 nm 미만, 약 200 nm 미만, 약 100 nm 미만, 또는 약 90 nm 미만일 수 있다.
본원의 방법을 이용하여 패턴화된 형상들은, 팁 어레이의 상이한 잉크가 묻은 팁들과 인디시아의 피처 크기의 이격(separation)에 의해 정해지는 수준으로, 기재 표면 상에 이격되어 있을 수 있다. 형상들은, 예컨대 500 ㎛ 미만, 400 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛, 또는 100 ㎛ 미만의 거리로 이격되어 있을 수 있다.
인디시아의 밀도는 개별 인디시아의 구역에 존재하는 바이오분자의 양(예, 농도)을 지칭한다. 각 인디시아의 밀도는 약 5%, 약 1% 또는 약 0.5%의 허용 오차내에 있을 수 있다. 허용 오차는 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%일 수 있다.
패턴화된 기재
또한, 본 발명은 예컨대 기재 표면 상에 패턴화된 2종 이상의 바이오분자를 가지고 있는 물품 등의, 개시된 기법들을 이용하여 제조될 수 있는, 패턴화되어진, 기재를 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 물품은 제1 바이오분자를 포함하는 인디시아와 제2 바이오분자를 포함하는 인디시아를 포함한다. 본 발명의 방법으로 인디시아의 배치를 제어할 수 있으며, 잘못된 팁에 여러가지 잉크의 교차 오염이 없거나 또는 실질적으로 없게 할 수 있기 때문에, 표면은, 인디시아가 소폭으로, 예컨대 750 ㎛ 미만, 500 ㎛ 미만, 400 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛ 미만 또는 100 ㎛ 미만으로 이격되도록, 여러가지 잉크로 인디시아를 패턴화할 수 있다. 여러가지 바이오분자들로 구성된 인디시아의 이러한 고밀도는, 예컨대 가능한 표적 호스트에서 대상 분자의 생활성을 평가하기 위해, 다양한 분석법에서 사용될 수 있는, 효율적인 분석 칩을 제공한다. 또한, 본 발명의 패턴화된 기재는, 바이오분자의 밀도가 동일하거나 또는 실질적으로 동일한, 여러가지 바이오분자로 구성된 인디시아가를 형성시킬 수 있다. 일부 경우에, 인디시아는 약 10 nm - 약 1 mm, 약 10 nm - 약 500 ㎛, 약 10 nm - 약 100 ㎛, 약 50 nm - 약 100 ㎛, 약 50 nm - 약 50 ㎛, 약 50 nm - 약 10 ㎛, 약 50 nm - 약 5 ㎛, or about 50 nm - 약 1 ㎛의 피처 크기를 가진다. 피처 크기는, 1 ㎛ 미만, 약 900 nm 미만, 약 800 nm 미만, 약 700 nm 미만, 약 600 nm 미만, 약 500 nm 미만, 약 400 nm 미만, 약 300 nm 미만, 약 200 nm 미만, 약 100 nm 또는 약 90 nm 미만일 수 있다.
실시예
재료. 500 nm의 열 증착된 SiO2의 Si 웨이퍼 <100>는 Silicon Quest International로부터 구입하였다. Codelink 슬라이드를 SurModics 사에서 구입하였다. Shipley1805 포토레지스트와 MF319 현상액(developing solution)은 MicroChem 사에서 구입하였다. 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로로실란은 Gelest 사에서 구입하였다. TRITC - 항-마우스 IgG 접합체, 소 혈청 알부민(BSA), 전립선 특이 항원(PSA) 단백질은 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였다. 항-PSA는 R & D Systems 사에서 구입하였다. Alexa Fluor 488와 647 단일클론 항체 표지 키트 및 항-콜레라 독소 β(항-CTb) 항체는 Invitrogen 사에서 구입하였다. 항체를 제조사의 설명서에 따라 Alexa Fluor 염료로 표지하였다. 10.119 g Na2HPO4 (Sigma-Aldrich)와 0.4487 g NaH2PO4 (Sigma-Aldrich)을 탈이온수 500 mL에 용해하여, 500 mL의 150 mM PBS (pH=8.0)를 제조하였다. HF 식각 용액은 Transene Company에서 구입하였다. 이소프로파놀과 아세톤은 Fisher에서 구입하였다.
항체의 표지. 항체를 실라이드에 결합시킨 후, 0.1% Tween 20이 첨가된 0.15 M PBS로 헹구었다. 그런 후, 표지된 항체를 0.025% Tween 20과 0.1% BSA가 첨가된 0.15 M PBS에 최종 농도 100 nM로 각각 희석하고, 항원이 결합된 표면과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 슬라이드를 0.15 M PBS 및 Tween 20 용액으로 헹군 다음, 물로 간단하게 헹구고, 스핀 건조하였다.
Si 잉크웰 및 Si 마스터의 제작. Shipley1805 (MicroChem, Inc.) 포토레지스트를, 500 nm 두께의 SiO2 상층을 가지고 있는 Si 웨이퍼 상에 스핀 코팅하였다. 정방형 웰 어레이를 크롬 마스크를 사용하여 포토리소그래피에 의해 제작하였다. 포토레지스트 패턴을 MF319 현상액으로 현상하고, 이어서 O2 플라즈마에 30초 동안 (200m Torr) 노출하여 잔류 유기층을 제거하였다. 그런 후, 기재를 HF 식각 용액에 6분간 두었다. 각각의 식각 단계 후에 표면을 정화하기 위해 MiliQ 물로 대량 헹굼이 필요하였다. 그런 후, 아세톤으로 포토레지스트를 세정 제거하여 SiO2 패턴을 노출시켰다. SiO2 패턴화된 기재를 75℃에서 약2.5시간 동안 KOH 식각 용액 (H2O:이소프로판올 (4:1 v/v) 중의 30% KOH)에 넣고, 격렬하게 교반하였다. Si 웨이퍼의 비코팅 영역은 비등방적으로 식각되어, 리세스형 피라미드(recessed pyramid)가 형성되었다. 남아있는 SiO2 층은 HF 식각 용액을 다시 사용하여 제거하였다. 마지막으로, 피라미드 잉크웰/마스터를 가스상 실란화(silanization)에 의해 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로로실란으로 개질하였다.
폴리머 펜 어레이의 제작: 경질 PDMS (h-PDMS)를 폴리머 펜 어레이 제작에 사용하였다. h-PDMS는 비닐-화합물이 다량 함유된 프리폴리머 (VDT-731, Gelest) 3.4 g 및 하이드로실란이 다량 함유된 가교제 (HMS-301) 1.0 g으로 이루어져있다. 폴리머의 제조에는, 일반적으로 비닐 분획에 대해 20 ppm w/w의 백금 촉매 (크실렌 내의 백금디비닐테트라메틸디실록산 복합체, SIP6831.1 Gelest) 및 혼합물에 대한 0.1% w/w의 조정제(modulator) (2,4,6,8-테트라메틸테트라비닐시클로테트라실록산, Fluka)의 첨가가 필요하였다. 혼합물을 교반하고, 탈기하고, 폴리머 펜 어레이 마스터의 최상부에서 부었다. 그런 다음, 미리 세정해 둔 유리 슬라이드를 엘라스토머 어레이의 최상부에 위치시키고, 전체 조립체를 70℃에서 하룻밤 동안 경화시켰다. 폴리머 펜 어레이를 피라미드 마스터로부터 조심스럽게 분리시킨 다음, 폴리머 펜 리소그래피 실험에 사용하였다.
폴리머 펜 어레이에 잉크 탑재(inking) 및 잉크가 탑재된 폴리머펜 어레이를 이용한 기재의 패턴 형성. 웰-간 간격과 크기가 폴리머 펜 어레이와 일치되는, Si 잉크웰 어레이에 먼저 단백질 잉크를 잉크젯 인쇄에 의해 충전하였다. 잉크 용액은 포스페이트 완충 염수(PBS, pH=8.0) 중의 단백질 분자 0.1 mg/mL와 5 wt%의 글리세롤로 구성되었다. 글리세롤 분자는 폴리머 펜으로의 잉크의 이동성을 높이기 위한 담체로서 제공됨을 유념하여야 한다. 피에조어레이(PerkinElmer, Waltham, MA) 잉크젯 프린터를, 선택적으로 어드레스를 지정하고, 각 웰에 주위 웰을 오염시키지 않으면서 대상 단백질 분자로 채우기 위해, 프라이밍(priming), 흡입(aspiration) 및 배분 사이클 프로그램을 입력하였다. 잉크웰 어레이의 각 웰에 단백질 잉크 액적 320 pL 2 방울을 충전하였다.
이후, 폴리머 펜 어레이에 30초간 산소 플라즈마를 처리하여, 단백질 분자의 비특이적인 부착을 최소화시키는 표면 친수성을 부여시켰다. 친수성 펜 어레이를 나노리소그래피 장치(NSCRIPTOR™(NanoInk, Skokie, IL) 또는 Park AFM platform XEP(Park Systems Co., Suwon, Korea))에 넣고, 펜 어레이의 팁들을 잉크웰 어레이의 웰들과 접촉시켜, 약 10분간 약 90% 습도(humidity)로 잉크웰에 담구었다. 폴리머 펜 어레이는 투명해서, 잉크웰 어레이에서 2D 펜 어레이를 쉽게 평준화, 정렬화 및 침지할 수 있으며, 잉크 탑재를 시각적으로 확인할 수 있다. 잉크가 묻은 폴리머 펜 어레이를 사용하여, 표면 상의 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르-말단의 관능기로 변형되어진 Codelink™ 슬라이드 상에 직접 작성하였다. 패턴화된 슬라이드를 4℃에서 밤새 인큐베이션하여, 단백질 상의 아민기가 NHS 에스테르와 반응될 수 있도록 하였다. 마지막으로, 슬라이드를 1시간 동안 소 혈청 알부민(BSA)로 부동태화한 다음, PBS 완충액으로 헹구고, 건조하였다.
패턴화된 기재를 이용한 분석. 팁-기재 접촉 시간과 접촉력을 증가시키면서, Codelink™ 슬라이드 상에 PPL에 의해, 5 x 5의 전립선 특이 항원 (PSA) 어레이에 패턴을 형성시켰다. 이 단백질 칩을, 100 nM Alex Fluor 488 - 항-PSA 접합체가 포함된 PBS (pH = 7.4) 용액에 1시간 동안 침지하고, 세정한 후 건조함으로써, 대응되는 항체로 표지하였고, 형광 현미경으로 이미지를 촬영하였다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, 항-PSA는 PSA 영역 상에 선택적으로 결합되어 있고, 백그라운드에서는 검출되지 않았는데, 이는, PSA가 폴리머 펜 리소그래피 공정을 통해서도 그것의 생활성을 유지시킴을 보여준다. 피처 크기는 접촉력 증가에 따라 1.1 ㎛에서 3.2 ㎛로 증가되었다. 흥미롭게도, 형광 강도는 팁-기질 접촉 시간 증가에 따라 증가하였는데, 이는 필시 보다 짧은 접촉 시간에는 증착되는 PSA 밀도가 더 낮기 때문이다.
이상은 본 발명을 설명하고 예시한 것이나, 후속하는 청구범위에 의해 한정되는 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니다. 본원에서 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시 내용의 관점에서 과도한 실험 없이 실시되고 수행될 수 있다. 본 발명의 물질과 방법은 특정 구현예의 측면에서 기술되었으나, 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 이탈되지 않으면서, 본원에 기재된 물질 및/또는 방법과 방법의 단계 또는 단계의 순서에 수정을 가할 수 있음은, 당해 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 물질들이 본원에 기술된 물질들을 동일하거나 또는 유사한 결과를 달성하면서 대체할 수 있음은 자명할 것이다.
본원에 인용된 모든 특허, 간행물 및 참조 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 완전히 통합된다. 본원의 내용과 통합된 특허, 간행물 및 참조 문헌들 사이에 충돌이 있는 경우, 본원의 내용이 우선된다.

Claims (48)

  1. 2종 이상의 바이오분자(biomolecule)를 동시에 기재(substrate) 표면에 인쇄하는 방법으로서,
    제1 바이오분자 및 제1 담체를 포함하는 제1 잉크를 포함하는 제1 복수개의 웰과 제2 바이오분자와 제2 담체를 포함하는 제2 잉크를 포함하는 제2 복수개의 웰을 구비한, 대응되는 잉크웰 어레이에, 팁 어레이의 제1 복수개의 팁을 상기 제1 복수개의 웰에 넣어 상기 제1 잉크로 코팅되고, 상기 칩 어레이의 제2 복수개의 팁을 상기 제2 복수개의 웰에 넣어 상기 제2 잉크로 코팅되도록, 팁 어레이를 침지함으로써, 상기 팁 어레이를 2종 이상의 잉크로 코팅하는 단계,
    상기 어레이의 코팅된 팁들 전부 또는 실질적으로 전부를 제1 접촉 시간 동안 제1 접촉 압력에서 기재 표면과 접촉시켜, 상기 제1 잉크를 상기 기재 표면 상의 제1 위치 세트에, 그리고 상기 제2 잉크를 상기 기재 표면 상의 제2 위치 세트에 증착시켜, 제1 인디시아(indicia) 세트와 제2 인디시아 세트를 모두 실질적으로 균일한 크기로 형성시키는 단계를 포함하며,
    상기 팁 어레이의 팁들은, 각각 1 ㎛ 미만의 곡률 반경을 가지며 압축성 엘라스토머(elastomeric) 폴리머를 포함하는, 비-캔틸레버형 팁(non-cantilevered tip)을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 잉크젯 프린터를 이용하여 상기 웰 안으로 잉크 액적들을 분사시킴으로써, 상기 제1 복수개의 웰에는 상기 제1 잉크를, 상기 제2 복수 웰에는 상기 제2 잉크를, 적어도 부분적으로 충전하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 잉크젯 프린터는 전기유체역학 잉크젯 프린터인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 인디시아 세트와 제2 인디시아 세트 모두 잉크 밀도가 실질적으로 균일한 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 잉크웰은 상기 팁 어레이의 팁들의 팁 정점 간격, 팁 구조 또는 이들 모두와 각각 부합되는, 웰-간 간격, 웰 구조 또는이들 모두를 가지는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 복수개의 팁 중 하나 이상의 팁 정점 및 상기 제2 복수개의 팁 중 하나 이상의 팁 정점은 상기 표면 상에 200 ㎛ 미만의 거리로 이격되어 있는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 인디시아 세트와 상기 제2 인디시아 세트는 상기 표면 상에 100 ㎛ 미만의 거리로 떨어져있는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 제1 바이오분자, 제2 바이오분자 또는 제1 바이오분자와 제2 바이오분자의 각각은, 항체, 항원, 단백질, 효소, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고당, 다당류 또는 이의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 제2 복수개의 팁을 오염시키지 않거나 또는 실질적으로 오염시키지 않으면서 상기 팁 어레이를 상기 제1 잉크로 코팅시키는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제2 잉크로 오염시키지 않거나 또는 실질적으로 오염시키지 않으면서 제1 인디시아 세트를 형성하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 잉크, 상기 제2 잉크 또는 각각의 상기 제1 잉크와 제2 잉크는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 잉크웰 어레이의 적어도 한면은 불소화된 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 불소화된 표면은 불소화된 실란을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 불소화된 실란은 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로르실란을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 인디시아 세트, 상기 제2 인디시아 세트 또는 이 둘다를 1 ㎛ 미만의 피처 크기(feature size)로 형성하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 바이오분자, 제2 바이오분자 또는 이 둘다가 표지물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표지물은 형광 표지물인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 형광 표지물은 플루오레세인 염료, 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥사논산, 5(및 6)-카르복시-X-로다민, 로다민 염료, 벤조페녹사진, Cyanine 2 (Cy2) 염료, Cyanine 3 (Cy3) 염료, Cyanine 3.5 (Cy3.5) 염료, Cyanine 5 (Cy5) 염료, Cyanine 5.5 (Cy5.5) 염료, Cyanine 7 (Cy7) 염료, Cyanine 9 (Cy9) 염료, 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 5(6)-카르복시-테트라메틸 로다민 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 바이오분자는 제1 표지물을 포함하고, 상기 제2 바이오분자는 상기 제1 표지물과는 다른 제2 표지물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, 각 팁은 곡률 반경이 약 0.2 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서, 상기 팁 어레이의 압축성 엘라스토머 폴리머는 약 10 MPa - 약 300 MPa 범위의 압축 모듈러스(compression modulus)를 가지는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서, 상기 압축성 엘라스토머 폴리머는 폴리디메틸실록산(PMDS)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PMDS는 트리메틸실록시 말단의 비닐메틸실록산-디메틸실록산 코폴리머, 메틸하이드로실록산-디메틸실록산 코폴리머 또는 이의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서, 상기 팁 어레이의 각 팁은 형태가 동일한 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 팁의 형태는 피라미드형인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 웰은 피라미드형인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 팁 어레이, 기재 표면 또는 이들 모두를 서로에 대해 이동시키는 단계, 및
    상기 제1 접촉 시간과 동일하거나 상이한 제2 접촉 시간 및 상기 제1 접촉 압력과 동일하거나 상이한 제2 접촉 압력에서, 상기 접촉 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한항에 있어서, 상기 접촉 단계 동안에는 도트를 포함하는 인디시아를 형성하기 위해 상기 팁 어레이와 상기 기재 간의 측방향 이동을 제한하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 약 10 nm 내지 약 500 ㎛의 범위의 직경을 가진 도트가 형성되도록, 접촉 시간, 접촉 압력 또는 이 둘다를 조절하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서, 상기 팁 어레이의 각 팁들을 상기 기재 표면에 동시에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 팁 어레이는 제3 바이오분자와 제3 담체를 포함하는 제3 잉크를 포함하는 제3의 복수개 웰을 더 포함하며,
    상기 침지 단계 동안에 제3 복수개의 팁을 코팅하는 단계, 및 상기 접촉 단계 동안에 상기 기재 표면 상에 상기 제3 바이오분자를 인쇄하여, 제3 위치 세트에 제3 인디시아 세트를 형성하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 제3 인디시아 세트 전체는 상기 제1 및 제2 인디시아 세트와 실질적으로 균일한 크기인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제3 인디시아 세트 전체는 상기 제1 또는 제2 인디시아 세트와 실질적으로 균일한 바이오분자 밀도를 가지는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제3 인디시아 세트 전체는 상기 제1 및 제2 인디시아 세트와 실질적으로 균일한 바이오분자 밀도를 가지는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 방법은,
    팁 어레이에 입사광을 역광 조사(backlighting)하여, 팁의 내부 표면으로부터 입사광의 내부 반사를 유발시키는 단계;
    상기 팁 어레이의 팁과 기재 표면을, 상기 팁들의 일부와 상기 기재 표면 간의 접촉 지점까지 z-축에 따라 접근시키며, 이때 접촉은 상기 기재 표면과 접촉된 일부 팁들로부터 반사되는 광의 강도 증가에 의해 표시되며, 다른 팁들에서 반사되는 광의 강도의 무변화는 비접촉 팁인 것으로 표시되는 단계;
    상기 팁 어레이와 상기 기재 표면 중 한가지 또는 이들 모두를, 상기 팁들의 내부 표면으로부터 반사된 광의 강도 차이에 따라 서로에 대하여 틸팅(tilting)하여, 상기 기재 표면과 비-접촉 팁 간의 접촉을 달성시키는 단계에 의해,
    상기 팁 어레이의 팁들을 상기 기재 표면에 대해 수평화(leveling)하는 단계를 더 포함하며,
    상기 틸팅은 1회 이상 x축, y축 및/또는 z축에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 방법은,
    팁 어레이에 입사광을 역광 조사(backlighting)하여, 팁의 내부 표면으로부터 입사광의 내부 반사를 유발시키는 단계;
    상기 팁 어레이의 팁들과 기재 표면을 서로 접촉되도록 z-축을 따라 접근시키는 단계;
    상기 팁 어레이와 상기 기재 중 하나 또는 이들 모두를 z-축에 따라 서로를 향해 더욱 이동시켜, 상기 팁들 중 일부를 압축시키고, 이때 상기 팁으로부터 반사되는 광의 강도는 상기 기재 표면에 대한 상기 팁들의 압축 수준에 대한 함수로서 증가되는 단계; 및
    상기 팁 어레이와 상기 기재 표면 중 한가지 또는 이들 모두를, 상기 팁들의 내부 표면으로부터 반사된 광의 강도 차이에 따라 서로에 대하여 틸팅(tilting)하여, 상기 기재 표면과 비-접촉 팁 간의 실질적으로 균일한 접촉을 달성시키는 단계에 의해,
    상기 팁 어레이의 팁들을 상기 기재 표면에 대해 수평화하는 단계를 더 포함하며,
    상기 틸팅은 1회 이상 x축, y축 및/또는 z축에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 방법은,
    랜드(land)에 의해 이격된 기재 내 리세스(recess)의 어레이를 포함하는 마스터를 형성하는 단계;
    프리폴리머 및 선택적으로 가교제를 포함하는 프리폴리머 혼합물로 상기 리세스를 충전하고 상기 랜드를 덮는 단계;
    상기 프리폴리머 혼합물을 경화시켜, 팁 어레이와 공통 기재를 포함하는 폴리머 구조를 형성하는 단계;
    상기 마스터로부터 경화된 폴리머 구조물을 분리하는 단계; 및
    상기 팁 어레이에 대한 잉크웰 어레이로서 사용하기 위해, 상기 마스터의 리세스에 하나 이상의 잉크를 적어도 일부 충전하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 방법은,
    리세스와 랜드를 가지고 있는 몰드를 제작하는 단계;
    상기 몰드로부터 팁 어레이를 형성하는 단계;
    상기 형성된 팁 어레이를 상기 몰드에서 분리시키는 단계;
    상기 몰드의 리세스에 하나 이상의 잉크를 적어도 일부 충전하여, 잉크웰 어레이를 제조하는 단계; 및
    상기 팁 어레이를 상기 잉크웰 어레이에 침지하여, 팁 어레이를 상기 잉크로 코팅하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 리세스와 랜드를 포함하는 마스터를 적어도 일부 표면에 불소화된 기질로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 마스터에 프리폴리머 혼합물을 충전하기 전에 상기 처리 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 마스터에 프리폴리머 혼합물을 충전한 후에 상기 처리 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한항에 있어서, 상기 불소화된 기질은 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실트리클로르실란인 것을 특징으로 하는, 2종 이상의 바이오분자를 동시에 기재 표면에 인쇄하는 방법.
  42. 기재;
    상기 기재 표면 상의 제1 바이오분자를 포함하는 제1 인디시아 세트 및 상기 기재 표면 상의 제2 바이오분자를 포함하는 제2 인디시아 세트를 포함하며,
    상기 제1 및 제2 인디시아 세트 모두 실질적으로 크기가 균일하며,
    상기 제1 인디시아 세트의 하나의 인디시움과 제2 인디시아 세트의 하나의 인디시움이 상기 표면 상에 200 ㎛ 미만의 거리로 이격되어 있는,
    물품(article).
  43. 제42항에 있어서, 상기 제1 인디시아 세트와 제2 인디시아 세트는 모두 밀도가 실질적으로 균일한 것을 특징으로 하는 물품.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 제1 인디시아 세트의 하나의 인디시움과 제2 인디시아 세트의 하나의 인디시움이 상기 표면 상에 100 ㎛ 미만의 간격으로 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 물품.
  45. 제42항 내지 제45항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 인디시아 세트와 제2 인디시아 세트는 전부 100 ㎛ 미만의 피처 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 물품.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 바이오분자, 제2 바이오분자 또는, 각각의 제1 바이오분자 및 제2 바이오분자는 항체, 항원, 단백질, 효소, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고당, 다당류 또는 이의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 기재 표면 상에 제3 바이오분자를 포함하는 제3 인디시아 세트를 추가로 포함하며,
    상기 제3 인디시아 세트 전체는 제1 인디시아 세트 전체는 실질적으로 크기가 균일한 것을 특징으로 하는 물품.
  48. 제47항에 있어서, 상기 제3 인디시아 세트 전체와 제1 인디시아 세트 전체는 실질적으로 밀도가 균일한 것을 특징으로 하는 물품.
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