KR20120005280A

KR20120005280A - Hyaluronic acid derivative, hyaluronic acid-peptide conjugate, and preparing the same

Info

Publication number: KR20120005280A
Application number: KR1020100065941A
Authority: KR
Inventors: 한세광; 오은주; 공지현
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2012-01-16
Also published as: KR101220946B1

Abstract

PURPOSE: A hyaluronic acid derivative, a hyaluronic acid-peptide conjugate, and producing method thereof are provided to apply the hyaluronic acid derivative to a water soluble active component for the human body. CONSTITUTION: A hyaluronic acid-peptide conjugate contains a hyaluronic acid derivative and water soluble peptide with a thiol-terminal, and is marked with chemical formula 1. In the chemical formula 1, n is an integer selected from 50-10,000. The hyaluronic acid-peptide conjugate is obtained by producing the hyaluronic acid derivative with a vinylsulfone group marked with chemical formula 2 or 3, and reacting the vinylsulfone group with the water soluble peptide with the thiol-terminal in an aqueous solution.

Description

히알루론산 유도체, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 및 이의 제조방법{HYALURONIC ACID DERIVATIVE, HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE, AND PREPARING THE SAME}HYALURONIC ACID DERIVATIVE, HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE, AND PREPARING THE SAME}

본 발명은 펩타이드 의약품의 약물 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 다양한 펩타이드 등의 활성 성분 및 이를 이용한 다양한 펩타이드 의약품의 약물 전달 시스템에 적용 가능하고, 생체적합성, 생분해성 전달체와 컨쥬게이션을 하여, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며, 또한 생접합 효율이 높고, 약효 시간을 증대할 수 있는 히알루론산 유도체, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a drug carrier of a peptide medicine and a method for preparing the same. More specifically, it can be applied to active ingredients such as various peptides and drug delivery systems of various peptide medicines using the same, and can be safely applied to the human body by conjugating with biocompatible and biodegradable carriers, and also bioconjugation efficiency The present invention relates to a hyaluronic acid derivative, a hyaluronic acid-peptide conjugate, and a method for preparing the same, which are high and can increase the medicinal time.

펩타이드 의약품의 장기 약효 지속 제형에 관한 연구는 최근까지 생체 적합한 생분해성 고분자와의 컨쥬게이션 반응을 통한 제형 개발에 포커스가 맞추어 지고 있다. 상기와 같은 펩타이드 의약품의 약효 지속 시간은 제형의 형태 및 컨쥬게이션 되는 활성 성분에 따라 몇 주까지 연장되기도 한다. 이와 같은 제형을 개발하기 위해서는 제형의 약효 지속 시간의 증대 및 활성 성분에 컨쥬게이션 되는 고분자의 생체적합성 여부도 고려해야 한다.Research into long-term sustained-release formulations of peptide drugs has been focused on developing formulations through conjugation reactions with biocompatible biodegradable polymers until recently. The duration of drug efficacy of such peptide drugs may be extended up to several weeks depending on the form of the formulation and the active ingredient being conjugated. In order to develop such a formulation, it is also necessary to consider the increase in the duration of drug efficacy and the biocompatibility of the polymer conjugated to the active ingredient.

따라서, 최근에는 생체적합한 생분해성 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 또는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)과 활성 성분을 컨쥬게이션하여 약물 전달 시스템에 응용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.Therefore, recently, studies are being actively conducted to conjugate biocompatible biodegradable polyethylene glycol (PEG) or hyaluronic acid (HA) with an active ingredient to apply them to drug delivery systems.

하지만, 활성 성분에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 컨쥬게이션하는 반응, 즉 소위 말하는 페길화(PEGylation) 반응에 사용되는 PEG는 FDA에서 공인한 대표적인 생체용 고분자 재료 중의 하나이지만, 약물전달체로 활용되는 폴리에틸렌 글리콜-리포솜(PEG-Liposome) 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 'accelerated blood clearance(가속된 혈중 청소율, ABC)' 현상이 일어나는 것으로 보고되고 있다.However, PEG, which is used for the conjugation of polyethylene glycol (PEG) to the active ingredient, that is, the so-called PEGylation reaction, is one of the representative biopolymer materials approved by the FDA, but is used as a drug carrier. Repeated injections of the PEG-Liposome conjugate have been reported to result in accelerated blood clearance (ABC), which leads to rapid loss of the administered drug in the body.

한편, 히알루론산을 활성 성분에 컨쥬게이션하여 사용하는 기술의 경우, 이들 컨쥬게이트 반응의 생접합 효율이 낮아 한계가 있다.On the other hand, in the case of a technique in which hyaluronic acid is conjugated to an active ingredient and used, there is a limitation in that the bioconjugation efficiency of these conjugate reactions is low.

이에 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 생접합 효율이 높고 수용성 펩타이드 등의 수용성 활성 성분에 적용 가능한 히알루론산 유도체, 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, the present invention has been made to solve the problems of the prior art as described above, and provides a hyaluronic acid derivative, a hyaluronic acid-peptide conjugate and a method for preparing the same, having high bioconjugation efficiency and being applicable to water-soluble active ingredients such as water-soluble peptides. It aims to do it.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1을 갖는 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 유도체와 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드가 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a hyaluronic acid (HA) derivative having the formula (1) and a hyaluronic acid-peptide conjugate to which a water-soluble peptide having a terminal thiol group is combined.

상기 화학식 1에서,In Chemical Formula 1,

n은 50 내지 10,000의 정수이고,n is an integer from 50 to 10,000,

R1 및 R2는 각각 독립적으로 -OH,

또는 이다.R1 and R2 are each independently -OH,

or to be.

또한, 본 발명은 비닐술폰기를 갖는 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조하고,In addition, the present invention to prepare a hyaluronic acid derivative of formula (2) or formula (3) having a vinyl sulfone group,

상기 제조된 히알루론산 유도체의 비닐술폰기에 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드를 수용액에서 반응시키는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing a hyaluronic acid-peptide conjugate comprising the step of reacting a water-soluble peptide having a terminal thiol group in a vinyl sulfone group of the prepared hyaluronic acid derivative in an aqueous solution.

상기 화학식 2 및 화학식 3에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.In Chemical Formulas 2 and 3, n is an integer of 50 to 10,000.

또한 본 발명은 하기 화학식 2를 갖는 히알루론산 유도체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a hyaluronic acid derivative having the formula (2).

[화학식 2][Formula 2]

상기 화학식 2에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.In Formula 2, n is an integer of 50 to 10,000.

이하, 본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 및 이의 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the hyaluronic acid-peptide conjugate and its preparation method according to an embodiment of the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 화학식 1을 갖는 히알루론산 유도체 및 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드가 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트가 제공된다.According to one embodiment of the present invention, a hyaluronic acid-peptide conjugate having a hyaluronic acid derivative having Formula 1 and a water-soluble peptide having a terminal thiol group is provided.

본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 활성 성분인 상기 펩타이드에 생체적합성, 생분해성 고분자인 히알루론산을 컨쥬게이션하여, 인체에 안전하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 생접합 효율이 높아, 수용성 펩타이드 등을 포함한 수용성 활성 성분의 약물 전달 시스템에 관한 산업분야에 널리 적용할 수 있다.Hyaluronic acid-peptide conjugate according to an embodiment of the present invention is conjugated to the peptide as the active ingredient, biocompatible, biodegradable polymer hyaluronic acid, not only safely applicable to the human body, but also high bioconjugation efficiency It is widely applicable to the industrial field of drug delivery system of water soluble active ingredient including water soluble peptide.

바람직하게는 상기 히알루론산 유도체는 상기 화학식 2 또는 화학식 3을 갖는 화합물인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트가 될 수 있다.Preferably, the hyaluronic acid derivative may be a hyaluronic acid-peptide conjugate which is a compound having Formula 2 or Formula 3.

상기 화학식 2를 갖는 화합물은 신규한 히알루론산 유도체로서, 본 발명자의실험 결과 상기 화합물의 비닐술폰기와 수용성 펩타이드의 티올기간의 반응을 통해 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 생접합 효율을 90% 이상으로 현저히 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 약효시간도 현저히 증대시킬 수 있음이 밝혀졌다.The compound having Formula 2 is a novel hyaluronic acid derivative. As a result of the experiments of the present inventors, the hyaluronic acid-peptide conjugate bound through the reaction of the thiol period of the vinyl sulfone group and the water-soluble peptide of the compound has a bioconjugation efficiency of 90% or more. It was found that not only can be significantly improved, but also the drug time can be significantly increased.

상기 화학식 2를 갖는 히알루론산 유도체를 제조하는 방법은 제한되지 않으나, 바람직하게는 히알루론산의 카르복실기에 시스테아민 화합물을 반응시킨 후 디비닐술폰(Divinyl sulfone, DVS)을 추가로 반응시켜 제조된 것일 수 있다.The method for preparing the hyaluronic acid derivative having the above formula (2) is not limited, but preferably one prepared by reacting the cysteamine compound with a carboxyl group of hyaluronic acid and then further reacting with divinyl sulfone (DVS). Can be.

상기 시스테아민 화합물은 시스테아민, 다양한 시스테아민 염, 및 체내에서 대사되어 시스테아민을 생성할 수 있는 시스테아민 전구체를 비롯하여 시스테아민 유사체, 시스테아민의 유도체, 시스테아민의 접합체 및 시스테아민의 대사 산물을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 시스테아민 화합물은 시스테아민 하이드로클로라이드, 시스테아민 포스페이트, 판토텐산, 시스타민 또는 시스타민 디하이드로클로라이드이며, 더욱 바람직하게는 시스테아민, 시스테아민 하이드로클로라이드, 시스타민 또는 시스타민 디하이드로클로라이드이다. The cysteamine compounds include cysteamine, various cysteamine salts, and cysteamine analogues that can be metabolized in the body to produce cysteamine, including cysteamine analogues, derivatives of cysteamine, conjugates of cysteamine, and Includes all metabolites of cysteamine. Preferably the cysteamine compound is cysteamine hydrochloride, cysteamine phosphate, pantothenic acid, cystamine or cystamine dihydrochloride, more preferably cysteamine, cysteamine hydrochloride, cystamine or cis Tamine dihydrochloride.

바람직하게는 상기 화학식 2를 갖는 화합물은 하기 반응식 1a 내지 1c에 따라 제조될 수 있다.Preferably, the compound having Formula 2 may be prepared according to the following Schemes 1a to 1c.

[반응식 1a]Scheme 1a

[반응식 1b]Scheme 1b

[반응식 1c]Scheme 1c

상기 반응식 1a 및 반응식 1b에 따른 반응은 바람직하게는 수용액에서 이루어질 수 있으며, 상세하게는 히알루론산 또는 히알루론산의 염의 카르복실기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt)로 활성화시킨 후 시스타민 디하이드로클로라이드(Cystamine dihydrochloride)와 반응시켜 히알루론산-시스타민(HA-Cystamine) 결합체를 형성하고 상기 히알루론산-시스타민 결합체에 트리스(2-카르복시에틸)포스파인(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)를 추가로 첨가하여 반응시켜 티올기를 갖는 히알루론산 유도체(HA-SH)를 형성하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 제조된 티올기를 갖는 히알루론산 유도체(HA-SH)는 추가로 디비닐술폰과 수용액에서 반응시킴으로써 상기 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있다.The reaction according to Schemes 1a and 1b may preferably be carried out in an aqueous solution. Specifically, the carboxyl group of hyaluronic acid or a salt of hyaluronic acid may be 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (1- Activated with Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 1-Hydroxybenzotriazole (HOBt) and reacted with cystamine dihydrochloride to react with hyaluronic acid-citamine ( To form a HA-Cystamine conjugate and further react by adding tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) to the hyaluronic acid-citamine conjugate to react with a hyaluronic acid derivative having a thiol group ( HA-SH) can be formed. The hyaluronic acid derivative (HA-SH) having the thiol group prepared above may further prepare the compound of Formula 2 by reacting with divinyl sulfone in an aqueous solution.

또한 바람직하게는 상기 화학식 2를 갖는 화합물은 하기 화학식 4를 갖는 화합물의 카르복실기와 하기 화학식 5를 갖는 화합물의 아민기를 유기용매에서 반응시켜 제조할 수 있다.Also preferably, the compound having Formula 2 may be prepared by reacting a carboxyl group of a compound having Formula 4 with an amine group of a compound having Formula 5 in an organic solvent.

상기 화학식 4에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.In Formula 4, n is an integer of 50 to 10,000.

상기 화학식 2를 갖는 화합물은 바람직하게는 하기 반응식 2에 따라 히알루론산, 또는 히알루론산의 염과 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시켜 상기 화학식 4의 HA-TBA를 형성하고, 이와 별도로 시스테아민 화합물을 디비닐술폰과 유기용매 존재 하에 반응시켜 상기 화학식 5의 비닐술폰-시스테아민 결합체(vinyl sulfone cysteamine, VSC)를 형성하여 상기 HA-TBA와 상기 비닐술폰-시스테아민 결합체를 유기용매 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.The compound having Formula 2 is preferably reacted with a salt of hyaluronic acid or a hyaluronic acid and tetra-n-butyl ammonium hydroxide (TBA-OH) according to Scheme 2 below. Forming HA-TBA of Formula 4, and separately from the cysteamine compound in the presence of an organic solvent and divinyl sulfone to form a vinyl sulfone cysteamine (VSC) of the formula (5) It can be prepared by the step of reacting the HA-TBA and the vinyl sulfone-cysteamine conjugate in the presence of an organic solvent.

또한 바람직하게는 히알루론산 한 구성단위(unit)에 대한 상기 비닐술폰-시스테아민 결합체의 몰비를 조절하여 비닐기 치환율을 조절할 수 있으며, 비닐기 치환율을 높임으로써 혈청 안정성 및 약효 시간을 더욱 증대시킬 수 있다. In addition, it is preferable to control the vinyl group substitution rate by adjusting the molar ratio of the vinyl sulfone-cysteamine conjugate to one unit of hyaluronic acid, and further increase serum stability and drug efficacy time by increasing the vinyl group substitution rate. Can be.

[반응식 2]Scheme 2

바람직하게는 상기 화학식 4의 HA-TBA의 형성은 양이온 교환수지를 이용하여 수행할 수 있다. Preferably, the formation of HA-TBA of Chemical Formula 4 may be performed using a cation exchange resin.

상세하게는, 양이온 교환수지에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide)를 반응시키는 단계, 및 히알루론산, 또는 히알루론산의 염을 추가로 첨가하여 반응하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.Specifically, the step of reacting the tetra-n-butyl ammonium hydroxide to the cation exchange resin, and the addition of a hyaluronic acid or a salt of hyaluronic acid to the reaction It can be made, including.

이 때, 상기 양이온 교환수지는 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드와 반응하여, TBA-OH의 양이온을 교환할 수 있는 것이면, 어떠한 것이든 무방하나 바람직하게는 상기 양이온 교환수지는 Dowex® 50WX2-200, Dowex® 50WX4-400, Dowex® 50WX2-100, Dowex® 50WX2-400, Dowex® 50WX8-100, Dowex® 50WX8-200, 및 Dowex® 50WX8-400로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기와 같은 양이온 교환수지를 HA-TBA 형성에 사용하는 경우, HA의 카르복실기에 있던 Na+ 이온을 TBA 이온으로 교환하여 HA-Na를 HA-TBA로 변환시킬 수 있는 점에서 유리하다.In this case, the cation exchange resin may react with tetra-n-butyl ammonium hydroxide to exchange cations of TBA-OH, but any one may be preferred. The cation exchange resin is preferably Dowex® 50WX2. One or more selected from the group consisting of -200, Dowex® 50WX4-400, Dowex® 50WX2-100, Dowex® 50WX2-400, Dowex® 50WX8-100, Dowex® 50WX8-200, and Dowex® 50WX8-400 have. When such a cation exchange resin is used to form HA-TBA, it is advantageous in that HA + Na can be converted to HA-TBA by exchanging Na + ions in the carboxyl group of HA with TBA ions.

상기 화학식 5의 비닐술폰-시스테아민 결합체(VSC)의 형성에 사용되는 시스테아민 화합물로는 바람직하게는 시스테아민 하이드로클로라이드(Cysteamine hydrochloride)를 사용할 수 있다.As the cysteamine compound used to form the vinyl sulfone-cysteamine conjugate (VSC) of Chemical Formula 5, cysteamine hydrochloride may be preferably used.

또한 상기 유기 용매는 상기 화학식 4의 HA-TBA 및 상기 화학식 5의 비닐술폰-시스테아민 결합체를 용해시킬 수 있는 것이면, 어떠한 것이든 무방하나 바람직하게는, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.In addition, the organic solvent may be any one as long as it can dissolve HA-TBA of Formula 4 and vinylsulfone-cysteamine conjugate of Formula 5, and preferably, dimethyl sulfoxide (DMSO), Dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), and hexamethylphosphoramide (HMPA) One or more selected from the group can be used.

또한 바람직하게는, 상기 화학식 4의 HA-TBA 및 상기 화학식 5의 비닐술폰-시스테아민 결합체를 유기용매 존재 하에 반응시키기 전에, 상기 HA-TBA를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 활성제에 첨가하여 활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.Also preferably, the HA-TBA is reacted with benzotriazol-1-yl-oxy-tris before reacting HA-TBA of Formula 4 and vinylsulfone-cysteamine conjugate of Formula 5 in the presence of an organic solvent. Benzotriazole-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) and 1 , 3-diisopropylcarbodiimide (1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC) may further comprise the step of activating by adding to at least one active agent selected from the group consisting of.

이처럼 활성제에 HA-TBA를 첨가해 활성화 시키는 단계를 거친 후에, HA-TBA 및 비닐술폰-시스테아민 결합체를 유기 용매 존재 하에 반응시키는 컨쥬게이션 반응을 진행하면, 히알루론산의 카르복실기가 활성화되어 비닐술폰-시스테아민 결합체의 아미노기와 반응성이 높아져 컨쥬게이션 반응 효율을 높일 수 있다. 이 때, 활성제에 첨가해 활성화시키는 시간은 사용되는 활성제의 종류 및 농도에 따라 달리 적용할 수 있는데, 바람직하게는 충분한 반응성 향상을 위해 30분 내지 1시간 활성화시킬 수 있다.After the HA-TBA is added to the activator and activated, the conjugation reaction of HA-TBA and vinylsulfone-cysteamine conjugate in the presence of an organic solvent activates the carboxyl group of the hyaluronic acid to activate the vinylsulfone. -Higher reactivity of the amino group of the cysteamine conjugate can improve the conjugation reaction efficiency. At this time, the time to be activated by adding to the active agent can be applied differently depending on the type and concentration of the active agent, and preferably 30 minutes to 1 hour for sufficient reactivity improvement.

바람직하게는 상기 HA-TBA 및 상기 비닐술폰-시스테아민 결합체를 유기 용매 존재 하에 반응시키는 공정은, N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA), 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine), 또는 이들의 혼합물을 추가로 첨가하여 이루어질 수 있다. 이를 통해 상기 N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA) 등의 첨가물이 컨쥬게이션 반응에서 촉매의 역할을 하여 반응 속도를 증가시킬 수 있다.Preferably, the step of reacting the HA-TBA and the vinylsulfone-cysteamine conjugate in the presence of an organic solvent is N, N-diisopropyl ethylamine (DIPEA), 2,2, 6,6, -tetramethylpiperidine (2,2,6,6-tetramethylpiperidine), or mixtures thereof. Through this, additives such as N, N-diisopropyl ethylamine (DIPEA) may increase the reaction rate by acting as a catalyst in the conjugation reaction.

하기 화학식 3을 갖는 화합물은 바람직하게는 히알루론산을 디비닐술폰과 수용액에서 반응시켜 제조될 수 있다(반응식 3).Compounds having the formula (3) may preferably be prepared by reacting hyaluronic acid with divinylsulfone in an aqueous solution (Scheme 3).

[화학식 3](3)

상기 화학식 3에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.In Formula 3, n is an integer of 50 to 10,000.

[반응식 3]Scheme 3

본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 히알루론산, 히알루론산의 염 또는 히알루론산의 유도체는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)인 것을 사용할 수 있다. 상기와 같은 범위의 분자량을 갖는 히알루론산, 또는 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 약물 전달을 위한 컨쥬게이트에 사용되기에 적합하다.Hyaluronic acid, a salt of hyaluronic acid or a derivative of hyaluronic acid used in the preparation of the hyaluronic acid-peptide conjugate according to one embodiment of the present invention is not limited in its configuration, but preferably has a molecular weight of 10,000 to 3,000,000 Daltons (Da ) Can be used. Hyaluronic acid, or a salt of hyaluronic acid, or a derivative of hyaluronic acid having a molecular weight in the above range is suitable for use in conjugates for drug delivery.

또한, 상기 컨쥬게이션 반응에 있어서, 히알루론산 유도체 한 분자에 결합되는 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드 분자수는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 3 내지 60 분자수의 펩타이드가 결합될 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 펩타이드가 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 원하는 약효 지속 시간을 나타낼 수 있다.In the conjugation reaction, the number of water-soluble peptide molecules having a terminal thiol group bonded to one molecule of the hyaluronic acid derivative is not limited in configuration, but preferably 3 to 60 molecules of peptides may be bound. The hyaluronic acid-peptide conjugate to which the number of peptides in the above range is bound may exhibit a desired drug duration.

한편, 본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 예컨대 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이, 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드를 준비해 화학식 2의 화합물(HA-VS)과 수용액 상에서 반응시켜 생성할 수 있으며, 또는 하기 반응식 5에 나타난 바와 같이, 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드를 준비해 화학식 3의 화합물(HA-DVS)과 수용액 상에서 반응시켜 생성할 수 있다.Meanwhile, the hyaluronic acid-peptide conjugate according to one embodiment of the present invention may be prepared by preparing a water-soluble peptide having a terminal thiol group and reacting the compound of Formula 2 (HA-VS) in an aqueous solution, for example, as shown in Scheme 4 below. Alternatively, as shown in Scheme 5, a water-soluble peptide having a terminal thiol group may be prepared and reacted with a compound of Formula 3 (HA-DVS) in an aqueous solution.

[반응식 4]Scheme 4

[반응식 5]Scheme 5

히알루론산에 생접합되는 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드는 수용액 상에서 용해될 수 있는 것이면, 어떠한 것이든 무방하나, 예컨대 제2형 당뇨병 치료제인 엑센딘 4(Exendin 4), 또는 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonistic peptide)를 사용할 수 있으며, 상기 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드(agonistic peptide)로는 예컨대, CWRYMVm (서열번호 1: Cys-Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met) 또는 CWKYMVm (서열번호 2: Cys-Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met)를 사용할 수 있다. 또한 바람직하게는 엑센딘 4(Exendin 4), 또는 FPRL1 수용체(receptor)에 대한 작용제 펩타이드의 N-말단에 시스테인을 도입한 것을 사용할 수 있다.The water-soluble peptide having a terminal thiol group bioconjugated to hyaluronic acid may be dissolved in an aqueous solution, but may be any one, for example, for exendin 4, a type 2 diabetes drug, or a FPRL1 receptor. An agonistic peptide may be used, and as an agonistic peptide for the FPRL1 receptor, for example, CWRYMVm (SEQ ID NO: 1: Cys-Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met) Or CWKYMVm (SEQ ID NO 2: Cys-Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met). Also preferably, exendin 4 or a cysteine introduced at the N-terminus of the agonist peptide for the FPRL1 receptor may be used.

말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드의 준비는 활성 성분인 펩타이드가 그 자체에 티올기를 말단에 포함한 경우 별도의 준비 과정이 필요치 않으며, 말단에 티올기를 포함하지 않거나, 또는 말단에 티올기를 갖고 있기는 하나 포함된 티올기의 반응성이 낮은 펩타이드의 경우, 펩타이드의 말단에 별도로 티올기를 도입하는 공정을 거칠 수 있다. Preparation of the water-soluble peptide having a terminal thiol group does not require a separate preparation process when the active ingredient peptide contains a thiol group at its own end, and does not include a thiol group at the terminal or a thiol group at the terminal. In the case of a peptide having a low reactivity of the thiol group, a step of introducing a thiol group separately at the terminal of the peptide may be performed.

펩타이드의 말단에 별도로 티올기를 도입하는 공정은 특별한 제한 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 펩타이드의 말단에 시스테인을 도입하여 진행할 수 있다. 이처럼 펩타이드의 말단에 시스테인을 사용하여 티올기를 도입하면, 도입된 티올기에 의해 컨쥬게이션 반응성을 증가시킬 수 있다.The step of introducing a thiol group separately at the end of the peptide may be performed without particular limitation, but preferably, it may proceed by introducing cysteine at the end of the peptide. As such, by introducing a thiol group using cysteine at the end of the peptide, the conjugated reactivity can be increased by the introduced thiol group.

본 발명의 다른 구현예에 따라, 비닐술폰기를 갖는 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조하고, 상기 제조된 히알루론산 유도체의 비닐술폰기에 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드를 수용액에서 반응시키는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, preparing a hyaluronic acid derivative of Formula 2 or Formula 3 having a vinyl sulfone group, and reacting the water-soluble peptide having a terminal thiol group with a vinyl sulfone group of the hyaluronic acid derivative prepared above in an aqueous solution It provides a method for producing a hyaluronic acid-peptide conjugate comprising a.

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3](3)

바람직하게는 상기 화학식 2를 갖는 화합물은 히알루론산의 카르복실기에 시스테아민 화합물을 반응시킨 후 디비닐술폰을 추가로 반응시켜 제조된 것일 수 있다. Preferably, the compound having Formula 2 may be prepared by reacting a cysteamine compound with a carboxyl group of hyaluronic acid and then further reacting divinyl sulfone.

보다 바람직하게는 히알루론산의 카르복실기에 시스테아민 화합물을 반응시키고 트리스(2-카르복시에틸)포스파인(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)를 반응시켜, 티올기를 갖는 하기 화학식 6의 화합물을 제조하고, 상기 화학식 6의 화합물을 디비닐술폰과 수용액에서 반응시켜 제조되는 것일 수 있다.More preferably, a cysteamine compound is reacted with a carboxyl group of hyaluronic acid and tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) is reacted to prepare a compound of formula 6 having a thiol group. And, the compound of Formula 6 may be prepared by reacting with divinyl sulfone in an aqueous solution.

상기 화학식 6에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.In Chemical Formula 6, n is an integer of 50 to 10,000.

상기 화학식 3을 갖는 화합물은 바람직하게는 히알루론산을 디비닐술폰과 수용액에서 반응시켜 제조할 수 있다.Compound having the formula (3) is preferably prepared by reacting hyaluronic acid with divinyl sulfone in an aqueous solution.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는, 히알루론산 유도체와 수용성 펩타이드의 말단에 포함된 티올기 간의 컨쥬게이션 반응을 통해 제조될 수 있으며, 이러한 컨쥬게이션 반응이 수용액 상에서 진행되므로, 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는 수용액에 용해 가능한 수용성 펩타이드 활성 성분의 생접합을 통한 약물 전달 시스템 전반에 걸쳐 응용 가능하다.As described above, the hyaluronic acid-peptide conjugate according to one embodiment of the present invention may be prepared through a conjugation reaction between a hyaluronic acid derivative and a thiol group contained at the terminal of the water-soluble peptide, and the conjugation reaction may be As it proceeds in an aqueous solution, the hyaluronic acid-peptide conjugate prepared according to one embodiment of the present invention is applicable throughout the drug delivery system through bioconjugation of a water-soluble peptide active ingredient soluble in an aqueous solution.

본 발명의 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조 방법에 따르면, 수용액 상에서 컨쥬게이션 반응을 진행할 수 있어, 수용액에 용해 가능한 수용성 펩타이드 활성 성분의 생접합을 통한 약물 전달 시스템 전반에 걸쳐 응용 가능하다. 또한 본 발명의 히알루론산 유도체를 사용함에 따라 생접합 효율이 매우 높고 약효 시간을 증대할 수 있으며 생체적합성, 생분해성 유도체와 결합하여 인체에 적용하기에 안전하므로 다양한 펩타이드 의약품의 약물 전달 시스템에 유용한 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. According to the method for preparing a hyaluronic acid-peptide conjugate of the present invention, the conjugation reaction can be carried out in an aqueous solution, and thus can be applied throughout a drug delivery system through bioconjugation of a water-soluble peptide active ingredient soluble in an aqueous solution. In addition, by using the hyaluronic acid derivative of the present invention, the bioconjugation efficiency is very high, and the medicinal time can be increased, and it is safe to apply to the human body by combining with biocompatible and biodegradable derivatives, which is useful for drug delivery systems of various peptide medicines. Lonic acid-peptide conjugates can be obtained.

도 1a는 본 발명의 실험예 1에 따른 비닐술폰기를 갖는 히알루론산 유도체(HA-VS)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 1b는 비닐술폰-시스테아민 결합체의 비율에 따른 비닐술폰기의 치환율을 나타낸 것이다.
도 1c는 본 발명의 실험예 1에 따른 비닐술폰기를 갖는 히알루론산 유도체(HA-DVS)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 1d는 본 발명의 실험예 1에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬케이트의 시스테인 억제(cysteine blocking) 전후의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실험예 2에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 하나의 히알루론산 체인에 포함된 펩타이드 분자수(빨간색) 및 펩타이드 분자수에 따른 생접합 효율 (하얀색)를 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 실험예 3에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트와 펩타이드의 GPC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실험예 4에 따른 인간 혈청(Human serum) 내에서 펩타이드 (검정색) 및 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트(빨간색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(70/10) 및 파란색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(30/10))의 안정성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실험예 5에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 (분홍색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(70/10) 및 초록색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(30/10))와 펩타이드 (파란색: Exendin 4)의 포도당 내성검사 결과 (도 5a) 및 이의 곡선하면적(area under the curve)을 이용한 정량결과 (도 5b)를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실험예 6에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 (분홍색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(70/10) 및 초록색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(30/10))와 펩타이드 (파란색: Exendin 4)의 혈당 강하 효과 검사 결과 (도 6a) 및 이의 곡선하면적(area under the curve)을 이용한 정량결과(도 6b)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실험예 7에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트와 펩타이드의 면역 조직 화학적 검사 결과 (도 7a) 및 이의 면적을 이용한 정량결과 (도 7b)를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실험예 8에 따른 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 (분홍색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(70/10) 및 초록색: HA-Exendin 4 컨쥬게이트(30/10))와 펩타이드 (파란색: Exendin 4)의 약리 (PK) 특성 분석 결과를 비교하여 나타낸 것이다.Figure 1a shows the ¹ H-NMR spectrum of the hyaluronic acid derivative (HA-VS) having a vinyl sulfone group according to Experimental Example 1 of the present invention.
Figure 1b shows the substitution rate of the vinyl sulfone group according to the ratio of the vinyl sulfone-cysteamine conjugate.
Figure 1c shows the ¹ H-NMR spectrum of the hyaluronic acid derivative (HA-DVS) having a vinyl sulfone group according to Experimental Example 1 of the present invention.
1D shows ¹ H-NMR spectra before and after cysteine blocking of hyaluronic acid-peptide conjugates according to Experimental Example 1 of the present invention.
FIG. 2 shows the number of peptide molecules (red) and bioconjugation efficiency (white) included in one hyaluronic acid chain of the hyaluronic acid-peptide conjugate according to Experimental Example 2 of the present invention.
3A and 3B show the results of GPC analysis of the hyaluronic acid-peptide conjugate and the peptide according to Experimental Example 3 of the present invention.
4 is a peptide (black) and hyaluronic acid-peptide conjugate (red: HA-Exendin 4 conjugate (70/10) and blue: HA-Exendin) in human serum according to Experimental Example 4 of the present invention. 4 conjugate (30/10) is shown.
5 is a hyaluronic acid-peptide conjugate (pink: HA-Exendin 4 conjugate (70/10) and green: HA-Exendin 4 conjugate (30/10)) and peptide (blue) according to Experimental Example 5 of the present invention. : Exendin 4) shows the results of glucose tolerance test (FIG. 5A) and quantitative results using the area under the curve (FIG. 5B).
6 is a hyaluronic acid-peptide conjugate (pink: HA-Exendin 4 conjugate (70/10) and green: HA-Exendin 4 conjugate (30/10)) and peptide (blue) according to Experimental Example 6 of the present invention. : Exendin 4) shows the result of blood glucose lowering effect test (FIG. 6A) and the quantitative result using the area under the curve (FIG. 6B).
Figure 7 shows the immunohistochemical test results of hyaluronic acid-peptide conjugates and peptides according to Experimental Example 7 of the present invention (Fig. 7a) and quantitative results using the area thereof (Fig. 7b).
8 is a hyaluronic acid-peptide conjugate (pink: HA-Exendin 4 conjugate (70/10) and green: HA-Exendin 4 conjugate (30/10)) and peptide (blue) according to Experimental Example 8 of the present invention. : Comparison of the results of pharmacological (PK) characterization of Exendin 4).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 다만, 이는 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐, 이에 의해 본 발명의 권리 범위가 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, this is only to help the understanding of the invention, whereby the scope of the present invention is not limited.

실시예Example 1. 화학식 2의 화합물( 1. a compound of formula (2) HAHA -- VSVS )과 )and HAHA -- ExendinExendin 4 4 컨쥬게이트의Conjugate 제조 Produce

[화학식 2][Formula 2]

히알루론산(HA)(MW=100kDa) 200mg을 증류수 20ml에 용해시킨 후, EDC와 HOBt을 각각 HA의 카르복실기에 대해 4배의 몰비로 첨가해 30분 간 활성화 시켰다. 이 후, 시스타민 디하이드로클로라이드(Cystamine dihydrochloride)를 HA의 카르복실기에 대해 20배의 몰비로 첨가하고 용액의 pH를 4.8로 맞춘 후 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 에탄올 침전법(ethanol precipitation)을 통해 불순물을 거르고 남은 석출물을 증류수 20ml에 녹여 TCEP을 HA의 카르복실기에 대해 4배의 몰비로 첨가하고 용액의 pH를 6으로 맞춘 후 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 에탄올 침전법을 통해 불순물을 거르고 남은 석출물을 증류수 20ml에 녹여 3일간 동결건조 시켜, HA-SH을 얻었다. 얻어진 HA-SH 50mg을 pH 8.5의 인산염 완충용액(phosphate buffer solution) 10ml에 용해시킨 후, TCEP을 HA의 카르복실기에 대해 4배의 몰비로 첨가하고, DVS를 HA-SH의 -SH에 대해 20배의 몰비로 첨가하였다. 다시 pH를 8.5로 맞춘 후 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 과량의 증류수에 대해 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜, HA-VS을 얻었다. 얻어진 HA-VS는 ¹H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 분석하였다.After dissolving 200 mg of hyaluronic acid (HA) (MW = 100 kDa) in 20 ml of distilled water, EDC and HOBt were added at a 4-fold molar ratio to the carboxyl groups of HA, respectively, and activated for 30 minutes. Thereafter, cystamine dihydrochloride was added at a molar ratio of 20 times with respect to the carboxyl group of HA, the pH of the solution was adjusted to 4.8, and reacted overnight. After completion of the reaction, the impurities were filtered through ethanol precipitation, and the remaining precipitate was dissolved in 20 ml of distilled water. TCEP was added at a molar ratio of 4 times to the carboxyl group of HA, and the pH of the solution was adjusted to 6, followed by reaction for 4 hours. I was. After the reaction, the impurities were filtered through ethanol precipitation, and the remaining precipitate was dissolved in 20 ml of distilled water and lyophilized for 3 days to obtain HA-SH. 50 mg of the obtained HA-SH was dissolved in 10 ml of a phosphate buffer solution of pH 8.5, TCEP was added at a molar ratio of 4 times to the carboxyl group of HA, and DVS was 20 times to -SH of HA-SH. The molar ratio of was added. Again pH was adjusted to 8.5 and reacted at room temperature for 12 hours. After dialysis against excess distilled water, lyophilized for 3 days to obtain HA-VS. The obtained HA-VS was analyzed by ¹ H-NMR (DPX300, Bruker, Germany).

N-말단에 티올기를 갖는 Exendin 4 펩타이드(Exendin 4-Cys)를 준비하고, Exendin 4-Cys 펩타이드 5mg과 상기 HA-VS 14mg을 각각 증류수에 용해시켰다. Exendin 4-Cys 펩타이드 용액에 10배의 몰비로 TCEP를 첨가해 30분간 상온에서 반응시켰다. 이 후, HA-VS 용액 3ml와 상기 Exendin 4-Cys 펩타이드 용액 1ml를 혼합하고 1N NaOH를 이용해 pH를 9로 맞추어 주었다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 반응하지 않은 아크릴로일(acryloyl)기를 억제(blocking)하기 위해 HA-VS의 비닐기에 대해 2배의 몰비로 시스테인(cysteine)을 첨가하였다. 다시 pH를 9로 맞춘 후 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. ¹N HCl을 이용해 pH를 7.0으로 맞추어 반응을 종결시킨 후, GPC를 통해 HA-Exendin 4 컨쥬게이트를 정제하였다.Exendin 4 peptide (Exendin 4-Cys) having a thiol group at the N-terminus was prepared, and 5 mg of Exendin 4-Cys peptide and 14 mg of HA-VS were dissolved in distilled water, respectively. TCEP was added to the Exendin 4-Cys peptide solution at a 10-fold molar ratio and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Thereafter, 3 ml of the HA-VS solution and 1 ml of the Exendin 4-Cys peptide solution were mixed and the pH was adjusted to 9 using 1N NaOH. Cysteine was added at twice the molar ratio to the vinyl groups of HA-VS to block unreacted acryloyl groups after reacting at 37 ° C. for 12 hours. Again pH was adjusted to 9 and reacted at 37 ℃ for 12 hours. ^The reaction was terminated by adjusting the pH to 7.0 with ¹ N HCl, and then purified HA-Exendin 4 conjugate through GPC.

실시예Example 2. 화학식 2의 화합물( 2. A compound of formula 2 ( HAHA -- VSVS )과 )and HAHA -- ExendinExendin 4 4 컨쥬게이트의Conjugate 제조 Produce

Dowex 50WX-8-400 이온교환수지(ion-exchange resin) 12.5 g을 250 mL의 증류수로 3회 세척한 후, 상기 Dowex 수지 에 24.5 mL의 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH) 를 넣어 30분간 반응 후, 필터를 통해 여과하였다. 히알루론산(HA)(MW=100kDa) 1 g을 100 mL의 물에 녹인 후, DOWEX-TBA 수지 (10g)을 첨가해 3시간 동안 반응시켰다. 상층액을 0.45 μm 필터로 걸러 3일간 동결건조 시켜, HA-TBA를 얻었다.After washing 12.5 g of Dowex 50WX-8-400 ion-exchange resin three times with 250 mL of distilled water, 24.5 mL of tetra-n-butyl ammonium hydroxide (tetra-n) was added to the Dowex resin. -butyl ammonium hydroxide, TBA-OH) was added to the reaction for 30 minutes, and then filtered through a filter. After dissolving 1 g of hyaluronic acid (HA) (MW = 100 kDa) in 100 mL of water, DOWEX-TBA resin (10 g) was added to react for 3 hours. The supernatant was filtered through a 0.45 μm filter and lyophilized for 3 days to obtain HA-TBA.

시스테아민 하이드로클로라이드(0.2mmol)를 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 2ml에 녹인 후, DVS(1mmol)을 첨가하고 4시간 동안 반응시켜 비닐술폰-시스테아민 결합체(VSC)를 합성하였다. 상기 HA-TBA (0.1mmol)을 DMSO 8ml에 녹이고 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, BOP)를 HA의 카르복실기에 대해 2.5배의 몰비로, N,N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA)을 HA의 카르복실기에 대해 1/1의 몰비로 첨가해 30분간 활성화 시켰다. 이 후, HA-TBA 용액 8ml와 상기 VSC 용액 2ml를 혼합하여 24시간 동안 반응시켰다. 이후 과량의 100 mM NaCl 수용액, 증류수에 대해 투석시킨 후 3일간 동결건조시켜, 상기 화학식 2의 화합물(HA-VS)을 얻었다. 얻어진 HA-VS는 ¹H-NMR (DPX500, Bruker, Germany)으로 분석하였다.Cysteamine hydrochloride (0.2 mmol) was dissolved in 2 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), and then DVS (1 mmol) was added and reacted for 4 hours to synthesize vinylsulfone-cysteamine conjugate (VSC). The HA-TBA (0.1 mmol) was dissolved in 8 ml of DMSO and benzotriazol-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate , BOP) at 2.5-fold molar ratio with respect to the carboxyl group of HA, and N, N-diisopropyl ethylamine (DIPEA) was added at a molar ratio of 1/1 with respect to the carboxyl group of HA for 30 minutes. Activated. Thereafter, 8 ml of the HA-TBA solution and 2 ml of the VSC solution were mixed and reacted for 24 hours. After dialysis against an excess of 100 mM NaCl aqueous solution, distilled water and then lyophilized for 3 days to obtain the compound of Formula 2 (HA-VS). The obtained HA-VS was analyzed by ¹ H-NMR (DPX500, Bruker, Germany).

N-말단에 티올기를 갖는 Exendin 4 펩타이드(Exendin 4-Cys)를 준비하고, 상기 Exendin 4-Cys 펩타이드 5mg과, 피드(Feed) 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수가 7, 11, 15, 21, 29가 되도록 상기 HA-VS를 각각 증류수에 용해시켰다. Exendin 4-Cys 펩타이드 용액에 10배의 몰비로 TCEP를 첨가해 30분간 상온에서 반응시켰다. 이 후, HA-VS 용액 3ml와 상기 Exendin 4-Cys 펩타이드 용액 1ml를 혼합하고 1N NaOH를 이용해 pH를 9로 맞추어 주었다. 피드(Feed) 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수는 7, 11, 15, 21, 29였다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 반응하지 않은 아크릴로일(acryloyl)기를 억제(blocking)하기 위해 HA-VS의 비닐기에 대해 2배의 몰비로 시스테인(cysteine)을 첨가하였다. 다시 pH를 9로 맞춘 후 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 1N HCl을 이용해 pH를 7.0으로 맞추어 반응을 종결시킨 후, GPC(겔 침투 크로마토그래피, gel permeation chromatography)를 통해 HA-Exendin 4 컨쥬게이트를 정제하였다.
Prepare an Exendin 4 peptide (Exendin 4-Cys) having a thiol group at the N-terminus, and 5 mg of the Exendin 4-Cys peptide and the number of molecules of the peptide reacted per HA molecule in the feed (7, 11, 15) The HA-VS was dissolved in distilled water so as to be 21, 29, respectively. TCEP was added to the Exendin 4-Cys peptide solution at a 10-fold molar ratio and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Thereafter, 3 ml of the HA-VS solution and 1 ml of the Exendin 4-Cys peptide solution were mixed and the pH was adjusted to 9 using 1N NaOH. The number of molecules of the peptide reacted per molecule of HA in the feed was 7, 11, 15, 21, 29. Cysteine was added at twice the molar ratio to the vinyl groups of HA-VS to block unreacted acryloyl groups after reacting at 37 ° C. for 12 hours. Again pH was adjusted to 9 and reacted at 37 ℃ for 12 hours. After the reaction was terminated by adjusting the pH to 7.0 with 1N HCl, HA-Exendin 4 conjugate was purified by GPC (gel permeation chromatography).

실시예Example 3. 화학식 3의 화합물( 3. A compound of formula 3 ( HAHA -- DVSDVS )과 )and HAHA -- ExendinExendin 4 4 컨쥬게이트의Conjugate 제조 Produce

[화학식 3](3)

히알루론산(HA) (MW=12kDa) 200mg을 pH10의 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate buffer solution) 40ml에 용해시킨 후, DVS를 HA의 단위 unit에 대해 20배의 몰비로 첨가해 6시간 동안 반응시켰다. 과량의 증류수에 대해 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜, 상기 화학식 3의 화합물(HA-DVS)을 얻었다. 얻어진 HA-DVS는 ¹H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 분석하였다.After dissolving 200 mg of hyaluronic acid (HA) (MW = 12 kDa) in 40 ml of sodium carbonate buffer solution at pH 10, DVS was added at a molar ratio of 20 times to the unit of HA and reacted for 6 hours. After dialysis against an excess of distilled water was lyophilized for 3 days to obtain a compound of Formula 3 (HA-DVS). The obtained HA-DVS was analyzed by ¹ H-NMR (DPX300, Bruker, Germany).

말단 티올기를 갖는 Exendin 4 펩타이드(Exendin 4-Cys)를 준비하고, Exendin 4-Cys 펩타이드 5mg과 상기 HA-DVS 25mg을 각각 증류수에 용해시켰다. Exendin 4-Cys 펩타이드 용액에 10배의 몰비로 TCEP를 첨가해 30분간 상온에서 반응시켰다. 이 후, HA-DVS 용액 4ml와 상기 Exendin 4-Cys 펩타이드 용액 1ml를 혼합하고 1N NaOH를 이용해 pH를 9로 맞추어 주었다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 반응하지 않은 아크릴로일(acryloyl)기를 억제(blocking)하기 위해 HA-DVS의 비닐기에 대해 2배의 몰비로 시스테인(cysteine)을 첨가하였다. 다시 pH를 9로 맞춘 후 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 1N HCl을 이용해 pH를 7.0으로 맞추어 반응을 종결시킨 후, GPC를 통해 HA-Exendin 4 컨쥬게이트를 정제하였다.
Exendin 4 peptide (Exendin 4-Cys) having a terminal thiol group was prepared, and 5 mg of Exendin 4-Cys peptide and 25 mg of HA-DVS were dissolved in distilled water, respectively. TCEP was added to the Exendin 4-Cys peptide solution at a 10-fold molar ratio and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Thereafter, 4 ml of the HA-DVS solution and 1 ml of the Exendin 4-Cys peptide solution were mixed and the pH was adjusted to 9 using 1N NaOH. Cysteine was added at a molar ratio of 2 times the vinyl group of HA-DVS to block unreacted acryloyl group after reacting at 37 ° C. for 12 hours. Again pH was adjusted to 9 and reacted at 37 ℃ for 12 hours. After the reaction was terminated by adjusting the pH to 7.0 with 1N HCl, the HA-Exendin 4 conjugate was purified through GPC.

실시예Example 4. 화학식 3의 화합물( 4. A compound of formula 3 ( HAHA -- DVSDVS )과 )and HAHA -- CWRYMVmCWRYMVm 컨쥬게이트의Conjugate 제조 Produce

히알루론산(HA) (MW=100kDa) 200mg을 pH10의 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate buffer solution) 40ml에 용해시킨 후, DVS를 HA의 단위 unit에 대해 20배의 몰비로 첨가해 6시간 동안 반응시켰다. 과량의 증류수에 대해 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜, 상기 화학식 3의 화합물(HA-DVS)을 얻었다. 얻어진 HA-DVS는 ¹H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 분석하였다.After dissolving 200 mg of hyaluronic acid (HA) (MW = 100 kDa) in 40 ml of sodium carbonate buffer solution at pH 10, DVS was added at a molar ratio of 20 times to the unit of HA and reacted for 6 hours. After dialysis against an excess of distilled water was lyophilized for 3 days to obtain a compound of Formula 3 (HA-DVS). The obtained HA-DVS was analyzed by ¹ H-NMR (DPX300, Bruker, Germany).

말단 티올기를 갖는 FPRL 1 수용체에 대한 작용제 펩타이드 (CWRYMVm, 서열번호 1)를 준비하고, CWRYMVm 펩타이드 5mg과 상기 HA-DVS 14mg을 각각 증류수에 용해시켰다. CWRYMVm 펩타이드 용액에 10배의 몰비로 TCEP를 첨가해 30분간 상온에서 반응시켰다. 이 후, HA-DVS 용액 6ml와 상기 CWRYMVm 펩타이드 용액 1ml를 혼합하고 1N NaOH를 이용해 pH를 9로 맞추어 주었다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 반응하지 않은 아크릴로일(acryloyl)기를 억제(blocking)하기 위해 HA-DVS의 비닐기에 대해 2배의 몰비로 시스테인(cysteine)을 첨가하였다. 다시 pH를 9로 맞춘 후 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 1N HCl을 이용해 pH를 7.0으로 맞추어 반응을 종결시킨 후, GPC를 통해 HA-CWRYMVm 컨쥬게이트를 정제하였다.
An agonist peptide (CWRYMVm, SEQ ID NO: 1) for the FPRL 1 receptor with terminal thiol groups was prepared, and 5 mg of CWRYMVm peptide and 14 mg of HA-DVS were dissolved in distilled water, respectively. TCEP was added to the CWRYMVm peptide solution at a molar ratio of 10 times and reacted at room temperature for 30 minutes. Thereafter, 6 ml of the HA-DVS solution and 1 ml of the CWRYMVm peptide solution were mixed and adjusted to pH 9 using 1N NaOH. Cysteine was added at a molar ratio of 2 times the vinyl group of HA-DVS to block unreacted acryloyl group after reacting at 37 ° C. for 12 hours. Again pH was adjusted to 9 and reacted at 37 ℃ for 12 hours. After the reaction was terminated by adjusting the pH to 7.0 with 1N HCl, the HA-CWRYMVm conjugate was purified through GPC.

실험예Experimental Example 1. 히알루론산- Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate NMRNMR 분석 analysis

1-1) 분석 방법1-1) Analysis method

상술한 실시예들에 따라 얻어진 히알루론산 유도체 및 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트를 ¹H-NMR로 분석하였다. 분석 결과 중, 실시예 2에 따른 HA-VS 유도체(도 1a), 실시예 3에 따른 HA-DVS 유도체(도 1c) 및 실시예 2에 따른 HA-Exendin 4 컨쥬게이트(도 1d)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도 1에 도시하였다.
Hyaluronic acid derivatives and hyaluronic acid-peptide conjugates obtained according to the above-described examples were analyzed by ¹ H-NMR. Analysis according to Example 2 of the resulting HA-VS derivative (Fig. 1a), in Example 3 HA-Exendin according to HA-DVS derivative (Fig. 1c) and Example 2 according to the fourth conjugate ¹ H of the gate (Fig. 1d) -NMR spectrum is shown in FIG.

1-2) 분석 결과1-2) Analysis Results

도 1a에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 2에 따른 HA-VS의 ¹H-NMR 스펙트럼(DPX500, Bruker, Germany)에서는 히알루론산의 피크 외에도, δ = 6.4 ~ 6.9 ppm에 VS의 피크가 나타났다(도 1a의 α, β 및 γ). 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세트아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)로 정했다(도 1a의 δ). 실시예 2에 따른 HA-VS 유도체 내의 비닐기 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 6.4 ~ 6.9 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, HA unit에 대한 VSC(vinyl sulfone cysteamine)의 몰비를 조절하여 비닐기 치환율을 조절할 수 있었다.As can be seen in Figure 1a, in the ¹ H-NMR spectrum (DPX500, Bruker, Germany) of HA-VS according to Example 2, in addition to the peak of hyaluronic acid, the peak of VS appeared at δ = 6.4 ~ 6.9 ppm ( Α, β and γ in FIG. 1A). For quantitative analysis, methyl resonance of acetamido moiety of HA of δ = 1.85-1.95 ppm of hyaluronic acid was set as an internal standard (δ of FIG. 1A). The vinyl group substitution rate in the HA-VS derivative according to Example 2 was obtained by comparing the peak area of δ = 1.85-1.95 ppm and the peak area of δ = 6.4-1.6.9 ppm. As can be seen in Figure 1b, by controlling the molar ratio of VSC (vinyl sulfone cysteamine) to the HA unit was able to control the vinyl group substitution rate.

도 1c에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 3에 따른 HA-DVS의 ¹H-NMR 스펙트럼(DPX300, Bruker, Germany)에서는 히알루론산의 피크 외에도, δ = 6.4 ~ 6.9 ppm에 DVS의 피크가 나타났다(도 1c의 α, β 및 γ). 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)로 정했다(도 1c의 δ). 실시예 3에 따른 HA-DVS 유도체 내의 비닐기 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 6.4 ~ 6.9 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. As can be seen in Figure 1c, in the ¹ H-NMR spectrum (DPX300, Bruker, Germany) of HA-DVS according to Example 3, in addition to the peak of hyaluronic acid, the peak of DVS appeared at δ = 6.4 ~ 6.9 ppm ( Α, β and γ in FIG. 1C). For quantitative analysis, methyl resonance of acetamido moiety of HA of δ = 1.85-1.95 ppm of hyaluronic acid was set as an internal standard (δ of FIG. 1C). The vinyl group substitution rate in the HA-DVS derivative according to Example 3 was obtained by comparing the peak area of δ = 1.85-1.95 ppm with the peak area of δ = 6.4-1.6.9 ppm.

도 1d에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 2에 따른 HA-Exendin 4 컨쥬게이트의 ¹H-NMR 스펙트럼(DPX500, Bruker, Germany)에서는 HA-VS의 피크 외에도, δ = 7.2 ~ 7.5 ppm과 8.7 ppm에 Exendin 4의 피크가 나타났다(도 1d의 ε). 이들 피크는 Exendin 4의 페닐알라닌(phenylalanine)과 트립토판(tryptophan)의 방향족 고리(aromatic ring)에 의한 것이다. 반응하지 않고 남아 있는 아크릴로일(acryloyl)기를 억제하기 위해 시스테인으로 억제하였는데, 억제 이전에는 δ = 6.4 ~ 6.9 ppm에 아크릴로일기의 세 개의 수소에 해당하는 피크가 나타났으나, 억제 이후에는 δ = 6.4 ~ 6.9 ppm에 피크가 나타나지 않았다. 이 때, δ = 7.2 ~ 7.5 ppm과 8.7 ppm의 Exendin 4 피크는 변함이 없었다. 이러한 ¹H-NMR 분석 결과를 통해 HA-Exendin 4 컨쥬게이트가 합성된 것을 확인할 수 있었다.
As can be seen in FIG. 1D, in the ¹ H-NMR spectrum of the HA-Exendin 4 conjugate according to Example 2 (DPX500, Bruker, Germany), in addition to the peak of HA-VS, δ = 7.2 to 7.5 ppm and 8.7 ppm The peak of Exendin 4 appeared in ((epsilon) of FIG. 1D). These peaks are due to the aromatic rings of phenylalanine and tryptophan of Exendin 4. In order to inhibit the remaining acryloyl group, it was inhibited with cysteine. Before the inhibition, peaks corresponding to three hydrogens of the acryloyl group appeared at δ = 6.4 to 6.9 ppm, but after inhibition, δ There was no peak at 6.4-6.9 ppm. At this time, Exendin 4 peaks of δ = 7.2 to 7.5 ppm and 8.7 ppm did not change. These ¹ H-NMR analysis results confirmed that the HA-Exendin 4 conjugate was synthesized.

실험예Experimental Example 2. 히알루론산- 2. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 정량 분석 Quantitative Analysis

2-1) 분석 방법2-1) Analysis method

상기 실시예 2에 따른 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 내의 Exendin 4 함량은 GPC에서 피크 아래의 면적을 측정해 구하였다. 먼저 증류수에 1 mg/mL의 농도로 Exendin 4 원액 (Exendin 4 stock solution)을 준비한 뒤, 희석시켜 Exendin 4 표준용액(Exendin 4 standard solutions)을 준비하였다. 상기의 GPC 분석 조건에서 Exendin 4 표준용액을 분석하여 Exendin 4 농도에 따른 GPC 피크 아래 면적의 표준곡선(stnadard curve)를 구하였다. 상기 실시예 2에 따른 HA-Exendin 4 컨쥬게이트를 같은 조건에서 분석해 얻은 GPC 피크 아래 면적을 표준곡선에 대입해 펩타이드 함량을 구했다. 도 2는 GPC 분석으로 정량한 실시예 2에 따른 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 내의 Exendin 4 함량 분석 결과 및 생접합 효율을 분석한 결과를 도시한 것이다.
Exendin 4 content in the HA-Exendin 4 conjugate according to Example 2 was determined by measuring the area under the peak in GPC. First, an Exendin 4 stock solution (Exendin 4 stock solution) was prepared in distilled water at a concentration of 1 mg / mL, and then diluted to prepare an Exendin 4 standard solution. Exendin 4 standard solution was analyzed under the GPC analysis conditions to obtain a standard curve of the area under the GPC peak according to Exendin 4 concentration. The peptide content was determined by substituting the area under the GPC peak obtained by analyzing the HA-Exendin 4 conjugate according to Example 2 in the standard curve. Figure 2 shows the results of analyzing the results of the analysis and exendin 4 content in the HA-Exendin 4 conjugate according to Example 2 quantified by GPC analysis.

2-2) 분석 결과2-2) Analysis result

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 2에 따른 HA - Exendin 4 컨쥬게이트 내의 펩타이드 함량은 feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수를 7, 11, 15, 21, 29로 변화시켰을 때, HA 한 분자 당 결합한 펩타이드의 평균 분자수는 7에서 27까지 조절 가능했다.As can be seen in Figure 2, the peptide content in the HA-Exendin 4 conjugate according to Example 2 was found to increase with the number of molecules of the peptide reacted per molecule of HA in the feed. When the number of peptides reacted per molecule of HA in the feed was changed to 7, 11, 15, 21, 29, the average number of peptides bound per molecule of HA was controlled from 7 to 27.

생접합 효율(Bioconjugation efficiency) (%)은 반응용액에 첨가한 펩타이드에 대해 반응한 펩타이드의 몰 비로 표시했다. Feed 내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 펩타이드의 분자수에 상관없이 생접합 효율은 90 % 이상으로 매우 높게 나타났다.
Bioconjugation efficiency (%) was expressed as the molar ratio of peptides reacted to the peptides added to the reaction solution. Regardless of the number of peptides reacted per molecule of HA in the feed, the bioconjugation efficiency was very high (more than 90%).

실험예Experimental Example 3. 히알루론산- 3. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 분석 analysis

3-1) 분석 방법 3-1) Analysis method

실시예 2에 따라 준비된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 GPC 분석을 통해 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 형성을 확인하였다. 고성능 액상 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트의 GPC 분석하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
Formation of the hyaluronic acid-peptide conjugate was confirmed through GPC analysis of the hyaluronic acid-peptide conjugate prepared according to Example 2. GPC analysis of hyaluronic acid-peptide conjugates was performed using High performance liquid chromatography (HPLC). Analysis conditions are as follows.

3-2) GPC 분석 조건3-2) GPC Analysis Conditions

<HA-Exendin 4 컨쥬게이트의 GPC 분석조건><GPC analysis conditions of HA-Exendin 4 conjugate>

펌프: Waters 1525 binary HPLC pumpPump: Waters 1525 binary HPLC pump

흡광도 측정기: Waters 2487 dual λ absorbance detectorAbsorbance Meter: Waters 2487 dual λ absorbance detector

샘플러: Waters 717 plus auto-samplerSampler: Waters 717 plus auto-sampler

컬럼: Superdex 200 10/300 GL columnColumn: Superdex 200 10/300 GL column

이동상: PBS(인산완충식염수, phosphate buffered saline) pH 7.4, flow rate는 0.5 mL/min. Mobile phase: PBS (phosphate buffered saline) pH 7.4, flow rate 0.5 mL / min.

측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이중 측정(dual detection)
Measurement wavelength: dual detection at 210 nm and 280 nm

<HA-CWRYMVm 컨쥬게이트의 GPC 분석조건><GPC analysis conditions of HA-CWRYMVm conjugate>

펌프: Waters 1525 binary HPLC pumpPump: Waters 1525 binary HPLC pump

샘플러: Waters 717 plus auto-samplerSampler: Waters 717 plus auto-sampler

컬럼: Superdex Peptide 10/300 GL columnColumn: Superdex Peptide 10/300 GL column

이동상: 30% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, flow rate는 0.5 mL/min.Mobile phase: 30% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, flow rate 0.5 mL / min.

3-3) 분석 결과 3-3) Analysis result

도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이, 280nm의 파장에서 측정하였을 때, 고분자량의 히알루론산의 체류 시간(retention time)인 14분 대에서 피크가 나타나 히알루론산(HA)에 펩타이드가 컨쥬게이션 되었음을 확인하였다. 또한 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이, 280nm의 파장에서 측정하였을 때, 고분자량의 히알루론산의 체류 시간(retention time)인 15분 대에서 피크가 나타나 히알루론산(HA)에 펩타이드가 컨쥬게이션 되었음을 확인하였다.
As can be seen in Figure 3a, when measured at a wavelength of 280nm, a peak appears in the 14 minutes, the retention time of the high molecular weight hyaluronic acid appeared to confirm that the peptide conjugated to the hyaluronic acid (HA) . In addition, as can be seen in Figure 3b, when measured at a wavelength of 280nm, a peak appears in the 15 minutes of the retention time (retention time) of the high molecular weight hyaluronic acid to confirm that the peptide conjugated to the hyaluronic acid (HA) It was.

실험예Experimental Example 4. 히알루론산- 4. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 혈청 안정성( Serum stability ( serumserum stabilitystability ) 분석() analysis( InIn vitroin vitro ))

4-1) 분석 방법4-1) Analysis method

다음의 세 가지 샘플을 사용하였다.The following three samples were used.

- Exendin 4 Exendin 4

- HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10) HA-Exendin 4 conjugate (30/10)

: 상기 실시예 2에 따라 합성하였으며, 비닐기 치환율이 30% 이며 HA 한 체인(chain) 당 10개의 Exendin 4 분자가 결합. : Synthesis according to Example 2, the vinyl group substitution rate is 30% and 10 Exendin 4 molecules per HA chain (bond).

- HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10) HA-Exendin 4 conjugate (70/10)

: 상기 실시예 2에 따라 합성하였으며, 비닐기 치환율이 70% 이며 HA 한 체인(chain) 당 10개의 Exendin 4 분자가 결합. : Synthesis according to Example 2, the vinyl group substitution rate is 70% and 10 Exendin 4 molecules per HA chain (bond).

위의 세 가지 샘플을 Exendin 4 농도가 1 mg/mL로 동일하도록 각각 인간 혈청(human serum)에 용해시켜 37℃에서 96시간 동안 배양했다. 정해진 시간이 되었을 때 일부를 샘플링해 인간 혈청의 영향을 막기 위해 PBS에 1000배로 희석한 후 냉동시켰다. 각 샘플의 생물학적 활성도는 Exendin 4 EIA kit를 사용해 측정하였다.
The above three samples were dissolved in human serum so that the Exendin 4 concentration was the same as 1 mg / mL and incubated at 37 ° C. for 96 hours. At the appointed time, a portion of the sample was sampled, diluted 1000-fold in PBS to prevent human serum effects, and frozen. Biological activity of each sample was measured using the Exendin 4 EIA kit.

4-2) 분석결과4-2) Analysis result

도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, Exendin 4는 약 4.1시간의 반감기를 가지며 빠르게 분해되었다. 하지만 두 종류의 HA-Exendin 4 컨쥬게이트는 96시간 이상으로 반감기가 연장되어, Exendin 4에 비해 약 20배 길어진 반감기를 가졌다. HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)은 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10)에 비해 약간 더 높은 혈청 안정성(serum stability)을 보였는데 이는 VS 치환율이 더 높기 때문이다.
As can be seen in FIG. 4, Exendin 4 degraded rapidly with a half-life of about 4.1 hours. However, the two HA-Exendin 4 conjugates have half-lives longer than 96 hours, with a half-life of about 20 times longer than Exendin 4. HA-Exendin 4 conjugate (70/10) showed slightly higher serum stability compared to HA-Exendin 4 conjugate (30/10) due to the higher VS substitution rate.

실험예Experimental Example 5. 히알루론산- 5. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 포도당 내성 검사( Glucose tolerance test ( InIn vivovivo ))

5-1) 분석 방법5-1) Analysis method

본 실험은 당뇨병이 발생한 실험용 쥐 db/db 마우스 (n=5)를 이용해 진행되었다. 각 그룹의 평균 몸무게와 혈당치는 동일했다. db/db 마우스를 18시간 동안 절식시킨 후, 실험예 4의 Exendin 4, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA- Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)를 각각 10nmol/kg으로 복강투여 하였다. 한 시간 후, 400 mg/kg의 포도당을 복강투여 하였다. 꼬리 정맥으로부터 매 15분마다 혈액을 채취해 혈당측정기로 혈당을 측정하였다.This experiment was performed using experimental rat db / db mice (n = 5) with diabetes. The average weight and blood sugar level of each group were the same. After fasting db / db mice for 18 hours, the Exendin 4, HA-Exendin 4 conjugate (30/10) and HA-Exendin 4 conjugate (70/10) of Experimental Example 4 were intraperitoneally administered at 10 nmol / kg, respectively. It was. One hour later, 400 mg / kg of glucose was intraperitoneally administered. Blood was taken every 15 minutes from the tail vein and blood glucose was measured using a glucometer.

5-2) 분석 결과5-2) Analysis result

도 5a에서 볼 수 있는 바와 같이, Exendin 4, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)의 포도당 내성은 PBS에 비해 높았다. PBS를 처리한 대조군의 혈당은 빠르게 높은 혈당치까지 상승하고 천천히 내려가 포도당을 투여한지 4시간 만에 기준(baseline) 혈당치로 돌아왔다. 반면에 Exendin 4, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)를 처리한 실험군에서는 낮은 최고 혈당치를 보였고, 빠르게 내려가 90분 만에 기준(baseline) 혈당치로 돌아왔다. 도 5a의 그래프의 곡선하면적(area under the curve, AUC)을 도 5b로 나타냈는데, PBS를 처리한 대조군에 비해 Exendin 4, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)를 처리한 실험군의 AUC가 통계학적으로 유의한 수준으로 낮았다.
As can be seen in Figure 5a, glucose tolerance of Exendin 4, HA-Exendin 4 conjugate (30/10), HA-Exendin 4 conjugate (70/10) was higher than that of PBS. Blood glucose from the control group treated with PBS rose to high blood glucose levels rapidly and slowly descended to baseline blood glucose levels within 4 hours of glucose administration. On the other hand, the experimental group treated with Exendin 4, HA-Exendin 4 conjugate (30/10), and HA-Exendin 4 conjugate (70/10) showed low peak blood glucose levels and rapidly descended from baseline blood glucose levels in 90 minutes. Came back. The area under the curve (AUC) of the graph of FIG. 5A is shown in FIG. 5B, which is Exendin 4, HA-Exendin 4 conjugate (30/10), HA-Exendin 4 conjugate compared to the PBS-treated control group. The AUC of the experimental group treated with gate (70/10) was statistically significant.

실험예Experimental Example 6. 히알루론산- 6. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 혈당 강하 효과 검사( Blood glucose lowering effect test ( InIn vivovivo ))

6-1) 분석 방법6-1) Analysis method

본 실험은 db/db 마우스(n=5)를 이용해 진행되었다. 각 그룹의 평균 몸무게와 혈당치, 그리고 먹이 제공량은 동일했다. 실험예 4의 Exendin 4, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)를 각각 50nmol/kg으로 피하투여 하였다. 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취해 혈당측정기로 혈당을 측정하였다. 다음의 저혈당도(Hypoglycemic degree) (HGD%0-time) 계산식을 사용하여 PBS와 다른 샘플의 결과를 비교하였다.This experiment was performed using a db / db mouse (n = 5). The average weight, blood sugar level and food supply of each group were the same. Exendin 4, HA-Exendin 4 conjugate (30/10), and HA-Exendin 4 conjugate (70/10) of Experimental Example 4 were administered subcutaneously at 50 nmol / kg. Blood was collected from the tail vein and blood glucose was measured using a blood glucose meter. The following Hypoglycemic Degree (HGD% 0-time) equation was used to compare the results of PBS and other samples.

[수학식 1][Equation 1]

HGD%0-time = [(AUCPBS, 0-time - AUCtest, 0-time) / AUCPBS, 0-time] × 100
HGD% 0-time = [(AUCPBS, 0-time-AUCtest, 0-time) / AUCPBS, 0-time] × 100

6-2) 분석 결과6-2) Analysis result

도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 샘플을 투여하자 모든 그룹의 혈당이 빠르게 정상 혈당치로 떨어졌지만, 그 지속시간은 그룹별로 달랐다. Exendin 4는 혈당이 24시간 만에 빠르게 고혈당치로 돌아왔다. 반면에 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)의 혈당 강하 효과는 3일 동안 지속되었다. 도 6a의 AUC를 이용해 24시간, 72시간까지의 혈당 강하 효과를 구했고, 이를 도 6b에 나타내었다. 24시간 일 때 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)의 혈당 강하 효과는 Exendin 4의 약 2배로 높았고, 72시간일 때 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)의 혈당 강하 효과는 Exendin 4의 약 3배로 높았다.
As can be seen in FIG. 6A, the blood glucose of all groups rapidly dropped to normal blood glucose levels after administration of each sample, but its duration varied from group to group. Exendin 4 quickly returned to hyperglycemia in 24 hours. In contrast, the hypoglycemic effect of HA-Exendin 4 conjugate (30/10) and HA-Exendin 4 conjugate (70/10) lasted for 3 days. The blood glucose lowering effect of 24 hours and 72 hours was calculated using the AUC of FIG. 6A, which is shown in FIG. 6B. The hypoglycemic effect of HA-Exendin 4 conjugate (30/10) and HA-Exendin 4 conjugate (70/10) at 24 hours was approximately twice that of Exendin 4, and at 72 hours HA-Exendin 4 conjugate. (30/10), the hypoglycemic effect of HA-Exendin 4 conjugate (70/10) was about three times higher than that of Exendin 4.

실험예Experimental Example 7. 히알루론산- 7. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 면역 조직 화학적 검사( Immunohistochemical tests ( InIn vivovivo ))

7-1) 분석 방법7-1) Analysis method

Db/db 마우스에 상기의 각 샘플을 피하투여 하고 30분 후 췌장 섬(islet)을 인슐린 면역조직화학 염색(insulin immunostain)하였다. 각 조직 샘플은 PBS로 세척한 후 10 vol% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin)에 보관하였다. 조직 염색(staining)은 일반적인 방법으로 진행했는데, 파라핀 왁스(paraffin wax)에 넣고 2μm 두께로 잘라서 폴리리신(polylysine)이 코팅된 슬라이드에 부착하였다. 이 섹션 샘플은 자일렌(xylene), 단계적인 알콜, 공기 건조로 투명화하고 탈수시켰다. 내재성 과산화효소의 억제(Endogenous peroxidase blocking) 과정은 상온에서 10분 동안 전처리를 한 후 실시되었다. 각 섹션을 일차 항체(primary antibody로서 1/100의 비율로 희석된 guinea pig anti-swine insulin antibody)와 15분 동안 반응시킨 후, 덱스트란(dextran)(Envision kit)과 상온에서 30분 간 배양하였다. 각 과정 사이에 0.5 wt%의 트윈 20(Tween 20)을 포함한 트리스-버퍼(tris-buffer)(pH 7.6)로 세척하는 과정을 수차례 거쳤다. 최종적으로 각 섹션을 3,3'-디아미노-벤지딘(3,3'-diamino-benzidine, DAB)로 염색하고, 헤마톡실린(real hematoxylin)과 0.3% 암모니아수(ammonia water)로 대비 염색(conter stain)하였다. 인슐린 양성(Insulin positive) 세포(cell) / 섬(islet) (%)는 섬(islet) 내의 인슐린-양성 세포(insulin-positive cell)의 면적을 섬(islet) 면적으로 나누어 구했다. 이미지 분석은 Image J version 1.33 (NIH image, Maryland, MD)를 이용했다. 정량분석을 위해 n=3로 진행하였다.
After 30 minutes of subcutaneous administration of Db / db mice, each pancreatic islet was insulin immunostained. Each tissue sample was washed with PBS and then stored in 10 vol% neutral buffered formalin. Tissue staining was carried out in a general manner, which was placed in paraffin wax, cut into 2 μm thickness and attached to a polylysine coated slide. This section sample was cleared and dehydrated with xylene, staged alcohol, air drying. Endogenous peroxidase blocking was performed after pretreatment at room temperature for 10 minutes. Each section was reacted with guinea pig anti-swine insulin antibody diluted at a ratio of 1/100 as a primary antibody for 15 minutes, and then incubated with dextran (Envision kit) for 30 minutes at room temperature. . Between each procedure, several washings were performed with a tris-buffer (pH 7.6) containing 0.5 wt% Tween 20. Finally, each section was stained with 3,3'-diamino-benzidine (DAB) and contrasted with real hematoxylin and 0.3% ammonia water. stain). Insulin positive cells / islet (%) were obtained by dividing the area of insulin-positive cells in the islet by the islet area. Image analysis was performed using Image J version 1.33 (NIH image, Maryland, MD). N = 3 for quantitative analysis.

7-2) 분석 결과7-2) Analysis result

도 7a에서 볼 수 있는 바와 같이, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)를 투여한 그룹의 인슐린 양성 신호가 PBS나 Exendin 4를 투여한 그룹보다 강했다. 더 진한 색깔은 인슐린 분비가 더 많이 되었음을 의미한다. 도 7b에는 정량분석을 통해 구한 인슐린 양성(insulin positive) 세포(cell) / 섬(islet)(%) 수치를 나타냈다. HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)의 인슐린 분비 촉진 효과가 가장 높았고, 다음으로 HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (30/10), Exendin 4 순으로 높았다.
As can be seen in Figure 7a, the insulin-positive signal of the group administered HA-Exendin 4 conjugate (30/10), HA-Exendin 4 conjugate (70/10) than the group administered PBS or Exendin 4 It was strong. Darker color means more insulin secretion. 7b shows the values of insulin positive cells / islets (%) obtained through quantitative analysis. The HA-Exendin 4 conjugate (70/10) had the highest insulin-stimulating effect, followed by HA-Exendin 4 conjugate (30/10), followed by Exendin 4.

실험예Experimental Example 8. 히알루론산- 8. Hyaluronic Acid 펩타이드Peptide 컨쥬게이트의Conjugate 약리( Pharmacology PKPK ) 특성 분석 (Characteristic Analysis InIn vivovivo ))

8-1) 분석 방법8-1) Analysis method

SD 래트(rat)의 꼬리 정맥을 통해 PBS, Exendin 4, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)를 각각 투여한 후, 정해진 시간이 되었을 때 꼬리 정맥에서 혈액을 채취해 각 샘플의 혈중농도를 Exendin 4 EIA kit를 사용해 측정하였다.
After administration of PBS, Exendin 4, and HA-Exendin 4 conjugates (70/10) through the tail vein of SD rats, blood was collected from the tail vein at a defined time to determine the blood concentration of each sample. Measurement was made using an Exendin 4 EIA kit.

8-2) 분석 결과8-2) Analysis result

도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, Exendin 4의 혈중농도는 4시간 이전에 기준(baseline)으로 떨어졌으나, HA-Exendin 4 컨쥬게이트 (70/10)의 혈중농도는 4일째에도 기준(baseline)으로 떨어지지 않았다. 따라서 약효 시간을 현저히 증대시킬 수 있음을 확인하였다.As can be seen in Figure 8, the blood concentration of Exendin 4 fell to the baseline before 4 hours, the blood concentration of HA-Exendin 4 conjugate (70/10) to the baseline even on day 4 Did not fall. Therefore, it was confirmed that the drug efficacy can be significantly increased.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> HYALURONIC ACID DERIVATIVE, HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE, AND PREPARING THE SAME <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CWRYMVm <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> D-Met <400> 1 Cys Trp Arg Tyr Met Val Met 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CWKYMVm <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> D-Met <400> 2 Cys Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5 <110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> HYALURONIC ACID DERIVATIVE, HYALURONIC ACID-PEPTIDE CONJUGATE, AND PREPARING THE SAME <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CWRYMVm <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> D-Met <400> 1 Cys Trp Arg Tyr Met Val Met 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CWKYMVm <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> D-Met <400> 2 Cys Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5

Claims

하기 화학식 1을 갖는 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) 유도체와 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드가 결합된 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
n은 50 내지 10,000의 정수이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -OH,

또는

이다. A hyaluronic acid-peptide conjugate having a hyaluronic acid (HA) derivative having Formula 1 and a water-soluble peptide having a terminal thiol group bound thereto:
[Formula 1]

In Chemical Formula 1,
n is an integer from 50 to 10,000,
R1 and R2 are each independently -OH,

or

to be.

제1항에 있어서,
상기 히알루론산 유도체는 하기 화학식 2 또는 화학식 3을 갖는 화합물인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트:
[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 2 및 화학식 3에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.The method of claim 1,
The hyaluronic acid derivative is a hyaluronic acid-peptide conjugate which is a compound having the formula
(2)

(3)

In Chemical Formulas 2 and 3, n is an integer of 50 to 10,000.

제1항에 있어서,
상기 히알루론산 유도체는 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
The method of claim 1,
The hyaluronic acid derivative is a hyaluronic acid-peptide conjugate having a molecular weight of 10,000 to 3,000,000 Daltons (Da).

제1항에 있어서,
상기 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트는, 상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드가 상기 히알루론산 유도체 한 분자당 3 내지 60 분자로 결합된 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
The method of claim 1,
The hyaluronic acid-peptide conjugate is a hyaluronic acid-peptide conjugate in which the water-soluble peptide having the terminal thiol group is bonded at 3 to 60 molecules per molecule of the hyaluronic acid derivative.

제1항에 있어서,
상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드는 엑센딘 4(Exendin 4), CWRYMVm (서열번호 1) 또는 CWKYMVm (서열번호 2)인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
The method of claim 1,
The water-soluble peptide having the terminal thiol group is exendin 4 (Exendin 4), CWRYMVm (SEQ ID NO: 1) or CWKYMVm (SEQ ID NO: 2) hyaluronic acid-peptide conjugate.

제1항에 있어서,
상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드는 펩타이드의 말단에 시스테인을 도입한 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
The method of claim 1,
The water-soluble peptide having a terminal thiol group is a hyaluronic acid-peptide conjugate in which cysteine is introduced at the terminal of the peptide.

제6항에 있어서,
상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드는 엑센딘 4(Exendin 4)의 N-말단에 시스테인을 도입한 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트.
The method of claim 6,
The water-soluble peptide having a terminal thiol group is a hyaluronic acid-peptide conjugate in which cysteine is introduced at the N-terminus of Exendin 4.

비닐술폰기를 갖는 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 히알루론산 유도체를 제조하고,
상기 제조된 히알루론산 유도체의 비닐술폰기에 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드를 수용액에서 반응시키는 단계를 포함하는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법:
[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 2 및 화학식 3에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.
Preparing a hyaluronic acid derivative of Formula 2 or Formula 3 having a vinylsulfone group,
A method for preparing a hyaluronic acid-peptide conjugate, comprising reacting a water-soluble peptide having a terminal thiol group in an aqueous solution with a vinylsulfone group of the hyaluronic acid derivative prepared above:
(2)

(3)

In Chemical Formulas 2 and 3, n is an integer of 50 to 10,000.

제8항에 있어서,
상기 화학식 2를 갖는 화합물은 히알루론산의 카르복실기에 시스테아민 화합물을 반응시킨 후 디비닐술폰을 추가로 반응시켜 제조된 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법.
The method of claim 8,
The compound having Formula 2 is prepared by reacting a cysteamine compound with a carboxyl group of hyaluronic acid, and then further reacted with divinyl sulfone.

제9항에 있어서,
상기 화학식 2를 갖는 화합물은 히알루론산의 카르복실기에 시스테아민 화합물을 반응시키고 트리스(2-카르복시에틸)포스파인(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)를 반응시켜, 티올기를 갖는 하기 화학식 6의 화합물을 제조하고, 상기 화학식 6의 화합물을 디비닐술폰과 수용액에서 반응시켜 제조되는 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법:
[화학식 6]

상기 화학식 6에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.
10. The method of claim 9,
The compound having the formula (2) is reacted with a cysteamine compound and a tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) to the carboxyl group of the hyaluronic acid, and having a thiol group A method for preparing a hyaluronic acid-peptide conjugate prepared by preparing a compound and reacting the compound of Formula 6 with divinyl sulfone in an aqueous solution:
[Formula 6]

In Chemical Formula 6, n is an integer of 50 to 10,000.

제9항에 있어서,
상기 시스테아민 화합물은 시스테아민, 시스테아민 염, 시스테아민의 전구체, 시스테아민의 유사체, 시스테아민의 유도체, 시스테아민의 접합체 및 시스테아민의 대사 산물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 제조방법.
10. The method of claim 9,
The cysteamine compound is prepared at least one selected from the group consisting of cysteamine, cysteamine salts, precursors of cysteamine, analogs of cysteamine, derivatives of cysteamine, conjugates of cysteamine and metabolites of cysteamine. Way.

제11항에 있어서,
상기 시스테아민 화합물은 시스테아민, 시스테아민 하이드로클로라이드, 시스타민 및 시스타민 디하이드로클로라이드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 제조방법.
The method of claim 11,
The cysteamine compound is at least one selected from the group consisting of cysteamine, cysteamine hydrochloride, cystamine and cystamine dihydrochloride, the production method.

제8항에 있어서,
상기 화학식 2를 갖는 화합물은 하기 화학식 4를 갖는 화합물의 카르복실기와 하기 화학식 5를 갖는 화합물의 아민기를 유기용매에서 반응시켜 제조된 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법:
[화학식 4]

상기 화학식 4에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.
[화학식 5]

The method of claim 8,
The compound having Formula 2 is prepared by reacting a carboxyl group of a compound having Formula 4 with an amine group of a compound having Formula 5 in an organic solvent:
[Chemical Formula 4]

In Formula 4, n is an integer of 50 to 10,000.
[Chemical Formula 5]

제13항에 있어서,
상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법.
The method of claim 13,
The organic solvent is dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (dimethylformamide, DMF), dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) And hexamethylphosphoramide (hexamethylphosphoramide, HMPA) is selected from the group consisting of hyaluronic acid-peptide conjugate.

제8항에 있어서,
상기 화학식 3을 갖는 화합물은 히알루론산을 디비닐술폰과 수용액에서 반응시켜 제조된 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법.
The method of claim 8,
The compound having formula 3 is prepared by reacting hyaluronic acid with divinyl sulfone in an aqueous solution.

제8항에 있어서,
상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드는 펩타이드 말단에 시스테인을 도입한 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법.
The method of claim 8,
The water-soluble peptide having a terminal thiol group is a hyaluronic acid-peptide conjugate production method is a cysteine introduced into the peptide terminal.

제8항에 있어서,
상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드는 엑센딘 4(Exendin 4)의 N-말단에 시스테인을 도입하여 제조된 것인 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법.
The method of claim 8,
The water-soluble peptide having a terminal thiol group is a hyaluronic acid-peptide conjugate manufacturing method prepared by introducing a cysteine to the N- terminal of Exendin 4 (Exendin 4).

제8항에 있어서,
상기 말단 티올기를 갖는 수용성 펩타이드를 상기 히알루론산 유도체 한 분자당 3 내지 60분자로 결합시키는 히알루론산-펩타이드 컨쥬게이트 제조방법.
The method of claim 8,
A method for preparing a hyaluronic acid-peptide conjugate, wherein the water-soluble peptide having the terminal thiol group is bonded at 3 to 60 molecules per molecule of the hyaluronic acid derivative.

하기 화학식 2를 갖는 히알루론산 유도체:
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.Hyaluronic acid derivative having the formula (2)
(2)

In Formula 2, n is an integer of 50 to 10,000.