KR20110140128A

KR20110140128A - 포자-표면 상호작용을 길항하는 화합물을 스크리닝 및 사용하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110140128A
Application number: KR1020117025319A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 알. 마싱가; 제임스 에드먼드 빙햄; 사라 엘. 에드몬즈
Original assignee: 고조 인더스트리즈, 인크
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-12-30
Also published as: AU2010241947A1; WO2010126670A3; JP5911421B2; CN102388064A; AU2010241947B2; BRPI1014121A2; WO2010126670A9; TW201039841A; CA2756760A1; PT2411410E; ES2544435T3; DK2411410T3; EP2411410B1; US20100291100A1; JP2012522010A; EP2411410A2; WO2010126670A2

Abstract

본 발명은 표면에 대한 미생물 포자의 부착을 매개하는 신규한 미생물 단백질 (즉, 예를 들어, 포자외막 유전자 및 단백질)을 코딩하는 유전자를 제공한다. 표면에 대한 미생물 포자의 부착을 억제하는 감염 제어 물질을 제공하기 위해, 이들 미생물 포자 단백질의 특이적인 단편을 이용할 수 있다. 본 발명은 포자외막 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 이들 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 체조직 또는 고체 표면에 대한 세균 포자 부착을 억제하는, 포자외막 단백질을 포함하는 감염 제어 조성물을 확인하기 위한 스크리닝 방법을 본원에서 추가로 제공한다. 추가로, 본 발명은 포자외막 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 및 포자외막 mRNA와 혼성화함으로써 포자외막 단백질 발현의 핵산 억제제의 사용을 제공한다. 본 발명은 포자외막 단백질에 대한 친화도를 갖는 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 추가로 설명한다.

Description

포자-표면 상호작용을 길항하는 화합물을 스크리닝 및 사용하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR SCREENING AND USING COMPOUNDS ANTAGONIZING SPORE-SURFACE INTERACTIONS}

본 발명은 감염 제어 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 방부 상태의 유지, 세균 오염제거, 및/또는 세균 노출 예방을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 기질 표면에 대한 미생물 포자 결합을 억제하는 감염 제어 조성물을 고려한다. 예를 들어, 억제는 기질 표면에 대한 미생물 포자의 상호작용, 부착 및/또는 안정화를 파괴하고/하거나 대체한다.

포자-형성 세균은 병원 감염, 식품 부패 및/또는 식품매개 (food-borne) 병 문제를 포함하고 이로 제한되지 않는 오염의 원인이 될 수 있다. 최소 가공 냉장 제품의 생산이 보다 효율적이고 무균성이 됨에 따라, 배경 미생물총이 제거되고, 궁극적으로 이들 제품의 저장 수명을 제한할 수 있는 것은 포자-형성 유기체이다. 포자-형성 세균은 통조림 식품, 빵, 진공 충진된 고기, 저온살균 유제품, 및 과일 쥬스의 부패의 원인인 것으로 의심된다. 임의의 이들 종류의 제품 내로 도입되는 성분 내에 높은 수준의 세균 포자의 존재는 최종 생성물의 부패 가능성을 증가시킬 수 있다.

의료계 환경에서, 포자-형성 세균은 종종 병원내 감염 설사, 파상풍 및 괴저를 비롯한 감염을 일으킨다. 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile)는 항생제 연관 설사 및 위막성 대장염을 일으키는 포자 형성 혐기성 세균이다. 최근에 원인이 되는 이환율 및 사망률이 증가된 고도 병원성 유행 균주가 출현하여, 상기 병원내 병원체의 중요성이 더욱 증가하였다. 병원 직원-대-환자 감염성 전염의 감소는 회복 시간을 대폭 개선하여, 그에 의해 환자 퇴원을 가속화시키는 것으로 기대될 것이다. 이것은 환자 건강 및 사회 비용 관점 모두에서 유익하다. 미생물 전염을 방지하기 위한 방부제 사용을 증가시키기 위한 의료 사회의 노력에도 불구하고, 환자 감염의 발생 및 재감염은 불필요한 이환율 및 사망률을 일으킨다.

포자를 형성하는 세균은 숙주 세포 내에서 발아하기 전에 수십 년간 휴면 형태로 체류할 수 있고, 식품 산업에 관련되든 의료 실시에 관련되든 예기치 않은 오염의 원인이 될 수 있다. 추가로, 세균 내생포자는 피부 및 표면 소독제에 내성이고, 따라서 현재의 항미생물 수단은 대체로 비효과적이다. 미생물 포자에 의한 숙주에의 부착 및 후속적인 감염을 제거하고/하거나 예방하는 감염 제어 조성물을 스크리닝하기 위한 방법이 필요하다.

<발명의 개요>

본 발명은 감염 제어 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 방부 상태의 유지, 세균 오염제거, 및/또는 세균 노출 예방을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 기질 표면에 대한 미생물 포자 결합을 억제하는 감염 제어 조성물을 고려한다. 예를 들어, 억제는 기질 표면에 대한 미생물 포자의 상호작용, 부착 및/또는 안정화를 길항, 파괴 및/또는 대체한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 기질 표면에 대한 미생물 포자의 결합을 차단 및/또는 억제할 수 있는 감염 제어 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 조성물은 작은 유기 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 포자 표면 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 클로스트리듐 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 바실러스 (Bacillus) 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 펩티드는 서열 1 또는 서열 1의 상동체를 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 펩티드는 서열 3, 서열 5, 서열 7, 및 서열 15를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 조성물은 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 조성물은 합성 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 무기 이온 복합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 단백질 모방체 (mimetic)를 포함한다. 한 실시양태에서, 기질 표면은 무생물 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기질 표면은 생물 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 생물 표면은 체조직 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 체조직 표면은 상피 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 상피 표면은 포유동물 피부 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 스테인레스 스틸을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 세라믹을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 비닐을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 타일을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 세제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 무균이고 인간 투여에 적합하다. 한 실시양태에서, 담체는 항미생물 피부 세정제를 포함한다. 한 실시양태에서, 피부 세정제는 손세척 (handwash) 세정제를 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 항미생물 표면 세정제를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 기질 표면에 대한 미생물 포자의 결합을 차단 및/또는 억제할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 감염 제어 조성물을 고려하고, 여기서 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질에 실질적인 상동성을 갖는다. 한 실시양태에서, 실질적인 상동성은 약 75% 상동성, 바람직하게는 85% 상동성, 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 상동성을 포함한다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 (C. difficile) 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 바실러스 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 비. 안트라시스 (B. anthracis) 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 포자 표면 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 클로스트리듐 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 표면 단백질은 클로스트리듐 디피실레 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 바실러스 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 바실러스 표면 단백질은 바실러스 안트라시스 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 펩티드는 서열 1 또는 서열 1의 상동체를 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 펩티드는 서열 3, 서열 5, 서열 7, 및 서열 15를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 포자 표면 단백질의 C-말단부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 포자 표면 단백질의 N-말단부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 세제를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 인간 투여에 적합한 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 항미생물 피부 세정제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 피부 세정제는 손세척 세정제이다. 한 실시양태에서, 조성물은 항미생물 표면 세정제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 피부 장벽을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 표면 장벽을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 길항 화합물을 포함하는 감염 제어 조성물을 고려하고, 여기서 화합물은 미생물 포자 표면 단백질 아미노산 서열에 대한 친화도를 갖는다. 한 실시양태에서, 친화도는 기질 표면 특이적 결합 부위 영역에 대한 것이다. 한 실시양태에서, 화합물은 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 화합물은 작은 유기 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질 아미노산 서열은 펩티드 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드 단편은 포자 표면 단백질의 C-말단부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 펩티드 단편은 포자 표면 단백질의 N-말단부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 바실러스 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 비. 안트라시스 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 인간 투여에 적합하다. 한 실시양태에서, 조성물은 항미생물 손 세정제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 항미생물 표면 세정제를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 미생물에 노출될 위험이 있는 대상체 (여기서, 노출은 미생물 감염을 일으킬 가능성이 있음); 및 ii) 감염 제어 조성물을 제공하고; b) 조성물을 미생물 노출 전에 대상체에게 미생물 감염 장벽이 형성되도록 하는 조건 하에 투여하는 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 미생물 감염 장벽은 미생물 감염을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 미생물 감염 장벽은 미생물 감염을 방지한다. 한 실시양태에서, 미생물은 세균을 포함한다. 한 실시양태에서, 세균은 클로스트리듐, 바실러스, 데술포토마쿨룸 (Desulfotomaculum), 스포로락토바실러스 (Sporolactobacillus), 스포로사르시나 (Sporosarcina), 또는 써모악티노마이세스 (Thermoactinomyces)를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 세균은 세균 포자를 포함한다. 한 실시양태에서, 세균 포자는 적어도 하나의 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 비. 안트라시스 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질에 실질적인 상동성을 갖는다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 기질 표면에 대한 미생물 포자의 결합을 억제, 길항, 파괴, 대체 및/또는 차단할 수 있다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 길항 화합물을 추가로 포함하고, 여기서 화합물은 미생물 포자 표면 단백질 아미노산 서열에 대한 친화도를 갖는다. 한 실시양태에서, 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 의료계 종사자 (healthcare worker)이다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 의료 최초 반응자 (first responder)이다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 환자이다. 한 실시양태에서, 환자는 의료계 환경 하의 환자이다. 한 실시양태에서, 환자는 적어도 하나의 항생제를 투여받았다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 소방관이다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 경찰관이다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 군인이다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 식품 취급자이다. 한 실시양태에서, 위험이 있는 대상체는 무생물 표면 및/또는 물체이다. 한 실시양태에서, 투여는 국소, 경구, 비경구, 폐, 직장내, 질내, 눈, 또는 비내를 포함하는 군 중에서 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 미생물에 노출된 대상체 (여기서, 노출은 미생물 감염을 일으켰음); ii) 감염 제어 조성물을 제공하고; b) 조성물을 대상체에게 미생물 노출 후에, 미생물 감염이 감소되도록 하는 조건 하에 투여하는 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 미생물은 세균을 포함한다. 한 실시양태에서, 세균은 클로스트리듐, 바실러스, 데술포토마쿨룸, 스포로락토바실러스, 스포로사르시나, 또는 써모악티노마이세스를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 세균은 세균 포자를 포함한다. 한 실시양태에서, 세균 포자는 적어도 하나의 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 비. 안트라시스 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질에 실질적인 상동성을 갖는다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 기질 표면에 대한 미생물 포자의 결합을 억제, 길항, 파괴, 대체 및/또는 차단할 수 있다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 길항 화합물을 추가로 포함하고, 여기서 화합물은 미생물 포자 표면 단백질 아미노산 서열에 대한 친화도를 갖는다. 한 실시양태에서, 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 노출된 대상체는 의료계 종사자이다. 한 실시양태에서, 노출된 대상체는 의료 최초 반응자이다. 한 실시양태에서, 노출된 대상체는 소방관이다. 한 실시양태에서, 노출된 대상체는 경찰관이다. 한 실시양태에서, 노출된 대상체는 군인이다. 한 실시양태에서, 투여는 국소, 경구, 비경구, 폐, 직장내, 질내, 눈, 또는 비내 투여를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 노출된 대상체는 무생물 표면 및/또는 물체이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 미생물 포자 표면 단백질로부터 유래하는 단리된 펩티드; 및 ii) 펩티드와 상호작용을 하는 것으로 의심되는 감염 제어 시험 화합물을 제공하고; b) 펩티드를 감염 제어 시험 화합물과 접촉시키고; c) 펩티드와 감염 제어 시험 화합물의 상호작용을 검출하는 것을 포함하는 스크리닝 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 방법은 단리된 펩티드에 부착할 수 있는 기질을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 기질 표면은 돈피 (pigskin)를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 클로스트리듐 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 디피실레 포자외막 (exosporium)을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 바실러스 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자외막은 바실러스 안트라시스 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 포자 표면 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 펩티드는 서열 1 또는 서열 1의 상동체를 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 펩티드는 서열 3, 서열 5, 서열 7, 및 서열 15를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 감염 제어 시험 화합물은 작은 유기 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 시험 화합물은 합성 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 시험 화합물은 단백질 모방체를 포함한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 시험 화합물은 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 제1 형광 강도 패턴을 생성하는, 단리된 표지된 미생물 포자 표면 펩티드; 및 ii) 상기 펩티드와 상호작용할 수 있는 감염 제어 시험 화합물을 제공하고; b) 상기 펩티드를 상기 화합물과 접촉시켜 제2 형광 강도 패턴을 갖는 접촉된 펩티드를 생성하고; c) 상기 제1 형광 강도 패턴을 제2 형광 강도 패턴과 비교하는 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 방법은 제1 강도 패턴과 제2 강도 패턴 사이의 차이를 검출하는 단계 d)를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 차이는 상기 화합물이 상기 펩티드에 결합함을 나타낸다. 한 실시양태에서, 펩티드는 세균 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 세균 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 세균 포자 표면 단백질은 바실러스 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 바실러스 안트라시스 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 펩티드 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 또는 서열 9를 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 표지는 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 아닐리노나프탈렌 술포네이트 (ANS), 비스-ANS (비스-아닐리노나프탈렌 술포네이트), N-페닐-1-나프탈렌 (NPN), 루테늄 레드, 크레졸 바이올렛, 및 4-(디시아노비닐)줄롤리딘 (DCVJ)으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 재조합 발현 벡터를 포함하는 세균 (여기서, 상기 벡터는 포자 표면 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함함); 및 ii) 감염 제어 활성을 갖는 것으로 의심되는 화합물을 제공하고; b) 포자 표면 단백질이 세균막 상에 디스플레이되도록 상기 벡터를 발현시키고; c) 상기 세균을 상기 화합물과 접촉시키고; d) 상기 화합물의 감염 제어 활성을 검출하는 것을 포함하는, 화합물을 스크리닝하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 활성은 상기 화합물과 상기 디스플레이된 단백질의 결합쌍을 형성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 2를 포함한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 4, 서열 6, 서열 8, 또는 서열 16을 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 리포터 서열을 포함하는 융합 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 리포터 서열은 β-갈락토시다제 서열이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 서열 2의 적어도 일부; 및 ii) 포자 표면 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하고; b) 서열 2 일부 및 샘플을, 서열 2 일부와 포자 표면 올리고뉴클레오티드 서열 사이에 혼성화 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 조합하고; c) 혼성화 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 샘플 내에서 미생물 포자 표면 단백질 유전자의 적어도 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 올리고뉴클레오티드는 미생물 포자로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 포자는 클로스트리듐 종으로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 포자는 바실러스 종으로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 RNA이다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 DNA이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 감염 제어 조성물, 및 세균 포자를 포함하는 기질 표면을 제공하고; 조성물을 표면에 적용하는 (여기서, 포자의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70%, 훨씬 더 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90%, 또는 100%가 표면으로부터 제거됨) 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 표면은 피부, 체조직, 무기 표면 (즉, 예를 들어, 스테인레스 스틸, 화강암, 플라스틱, 타일, 세라믹 등), 장갑, 실험실 코트, 또는 의료 기기로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 감염 제어 조성물, 및 세균 포자 결합의 위험이 큰 기질 표면을 제공하고; 조성물을 표면에 적용하는 (여기서, 세균 포자 결합의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70%, 훨씬 더 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90%, 또는 100%가 방지됨) 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 표면은 피부, 체조직, 무기 표면 (즉, 예를 들어, 스테인레스 스틸, 화강암, 플라스틱, 타일, 세라믹 등) 또는 의료 기기로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) 미생물 포자 단백질을 보유하는 비드를 포함하는 크로마토그래피 컬럼을 제공하고; b) 상기 복수의 감염 제어 조성물을 상기 비드와, 적어도 하나의 상기 감염 제어 조성물이 상기 비드와 결합쌍을 형성하도록 하는 조건 하에 접촉시키고; c) 상기 적어도 하나의 결합된 감염 제어 조성물을 상기 비드로부터 제어가능하게 방출시키고; d) 상기 적어도 하나의 결합된 감염 제어 조성물을 검출하는 것을 포함하는, 미생물 포자 단백질에 대한 결합에 대해 복수의 감염 제어 조성물을 스크리닝하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 상기 결합쌍은 미생물 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 결합된 감염 제어 조성물의 검출은 형광 신호의 생산을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 결합된 감염 제어 조성물의 검출은 효소-기질 생성물의 형성을 포함한다. 한 실시양태에서, 제어가능한 방출 단계는 비드를 방출제 (releasing agent)에 노출시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 방출제는 빛, 산 및 염기로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단백질 모방체 화합물 및 담체를 포함하는 감염 제어 조성물을 고려하고, 여기서 단백질 모방체 화합물은 기질 표면 상에 제1 특이적 결합 부위 패턴을 갖고, 여기서 제1 결합 패턴은 아미노산 서열의 제2 특이적 결합 부위 패턴에 적어도 50% 동일성, 바람직하게는 60% 동일성, 보다 바람직하게는 70% 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 80% 동일성, 가장 바람직하게는 90% 동일성, 또는 100% 동일성을 갖고, 서열은 미생물 포자 표면 단백질에 실질적인 상동성을 갖는다. 한 실시양태에서, 단백질 모방체 화합물은 작은 유기 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질 모방체 화합물은 합성 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질 모방체 화합물은 무기 이온 복합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 바실러스 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 바실러스 포자 표면 단백질은 비. 안트라시스 포자 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질의 C-말단부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 미생물 포자 표면 단백질의 N-말단부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 기질 표면은 생물 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기질 표면은 무생물 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 생물 표면은 체조직 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 체조직 표면은 포유동물 피부 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 스테인레스 스틸을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 세라믹을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 비닐을 포함한다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 타일을 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 세제를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 무균이고 인간 투여에 적합하다. 한 실시양태에서, 조성물은 항미생물 피부 세정제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 항미생물 표면 세정제를 추가로 포함한다.

<정의>

용어 "제약상" 또는 "약물학상 허용되는"은 본원에서 사용될 때, 동물 또는 인간에 투여될 때 이상, 알레르기, 또는 다른 부작용을 일으키지 않는 분자 엔티티 (entity) 및 조성물을 나타낸다.

용어 "제약상 허용되는 담체"는 본원에서 사용될 때, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및 식물유, 코팅, 등장제 및 흡수 지연제, 리포좀, 상업적으로 이용가능한 세척제 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 및 모든 용매 또는 분산 매질을 포함한다. 추가 생물활성 성분은 또한 그러한 담체 내로 포함될 수 있다.

용어 "정제된" 또는 "단리된"은 본원에서 사용될 때, 각종 다른 성분을 제거하기 위해 처리 (즉, 예를 들어, 분획화)된 펩티드 조성물을 나타낼 수 있고, 상기 조성물 실질적으로 그의 발현된 생물학적 활성을 보유한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우에, 상기 명칭은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는; 예를 들어 조성물의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상 (즉, 예를 들어, 중량/중량 및/또는 중량/부피)을 구성하는 조성물을 나타낼 것이다. 용어 "균질성으로 정제된"은 단일 단백질 종 (즉, 예를 들어, SDS-PAGE 또는 HPLC 분석에 기초하여)이 존재하도록 "겉보기 균질성"으로 정제된 조성물을 포함하도록 사용된다. 정제된 조성물은 일부 미량의 불순물이 남을 수 있음을 의미하는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 사용될 때, 용어 "실질적으로 정제된"은 천연 환경으로부터 제거된, 단리된 또는 분리되고, 자연적으로 결합하는 다른 성분이 적어도 60%, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 90%가 존재하지 않는 분자, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열을 나타낸다. 따라서, "단리된 폴리뉴클레오티드"는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드이다.

"핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 본원에서 사용될 때, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편 또는 일부 및 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 나타내고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.

용어 "단리된 핵산"은 본원에서 사용될 때, 그의 천연 상태로부터 제거된 (예를 들어, 세포로부터 제거된, 바람직한 실시양태에서, 다른 게놈 핵산이 없는) 임의의 핵산 분자를 나타낸다.

용어 "기능상 동등한 코돈"은 본원에서 사용될 때, 동일한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈을 나타낸다. 상기 현상은 종종 유전자 코드의 "축퇴 (degeneracy)"로서 언급된다. 예를 들어, 6가지 상이한 코돈이 아미노산 아르기닌을 코딩한다.

용어 "아미노산 서열" 및 "폴리펩티드 서열"은 본원에서 사용될 때, 상호교환가능하고, 아미노산의 서열을 나타낸다.

용어 "포자 표면 단백질"은 본원에서 사용될 때, 임의의 세균 포자 포자외막 단백질으로부터 유래하거나 그에 실질적인 유사성 (즉, 상동성)인 임의의 단백질 또는 펩티드 단편을 나타낸다. 미생물 포자 표면 단백질은 상태가 발아를 유도하기 위해 충분할 때까지 미생물 포자를 무생물 및/또는 생물 표면에 부착 및 고정시키는 역할을 하는 것으로 생각된다.

용어 "로부터 유래하는"은 본원에서 사용될 때, 화합물 또는 서열의 공급원을 나타낸다. 한 측면에서, 화합물 또는 서열은 유기체 또는 특정 종으로부터 유래할 수 있다. 또 다른 측면에서, 화합물 또는 서열은 보다 큰 복합체 또는 서열로부터 유래할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "BclA" 또는 "BclA 폴리펩티드" 또는 "BclA 단백질" 또는 "BclA 상동체"는 임의의 종, 특히 그람 음성, 그람 양성, 호기성, 및 혐기성 세균을 포함하는 세균 종으로부터 얻어진 및 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합의 임의의 공급원으로부터 얻어진, 실질적으로 정제된 바실러스-유사 단백질의 아미노산 서열을 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 클로스트리듐 디피실레 BclA 상동체는 바실러스 안트라시스 BclA 펩티드와 동일한 기능 및 활성을 가질 것이다.

단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 서열 (즉, 예를 들어, 서열 1) 또는 폴리펩티드 서열의 임의의 상동체와 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 서열로서 정의된다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 것이고, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성, 예를 들어, 류신의 이소류신으로의 교체를 갖는다. 보다 드물게, 변이체는 "비-보존적" 변화, 예를 들어, 글리신의 트립토판으로의 교체를 가질 수 있다. 유사한 작은 변동은 또한 아미노산 결실 또는 삽입 (즉, 부가) 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 없애지 않으면서 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기의 종류 및 수를 결정하는 지침은 DNAStar® 소프트웨어를 포함하고 이로 제한되지 않는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 찾을 수 있다.

뉴클레오티드의 "변이체"는 결실, 삽입 및 치환을 가짐으로써 참조 올리고뉴클레오티드와 상이한 신규한 뉴클레오티드 서열로서 규정된다. 이들은 다양한 방법 (예를 들어, 서열결정, 혼성화 분석 등)을 이용하여 검출할 수 있다. 본 정의 내에 클로스트리듐 포자 표면 단백질을 코딩하는 게놈 DNA 서열에 대한 변경 (즉, 예를 들어, 서열 2에 혼성화할 수 있는 제한 효소 단편의 패턴의 변경 (RFLP 분석), 고엄격도 조건 하에 게놈 DNA의 샘플에 혼성화할 수 없는 서열 2의 선택된 단편 (예를 들어, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여), 및 부적합한 또는 예상되지 않은 혼성화, 예를 들어 클로스트리듐 포자 표면 유전자의 정상 염색체 로커스 이외의 로커스에의 혼성화 (예를 들어, 형광 계내 (in situ) 혼성화 (FISH)를 이용하여)에 의해)가 포함된다.

"결실"은 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 부재하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 내의 변화로서 정의된다.

"삽입" 또는 "부가"는 예를 들어, 자연 발생 클로스트리듐 포자 표면 단백질에 비해 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 일으킨 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.

"치환"은 각각 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산에 의한 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 교체로부터 일어난다.

용어 "유도체"는 본원에서 사용될 때, 핵산 또는 아미노산의 임의의 화학적 변형을 나타낸다. 그러한 변형의 예는 알킬, 아실, 또는 아미노기에 의한 수소의 교체일 것이다. 예를 들어, 핵산 유도체는 필수적인 생물학적 특징을 보유하는 폴리펩티드를 코딩할 것이다.

본원에서 사용될 때, 단백질을 언급할 때 용어 "일부" ("주어진 단백질의 일부"에서와 같이)는 그 단백질의 단편을 나타낸다. 단편의 크기는 4개의 아미노산 잔기 내지 전체 아미노산 서열에서 1개의 아미노산이 없는 서열일 수 있다. 예를 들어 "서열 1의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는" 단백질은 전장 클로스트리듐 포자 표면 단백질 및 4개 이상의 아미노산의 그의 단편을 포함한다.

뉴클레오티드 서열을 언급하여 사용될 때 용어 "일부"는 그 뉴클레오티드 서열의 단편을 나타낸다. 단편의 크기는 5개의 뉴클레오티드 잔기 내지 전체 뉴클레오티드 서열에서 1개의 핵산 잔기가 없는 서열일 수 있다.

용어 "생물학적 활성"은 구조, 조절 또는 생화학적 기능을 갖는 임의의 분자를 나타낸다. 예를 들어, 포자 표면 단백질 생물학적 활성은 예를 들어, 포자 표면 단백질 활성이 결여된 세포 (즉, 예를 들어, 포자 표면 단백질 눌 (null) 세포 및/또는 "낙 아웃 (knock out)" 세포)에서 야생형 성장의 회복에 의해 결정할 수 있다. 포자 표면 단백질 활성이 결여된 세포는 많은 방법 (즉, 예를 들어, 점 돌연변이 및 프레임-쉬프트 (shift) 돌연변이)에 의해 생산할 수 있다. 상보성은 포자 표면 단백질 활성이 결여되는 세포를 포자 표면 단백질을 발현하는 발현 벡터, 그의 유도체, 또는 그의 일부로 형질감염시킴으로써 달성된다.

용어 "면역학적 활성"은 적절한 동물 또는 세포에서 특이적 면역 반응을 유도하고/하거나 특이적 항체와 결합하는 천연, 재조합 또는 합성 펩티드 (즉, 예를 들어, 포자 표면 단백질), 또는 그의 임의의 올리고펩티드의 능력을 정의한다.

용어 "항원 결정자"는 본원에서 사용될 때 특정 항체에 의해 인식되는 분자의 일부 (즉, 에피토프)를 나타낸다. 단백질 또는 단백질의 단편이 숙주 동물을 면역화시키기 위해 사용될 때, 단백질의 많은 영역은 단백질 상의 주어진 영역 또는 3차원 구조에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있고; 이들 영역 또는 구조를 항원 결정자로서 칭한다. 항원 결정자는 항체에 결합하기 위해 무손상 (intact) 항원 (즉, 면역 반응을 일으키기 위해 사용된 면역원)과 경쟁할 수 있다.

용어 "면역원", "항원", "면역원성" 및 "항원성"은 동물에 도입될 때 항체를 생성할 수 있는 임의의 물질을 나타낸다. 정의상, 면역원은 적어도 하나의 에피토프 (면역 반응을 일으킬 수 있는 특이적 생화학적 단위)를 함유해야 하고, 일반적으로 더 많이 함유한다. 단백질이 면역원으로서 가장 빈번하게 사용되지만, 단백질과 복합체화된 지질 및 핵산 모이어티 (moiety)는 면역원으로서 작용할 수 있다. 후자의 복합체는 몇 개의 에피토프를 갖는 보다 작은 분자가 단독으로 만족스러운 면역 반응을 자극하지 않을 때 종종 유용하다.

용어 "항체"는 면역원 (항원)에 의해 동물에서 유발된 면역글로불린을 나타낸다. 항체는 면역원 내에 포함된 에피토프에 특이성을 나타내는 것이 바람직하다. 용어 "폴리클로날 항체"는 하나 초과의 클론의 형질 세포로부터 생산된 면역글로불린을 나타내고; 반대로 "모노클로날 항체"는 단일 클론의 형질 세포로부터 생산된 면역글로불린을 나타낸다.

항체 및 단백질 또는 펩티드의 상호작용에 관련하여 사용될 때 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 상호작용이 단백질 상의 특정 구조 (즉, 예를 들어, 항원 결정자 또는 에피토프)의 존재에 의존성임을 의미하고; 즉, 항체는 일반적인 단백질이 아니라 특이적 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 예를 들어, 항체가 에피토프 "A"에 특이적이면, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응물 내에서 에피토프 A (또는 유리된 표지되지 않은 A)를 함유하는 단백질의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.

용어 "재조합 DNA 분자"는 본원에서 사용될 때, 분자 생물학 기술에 의해 함께 연결된 DNA의 세그먼트 (segment)로 구성되는 DNA 분자를 나타낸다.

용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"는 본원에서 사용될 때, 재조합 DNA 분자를 사용하여 발현되는 단백질 분자를 나타낸다.

본원에서 사용될 때, 용어 "벡터" 및 "비히클 (vehicle)"은 하나의 세포로부터 또 다른 세포로 DNA 세그먼트(들)을 전달하는 핵산 분자에 관하여 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "발현 벡터" 또는 "발현 카세트 (cassette)"는 본원에서 사용될 때, 목적하는 코딩 서열, 및 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 적절한 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 나타낸다. 원핵생물에서 발현을 위해 필요한 핵산 서열은 대체로 프로모터 (promoter), 오퍼레이터 (operator) (선택적임) 및 리보솜 결합 부위를 종종 다른 서열과 함께 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.

용어 "작동가능한 조합으로", "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"은 본원에서 사용될 때, 주어진 유전자의 전사 및/또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 유도할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식의 핵산 서열의 연결을 나타낸다. 이 용어는 또한 기능성 단백질이 생산되는 방식의 아미노산 서열의 연결을 나타낸다.

용어 "형질감염"은 본원에서 사용될 때, 세포 내로 외래 DNA의 도입을 나타낸다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 전기천공, 마이크로주사 (microinjection), 리포좀 융합, 리포펙션 (lipofection), 원형질체 (protoplast) 융합, 레트로바이러스 감염, 비오리스틱스 (biolistics) (즉, 입자 충격) 등을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 달성할 수 있다.

본원에서 사용될 때, 용어 "상보성인" 또는 "상보성"은 염기-쌍형성 규칙에 관련된 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" (뉴클레오티드의 서열을 나타내는 상호교환가능한 용어임)에 관하여 사용된다. 예를 들어, 서열 "C-A-G-T"는 서열 "G-T-C-A"에 상보성이다. 상보성은 "부분적" 또는 "전체적"일 수 있다. "부분" 상보성은 하나 이상의 핵산 염기가 염기 쌍형성 규칙에 따라 일치되지 않는 경우이다. 핵산 사이의 "전체" 또는 "완전" 상보성은 각각의 및 모든 핵산 염기가 염기 쌍형성 규칙 하에 또 다른 염기와 일치하는 경우이다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대해 유의한 효과를 갖는다. 이것은 증폭 반응, 및 핵산 사이의 결합에 의존적인 검출 방법에서 특히 중요하다.

용어 "상동성" 및 "상동성인"은 뉴클레오티드 서열에 관하여 본원에서 사용될 때 다른 뉴클레오티드 서열과의 상보성 정도를 나타낸다. 부분적 상동성 또는 완전 상동성 (즉, 동일성)이 존재할 수 있다. 핵산 서열에 부분적 상보성인, 즉, "실질적으로 상동성인" 뉴클레오티드 서열은 완전 상보성 서열이 표적 핵산 서열에 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 억제하는 것이다. 표적 서열에 대한 완전 상보성 서열의 혼성화의 억제는 저엄격도의 조건 하에 혼성화 분석 (서던 (Southern) 또는 노던 (Northern) 블롯, 용액 혼성화 등)을 이용하여 검사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브는 저엄격도의 조건 하에 표적 서열에 대한 완전히 상동성인 서열에 대해 경쟁하고 그의 결합 (즉, 혼성화)을 억제할 것이다. 이것은 저엄격도의 조건이 비-특이적 결합을 허용한다는 것은 아니고; 저엄격도 조건은 서로에 대한 2개의 서열의 결합이 특이적 (즉, 선택적) 상호작용일 것을 요구한다. 비-특이적 결합의 부재는 심지어 부분적인 상보성도 결여되는 (예를 들어, 약 30% 미만의 동일성) 제2 표적 서열의 사용에 의해 시험할 수 있고; 비-특이적 결합의 부재 하에, 프로브는 제2 비-상보성 표적에 혼성화하지 않을 것이다.

용어 "상동성" 및 "상동성인"은 아미노산 서열에 관하여 본원에서 사용될 때 2개의 아미노산 서열 사이의 1차 구조의 동일성 정도를 나타낸다. 그러한 동일성 정도는 각각의 아미노산 서열의 일부, 또는 아미노산 서열의 전체 길이에 관련될 수 있다. "실질적으로 상동성인" 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 50% 동일성, 바람직하게는 적어도 75% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

클로스트리듐 포자 표면 단백질 핵산 서열 (즉, 예를 들어, 서열 2)의 "상동체"인 올리고뉴클레오티드 서열은 본원에서 100 bp 또는 그 이상의 길이의 서열을 비교할 때 서열 2의 서열에 50% 이상의 동일성을 보이는 올리고뉴클레오티드 서열로서 정의된다. 별법으로, 서열 2의 상동체는 생물학적 활성 클로스트리듐 포자 표면 단백질 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열로서 정의된다. 예를 들어, 클로스트리듐 포자 표면 단백질 상동체는 포자 표면 단백질을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열의 일부를 포함할 수 있다.

저엄격도 조건은 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브가 사용될 때 5 x SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄·H₂O 및 1.85 g/l EDTA, pH를 NaOH로 7.4로 조정함), 0.1% SDS, 5x 덴하르트 (Denhardt) 시약 {50x 덴하르트는 500 ml당 5 g Ficoll (타입 400, 파마시아 (Pharmacia)), 5 g BSA (분획 V; 시그마 (Sigma))를 함유한다} 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 이루어지는 용액 중에서 42℃에서 결합 또는 혼성화에 이어 42℃에서 5x SSPE, 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 세척과 동등한 조건을 포함한다. 저엄격도 조건을 포함하기 위해 수많은 동등한 조건을 또한 사용할 수 있고; 프로브의 길이 및 성질 (DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적의 성질 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액 중에 존재하는지 고정된 것인지 등), 및 염 및 다른 성분의 농도 (예를 들어, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재)뿐만 아니라 혼성화 용액의 성분과 같은 인자들은 상기 나열된 조건과 상이하지만 동등한 저엄격도 혼성화의 조건을 생성하기 위해 변할 수 있다. 추가로, 고엄격도의 조건 하에 혼성화를 촉진하는 조건 (예를 들어, 혼성화 및/또는 세척 단계의 온도 증가, 혼성화 용액 내에 포름아미드의 사용 등)을 또한 사용할 수 있다.

본원에서 사용될 때, 용어 "혼성화"는 그에 의해 핵산의 가닥이 염기 쌍형성을 통해 상보성 가닥과 연결되어 혼성화 복합체를 형성하는 임의의 공정을 이용하는 상보성 핵산의 쌍형성에 관하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화의 강도 (즉, 핵산들 사이의 회합의 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도, 사용된 조건의 엄격도, 형성된 하이브리드의 T_m, 및 핵산 내의 G:C 비와 같은 인자에 의해 영향을 받는다.

본원에서 사용될 때 용어 "혼성화 복합체"는 상보성 G 및 C 염기 사이에 및 상보성 A 및 T 염기 사이에 수소 결합의 형성에 의해 2개의 핵산 서열 사이에 형성된 복합체를 나타내고; 이들 수소 결합은 염기 쌓임 (stacking) 상호작용에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 수소 결합 내의 2개의 상보성 핵산 서열은 역평행 입체형상이다. 혼성화 복합체는 용액 내에서 (예를 들어, C₀t 또는 R₀t 분석) 또는 용액 내에 존재하는 하나의 핵산 서열과 고체 지지체 (예를 들어, 서던 및 노던 블로팅, 도트 (dot) 블로팅에서 사용되는 나일론 막 또는 니트로셀룰로스 필터, 또는 FISH (형광 계내 혼성화)를 비롯한 계내 혼성화에 사용되는 유리 슬라이드)에 고정된 또 다른 핵산 서열 사이에 형성될 수 있다.

본원에서 사용될 때, 용어 "T_m"은 "용융 온도"에 관하여 사용된다. 용융 온도는 이중-가닥 핵산 분자의 집단의 절반이 단일 가닥으로 해리되는 온도이다. 표준 참조문에 지시된 바와 같이, T_m 값의 간단한 추정치는 다음 식에 의해 계산할 수 있다: T_m = 81.5 + 0.41 (% G+C), 여기서 핵산은 1M NaCl에서 수용액 내에 존재한다 (Anderson et al., "Quantitative Filter Hybridization" In: Nucleic Acid Hybridization (1985)). 보다 정교한 컴퓨터 계산에서는 T_m의 계산을 위해 구조적 및 서열 특징을 고려한다.

본원에서 사용될 때 용어 "엄격도"는 핵산 혼성화가 수행되는, 온도, 이온 강도, 및 유기 용매와 같은 다른 화합물의 존재의 조건에 관하여 사용된다. "엄격도"는 대개 약 T_m 내지 T_m의 약 20℃ 내지 25℃ 미만 범위에서 발생한다. "엄격한 혼성화"는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 확인 또는 검출하기 위해 또는 유사한 또는 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 확인 또는 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 2의 단편이 엄격한 조건 하에 혼성화 반응에서 사용될 때, 특유한 서열 (즉, 서열 2에 비-상동성인 또는 서열 2와 약 50% 미만의 상동성을 함유하는 영역)을 함유하는 서열 2의 단편의 혼성화가 유리하다. 별법으로, "약한" 또는 "저" 엄격도의 조건이 사용될 때, 혼성화는 유전적 다양성인 유기체로부터 유래한 핵산을 사용하여 일어날 수 있다 (즉, 예를 들어, 상보성 서열의 빈도는 그러한 유기체 사이에 대체로 낮음).

본원에서 사용될 때, 용어 "증폭가능한 핵산"은 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산에 관하여 사용된다. "증폭가능한 핵산"은 대체로 "샘플 주형"을 포함할 것으로 고려된다.

본원에서 사용될 때, 용어 "샘플 주형"은 관심있는 표적 서열의 존재에 대해 분석되는 샘플로부터 기원하는 핵산을 나타낸다. 이와 반대로, "배경 주형"은 샘플 내에 존재할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 샘플 주형 이외의 핵산에 관하여 사용된다. 배경 주형은 가장 종종 비의도적으로 존재하는 것이다. 배경 주형은 이월 (carryover)의 결과일 수 있거나, 샘플로부터 정제되어야 할 핵산 오염물의 존재 때문일 수 있다. 예를 들어, 검출할 것 이외의 유기체로부터의 핵산은 시험 샘플 내에 배경으로서 존재할 수 있다.

"증폭"은 추가의 카피의 핵산 서열의 생산으로서 정의되고, 일반적으로 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 수행된다 (Dieffenbach C. W. and G. S. Dveksler (1995) In: PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y).

본원에서 사용될 때, 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR")은 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 내에서 표적 서열의 세그먼트의 농도를 증가시키는 방법을 설명하는, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 4,683,195 및 4,683,202 (K.B. Mullis)의 방법을 나타낸다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 세그먼트의 길이는 서로에 관하여 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (primer)의 상대적인 위치에 의해 결정되고, 따라서, 상기 길이는 제어가능한 파라미터이다. 공정의 반복되는 측면 때문에, 방법을 "중합효소 연쇄 반응" (이하 "PCR")로서 언급한다. 표적 세포의 목적하는 증폭된 세그먼트가 혼합물 내에서 주요 서열 (농도 면에서)이 되므로 이들이 "PCR 증폭된" 것으로 말해진다. PCR을 이용하여, 게놈 DNA 내의 특이적 표적 서열의 단일 카피를 몇몇 상이한 방법 (예를 들어, 표지된 프로브와의 혼성화; 비오티닐화 프라이머의 혼입 후 아비딘-효소 접합체 검출; 증폭된 세그먼트 내로 ³²P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예를 들어 dCTP 또는 dATP의 혼입)에 의해 검출가능한 수준으로 증폭하는 것이 가능하다. 게놈 DNA에 추가로, 적절한 세트의 프라이머 분자를 사용하여 임의의 올리고뉴클레오티드 서열을 증폭시킬 수 있다. 특히, PCR 공정 자체에 의해 생성된 증폭된 세그먼트는 후속적인 PCR 증폭을 위한 효율적인 주형이다.

본원에서 사용될 때, 용어 "프라이머"는 핵산 가닥에 상보성인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 놓일 때 (즉, 뉴클레오티드 및 유도제, 예를 들어 DNA 중합효소의 존재 하에 및 적합한 온도 및 pH에서) 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는, 정제된 제한 소화물로서 자연 발생하거나 합성 방식으로 생산되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머는 증폭의 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 별법으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우에, 프라이머는 그의 가닥을 분리하기 위해 먼저 처리된 후, 연장 생성물을 제조하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하에 연장 생성물의 합성을 프라이밍하기 위해 충분하게 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법의 사용을 비롯한 많은 인자에 따라 결정될 것이다.

본원에서 사용될 때, 용어 "프로브"는 관심있는 또 다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는, 정제된 제한 소화물로서 자연 발생하거나 재조합 또는 PCR 증폭에 의해 합성 방식으로 생산되는 올리고뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드의 서열)을 나타낸다. 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용된 임의의 프로브는 임의의 "리포터 (reporter) 분자"로 표지될 것으로 고려되고, 따라서 효소 (예를 들어, ELISA 및 효소-기반 조직화학 분석), 형광, 방사성, 및 발광 시스템을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 검출 시스템에서 검출가능하다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 사용될 때, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 각각 이중-가닥 DNA를 특이적 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 부근에서 절단하는 세균 효소를 나타낸다.

모노뉴클레오티드는 하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 연결을 통해 한 방향으로 그의 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 반응하기 때문에, DNA 분자는 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 갖는 것으로 말해진다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 단부는 그의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않으면 "5' 단부"로서 언급한다. 올리고뉴클레오티드의 단부는 그의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않으면 "3' 단부"로서 언급한다. 본원에서 사용될 때, 핵산 서열은 더 큰 올리고뉴클레오티드에 내부에 있더라도 또한 5' 및 3' 단부를 갖는 것으로 말해질 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소는 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'에 있는 것으로 언급된다. 상기 용어는 전사가 DNA 가닥을 따라 5'에서 3' 양식으로 진행한다는 사실을 반영한다. 연결된 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소는 일반적으로 코딩 영역의 5' 또는 상류에 위치한다. 그러나, 인핸서 요소는 프로모터 요소 및 코딩 영역의 3'에 위치할 때에도 그 효과를 발휘할 수 있다. 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호는 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드"는 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열, 즉, 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중-가닥일 수 있다. 적합한 제어 요소, 예를 들어 인핸서/프로모터, 스플라이스 연결부 (splice junction), 폴리아데닐화 신호 등이 전사의 적합한 개시 및/또는 1차 RNA 전사체의 정확한 처리를 허용하기 위해 필요한 경우에 유전자의 코딩 영역에 밀접하게 근접하게 위치할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 스플라이스 연결부, 개재 서열, 폴리아데닐화 신호 등 또는 내인성 및 외인성 제어 요소 모두의 조합을 함유할 수 있다.

본원에서 사용될 때, 용어 "조절 요소"는 핵산 서열의 발현의 일부 측면을 제어하는 유전자 요소를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사의 개시를 촉진하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 스플라이싱 (splicing) 신호, 폴리아데닐화, 종결 신호 등이다.

진핵생물에서 전사 제어 신호는 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여되는 세포성 단백질과 특이적으로 상호작용하는 DNA 서열의 짧은 어레이 (array)로 이루어진다 (Maniatis, T. et al., Science 236: 1237 (1987)). 프로모터 및 인핸서 요소는 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포 및 바이러스 내의 유전자를 포함하는 다양한 진핵생물 공급원으로부터 단리되었다 (유사한 제어 요소, 즉, 프로모터는 또한 원핵생물에서 발견됨). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 어떠한 세포 종류가 관심있는 단백질을 발현시키기 위해 사용될 것인지에 따라 결정된다.

발현 벡터 상의 "스플라이싱 신호"의 존재는 종종 재조합 전사체의 보다 높은 수준의 발현을 일으킨다. 스플라이싱 신호는 1차 RNA 전사체로부터 인트론의 제거를 매개하고, 스플라이스 공여자 (donor) 및 수용자 (acceptor) 부위로 이루어진다 (Sambrook, J. et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.7-16.8). 흔히 사용되는 스플라이스 공여자 및 수용자 부위는 SV40의 16S RNA로부터의 스플라이스 연결부이다.

용어 "폴리 A 부위" 또는 "폴리 A 서열"은 본원에서 사용될 때, 발생기 (nascent) RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화를 모두 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리 A 꼬리가 결여되는 전사체는 불안정하고 급속하게 파괴되므로, 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에 사용되는 폴리 A 신호는 "이종성" 또는 "내인성"일 수 있다. 내인성 폴리 A 신호는 게놈 내에서 주어진 유전자의 코딩 영역의 3' 단부에서 자연적으로 발견되는 것이다. 이종성 폴리 A 신호는 하나의 유전자로부터 단리되어 또 다른 유전자의 3'에 배치된 것이다. 진핵 세포 내에서 재조합 DNA 서열의 효율적인 발현은 생성되는 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 신호의 발현을 수반한다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되고, 수백 개의 뉴클레오티드 길이이다.

용어 "형질감염" 또는 "형질감염된"은 세포 내로 외래 DNA의 도입을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, 용어 "코딩하는 핵산 분자", "코딩하는 DNA 서열" 및 "코딩하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따른 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 나타낸다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, DNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "안티센스"는 특이적 RNA 서열 (예를 들어, mRNA)에 상보성인 RNA 서열에 관하여 사용된다. 안티센스 RNA는 관심있는 유전자(들)을 코딩 가닥의 합성을 허용하는 바이러스 프로모터에 역방향으로 스플라이싱함에 의한 합성을 비롯한 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 일단 세포 내로 도입되면, 전사된 가닥은 세포에 의해 생산된 천연 mRNA와 조합하여 이중체를 형성한다. 이어서, 이들 이중체는 mRNA의 추가 전사 또는 그의 번역을 차단한다. 상기 방식으로, 돌연변이체 표현형이 생성될 수 있다. 용어 "안티센스 가닥"은 "센스" 가닥에 상보성인 핵산 가닥에 관하여 사용된다. 기호 (-) (즉, "음성")은 때때로 안티센스 가닥에 관하여 사용되고, 기호 (+)는 때때로 센스 (즉, "양성") 가닥에 관하여 사용된다.

용어 "서던 블롯"은 크기에 따라 DNA를 분획화한 후 겔로부터 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 DNA를 전달 및 고정화하기 위한 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 상에서의 DNA의 분석을 나타낸다. 이어서, 고정화된 DNA를 사용된 프로브에 상보성인 DNA 종을 검출하기 위해 표지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 프로브 또는 DNA 프로브로 프로빙한다. DNA를 전기영동에 앞서 제한 효소로 절단할 수 있다. 전기영동 후에, DNA를 고체 지지체에 전달하기 전에 또는 전달하는 동안 부분적으로 퓨린제거하고 변성시킬 수 있다. 서던 블롯은 분자 생물학자의 표준 도구 (tool)이다 (J. Sambrook et al. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58).

용어 "노던 블롯"은 본원에서 사용될 때, 크기에 따라 RNA를 분획화한 후 겔로부터 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 RNA로 전달하기 위한 아가로스 겔 상에서 RNA의 전기영동에 의한 RNA의 분석을 나타낸다. 이어서, 고정화된 RNA를 사용된 프로브에 상보성인 RNA 종을 검출하기 위해 표지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 프로브 또는 DNA 프로브로 프로빙한다. 노던 블롯은 분자 생물학자의 표준 도구이다 (J. Sambrook, et al. (1989) 상기 문헌, pp 7.39-7.52).

용어 "역 (reverse) 노던 블롯"은 본원에서 사용될 때, 크기에 기초하여 DNA를 분획화한 후 분획화된 DNA를 겔로부터 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 전달하기 위한 아가로스 겔 상에서 DNA의 전기영동에 의한 DNA의 분석을 나타낸다. 이어서, 고정화된 DNA를 사용된 리보 프로브에 상보성인 DNA 종을 검출하기 위해 표지된 올리고리보뉴클레오티드 프로브 또는 RNA 프로브로 프로빙한다.

본원에서 사용될 때 용어 "코딩 영역"은 구조 유전자에 관하여 사용될 때, mRNA 분자의 번역의 결과로서 발생기 폴리펩티드 내에서 발견되는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 코딩 영역에는 진핵생물에서 5' 측면 상에서 개시인자 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 삼중체 "ATG"에 의해 및 3' 측면 상에서 중지 코돈를 명시하는 3개의 삼중체 (즉, TAA, TAG, TGA) 중 하나가 결합된다.

본원에서 사용될 때, 용어 "구조 유전자"는 RNA 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. 이와 반대로, "조절 서열"는 다른 유전자의 발현을 제어하는 생성물 (예를 들어, 전사 인자)을 코딩하는 구조 유전자이다.

본원에서 사용될 때, 용어 "유전자"는 구조 유전자의 코딩 영역을 포함하고, 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록 양단부 상에 약 1 kb의 거리 사이에 5' 및 3' 단부 모두 상에 코딩 영역에 인접하게 위치하는 서열을 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비-번역 서열로서 칭한다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비-번역 서열로서 칭한다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 형태의 유전자를 모두 포함한다. 게놈 형태 또는 클론의 유전자는 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 명명된 비-코딩 서열이 개입되어 있는 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 불균질 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 세그먼트이고; 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 함유한다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거 또는 "스플라이싱"되고; 따라서, 인트론은 메신저 RNA (mRNA) 전사체에는 부재한다. mRNA는 번역 동안 발생기 폴리펩티드에서 아미노산의 서열 또는 순서를 명시하는 기능을 한다.

인트론을 함유한 것에 추가로, 게놈 형태의 유전자는 RNA 전사체 상에 존재하는 서열의 5' 및 3' 단부 모두 상에 위치하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 이들 서열은 "측면 (flanking)" 서열 또는 영역으로서 칭한다 (이들 측면 서열은 mRNA 전사체 상에 존재하는 비-번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치함). 5' 측면 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 영향을 미치는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 3' 측면 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.

용어 "샘플"은 본원에서 사용될 때 그의 가장 넓은 의미로 사용되고, 환경적 및 생물학적 샘플을 포함한다. 환경적 샘플은 토양 및 물과 같은 환경으로부터의 물질을 포함한다. 생물학적 샘플은 동물, 예를 들어, 인간, 유체 (예를 들어, 혈액, 혈장 및 혈청), 고체 (예를 들어, 대변), 조직, 액체 식품 (예를 들어, 우유), 및 고체 식품 (예를 들어, 채소)일 수 있다. 포자 표면 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 세포, 조직 추출물, 체액, 세포로부터 단리된 염색체 또는 염색체외 요소, 게놈 DNA (용액 내에 또는 서던 블롯 분석을 위한 것과 같은 고체 지지체에 결합된), RNA (용액 내에 또는 노던 블롯 분석을 위한 것과 같은 고체 지지체에 결합된), cDNA (용액 내에 또는 고체 지지체에 결합된) 등을 포함할 수 있다.

용어 "감염 제어 조성물"은 조성물의 부재 하에 유기체의 성장 속도에 비해 유기체 (즉, 예를 들어, 미생물 유기체로부터 유래한 포자를 비롯한 미생물 유기체)의 성장 속도를 방지 및/또는 감소시키는 임의의 화합물(들)을 나타낸다. 감염 제어 조성물은 천연 (예를 들어, 세균, 바이러스, 진균, 조류 (algae), 곰팡이 (mold) 등과 같은 미생물로부터 유래한), 합성, 또는 재조합의 것일 수 있다. 감염 제어 조성물은 미생물 포자 단백질 및/또는 미생물 포자 표면 단백질의 경쟁적 억제제일 수 있다. 별법으로, 감염 제어 조성물은 미생물 포자 단백질 및/또는 미생물 포자 표면 단백질과 안정한 및/또는 일시적인 결합쌍을 형성할 수 있다. "감염 제어 조성물"은 항세균 및/또는 항미생물제 및/또는 약물 (즉, 예를 들어, 항생제)을 또한 추가로 포함할 수 있다. 결과적으로, "감염 제어 활성"은 표면에 대한 감염 제어 조성물의 적용의 결과로서 미생물 성장의 임의의 감소 및/또는 방지를 의미하는 것으로 해석된다.

용어 "항균" 및 "항미생물"은 조성물의 부재 하에 유기체의 성장 속도에 비해 유기체의 성장 속도를 방지 및/또는 감소시키는 조성물을 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다. 항세균 및/또는 항미생물 조성물은 정균성, 살균성, 둘 모두이거나 둘 다 아닐 수 있다. 항세균 및/또는 항미생물 조성물은 억제된 세포의 생활력을 해치지 않으면서 세포 분할을 억제하면 정균성이다. 항세균 및/또는 항미생물 조성물은 세포 사멸을 일으키면 살균성이다. 세포 사멸은 액체 성장 배지 (예를 들어, 혼탁도 (turbidity)의 부재) 내에서 또는 고체 표면 (예를 들어, 한천 (agar) 상의 콜로니 형성의 부재)상에서 세포 성장의 부재에 의해 일반적으로 검출된다. 항세균 및/또는 항미생물 조성물은 바이러스, 곰팡이, 및 진균에 대해 성장 속도를 감소시키고/시키거나 세포 사멸을 일으키기 위해 효과적일 수 있다. 주어진 농도에서 정균성인 조성물은 보다 고농도에서 살균성일 수 있는 한편, 다른 특정 정균 조성물은 어떠한 농도에서도 살균성이 아니다.

용어 "세균"은 원핵생물계 (Procaryotae) 내의 모든 문 (phyla) 내의 것을 비롯한 모든 원핵 유기체를 나타낸다. 이 용어는 클로스트리듐, 바실러스, 마이코플라스마 (Mycoplasma), 클라미디아 (Chlamydia), 악티노마이세스 (Actinomyces), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 및 리케치아 (Rickettsia)를 포함하고 이로 제한되지 않는 세균인 것으로 간주되는 모든 미생물을 포함하는 것으로 의도된다. 구균, 간균, 스피로헤타 (spirochete), 스페로플라스트 (spheroplast), 원형질체, 포자 등을 비롯한 모든 형태의 세균이 상기 정의 내에 포함된다. 그람 음성 또는 그람 양성인 원핵 유기체가 또한 상기 용어 내에 포함된다. "그람 음성" 및 "그람 양성"은 그람-염색 방법을 이용한 염색 패턴을 나타낸다 (Finegold and Martin, In: Diagnostic Microbiology. 6th Ed. (1982), C.V. Mosby St. Louis, pp 13-15). "그람 양성 세균"은 그람 염색에 사용된 1차 염료를 보유하여, 염색된 세포가 현미경 하에 암청색 내지 보라색으로 보이는 세균이다. "그람 음성 세균"은 그람 염색에 사용된 1차 염료를 보유하지 않지만, 대비 (counter) 염색에 의해 염색된다. 따라서, 그람 음성 세균은 적색으로 보인다.

용어 "시험 물질"은 본원에 기재된 하나 이상의 분석으로 스크리닝할 물질을 나타낸다. 물질은 실질적으로 임의의 화학적 화합물일 수 있다. 물질은 단일의 단리된 화합물로서 존재할 수 있거나, 화학적 (예를 들어, 조합) 라이브러리의 구성원일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 시험 물질은 작은 유기 분자일 것이다.

용어 "작은 유기 분자"는 본원에서 사용될 때, 약품에서 일반적으로 사용되는 유기 분자에 대등한 크기의 임의의 분자를 나타낸다. 이 용어는 생물학적 거대분자 (예를 들어, 단백질, 핵산 등)를 배제한다. 바람직한 작은 유기 분자의 크기는 약 10 Da 내지 약 5000 Da 이하 범위, 보다 바람직하게는 2000 Da 이하, 가장 바람직하게는 약 1000 Da 이하이다.

용어 "표지" 또는 "검출가능한 표지"는 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 나타내도록 본원에서 사용된다. 그러한 표지는 표지된 스트렙타비딘 접합체로 염색하기 위한 비오틴, 자성 비드 (예를 들어, 다이나비드 (Dynabead)®), 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드 (texas red), 로다민, 초록 형광 단백질 등), 방사성 표지 (예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²P), 효소 (예를 들어, 호스 래디시 페록시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에서 흔히 사용되는 다른 것), 및 비색 표지, 예를 들어 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 그러한 표지의 사용을 교시하는 특허는 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241 (모두 본원에 참고로 포함됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 고려되는 표지는 많은 방법에 의해 검출할 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 사진 필름 또는 섬광 계수기를 사용하여 검출할 수 있고, 형광 마커는 방출된 빛을 검출하기 위해 광검출기를 사용하여 검출할 수 있다. 효소적 표지는 대개 효소에 기질을 제공하고 기질에 대한 효소의 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출하고, 비색 표지는 단순히 착색된 표지를 가시화함으로써 검출한다.

용어 "1차 계면활성제"는 본원에서 사용될 때, 치환된 페놀의 감염 제어 활성을 추가로 향상시키거나 적어도 유의하게 감소시키지 않도록 치환된 페놀에 대해 작용하거나 그와 함께 작용하는 임의의 계면활성제를 의미한다.

용어 "억제하다", "파괴하다", "대체하다", "길항하다", 또는 "차단하다"는 본원에서 사용될 때 미생물 포자 및/또는 미생물 포자 표면 단백질이 기질 표면으로부터 제거되고/되거나 그에 부착하는 것이 방지되는 임의의 수단을 나타낸다.

용어 "길항제"는 본원에서 사용될 때, 표면에 대한 미생물 (즉, 예를 들어, 세균, 바이러스, 곰팡이, 진균 등) 및/또는 미생물의 생식 성분 (즉, 예를 들어, 포자)의 부착을 방지할 수 있는 임의의 화합물을 나타낸다. '길항제'는 경쟁적 대체에 의해 또는 미생물 및/또는 미생물의 생식 성분과 결합쌍 (즉, 예를 들어, 안정한 또는 일시적인)을 형성함으로써 부착을 방지할 수 있다. 예를 들어, 길항제는 포자 표면 단백질에 결합함으로써 표면에 대한 세균 포자의 부착을 방지할 수 있다.

용어 "결합 길항제"는 본원에서 사용될 때, 미생물 포자 보풀 (nap) 층 단백질 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 포자 표면 단백질) 또는 기질 표면과 결합쌍을 형성할 수 있는 화합물을 임의의 나타낸다. 결합쌍의 형성은 기질 표면에 대한 미생물 포자의 부착을 방지 및/또는 대체한다.

용어 "기질 표면"은 본원에서 사용될 때, 미생물 포자 표면 단백질 부착을 위한 결합 부위를 포함하는 임의의 물질을 나타낸다. 기질 표면은 생물 표면 및/또는 무생물 표면을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

용어 "무생물 표면"는 본원에서 사용될 때, 임의의 비-생물 물질을 나타낸다. 예를 들어, 무생물 표면은 비닐, 스테인레스 스틸, 플라스틱, 나무, 세라믹, 유리, 크롬, 타일 등을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 조리대, 의자, 탁자, 수술 장비, 의료 장치, 마루, 벽, 창문, 싱크대, 캐비넷 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 그러한 표면은 흔히 마주친다.

용어 "생물 표면"는 본원에서 사용될 때, 임의의 생물 물질을 나타낸다. 예를 들어, 생물 표면은 표피 피부 표면, 점막 상피 조직 표면, 및/또는 내부 장기 표면을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본원에서 사용될 때, 용어 "생물 표면"은 또한 과일 표면 (즉, 예를 들어, 딸기, 사과, 오렌지, 귤 등), 채소 표면 (가지, 호박, 토마토, 감자 등), 콩과식물 표면 (즉, 예를 들어, 땅콩, 캐슈 (cashew), 콩 등), 곡물 표면 (즉, 예를 들어, 밀, 대두, 쌀, 호밀 등), 꽃 표면, 줄기 표면, 잎자루 표면, 잎 표면, 나무껍질 표면, 큰 가지 표면, 작은 가지 표면 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 식물 표면을 포함한다.

용어 "상호작용 길항제"는 본원에서 사용될 때, 미생물 포자 보풀층 단백질/기질 표면 결합쌍의 형성을 저해할 수 있는 임의의 화합물을 나타낸다.

용어 "결합"은 본원에서 사용될 때, 감염 제어 조성물 및 표면 사이의 임의의 상호작용을 나타낸다. 그러한 표면은 "결합 표면"으로서 정의한다. 결합은 가역적이거나 비가역적일 수 있다. 그러한 결합은 비-공유 결합, 공유 결합, 이온성 결합, 반 데어 발스 (Van de Waals)력 또는 마찰 등일 수 있고 이로 제한되지 않는다. 감염 제어 조성물은 함침시키거나, 포함되거나, 코팅되거나, 현탁 상태이거나, 용액이거나, 혼합되는 등의 상태이면 표면에 결합되는 것이다.

용어 "감염 제어 시험 조성물"은 본원에서 사용될 때, 표면에 대한 미생물 포자 결합을 방지하는 능력에 대해 스크리닝할 화합물의 다양한 컬렉션 (collection)을 나타낸다. 그러한 시험 조성물은 매우 다양한 상이한 화합물, 예를 들어 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 예를 들어, 다당류, 작은 유기 또는 무기 분자, 생물학적 거대분자, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 핵산, 또는 세균, 식물, 진균, 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터의 추출물, 자연 발생 또는 합성 조성물을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다.

용어 "위험이 있는"은 본원에서 사용될 때, 미생물로 오염될 확률이 평균 초과 (즉, 50% 초과)인 임의의 사람 또는 무생물 표면을 나타낸다. 노출 '위험이 있는' 확률은 소방관, 경찰관, 응급 의료진을 포함하고 이로 제한되지 않는 최초 반응자와 같은 직업에서 볼 수 있다. 노출 '위험이 있는' 확률은 의사, 간호사, 잡역부, 병원 수위 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 의료계 종사자와 같은 직업에서도 볼 수 있다. 노출 '위험이 있는' 확률은 육군, 해군, 공군, 해병, 주방위군, 해안경비대원을 포함하고 이로 제한되지 않는 군인과 같은 직업에서도 볼 수 있다. 노출 '위험이 있는' 확률은 면역손상 환자, 화상 환자, 총상 환자 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 환자에서도 볼 수 있다.

용어 "특이적 결합 부위 패턴"은 본원에서 사용될 때, 체표면 또는 무생물 표면 상의 임의의 재현가능한 세트의 결합 부위를 나타낸다. 그러한 결합 부위는 본원에 논의된 바와 같은 미생물 포자, 감염 제어 조성물, 또는 작은 유기 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는 조성물에 대한 고유 친화도를 갖는다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 그러한 결합 패턴은 조성물과 3차원상 적합성인 (즉, 예를 들어, 입체특이적 화학기 상호작용을 통해) 표면 화학기 및/또는 지형학의 특유한 배열의 결과인 것을 생각된다. 특이적 결합 부위 패턴은 지정된 표면 영역 내에서 비-특이적 결합 (즉, 전용 수용체를 통해 매개되지 않은 결합)의 배열을 예측하는 것으로 또한 생각된다.

도 1은 긴, 파형, 또는 실모양 포자외막 돌출부 (projection) (화살표)를 갖는 씨. 스포로게네스 (C. sporogenes) 내생포자 (S)의 예시적인 주사 전자 현미경사진을 제시한다. 표면을 대면하는 돌출부가 끈질긴 접촉을 형성한다.
도 2는 활성화 전에 평탄한 표면의 타원형 내생포자 (삽입부), 및 활성화 후에 포자외막 돌출부 (화살표)로 덮인 씨. 디피실레 43594를 보여주는 예시적인 전자 현미경사진을 제시한다.
도 3은 포자외막이 낮은 돌기들 (bump) 및 하나의 막대에서 두꺼운 고정 구조 (꼬리 (T) 영역으로 지정됨)로 덮인, 발아가 진행할 때 씨. 디피실레 43594 포자를 보여주는 예시적인 전자 현미경사진을 제시한다.
도 4는 18 kDa 밴드 (화살표 참조) 내에 존재하는 전체 포자 단백질을 확인하는 SDS-PAGE 겔을 보여주는 예시적인 데이타를 제시한다. 상기 18 kDa 밴드는 씨. 디피실레 항체에 혼성화할 수 있는 웨스턴 블롯 (Western Blot) 18 kDa 밴드에 상응한다.
도 5는 140, 150, 및 160 kDa 밴드 (각각 p1, p2, 및 p3 참조) 내에 존재하는 전체 포자 단백질을 확인하는 SDS-PAGE 겔을 보여주는 예시적인 데이타를 제시한다. 이들 140, 150, 및 160 kDa 밴드는 씨. 디피실레 항체에 혼성화할 수 있는 웨스턴 블롯 140, 150, 및 160 kDa 밴드에 상응한다.
도 6A는 약 300 kDa (화살표 1); 275 kDa (화살표 2); 250 kDa (화살표 3); 160 kDa (화살표 4); 150 kDa (화살표 5); 140 kDa (화살표 6); 35 kDa (화살표 7); 28 kDa (화살표 8); 및 15 kDa (화살표 9)에서 씨. 디피실레 포자외막 단백질을 확인하기 위해 사용된 SDS-PAGE 겔을 보여주는 예시적인 데이타를 제시한다. 비-면역반응성 포자외막 단백질을 결정하기 위해 6개의 다른 비-혼성화 밴드 (화살표 10-15)가 또한 확인되었다.
도 6B 및 6C는 도 6A에 도시된 밴드에 상응하는 300 kDa (화살표 1); 275 kDa (화살표 2); 250 kDa (화살표 3); 160 kDa (화살표 4); 150 kDa (화살표 5); 140 kDa (화살표 6); 35 kDa (화살표 7); 28 kDa (화살표 8); 및 15 kDa (화살표 9) 밴드에 대한 씨. 디피실레 항체 혼성화를 입증하는 웨스턴 블롯을 보여주는 예시적인 데이타를 제시한다.
도 7은 BclA (초록색) 및 Clq (연보라색) 단량체 (각각 A 및 B) 및 그들의 중첩 (C)에 대한 구조의 하나의 실시양태를 제공한다. N 및 C 말단 및 β-가닥을 표지한다.
도 8은 측면으로부터 및 위로부터 본 BclA (A) 및 Clq (B) 삼량체의 하나의 실시양태를 제공한다. 각각의 삼량체를 구성하는 3개의 단량체를 청색, 초록색 및 적색으로 표시한다.
도 9A는 포자외막을 보여주는 비. 세레우스 (B. cereus) ATCC 10876 포자의 예시적인 투과 전자 현미경사진을 제공한다.
도 9B는 포자외막으로부터 돌출하는 보풀층을 보여주는 비. 안트라시스 포자의 예시적인 투과 전자 현미경사진을 제공한다.
도 9C는 BclA 보풀층 및 내부 기저층 (basal layer)을 보여주는 비. 안트라시스 포자외막층의 예시적인 근접사진을 제공한다.
도 10은 표면 기질 (즉, 예를 들어, 피부 표면)과 미생물 포자 상호작용을 보여주는 실시양태의 예시를 제공한다.
도 10A는 포유동물 피부의 상피층에 대한 미생물 포자 보풀층의 부착 (즉, 예를 들어, 포자 표면 단백질 돌출부에 의한)을 예시한다.
도 10B는 표면 기질에 대한 미생물 포자 표면 단백질 (즉, 예를 들어 천연형) 및 표면 기질에 대한 미생물 포자 표면 단백질의 부착을 파괴할 수 있는 각종 감염 제어 조성물의 부착을 예시한다.
도 11은 포자 표면 단백질 유전자를 포함하는 pET-19b 플라스미드의 하나의 실시양태의 개략도를 제공한다.
도 12는 pET-19b 벡터로부터 재조합 CD1067 (적색 화살표) 발현을 보여주는 SDS-PAGE 전기영동적 분리를 보여주는 예시적인 데이타를 제공한다. 레인 1: MW 표준물 래더 (ladder). 레인 2: 1시간 샘플. 레인 3: 2시간 샘플. 레인 4: 3시간 샘플. 레인 5: 4시간 샘플. 레인 6: 5시간 샘플. 레인 7: 6시간 샘플. 단백질 염색: 쿠마지 블루 (Coomassie Blue).
도 13은 pET-19b 벡터로부터 재조합 CD1067 (적색 화살표) 발현의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 예시적인 데이타를 제공한다. 레인 1: MW 표준물 래더. 레인 2: 1시간 샘플. 레인 3: 2시간 샘플. 레인 4: 3시간 샘플. 레인 5: 4시간 샘플. 레인 6: 5시간 샘플. 레인 7: 6시간 샘플.
도 13A: F1373 항-씨. 디피실레 항체를 사용하는 검출.
도 13B: 항-HIS 항체를 사용하는 검출.
도 14는 pET-19b 벡터로부터 재조합 CD3620 (적색 화살표) 발현의 SDS-PAGE 전기영동적 분리를 보여주는 예시적인 데이타를 제공한다. 레인 1: MW 표준물 래더. 레인 2: 0시간 샘플. 레인 3: 1시간 샘플. 레인 4: 2시간 샘플. 레인 5: 3시간 샘플. 레인 6: 4시간 샘플. 레인 7: 4.5시간 샘플. 단백질 염색: 쿠마지 블루.
도 15는 pET-19b 벡터로부터 재조합 CD3620 (적색 화살표) 발현의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 예시적인 데이타를 제공한다. 레인 1: MW 표준물 래더. 레인 2: 0시간 샘플. 레인 3: 1시간 샘플. 레인 4: 2시간 샘플. 레인 5: 3시간 샘플. 레인 6: 4시간 샘플. 레인 7: 4.5시간 샘플.
도 15A: F1373 항-씨. 디피실레 항체를 사용하는 검출.
도 15B: 항-HIS 항체를 사용하는 검출.
도 16은 pET-19b 벡터로부터 재조합 CD3620 (적색 화살표) 발현에 대한 항체 검출 대조 데이타를 보여주는 예시적인 데이타를 제공한다. 레인 1: MW 표준물 래더. 레인 2: 6시간 pJEB02 샘플. 레인 3: 4.5시간 pJEB03 샘플.
도 16A: 재조합 CD1067 (상부 적색 화살표) 및 재조합 CD3620 (하부 적색 화살표)을 확인하는 SDS-PAGE 쿠마지 블루 참조 전기영동 분리.
도 16B: 면역전 (preimmune) F1373 검출을 사용하는 웨스턴 블롯 분석.
도 16C: 면역전 F1997 검출을 사용하는 웨스턴 블롯 분석.
도 16D: F1997 항-씨. 디피실레 항체 검출을 사용하는 웨스턴 블롯 분석.
도 17은 씨. 디피실레 포자외막 외피 (coat)를 제거하기 위한 방법의 몇몇 실시양태를 예시한다 (실시예 IV 참조).
도 18A는 출발 물질로서 사용할 수 있는 대표적인 씨. 디피실레 630 포자를 도시한 것이다.
도 18B는 포자외막 제거 후 대표적인 씨. 디피실레 630 포자를 도시한 것이다.
도 18C는 제거 후, 정제 및 농축된 대표적인 씨. 디피실레 630 포자 포자외막을 도시한 것이다.

상세한 설명

약 70년 동안, 세균 감염에 대항한 제1 방어선은 항생제였다. 최초의 항생제는 1940년대와 1950년대에 임상적으로 사용되었고, 그 사용은 상기 기간 이래로 유의하게 증가하였다. 매우 귀중한 진보에도 불구하고, 항생제 및 항미생물 요법은 몇 가지 문제점이 있다. 먼저, 항생제는 포자에 대해 비효과적이다. 두 번째로, 항생제 내성의 발달은 세계적으로 중요한 심각하고 생명을 위협하는 사건이다. 예를 들어, 일부 미생물 균주는 대부분의 이용가능한 항생제에 면역화하는 것으로 알려져 있다 (Travis, Science 264:360-362 (1994)). 다른 약물 내성 유기체에는 다음의 것이 있다: 폐렴 및 수막염을 일으키는 폐구균; 설사를 일으키는 크립토스포리듐 (Cryptosporidium) 및 이. 콜라이 (E. coli); 및 혈류, 수술 상처 및 요로 감염을 일으키는 장구균 (Berkelman et al., J Infect Dis. 170:272-277 (1994)). 본 발명은 미생물 포자의 오염 제어 및 통상적인 항생제 투여에 대한 미생물 감염의 임상 내성에 관한 문제를 해결하기 위한 조성물 및 방법을 고려한다.

I. 세균 포자

일부 미생물은 성장 및 증식에 우호적이지 않은 환경에 노출될 때 휴면기에 들어가는 포자를 떨어뜨린다. 포자 생존은 고체 표면에 대한 부착 및/또는 접착이 이루어질 때 향상된다. 환경적 조건이 다시 성장 및 증식에 우호적으로 변할 때, 미생물 포자는 발아하고 진행하여 주변 지역을 오염시킨다. 이어서, 증식하는 새로운 미생물 성장과 접촉하게 되는 사람 또는 동물은 앞서 오염된 것으로 알려지지 않은 영역으로부터 감염되게 된다. 일부 경우에, 사람 및/또는 동물은 미생물 포자와 접촉하게 될 수 있고, 여기서 발아 및 감염은 접촉 후에 진행한다. 별법으로, 그러한 비검출된 포자 발아는 식품 부패를 일으켜, 식품매개 병 발생 (outbreak)을 개시시킬 수 있다. 화학적 및 물리적 멸균제에 대한 그들의 상대적인 내성 때문에, 이들 세균의 포자는 습열 및 건열, UV 방사선 조사 및 과산화수소를 수반한 처리에 대한 멸균 효율의 표시자로서 사용된다 (Ito et al., "Sterilization of packaging materials using aseptic systems" Food Technol. 38:60-62 (1984)).

세균 포자의 표면 특성 및 그들의 무생물 및 생물 기질과의 상호작용을 이해하는 것은 포장 물질의 선택 및 식품, 제약 물질, 및 의료 용품 (supplies)의 포장에 사용되는 표면 멸균 절차의 평가를 위해 중요하다. 예를 들어, 비활성 물질의 표면에 대한 세균 (즉, 영양 세포 (vegetative cell))의 접착에서 소수성 상호작용의 역할은 잘 인정되고 있다. 그러나, 비교적 적은 연구에서만 세균 포자의 표면 소수도 또는 무생물 기층에 대한 포자의 접착에 관하여 완전히 검사하였다. 세균 포자의 소수도는 영양 세포 소수도를 측정하기 위해 사용된 방법을 적용함으로써 결정할 수 있다. 표면 소수도를 측정하기 위한 확립된 기술은 다음의 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다: i) 탄화수소에의 부착 (Beck et al., "Effect of growth on surface charge and hydrophobicity of Staphylococcus aureus" Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. (Paris) 139:655-664 (1988)); ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) (Doyle et al., "Hydrophobic characteristics of Bacillus spores" Curr. Microbiol. 10:329-332 (1984)); iii) 염 응집 (Takubo et al., "Isolation and characterization of outermost layer deficient mutant spores of Bacillus megaterium" Microbiol. Immunol. 9:973-979 (1988); iv) 접촉각 측정 (Minagi et al., "Cell-surface hydrophobicity of Candida species as determined by the contact-angle and hydrocarbon-adherence methods" J. Gen. Microbiol. 132: 1111-1115 (1986)); 및 v) 헥사데칸에 대한 세균 부착 (BATH) (Wienek et al., Hydrophobicity of Bacillus and Clostridium spores" Appl Environ Microbiol 56:2600-2605 (1990)).

연구에서는 포자 소수도가 종 및 균주 사이에서 다양함을 입증하였다. 그러나, 각각의 유기체에 대해, 포자의 소수도는 영양 세포 소수도보다 더 큰 것으로 생각된다. 추가로, 온건한 열 처리는 대부분의 바실러스 포자의 소수도를 증가시킨다. 하나의 가설은 열 처리 후 포자 소수도의 증가가 외부 외피 또는 포자외막 단백질의 파괴로부터 기인할 수 있음을 제안한다.

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 세균 포자의 증가된 소수도는 영양 세포 상의 펩티도글리칸에 비해 외부 외피 및 포자외막 내에 단백질의 풍부함 때문인 것으로 생각된다 ([Doyle et al., "Hydrophobic characteristics of Bacillus spores" Curr. Microbiol. 10:329-332 (1984)]; [Matz et al., "Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus" J. Bacteriol. 101:196-201 (1970)]; 및 [Takumi et al., "Isolation and partial characterization of exosporium from spores of a highly sporogenic mutant of Clostridium botulinum type A" Microbiol. Immunol. 28:443-454 (1979)]). 포자 소수도 및 포자외막의 존재 사이의 연관성은 몇몇 바실러스 종에 대해 최근에 보고되었다 (Kjelleberg, S. "Adhesion to inanimate surfaces" In: Microbial adhesion and aggregation, pp. 51-70. K.C. Marshall (ed), Springer-Verlag KG, Berlin (1984)). 비. 세레우스 T 포자의 감소된 포자 소수도는 포자 표면이 화학적 처리에 의해 제거될 때 관찰되었다 (Kutima et al., "Involvement of the spore surface in germination of Bacillus cereus T spores" Appl. Environ. Microbiol. 53:47-52 (1987)). 포자 소수도의 감소는 또한 비. 메가테리움 (B. megaterium) (QMB1551: ATCC 12872)의 "낙-아웃" 외부 외피-음성 돌연변이체에서 보였다 ([Takubo et al., "Isolation and characterization of outermost layer deficient mutant spores of Bacillus megaterium" Microbiol. Immunol. 9:973-979 (1988)]; 및 [Koshikawa et al., "Surface hydrophobicity of spores of Bacillus spp." J. Gen. Microbiol. 135:2717-2722 (1989)]). 이들 관찰은 포자외막의 외부 외피가 포자 소수도에서 일정 역할을 수행함을 제안한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 표면 위생, 의료, 제약, 및/또는 식품 산업에서 사용되는 장비 및/또는 포장 물질의 멸균을 개선하기 위한 조성물 및 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 피부 위생을 개선하기 위한 조성물 및 방법을 고려한다.

A. 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 단백질

클로스트리듐 속의 세균은 가스 괴저, 상처 감염, 보툴리즘 (botulism), 파상풍, 위막성 대장염, 패혈증, 또는 병원내 감염 설사를 포함하고 이로 제한되지 않는 질병을 일으키는 것으로 생각된다. 상기 속의 세균은 열, 화학물질, 및 방사선에 고도로 내성인 탈수된 내생포자를 형성함으로써 불리한 조건 하에 잘 생존한다. 이들 포자는 토양에서 발견되고, 바람에 의해 운반되고, 포유동물 소화관 및 비뇨생식기관으로부터 회수될 수 있고, 성장을 위한 조건이 포자 활성화 및 발아를 지지할 때까지 매우 오랜 기간 동안 휴면 상태를 유지하는 능력을 가진다.

씨. 디피실레 포자는 의료계 및 병원 환경 내에 널리 퍼져있다. 씨. 디피실레 포자는 생물 및/또는 무생물 표면 상에서 장기간 동안 생존하고, 많은 소독제 및 항생제에 대해 내성이고, 환자에서 환자로 쉽게 전염된다. 표면에 대한 씨. 디피실레 포자 부착, 및 포자형성 및 발아를 이해하면 씨. 디피실레-연관 질병의 예방, 제어 및 치료에 도움이 될 것이다. 예를 들어, 씨. 디피실레는 바실러스 종에서 포자형성 과정을 촉발하는 인산기 연속 전달 (phospho-relay) 시스템에 관여하는 몇몇 유전자가 결여되고; 클로스트리듐 종에서 포자형성 시스템의 상기 및 다른 측면은 최근에 검토되었다 (Paredes et al., "A comparative genomic view of clostridial sporulation and physiology" Nat. Rev. Microbiol. 3:969-978 (2005)). 추가로, 씨. 디피실레는 대체로 대부분의 바실러스 및 클로스트리듐 종에 존재하는 트리시스트로닉 (tricistronic) ger 오페론이 또한 결여된다 ([Moir et al., "Spore germination" Cell Mol. Life Sci. 59:403-409 (2002)]; 및 [Broussolle et al., "Molecular and physiological characterisation of spore germination in Clostridium botulinum and C. sporogenes" Anaerobe 8:89-100 (2002)]). 이들 관찰은 씨. 디피실레 발아촉진제 (germinant) 수용체는 다른 클로스트리듐 종 및 바실러스 종과 실질적으로 상이하고, 그에 대한 서열 유사성에 기초하여 확인될 수 없을 것임을 제안한다.

열, 용매, 효소, 세제, 자외선 및 이온화 방사선, 수산화나트륨, 에탄올, 과포름산, 페놀, 추위, 및 대부분의 포자박멸제에 대한 미생물 포자 내성, 및 조건이 최적일 때 공격적으로 성장하는 그들의 능력으로 인해 이들은 동물 및 특히 인간 건강에 심각한 위협이 된다 ([Tipper et al., "Structure of the bacterial endospore" In: Spores V, Ed. H. Halvorson, R. Hanson and L. Campbell. Amer. Soc. for Microbiol., Bethesda, Maryland, 3-12 (1972)]; 및 [Russell, A., "Bacterial spores and chemical sporicidal agents" Clin. Microbiol. Rev., 3, 99-119 (1990)]). 포자가 의료 시설의 벽, 마루, 기구, 침대 시트, 및 간병인의 손에서 발견되기 때문에, 병원 및 요양원에서 클로스트리듐 디피실레의 감염의 병원내 획득은 심각한 역학 문제를 제기한다. 포자는 i) 항생제 요법으로 인한 변경된 장내 균총; ii) 손상된 면역계의 개체, 또는 iii) 진단 시험 또는 처리에 관련한 다수의 관장을 요하는 개체를 포함하고 이로 제한되지 않는 개체를 쉽게 감염시키는 것으로 보인다 (Zaleznik, D. "Clostridium difficile: an important nosocomial pathogen for the 1990s" Clin. Microbiol. Newsletter 13, 145-152 (1991)).

2가지 종의 클로스트리듐 포자 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 스포로게네스 (Clostridium sporogenes) ATCC 3584 및 씨. 디피실레 ATCC 9689 및 ATCC 43594)로부터의 포자외막은 부착, 발아 및/또는 콜로니 형성에서 일정 역할을 할 수 있다 (Panessa-Warren et al., "Exosporial membrane plasticity of Clostridium sporogenes and Clostridium difficile" Tissue & Cell 29:449-461 (1997)). 초미세구조 변화가 씨. 바이퍼멘탄스 (C. bifermentans) 포자 부속물의 발아 및 성장과 연관되었지만 구체적인 기능을 결정되지 않았다 (Samsonoff et al., "Ultrastructural changes associated with germination and outgrowth of an appendage-bearing clostridial spore" J. Bacteriol., 101, 1038-1045 (1970)). 박편 (thin-section) 투과 전자 현미경에 의한 씨. 스포로게네스 포자의 검사로 모발-유사 돌출부를 갖는 포자외막 외부층을 밝혔지만, 클로스트리듐 콜로니 형성의 분포, 기능 또는 외관에 관한 논의는 제공되지 않았다 (Hoeniger et al., "Ultrastructural aspects of spore germination and outgrowth in Clostridium sporogenes" Can. J. Microbiol., 15, 1061-1065 (1969)). 투과 전자 현미경 박편 재구성은 한번에 수많은 포자의 포자외막 형태학를 동시에 관찰하고 해석할 때 심각한 문제, 및 영양 기질에 대한 그러한 작고 섬세하고 거의 염색되지 않는 포자 부착의 박편 슬라이스를 얻는 것과 연관된 문제를 갖는 것으로 알려져 있다.

씨. 스포로게네스 포자는 일단 휴면이 깨지면 특이적인 형태학적 기를 보일 수 있고, 포자외막이 성공적인 발아, 성장, 식물 증식, 및 기질 표면 결합 부위의 콜로니 형성에서 능동적인 역할을 하는 것으로 보인다 (Panessa-Warren et al., "Electron microscopy of C. sporogenes endospore attachment and germination" Scanning 16, 227-240 (1994)). 클로스트리듐 포자외막은 포자의 외부 '막'층인 것으로 생각되고, 발아에서 수동적인 참여자인 것으로 설명되었다. 그러나, 일단 휴면이 깨지면, 씨. 스포로게네스 ATCC 3584 포자는 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 보이는 매우 특이적인 포자외막 형태학적 구조를 생성시키는 것으로 보이고, 이것은 기질 또는 다른 포자에 대한 포자의 부착 (즉, 예를 들어, 포자 동시-응집)을 촉진하는 것으로 보인다. 포자외막 돌출부는 나중에 포자의 원위부 (즉, 예를 들어, 꼬리 영역)으로부터 신장하는 단일 잎자루에 의해 교체되고, 이것은 영양 세포 발생 및 성장의 최종기 동안 포자를 고정하는 것으로 보인다.

씨. 스포로게네스 부착의 초기의 시기 동안, 포자외막의 섬세한 실모양 돌출부는 바깥쪽으로 신장하고, 이때 더 짧은 돌출부의 일부는 표면에 부착한다. 도 1의 백색 화살표를 참조한다. 포자외막으로부터 대체로 긴 필라멘트상 돌출부는 포자의 상단 표면 또는 측면에서 기원하고, 표면으로 또는 최근접 이웃 포자로 신장하여, 포자들을 함께 결합시킨다 (동시-응집). 포자외막 돌출부는 모두 결국 포자를 고정시키는 것으로 보이는 표면으로 신장하는 단일의 두꺼운 부착 구조로 발달하는 씨. 스포로게네스 할성화된 포자의 외부 표면 위에서 보인다.

씨. 스포로게네스와는 달리, 씨. 디피실레는 부착된 포자의 수가 감소되고, 부착이 일어나기 위해 보다 긴 인큐베이션 시간을 필요로 한다. 휴면 씨. 디피실레 포자는 작고 (길이 약 2.0 gm x 폭 1.1 gm), 탄원형이고 주로 평탄하다 (도 2 삽입부 참조). 일단 활성화가 시작되면, 포자는 포자외막을 덮는 낮은 융기부 (prominence)를 나타냈다 (도 3 참조). 부착의 초기기에서, 씨. 디피실레 43594는 긴 포자의 전체 표면을 덮는 포자외막 돌기 및 마디 (knob)를 발달시켰다. 이들 포자는 꼬리 영역에서 보다 긴 포자외막 돌출부를 발달시켰고, 이들은 발아 사이클 동안 나중에 두꺼워진 부착 구조에 의해 교체되었다 (도 3, 흑색 화살표). 씨. 스포로게네스와 달리, 씨. 디피실레는 보다 적은 포자외막 연장부를 보이지만, 포자의 꼬리 단부에서 발달된 두꺼워진 포자외막 연장부를 생성시킨다.

물 또는 버퍼 중에서 교반 (즉, 예를 들어, 300 rpm 원심분리)하는 동안 한천 표면에 부착된 상태로 유지되는 씨. 스포로게네스 및 씨. 디피실레 포자의 능력은 이들 포자가 표면에 대한 접착 및/또는 부착의 강력한 수단을 가짐을 강하게 시사한다. 이상적인 조건 하에, 한천 표면에 대한 씨. 스포로게네스의 부착은 접종 후 27 min 이내에 일어나는 것으로 관찰되었다. 예비-환원시킨 한천 상에서 혐기성 조건 하에, 씨. 스포로게네스 포자의 최대 부착은 88 내지 105 min 내에 일어나는 것으로 관찰되었다. 씨. 디피실레 포자 부착은 상당히 더 긴 시간, 예를 들어, 씨. 디피실레 9689에 대해 105 min 및 씨. 디피실레 ATCC 43594에 대해 180 min이 걸렸다.

일단 부착되면, 포자는 고체 표면에 끈질기게 고정되어 남아있을 수 있다. 씨. 디피실레 43594는 포자가 매우 느리게 부착하는 면에서 독특한 것으로 보인다. 그러나, 씨. 디피실레는 생물 표면에의 노출 후에 부착을 가속화시키는 적응 반응을 가질 수 있다. 예를 들어, 장 운동성이 증가된 환자 및 다수의 관장을 겪은 환자에서 씨. 디피실레 병원내 감염의 증가된 발생률이 보고되었다 ([Bartlett, J. "Introduction" In: Clostridium difficile: Its Role in Intestinal Disease, Ed. R. Rolfe and S. Finegold). Academic Press, New York, pp. 113 (1988)]; [Silva, J. Jr., "Prevention of Clostridium difficile-associated intestinal disease" In: Clostridium difficile: Its Role in Intestinal Disease, Ed. R. Rolfe and S. Finegold. Academic Press, New York, pp. 368-378 (1988)]; 및 [McFarland et al., "Nosocomial acquisition of Clostridium difficile infection. New Engl. J. Med., 320:204-210 (1989)]). 씨. 디피실레 포자는 건강한 무-증상 개체의 소화관에서 일상적으로 발견될 수 있다. 결과적으로, 창자에 대한 부착을 개시하고 감염성 과정을 시작시키는 촉발 메카니즘은 정상 균총의 상실 (즉, 예를 들어, 항생제, 질병 또는 반복된 관장에 의해 유발된) 및/또는 대장 과운동성의 조합일 수 있다.

클로스트리듐 포자 포자외막 부착 성장물은 대개 직경이 약 7 nm이고, 길이가 0.1 내지 2.9 nm로 다양할 수 있다. 이들 성장물은 대체로 길이가 200 nm 미만이고 극히 섬세할 수 있는 원섬유 (fibril)를 포함한다 (Hancock, I, "Microbial cell surface architecture" In: Microbial Cell Surface Analysis, Ed. N. Mozes, P. Handley, H. Busscher and P. Rouxhet, VCH Publishers, New York, pp. 23-59 (1991)). 대체로, 씨. 스포로게네스의 포자외막 성장물은 폭이 85 내지 1015 nm이지만, 일부 성장물, 특히 동시-응집 부착을 포함하는 것은 길이가 2000 nm 정도로 길 수 있다. 씨. 스포로게네스 포자외막으로부터의 마디-유사 돌출은 직경이 68 내지 75 nm일 수 있고, 발아의 후기기에서 보이는 팽창된 돌출부는 직경이 180 내지 240 nm 정도로 클 수 있다.

명백하게, 항상 '발아에서 수동적인 참여자'인 것으로 생각되었던 포자의 포자외막은 씨. 스포로게네스 및 씨. 디피실레의 포자 부착 및 콜로니 형성에서 능동적인 역할을 하는 것으로 보인다. 한 실시양태에서, 씨. 디피실레 단백질은 포자외막 표면층으로부터 유래되고, 여기서 포자외막층은 씨. 디피실레 포자의 최외각 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 클로스트리듐 디피실레 포자의 적어도 하나의 최외각 표면 단백질을 포함하는 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 포자 표면 단백질을 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 이들 포자 표면 단백질은 세균 포자 및 기질 표면 결합 부위 사이에 계면을 제공하는 것으로 생각된다. 이들 단백질은 i) 포자 및 생물 표면 사이; 및 ii) 포자 및 무생물 표면 사이를 포함하고 이로 제한되지 않는 분자 부착 상호작용을 규정하기 위해 사용될 수 있는 것으로 또한 생각된다. 클로스트리듐 디피실레 포자외막 단백질의 크기 특징을 표 I에 제시한다.

<표 I>

한 실시양태에서, 클로스트리듐 디피실레 단백질은 전체 포자 단백질 제제를 정제된 무손상 씨. 디피실레 포자에 대해 작용성인 항체로 프로빙하여 혼성화된 단백질-항체 복합체를 생성함으로써 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, 씨. 디피실레 포자 표면 단백질은 CD1067, CD3620, CD1581, CD598, 또는 CD2401을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 씨. 디피실레 효소는 씨. 디피실레 포자 표면 단백질 제제와 회합된다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1581)은 분자량이 18, 140, 150, 또는 160 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않는 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다 (도 4-6 참조). 한 실시양태에서, 가상 단백질 (~20 kDa)은 다음의 서열 2:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 1:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001088081, GI: 126699184)을 갖는다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1067)은 분자량이 140, 150, 및 160 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않는 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다 (도 5 및 6 참조). 한 실시양태에서, 가상 단백질 (~47 kDa)은 다음의 서열 4:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 3:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001087551; GI: 126698654)을 갖는다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD3620)은 분자량이 140 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않는 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다 (도 5 및 6 참조). 한 실시양태에서, 가상 단백질 (~14 kDa)는 다음의 서열 6:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 5:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001090143; GI: 126701246)을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1613)은 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다. 한 실시양태에서, 가상 단백질은 다음의 서열 8:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 7:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP 001088114)을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1711)은 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다. 한 실시양태에서, 가상 단백질은 다음의 서열 10:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 9:

의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD0881)은 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다. 한 실시양태에서, 가상 단백질은 다음의 서열 12:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 11:

의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1511)은 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다. 한 실시양태에서, 가상 단백질은 다음의 서열 14:

의 클로스트리듐 가상 핵산에 의해 코딩되는 서열 13:

의 아미노산 서열을 포함한다.

B. 클로스트리듐 디피실레 콜라겐-유사 단백질

비. 안트라시스 포자외막 단백질 BclA를 씨. 디피실레 게놈에 비교하였고, 여기서 3개의 씨. 디피실레 게놈 영역이 비. 안트라시스 BclA에 상동성으로서 확인되었다 (즉, 예를 들어, 포자 표면 게놈 영역).

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 상동체 단백질은 다음의 서열 16:

의 클로스트리듐 포자 표면 상동체 핵산에 의해 코딩되는 서열 15:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 CAJ67154)을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 상동체 단백질은 다음의 서열 18:

의 클로스트리듐 포자 표면 상동체 핵산에 의해 코딩되는 서열 17:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 CAJ70248)을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 상동체 단백질은 다음의 서열 20:

의 클로스트리듐 포자 표면 상동체 핵산에 의해 코딩되는 서열 19:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 CAJ70128)을 포함한다.

C. 클로스트리듐 디피실레 포자 단백질

1. 추정 클로스트리듐 포자 단백질

한 실시양태에서, 클로스트리듐 추정 포자 단백질 (CD2401)은 분자량이 140, 150, 또는 160 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않는 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다 (도 5 및 6 참조). 한 실시양태에서, 가상 단백질 (~22 kDa)는 다음의 서열 22:

의 클로스트리듐 추정 포자 단백질 핵산에 의해 코딩되는 서열 21:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001088913; GI: 126700016)을 포함한다.

한 실시양태에서, 클로스트리듐 추정 포자 표면 단백질 (CD589)은 분자량이 140, 150, 또는 160 kDa를 포함하고 이로 제한되지 않는 혼성화된 항체-단백질 복합체로서 단리할 수 있다 (도 5 및 6 참조). 한 실시양태에서, 가상 단백질 (~22 kDa)은 다음의 서열 24:

의 클로스트리듐 추정 포자 단백질 핵산에 의해 코딩되는 서열 23:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP 001087073; GI: 126698176)을 포함한다.

2. 피루베이트-플라보독신 옥시도리덕타제

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 26:

의 클로스트리듐 피루베이트-플라보독신 옥시도 리덕타제 핵산에 의해 코딩되는 서열 25:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001089193; GI: 126700296)로 설명되는 피루베이트-플라보독신 옥시도리덕타제 단백질 (CD2682)을 포함한다.

3. γ-아미노부티레이트 대사 데히드라타제/이소머라제

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 28:

의 클로스트리듐 감마 아미노부티레이트 대사 데히드라타제/이소머라제 핵산에 의해 코딩되는 서열 27:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001088856; GI: 126699959)로 설명되는 γ-아미노부티레이트 대사 데히드라타제/이소머라제 단백질 (CD2341)을 포함한다.

4. 부티릴-CoA 데히드로게나제

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 30:

의 클로스트리듐 부티릴-CoA 데히드로게나제 핵산에 의해 코딩되는 서열 29:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001087535; GI: 126698638)로 설명되는 부티릴-CoA 데히드로게나제 단백질 (CD1054)을 포함한다.

5. 아미노산 아미노트랜스퍼라제

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 32:

의 클로스트리듐 아미노산 아미노트랜스퍼라제 핵산에 의해 코딩되는 서열 31:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP 001090189; GI: 126701292)로 설명되는 아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질 (CD3664)을 포함한다.

6. 숙신산-세미알데히드 데히드로게나제

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 34:

의 클로스트리듐 숙신산-세미알데히드 데히드로게나제 핵산에 의해 코딩되는 서열 33:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001088857; GI: 126699960)로 설명되는 숙신산-세미알데히드 데히드로게나제 단백질 (CD2342)을 포함한다.

7. 루브레리트린

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 36:

의 클로스트리듐 루브레리트린 핵산에 의해 코딩되는 서열 35:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001088025; GI: 126699128)로 설명되는 루브레리트린 단백질 (CD1524)을 포함한다.

8. 플라보단백질 알파 서브유닛

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 38:

의 클로스트리듐 플라보단백질 알파 서브유닛 핵산에 의해 코딩되는 서열 37:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001087535; GI: 126698640)로 설명되는 플라보단백질 알파 서브유닛 단백질 (CD1056)을 포함한다.

9. 2-케토이소발레레이트 페로독신 리덕타제

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 단백질은 다음의 서열 40:

의 클로스트리듐 플라보단백질 알파 서브유닛 핵산에 의해 코딩되는 서열 39:

의 아미노산 서열 (기탁 번호 YP_001086585; GI: 126697688)로 설명되는 2-케토이소발레레이트 페로독신 리덕타제 단백질 (CD116)을 포함한다.

II . 미생물 포자 결합의 항체 억제

한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 사용하여 무생물 및/또는 생물 표면에 대한 미생물 포자 결합 및/또는 부착을 억제하는 것을 고려한다. 한 실시양태에서, 항체는 클로스트리듐 포자 결합을 억제한다. 이들 항체는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가로, 키메라 (chimera) 항체는 예를 들어, 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱함으로써 생산할 수 있다. 단일쇄 항체, 및 항체 분자의 펩신 소화에 의해 또는 Fab 단편의 디술피드 가교의 환원에 의해 생성된 항체 단편이 또한 고려된다.

A. 항체 생성 방법

본 발명은 단리된 항체 또는 그의 단편 (즉, 예를 들어, 폴리클로날, 모노클로날, 및/또는 Fab)을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 각종 표면 (즉, 예를 들어, 생물 표면 및/또는 무생물 표면)에 대한 미생물 포자 표면 단백질의 결합을 특이적으로 억제하는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 단백질에 대한 항체는 단백질을 인식할 수 있는 한 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 항체는 통상적인 항체 또는 항혈청 제조 공정에 따라 항원으로서 본 발명의 단백질을 사용함으로써 생산할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용된 항체를 생성하기 위해 본원에 개시된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체의 제조를 위해, 단백질을 단독으로 또는 적합한 담체 또는 희석제와 함께, 항체의 생산을 허용하는 (즉, 예를 들어, 면역화) 조건 하에 동물 (예를 들어, 포유동물)에게 투여한다. 보통, 단백질은 2주 내지 6주 마다 1회로 총 약 2회 내지 약 10회 투여된다. 그러한 방법에 사용하기에 적합한 동물은 영장류, 토끼, 개, 기니 피그, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하고 이로 제한되지 않고, 전장 단백질 또는 면역원성 특성을 보유하는 임의의 부분, 단편 또는 올리고펩티드를 주사하여 면역화될 수 있다. 면역학적 반응을 증가시키기 위해 숙주 종에 따라, 다양한 어쥬번트 (adjuvant)를 사용할 수 있다. 항체 생산 능력을 향상시키기 위해, 완전 또는 불완전 프로인트 (Freund) 어쥬번트를 투여할 수 있다. 그러한 어쥬번트는 프로인트, 미네랄 겔, 예를 들어 수산화알루미늄, 및 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴, 플루로닉 (pluronic) 폴리올, 다가음이온 (polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 디니트로페놀을 포함하고 이로 제한되지 않는다. BCG (바실러스 칼메트-게랭 (Bacillus Calmette-Guerin)) 및 코르네박테리움 파룸 (Cornebacterium parrum)은 잠재적으로 유용한 어쥬번트이다.

모노클로날 항체는 배양액 내의 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 이들은 하이브리도마 (hybridoma) 기술을 포함하고 이로 제한되지 않는다 ([Koehler et al. Nature 256:495-497(1975)]; [Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983)]; [Cote et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030 (1983)]; [Cole et al., In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York, N.Y., pp 77-96 (1985), 모든 참조문은 본원에 참고로 포함됨).

모노클로날 항체-생산 세포를 제조하기 위해, 그의 항체 역가가 확정된 개별 동물 (예를 들어, 마우스)을 선택하고, 최종 면역화의 2일 내지 5일 후에, 그의 비장 또는 림프절을 수거하고, 여기에 함유된 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜, 목적하는 모노클로날 항체 생산자 하이브리도마를 제조한다. 항혈청 내의 항체 역가의 측정은 예를 들어 아래에 설명된 바와 같이 표지된 단백질 및 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써 수행할 수 있다. 세포 융합은 공지의 방법, 예를 들어, 문헌 [Koehler and Milstein (Nature 256:495 [1975])]에 설명된 방법에 따라 수행할 수 있다. 융합 프로모터로서, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 센다이 (Sendai) 바이러스 (HVJ), 바람직하게는 PEG가 사용된다.

골수종 세포의 예는 NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 등을 포함한다. 항체 생산자 세포 (즉, 예를 들어, 비장 세포)의 수 및 사용할 골수종 세포의 수의 비율을 바람직하게는 약 1:1 내지 약 20:1이다. PEG (바람직하게는 PEG 1000-PEG 6000)은 바람직하게는 약 10% 내지 약 80%의 농도로 첨가된다. 세포 융합은 두 세포의 혼합물을 약 20℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 37℃에서 약 1분 내지 10분 동안 인큐베이팅함으로써 효율적으로 수행할 수 있다.

항체 (예를 들어, 종양 항원에 대한 항체 또는 본 발명의 자가항체)를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마의 상등액이 항체가 직접적으로 또는 담체와 함께 흡착된 고체상 (예를 들어, 마이크로플레이트 (microplate))에 첨가되는 경우에, 고체상에 결합된 단백질에 대한 모노클로날 항체를 검출하기 위해 항-면역글로불린 항체 (마우스 세포가 세포 융합에 사용되는 경우에, 항-마우스 면역글로불린 항체가 사용됨) 또는 방사성 물질 또는 효소로 표지된 단백질 A가 첨가된다. 별법으로, 하이브리도마의 상등액을 항-면역글로불린 항체 또는 단백질 A가 흡착된 고체상에 첨가한 후, 고체상에 결합된 단백질에 대한 모노클로날 항체를 검출하기 위해 방사성 물질 또는 효소로 표지된 단백질을 첨가한다.

모노클로날 항체의 선택은 임의의 공지의 방법 또는 그의 변형에 따라 수행할 수 있다. 보통, HAT (하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘)이 첨가되는 동물 세포에 대한 배지가 사용된다. 하이브리도마가 성장할 수 있다면 임의의 선택 및 성장 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 1% 내지 20%, 바람직하게는 10% 내지 20% 태소 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지, 1% 내지 10% 태소 혈청을 함유하는 GIT 배지, 하이브리도마의 배양을 위한 무혈청 배지 (SFM-101, 니수이 세이야쿠 (Nissui Seiyaku)) 등을 사용할 수 있다. 보통, 배양은 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 37℃에서 약 5일 내지 3주, 바람직하게는 1주 내지 2주 동안 약 5% CO₂ 기체 하에 수행한다. 하이브리도마 배양액의 상등액의 항체 역가는 항혈청 내의 항-단백질의 항체 역가에 관하여 상기 설명된 것과 동일한 방식에 따라 측정할 수 있다.

모노클로날 항체의 분리 및 정제는 면역글로불린의 분리 및 정제와 같은 통상적인 폴리클로날 항체와 동일한 방식, 예를 들어, 염석 (salting-out), 알콜 침전, 등전점 침전, 전기영동, 이온 교환 수지 (예를 들어, DEAE)를 사용한 흡착 및 탈착, 초원심분리, 겔 여과, 또는 활성 흡착제, 예를 들어 항원-결합 고체상, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 항체만을 수집하고 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제 방법에 따라 수행할 수 있다.

폴리클로날 항체는 환자로부터 항체를 얻는 것을 비롯한 임의의 공지의 방법 또는 이들 방법의 변형에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역원 (단백질에 대한 항원) 및 담체 단백질의 복합체를 제조하고, 동물을 상기 모노클로날 항체 제제에 관하여 설명된 것과 동일한 방식으로 복합체로 면역화시킨다. 항체를 함유하는 물질을 면역화시킨 동물로부터 회수하고, 항체를 분리하고 정제한다.

동물의 면역화에 사용할 면역원 및 담체 단백질의 복합체에 관하여, 담체 상에 가교연결되고 면역화를 위해 사용되는 합텐 (hapten)에 대한 항체가 효율적으로 생산된다면, 임의의 담체 단백질 및 임의의 혼합 비율의 담체 및 합텐을 사용할 수 있다. 예를 들어, 소 혈청 알부민, 소 시클로글로불린, 키홀 림펫 헤모시아닌 등을 합텐 1부당 약 0.1부 내지 약 20부, 바람직하게는, 약 1부 내지 약 5부의 중량비로 합텐에 커플링시킬 수 있다.

추가로, 합텐 및 담체의 커플링을 위해 다양한 축합제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 글루타르알데히드, 카르보디이미드, 말레이미드 활성화된 에스테르, 티올기 또는 디티오피리딜기를 함유하는 활성화된 에스테르 시약 등을 본 발명에서 사용한다. 축합 생성물을 단독으로 또는 적합한 담체 또는 희석제와 함께 항체 생산을 허용하는 동물의 부위에 투여된다. 항체 생산 능력을 향상시키기 위해, 완전 또는 불완전 프로인트 어쥬번트를 투여할 수 있다. 보통, 단백질은 2주 내지 6주마다 1회로 총 약 3회 내지 약 10회 투여된다.

폴리클로날 항체는 상기 방법에 의해 면역화시킨 동물의 혈액, 복수 등으로부터 회수된다. 항혈청 내의 항체 역가는 하이브리도마 배양액의 상등액에 관하여 상기 설명된 것과 동일한 방식에 따라 측정할 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 상기 모노클로날 항체에 관하여 설명된 것과 동일한 면역글로불린의 분리 및 정제 방법에 따라 수행할 수 있다.

면역원으로서 본원에서 사용되는 단백질은 임의의 특정 종류의 면역원에 제한되지 않는다. 예를 들어, 바이러스 감염으로부터 발현된 단백질 (부분적으로 변경된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 추가로 포함하는)을 면역원으로서 사용할 수 있다. 추가로, 단백질의 단편을 사용할 수 있다. 단편은 유전자 단편의 발현, 단백질의 효소 처리, 화학적 합성 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명의 문맥에서 항체 생산을 위해, 본원에 고려되는 미생물 포자 단백질 아미노산 서열 (즉, 예를 들어, 서열 1, 3, 5, 7, 또는 9)의 임의의 항원성 부분을 단독으로, 또는 또 다른 단백질의 아미노산 (즉, 예를 들어, 키메라 분자에 대한 항체를 생산하기 위해 글루타티온)과 융합시켜 사용할 수 있다. 그러한 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단일쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

중화 항체, 즉, 이량체 형성을 억제하는 항체가 진단제 및 치료제에 특히 바람직하다.

항체 유도를 위해 사용할 폴리펩티드는 생물학적 활성을 보유할 필요가 없지만; 단백질 단편 또는 올리고펩티드는 항원성이어야 한다. 특이적 항체를 유도하기 위해 사용되는 펩티드는 적어도 5개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 이들은 천연 단백질의 아미노산 서열의 일부를 모방하여야 하고, 작은 자연 발생 분자의 전체 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 아미노산 서열의 짧은 스트레치 (stretch)를 키홀 림펫 헤모시아닌 및 키메라 분자에 대해 생산된 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는 또 다른 단백질의 것과 융합시킬 수 있다.

항체는 또한 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역분석 (RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함하고 이로 제한되지 않는 기술을 이용하여 체액, 세포 추출물, 조직 추출물, 또는 표면 도말물 (swipe)을 포함하고 이로 제한되지 않는 샘플 내의 폴리펩티드를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 리포터 분자는 폴리펩티드-항체 결합의 검출을 용이하게 하기 위해 폴리펩티드 및 항체에 연결될 수 있다.

B. 미생물 포자 표면 단백질 결합의 항체 억제 방법

한 실시양태에서, 본 발명은 클로스트리듐 포자 표면 단백질에 대한 친화도를 갖는 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체를 포함하는 스크리닝 방법을 고려한다.

비. 세레우스 T 포자와 클로스트리듐 스포로게네스 PA3679 포자의 1:1 혼합물로 면역화시킨 마우스는 10⁷개의 비. 세레우스 포자와의 그들의 반응성 및 10⁷개의 씨. 스포로게네스 포자와의 그들의 반응성에 대해 스크리닝된 397 하이브리도마를 생성시키는 것으로 보고되었다. 명백하게, 9개의 하이브리도마는 비. 세레우스 T 포자에 특이적인 항체를 생산한 한편, 15개의 하이브리도마는 씨. 스포로게네스 포자에 특이적인 항체를 생산하였다. 7개의 하이브리도마는 비. 세레우스 T 포자 및 씨. 스포로게네스 포자와 교차-반응하는 항체를 생산하였다 (Quinlan et al., "Monoclonal antibodies for use in detection of Bacillus and Clostridium spores" Appl Environ Microbiol. 63:482-487 (1997)). 씨. 스포로게네스 포자에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 중의 2개를 서브클로닝하고, 생성되는 IgM 항체를 C33 및 C225로 지정하였다.

항체를 도트 (dot) 블롯 형식을 사용함으로써 다양한 바실러스, 클로스트리듐 및 데술포토마쿨룸 포자와의 반응성에 대해 정성적으로 (시각적으로) 검사하였다. 항체 C33은 씨. 스포로게네스 포자와 강하게 반응하고 씨. 페르프린겐스 (C. perfringens) 포자와 약하게 반응하였다. 항체 C225는 비. 메가테리움 포자와 약하게 반응하고 비. 스테아로써모필러스 (B. stearothermophilus), 씨. 페르프린겐스 및 씨. 스포로게네스의 포자와 강하게 반응하였다. 씨. 스포로게네스에서 항원의 면역세포화학적 위치결정은 포자의 포자외막 및 외부 피질 영역 상에 존재함을 나타냈다.

씨. 스포로게네스 포자 항원에 관하여 더 적은 정보가 이용가능하지만, 특이적 포자 항원은 식물 항원과 구분되는 것으로 입증되었다 ([Norris J., "Bacterial spore antigens: a review" J. Gen. Microbiol. 28:393-408 (1962)]; 및 [Princewell, T., "Spore antigens of Clostridium sporogenes" J. Med. Microbiol. 12:29-41 (1979)]). 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 클로스트리듐 포자 항원에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 하나 초과의 특이적 클로스트리듐에 대해 공통적인 것으로 생각된다 (Foegeding et al., "Polyclonal antibodies in an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect bacterial spores" J. Rapid Methods Automat. Microbiol. 2:135-150 (1993)).

한 실시양태에서, 본 발명은 그에 의해 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체가 클로스트리듐 포자 표면 단백질 (즉, 예를 들어, CD1581)에 친화도를 갖는 방법을 표면에 대한 클로스트리듐 포자의 결합을 파괴하기 위해 사용하는 것을 고려한다. 한 실시양태에서, 표면은 플라스틱, 세라믹, 스테인레스 스틸, 철강, 비닐, 타일, 나무 라미네이트, 피부 (즉, 예를 들어, 돈피), 내부 체조직, 의류, 또는 환경 보호복을 포함하고 이로 제한되지 않는 군 중에서 선택될 수 있다.

C. 미생물 포자 결합의 항체 억제

변형된 컵 스크럽 (cup scrub) 방법을 사용하여 인간 피부 대용물 (즉, 예를 들어, 돈피)에 결합하는 씨. 디피실레 포자의 능력을 평가하였다 (실시예 X 참조). 돈피를 먼저 비-항미생물 비누를 사용하여 30초 동안 세척한 후, 30초 동안 물로 세정하였다. 돈피를 세척한 후에, 50 ㎕ 이하의 포자를 피부의 표면 상에 20 mm 직경 영역에 첨가하였다. 포자를 1시간까지 건조시킨 후 컵 스크럽 방법에 따라 제거하였다. 상기 실험은 피부 대용물에 결합하는 씨. 디피실레 포자의 능력을 결정하였다. 예비 데이타는 80% 이하의 포자가 돈피 표면으로부터 제거될 수 있음을 보여주었다. 후속 실험에서, 포자를 먼저 씨. 디피실레 포자 표면 항체와 반응시킨 후 피부 표면에 적용하였다. 피부로부터 포자를 대체하는 능력을 다시 컵 스크럽 방법을 이용하여 결정하였다. 예비 데이타는 돈피로부터 80% 초과의 포자를 대체하는 능력을 보여주었고, 이것은 항체가 피부에 포자가 결합하는 것을 방지함을 제안한다.

III . 미생물 포자 결합의 미생물 포자 표면 단백질 억제

한 실시양태에서, 본 발명은 감염 제어 물질을 사용하여 미생물 포자 결합을 억제하는 것을 포함하는 방법을 고려하고, 상기 물질은 미생물 포자 단백질의 적어도 일부를 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 감염 제어 물질은 미생물 포자가 그에 대해 유사한 친화도를 갖는 표면 결합 부위에 대해 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 생각된다. 결과적인 경쟁적 결합은 앞서 결합된 미생물 포자를 표면 부착 부위로부터 대체하고/하거나 미생물 포자 표면 단백질의 적어도 일부의 존재 때문에 결합이 입체적으로 방지되는 것으로 추가로 생각된다.

한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 세균, 바이러스, 진균, 조류 또는 곰팡이를 포함하는 군으로부터 선택되는 미생물 유기체로부터 유래할 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 포자 표면 단백질을 사용하여 표면에 대한 미생물 포자의 부착을 방지하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 소분자, 단백질, 또는 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 비-포자 표면 단백질 화합물과 함께 제형화된다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 계면활성제, 비누, 세제, 발포제, 습윤제, 및 에어로졸화제를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는 표면 작용 물질과 함께 제형화된다. 한 실시양태에서, 화합물은 용매로서 공지된 화합물의 클래스로부터 선택된다.

A. 전장 포자 표면 단백질

한 실시양태에서, 미생물 포자 표면 단백질의 적어도 일부는 전장 미생물 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 전장 미생물 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 전장 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 전장 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 씨. 디피실레 전장 포자 표면 단백질은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다.

한 실시양태에서, 전장 미생물 포자 표면 단백질은 바실러스 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 바실러스 전장 포자 표면 단백질은 비. 안트라시스 전장 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 비. 안트라시스 전장 포자 표면 단백질은 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다.

B. 말단절단된 포자 표면 단백질

한 실시양태에서, 미생물 포자 표면 단백질의 적어도 일부는 말단절단된 미생물 포자 표면 단백질을 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 그러한 말단절단된 미생물 포자 표면 단백질은 재조합 단백질 발현 플랫폼 (platform) (아래 참조)에 의해 제작될 수 있는 것으로 생각되고, 여기서 미생물 포자 표면 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부가 벡터 내에 통합되고 적합성 프로모터와 작동가능한 조합으로 놓인다. 별법으로, 그러한 말단절단된 미생물 표면 단백질은 임의의 하나 이상의 앞서 보고된 펩티다제 효소를 사용하여 전장 미생물 포자 표면 단백질을 소화시킴으로써 생성할 수 있다. 그러한 펩티다제 효소는 엔도펩티다제, 엑소펩티다제, 아미도펩티다제, 및/또는 카르복시펩티다제를 포함하고 이로 제한되지 않는 효소를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 말단절단된 미생물 포자 표면 단백질은 클로스트리듐 포자 표면 단백질로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 말단절단된 포자 표면 단백질은 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 III에 나열된 바와 같은 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1581)로부터 유래할 수 있다:

<표 III>

한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 IV에 나열된 바와 같이 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1067)로부터 유래할 수 있다:

<표 IV>

한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 V에 나열된 바와 같이 클로스트리듐 가상 단백질 (CD3620)로부터 유래할 수 있다:

<표 V>

한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 VI에 나열된 바와 같이 클로스트리듐 가상 단백질 (CD1613)로부터 유래할 수 있다:

<표 VI>

한 실시양태에서, 클로스트리듐 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 VII에 나열된 바와 같이 가상 단백질 (CD1711)로부터 유래할 수 있다:

<표 VII>

한 실시양태에서, 클로스트리듐 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 VIII에 나열된 바와 같이 가상 단백질 (CD0881)로부터 유래할 수 있다:

<표 VIII>

한 실시양태에서, 클로스트리듐 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 IX에 나열된 바와 같이 가상 단백질 (CD1511)로부터 유래할 수 있다:

<표 IX>

한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 X에 나열된 바와 같이 콜라겐-유사 단백질로부터 유래할 수 있다.

<표 X>

한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 XI에 나열된 바와 같이 콜라겐-유사 단백질로부터 유래할 수 있다.

<표 XI>

한 실시양태에서, 씨. 디피실레 말단절단된 포자 표면 단백질은 표 XII에 나열된 바와 같이 콜라겐-유사 단백질로부터 유래할 수 있다.

<표 XII>

C. 포자 표면 단백질 모방체

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 포자 표면 단백질 모방체를 포함하는 감염 제어 조성물을 제조 및 사용하기 위한 조성물 및 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 단백질 모방체는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 원형 3차 구조를 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질 모방체는 작은 유기 분자를 포함한다.

본 발명의 펩티드에 결합하는 활성 부위의 인식 및 결합에 필요한 입체형태를 모방하는 작은 유기 분자가 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 예를 들어, 미생물 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편의 모방체가 고려된다. 그러한 모방체에 대한 다양한 설계가 가능하다. 예를 들어, 결합에 필요한 입체형태가 비펩티드에 의해 안정화된 환상 및/또는 선형 단백질 및/또는 펩티드 단편이 구체적으로 고려된다. 모두 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,192,746 (Lobl, et al.), 미국 특허 5,169,862 (Burke, Jr., et al.), 미국 특허 5,539,085 (Bischoff, et al.), 미국 특허 5,576,423 (Aversa, et al.), 미국 특허 5,051,448 (Shashoua), 및 미국 특허 5,559,103 (Gaeta, et al.)에는 그러한 화합물을 생성하기 위한 다수의 방법이 기재되어 있다.

펩티드 서열을 모방하는 비-펩티드 화합물의 합성은 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 비-펩티드 길항제는 Arg-Gly-Asp 서열을 모방한다 (Eldred, et al., J. Med. Chem. 37:3882 (1994)). 마찬가지로, 문헌 [Ku, et al., J. Med. Chem. 38:9 (1995)]에는 일련의 그러한 화합물의 합성이 추가로 제시되어 있다. 미생물 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편을 모방하는 그러한 비-펩티드 화합물이 본 발명에서 구체적으로 고려된다.

본 발명은 관련 펩티드 서열을 반복하는 다량체성 화합물인 합성 모방 화합물을 또한 고려한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 펩티드는 아미노기를 커플링제, 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)와의 반응에 의해 활성화시킨 카르복실기에 연결함으로써 합성할 수 있다. 활성화된 카르복실에 대한 유리 아미노기의 공격이 펩티드 결합 및 디시클로헥실우레아의 방출을 일으킨다. 반응하도록 의도되는 아미노 및 카르복실기 이외의 잠재적으로 반응성인 기를 보호하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 카르복실기를 함유하는 성분의 a-아미노기를 tert-부틸옥시카르보닐기로 차단할 수 있다. 상기 보호기는 후속적으로 펩티드를 묽은 산 (이는 펩티드 결합을 무손상 상태로 유지시킴)에 노출시킴으로써 제거할 수 있다.

상기 방법을 이용하여, 펩티드는 불용성 매트릭스, 예를 들어 폴리스티렌 비드에 연결된 성장하는 펩티드 사슬에 아미노산을 단계식으로 첨가함으로써 고체상 방법에 의해 쉽게 합성할 수 있다. 목적하는 펩티드 서열의 카르복실-말단 아미노산 (아미노 보호기를 갖는)을 먼저 폴리스티렌 비드에 고정시킨다. 이어서, 아미노산의 보호기를 제거한다. 다음 아미노산 (보호기를 갖는)을 커플링제와 함께 첨가한다. 이어서 세척 사이클을 수행한다. 사이클은 필요한 경우에 반복된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 모방체는 상기한 미생물 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편에 서열 상동성을 갖는 펩티드이다. 서열 상동성 및 보다 중요하게는 통계상 유의한 유사성을 평가하기 위한 하나의 일반적인 방법은 Z 값을 얻기 위해 립만 (Lipman) 및 피어슨 (Pearson)에 의해 저술된 알고리즘을 이용하는 몬테 카를로 (Monte Carlo) 분석을 사용하는 것이다. 상기 분석에 따라, 6을 초과하는 Z 값은 확률적 유의성을 나타내고, 10을 초과하는 Z 값은 통계상 유의한 것으로 간주된다 ([W.R. Pearson and D.J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85:2444-2448 (1988)]; [D.J. Lipman and W.R. Pearson, Science, 227:1435-1441 (1985)]). 본 발명에서, 미생물 오염제거 및 미생물 감염의 문제를 해결하는데 유용한 합성 폴리펩티드는 통계상 유의한 서열 상동성 및 유사성 (몬테 카를로 분석에서 립만 및 피어슨 알고리즘의 Z 값이 6을 초과함)을 갖는 펩티드이다.

IV . 감염 제어 조성물의 스크리닝

한 실시양태에서, 본 발명은 무생물 및/또는 생물 표면에 대한 미생물 포자의 결합을 억제, 길항, 저해, 대체 및/또는 파괴하는 감염 제어 조성물을 스크리닝하는 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 무생물 및/또는 생물 표면에 대한 미생물 포자 표면 단백질의 결합을 억제, 길항, 저해, 대체 및/또는 파괴하는 감염 제어 조성물을 스크리닝하는 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 생물 표면은 피부, 인간 체조직 및/또는 인간 세포를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 무생물 표면은 세라믹, 타일, 화강암 및/또는 스테인레스 스틸을 포함하고 이로 제한되지 않는 경질 표면을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 미생물 포자는 클로스트리듐 포자를 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자는 씨. 디피실레 포자를 포함한다. 한 실시양태에서, 스크리닝된 감염 제어 조성물은 미생물 포자 표면 단백질에 결합할 수 있다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 감염 제어 조성물은 표면에 결합하여, 미생물 포자 표면 단백질의 결합을 차단하는 것으로 생각된다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 그러한 감염 제어 조성물은 바이러스, 세균, 진균, 식물, 및 동물 공급원으로부터 단리된 천연 화합물, 및 합성 화합물을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는 것으로 생각된다. 감염 제어 조성물의 공급원, 화학 구조 또는 작용 메카니즘은 본 발명에 필수적이지 않은 것으로 추가로 생각된다.

A. 표면에 대한 미생물 포자 결합의 검출을 위한 분석

1. 표준 성장 분석

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 적어도 하나의 미생물 포자에 의한 오염이 의심되는 기질 표면; ii) 적어도 하나의 미생물 포자에 부착할 수 있는 복수의 감염 제어 조성물을 포함하는 포자 수집 장치; 및 iii) 적어도 하나의 미생물 포자의 성장을 지지할 수 있는 포자 성장 플레이트를 제공하고; b) 포자 수집 장치를 기질 표면과 접촉시키고 (여기서, 적어도 하나의 미생물 포자가 장치에 부착됨); c) 미생물 수집 장치를 포자 성장 플레이트와 접촉시키고; d) 포자 성장 플레이트 상에서 적어도 하나의 미생물 포자를 검출하는 것을 포함하는, 미생물 포자 및/또는 미생물 포자 단백질을 검출하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 감염 제어 조성물은 미생물 포자 단백질 펩티드 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자 단백질 펩티드 단편은 클로스트리듐 포자 단백질 펩티드 단편을 포함하는 군 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 미생물 포자는 클로스트리듐 디피실레 포자이다.

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 임의의 미생물 포자를 사용하여 성장 분석을 수행할 수 있는 것으로 생각된다. 예시로서, 씨. 스포로게네스 포자는 아래에서 오염된 표면으로부터 수집 후에 포자의 성장을 검출하는 방법에서 사용되지만, 임의의 미생물 포자가 치환될 수 있음을 이해해야 하고, 여기서 각각의 미생물 포자의 수집 및 검출은 각각 성공적으로 수행될 것이다 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 디피실레 항체).

a. 컵 스크럽 분석

하나의 설명된 기술은 인간 또는 동물 피부로부터 상재성 및 일과성 미생물의 회수를 위해 적합하다. 예를 들어, 기술은 임상 프로토콜 내에서 계내에서 또는 단리된 피부 또는 피부 동등물을 사용하는 연구를 위해 시험관 내에서 사용될 수 있다 (ASTM International, "Standard Test Method for Recovery of Microorganisms From Skin using the Cup Scrub Technique, E1874 - 09 (2009)). 간단히 설명하면, 상재성 미생물 또는 일과성 미생물 (즉, 예를 들어, 앞서 시험 부위에 적용된 미생물)은 피부에 대해 단단한 실린더 (cylinder)를 밀봉을 형성하기 위해 충분한 압력으로 누름으로써 및 회수 액체를 실린더 내로 주입시킴으로써 부위로부터 회수한다. 이어서, 피부의 표면을 규정된 기간 동안 유리 막대, 고무 폴리스맨 (rubber policeman), 또는 일부 다른 적합한 장치로 기계적으로 '긁는다'. 유체는 추가의 분석을 위해 실린더로부터 시험관 또는 다른 적합한 수용기 내로 피펫팅한다.

컵 스크럽 절차는 시험 표면 (즉, 예를 들어, 무손상 피부) 상의 미생물 포자의 수를 유의하게 감소시키기 위해 의도된 감염 제어 조성물을 함유하는 시험 물질을 평가하기 위해 본원에 기재된 임의의 방법 내로 통합될 수 있다. 이는 또한 잔류 항미생물 활성의 표시를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

b. 세포 배양 분석

씨. 디피실레 내생포자 현탁액의 분취액을 예비-환원시킨 (즉, 예를 들어, 산소 제거한) BCDC, TCCFA, 및 TSA 상에서 35℃에서 혐기성 조건으로 인큐베이팅한다. 대조군 및 실험 플레이트에 포자 현탁액을 동일하게 접종하고, 하나의 세트의 대조군 플레이트를 각각의 실험 지속 시간 동안 인큐베이팅하고 방해하지 않고 성장시켰다.

부착 실험은 한천을 채운 페트리 (Petri) 접시의 바닥 상에 원 (즉, 예를 들어, 표적 영역)을 놓고, 플레이트에 5 또는 10 ㎕의 씨. 디피실레 포자 현탁액을 표적 영역 내에 바로 접종하고, 이들 포자를 혐기성 후드 (포르마 사이언티픽 (Forma Scientific, 미국 오하이오주 마리에타)) 내에서 예비-환원시킨 플레이트 상에서 27 min, 99 min, 150 min 및 360 min 동안 인큐베이팅함으로써 이루어진다. 일정 시한의 인큐베이션 후에, 플레이트를 제거하고, 4 ml의 무균 증류수를 각각의 배양 플레이트에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 300 rpm에서 10 min 동안 진탕하고, 이 후 교반 용액을 한천 표면으로부터 무균적으로 피펫팅하여 제거하고, 플레이트를 24, 48, 및 72 h 동안 혐기성 조건으로 재-인큐베이팅한다. 플레이트가 오염되었는지 결정하기 위해, 유리 슬라이드 상에 광학 현미경 도말을 무작위 선정된 콜로니로부터 제조하고 광현미경 상에서 사진을 찍고, 임의의 호기성 오염물을 확인하기 위해 플레이트를 접종하고 호기성 조건 하에 인큐베이팅한다.

포자가 아직 한천에 부착되지 않은지 결정하고 이들이 한천 표면으로부터 쉽게 탈착되고 세척 제거될 수 있는지 확립하기 위해, 물 교반 용액 (플레이트를 진탕한 후 제거됨)을 또한 포자의 존재에 대해 시험한다. 물의 분취액을 (i) 위상 현미경에 의해 스크리닝하고; (ii) 이를 사용하여 한천 플레이트를 도말하고 (streaking); 및 (iii) BacTec NR6A 브로쓰 (혐기성 혈액 배양 브로쓰, 비디 마이크로바이올로지 시스템즈 (BD Microbiology Systems, 미국 메릴랜드주 코키스빌)) 내로 주입하고, 플레이트 및 브로쓰를 24 및 48 h에 세균 성장의 존재에 대해 판독한다.

2. 항-포자 표면 항체 분석

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 적어도 하나의 미생물 포자에 의한 오염이 의심되는 기질 표면; 및 ii) 적어도 하나의 미생물 포자에 결합할 수 있는 항-포자 표면 항체를 제공하고; b) 항-포자 표면 항체를 기질 표면 또는 포자 표면과, 항체가 적어도 하나의 미생물 포자에 결합하도록 하는 조건 하에 접촉시키고 (여기서, 항체/포자 복합체가 생성됨); c) 항체/포자 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 미생물 포자의 검출 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체 (즉, 예를 들어, F1997)를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-포자 표면 항체를 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 표지는 형광 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자는 클로스트리듐 디피실레 포자이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 적어도 하나의 미생물 포자에 의한 오염이 의심되는 기질 표면; ii) 적어도 하나의 미생물 포자에 결합할 수 있는 항-포자 표면 항체; 및 iii) 성장 분석 플레이트를 제공하고; b) 항-포자 표면 항체를 항체와 합하고 (여기서, 항체/포자 복합체가 생성됨); c) 항체/포자 복합체를 기질 표면과 접촉시키고; d) 항체/포자 복합체의 샘플을 표면으로부터 (즉, 예를 들어, 컵 스크럽 방법에 의해) 제거하고; e) 샘플을 성장 분석 플레이트 상에 도말하는 것을 포함하는, 미생물 포자의 검출 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체 (즉, 예를 들어, F1997)를 포함한다. 한 실시양태에서, 기질 표면은 돈피 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 표지는 형광 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자는 클로스트리듐 디피실레 포자이다.

a. 항체 개발

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 항-포자 표면 항체는 포자 표면 상의 임의의 에피토프 (즉, 단백질이든 다른 항원성 구조이든)에 대해 생성될 수 있는 것으로 생각된다. 예시로서, 씨. 스포로게네스 포자는 아래에서 항-포자 표면 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 생성하기 위한 방법에서 사용되지만, 임의의 미생물 포자가 치환될 수 있음을 이해해야 하고, 여기서 각각의 미생물 포자에 대한 항체는 성공적으로 생성될 것이다 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 디피실레 항체).

씨. 스포로게네스 포자에 대한 마우스 폴리클로날 항혈청 및 모노클로날 항체는 10⁸개의 불활성화된 포자 (4% (v/v) 포름알데히드 내에서 4 h 동안 37℃에서 인큐베이팅됨)의 몇몇 주사에 의해 얻었다. 모노클로날 항체는 코흘러 (Kohler) 및 밀스타인 (Milstein) (Kohler and Milstein, 1975)의 절차에 따라 생산하였다. 간단히 설명하면, 마우스를 폴리클로날 항체를 위해 제21일 및 제42일에 추가접종하고 제50일에 출혈시키거나, 모노클로날 항체를 위해 제50일에 추가접종하고 제53일에 융합을 위해 희생시켰다. 포자 원액은 씨. 스포로게네스 세포를 조리된 고기 배지 내에서 35℃에서 성장시키고, 클로스트리듐 페르프린겐스 세포를 유체 티오글리콜레이트 배지 내에서 37℃에서 혐기성 조건 하에 성장시킴으로써 제조한다.

씨. 스포로게네스 PA3679 포자 원액의 상기 포르말린 불활성화에 의해 제조된 항원은 위상차 현미경으로 관찰할 때 영양 세포 물질이 없었다 (Phillips et al., "Assessment of immunofluorescence measurements of individual bacteria in direct and indirect assays for Bacillus anthracis and Bacillus cereus spores" J. Appl. Bacteriol. 53:223-231 (1982)). 총 1 x 10⁷개의 씨. 스포로게네스 포자를 항원으로서 사용한다.

모노클로날 항체 생산은 많은 절차 중의 하나에 따라 수행한다 (Kohler et al., "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity" Nature 296:495-497 (1975) (전문이 본원에 참고로 포함됨)). 하이브리도마를 씨. 스포로게네스 포자와의 반응성에 대해 스크리닝한다. 반응성인 것으로 밝혀진 하이브리도마를 또한 영양 세포와의 반응성에 대해 스크리닝한다.

모노클로날 항체의 이소형 결정은 도트 블롯 면역분석 형식을 이용하여 수행한다. 포자를 도트 블롯 기구 내에서 이모빌론 (Immobilon)-P® 막 (밀리포어 코퍼레이션 (Millipore Corp., 미국 매사추세츠주 베드포드))에 적용한다. 이어서, 포자를 100 ml의 적절한 조직 배양 상등액과 함께 인큐베이팅한다. 포자에 결합된 모노클로날 항체는 바이오-라드 (Bio-Rad)® (미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 얻은 토끼 항-마우스 서브클래스 특이적 항혈청을 사용하여 이소형 결정한다.

이어서, 클로스트리듐 스포로게네스 포자를 이모빌론-P 막에 적용한 후, 상기 생성된 항체와 함께 인큐베이팅한다. 유사하게, 10⁶개의 클로스트리듐 영양 세포를 막에 적용한 후, 지시된 항체와 함께 인큐베이팅한다. 반응성은 염소 항-마우스 면역글로불린 G (IgG)-호스 래디시 페록시다제 접합체 (시그마 A4416) 또는 염소 항-마우스 IgM-호스 래디시 페록시다제 접합체 (시그마 A8786)를 사용하여 검출한다. 색상 발색은 불용성 기질 3-아미노-9-에틸-카르바졸 (바이오메다 코퍼레이션 (Biomeda Corp))을 사용하여 수행할 수 있다.

이어서, 배양 상등액을 트리스 (Tris)-완충 염수 (TBS) (0.01 M 트리스, 0.15 M NaCl, pH 7.4)로 1:32 및 1:128 희석한다. 희석시킨 배양 상등액의 분취액을 부드럽게 뒤집으면서 동일 부피의 포자 항원 (4 x 10⁹개의 포자/ml)과 48℃에서 철야 혼합한다. 무균 증류수와 혼합한 희석시킨 배양 상등액이 양성 대조군 역할을 한다. 포자에 흡착된 항체는 원심분리 (약 4,000 xg, 10 min)에 의해 제거한다. 상등액 유체를 상기 상세히 설명한 바와 같이 면역블롯 분석에서 사용한다.

항체를 조직 배양 상등액의 황산암모늄 침전에 의해 농축시킨다 (Halow et al., "Storing and purifying antibodies" In: Antibodies: A Laboratory Manual, p. 283-318. E. Halow and D. Lane (ed), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)). 농축된 단백질을 N-히드록시숙신이미드비오틴 (시그마 케미컬 코. (Sigma Chemical Co)) (샘플 내에 약 100 mg/mg 항체)과 함께 실온에서 4 h 동안 인큐베이팅함으로써 비오티닐화한다. 1 몰 염화암모늄 (20 ml/250 mg 비오틴)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 비오티닐화된 단백질을 포스페이트-완충 염수 (0.1 M 인산나트륨, 0.8% NaCl) (PBS) (pH 7.0)에 대해 광범하게 투석시킨다. 면역세포화학 위치결정 연구를 위해.

IgG 항체는 제조자의 지시에 따라 단백질 A 컬럼 (피어스 케미칼 코. (Pierce Chemical Co., 미국 일리노이주 록포드))을 사용함으로써 조직 배양 상등액에서 정제한다. IgM 항체는 염소 항-마우스 IgM 항체 컬럼 (피어스 케미칼 코)를 사용함으로써 배양 상등액으로부터 정제한다. 조직 배양 상등액을 PBS 내에 1:1 희석하고, PBS로 평형화시킨 염소 항-마우스 IgM 컬럼에 적용한다. 컬럼으로부터 항체의 세척 및 용출을 제조자의 지시에 따라 수행한다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고 센트리콘 (Centricon) 10 마이크로농축기 (아미콘 (Amicon, 미국 매사추세츠주 댄버스))로 농축시키고, 3,000 xg에서 30 min 동안 원심분리한다.

3. 항-포자 표면 단백질 항체 분석

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 적어도 하나의 미생물 포자에 의한 오염이 의심되는 기질 표면 (상기 포자는 적어도 하나의 표면 단백질을 포함함); 및 ii) 적어도 하나의 표면 단백질에 결합할 수 있는 항-표면 단백질 항체를 제공하고; b) 항-표면 단백질 항체를 기질 표면과, 항체가 적어도 하나의 표면 단백질에 결합하도록 하는 조건 하에 접촉시키고 (여기서, 항체/단백질 복합체가 생성됨); c) 항체/단백질 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 미생물 포자의 검출 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 CD1067, CD1581, CD3520, CD0372, 또는 CD1613을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 항-표면 단백질 항체는 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 표지는 형광 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 클로스트리듐 디피실레 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 바실러스 안트라시스 표면 단백질이다.

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 미생물 표면 단백질 항체는 포자 표면 단백질 상의 특이적 에피토프 (즉, 아미노산 서열이든 다른 항원성 구조이든)에 대해 생성될 수 있는 것으로 생각된다. 예시로서, 특이적 씨. 디피실레 포자 표면 단백질은 아래에서 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성하기 위한 방법에서 사용되지만, 임의의 미생물 포자 표면 단백질이 치환될 수 있음을 이해해야 하고, 여기서 각각의 미생물 포자 표면 단백질에 대해 작용성인 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체는 성공적으로 생성될 것이다.

씨. 디피실레 가상 단백질 (서열 1)에 대한 마우스 폴리클로날 항혈청 및 모노클로날 항체는 단리된 가상 단백질의 몇몇 주사 (즉, 예를 들어, 주사 당 약 10⁸개의 단백질)에 의해 얻어진다. 모노클로날 항체는 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein, 1975)의 절차에 따라 생산한다. 간단히 설명하면, 마우스를 폴리클로날 항체를 위해 제21일 및 제42일에 추가접종하고 제50일에 출혈시키거나, 모노클로날 항체를 위해 제50일에 추가접종하고 제53일에 융합을 위해 희생시킬 수 있다. 하이브리도마를 씨. 디피실레 포자와의 반응성에 대해 스크리닝할 수 있다. 반응성인 것으로 밝혀진 하이브리도마를 또한 영양 세포와의 반응성에 대해 스크리닝한다.

모노클로날 항체의 이소형 결정은 도트 블롯 면역분석 형식을 이용하여 수행한다. 포자를 도트 블롯 기구 내에서 이모빌론-P® 막 (밀리포어 코퍼레이션, 미국 매사추세츠주 베드포드)에 적용한다. 이어서, 포자를 100 ml의 적절한 조직 배양 상등액과 함께 인큐베이팅한다. 포자에 결합된 모노클로날 항체는 바이오-라드® (미국 캘리포니아주 허큘레스)로부터 얻은 토끼 항-마우스 서브클래스 특이적 항혈청을 사용함으로써 이소형 결정한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 적어도 하나의 미생물 포자에 의한 오염이 의심되는 기질 표면 (상기 포자는 적어도 하나의 표면 단백질을 포함함); 및 ii) 적어도 하나의 표면 단백질에 결합할 수 있는 항-표면 단백질 모노클로날 항체를 제공하고; b) 항-표면 단백질 모노클로날 항체를 기질 표면과, 모노클로날 항체가 적어도 하나의 표면 단백질에 결합하도록 하는 조건 하에 접촉시키고 (여기서, 모노클로날 항체/단백질 복합체가 생성됨); c) 모노클로날 항체/단백질 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 미생물 포자의 검출 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 CD1067, CD1581, CD3520, CD0372, 또는 CD1613을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 항-표면 단백질 모노클로날 항체는 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 표지는 형광 표지를 포함한다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 클로스트리듐 디피실레 표면 단백질이다. 한 실시양태에서, 표면 단백질은 바실러스 안트라시스 표면 단백질이다.

B. 표면에 대한 미생물 포자 표면 단백질 결합을 검출하기 위한 분석

잠재적인 감염 제어 조성물을 스크리닝하기 위해 포자 표면 단백질 결합을 검출하기 위한 몇몇 방법을 본원에서 제공한다.

감염 제어 조성물을 개발하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 방법 및 장치를 제공하기 위해, 본 발명은 일반적으로 시험관 내에서 그에 대해 감염 제어 조성물이 요구되는 주어진 미생물 시스템을 모방하는 모델 시험관내 시스템을 포함한다. 그에 대해 이들 감염 제어 조성물이 스크리닝될 수 있는 시스템의 범위는 광범하다. 예를 들어, 잠재적인 감염 제어 조성물을 임의로 감염성 미생물 유기체와 연관된 핵심 사건을 차단하거나 느리게 하거나 달리 억제하는데 있어서의 효과에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 잠재적인 감염 제어 시험 조성물을 임의로 적어도 부분적으로 포자형성 또는 예를 들어, 피부, 체조직, 화강암, 스테인레스 스틸, 세라믹 등을 비롯한 표면에 대한 포자의 결합을 담당하는 시스템을 차단하는 그들의 능력에 대해 스크리닝한다. 이어서, 이들 스크리닝 분석 방법에서 유망한 결과를 보이는 감염 제어 시험 조성물을 미생물 감염의 질병 또는 증상의 치료를 위한 효과적인 약물학적 물질을 확인하기 위해 추가로 시험할 수 있다.

1. 결합 스크린

가장 간단한 형태에서, 본 발명의 방법 및 기구에서 사용되는 감염 제어 조성물 스크리닝 모델은 감염 제어 조성물과 생화학적 시스템의 성분의 상호작용, 예를 들어, 수용체-리간드 상호작용, 효소-기질 상호작용 등에 대해 스크리닝할 것이다. 본 형태에서, 스크리닝 모델은 대개 시스템의 2개의 상호작용 성분 (즉, 예를 들어, 세균 포자 단백질 및 감염 제어 조성물, 또는 미생물 효소 및 감염 제어 조성물)을 포함할 것이다.

한 실시양태에서, 방법은 미생물 포자 단백질을 감염 제어 시험 조성물과 접촉시키고 표면에 대한 미생물 포자의 잔류 결합을 분석함으로써, 감염 제어 시험 조성물이 표면과 미생물 포자 단백질 결합 상호작용에 대한 효과를 갖는지 결정하는 것을 포함한다. 이어서, 잔류 표면 결합량을 대조군 표면 결합, 예를 들어, 감염 제어 조성물의 부재 하에 수행된 동일한 결합 분석에 비교한다. 대개, 그러한 결합 분석은 스크리닝 시스템의 파라미터 측정을 수반한다. "스크리닝 시스템의 파라미터"는 몇몇 측정가능한 증거, 예를 들어, 표지된 기의 존재 또는 부재 또는 분자량의 변화 (예를 들어, 결합 반응, 전송 스크린에서), 반응 생성물 또는 기질의 존재 또는 부재 (기질 전환 (turnover) 측정에서), 또는 전기영동적 이동성의 변경 (대개 표지된 화합물의 용출 시간의 변화에 의해 검출됨)을 의미한다.

2-성분 스크리닝 시스템의 면에서 상기 설명하였지만, 방법 및 기구는 또한 훨씬 더 복잡한 시스템의 효과기에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 시스템의 결과 또는 최종 생성물은 공지되고 일부 수준, 예를 들어, 효소적 경로, 포자 표면 신호전달 경로 등에서 분석가능하다. 별법으로, 본원에 기재된 방법 및 기구는 임의로 생화학적 시스템의 단일 성분과 상호작용하는 화합물, 예를 들어, 특정 생화학적 화합물, 예를 들어, 수용체, 리간드, 효소, 핵산, 구조적 거대분자 등에 특이적으로 결합하는 화합물에 대해 스크리닝하기 위해 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 분석은 2개 이상의 성분들의 상호작용을 수반할 수 있다. 2개의 성분 사이의 상호작용을 수반하는 분석은 "결합쌍"의 구성원들 사이의 결합의 인핸서 또는 억제제에 대한 분석으로서 보여질 수 있다. 바람직한 결합쌍은 미생물 포자 단백질/작은 유기 분자, 미생물 포자 단백질/핵산, 미생물 포자 단백질/감염 제어 조성물 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 포자 표면 단백질 단편)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 결합쌍의 각각의 구성원은 고정 (즉, 예를 들어, 표면에 부착)될 수 있는 한편, 다른 구성원은 표면에 접촉하는 용액 내에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 두 구성원은 모두 상이한 표면에 부착될 수 있고, 이후 이들은 분석을 수행하기 위해 병치된다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 수용체 분자와 결합쌍을 형성하는 감염 제어 조성물에 대해 스크리닝하는데 유용할 것이고, 여기서 결합쌍은 수용체 분자 및 표면 사이에 상호작용에 영향을 미친다. 본원에서 사용될 때, 용어 "수용체"는 일반적으로 결합쌍의 하나의 구성원 (즉, 예를 들어, 미생물 포자 표면 단백질)를 나타낸다. 결합쌍의 다른 구성원은 "감염 제어 조성물"로 칭한다. 따라서, 수용체/리간드 쌍은 전형적인 단백질 수용체, 대체로 막 회합형, 및 그의 천연 리간드, 예를 들어, 또 다른 단백질 또는 소분자를 포함할 수 있다. 수용체/리간드 쌍은 또한 항체/항원 결합쌍, 상보성 핵산, 핵산 회합 단백질 및 그들의 핵산 리간드를 포함할 수 있다.

전통적으로, 수용체/리간드 상호작용의 효과기 (즉, 예를 들어, 미생물 포자 표면 단백질/감염 제어 조성물 상호작용)에 대해 스크리닝하는 방법은 시험 화합물의 존재 하에 수용체/리간드 결합쌍을 인큐베이팅하는 것을 수반하였다. 이어서, 수용체/리간드 쌍의 결합 수준을 음성 및/또는 양성 대조군에 비교한다. 정상 결합의 감소가 보이는 경우에, 시험 화합물은 수용체/리간드 결합의 억제제인 것으로 결정된다. 그 결합의 증가가 보이는 경우에, 시험 화합물은 상호작용의 인핸서 또는 유도제인 것으로 결정된다. 그러나, 본 발명에서 수용체/리간드 상호작용이 감염 제어 조성물의 존재 하에 표면에 대한 수용체의 잔류 결합의 양을 측정함으로써 분석되는 것이 고려된다.

한 실시양태에서, 고속대량 (high throughput) 스크리닝 분석은 멀티웰 반응 플레이트, 예를 들어, 멀티웰 마이크로플레이트를 포함할 수 있고, 이것은 다수의 잠재적인 감염 제어 조성물의 동시의 평행 스크리닝을 허용한다.

유사한, 아마도 겹치는 세트의 생화학적 시스템은 미생물 효소 및 그들의 기질 사이의 상호작용을 포함할 수 있다. 용어 "효소"는 본원에서 사용될 때, 일반적으로 다른 화합물 또는 "기질"에서 화학적 변화를 유도하도록 촉매로서 작용하는 단백질을 나타낸다. 대개, 그의 기질을 향한 효소 활성의 효과기는 효소 활성의 변화를 검출하기 위한 최적 조건 하에 스크리닝할 화합물의 존재 및 부재 하에 효소를 기질과 접촉시킴으로써 스크리닝된다. 반응을 위한 설정 시간 후에, 혼합물을 반응 생성물의 존재 또는 기질의 양의 감소에 대해 분석한다. 이어서, 촉매된 기질의 양을 대조군, 즉, 시험 화합물의 부재 또는 기지의 효과기의 존재 하에 기질과 접촉된 효소에 비교한다. 위에서와 같이, 그의 기질을 향한 효소 활성을 감소시키는 화합물은 "억제제"로 칭하는 한편, 활성을 강화하는 화합물은 "유도제"로 칭한다.

실시되는 특정 실시양태에 따라, 감염 제어 시험 조성물은 주사에 의해, 용액 내에 유리된, 담체에 부착된, 고체 지지체 (즉, 예를 들어, 비드)에 부착된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 상이한 매질 내에 제공된다. 시험 화합물의 고정화를 위해 많은 적합한 고체 지지체가 사용된다. 적합한 고체 지지체의 예는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란 (상업적으로 이용가능함, 즉, 세파덱스 (Sephadex), 세파로스 (Sepharose)) 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 여과지, 니트로셀룰로스, 이온 교환 수지, 플라스틱 필름, 유리 비드, 폴리아민메틸비닐에테르 말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 비단 등을 포함한다. 추가로, 본원에 기재된 방법 및 기구에 대해, 시험 화합물은 개별적으로 또는 집단으로 스크리닝된다. 집단 스크리닝은 주어진 기에 대한 하나 초과의 양성 결과를 예상하지 않을 것과 같이 효과적인 시험 화합물에 대한 적중률 (hit rate)가 낮은 것으로 예상되는 경우에 특히 유용하다. 별법으로, 그러한 집단 스크리닝은 상이한 시험 화합물의 효과가 단일 시스템에서 차별적으로 검출되는 경우에 사용된다.

2. 면역분석

한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 관련 면역학적 물질 (즉, 예를 들어, 항원 및 항체) 사이에서 반응이 일어나는 면역학적 시험을 고려한다. 따라서, 예를 들어, 특정 항원 또는 항체가 샘플 내에 체류하는지 및 체류하는 양을 결정하고자 할 때, 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 그의 면역학적 결합쌍과 반응시키려고 시도해야 한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 반응이 일어나면, 그 반응의 시각화가 원래 시험된 유체 내의 항원 또는 항체의 존재의 증거인 것으로 생각된다.

한 실시양태에서, 항체/항원 결합쌍은 표시자 또는 담체 입자를 사용하여 시각화될 수 있다. 하나의 적합한 시스템은 합성 수지 입자, 표면, 또는 매트릭스가 그 위에 적절한 항원 (즉, 예를 들어, 미생물 포자 단백질 단편) 또는 항체 (즉, 예를 들어, 미생물 포자 단백질 단편에 친화도를 갖는 것)이 흡착된 흡착제로서 사용된 중합성 입자 기술을 포함한다.

면역분석을 위한 형식은 경쟁적 (예를 들어, ELISA, 합텐 억제 등) 및 비경쟁적 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다양한 면역분석 형식이 보고되었다 (미국 특허 4,366,241 ; 4,376,110; 4,517,288; 및 4,837,168; [Asai (1993) Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York, Stites] 및 [Terr, eds. (1991) Basic and Clinical Immunology 7th Edition] 등과 이들에 인용된 문헌 참조, 모든 참조문은 본원에 참고로 포함됨).

3. 핵산 결합 분석

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 물질 및 방법은 핵산 결합 단백질 분석에서 성분들을 고정화하기 위해 사용된다. 대개, 그러한 분석은 하나 이상의 결합 단백질에 의한 핵산의 결합을 검출한다. 분석은 일반적으로 (특이성 또는 친화도를) 개선하거나 하나 이상의 특정 핵산 결합 단백질에 의한 핵산 결합을 억제하는 물질에 대해 스크리닝하기 위해 사용된다. 핵산 결합 단백질은 엔도뉴클레아제, 중합효소, 핵 전사 인자 수용체, API 단백질 (즉, 예를 들어, fas 및 jun)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 핵산 결합 분석은 단백질 결합 부위을 함유하는 핵산 또는 그의 결합 단백질의 표면에 대한 부착에 의해 촉진될 수 있다.

4. 생리학상 적합성 용액 내에서 결합 분석

많은 상기한 분석은 목적하는 활성을 유지하기 위해 대상체 분석 성분 (예를 들어, 효소)에 대해 특정 조건을 요구함이 이해될 것이다. 대개, 그러한 분석은 성분 활성에 중요한 요소 (예를 들어, pH, 이온 조성)에 대해 생리학상 적합성 조건을 유지하기 위해 최적화된다.

본 발명의 감염 제어 조성물이 대부분의 이온 종 (예를 들어, Na⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺ 등)의 생리학적 농도에 대해 안정한 것이 상당히 유리하다. 따라서, 분석은 표준 생리학상 적합성 조성물 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수 (PBS), 표준 링거 용액 등) 내에서 실행할 수 있다.

본 발명의 감염 제어 조성물은 그에 대해 결합쌍인 모이어티 (예를 들어, 폴리펩티드(들))를 정제하기 위해 또한 사용될 수 있다. 구체적으로, 감염 제어 조성물은 실질적으로 임의의 음이온 또는 양이온 교환 수지와 함께 사용될 수 있다. 적합한 음이온 및 양이온 교환 수지는 상업적으로 이용가능하다. 양이온 교환 수지는 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스를 포함하고 이로 제한되지 않는 한편, 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, DEAE 세파로스 겔 여과 이온 교환 매질, 헤파린 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

하나의 바람직한 실시양태에서, 감염 제어 조성물과 미생물 포자 표면 단백질의 상호작용은 정제 목적을 위해 활용될 수 있다. 이것은 운모 (mica)를 각각 양이온 교환 수지 또는 니켈 수지에 대해 치환시키는 양이온 교환 수지에 유사한 방식으로 또는 폴리히스티딘/니켈 분리 시스템에 유사한 방식으로 수행된다. 한 실시양태에서, 운모는 그를 통해 샘플이 유동하는 층 (bed) (운모 플레이크 또는 분말)으로서 제공된다. 운모 층은 시린지, 크로마토그래피 컬럼 등에 부착가능한 카트리지 (cartridge)를 비롯한 임의의 다양한 적합한 용기 내에 하우징된다. 미생물 포자 표면 단백질은 운모 층에 결합하는 반면, 샘플의 다른 성분들은 세척 제거된다. 비-특이적 결합 성분들은 미생물 포자 표면 단백질을 보유하면서 바람직하지 않은 성분을 방출시키기 위해 충분한 농도에서 염 용액을 사용하여 용출 제거될 수 있다. 일단 감염 제어 조성물이 미생물 포자 표면 단백질에 결합되면, 감염 제어 조성물은 요구되는 대로 충분한 염 농도 및/또는 다른 적절한 용매 혼합물의 적용에 의해 방출될 수 있다.

5. 연속 유동 분석 시스템

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 기구는 연속 유동 분석 시스템을 사용하는 감염 제어 시험 조성물의 스크리닝에서 사용된다. 그러한 연속 유동 분석 시스템의 사용은 표면에 대한 포자 표면 단백질 결합에 대한 스크리닝에 제한되지 않고, 대신에 효소 활성의 억제제 또는 유도제, 또는 수용체-리간드 결합의 효현제 또는 길항제에 대해 스크리닝하는데 또한 쉽게 사용될 수 있다.

간단히 설명하면, 연속 분석 유동 시스템은 유체 경로 (즉, 예를 들어, 마이크로어레이, 크로마토그래피 컬럼, 또는 마이크로제작된 채널)를 따라 특정 생화학적 시스템의 연속 유동을 수반한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "연속적"은 일반적으로 연속적으로 유동되는 특정 조성물의 끊어지지 않거나 인접한 흐름을 나타낸다. 예를 들어, 연속 유동은 설정 속도를 갖는 일정한 유체 유동, 또는 별법으로 일시정지 (pause)가 달리 유동 흐름을 중단시키지 않도록 전체 시스템의 유속 내의 일시정지를 포함하는 유체 유동을 포함할 수 있다.

6. 검출가능 표지

한 실시양태에서, 기능성 스크리닝 시스템은 검출가능한 사건 또는 신호를 생성하는 것을 포함한다. 그러한 검출가능한 신호는 광학상 검출가능한 발색 또는 형광 신호를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 효소 시스템에 대해, 그러한 신호는 예를 들어, 발색 또는 형광 기질에 대한 효소의 촉매 작용의 생성물에 의해 생산할 수 있다. 결합 시스템, 예를 들어, 표면에 대한 수용체 리간드 상호작용 또는 미생물 포자 표면 결합에 대해, 신호는 대개 표지된 리간드와 수용체의 또는 그 반대의 회합을 수반할 것이다.

매우 다양한 다른 검출가능한 신호 및 표지를 또한 본 발명의 실시양태에서 사용할 수 있다. 상기한 발색 및 형광 표지 이외에, 방사성 붕괴, 전자 밀도, pH 변화, 용매 점도, 온도 및 염 농도가 또한 편리하게 측정된다.

보다 일반적으로, 표지는 분광, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단에 의해 통상적으로 검출가능하다. 예를 들어, 유용한 핵산 표지는 32P, 35S, 형광 염료, 전자 치밀 (electron-dense) 시약, 효소 (예를 들어, ELISA에서 흔히 사용되는), 비오틴, 디옥시게닌, 또는 그에 대해 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용가능한 합텐 및 단백질을 포함한다. 생물학적 성분의 표지에 적합한 매우 다양한 표지는 공지되어 있고, 학술 및 특허 문헌 모두에 광범하게 보고되어 있으며, 일반적으로 생물학적 성분의 표지를 위해 본 발명에 적용가능하다. 적합한 표지는 방사성 뉴클레오티드, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자성 입자 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 표지제는 임의로 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단백질 또는 다른 중합체, 예를 들어 친화도 매트릭스, 탄수화물 또는 지질을 포함한다.

표지의 검출은 방사성 또는 형광 마커의 분광광도계 또는 광학적 추적 (tracking), 또는 크기, 전하 또는 친화도에 기초하여 분자를 추적하는 다른 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 진행할 수 있다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 물리 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질의 것일 수 있다. 그러한 검출가능한 표지는 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 고체 기질, 분광 기술 등의 영역에 존재하고, 일반적으로 그러한 방법에 유용한 표지는 본 발명에 적용될 수 있다.

따라서, 표지는 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 열 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성 표지 (예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P 또는 ³³P), 효소 (예를 들어, LacZ, CAT, 호스 래디시 페록시다제, 알칼리성 포스파타제, 및 마커 생성물로서 또는 ELISA에서와 같이 검출가능한 효소로서 흔히 사용되는 기타 효소), 핵산 중간삽입자 (intercalator) (예를 들어, 에티듐 브로마이드) 및 비색 표지, 예를 들어 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 형광 표지를 고려한다: 표지에서 높은 감수성, 높은 안정성, 낮은 배경, 낮은 환경 감수성 및 높은 특이성. 본 발명의 표지 내로 도입되는 그러한 형광 모이어티는 1- 및 2-아미노나프탈렌, p,p'-디아미노스틸벤, 파이렌, 4급 페난트리딘 염, 9-아미노아크리딘, p,p'-디아미노벤조페논 이민, 안트라센, 옥사카르보시아닌, 메로시아닌, 3-아미노에퀼레닌, 페릴렌, 비스벤족사졸, 비스-p-옥사졸릴 벤젠, 1,2-벤조페나진, 레티놀, 비스-3-아미노피리디늄 염, 헬레브리게닌, 테트라시클린, 스테로페놀, 벤즈이미다졸릴페닐아민, 2-옥소-3-크로멘, 인돌, 잔텐, 7-히드록시쿠마린, 페녹사진, 살리실레이트, 스트로판티딘, 포르피린, 트리아릴메탄 및 플라빈을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 실시양태에 의해 검출가능한 요소에 연결하기 위한 관능기를 갖거나, 그러한 관능기를 도입하기 위해 변형될 수 있는 개별적인 형광 화합물은 단실 클로라이드; 플루오레세인, 예를 들어 3,6-디히드록시-9-페닐잔트히드롤; 로다민이소티오시아네이트; N-페닐 1-아미노-8-술포나토나프탈렌; N-페닐 2-아미노-6-술포나토나프탈렌; 4-아세트아미도-4-이소티오시아나토-스틸벤-2,2'-디술폰산; 파이렌-3-술폰산; 2-톨루이디노나프탈렌-6-술포네이트; N-페닐-N-메틸-2-아미노나프탈렌-6-술포네이트; 에티듐 브로마이드; 스테브린; 아우라민-0,2-(9'-안트로일)팔미테이트; 단실 포스파티딜에탄올아민; N,N'-디옥타데실 옥사카르보시아닌: N,N'-디헥실 옥사카르보시아닌; 메로시아닌, 4-(3'피레닐)스테아레이트; d-3-아미노데스옥시에퀼레닌; 12-(9'-안트로일)스테아레이트; 2-메틸안트라센; 9-비닐안트라센; 2,2'(비닐렌-p-페닐렌)비스벤족사졸; p-비스(2-(4-메틸-5-페닐-옥사졸릴))벤젠; 6-디메틸아미노-1,2-벤조페나진; 레티놀; 비스(3'-아미노피리디늄) 1,10-데칸디일 디요오다이드; 헬리브리에닌의 술포나프틸히드라존; 클로로테트라시클린; N-(7-디메틸아미노-4-메틸-2-옥소-3-크로메닐)말레이미드; N-(p-(2-벤즈이미다졸릴)-페닐)말레이미드; N-(4-플루오란틸)말레이미드; 비스(호모바닐린산); 레사자린; 4-클로로-7-니트로-2,1,3-벤조옥사디아졸; 메로시아닌 540; 레소루핀; 로즈 벵갈 (rose bengal); 및 2,4-디페닐-3(2H)-푸라논을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

많은 형광 태그가, 예를 들어 시그마 케미컬 컴퍼니 (미국 미주리주 세인트루이스), 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes), 알&디 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스), 파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지 (Pharmacia LKB Biotechnology, 미국 뉴저지주 피스카타웨이), 클론테크 래보래토리즈, 인크. (CLONTECH Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 팔로 알토), 켐 진스 코퍼레이션 (Chem Genes Corp), 알드리치 케미칼 컴퍼니 (Aldrich Chemical Company, 미국 위스콘신주 밀워키), 글렌 리써치, 인크. (Glen Research, Inc), 깁코 비알엘 라이프 테크놀로지스, 인크. (GIBCO BRL Life Technologies, Inc., 미국 메릴랜드주 게이터스버그), 플루카 케미카-바이오케미카 어낼리티카 (Fluka Chemica-Biochemika Analytika) (플루카 케미에 아게 (Fluka Chemie AG, 스위스 부흐스)), 및 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터시티)로부터 상업적으로 이용가능하다.

바람직하게는, 형광 표지는 약 300 nm 초과, 바람직하게는 약 350 nm, 보다 바람직하게는 약 400 nm 초과의 빛을 흡수하고, 대체로 흡수된 빛의 파장보다 약 10 nm 초과로 더 높은 파장을 방출한다. 결합된 표지의 흡수 및 방출 특징은 결합되지 않은 표지와 다를 수 있음을 알아야 한다. 따라서, 표지의 다양한 파장 범위 및 특징을 언급할 때, 사용될 때의 표지를 나타내고, 접합되지 않고 임의 용매 내에서 특성 결정되는 표지를 나타내지 않도록 의도된다. 형광 표지에 빛을 조사함으로써 복수의 방출을 얻을 수 있기 때문에 형광 표지는 검출가능하다. 따라서, 단일 표지가 복수의 측정가능한 사건을 제공할 수 있다. 검출가능한 신호는 또한 화학발광원 및 생물발광원에 의해 제공될 수 있다.

화학발광원은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 (excited) 후, 방출가능한 신호로서 기능을 하거나 형광 수용자에 에너지를 기부하는 빛을 방출할 수 있는 화합물을 포함한다. 광범하게 많은 패밀리의 화합물이 다양한 조건 하에 화학발광을 제공하는 것으로 발견되었다. 화합물들 중 하나는 2,3-디히드로-1,4-프탈라진디온이다. 가장 대중적인 화합물은 5-아미노 화합물인 루미놀이다. 다른 구성원은 5-아미노-6,7,8-트리메톡시- 및 디메틸아미노[ca]벤즈 유사체를 포함한다. 이들 화합물은 알칼리성 과산화수소 또는 차아염소산칼슘 및 염기를 사용하여 발광하도록 제조될 수 있다. 또 다른 화합물은 2,4,5-트리페닐이미다졸이고, 이것은 모 제품에 대한 일반명이 로핀 (lophine)이다. 화학발광 유사체는 파라-디메틸아미노 및 파라-메톡시 치환체를 포함한다. 또한, 화학발광은 또한 염기성 조건 하에 옥살레이트, 대체로 옥살릴 활성 에스테르, 예를 들어, p-니트로페닐 및 퍼옥시드, 예를 들어, 과산화수소를 사용하여 얻을 수 있다. N-알킬 아크리디늄 에스테르 (염기성 H₂0₂) 및 디옥세탄을 비롯한 다른 유용한 화학발광 화합물이 또한 공지되어 있고 이용가능하다. 별법으로, 생물발광을 제공하기 위해 루시페린이 루시퍼라제 또는 루시게닌과 함께 사용될 수 있다.

표지는 많은 방법에 따라 검출할 분자 (생성물, 기질, 효소 등)에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 매우 다양한 표지가 사용되고, 이때 표지의 선택은 요구되는 감도, 화합물의 접합의 용이성, 안정성 요건, 이용가능한 기기장치, 및 폐기 조항 (disposal provision)에 따라 결정된다. 비-방사성 표지는 종종 간접적인 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자 (예를 들어, 비오틴)은 중합체에 공유 결합된다. 이어서, 리간드는 본래 검출가능하거나 신호 시스템, 예를 들어 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 공유 결합된 항-리간드 (예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 많은 리간드 및 항-리간드를 사용할 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드를 갖는 경우, 예를 들어, 비오틴, 티록신 및 코티솔의 경우에, 이는 표지된 항-리간드와 함께 사용할 수 있다. 별법으로, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물을 항체와 조합으로 사용할 수 있다. 표지는 또한 예를 들어, 효소 또는 형광단과의 접합에 의해 신호 생성 화합물에 직접 접합될 수 있다. 표지로서 관심있는 효소는 주로 히드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도리덕타제, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어, 루미놀을 포함한다.

표지의 검출 수단은 표지의 종류에 따라 결정된다. 따라서, 예를 들어, 표지가 방사성 표지인 경우에, 검출 수단은 자가방사선술에서와 같은 사진 필름 또는 섬광 계수기를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 표지가 형광 표지인 경우에, 검출 수단은 형광색소 (fluorochrome)을 적절한 파장의 빛으로 여기시키고 생성되는 형광을 예를 들어, 현미경, 시각 검사에 의해, 사진 필름을 통해, 전자 검출기, 예를 들어 디지털 카메라, 전하 결합 소자 (CCD) 또는 광전증배관 (photomultiplier) 및 광전관 (phototube)의 사용 등에 의해 검출하는 것을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 형광 표지 및 검출 기술을 이용할 때, 현미경 및 분광학 기술이 종종 검출 시스템 내로 통합된다. 유사하게, 효소 표지는 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 생성되는 반응 생성물을 검출함으로써 검출할 수 있다. 마지막으로, 간단한 비색 표지는 종종 간단히 표지와 연관된 색상을 관찰함으로써 검출된다. 예를 들어, 접합된 금은 종종 분홍색으로 보이는 한편, 다양한 접합된 비드는 비드의 색상을 보인다.

한 실시양태에서, 연속 유동 스크리닝 시스템은 시스템에 영향을 미치는 시험 화합물이 도입될 때에만 변하는 일정한 신호를 생성한다. 구체적으로, 시스템 성분이 시스템을 통해 유동함에 따라, 이들은 검출 대역에서 비교적 일정한 신호 수준을 생성할 것이다. 시험 화합물 (즉, 예를 들어, 감염 제어 조성물)이 주기적으로 채널 내로 도입되고 시스템 성분과 혼합될 때, 시험 화합물은 검출 대역에서 일정한 신호 수준으로부터 편차를 생성시킨다. 이어서, 상기 편차는 스크리닝된 특정 시험 화합물에 상호관련될 수 있다.

D. 표피 단백질에 대한 미생물 포자 표면 단백질 결합의 검출

한 실시양태에서, 본 발명은 표피층에 대한 미생물 포자 표면 단백질 결합의 검출 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 표피층은 피부로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 표피층은 내부 장기로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 표피층은 점막으로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 표피층은 피부 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 피부 단백질은 인볼루크린을 포함한다. 한 실시양태에서, 피부 단백질은 로리크린을 포함한다. 한 실시양태에서, 피부 단백질은 세포각질 (cytokeratin)을 포함한다 (도 10 참조).

효소 연결 면역흡착 분석 플레이트를 100 ㎕의 PBS/웰 내에서 5 mg의 인간 케라틴으로 4℃에서 철야 코팅하였다. 이어서, 웰을 PBS로 3회 세척한 다음 PBS 중 1% 소 혈청 알부민으로 1 h 동안 차단시킨 후에, 포자를 첨가하였다. 포자 (상기 설명된 바와 같이 제조된 씨. 디피실레)를 PBS 내에 600 nm에서 1.0의 흡광도를 갖는 농도 (약 5x10⁷개 포자/ml)로 희석한 후, FITC로 표지하였다. 100 ㎕의 표지된 포자를 웰마다 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 h 동안 인큐베이팅하였다. 웰 당 총 형광 (F_total)을 1-h 인큐베이션 후에 λ_ex = 485 nm 및 λ_em = 535 nm인 플루오로스캔 (Fluoroskan) II 형광 판독기 (랩시스템즈 (Labsystems, 미국 매사추세츠주 베벌리))를 사용하여 측정하였다. 웰을 PBS로 3회 세척하여 결합되지 않은 포자를 대체하고, 잔여 형광 (F_test)을 측정하였다. 부착은 다음과 같이 계산하였다: 부착 = F_test/F_total. 항체 또는 감염 제어 조성물의 부재 하에 표지된 세포의 부착을 100%로 표준화하였다. 소 혈청 알부민-코팅된 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다. 억제 분석을 위해, FITC-표지된 포자를 먼저 항-포자 항체 또는 감염 제어 조성물과 함께 1 h 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 혼합물을 케라틴-코팅된 웰에 첨가하였다.

별법으로, 에피덤 (EpiDerm)™ 피부 모델 플레이트 (24-웰 또는 96-웰)를 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 1 h 동안 차단한 후 포자를 첨가하였다. 포자 (상기 설명된 바와 같이 제조된 씨. 디피실레)를 PBS 내에 600 nm에서 1.0의 흡광도를 갖는 농도 (약 5x10⁷개 포자/ml)로 희석한 후, FITC로 표지하였다. 100 ㎕의 표지된 포자를 웰 마다 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 h 동안 인큐베이팅하였다. 웰 당 총 형광 (F_total)을 1-h 인큐베이션 후에 λ_ex = 485 nm 및 λ_em = 535 nm인 플루오로스캔 II 형광 판독기 (랩시스템즈, 미국 매사추세츠주 베벌리)를 사용하여 측정하였다. 웰을 PBS로 3회 세척하여 결합되지 않은 포자를 대체하고, 잔여 형광 (F_test)을 측정하였다. 부착은 다음과 같이 계산하였다: 부착 = F_test/F_total. 항체 또는 감염 제어 조성물의 부재 하에 표지된 세포의 부착을 100%로 표준화하였다. 소 혈청 알부민-코팅된 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다. 억제 분석을 위해, FITC-표지된 포자를 먼저 항-포자 항체와 함께 1 h 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 혼합물을 에피덤™ 피부 모델 플레이트에 첨가하였다.

E. 감염 제어 조성물의 고속대량 스크리닝

한 실시양태에서, 본 발명은 감염 제어 조성물의 스크리닝을 위한 고속대량 분석을 포함하는 방법을 고려한다. 예를 들어, 단백질 및/또는 핵산에 대한 고속대량 결합 분석이 개발되었다; i) 단백질에 대한 고속대량 스크리닝 방법 (미국 특허 5,559,410); ii) 핵산 결합 (즉, 어레이 내에서)에 대한 고속대량 스크리닝 방법 (미국 특허 5,585,639); 및 iii) 리간드/항체 결합에 대한 고속대량 스크리닝 방법 (미국 특허 5,576,220 및 5,541,061) (모든 특허는 본원에 참고로 포함됨). 또한, 고속대량 스크리닝 시스템은 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 자이마크 코퍼레이션 (Zymark Corp., 미국 매사추세츠주 홉킨톤); 에어 테크니컬 인더스트리즈 (Air Technical Industries, 미국 오하이오주 멘터); 베크만 인스트루먼츠, 인크. (Beckman Instruments, Inc., 미국 캘리포니아주 풀러톤); 프리시젼 시스템즈, 인크. (Precision Systems, Inc., 미국 매사추세츠주 나틱) 등 참조). 이들 시스템은 대개 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 시간을 정한 인큐베이션, 및 분석에 적절한 검출기(들)에서 마이크로플레이트의 최종 판독을 비롯한 전체 절차를 자동화한다. 이들 변경가능한 시스템은 고속대량 및 신속한 시동 (start up)뿐만 아니라 높은 정도의 유연성 및 맞춤제작 (customization)을 제공한다. 그러한 시스템의 제조자는 각종 고속대량의 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, 예를 들어, 자이마크 코퍼레이션은 유전자 전사의 조정, 리간드 결합 등을 검출하기 위한 스크리닝 시스템을 설명하는 기술 회보 (bulletin)를 제공한다.

통상적으로, 유용한 특성을 갖는 새로운 화학적 엔티티는 일부 바람직한 특성 또는 활성을 갖는 화학적 화합물 ("선도 화합물"로 칭함)을 확인하고, 선도 화합물의 변이체를 생성시키고, 변이체 화합물의 특성 및 활성을 평가함으로써 생성된다. 그러나, 현재의 경향은 약물 개발의 모든 측면에 대한 기간을 단축하는 것이다. 다수를 빠르고 효율적으로 시험하는 능력 때문에, 고속대량 스크리닝 (HTS) 방법이 통상적인 선도 화합물 확인 방법을 대신하고 있다.

한 바람직한 실시양태에서, 고속대량 스크리닝 방법은 다수의 잠재적인 치료 화합물 (후보 화합물)을 함유하는 라이브러리를 제공하는 것을 수반한다. 이어서, 그러한 "조합 화학물질 라이브러리"를 목적하는 특징적인 활성을 보이는 라이브러리 구성원 (특정 화학물질 종 또는 서브클래스)를 확인하기 위해 본원에 설명된 바와 같이 하나 이상의 분석으로 스크리닝한다. 이렇게 확인된 화합물은 통상적인 "선도 화합물"로서 역할을 할 수 있거나, 자체가 잠재적인 또는 실제 치료제로서 사용될 수 있다.

1. 조합 화학물질 라이브러리

최근에, 새로운 화학적 선도 화합물의 생성을 돕기 위해 조합 화학물질 라이브러리의 사용에 주의가 집중되었다. 조합 화학물질 라이브러리는 시약과 같은 많은 화학적 "빌딩 블록"을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물의 컬렉션이다. 예를 들어, 선형 조합 화학물질 라이브러리, 예를 들어 폴리펩티드 라이브러리는 아미노산으로 불리는 화학적 빌딩 블록의 세트를 주어진 화합물 길이 (즉, 폴리펩티드 화합물 내의 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 조합함으로써 형성된다. 수백만의 화학적 화합물은 화학적 빌딩 블록의 그러한 조합 혼합을 통해 합성할 수 있다. 예를 들어, 100개의 상호 교환가능한 화학적 빌딩 블록의 체계적인 조합 혼합은 일억 개의 사량체 화합물 또는 백억 개의 5량체성 화합물의 이론적인 합성을 일으킬 수 있다.

조합 화학물질 라이브러리는 펩티드 라이브러리를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (미국 특허 5,010,175, [Furka et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991)]; 및 [Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)], 모든 참조문은 본원에 참고로 포함됨). 펩티드 합성은 결코 본 발명에서 사용하기 위해 고안되고 의도되는 유일한 방안이 아니다. 화학적 다양성 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학이 또한 사용될 수 있다. 그러한 화학은 다음의 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 펩토이드 (peptoid) (PCT 공개 WO 91/19735, 1991년 12월 26일), 코딩된 펩티드 (PCT 공개 WO 93/20242, 1993년 10월 14일), 랜덤 (random) 바이오-올리고머 (PCT 공개 WO 92/00091, 1992년 1월 9일), 벤조디아제핀 (미국 특허 5,288,514) (본원에 참고로 포함됨), 다이버소머 (diversomer), 예를 들어 하이단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드 (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), 비닐성 폴리펩티드 (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), 베타-D-글루코스 스캐폴딩을 갖는 비-펩티드성 펩티드모방체 (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성 (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), 올리고카르바메이트 (Cho et al., Science 261:1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (Campbell et al., J. Org. Chem. 59 658 (1994)); 핵산 라이브러리, 펩티드 핵산 라이브러리 (미국 특허 5,539,083) 항체 라이브러리 (Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3):309-314 (1996) 및 PCT/US96/10287), 탄수화물 라이브러리 (Liang et al. Science 274:1520-1522 (1996) 및 미국 특허 5,593,853), 및 작은 유기 분자 라이브러리 - 벤조디아제핀 (Baum C&EN, January 18, page 33 (1993)); 이소프레노이드 (미국 특허 5,569,588) (본원에 참고로 포함됨); 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 5,549,974; 피롤리딘, 미국 특허 5,525,735 및 5,519,134; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 5,506,337; 벤조디아제핀, 5,288,514 등, 모든 참조문은 본원에 참고로 포함됨).

조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 357 NIPS, 390 NTS, 어드밴스트 켐 테크 (Advanced Chem Tech, 미국 켄터키주 루이스빌), 심포니 (Symphony, 미국 매사추세츠주 워번 레이닌), 433A 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터시티), 9050 Plus (밀리포어, 미국 매사추세츠주 베드포드) 참조).

용액상 화학을 위한 많은 로봇식 시스템이 또한 개발되었다. 이들 시스템은 다께다 케미칼 인더스트리즈, 엘티디. (Takeda Chemical Industries, LTD., 일본 오사까)에서 개발된 자동화 합성 기구와 같은 자동화 워크스테이션, 및 화학자가 수행하는 수동 합성 작업을 모방하는 로봇 팔을 이용하는 많은 로봇식 시스템 (자이메이트 (Zymate) II, 자이마크 코퍼레이션 (미국 매사추세츠주 홉킨턴); 오르카 (Orca), 휴렛-팩카드 (Hewlett-Packard, 미국 캘리포니아주 팔로 알토))을 포함한다. 임의의 상기 장치가 본 발명에서 사용하기 위해 적합하다. 또한, 수많은 조합 라이브러리 자체가 상업적으로 이용가능하다 (콤제넥스 (ComGenex, 미국 뉴저지주 프린스톤); 아시넥스 (Asinex, 러시아 모스코바); 트리포스, 인크. (Tripos, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스); 켐스타, 엘티디. (ChemStar, Ltd, 러시아 모스코바); 3디 파마슈티칼스 (3D Pharmaceuticals, 미국 펜실베니아주 엑스톤); 또는 마르텍 바이오사이언시스 (Martek Biosciences, 미국 메릴렌드주 콜럼비아)).

2. 화학물질 라이브러리의 고속대량 분석

본원에 기재된 바와 같은 세균 포자의 부착을 억제하는 화합물에 대한 임의의 분석은 고속대량 스크리닝에 매우 적합하다. 상기 설명된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 분석은 미생물 포자 표면 단백질과 상호작용하는 물질을 스크리닝한다.

본원에 기재된 분석의 고속대량 시행은 기껏해야 분석 형식을 일상적으로 변형하여 (예를 들어, 로봇 매니퓰레이터 (manipulator), 대형 플레이트 판독기 등과의 호환성을 위해) 시행할 수 있다. 각종 고속대량 스크리닝 시스템 (예를 들어, 단백질 결합, 핵산 결합 등에 대한)이 설명되어 있다 (모두 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,559,410, 5,585,639, 5,576,220, 및 5,541,061).

추가로, 고속대량 스크리닝 시스템은 상업적으로 이용가능하다 (자이마크 코퍼레이션 (미국 매사추세츠주 홉킨톤); 에어 테크니컬 인더스트리즈 (미국 오하이오주 멘터); 베크만 인스트루먼츠, 인크. (미국 캘리포니아주 풀러톤); 또는 프리시젼 시스템즈, 인크. (미국 매사추세츠주 나틱)). 이들 시스템은 일반적으로 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 시간을 정한 인큐베이션, 및 분석에 적절한 검출기(들)에서 마이크로플레이트의 최종 판독을 비롯한 전체 절차를 자동화한다. 이들 변경가능한 시스템은 고속대량 및 신속한 시동뿐만 아니라 높은 정도의 유연성 및 맞춤제작을 제공한다. 그러한 시스템의 제조자는 각종 고속대량의 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, 예를 들어, 자이마크 코퍼레이션은 유전자 전사의 조정, 리간드 결합 등을 검출하기 위한 스크리닝 시스템을 설명하는 기술 회보를 제공한다.

V. 감염 제어 시험 화합물의 평가

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 포자 표면 단백질 및 감염 제어 시험 화합물 사이의 상호작용의 양 또는 속도를 검출 및/또는 정량하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 검출 방법은 비디오 현미경; DAPI 형광 변화, 형광 공명 에너지 전달 또는 원심분리를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

A. 현미경

한 실시양태에서, 감염 제어 시험 화합물은 현미경에 의해 (즉, 예를 들어, 직접적 시각 관찰에 의해 또는 비디오 또는 사진 기록 장치를 사용하여) 검출된다. 현미경 시각화를 수반한 분석은 표지된 (예를 들어, 형광 표지된) 클로스트리듐 포자 표면 펩티드 및/또는 또 다른 미생물 포자 표면 단백질을 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 펩티드 및/또는 단백질은 고체 지지체 (예를 들어, 유리 슬라이드)에 인접하게 놓이고, 감염 제어 시험 화합물을 함유하는 용액에 노출된다. 고체 지지체에 대한 펩티드 및/또는 단백질의 부착은 현미경 (즉, 예를 들어, 주사 전자 현미경)을 사용하여 직접 시각화할 수 있다.

현미경에는 임의로 스틸 (still) 카메라 또는 비디오 카메라가 구비될 수 있고, 단백질 및/또는 펩티드 부착의 상대적인 풍부함을 정량하기 위해 영상 획득 및 분석 소프트웨어가 설치될 수 있다.

현미경에서 시각화할 수 있는 임의의 표지가 상기 종류의 검출에서 사용될 수 있다. 그러한 표지는 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인, 로다민 등), 비색 표지 및 방사성 표지 (적절한 섬광 스크린 사용) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 분석의 일부 실시양태에서, 미세소관 (microtubule)은 임의의 표지 없이 (예를 들어, 미분 간섭 위상차 현미경을 통해) 시각화할 수 있다.

B. DAPI 형광 변화.

또 다른 실시양태에서, 감염 제어 시험 화합물과 클로스트리듐 포자 표면 펩티드 및/또는 또 다른 미생물 포자 표면 단백질의 상호작용은 DAPI를 포함하는 표지를 이용하는 형광의 변화에 의해 결정할 수 있다. DAPI 형광의 비율 또는 양의 감소는 시험 화합물과 미생물 포자 표면 단백질 사이의 상호작용을 표시한다. 시험 화합물의 사용 시에 형광의 변화를 음성 및/또는 양성 대조군 반응에서 관찰된 것에 비교한다.

사용할 수 있는 다른 표지는 아닐리노나프탈렌 술포네이트 (ANS) (예를 들어, 몰레큘라 프로브스 카탈로그 번호: A-47, A-50, T-53 등), 비스-ANS (몰레큘라 프로브스 카탈로그 번호: B-153), N-페닐-1-나프틸렌 (NPN) (몰레큘라 프로브스 카탈로그 번호: P65), DCV (몰레큘라 프로브스 카탈로그 번호: D-3923), 루테늄 레드 및 크레졸 바이올렛을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

C. 형광 공명 에너지 전달

클로스트리듐 포자 표면 펩티드 및/또는 또 다른 미생물 포자 표면 단백질과 감염 제어 시험 화합물 사이의 상호작용 정도는 또한 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 결정할 수 있다. 형광 공명 에너지 전달은 겹치는 흡수 및 방출 스펙트럼을 가진 2개의 형광단이 함께 가까이 (예를 들어, <7 mm 이격) 위치할 때 일어나는 현상이다 (Stryer et al., Ann. Rev. Biochem., 47:819-846 (1978)). 한 실시양태에서, 본 발명은 FRET를 사용하는 단백질-단백질 상호작용의 검출을 고려한다 (Taylor et al., J. Cell Biol. 89:362-367 (1981)).

한 실시양태에서, 등몰 비율의 상이하게 표지된 미생물 포자 표면 펩티드 및 감염 제어 시험 펩티드 화합물을 조합한다 (예를 들어, 각각 플루오레세인 표지된 및 로다민-표지된). 형광은 미생물 포자 표면 펩티드와 펩티드 시험 화합물의 상호작용 시에 켄칭될 수 있고, 이것은 각각의 결합된 형광색소가 에너지 전달이 일어나도록 하기에 충분한 근접성으로 가까운 것을 나타낸다. 시험 화합물 및 대조군을 사용한 반응에 의해 생성된 형광의 비율 및/또는 양을 비교할 수 있다.

VI . 미생물 포자 표면 단백질 및 펩티드의 재조합 발현

한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 펩티드 및/또는 또 다른 미생물 포자 표면 단백질은 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성된다. 일반적으로, 이것은 DNA 단백질을 코딩하는 서열을 생성하고, DNA를 특정 프로모터의 제어 하에 발현 카세트 내에 놓고, 숙주 내에서 단백질을 발현시키고, 발현된 단백질을 단리하고, 요구되는 경우에 단백질을 복원하는 것을 수반한다. 본 발명에서 고려되는 펩티드 및/또는 단백질을 코딩하는 DNA는 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝 및 제한, 또는 문헌 [Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979)]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979)]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981)]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 4,458,066의 고체 지지체 방법 (상기 모든 참조문은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)과 같은 직접적 화학적 합성을 포함한 많은 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다.

일반적으로, 이하 사용되는 명칭 및 아래 설명된 세포 배양, 분자 유전학, 및 핵산 화학 및 혼성화에서 실험실 절차는 당업자가 이해할 것이다. 재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오티드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계는 상업적인 키트 내에 제공된 제조자의 명세서에 따라 수행한다. 기술 및 절차는 일반적으로 당업계의 통상적인 방법 및 다양한 일반적인 참조문에 따라 수행된다 (전문이 본원에 참고로 포함된 [Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; 및 [In: Current Protocols in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc., N.Y. (1996)]).

본 발명은 포자 표면 폴리펩티드 서열 또는 그의 변이체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 고려하고; 이들 핵산 서열은 포자 표면 단백질을 코딩하는 재조합 분자를 제조하기 위해 사용된다. 예를 들어, 유전자 코드의 중복성은 포자 표면 폴리펩티드를 코딩하는 많은 핵산 서열을 허용한다. 따라서, 포자 표면 뉴클레오티드 서열의 발현 속도를 증가시키기 위해 서열 2, 4, 6 또는 8과 상이한 코돈이 사용될 수 있다. 추가로, 다른 특성 (즉, 예를 들어, 더 긴 또는 더 짧은 반감기)을 갖는 재조합 RNA 전사체의 스플라이스 변이체를 생성하기 위해 진핵생물 발현 숙주에서 대체 코돈이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 제한 효소 부위를 변경하거나, 진핵생물 발현 숙주 내에서 번역된 폴리펩티드 내의 글리코실화 패턴을 변경하기 위해 상이한 코돈이 또한 바람직할 수 있다.

미생물 포자 표면 단백질 뉴클레오티드 서열 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 포자 표면 단백질)의 변이체가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 변이체는 뉴클레오티드 서열의 번역 생성물의 생물학적 활성이 유지되는 한, 상이한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 결실, 삽입 또는 치환된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 클로스트리듐 포자 표면 단백질 핵산 서열 (즉, 예를 들어, 서열 2)로 제한되지 않고, 구체적으로 상이한 혼성화 엄격도 하에 서열 2 (즉, 예를 들어, 바실러스 상동체; 서열 3, 5, 및 7) 및 그의 일부, 변이체 및 유도체에 혼성화할 수 있는 핵산 상동체를 포함한다. 예를 들어, 보다 고엄격도는 서열 2 및 다른 핵산 서열 사이의 비특이적 결합을 감소 또는 제거할 수 있다. 별법으로, 보다 저엄격도는 서열 2에 상이한 상동을 갖는 더 많은 수의 핵산 서열을 검출할 수 있다. 서열 2의 단편 (즉, 부분으로도 언급함)이 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 한 실시양태에서, 단편의 길이는 10개 이상의 뉴클레오티드이고, 서열 2에 대해 50% 초과의 상동성을 보인다.

본 발명은 서열 2의 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부 또는 포자 표면 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보성인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 분자를 추가로 고려한다. 본 발명은 서열 2, 또는 하나 이상의 이종성 서열에 라이게이팅 (ligating)된 포자 표면 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산의 적어도 일부, 변이체, 유도체 및/또는 상동체를 포함하는 융합 유전자를 추가로 고려한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 그러한 융합 유전자는 핵산 서열의 발현을 검출할 수 있는 것으로 생각된다. 이종성 서열의 예는 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제와 같은 효소를 코딩하는 리포터 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 융합 유전자는 또한 발현된 단백질의 정제를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A의 이종성 서열은 고정된 면역글로불린 상에서 융합 단백질의 정제를 허용한다. 발현된 융합 단백질을 정제하기 위해 다른 친화도 트랩 (trap)을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 포자 표면 단백질을 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 발현시키기 위해 pGEX 벡터 (프로메가 (Promega, 미국 위스콘신주 매디슨))를 사용할 수 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드에의 흡착에 이어 유리 글루타티온의 존재 하의 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. 그러한 시스템에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈, 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되어, 관심있는 클로닝된 폴리펩티드는 GST 모이어티로부터 자유로이 방출될 수 있다.

A. 대표적인 포자 표면 단백질의 재조합 발현

한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 미생물 포자 표면 단백질의 발현 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 방법은 미생물 포자 표면 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 플라스미드의 제작을 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 적합한 유기체를 플라스미드로 형질감염시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 적합한 유기체는 이. 콜라이이다.

본원에 제시된 데이타는 씨. 디피실레 포자 표면 단백질의 적어도 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드로 형질감염된 이. 콜라이의 성공적인 클로닝을 입증한다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 CD1067이다. 한 실시양태에서, 포자 표면 단백질은 CD3620이다. 다음 실험은 단지 본 실시양태를 예시하는 것으로서 본 발명을 제한하고자 의도되지 않고, 그 이유는 아래에 설명된 기본 기술을 사용하여 다른 포자 표면 단백질 핵산 구성체를 사용할 때 유사한 결과를 얻을 수 있기 때문이다

씨. 디피실레 포자 표면 단백질의 클로닝을 10개의 아미노산 His 태그를 갖는 pET-19b 플라스미드 (노바겐 (Novagen), 제품 번호 69677-3)을 통해 이. 콜라이 로세타-가미 (Rosetta-Gami) 발현 균주 내에서 수행하였다. 구체적으로, pET-19b+CD1067 (pJEB02) 또는 pET-19b+CD3620 (pJEB03)를 이. 콜라이 로세타-가미 세포를 포함하는 철야 배양액 (즉, 예를 들어 12 hr) 내에서 인큐베이팅하였다 (도 11 참조).

약 2 ml의 형질감염된 이. 콜라이 세포 배양액을 50 ml 루리아 브로쓰 (LB) + 100 ㎍/ml 아데노신 모노포스페이트 (AMP) 및 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 포함하는 발현 배양 배지로 옮겼다. 배양액을 0.5-0.6의 약 OD₆₂₅로 성장시킨 후, 1 mM IPTG를 사용하여 pET 플라스미드의 발현을 유도하였다. IPTG 유도 후에, 1 ml의 배지 샘플을 약 1시간 간격으로 취하였다. 샘플을 원심분리하고 (즉, 예를 들어, 1분 동안 약 10,000 xg), 생성되는 펠렛을 100 ㎕ 노벡스 (Novex) 용액 (45 ㎕ 2x SDS-PAGE 샘플 버퍼 + 45 ㎕ H₂0 + 10 ㎕ 2M 디티오트레이톨) 내에 재현탁시키고, 약 5분 동안 비등시켰다. 약 20 ㎕의 비등시킨 펠렛 현탁액을 초기에 4-12% 트리스-글리신 SDS-PAGE 겔 상에서 진행시키고, 이때 약 10 ㎕의 의심되는 단리된 재조합 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용하였다.

pJEB02 플라스미드는 근사 분자량 44 kDa의 405개 아미노산을 갖는 단백질을 발현시키는 것으로 예상되었다. SDS-PAGE 겔 전기영동 분리는 약 50 kDa의 단백질의 발현이 IPTG 유도의 1시간 이내에 나타나고, 후속 샘플 (즉, 2 - 6시간 샘플)에서 강도가 증가함을 보여주어 상기 예상을 확정한다 (도 12 참조). 상기 예비 분리는 F1373 항-씨. 디피실레 항체 또는 항-His 항체 (각각 도 13A 및 도 13B 참조)에 의해 검출된 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 확정되었다.

pJEB03 플라스미드는 근사 분자량 14 kDa의 122개 아미노산을 갖는 단백질을 발현시키는 것으로 예상되었다. SDS-PAGE 겔 전기영동 분리는 약 20 kDa의 단백질의 발현이 IPTG 유도의 1시간 이내에 나타나고, 후속 샘플 (즉, 2 - 4.5시간 샘플)에서 강도가 증가함을 보여주어 상기 예상을 확정한다 (도 14 참조). 상기 예비 분리는 F1373 항-씨. 디피실레 항체 또는 항-His 항체 (각각 도 15A 및 도 15B 참조)에 의해 검출된 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 확정되었다.

F1373 항-씨. 디피실레 항체 또는 F1997 항-씨. 디피실레 항체 모두에 대한 면역전 웨스턴 블롯 대조군 샘플 (예를 들어, 포자 표면에 대해 작용성인 상업적인 맞춤형 제제; 스트래터직 다이아그노스틱스, 인크. (Strategic Diagnostics, Inc.))은 pJEB02 및 pJEB03 발현 프로필 모두에서 결합 특이성의 부재를 나타냈다 (도 16A-D 참조). 이들 데이타는 CD1067 및 CD3620이 이. 콜라이 내로 클로닝될 때, 면역전 대조군 검출이 재조합 CD1067 단백질 또는 재조합 CD3620 단백질과 반응성이 아님을 보여준다. 그 반대로, 씨. 디피실레 포자 표면 항체 (즉, 예를 들어, F1373 또는 F1997)은 재조합 CD1067 단백질 및 재조합 CD3620 단백질과 특이적으로 반응한다. 이들 단백질의 특이적인 발현은 재조합 CD1067 단백질 및 CD3620 재조합 단백질의 MW와 일치하는 발현 플라스미드 구성체에 부착된 His10 태그의 검출에 의해 확정하였다.

B. 핵산 서열 합성 기술

본 발명에서 고려되는 핵산 서열을 생성하기 위해 합성 화학 기술을 또한 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 제조자가 제공하는 명세서에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 올리고뉴클레오티드 합성기 상에서 합성할 수 있다 (Sinha et al., Nucleic Acids Res. 12:4539 (1984)). 합성 후에, 상보성 올리고뉴클레오티드를 이들을 NaCl (200 mM)을 함유하는 10 mM 트리스-HCl 버퍼 (pH 8.0)의 용액 내에서 90℃로 가열한 후 이들을 실온으로 서서히 냉각함으로써 어닐링시킬 수 있다. 결합 및 전환 분석을 위해, 이중체 DNA를 천연 폴리아크릴아미드 (15% w/v) 겔로부터 정제한다. 이중-가닥 DNA에 대응하는 밴드를 절개하고 EDTA (1 mM)를 함유하는 0.30 M 아세트산나트륨 버퍼 (pH 5.0) 내에서 철야 흡수시킨다. 흡수 후에, 상등액을 페놀/클로로포름 (1/1 v/v)로 추출하고, 에탄올을 사용하여 침전시켰다. DNA 기질을 ³²P-ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 5'-OH 기에 방사성 표지하였다. 염 및 통합되지 않은 뉴클레오티드는 세파덱스 G 컬럼 상에서 크로마토그래피에 의해 제거한다.

합성된 뉴클레오티드 서열은 DNA 중합효소 I의 클레나우 (Klenow) 단편, 씨퀘나제 (Sequenase)®, Taq DNA 중합효소, 또는 열안정성 T7 중합효소를 포함하고 이로 제한되지 않는 효소를 포함하는 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 확인할 수 있다. 핵산 서열 크기를 분석하고 서열 핵산 합성 생성물을 확인하기 위해 모세관 전기영동을 또한 사용할 수 있다. 합성된 서열은 또한 i) 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (미국 특허 4,683,195 (Mullis et al.); 및 미국 특허 4,683,202 (Mullis et al.)), 리가제 사슬/증폭 반응 (LCR/LAR) ([Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189 (1991)]; [Barany et al., PCR Methods and Applic, 1:5 (1991)]; 및 [Wu et al., Genomics 4:560 (1989)])에 의해 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 포자 표면 단백질 뉴클레오티드 서열은 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 10 bp, 보다 대체로 적어도 약 15 bp, 및 전체 이하 서열의 단편 및 전체 (즉, 전장) 서열을 바실러스, 클로스트리듐, 및 다른 세균으로부터의 상보성 게놈 DNA 서열의 검출 및 단리를 위한 프로브로서 사용할 수 있다. 게놈 서열은 세균 DNA를 함유하는 게놈 라이브러리를 포자 표면 단백질 핵산 서열 전체 또는 일부를 사용하여 스크리닝함으로써 단리한다. 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 것에 추가로, 포자 표면 단백질 핵산 서열은 또한 세균 RNA를 사용하여 제조된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 포자 표면 단백질 핵산 서열은 포자 표면 단백질의 합성을 지시하는데 또한 유용하다. 포자 표면 단백질 항체는 또한 포유동물 세포, 포유동물 피부, 경질 표면 등에 대한 포자 표면 단백질의 상호작용을 길항하기 위해 사용될 수 있다. 포자 표면 단백질은 포자 표면 단백질을 발현하는 세균으로의 감염을 검출하는 것과 같은 진단 목적을 위한 포자 표면 단백질 항체의 생산에 사용된다. 포자 표면 단백질 핵산 서열은 결합 길항제의 스크리닝 및 포자 표면 단백질을 함유하는 미생물의 검출을 위해 또한 유용하다.

화학적 합성은 대체로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산한다. 이것은 상보성 서열과의 혼성화, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하여 DNA 중합효소를 사용한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. DNA의 화학적 합성은 약 100개 염기의 서열에 대해 일상적으로 수행되지만, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 얻을 수 있다.

별법으로, 하위서열을 클로닝하고, 적절한 하위서열을 적절한 제한 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 이어서, 단편들은 라이게이팅시켜 목적하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.

한 실시양태에서, 미생물 포자 표면 단백질 핵산은 DNA 증폭 방법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 클로닝할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 핵산 서열 또는 하위서열을 하나의 제한 부위 (예를 들어, NdeI)를 함유하는 센스 프라이머 및 또 다른 제한 부위 (예를 들어, HindIII)를 함유하는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 이것은 말단 제한 부위를 포함하는 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산을 생성할 것이다. 이어서, 상기 핵산은 제2 분자를 코딩하는 핵산을 함유하고 적절한 상응하는 제한 부위를 갖는 벡터 내로 쉽게 라이게이팅될 수 있다.

적합한 PCR 프라이머는 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 결정할 수 있다. 적절한 제한 부위가 또한 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 미세소관 해중합 또는 절단 단백질을 코딩하는 핵산에 첨가될 수 있다. 미세소관 해중합 또는 절단 단백질 코딩 핵산을 함유하는 플라스미드를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 후, 표준 방법에 따라 제2 분자를 코딩하는 벡터 내로 라이게이팅한다.

클로스트리듐 포자 표면 펩티드 및/또는 다른 미생물 포자 표면 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이. 콜라이, 다른 세균 숙주, 효모 및 각종 고등 진핵 세포, 예를 들어 COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 골수종 세포주를 비롯하여 다양한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 재조합 단백질 유전자는 대체로 각각의 숙주에 대해 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 이. 콜라이의 경우에, 바람직한 프로모터는 T7, trp, 또는 람다 프로모터를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 신호는 발현 벡터의 일부이다. 진핵 세포의 경우에, 제어 서열은 프로모터 및 바람직하게는 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래한 인핸서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 것이고, 스플라이스 공여자 및 수용자 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 선택된 숙주 세포 내로 염화칼슘, 인산칼슘 또는 전기천공을 포함하고 이로 제한되지 않는 방법에 의해 전달될 수 있다. 플라스미드에 의해 형질전환된 세포를 플라스미드 상에 함유된 유전자, 예를 들어 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항생제 내성에 의해 선택할 수 있다.

일단 발현된 후에, 재조합 단백질은 황산암모늄 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 표준 절차에 따라 정제할 수 있다 ([R. Scopes, In: Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)]; 및 [Deutscher et al., In: Methods in Enzymology Vol. 182 (1990)]). 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 일단 요구되는 대로 부분적으로 또는 균질성으로 정제된 후, 폴리펩티드를 예를 들어, 항체 생산을 위한 면역원으로서 사용할 수 있다.

VII . 클로스트리듐 감염

그람-양성 혐기성 세균인 클로스트리듐 디피실레는 종종 입원 환자에서 이환율을 일으키고, 항생제-연관 설사 및 위막성 대장염의 병인 물질로 믿어진다 ([Borriello et al., "Virulence factors of Clostridium difficile" Rev. Infect. Dis. 12:S185-S191 (1990)]; [Cerquetti et al., "Characterization of surface layer proteins from different Clostridium difficile clinical isolates" Microb. Pathog. 28:363-372 (2000)]; 및 [Kuipers et al., "Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria" J. Biotechnol. 64:15-21 (1998)]). 이들 병태의 발병기전에서 연관성에 대해 2가지 인자가 평가되었다: i) 항생제 투여에 의한 상재성 장내 균총의 억제 ([Freeman et al., "Antibiotics and Clostridium difficile" Microbes Infect. 1:377-384 (1999)]; 및 [George W., "Antimicrobial agent-associated colitis and diarrhea: historical background and clinical aspects" Rev. Infect. Dis. 6:S208-S213 (1984)]); 및 ii) 세균에 의한 2가지 고분자량 (MW) 독소 (독소 A 및 B)의 생산 ([Pothoulakis et al., "Microbes and microbial toxins: paradigms for microbial-mucosal interactions. II. The integrated response of the intestine to Clostridium difficile toxins" Am. J. Physiol. Gastroint. Liver Physiol. 280:G178-G183 (2001)]; 및 [Wren B., "Molecular characterisation of Clostridium difficile toxins A and B" Rev. Med. Microbiol. 3:21-27 (1992)]).

다른 장독소생성 병원체에서와 같이, 독소의 전달이 소화관의 씨. 디피실레 콜로니 형성 후에 발생하고, 이것은 점막에 대한 세균 부착을 요구한다. 클린다마이신-유도성 질병의 시리아 햄스터 모델에서, 상이한 씨. 디피실레 균주에 의한 소화관 콜로니 형성의 가변적인 효율 및 공장에서 결장에 이르는 위장관의 영역과 회합하는 그들의 능력 사이의 상호관계가 보고되었다. 독소 생산 이외의 인자로 인해 적어도 일부의 변동이 존재하는 것이 제안되었다. 그러나, 소장 점막에 대한 독성이 거의 없는 균주의 부착은 가능하게는 세포 손상 후 수용체 부위의 드러남 때문에, 조질 독소 제제의 투여에 의해 증가하였다.

씨. 디피실레로부터의 2가지 병동 인자는 외독소, 독소 A (TcdA) 및 독소 B (TcdB) 3인 것으로 나타났고, 부착 및 콜로니 형성 과정에 관여된 다른 인자에 관해서는 거의 알려져 있지 않다 (Voth et al., "Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease" Clin. Microbiol. Rev. 18, 247-263 (2005)). 이것은 다른 장내 유기체, 예를 들어 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 (Salmonella) 및 시겔라 (Shigella) 종과 반대이다. 가능하게는, 이것은 부분적으로는, 씨. 디피실레를 연구하기 위해 잘 발달된 돌연변이 유발 시스템의 결핍에 의해 설명될 수도 있다. 가능하게 씨. 디피실레를 이해하기 위한 하나의 방안은 병원성에 관여되는 잠재적인 인자의 게놈 위치를 확인하는 것을 포함한다. 씨. 디피실레 균주 630 (유행형 X; 독성 및 다제약물 내성)의 완전 게놈 서열이 보고되었다 (Wust et al., "Investigation of an outbreak of antibiotic-associated colitis by various typing methods" Clin. Microbiol 16:1096-1101 (1982)).

씨. 디피실레 균주 630의 게놈은 4,290,252 bp의 원형 염색체 및 7,881 bp의 플라스미드 pCD630을 포함한다. 염색체는 3,776개의 예측된 코딩 서열 (CDS)을 코딩하고; 다른 낮은 G+C 함량 그람-양성 세균과 마찬가지로, 염색체는 강한 코딩 편향 (coding bias)을 갖고, 이때 CDS의 82.1%가 선도 가닥 상에서 코딩된다. 플라스미드는 11개의 CDS를 보유하고, 이들 중 어느 것도 임의의 명백한 기능을 갖지 않는다. 4개의 서열결정된 클로스트리듐 게놈, 즉, 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 씨. 보툴리눔 (C. botulinum), 씨. 페르프린겐스 및 씨. 테타니 (C. tetani)에 대한 역 (reciprocal) FASTA 분석은 씨. 디피실레 CDS의 단지 567개 (15%)만이 모든 서열결정된 클로스트리듐과 공유되는 반면, 1,893개 (50%)은 씨. 디피실레에 대해 특유함을 보여주었다. 보존된 클로스트리듐 CDS는 주로 필수 기능을 코딩하는 반면, 씨. 디피실레 특유의 CDS는 많은 보조 기능 및 이동 요소를 코딩한다 (Sebaihia et al., "The multi-drug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome" Nature Genetics 38:779-786 (2006)).

정제된 씨. 디피실레 표면 층 단백질 (SLP)의 결합이 인간 상피 세포 및 위장 조직 모두에서 관찰되었다 (Calabi et al., "Binding of Clostridium difficile surface layer proteins to gastrointestinal tissues" Infect. Immun. 70:5770-5778 (2002)). 세포 및 조직 모두에 대한 결합은 산-추출된 SLP를 사용하여 및 가용형 재조합 고-MW 서브유닛을 사용하여 관찰된다. 이와 반대로, 재조합 고-MW SLP 서브유닛과 동일한 조건 하에 발현되고 정제된 가용형 재조합 저-MW SLP 서브유닛을 사용할 때 훨신 더 적은 결합이 관찰되거나 결합이 관찰되지 않는다. 항-고-MW 서브유닛 혈청은 HEp-2 세포에 대한 씨. 디피실레의 부착을 부분적으로 차단하기 때문에, SLP가 상피 세포에 대한 전체 세균의 부착에 관여하는 것이 가능하다. i) 천연 및 재조합 SLP 제제가 모두 펩티도글리칸 히드롤라제 활성을 보유하였고; ii) 산-추출된 SLP는 칼슘의 첨가 시에 고차 구조로 중합할 수 있고; iii) 두 재조합 서브유닛에 대해 생성된 항혈청은 전체 씨. 디피실레 세포와 고역가에서 반응하기 때문에, 이들 단백질의 천연 입체형태는 접착 동안 보유되는 것을 생각된다.

클로스트리듐 페르프린겐스는 중증 형태의 괴저 (조직 사멸; 괴사성 피하 감염으로도 칭함)인 가스 괴저를 일으키는 것으로 의심된다. 가스 괴저는 또한 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종 및 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus)의 감염으로부터 일어날 수 있다.

가스 괴저는 대체로 혐기성 (저산소) 조건 하에 조직 사멸 및 관련 증상을 유발하는 독소를 생산하는 클로스트리듐 페르프린겐스 세균의 감염의 결과로서 발생한다. 미국에서, 가스 괴저는 희귀하여, 매년 단지 1,000-3,000건만 발생한다. 가스 괴저는 일반적으로 외상 또는 최근의 수술 상처의 부위에서 발생하지만, 또한 자발적으로 발생할 수 있다. 자발적으로 가스 괴저를 발병하는 환자는 종종 근본적인 혈관 질병 (즉, 예를 들어, 죽상경화증 또는 동맥의 경화), 당뇨 또는 결장암을 포함하고 이로 제한되지 않는 높은 위험 인자를 갖는다.

가스 괴저의 발병은 일반적으로 급작스럽고 극적이다. 염증은 감염 부위에서 창백 내지 적갈색의 극히 고통스러운 조직 팽창으로서 시작한다. 가스는 팽창된 영역을 손가락으로 누를 때 조직 내에서 파삭파삭한 감각으로서 느껴질 수 있다. 감염된 영역의 가장자리는 급속하게 팽창하여, 변화가 수 분에 걸쳐 보인다. 관여된 조직은 완전히 파괴된다.

클로스트리듐 페르프린겐스 세균은 많은 상이한 독소를 생산하고, 그 중 4가지 (즉, 예를 들어, 알파, 베타, 엡실론 및 이오타)는 잠재적으로 치명적인 증후군을 일으킬 수 있다. 또한, 이들은 조직 사멸 (즉, 예를 들어 괴사), 혈액 세포의 파괴 (즉, 예를 들어, 용혈), 혈류의 국소 감소 (즉, 예를 들어, 혈관수축), 및 혈관의 누출 (즉, 예를 들어, 증가된 혈관 투과성)을 일으킨다.

클로스트리듐 페르프린겐스 독소는 국소 조직 파괴 및 전신 증상 (신체 전체에서 발생하는 다른 증상) 모두의 원인이 된다. 전신 증상은 가스 괴저 감염 초기에 발생하고, 발한, 발열 및 불안증을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 치료되지 않을 경우에, 대상체는 혈압 감소 (즉, 예를 들어, 저혈압), 신부전, 혼수 및 마지막으로 사망을 포함하고 이로 제한되지 않는 쇼크-유사 증후군을 발병한다. 다른 가스 괴저 증상은 피부 손상 주위에 중간 내지 중증 통증, 피부 손상 주위에 진행성 팽창, 중간 내지 고열, 피부색이 초기에 창백한 후 나중에 암적색 또는 자줏빛으로 거무스름하게 진행함, 황달, 소포 형성, 합해져서 큰 수포가 되는 유착성 소포, 적갈색 유체로 채워진 수포, 조직으로부터의 배농, 악취가 나는 적갈색 또는 혈액성 유체 (즉, 예를 들어, 장액혈액성 분비물), 심박수 증가 (즉, 예를 들어, 빈맥), 발한, 피하 기종 (즉, 예를 들어, 피부 아래의 공기) 또는 마찰음 (즉, 예를 들어, 조직 내의 공기)를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

별법으로, 대상체는 전신 창백, 사지 냉증, 낮은 혈압 또는 빠른 심박수를 포함하는 쇼크에 빠질 수 있다. 결국, 전신 (즉, 예를 들어, 전신 독성 또는 패혈증)을 수반한 전신 감염이 발병할 수 있다. 가스 괴저의 존재를 결정하는 다른 방법은 감염된 영역으로부터의 유체의 그람 염색이 그람-양성 막대 (즉, 예를 들어, 클로스트리듐 종)을 보여줄 수 있거나; 배양이 감염을 일으키는 세균을 성장시킬 수 있거나; 혈액 배양이 감염성 세균을 성장시킬 수 있거나; 혐기성 조직 및/또는 유체 배양이 적어도 하나의 클로스트리듐 종을 밝힐 수 있거나; 이환된 영역의 X-선, 전산화 단층촬영 스캔, 또는 자성 공명 영상이 조직 내의 가스를 보여줄 수 있는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

가스 괴저의 치료는 일반적으로 죽은, 손상된 및 감염된 조직의 즉각적인 수술적 제거 (즉, 예를 들어, 괴사조직제거 (debridement))를 수반한다. 감염의 확산을 제어하기 위해 팔 또는 다리 절단술이 지시될 수 있다. 통상적인 항생제 (즉, 예를 들어, 페니실린)는 초기 볼러스 (bolus) 용량으로 정맥내 투여된 후, 장기 경구 요법으로 투여될 수 있다.

VIII . 예방 및 치료 용도

A. 병원 오염제거

병원 병원체 (즉, 예를 들어, 씨. 디피실레)는 병원 직원 및 입원 환자 집단 모두에서 방대한 대부분의 세균 감염의 원인이 된다. 그러한 감염은 중증 설사를 포함하고 이로 제한되지 않는 증상을 일으킬 수 있지만, 손상된 환자 (즉, 예를 들어, 면역손상 환자)의 감염 후에 사망을 일으킬 수도 있다. 결과적으로, 병원 시설 및 직원 모두의 개선된 방부 유지가 환자 회복을 촉진하고 더 짧은 입원 기간 덕분에 전체 건강 관리 비용을 감소시킬 것이다.

일부 세균 (즉, 예를 들어, 씨. 디피실레)은 일반적인 피부 및 표면 소독제에 대해 고도의 내성이 입증된 포자를 생산한다. 병원 시설 표면 및 병원 직원 피부 (즉, 표피층) 모두에 대한 현재 이용가능한 세척제는 세균 포자를 사멸하고/하거나 제거하기 위해서 비효과적이다. 혐기성 세균 (즉, 예를 들어, 씨. 디피실레)는 작업하고 조종하기 위해 전문화된 장비 및 취급 기술을 요구한다. 결과적으로, 현재 혐기성 세균 특이적 "포자 제거 손세척액"을 개발하기 위한 용이한 방법이 존재하지 않는다.

실제로, 씨. 디피실레는 항생제-연관 설사의 모든 사례의 15-25%의 원인이다. 상기 종류의 설사의 재발은 심각하고 어렵고 여전히 풀리지 않는 관리 문제이고, 입원의 길이 및 전체 비용을 모두 증가시킨다. 대부분의 연구에서는 씨. 디피실레 감염의 병원 재발이 동일한 또는 상이한 세균 하위형으로의 재감염 사이에 50:50으로 나누어짐을 입증하였다. 이들 종류의 재발을 적당하게 제어하는 것은 손세척, 환경적 오염제거, 및 장관계통 격리 (enteric isolation)와 같은 항미생물 절차의 품질에 의해 좌우된다. 환경 오염 및 포자 지속성은 교차 감염에서 입증되고 시사되었다 (Barbut et al., "Epidemiology of recurrences or reinfections of Clostridium difficile-Associated diarrhea" J. Clin. Microbiol. 38:2386-2388 (2000)).

한 실시양태에서, 본 발명은 혐기성 세균 포자의 적어도 하나의 최외각 단백질 성분을 포함하는 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 혐기성 세균은 씨. 디피실레 포자를 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질 성분은 포자외막층으로부터 유래한다. 한 실시양태에서, 단백질 성분은 포자 표면 단백질을 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 혐기성 세균 포자의 최외각 단백질 성분이 유기체의 조직 (즉, 예를 들어, 피부 또는 소화관) 또는 무생물 경질 표면 (즉, 예를 들어, 스테인레스 스틸, 화강암, 가죽, 비닐, 세라믹 등)에 대한 포자의 부착을 유도하는 것으로 생각된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혐기성 포자 단백질 및 조직 또는 무생물 표면 사이의 부착 상호작용을 파괴할 수 있는 조성물을 스크리닝하는 것을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 혐기성 세균 포자의 최외각 단백질 성분은 그러한 조성물의 스크리닝을 위한 분자 표적으로서 기능한다.

씨. 디피실레 포자외막으로부터 유래되는 포자 표면 단백질은 표준 방법 (상기 문헌)에 따라 발현되고 정제될 수 있다. 결과적으로, 정제되고 단리된 포자 표면 단백질을 사용하면, 무손상 씨. 디피실레 유기체를 사용하여 작업할 필요 없이 혐기성 포자 제거 제품 (예를 들어, 손세척액, 무생물 표면 세척제, 전신 오염제거 용액)을 개발하기 위해 간단한 스크리닝 분석을 사용할 수 있다. 이것은 대규모 혐기성 장비에 대한 상기 언급된 필요를 제거하고, 스크리닝 공정을 효과적으로 소형화한다.

B. 응급 최초 반응자

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 오염에 응답하는 응급요원 (즉, 예를 들어, 최초 반응자)의 예방 및 치료 처치를 고려한다. 한 실시양태에서, 응급 최초 반응자는 응급 구조사 (EMT), 소방관, 여자소방관, 경찰, 여경, 기자, 경찰견 또는 경찰마를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

미지 물질의 수집 및 확인은 위험하고 일반적으로 시간 소모적인 절차일 수 있다. 특히, 미생물 분석은 대개 실험실 내에서 전문화된 장비를 요구한다. 독성 물질 (즉, 예를 들어, 탄저병)을 마주칠 고위험이 증가한 전세계적 테러가 최근 증가하였기 때문에, 응급 최초 반응자 오염을 신속하게 예방 및/또는 치료할 필요가 있다. 추가로, 스크리닝 및/또는 시험 프로토콜은 전문화된 장비 없이 쉽게 이용가능해야 한다.

전세계에서 테러리스트 활동이 최근 가속화되었기 때문에, 최초 반응자는 미생물 감염에 대항한 특이적인 보호를 제공하는 화합물을 포함하는 쉽게 이용가능한 조성물을 필요로 한다. 응급 최초 반응자를 위한 그러한 보호에 대한 필요는 테러리스트 공격을 넘어 자연 재해, 트럭 사고 및 산업 재해를 포함하고 이로 제한되지 않는 사건으로 확장한다. 이들 사건은 미생물 물질을 분산시킬 수 있고, 상기 미생물 공급원의 서면 설명서, 경고 표지 등을 제거 또는 파괴함으로써 즉각적인 확인을 거의 불가능하게 한다.

미생물의 정체를 알지 못하면, 응급 최초 반응자는 그 자신, 그의 가족 및 다른 사람들뿐만 아니라 그들이 치료하는 사람까지 오염 위험이 큰 상태에 이르게 한다. 사람의 병태를 일으키는 물질을 모르면서 사람을 적합하게 치료할 수 없고, 최초 반응자가 사람이 노출된 물질을 모르면, 그 사람을 부정적인 방식으로 미지의 물질과 반응할 약물로 사람을 치료할 수도 있기 때문에 최초 반응자는 그들이 치료할 사람이 노출된 물질을 아는 것이 또한 필요하다.

응급 최초 반응자가 미지의 물질의 신속하고 효율적인 분석, 보호, 및 치료를 필요로 하는 유일한 사람은 아니다. 미지의 물질의 예방, 치료 및/또는 신속한 분석을 필요로 하는 사람의 다른 예는 산업 지역을 정화하는 폐기물 정화 인력, 유체를 누출하는 소포를 본 우편실 직원, 용의자의 자동차에서 미지의 물질을 발견한 경관, 및 표시가 없는 화학물질 병 옆에서 의식이 없는 어린이를 발견한 교사를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

미지의 물질을 시험하기 위해 사용되는 현재의 방법은 종종 전문화된 실험실에서 이용가능하다. 샘플 수송을 기다리고, 시험을 수행하기 위한 훈련받은 인력의 모집을 위해 귀중한 시간이 소모된다. 결과적으로, 본 발명은 표지된 미생물 DNA의 어레이, 샘플 DNA 추출 용액, 및 표지를 정량할 수 있는 검출기를 포함하는 키트를 고려한다. 그러한 키트는 미생물 오염의 종류의 현장 (on-site) 결정을 허용할 것이다.

비-특이적인 오염제거는 미생물 포자가 존재하는 경우에 효과적이지 않을 수 있는 노동 집약적이고 시간 소모적인 업무이다. 본 발명은 적어도 하나의 포자 표면 단백질로부터 유래한 복수의 펩티드 단편을 포함하는 쉽게 이용가능한 오염제거 조성물을 고려한다. 그러한 단편은 고체 표면 (즉, 예를 들어, 빌딩 벽, 천장, 계단, 사무용 가구 등)으로부터 및 응급 최초 반응자의 외부 상피층 (즉, 예를 들어, 피부)으로부터 세균 포자를 대체할 것이다. 또한, 인간 및/또는 동물 투여에 적합한 비경구, 비내, 폐 또는 경구 조성물은 체조직 (즉, 예를 들어, 입, 목구멍, 비도, 폐, 위, 장, 방광 또는 결장)으로부터 세균 포자를 대체할 것이다. 결과적으로, 본 발명은 포자 표면 단백질에 대한 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 조성물을 고려하고, 여기서 단백질은 표면 (즉, 예를 들어, 고체 인공 표면 또는 피부 표면)에 대한 미생물 포자의 부착을 책임진다.

C. 군용 용도

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 오염에 응답하는 군인 (즉, 예를 들어, 최초 반응자)의 예방 및 치료 처치를 고려한다. 한 실시양태에서, 군인은 보병, 조종사, 기갑부대, 해군, 해병, 특수부대원, 병참부대, 군납업자 또는 종군기자를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 적어도 하나의 포자 표면 단백질로부터 유래되는 복수의 펩티드 단편을 포함하는 쉽게 이용가능한 오염제거 조성물을 고려한다. 그러한 단편은 고체 표면 (즉, 예를 들어, 텐트, 지프차, 탱크, 무기, 유니폼 등)으로부터 및 군인의 외부 상피층 (즉, 예를 들어, 피부)으로부터 세균 포자를 대체할 것이다. 또한, 인간 및/또는 동물 투여에 적합한 비경구, 비내, 폐 또는 경구 조성물은 체조직 (즉, 예를 들어, 입, 목구멍, 비도, 폐, 위, 장, 방광 또는 결장)으로부터 세균 포자를 대체할 것이다. 결과적으로, 본 발명은 포자 표면 단백질에 대한 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 조성물을 고려하고, 여기서 단백질은 표면 (즉, 예를 들어, 고체 인공 표면 또는 피부 표면)에 대한 미생물 포자의 부착을 책임진다.

한 실시양태에서, 본 발명은 방탄 직물 (ballistic fabric)의 일상적인 오염제거 방법을 고려한다. 현재, 방탄 직물로 제조된 의복은 냉수 및 순한 세제를 사용하여 손으로 세척하고, 모든 미량의 세제를 제거하기 위해 완전히 세정한다. 적합한 세정은 물을 흡수하고 특정 종류의 방탄 직물의 방탄성을 감소시킬 수 있는 잔류 비누 필름의 축적을 방지한다. 그러한 과정은 시간 소모적이고 힘이 들지만, 세탁기 세척 또는 건조가 직물을 손상시키고, 결국 방탄 성능을 해칠 수 있기 때문에 필요하다. 추가로, 일부 세제, 드라이 클리닝 용매, 표백제 및 전분은 의복의 방탄 수준을 감소시킬 수 있고, 대부분의 제조자는 이들을 사용하지 않을 것을 강하게 권고한다. 추가로, 방탄 직물의 대부분의 제조자는 방탄 직물을 물에 담그거나, 그늘이더라도 실외에서 건조하지 않을 것을 강하게 권고하고, 이는 자외광이 특정 종류의 방탄 직물의 분해를 야기하기 때문이다.

유사하게, 보호 의류, 예를 들어 군용 소방보호복 및 다른 보호 품목, 예를 들어 무릎 패드, 정강이받이, 어깨 패드 등의 관리 및 세탁은 힘들고 시간 소모적이다. 반복된 세탁은 그러한 의복의 유용 수명을 감소시킬 수 있다.

방탄 직물로 제조된 보호복 및 의복 모두에 대한 공통적인 문제는 착용자의 땀이다. 땀을 제거하지 않으면, 시간이 지남에 따라 진균 및/또는 세균 성장이 일어날 수 있다. 상기 진균 및/또는 세균 성장은 결국 물품의 보호 특성을 저하시키고, 유독성 악취를 일으키고, 가능하게는 심지어 착용자에 대해 장기 건강 문제를 야기한다. 특히 군용 소방보호복에 관하여, 군용 보호 의류의 제작에 사용되는 모든 직물 및 성분은 최소 성능 요건을 통과해야 한다. 따라서, 무기 발사 및/또는 화염 및 고온에 노출될 위험이 있는 군인을 위해 디자인된 보호 의복의 내층은 대체로 아라미드 섬유 및 얀 (yarn)으로 제조된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 방탄 직물 물품 및 다른 군용 보호복의 오염제거 방법을 포함하고, 여기서 물품 및 의복은 아라미드, 폴리벤자졸, 또는 고성능 폴리에틸렌 섬유를 포함하고 이로 제한되지 않는 성분을 포함한다. 한 실시양태에서, 물품 및/또는 의복은 포자 표면 단백질에 대한 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 조성물에 의해 오염제거된다. 조성물은 물품에 직접 적용되거나, 또는 섬유에 또는 직물 마감제로서 쉽게 비용 효과적인 방식으로 적용될 수 있다.

IX . 항미생물 펩티드

감염 제어 연구는 현재 신규한 항-미생물 펩티드 및 항-미생물 유기 화학물질에 대한 탐구를 포함한다. 항미생물 펩티드는 식물, 곤충, 어류, 양서류, 조류 및 포유동물로부터 단리되었다 ([Gallo, J. Invest. Dermatol., 111:739-743 (1998)]; 및 [Ganz et al., Pharmac. Ther., 66:191-205 (1998)]). 이들 펩티드는 명백하게 미생물의 세포질막에 세공을 생성하는 기능을 하는 미생물 발병기전에 대한 선천적 숙주 보호의 1차 성분이다 (Oren et al., Biopolymers, 47(6):451-463 (1998)). 추가로, 항미생물 펩티드는 또한 신데칸 발현, 화학주성 및 클로라이드 분비와 같은 거동을 변경하기 위해 자극함으로써 동물 세포에 대해 작용한다 (Gallo, J. Invest. Dermatol., 111:739-743 (1998)). 미생물과 접촉한 후, 척추동물 피부, 기관 및 혀 상피는 펩티드 항생제를 생산하는 것으로 보고되었다 (Russell et al., Infect Immun., 64(5):1565-1568 (1996)). 그러나, 항미생물 펩티드는 일반적으로 미생물 포자에 대해 효과적인인 것으로 관찰되지 않았다.

고등 진핵생물의 항미생물 펩티드는 선천적 면역계의 성분으로서 오랫동안 인정되었지만, 초기에는 원시적이고 임상 유의성이 거의 없는 것으로 여겨졌다. 그러나, 이들 펩티드의 상대적인 단순성은 1차 미생물 감염의 예방에서뿐만 아니라 후속적인 면역조정에서도 또한 그의 중요성과 일치하지 않는다 (Bowman, "Peptide antibiotics and their role in innate immunity", Annu. Rev. Immunol, 13:61-92 (1995)). 추가로, 분자의 작은 크기는 많은 미생물 내성 메카니즘에 대한 감소된 감수성을 제안한다.

항미생물 펩티드는 일반적으로 세균 및 일부 진균에 치사성이다. 이들은 포유동물 세포에 대해 차별적인 독성을 보인다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 항미생물 펩티드는 지질 이중층과 상호작용하여 세균막의 통합성을 손상시킬 수 있다고 생각된다 (Hwang et al., Biochem Cell Biol, 76:235-246 (1998)).

SMAP 29는 양 골수 RNA의 3' RACE 분석을 통해 처음 확인된 카텔리시딘의 양 항미생물 펩티드이다 (Mahoney, FEBS Lett, 377:519-522 (1995)). RCAP 18은 과립구로부터 처음 확인된 카텔리시딘의 이리 (lupine) 항미생물 펩티드이다 (Hirata et al., Infect. Immun. 62:421-1426 (1994)). SMAP 29 및 RCAP 18 펩티드는 일부 약물 내성 세균 균주에 대항한 보호를 제공하는 것으로 생각된다. 예를 들어, SMAP 29 조성물은 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 알칼리게네스 자일로속시단스 (Alcaligenes xylosoxidans) 및 스테노트로포모나스 말토필라 (Stenotrophomonas maltophila)에 의한 항생제 내성 감염을 제어할 수 있다.

전장 항미생물 펩티드의 항세균 효능은 그의 백본을 따른 소수도 구배와 직접적으로, 음이온성 잔기의 상대적인 풍부함과 역으로 명백하게 상호관련되지만, 트리플루오로에탄올 내에서 나선 형성 정도와 상호관련되지 않는다.

따라서, 본 발명은 고체 표면에 대한 미생물 포자 상호작용, 부착 및/또는 안정화를 억제할 수 있는 조성물의 스크리닝 및 확인 방법을 고려한다. 이들 스크리닝 방법이 숙주 유기체 (즉, 예를 들어, 인간, 가축 동물, 목축 동물 등)에 대한 미생물 포자 상호작용, 부착 및/또는 안정화를 억제할 수 있는 화합물을 또한 확인하는 것도 추가로 고려된다.

X. 조합 영양 세포/포자 항미생물 조성물

본 발명은 통상적인 항생제 약물에 대한 항미생물 내성에 관련된 문제의 해결 방법을 포함한다. 명백한 항미생물 내성에 대한 하나의 이유는 통상적인 항미생물제가 미생물 포자에 대해 비효과적이라는 사실이다. 결과적으로, 통상적인 항미생물 화합물을 사용한 "오염제거" 후에 미생물 포자가 여전히 존재할 때, 포자는 활동적인 미생물 성장로 전환될 것이다. 이것은 실제로 재발하는 미생물 존재가 불완전한 오염제거 기술 때문일 때, "미생물 내성"으로서 (잘못)-해석될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 통상적인 항미생물제 또는 항생제와 조합으로 세균 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 조성물을 고려한다.

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 미생물 표면 포자 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물 및/또는 하나 이상의 통상적인 항미생물제 또는 항생제를 포함하는 조성물이 활동적인 미생물 (즉, 예를 들어, 영양 세포)을 효과적으로 치사시킬 뿐만 아니라 고체 표면 및/또는 체조직으로부터 미생물 포자를 탈리시킬 것으로 생각된다. 상기 조합 방법은 항미생물제를 단독으로 사용한 오염제거에서 가능하지 않은 방부 수준을 생성시키는 것으로 추가로 생각된다.

내성 특성을 갖는 것으로 확인된 세균 균주의 목록을 표 XIII에 나열한다.

<표 XIII>

[Lorian, In: Antibiotics in Laboratory Medicine. Satterfield (Ed), Williams & Wilkins, Philadelphia, pp. 558-559 (1991)].

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 조성물을 고려하고, 여기서 화합물은 상이한 종 및 균주의 세균으로부터 유래한 펩티드에 대한 친화도를 갖는다. 한 실시양태에서, 상이한 균주의 세균은 복수의 항생제 약물에 대해 내성이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 안정한 제약 제형을 포함한다. 한 실시양태에서, 제형은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 제형이 식품 제제, 제약 제제, 의학 및 제약 제품, 화장품, 위생 제품, 세정 제품 및 세정제뿐만 아니라, 물질 상의 미생물 포자 부착 및 후속적 성장의 억제가 요망되는, 조성물이 그 위에 분무 또는 부착될 수 있는 임의의 물질 내에 포함되어 인간 또는 동물에게 투여될 수 있음이 추가로 고려된다.

미생물 부착 및 후속적 성장 및 증식을 방지하기 위해 필요한 본 발명의 조성물의 적합한 적용량은 존재할 수도 있는 세균의 종류, 조성물이 도입되는 환경, 및 조성물이 주어진 영역 내에 남아있도록 고안되는 시간을 비롯한 많은 인자에 따라 결정된다.

본 발명의 조성물은 그의 활성을 향상시키기 위해 다른 항미생물제 또는 항생제와 조합으로 사용될 수 있음이 추가로 고려된다. 본 발명의 조성물 및 다른 물질의 조합물은 독성 문제 때문에 항생제가 보다 저용량으로 사용될 수 있도록 하기 위해, 그의 효능이 감소된 항생제의 활성을 향상시키기 위해, 또는 조합물이 독립적인 성분들의 효능의 합보다 더 효과적이도록 성분들 사이의 상승작용을 유발하기 위해 유용할 수 있다.

조합 치료에서 본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 항생제는 페니실린, 암피실린, 아목시실린, 반코마이신, 시클로세린, 바시트라신, 세팔로스포린, 이미페넴, 콜리스틴, 메티실린, 스트렙토마이신, 카나마이신, 토브라마이신, 겐타미신, 테트라시클린, 클로르테트라시클린, 독시시클린, 클로람페니콜, 링코마이신, 클린다마이신, 에리트로마이신, 올레안도마이신, 폴리믹신, 날리딕산, 리파마이신, 리팜피신, 간트리신, 트리메토프림, 이소니아지드, 파라미노살리실산 및 에탐부톨을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 항생제에 대한 세균 내성을 감소시킴으로써 예시되는 바와 같이 항미생물제에 대한 미생물 내성을 감소시키는 것, 또는 일반적으로 미생물 또는 세균을 미생물 또는 세균의 부착 및/또는 후속적 성장을 억제하기 위해 효과적인 양의 미생물 포자 표면 펩티드에 대해 친화도를 갖는 조성물과 조합으로 유효량의 항생제 또는 항미생물제와 접촉시킴으로써 미생물 또는 세균을 사멸시키는 것을 고려한다. 용어 "미생물" 및 "세균"은 단순함을 위해 사용되고, 본 발명은 미생물 집단에 대해 사용하기에 적합한 것이 이해될 것이다.

미생물, 예를 들어, 세균 또는 그의 집단은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 접촉될 수 있다. 생체내 접촉은 미생물 또는 세균으로 오염되거나 오염된 것으로 의심되는 동물 (인간 환자 포함)에게, 미생물 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물을 단독으로 또는 치료량의 약물학상 허용되는 항생제 제형과 조합으로 포함하는 조성물을 포함하는 약물학상 허용되는 제형 치료 유효량을 투여함으로써 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 전신 혈류 내로 물질의 조합물을 도입함으로써 또는 예를 들어, 상처 또는 화상과 같은 특정한 부위에 또는 눈, 귀 또는 다른 감염 부위에 국소적으로 조합물을 적용함으로써 전신 및 국재성 미생물 및 세균 감염을 치료하기 위해 모두 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 다른 항미생물제 또는 항생제와 조합으로 사용될 때, "유효량의 항미생물제 또는 항생제"는 정상적으로 제공되거나 처방되는 범위 내의 양 또는 용량을 의미한다. 상기 범위는 일상적인 임상 실행에 잘 확립되어 있고, 따라서 당업자에게 알려져 있을 것이다. 적절한 용량 및 치료 요법은 본원에 더욱 상세히 설명되어 있다 (표 XIV 참조). 물론, 미생물 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물에 대한 최적 치료 용량을 확립하는데 있어서, 당업계에서 일상적으로 실시되는 바와 같이 먼저 동물 연구 및 이어서 임상 시험을 수행할 것이다 (실시예 II 참조).

<표 XIV>

제안된 조성물 및/또는 조성물과 다른 항미생물제의 조합물의 안정한 사용을 위해 요구되는 LD₅₀/ED₅₀ 비는 실험 동물에서 LD₅₀ (중앙 치사 독성 투약량) 및 ED₅₀ (중앙 유효 치료 투약량)을 결정함으로써 평가한다. 이어서, 인간 대상체에 대한 최적 용량은 임상 시험에서 범위를 미세 조정함으로서 규정한다. LD₅₀의 경우에, 억제제는 대체로 치사 범위 내에서 수회 용량 (대체로 4-5회)으로 마우스 또는 래트에게 (경구 또는 복강내) 투여된다. 용량 (mg/kg 단위)를 % 사망률에 대해 플로팅하고 (plotting), 50%에서 용량은 LD₅₀을 나타낸다. ED₅₀은 유사한 양식으로 결정한다.

임상 시험에서, 치료 용량은 임의의 부작용 및 관련 독성을 최소화하면서 환자에 대한 이익을 최대화함으로써 결정될 것이다. 본원에 개시된 범위 내에서 치료 용량을 최적화하는데 있어서, 환자 이질성 때문에 범위의 상한을 임상 시험에서 출발점으로서 사용하지 않을 것이다. 보다 낮은 또는 중간-범위 용량 수준으로 시작한 후 용량을 증가시키면 임의의 주어진 환자 또는 환자의 하위세트에서 독성 또는 부적당한 반응을 일으킬 가능성을 제한할 것이다. 대부분의 유익한 약물은 또한 특정 환자에서 제한된 양의 바람직하지 않은 효과를 생성하는 것이 잘 알려져 있으므로, 일부 부작용 또는 특정 독성 반응 자체의 존재 자체가 본 발명의 유용성을 제한하지는 않을 것이다.

조합 치료를 사용한 동물 또는 인간 환자의 치료에서, 다양한 적절한 제형 및 치료 요법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물 및 적어도 하나의 추가의 항미생물 약물을 포함하는 조성물은 예를 들어, 화합물 및 추가의 약물(들)을 포함하는 단일 제형의 형태로, 또는 적어도 2개의 구분되는 제형을 사용함으로써 동물에게 동시에 투여할 수 있다. 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 화합물은 또한 추가의 약물(들)에 앞서 동물에게 투여될 수도 있고, 그 반대도 가능하다.

본 발명의 추가의 실시양태는 적합한 용기 수단 내에, 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 적어도 하나의 화합물 및 적어도 하나의 추가의 항미생물 약물 및/또는 항생제의 제약 조성물을 포함하는 치료 키트를 포함한다. 화합물, 항미생물제 및/또는 항생제는 단일 용기 수단 내에 함유될 수 있거나, 복수의 구분되는 용기를 사용할 수 있다.

상황에 따라, 항미생물 물질은 경구 또는 비경구 치료 요법으로 사용될 수 있다. 적절한 용량을 달성하기 위한 방법은 다양한 간행물에 기재되어 있다 (Reese and Betts, In: A Practical Approach to Infectious Diseases, (3rd ed), Boston, Little Brown, (1993)).

XI . 항세균 세척제 조성물

항세균 세정 조성물은 일반적으로 사용자의 팔과 손을 세정하기 위해 및 사용자의 팔 또는 손에 존재할 수도 있는 세균 및 임의의 다른 미생물을 파괴하기 위해 사용된다. 이들 조성물은 직원간 또는 직원과 환자 사이의 감염을 억제하기 위해 병원 직원 및 다른 건강 관리인이 손 세척제로서 건강 관리 산업에서 널리 사용한다. 이들은 세균 등에 접촉할 수도 있는 의료계 종사자, 예를 들어 외과의, 간호사 및 다른 건강 관리 전문가가 사용하기에 특히 적합하다. 이들은 외식 및 식육 가공 산업의 인력이 사용하기에 또한 적합하고, 일반적으로 대중의 손과 팔의 항미생물 세정을 위해 사용한다.

세정 조성물에서 사용하기 위해 몇몇 활성 항미생물제가 현재 이용가능하다. 예를 들어, 많은 항미생물 세정 조성물은 비스비구아나이드 세균성 물질, 예를 들어 클로르헥시딘 디글루코네이트 (CHG)를 함유한다. 다른 세정 조성물은 페놀계 화합물을 이용한다. 그러나, 이들 물질의 항미생물 활성은 종종 함께 사용되는 계면활성제 또는 다른 성분들의 종류(들)에 따라 결정되고, 따라서, 동일한 성분과 이들 항미생물 물질의 사용이 반드시 동일한 결과를 유도하지는 않을 것이다. 예를 들어, CHG를 활성 항미생물제로서 사용할 때, 세정 조성물은 1차 계면활성제로서 알킬 폴리글루코시드 및 비이온성 알콜 에톡실레이트를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 그러나, 치환된 페놀, 예를 들어 파라-클로로-메타-자일레놀 (PCMX; 4-클로로-3,5-디메틸 페놀)을 활성 항미생물제로서 함유하는 조성물에서, 대부분의 비이온성 알콜 에톡실레이트는 PCMX 항세균 활성을 향상시키기보다는 억제한다. PCMX는 그람-양성 및 그람-음성 세균뿐만 아니라 진균의 큰 초기 감소를 일으키고, 손 세척 사이에 수시간 동안 우수한 잔류 활성을 제공할 수 있다. 대개, PCMX는 세정 조성물에 사용될 때 약 0.1 내지 4 중량%의 농도로 사용된다. 그러나, 대다수의 제제는 1 중량% 이하를 함유한다.

치환된 페놀을 활성 항미생물제로서 함유하는 항미생물 세정 조성물은 음이온성 세제, 비누, 계면활성제 등뿐만 아니라, 페놀계 화합물의 항세균 활성을 감소시킬 수 있는 다른 화합물 (비이온성 에톡실화 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜 등)을 또한 포함한다. 알콜 및 수성 담체 내의 치환된 페놀계 화합물 및 음이온성 표면 활성 세제 또는 비누도 또한 유용하다. 추가로, 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산 (이하 EDTA)이 첨가될 수 있다 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 3,824,190 & RE 28,778 (Winicov et al.)).

순함 특성을 보이는 항미생물 조성물은 치환된 페놀, 즉 PCMX, 음이온성 세제, 점성도 부여제 (thickener), 예를 들어 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 및 거품 형성제 (foam builder), 예를 들어 지방산 알칸올 아미드를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 점성도 부여제 및 지방산 알칸올 아미드뿐만 아니라 음이온성 계면활성제는 페놀계 화합물의 항세균 활성을 저해하는 것으로 의심된다 (미국 특허 4,632,772 (Garabedian et al., 본원에 참고로 포함됨)). 다른 PCMX 조성물은 계면활성제 혼합물 내의 무수 블렌드를 포함한다 (미국 특허 5,114,978 (Corti et al., 본원에 참고로 포함됨)).

PCMX는 물 또는 수성 조성물 내에 고농도로 가용화될 수 있다. PCMX 조성물은 지방산의 디에탄올아미드 및 알킬폴리옥시에틸황산의 클래스 디에탄올암모늄 염의 음이온성 계면활성제를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

알콜계 항미생물 조성물은 PCMX 또는 CHG, 히드로프로필 셀룰로스, 알콜, 연화제 및 물을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 조성물 내에 용매 또는 담체로서 알콜의 사용은 피부를 탈지시키고 이는 피부 건조 및 자극을 일으킬 수 있음이 알려져 있는 것으로 생각된다 (미국 특허 5,288,486 (White et al., 본원에 참고로 포함됨)).

결과적으로, PCMX는 그의 효능이 항미생물 세척제 조성물 내의 담체와 다른 화학적 구성분 모두에 크게 의존한다는 점에서 미생물에 대하여 CHG 및 다른 치환된 페놀과 유사하다. PCMX의 항미생물 활성은 킬레이팅제 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및/또는 격리제 (sequestering agent) 헥사메타인산나트륨의 첨가에 의해 슈도모나스 애루기노사에 대항하여 강화될 수 있지만, PCMX는 일부 유기 물질 및/또는 중정도 농도의 음이온성 계면활성제의 존재 하에 감소될 수 있다. 또한, 항미생물 활성은 PCMX와 비이온성 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 스테아레이트 사이의 가역적인 상호작용의 결과로서 상실될 수 있다. 유사하게, PCMX의 항세균 효능의 감소는 또한 다양한 거대분자, 즉, 메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 폴리소르베이트 80과 그의 상호작용의 직접적인 결과인 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 표준 항생 세척제 조성물, 예를 들어 PCMX 및 CGH로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 통상적인 음이온성 계면활성제를 포함하지 않는 치환된 페놀 또는 치환된 페놀 항미생물 활성에 유해한 다른 화학 성분을 함유하는 항세균 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 항미생물 세정 조성물은 치환된 페놀 및 적어도 1종의 1차 계면활성제를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 치환된 페놀을 총 조성물의 약 0.1 내지 약 4 중량%, 바람직하게는 총 조성물의 약 0.3 내지 1 중량%의 양으로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 치환된 페놀을 항미생물제의 4 중량%를 초과하는 양으로 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 항미생물제 양의 상한은 피부에 비독성이고 비자극성인 것으로 간주되는 치환된 페놀의 양과 관련되는 것으로 생각된다.

물 또는 다른 비-알칸올 용매 (즉, 예를 들어, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜 등)에 가용성인 임의의 치환된 페놀을 본 발명의 조성물에서 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 치환된 페놀은 알킬 치환된, 할로겐 치환된, 페놀 치환된, 알킬 할로 치환된, 벤질 알킬 치환된, 페닐에틸 알킬 치환된 및 벤질 할로 치환된 페놀, 및 알킬 치환된, 할로겐 치환된 및 알킬 할로 치환된 비스페놀, 비스(히드록시페닐) 알칸, 아미노 치환된 페놀, 레솔시놀 유도체, 삼가 페놀 유도체, 나프톨 유도체 및 카르복실산 치환된 페놀 (예를 들어, 살리실산 및 에스테르)을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 치환된 페놀은 클로로-치환된 페놀, 즉 파라-클로로-메타-자일레놀 (PCMX)을 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, PCMX는 넓은 스펙트럼의 세균에 대해 비치환된 페놀의 60배의 항미생물 활성을 가질 수 있는 것으로 생각되고, 또한 약 3 중량% 미만의 수준에서 인간 피부에 비독성 및 비자극성인 것으로 간주된다 (미국 특허 5,635,462 (Fendler et al., "Antimicrobial cleansing compositions", 본원에 참고로 포함됨)).

한 실시양태에서, 본 발명의 감염 제어 세척제 조성물은 아민 옥시드, 인지질, 부분적으로 중화된 카르복실산 및 이염기산 (diacid), 베타인 또는 에톡실화된 메틸글루코시드 및/또는 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 1차 계면활성제를 포함한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 본 발명의 조성물에 첨가될 1차 계면활성제(들)의 양은 첨가되는 1차 계면활성제의 수에 다소 의존하는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 조성물은 복수의 1차 계면활성제를 포함하고, 여기서 1차 계면활성제의 조합되는 양은 조성물의 약 20 중량% 미만이다.

한 실시양태에서, 조성물은 아민 옥시드 또는 알킬 아민 옥시드를 포함하고 이로 제한되지 않는 1차 계면활성제를 포함한다. 한 실시양태에서, 아민 옥시드는 조성물에 약 0 (불포함) 내지 약 10 중량%, 보다 바람직하게는 약 5 내지 7 중량%의 양으로 첨가된다. 한 실시양태에서, 조성물은 아민 옥시드를 유일한 1차 계면활성제로서 포함하고, 여기서 아민 옥시드는 약 1 내지 약 10 중량%의 양으로 첨가된다. 한 실시양태에서, 아민 옥시드는 약 C₈ 내지 약 C₁₆의 알킬 사슬 길이를 갖고, 이때 사슬 길이는 C₁₂ 내지 C₁₄이다.

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 본 발명에서 고려되는 아민 옥시드는 양쪽성 계면활성제인 것으로 간주되는 것으로 생각된다. 본 발명에 적합한 것으로 밝혀진 아민 옥시드의 예는 라우라민 옥시드 C₁₂ 알킬 아민 옥시드 (맥카민 (Mackamine) LO®) 및 코카민 옥시드 C₁₂-C₁₄ 알킬 아민 옥시드 (맥카민 CO®) (매킨타이어 케미칼 컴퍼니 엘티디. (McIntyre Chemical Co., Ltd., 미국 일리노이주 시카고))뿐만 아니라 C₁₄ 알킬 아민 옥시드 (발록스 (Barlox) 14®) 및 C₁₂ 알킬 아민 옥시드 (발록스 12®) (론자, 인크. (Lonza, Inc., 미국 뉴저지주 페어 론))를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 본원에서 고려되는 조성물은 스탠다목스 (Standamox) LAO® 또는 맥카민 CAO® (헨켈 코퍼레이션 (Henkel Corp., 미국 뉴저지주 호보켄))를 포함하고 이로 제한되지 않는 아미도프로필 아민 옥시드에 적합하다.

추가로, 코카미드와 같은 알킬아미드를 거품 형성을 증가시기 위해 및 조성물의 점도를 증가시키기 위해 아민 옥시드 또는 다른 1차 계면활성제와 함께 사용할 수 있다. 점도 변형제 및/또는 거품 안정화제는 스탠다미드 (Standamide) CD®, 스탠다미드 SD®, 및 코카미드 (Cocamide) DEA® (헨켈 코퍼레이션, 미국 뉴저지주 호보켄)를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 아민 옥시드는 치환된 페놀의 항세균 활성을 유의하게 감소시키지 않고 미생물을 치사시키기 위해 PCMX와 조합으로 효과적인 것으로 밝혀진 것으로 생각된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 쌍성이온/양쪽성 계면활성제, 예를 들어 인지질 및 베타인을 1차 계면활성제로서 포함하는 감염 제어 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 인지질 및/또는 베타인은 아민 옥시드 대신에 또는 그와 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 인지질 및 베타인을 약 10 중량% 이하의 양으로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 감염 제어 세척제 조성물은 알킬 포스파티딜 PG-디모늄 클로라이드를 포함하고 이로 제한되지 않는 인지질을 포함한다. 한 실시양태에서, 알킬 포스파티딜 PG-디모늄 클로라이드는 코카미도프로필 포스파티딜 PG-디모늄 클로라이드 (포스포리피드 (Phospholipid) PTC®, 모나 인더스트리즈, 인크. (MONA Industries, Inc., 미국 뉴저지주 패터슨)); 스테아라미도프로필 포스파티딜 PG- 디모늄 클로라이드 (포스포리피드 PTS®, 모나 인더스트리즈, 인크. (미국 뉴저지주 패터슨)); 리놀레아미도프로필 포스파티딜 PG-디모늄 클로라이드 (포스포리피드 EFA®, 모나 인더스트리즈, 인크. (미국 뉴저지주 패터슨)); 및 스테아라미도프로필 포스파티딜 PG-디모늄 클로라이드/세틸 알콜 (포스포리피드 SV®, 모나 인더스트리즈, 인크. (미국 뉴저지주 패터슨))을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 알킬 포스파티딜 PG-디모늄 클로라이드는 조성물 내에 총 조성물의 0 (불포함) 내지 약 10 중량%의 양으로 포함된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 베타인 지질을 1차 계면활성제로서 단독으로 또는 다른 1차 계면활성제와 함께 포함하는 감염 제어 세척제 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 베타인 지질은 8 내지 18개의 탄소 원자의 알킬암모니오 카르복실레이트를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 총 조성물의 10 중량% 이하의 알킬암모니오 카르복실레이트를 포함한다. 한 실시양태에서, 알킬암모니오 카르복실레이트는 코코베타인 (맥캄 (Mackam) CB-35®, (매킨타이어 케미칼 컴퍼니 엘티디., 미국 일리노이주 시카고))을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 1차 계면활성제로서 사용될 수 있는 적어도 하나의 부분적으로 중화된 카르복실산 및/또는 이염기산 (즉, 예를 들어, 나트륨 카프로일 락틸레이트)의 혼합물을 포함하는 감염 제어 세척제 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 카르복실산 및/또는 이염기산은 세정 조성물에 0 (불포함) 내지 약 5 중량%의 양으로 첨가된다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 부분적으로 중화된 카르복실산 및 이염기산은 일부 음이온성 계면활성제를 함유할 수 있지만, 이들은 상당한 양성자화된 산 특성을 갖는 것으로 생각되고, 따라서, 이들 화합물은 용어 "통상적인 음이온성 계면활성제"로부터 분명하게 배제된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 비이온성 1차 계면활성제를 포함하는 감염 제어 세척제 조성물을 고려한다. 한 실시양태에서, 비이온성 1차 계면활성제는 에톡실화된 비이온성 메틸 글루코시드를 포함한다. 한 실시양태에서, 에톡실화된 비이온성 메틸글리코시드는 또한 조성물에 0 (불포함) 내지 약 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

조성물은 점성도 부여제, 연화제, 킬레이팅제 및 격리제, 방향제, 착색제, 불투명화제, 펄화제 (pearlizing agent), 비타민 등과 같은 다른 첨가제를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 조성물을 보다 심미적으로 만족스럽게 만들기 위해 중합체 증점제 또는 점성도 부여제, 예를 들어 히드록시에틸 셀룰로스를 포함할 수 있다. 다른 적합한 중합체 증점제의 예는 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하지만 반드시 이들로 제한되지는 않는다.

글리콜은 치환된 페놀의 용해 속도를 빠르게 하기 위해 및 연화제 및/또는 보습제로서 첨가될 수 있다. 글리콜은 프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜 및 헥실렌 글리콜을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 글리콜은 조성물에 총 조성물의 0 (불포함) 내지 약 10 중량%, 보다 바람직하게는 약 3%의 양으로 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, PCMX 및/또는 제2 치환된 페놀은 다른 성분을 용액에 첨가하기 전에 글리콜의 적어도 일부에 용해될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 25%/75% 비의 PCMX:글리콜을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 약 1 중량% 이하의 킬레이팅제 및/또는 격리제를 포함하는 감염 제어 세척제 조성물을 고려한다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 킬레이팅제 및/또는 격리제는 수성 조성물을 연화하기 위해 첨가될 수 있는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 본 발명에 적합한 킬레이팅제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (즉, 예를 들어, 이나트륨 EDTA)을 포함한다.

본 발명의 조성물은 소량이지만 유효량의 다른 통상적인 첨가제, 예를 들어 방향제, 색소, 불투명화제, 펄화제, 비타민 등을 추가로 포함할 수 있다. 특정 펄화제의 예는 에틸렌 글리콜 디스테아레이트를 포함하지만, 반드시 이로 제한되지는 않는다. 일반적으로, 이들 첨가제는 감염 제어 특성에 관한 조성물의 필수 특성을 해치지 않는 양으로 사용된다.

최적 항세균 효능을 위해, 조성물의 pH는 4 내지 8, 바람직하게는 5.5 내지 6.5이어야 한다. 조성물의 pH를 조정하기 위해, 조성물의 성분들에 적합성인 임의의 산을 사용할 수 있다. 산은 락트산, 시트르산, 아세트산, 글리콜산, 또는 글루콘산을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 대개, 적합한 pH 균형을 달성하기 위해 1 중량% 미만의 이들을 산을 사용한다.

조성물의 나머지는 대개 100 중량%의 조성물을 제공하도록 물이지만, 다른 수용성 화합물이 또한 적합하다 (즉, 예를 들어, 알콜).

본원에 나타낸 모든 중량%는 활성 조성물 %에 기초한 것이다. 따라서, 예를 들어, 5 중량% 라우라민 옥시드가 사용되고 라우라민 옥시드를 제조자로부터 입수하거나 30% 활성 용액을 구성하도록 용액 내로 희석한 경우에, 권장되는 5 중량%를 얻기 위해 용액의 16.7%를 사용해야 할 것이다.

본 발명의 감염 제어 세정 조성물은 치환된 페놀, 즉 PCMX를 상기한 바와 같은 글리콜에 용해시키고 이 용액을 물 내의 상기 논의된 하나 이상의 1차 계면활성제에 첨가함으로써 일반적으로 제조된다. 보다 특히, 1차 계면활성제(들) 및 다른 성분 (즉, 예를 들어, 방향제, 킬레이팅제, 펄화제 등)은 교반하면서 용액에 첨가한다. 조성물의 pH는 락트산 또는 유사한 산으로 조정한다. 이어서, 바람직하게는 점성도 부여제/증점제를 첨가하고, 용액을 완전히 균질하게 될 때까지 혼합한다. pH를 검토하고 필요할 경우에 다시 조정한다. 상기 과정은 필요한 경우에 증점제의 수화를 향상시키기 위해 열을 가하거나 가하지 않으면서 사용될 수 있다.

XII . 포자 표면 단백질 뉴클레오티드 서열을 포함하는 미생물의 검출

본 발명은 포자 표면 단백질 뉴클레오티드 서열 (즉, 예를 들어, 서열 2) 및/또는 포자 표면 단백질 뉴클레오티드 서열 (즉, 예를 들어, 서열 4, 6, 또는 8)을 함유하는 미생물의 검출 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 서열을 함유하는 미생물은 다양한 절차에 의해 확인할 수 있다. 이들 절차는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화, 및 DNA 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고머 프로브 또는 앰플리머 (amplimer)), mRNA 프로브 및 관심있는 서열의 단편을 사용하는 증폭 (예를 들어, PCR)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이들 프로브 및 단편은 뉴클레오티드 서열 또는 그의 임의의 일부의 화학적 합성, 제한 소화 및 발현 벡터에서의 발현을 포함하고 이로 제한되지 않는 매우 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 합성 또는 발현된 프로브 및 뉴클레오티드 서열 단편의 표지는 올리고표지, 말단부-표지, 또는 표지된 뉴클레오티드를 사용한 PCR 증폭을 이용하여 달성할 수 있다.

생성된 표지된 프로브를 사용하여, 생물학적 샘플 내에 존재하는 미생물을 단리된 플라스미드의 총 세포성 DNA의 서던 또는 역 노던 분석을 이용하여, 또는 mRNA의 노던 분석을 이용하여 뉴클레오티드 서열의 존재에 대해 시험할 수 있다. 미생물은 직접 또는 철야 배양 후에 필터 상에서 성장시키거나 필터 상에 점찍을 수 있다 ([Moseley et al., J. Infect. Dis. 142:892-898 (1980)]; [Perine et al., J. Infect. Diseases 152(1):59-63 (1985)]; 및 [Gootz et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 28(1):69-73 (1985)]). 간단히 설명하면, 니트로셀룰로스 종이 또는 나일론 막과 같은 고체 지지체에 임상 시료, 또는 세균을 함유하는 것으로 의심되는 임상 시료의 브로쓰 배양액을 접종한다. 세포를 니트로셀룰로스 종이 상으로 용해시키고, DNA를 예를 들어 NaOH 처리에 의해 변성시킨다. 콜로니 물질에 대한 DNA 프로브의 배경의 비-특이적 결합을 저하시키기 위해, 지지체를 프로나제 및 클로로포름으로 처리한다. 필터 (즉, 지지체)와 올리고뉴클레오티드, 올리고머, 또는 뉴클레오티드 서열의 일부의 예비혼성화 및 혼성화를 표준 기술을 이용하여 수행한다. 혼성화는 많은 이용가능한 방법 중의 임의의 하나, 예를 들어 X-선 필름을 사용한 영상화 방사성 프로브 (즉, 자가방사선술)에 의해 검출한다.

표면으로부터 유래한 샘플 내에 미생물 포자 표면 단백질 뉴클레오티드 서열을 갖는 세균의 검출은 표면에 대한 미생물 포자 표면 단백질 결합을 변경시키는 감염 제어 조성물을 투여하는 것이 유익함을 입증한다. 추가로, 그러한 검출은 감염 제어 조성물의 투여 동안 및 후에 세균의 존재에 대한 표면 모니터링을 허용한다.

한 실시양태에서, 본 발명에서 고려되는 스크리닝 방법 (즉, 예를 들어, 분석)은 분석의 하나 이상의 성분이 고체 표면에 부착된 고체상에서 수행할 수 있다. 고체상 분석에서, 분석의 하나 이상의 성분이 고체 표면에 부착된다. 표면 물질이 분석 시약에 적합성이고 분석 성분의 반응성을 과도하게 변경하지 않으면서 성분을 표면에 부착시키는 것이 가능하다면, 실질적으로 임의의 고체 표면이 적합하다. 일부 성분은 고체상에서 감소된 활성을 보일 수 있지만, 활성이 감염 제어 시험 화합물과 상호작용하기 위해 충분하다면 이것은 일반적으로 허용된다.

고체 지지체는 분자가 부착할 수 있는 유리 비드, 평면 유리, 세공 제어 유리, 플라스틱, 다공성 플라스틱 금속 또는 수지를 포함하고 이로 제한되지 않는 본질적으로 임의의 고체 표면을 포함한다. 고체 지지체는 링커의 부착 또는 성분(들)의 직접 부착을 위한 반응 부위를 제공하기 위해 관능기 (예를 들어, 히드록실, 아민, 카르복실, 에스테르 및 술프히드릴)로 유도체화될 수 있다.

고체 지지체에 대한 분석 성분 (예를 들어, 포자 표면 단백질)의 부착은 직접적 또는 간접적일 수 있다 (즉, 특정 화합물(들)은 지지체에 결합되고, 분석 성분은 고체 지지체가 아니라 상기 화합물(들)에 결합함). 성분은 i) 공유적으로 (즉, 예를 들어, 단백질 성분을 고정하기 위한 시스테인의 단일 반응성 티올기를 이용함으로써; [Colliuod et al., Bioconjugate Chem. 4:528-536 (1993)]); ii) 비-공유적이지만 특이적으로 (즉, 예를 들어, 고정된 항체 또는 다른 특이적 결합 단백질을 통해; [Schuhmann et al., Adv. Mater. 3:388-391 (1991)]; 및 [Lu et al., Anal. Chem. 67:83-87 (1995)]); iii) 비오틴/스트렙타비딘 시스템에 의해 (Iwane et al., Biophys. Biochem. Res. Comm. 230:76-80 (197)); iv) 금속-킬레이팅 랭뮈어-블로젯 (Langmuir-Blodgett) 필름을 사용함으로써 ([Ng et al. Langmuir 11:4048-4055 (1995)]; 및 [Schmitt et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:317-320 (1996)]); 및 v) 폴리히스티딘 융합 단백질의 결합을 위해 자가-조립 단일층을 금속-킬레이팅함으로써 (Sigal et al., Analytical Chem. 68:490-497 (1996)) 고정될 수 있다.

XIV . 포자 표면 단백질을 포함하는 미생물의 검출

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 포자 단백질 및/또는 펩티드 단편의 검출을 포함하는 방법을 고려한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자 단백질 및/또는 펩티드 단편은 미생물 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편은 클로스트리듐 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 클로스트리듐 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편은 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 단백질 및/또는 펩티드 단편을 포함한다.

단백질 및/또는 펩티드 단편 (임의의 공급원으로부터의)은 다양한 적합한 방법에 의해 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 및/또는 펩티드 단편은 면역조직화학에 의해 검출된다. 다른 실시양태에서, 단백질 및/또는 펩티드 단편은 단백질에 대해 생성된 항체에 대한 그의 결합에 의해 검출된다.

항체 결합은 예를 들어, 방사성 면역분석, ELISA (효소 연결 면역흡착 분석), "샌드위치 (sandwich)" 면역분석, 면역방사측정법, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 계내 면역분석 (예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지를 사용함), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 분석 (예를 들어, 겔 응집 분석, 적혈구응집 분석 등), 보체 고정 분석, 면역형광 분석, 단백질 A 분석 및 면역전기영동 분석 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 상이한 기술에 의해 검출할 수 있다.

한 실시양태에서, 항체 결합은 1차 항체 상의 표지를 검출함으로써 검출된다. 또 다른 실시양태에서, 1차 항체는 1차 항체에 대한 2차 항체 또는 시약의 결합을 검출함으로써 검출된다. 추가의 실시양태에서, 2차 항체가 표지된다.

일부 실시양태에서, 자동화 검출 분석을 이용한다. 면역분석의 자동화 방법은 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,885,530, 4,981,785, 6,159,750 및 5,358,691에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석 및 결과 제시도 또한 자동화된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 암 마커에 대응하는 일련의 단백질의 존재 또는 부재를 기초로 하여 예후를 생성시키는 소프트웨어를 이용한다.

다른 실시양태에서, 면역분석은 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,599,677 및 5,672,480에 기재되어 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질 및/또는 핵산의 검출 및 특성화를 위한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출 시약 및 버퍼에 추가로 관심있는 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적인 항체를 함유한다. 다른 실시양태에서, 키트는 mRNA 또는 cDNA의 검출에 특이적인 시약 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 키트는 검출 분석의 수행에 필요한 모든 성분, 예를 들어 모든 제어, 분석 수행 지시, 및 분석 및 결과 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 포함한다.

XV . 제약 제형

본 발명의 활성 조성물은 전통적인 제약 제형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이들 제형의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통해 이용가능하다면 임의의 일반적인 경로를 통할 것이다. 이것은 국소, 경구, 코, 구강, 직장, 질 또는 국소를 포함한다. 별법으로, 투여는 동소 (orthotopic), 피부내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 실시될 수 있다. 그러한 제형은 보통 제약상 허용되는 조성물로서 투여될 것이다.

A. 경구 또는 비경구 투여를 위한 용액

본 발명에서 고려되는 제형, 조성물 및 다른 물질 및 약물은 비경구 또는 경구로 또한 투여될 수 있는 활성 화합물일 수 있다. 유리 염기 또는 약물학상 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예를 들어 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 내에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 내에서 및 오일 내에서 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 방부제를 함유할 수 있다.

주사가능 용도에 적합한 제약 제형은 무균 수용액 또는 수성 분산액, 및 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 무균 분말을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 제형은 무균이다. 한 실시양태에서, 제형은 시린지를 사용하여 쉽게 제형을 처리하도록 유체 특성을 갖는다. 한 실시양태에서, 제형은 제조 및/또는 저장 조건 하에 안정하다. 한 실시양태에서, 제형은 담체, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물유를 포함하고 이로 제한되지 않는 용매 또는 분산 매질을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 목적하는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유도될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 내에 흡수 지연제, 예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 사용함으로써 유도될 수 있다.

무균 주사가능 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 요구될 때 상기 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 내에 포함시킨 후 멸균함으로써 (즉, 예를 들어, 여과, 방사선 및/또는 에틸렌 옥시드 노출에 의해) 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 각종 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거한 것 중에서 요구되는 다른 성분을 함유하는 무균 비히클 내에 포함시킴으로써 제조할 수 있다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조 기술이고, 이것은 그의 앞서 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말 + 임의의 추가의 바람직한 성분을 생성시킨다.

경구 투여를 위해, 본 발명의 미생물 포자 표면 단백질에 대한 친화도를 갖는 조성물은 부형제와 함께 포함되고 비-섭취 구강세척액 (mouthwash) 및 치약 형태로 사용될 수 있다. 구강세척액은 요구되는 양의 활성 성분을 적절한 용매, 예를 들어 붕산나트륨 용액 (즉, 예를 들어, 도벨 (Dobell) 용액) 내에 포함시킴으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유하는 방부 세척액 내로 포함될 수 있다. 활성 성분은 또한 겔, 페이스트 (paste), 분말 및 슬러리를 포함한 치약 내에 분산될 수 있다. 활성 성분은 물, 결합제, 연마제, 향미제, 발포제 및 보습제를 포함할 수 있는 페이스트 치약에 치료 유효량으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등을 사용하여 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철, 및 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래할 수 있다.

제형화 시에, 용액은 치료상 유효한 양으로 투약 제형에 적합성인 방식으로 투여될 것이다. 제형은 주사가능 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여형으로 쉽게 투여된다. 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 구강내, 복강내, 근육내, 피하, 경구, 국소, 직장, 질내, 코 및 눈 안 중에서 선택될 수 있다.

수용액 내에서 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 당업자는 본 명세서에 비추어 사용할 수 있는 무균 수성 매질을 알 것이다. 예를 들어, 하나의 투약량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가하거나, 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (본원에 참고로 포함된 문헌 [In: Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 치료하는 대상체의 상태에 따라 투약량의 일부 변동은 어쩔 수 없이 일어날 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여를 위해, 제제는 FDA 생물학제제부 (Office of Biologics) 표준에서 요구되는 무균성, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 만족해야 한다.

B. 국소 또는 비경구 투여를 위한 리포좀

한 실시양태에서, 본 발명은 미생물 포자 표면 단백질에 대한 친화도를 갖는 화합물을 포함하는 리포좀 제제를 포함하는 제형을 고려한다. 한 실시양태에서, 화합물은 리포좀에 의해 캡슐화되고, 여기서 캡슐화는 통상적인 약물 전달 시스템에 비해 화합물 반감기를 연장시킨다.

"리포좀"은 일반적으로 밀폐된 지질 이중층 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층상 지질 비히클 (vehicle)을 포함하는 일반적 용어로서 사용된다. 예를 들어, 인지질은 리포좀을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 순수 양전하, 순수 음전하를 보유할 수 있거나 중성이다. 디세틸 포스페이트는 리포좀에 음전하를 부여하기 위해 사용될 수 있고, 스테아릴아민은 리포좀에 양전하를 부여하기 위해 사용될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 할 수 있다. 다층상 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 갖는다. 리포좀은 인지질이 과잉의 수용액 내에 현탁될 때 대체로 자발적으로 형성된다. 발명의 메카니즘을 이해할 필요는 없지만, 지질 성분은 닫힌 구조의 형성 전에 자가-재배열하고 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용해질을 가두는 것으로 생각된다 (Ghosh et al., In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G. and C. Wu (eds.), New York: Marcel Dekker, pp.87-104 (1991)). 양이온성 지질-핵산 복합체, 예를 들어 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 리포좀은 혈구응집 바이러스 (HVJ)와 복합체화될 수 있다. HVJ는 세포막과의 융합을 용이하게 하고 세포 도입을 촉진하는 것으로 나타났다 (Kaneda et al., J. Biol. Chem., 264: 12126-12129 (1989)).

본 발명에 따른 리포좀 제조에 적합한 지질은 상업적인 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 시그마 케미컬 코. (Sigma Chemical Co)로부터, 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 케이 앤 케이 래보래토리즈 (K & K Laboratories, 미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터; 콜레스테롤 ("Chol")은 칼바이오켐-베링 (Calbiochem-Behring)으로부터; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크. (Avanti Polar Lipids, Inc., 미국 앨라배마주 버밍험)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름, 클로로포름/메탄올 또는 t-부탄올 내의 지질의 원액 용액은 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올보다 더 쉽게 증발하기 때문에 클로로포름을 유일한 용매로서 사용한다.

천연 공급원, 예를 들어 계란 또는 대두 포스파티딜콜린, 뇌 포스파티드산, 뇌 또는 식물 포스파티딜이노시톨, 심장 카디오리핀 및 식물 또는 세균 포스파티딜에탄올아민으로부터의 인지질은 바람직하게는 생성되는 리포좀의 불안정성 및 누출성 때문에 총 포스파티드 조성물의 50% 이상을 구성하는 1차 포스파티드로서 사용되지 않는다.

본 발명에 따라 사용되는 리포좀은 상이한 방법에 의해 제조할 수 있다. 리포좀의 크기는 합성 방법에 따라 상이하다. 수용액 내에 현탁된 리포좀은 일반적으로 지질 이중층 분자의 하나 이상의 동심층을 갖는 구형 소포 형태이다. 각각의 층은 식 XY (여기서, X는 친수성 모이어티이고, Y는 소수성 모이어티임)로 표시되는 분자의 평행 어레이로 이루어진다. 수성 현탁액 내에서, 친수성 모이어티가 수성상과 접촉하여 유지되는 경향이 있고 소수성 영역이 자가-회합하는 경향이 있도록 동심층이 배열된다. 예를 들어, 수성상이 리포좀과 함께 또는 리포좀 없이 존재할 때, 지질 분자는 배열 XY-YX의 이중층 (층 (lamella)으로서 공지됨)을 형성할 것이다.

본 발명의 범위 내의 리포좀은 많은 실험실 기술에 따라 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 리포좀은 용기, 예를 들어, 유리 배 (pear) 모양 플라스크 내에서 리포좀 지질을 용매 내에 혼합함으로써 제조한다. 용기는 리포좀의 예상 현탁액 부피보다 10배 초과의 부피를 가져야 한다. 회전 증발기를 사용하여, 용매를 약 40℃에서 음압 하에 제거한다. 용매는 보통 리포좀의 목적하는 부피에 따라 약 5 min 내지 2시간 내에 제거된다. 조성물은 진공 하에 데시케이터 내에서 추가로 건조할 수 있다. 건조된 지질은 일반적으로 시간이 경과함에 따라 품질이 저하되는 경향이 있기 때문에 약 1주 후에 버린다.

건조된 지질은 모든 지질 필름이 재현탁될 때까지 진탕함으로써 발열원 미함유 무균수 내에 약 25-50 mM 인지질로 수화될 수 있다. 이어서, 수성 리포좀을 분취액으로 나누고, 각각 바이알 내에 넣고, 동결건조시키고, 진공 하에 밀봉할 수 있다.

다른 방법에서, 리포좀은 다른 절차에 따라 제조할 수 있다 ([Bangham et al., J. Mol. Biol, 13:238-252 (1965)]; [Gregoriadis (Ed), In. Drug Carriers in Biology and Medicine, pp 287-341 (1979)]; [Deamer et al., "Liposome Preparation: Methods and Mechanisms", In. Liposomes. M. Ostro (Ed) (1983)]; 및 [Szoka et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 75:4194-4198 (1978)] (모든 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨). 상기 언급된 방법은 수성 물질을 가두는 각각의 능력 및 각각의 수성 공간 대 지질 비율에 있어서 상이할 수 있다.

상기한 바와 같이 제조된 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀은 핵산의 용액 내에 재구성하고 적합한 용매, 예를 들어, DPBS를 사용하여 적절한 농도로 희석할 수 있다. 이어서, 혼합물을 볼텍스 (vortex) 혼합기 내에서 격렬하게 진탕한다. 캡슐화되지 않은 핵산은 29,000xg에서 원심분리에 의해 제거하고, 리포좀 펠렛을 세척한다. 세척된 리포좀을 적절한 총 인지질 농도, 예를 들어, 약 50-200 mM로 재현탁시킨다. 캡슐화된 핵산의 양은 표준 방법에 따라 결정할 수 있다. 리포좀 제제 내에 캡슐화된 핵산의 양을 결정한 후, 리포좀을 적절한 농도로 희석하고 사용시까지 4℃에서 저장할 수 있다.

한 실시양태에서, 지질 디올레오일포스파티딜콜린을 사용하여 리포좀 제형을 생성한다. 한 실시양태에서, 미생물 포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 조성물을 과잉의 t-부탄올의 존재 하에 지질과 혼합한다. 혼합물을 볼텍싱한 후, 아세톤/드라이아이스 조 내에서 동결시킨다. 동결된 혼합물을 동결건조하고, HEPES-완충 염수 (1 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 7.5)로 철야 수화한 후, 리포좀을 바쓰 (bath)형 초음파 분해기 내에서 10 내지 15 min 동안 초음파 분해한다. 펩티드-리포좀의 크기는 마이크로미터 미만 입자 사이저 자동희석 (sizer autodilute) 모델 370 (니콤프 (Nicomp, 미국 캘리포니아주 산타 바바라))으로 결정할 때 대개 직경이 200-300 nm 범위이다.

포자 표면 펩티드에 대한 친화도를 갖는 감염 제어 조성물을 포함하는 정제된 조성물은 추가의 변형 없이 사용할 수 있거나 제약상 허용되는 담체 내에 희석할 수 있다. 감염 제어 조성물은 독립적으로 또는 다른 항미생물 약물과 조합으로 사용할 수 있다. 조성물의 안정성 때문에, 본 발명의 조성물이 식품 제제, 제약 제제, 의학 및 제약 제품, 화장품, 위생 제품, 세정 제품 및 세정제뿐만 아니라, 미생물 성장의 억제가 요망되는, 펩티드가 그 위에 분무 또는 부착될 수 있는 임의의 물질 내에 포함되어 인간 또는 동물에게 투여될 수 있음이 고려된다.

실험

다음 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 예시하기 위해 포함된다. 이들 실시예는 본 발명의 구체적인 실시양태를 실시할 수 있는 기술을 제시하기 위한 것으로 의도된다. 그러나, 본원에 개시된 구체적인 실시양태에 대한 많은 변화가 이루어질 수 있고, 여전히 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다.

실시예 I

포자 표면 펩티드 합성

본 발명에서 고려되는 포자 표면 펩티드는 0.1 mM 규모에서 어플라이드 바이오시스템즈 모델 433A 펩티드 합성기 및 파스트목 (Fastmoc) 전략을 사용하는 고체상 방법에 의해 합성할 수 있다. 펩티드 정제는 바이닥 (Vydac) 218TP1022 (22 x 250 mm) 컬럼을 사용하는 워터스 델타 프렙 (Waters Delta Prep) 상에서 역상 HPLC에 의해 수행할 수 있다. 분리는 수성 0.1% 트리플루오로아세트산 (용매 A) 및 0.085% 트리플루오로아세트산을 함유하는 100% 아세토니트릴 (용매 B)의 구배 시스템을 사용하여 수행한다. 0 내지 100% B의 선 구배를 70 min에 걸쳐 적용하고 분획을 0.2 min마다 수집한다. 분획을 후속적으로 등용매 용출 조건 하에 0.5 ml/min의 유속으로 바이닥 218TP54 (4.6x250 mm) 컬럼을 사용하는 베크만 골드 시스템 (Beckman Gold System) 상에서 분석 규모 역상 HPLC에 의해 모니터링한다. 선택한 분획을 모으고 동결건조시키고; 펩티드의 추가의 특성 결정은 질량 분광분석법 및 모세관 전기영동에 의해 제공한다. 질량 측정은 전기분무 이온화원이 장치된 휴렛-팩카드 모델 1100 MSD를 사용하여 0.05% 트리플루오로아세트산을 함유하는 64% 아세토니트릴 내에서 0.1 ml/min의 유동 주입에 의해 수행한다.

모세관 전기영동은 연장된 광경로 용융-실리케이트 컬럼 75 마이크로미터 (ID) x 80.5 센티미터 (총 길이)가 장치된 휴렛-팩카드 3D 기기 상에서 수행한다. 모세관 전기영동 실험은 18℃에서 100 mM 인산나트륨 버퍼 (pH 2.9) 내에서 20,000 볼트에서 실시한다. 펩티드 농도는 베크만 6300 아미노산 분석기 상에서 정량적 아미노산 분석에 의해 결정한다.

실시예 II

세균 균주 및 포자 제제

다음 클로스트리듐 디피실레 균주를 사용하였다: ATCC 700057, ATCC BAA-1382 (균주 630), ATCC 43594, 및 ATCC 9689. 포자 크롭 (spore crop)은 35℃에서 2일 동안 브루셀라 (Brucella) 혈액 한천 옥시라제 플레이트 (BBAO) 상에서 혐기성 성장, 이어서 BBAO 상에 재도말함으로서 생산하였다. 포자를 35℃에서 4일 동안 성장시킨 후 15 ml 1xPBS 및 0.1% 트윈 (Tween)-80 (PBST) 내에 수거하였다. 포자를 3000 x g에서 20 min 동안 4℃에서 원심분리하고, 15 ml의 PBST로 3회 세척하고, 10 ml 히스토덴즈 (HistoDenz) (시그마) 내에 재현탁시킨다. 현탁액을 15 ml 50% 히스토덴즈 용액의 상단 위에 쌓아 구배를 형성하였다. 구배를 5000 x g에서 15 min 동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠렛을 앞서 설명된 바와 같이 15 ml PBST 내에 3회 세척하고, 5 ml PBST 내에 재현탁시킨다. 이어서, 샘플을 출력 (power) 수준 0.5에서 5초 동안 2회 초음파 분해하여 영양 모 세포를 용해시켰다. 이어서, 앞서 설명된 히스토덴즈 절차를 반복하였다. 최종 포자 현탁액을 4℃에서 저장하였다.

실시예 III

박편 투과 전자 현미경

샘플 제조 및 전자 현미경을 위해 다음 절차를 이용하였다:

1. 샘플을 2.5% 글루타르알데히드, 2% 파라포름알데히드, 0.01 M 포스페이트 버퍼, 2.5% DMSO로 실온에서 2시간 동안 고정시킨다.

2. 0.1 M 포스페이트 버퍼 내에서 세척한다 (15-30분 경과 시간에 걸쳐 3회 교환).

3. 1% 수성 사산화오스뮴 + 1.5% 페로시안화칼륨 1 h 동안 RT에서.

4. DDW (15-30분 경과 시간에 걸쳐 3-4회 교환) 내에서 RT에서 세척한다.

5. 차단 염색: 4℃에서 철야 0.5% 수성 우라닐 아세테이트.

6. 탈수 (즉, 예를 들어, 에탄올 사용), 각각의 단계는 10-15 min 동안 수행:

a) 30%; b) 50%; c) 70% (4℃에서 가능한 철야 동안); d) 80%; e) 90%; f) 95%; g) 99%; 및 h) 100%.

7. 프로필렌 옥시드 (PO): 각각의 단계를 15-30 min 동안 수행:

a) 에탄올:PO = 50:50

b) 에탄올:PO = 25:75

c) PO = 100%

8. 에폰 (Epon): 각각의 단계를 2 h 동안 수행:

a) 에폰:PO = 30:70

b) 에폰:PO = 50:50

c) 에폰:PO = 75:25

d) 에폰 = 100%

e) 에폰 = 100%

9. 중합화, 즉, 예를 들어 60℃~70℃에서 48 hr 동안 가열함으로써.

10. 절편화

11. 우라닐 아세테이트 및 시트르산납 염색

12. 탄소 코팅.

13. EM 관찰 (JEOL 1200EX 또는 자이쓰 (Zeiss) 902)

실시예 IV

클로스트리듐 디피실레 포자외막 제제

약 10⁹개의 포자를 20,000 lb/in²에서 냉각 (4℃) 프렌치 프레스 (French press)를 통해 1회 통과시켰다 (도 17 참조). 투과 전자 현미경 (TEM) 검사로 상기 절차가 처리되지 않은 대조군 포자외막 단편에 비해 포자의 나머지에 대해 검출가능한 손상 없이 큰 포자외막 단편을 제거하였음을 확인하였다. 사진은 부착된 정제된 포자외막과 함께 벗기기 전후의 포자를 비교한다 (도 18A 대 도 18B 참조). 프렌치 프레스로부터 압출된 샘플을 9,000 x g 및 4℃에서 5 min 동안 원심분리하고, 상등액을 보관하였다. 펠렛을 10 ml의 냉 TEP 버퍼 내에 재현탁하고 상기한 바와 같이 원심분리하였다. 펠렛을 10 ml의 TEP 버퍼 내에 재현탁하고 -20℃에서 보관하고, 이 동안 상등액을 선행 원심분리의 상등액과 합하고 9.500 x g 및 4℃에서 15 min 동안 원심분리하였다.

이어서, 생성되는 상등액을 아미콘 초원심분리 필터 장치 (밀리포어)를 사용하여 5000 x g 및 4℃에서 약 60 min 동안 원심분리에 의해 농축시켰다 (최종 부피, 500 ㎕). 상기 포자외막 샘플의 전자 현미경 검사를 통해 포자가 실질적으로 부재함을 확인하였다 (도 18C 참조).

실시예 V

포자외막 가용화 , 단백질 전기영동 및 면역블로팅

포자외막 샘플 10 ㎕을 45 ㎕의 2x 노벡스 트리스-글리신 SDS 샘플 버퍼 (인비트로겐 (Invitrogen)), 35 ㎕ 물 및 10 ㎕ 200 mM 디티오트레이톨 내에서 5 min 동안 비등함으로써 가용화시켰다. 가용화된 단백질은 4-12% 트리스-글리신 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분리하였다. 면역블로팅을 위해, 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔로부터 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 전기영동에 의해 전달하고, 인비트로겐 웨스턴 브리즈 (Western Breeze) 분석 키트에 대한 매뉴얼에 기재된 바와 같이 처리하였다. 간단히 설명하면, 각각의 블롯을 차단하고, 1 h 동안 1차 MAb의 1:1000 희석액으로 프로빙하고, 세척하였다. 이어서, 블롯을 30 min 동안 알칼리성 포스파타제 접합된 염소 항-토끼 IgG 2차 항체로 프로빙하고, 세척하고, 알칼리성 포스파타제 발색제 용액으로 발색시켰다.

실시예 VI

아미노-말단 단백질 서열결정 및 질량 분광분석법

SDS-PAGE 조각을 물로 세척하고 아세토니트릴 내에서 탈수시켰다. 이어서, 밴드를 요오도아세트아미드로 알킬화시킨 후, 겔 내 소화시켰다. 모든 밴드를 트립신 (50 mM 중탄산암모늄 중 20 ng/㎕ 트립신) 5 ㎕ 내에서 실온에서 철야 인큐베이팅함으로써 겔 내 소화시켰다. 형성된 펩티드를 5% 포름산을 함유하는 50% 아세토니트릴 30 ㎕의 2개의 분취액 내에서 폴리아크릴아미드로부터 추출하였다. 이들 추출물을 합하고 스피드백 (Speedvac) 내에서 10 ㎕ 미만으로 증발시킨 후, 1% 아세트산 내에 재현탁시켜 LC-MS 분석을 위해 ~30 ㎕의 최종 부피를 구성하였다.

LC-MS 시스템 (피니간 (Finnigan) LTQ)은 자가-충진된 9 cm x 75 ㎛ id 페노메넥스 쥬피터 (Phenomenex Jupiter) C18 역상 모세관 HPLC 컬럼을 포함하였다. 10 ㎕ 부피의 추출물을 주입하고, 용출된 펩티드를 직렬 (on-line)의 질량 분광기의 공급원 내로 도입하였다. 펩티드 분자량을 결정하기 위해 전체 스캔 (full scan) 질량 스펙트럼, 및 연속적인 기기 스캔에서 아미노산 서열을 결정하기 위해 생성물 이온 스펙트럼을 획득하는 기기의 데이타 의존 멀티태스크 (multitask) 능력을 이용하여 소화물을 분석하였다. 상기 분석 방식은 풍부하게 몇몇 크기 자리수 (orders of magnitude)에 걸친 범위의 이온의 대략 2500 충돌 유도 분해 (CID) 스펙트럼을 생산한다.

데이타는 포유동물 분류학 필터를 사용하는 검색 프로그램 마스코트 (Mascot)로 NCBI 비-중복 데이타베이스를 검색하기 위해 실험에서 수집된 모든 CID 스펙트럼을 사용하여 분석하였다. 모든 일치 스펙트럼을 수동 해석에 의해 입증하였다. 해석 과정은 필요한 경우에 프로그램 세퀘스트 (Sequest) 및 블라스트 (Blast) (Cleveland Clinic for Mass Spectrometry and Protein Sequencing)를 사용하는 추가의 검색의 도움을 받았다.

실시예 VII

CD 분광학

원편광 이색성 (CD) 분광학은 25℃에서 열전기 온도 제어가 설치된 AVIV 62 DS 분광기 (아비브 어소시에이츠 (AVIV Associates, 미국 뉴저지주 레이크우드)) 상에서 수행할 수 있다. 샘플은 50 mM 인산나트륨 (pH 7.0) 내에 0.11 - 0.24 mg/mL 펩티드를 함유하였고; 일부 샘플은 또한 40% 트리플루오로에탄올 또는 0.1% (0.22 mM) 지질다당류 (LPS)를 함유하였다. 스펙트럼을 0.1 cm의 경로길이를 사용하여 데이타점마다 2 s의 평균 시간으로 0.5 nm 간격으로 수집하였다. 스펙트럼을 5개의 데이타 점의 간격에 걸쳐 1회 평탄화한 후, 2개의 스캔의 평균을 나타내는 각각의 스펙트럼으로 플로팅하였다. 2개의 버퍼 스캔의 평균은 데이타 평탄화 전에 공제한다. 분획 나선 함량은 25℃에서 동일한 길이의 100% 나선 펩티드에 대한 관찰된 평균 잔기 타원율 대 평균 잔기 타원율의 비로부터 계산한다 (Luo and Baldwin (1997)).

실시예 VIII

펩티드 소수성 모멘트 ( moment ) 및 소수도의 계산

펩티드 소수도 및 소수성 모멘트는 표준화 컨센서스 (consensus) 소수도 스케일 (scale)을 이용하여 계산한다 (Eisenberg et al., J. Cell Biochem 31:11-725 (1986)).

실시예 XI

클로스트리듐 스포로게네스 ( Clostridium sporogenes ) 포자외막 제거

30-s 간격으로 총 150 s 까지 브라운 (Braun) 균질기 내에서 균질화를 이용하여 씨. 스포로게네스 포자로부터 포자외막을 제거하였고, 이때 크리스탈 바이올렛 염색 및 광학 현미경에 의해 결정할 때 포자외막의 최적 제거를 위해서는 120 내지 150 s가 요구된다 (Du et al., "Bacillus thuringiensis HD-73 spores have surfaced localized Cry 1Ac toxin: physiological and pathogenic consequences" Appl. Environ. Microbiol. 62:3722-3726 (1996)).

포자 표면 및 포자외막 성분을 제거하기 위해 포자를 추출한다 (Aronson et al., "Comparative structural and functional aspects of spore surfaces" In: Spores VII. American Society for Microbiology, p. 54-61. G. Chambliss and J.C. Vary (ed), Washington, D.C. (1978)). 씨. 스포로게네스의 포자 (1.1 x 10⁹)를 5 mM 시클로헥실아미노에탄 술폰산-8 M 우레아-50 mM β-머캅토에탄올-0.8% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 내에서 pH 9.8에서 90 min 동안 37℃에서 추출하였다. 포자를 12,000 x g에서 10 min 동안 원심분리하고, 상등액 추출물을 5 min 동안 비등시켰다. 추출물을 6 M 우레아를 함유하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 직접 적용하였다. 분자량 결정을 위해, 겔을 0.2-mm-세공 크기 니트로셀룰로스에 전달하였다. 블롯을 TBS (pH 7.4) 중의 3% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 이어서, 블롯을 0.05% 트윈 20을 함유하는 TBS 내에 1:1,000으로 희석된 적절한 비오티닐화 항체 (즉, 예를 들어, C33 및/또는 C225, 또는 씨. 스포로게네스에 대해 D89)와 함께 인큐베이팅하였다. TBS-0.05% 트윈 20 내에 1:1,000으로 희석된 아비딘 표지된 퍼옥시다제 (시그마 A7419)를 사용하여 불용성 기질 4-나프톨 (바이오-라드 (Bio-Rad))로 항원을 검출하였다.

당단백질 결정은 과요오드산-쉬프 (Schiff) 염색을 이용하여 수행하였다. 겔을 철야 고정시키고 0.7% 과요오드산으로 2 h 동안, 이어서 0.2% 메타중아황산염으로 2 h 동안 처리하였다. 이어서, 겔을 염기성 푹신 (fuchsin), 메타중아황산나트륨 및 염산을 포함하는 쉬프 시약 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific, 미국 펜실바니아주 피츠버그))에 노출시켰다. 포자 추출물로부터 당단백질으로서 양성으로 염색되는 단백질의 운동성을 결정하고, 웨스턴 블로팅에 의해 결정된 항원의 운동성에 비교하였다.

콜로이드성 금을 사용한 면역학적 표지를 위한 포자의 초박 (약 100-mm) 냉동 절편을 제조하였다 (Chang et al., "Immunocytochemical localization of antigens in B. cereus T spores" J. Rapid Methods Automat. Microbiol. 2:229-233 (1993)). 항원에 사용된 것과 동일한 원액으로부터 씨. 스포로게네스 PA3679 포자를 이들 실험에 사용하였다. 냉동 절편을 5% 우태 혈청을 함유하는 PBS, 이어서 순서대로 PBS, 0.1 M 염화암모늄을 함유하는 PBS 및 PBS 상에 각각 5 내지 10 min 동안 실온에서 부유시켰다. 절편을 1차 시약 (1:100으로 희석된 적절한 모노클로날 항체)의 액적 상에 1 내지 2 h 동안 부유시킨 후, PBS 내에서 각각 5 min 동안 6회 세척하였다. 이어서, 절편을 2차 시약의 액적 상에 20 내지 30 min 동안 부유시켰다. 2차 시약은 1:10 희석비로 사용된 10-nm-직경 콜로이드성 금에 접합된 염소 항-마우스 IgG + 염소 항-마우스 IgM이었다. 절편을 다시 PBS 내에서 6회, 이어서 증류수로 3회 세척하였다. 이들을 약 20% (vol/vol) 포화 수성 우라닐 아세테이트를 함유하는 2.3 M 메틸셀룰로스의 액적 상에 부유시킴으로써 염색하고 메틸셀룰로스 내에 포매시켰다. 그리드 (grid)를 루프 (loop) 내에 집어들고, 배수시키고, 대기 건조시켰다. 이들을 필립스 (Philips) EM 300 전자 현미경 내에서 관찰하였다. 음성 대조군은 세균 포자와 반응하지 않는 IgG1 및 IgM 이소형의 모노클로날 항체로 처리한 포자이다.

실시예 X

표면에 결합된 클로스트리듐 디피실레 포자의 컵 스크럽 분석

본 실시예는 표면에 결합된 포자를 분석할 수 있는 방법의 하나의 실시양태를 설명한다. 본 실시예에서, 씨. 디피실레 포자를 표면에 결합시키고 컵 스크럽 방법에 의해 분석한다 (ATSM International, "Standard Test Method for Recovery of Microorganisms From Skin using the Cup Scrub Technique" E1874-09 (2009)).

물질

멸균기 - 멸균 조건을 생성할 수 있는 임의의 적합한 증기 멸균기.

컵 스크럽 - 바람직하게는 안정을 용이하게 하기 위해 막대 핸들이 있는 적합한 조성물의 무균 실린더, 높이 약 2.5 cm, 편리한 크기의 내경. 유용한 크기는 약 1.5 내지 4.0 cm 범위이다.

연마 유리 막대 또는 고무 폴리스맨 - 실험실에서 만들거나 구입할 수 있다.

피펫터 (Pipettor) - 적절한 부피(들)을 전달하기 위한 일회용 팁 (tip)을 가짐.

컵 스크럽 유체를 담기 위한 무균 비이커, 시험관 또는 다른 용기.

미생물 배양 - 본 시험 방법은 임의의 미생물 배양 (즉, 예를 들어, 씨. 디피실레 미생물 배양)을 표적으로 하는 프로토콜 내에서 사용될 수 있다.

샘플링 (sampling) 및 희석 유체 - 무균 버터필드 (Butterfield) 포스페이트 완충 물 또는 적합한 조성의 다른 회수 유체; 이것은 시험 부위 상에 존재할 수도 있는 임의의 미생물에 대해 특이적인 항미생물 불활성화제를 함유해야 하고; 불활성화제 효능은 시험 방법에 의해 결정될 것이다.

시험 대조군 및 기준선 피부 부위

대조군으로서 사용하기 위한 반대측 샘플 부위를 제공하는, 씨. 디피실레 성장에 적절한 피부 부위를 선택하였다. 분석을 위해 선택된 많은 대상체 (인간 또는 동물)는 예상된 시험 결과를 위해 필요한 통계 신뢰도, 연구에서 마주치는 변수, 및 평가할 수 있는 임의의 항세균제의 상대적인 효능에 따라 결정된다. 대상체 상에 이용가능한 다수의 부위가 존재할 수 있고; 샘플 편향을 억제하기 위해 무작위선정이 요구된다. 효과를 구별하기 위해 요구되는 복제물의 수는 부분적으로 프로토콜 내에서 대조군의 적절성 및 디자인에 따라 결정될 것이다. 단리된 피부 또는 동등물에 대한 상기 기술의 사용은 절차를 효과적으로 수행하기 위해서 시험 부위를 고정하는데 의존적이다.

생체내 샘플 수집

샘플링할 영역을 무균 샘플링 실린더로 그렸다. 샘플링 유체가 샘플링 부위로부터 누출하지 않도록 하기 위해 샘플링하는 동안 실린더를 피부 표면에 대해 단단히 누른다. 생성물 중화제를 함유하거나 함유하지 않는 무균 샘플링 유체의 최소 1.5-mL 분취액을 실린더 내로 피펫팅하였다. 이어서, 전체 영역을 무균 연마 유리 막대 또는 폴리스맨을 사용하여 60±6초 동안 중정도 압력으로 긁었다. 긁은 후에, 샘플링 유체를 피펫에 의해 무균 샘플 튜브로 옮겼다. 샘플링 유체의 신선한 분취액을 사용하여 상기 절차를 1회 더 반복하였다. 샘플링 유체를 모았다. 각각의 샘플링 부위에 대해 상기 절차를 반복하였다. 부위의 두 세척을 위해 동일한 피펫, 실린더, 유리 막대 및 폴리스맨을 사용하지만, 각각의 부위에 대해 새로운 무균 장비를 사용하였다. 샘플을 모은 후, 종이 타월을 사용하여 부위를 닦아 건조시켰다. 상기 공정 동안 샘플링 유체가 샘플링되지 않은 인접한 부위로 흐르지 않도록 주의해야 한다. 모든 샘플링 후에, 마커 유기체를 사용할 때, 샘플링 부위는 70 내지 90% 이소프로판올 또는 동등물, 이어서 4% 클로르헥시딘 스크럽을 사용하여 오염제거해야 한다.

단리된 피부 또는 피부 동등물 샘플 수집

정량적 미생물 계수는 컵 스크럽 기술에 의해 얻었다. 상기 절차를 시험 및 대조군 샘플에 대해 사용한다. 샘플을 놓고, 샘플링 실린더의 배치 및 효과적인 사용을 가능하게 하기 위해 필요한 경우에 고정한다. 샘플링할 영역을 무균 샘플링 실린더로 그렸다. 샘플링 유체가 샘플링 부위로부터 누출하지 않도록 하기 위해 샘플링하는 동안 실린더를 샘플 표면에 대해 단단히 누른다. 생성물 중화제를 함유하거나 함유하지 않는 무균 샘플링 유체의 최소 1.5-mL 분취액을 실린더 내로 피펫팅하였다. 이어서, 전체 영역을 무균 연마 유리 막대 또는 폴리스맨을 사용하여 60±6초 동안 중정도 압력으로 긁었다. 긁은 후에, 샘플링 유체를 피펫에 의해 무균 샘플 튜브로 옮겼다. 샘플링 유체의 신선한 분취액을 사용하여 상기 절차를 1회 더 반복하였다. 샘플링 유체를 모았다. 각각의 샘플링 부위에 대해 상기 절차를 반복하였다. 부위의 두 세척을 위해 동일한 피펫, 실린더, 유리 막대 및 폴리스맨을 사용하지만, 각각의 부위에 대해 새로운 무균 장비를 사용하였다. 단리된 조직의 동일한 조간 상에 다수의 샘플 부위가 조재하는 경우에, 상기 공정 동안 샘플링 유체가 샘플링되지 않은 인접한 부위로 흐르지 않도록 주의해야 한다.

미생물 계수

각각의 샘플을 완전히 혼합하였다. 각각의 샘플의 10배 연속 희석액을 희석 유체 내에 제조하였다. 적합한 중화제와 함께 대두-카제인 소화 한천을 사용하여 이중 정량적 붓기 (pour) 또는 확산 (spread) 플레이트를 제조하였다. 플레이팅한 샘플을 적합한 성장 온도, 즉, 62℃에서 24 내지 72 h 동안, 또는 콜로니가 플레이트 상에 가시적으로 될 때까지 인큐베이팅하였다.

실시예 XI

포자 부착 분석 - 피부 단백질

본 실시예는 피부 단백질에 대한 포자 부착을 분석하는 하나의 실시양태를 제공한다. 예시를 위해, 실시예는 씨. 디피실레의 부착을 연구하기 위해 인볼루크린 피부 단백질의 생성을 설명한다.

플라스미드

본 분석을 위한 적합성 플라스미드는 다음의 것들을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다: pIsdA IsdA 과다발현 벡터, pMK4 이. 콜라이-에스. 아우레우스 셔틀 벡터, pSRC001 rIsdA 상보성 벡터, pNZ8148 엘. 락티스 (L. lactis) 발현 플라스미드, pLIsdA IsdA 발현 벡터, pL_NEAT IsdA_NEAT 발현 벡터, pL_C IsdA_C 발현 벡터, pQE30 과다발현 플라스미드 (퀴아젠 (Qiagen)), pHuman K, pQE30 인간 세포각질 10 발현, pCMC-SPORT6-INV 인볼루크린 cDNA 클론 4749952 (이미지 컨소시엄 (IMAGE consortium), 엠알씨 젠서비스 (MRC Geneservice)), pQE30-INV 6 His-태깅된 (tagged) 인볼루크린, 또는 pET11a-LOR 로리크린 cDNA 클론 ([Clarke et al., "IsdA of Staphylococcus aureus is a broad spectrum, iron-regulated adhesin" Mol. Microbiol. 51:1509-1519 (2004)]; [Clarke et al., "The Staphylococcus aureus surface protein IsdA mediates resistance to innate defenses of human skin" Cell Host Microbe 1:199-212 (2007)]; [Sullivan et al., "New shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli which allow rapid detection of inserted fragments" Gene 29:21-26 (1984)]; [Kuipers, O.P., P.G. G.A. de Ruyter, M. Kleerebezem, and W.M. de Vos. 1998. Controlled overproduction of proteins by lactic acid bacteria. J. Biotechnol. 64:15-21]; [Sullivan et al., "New shuttle vectors for Bacillus subtilis and Escherichia coli which allow rapid detection of inserted fragments" Gene 29:21-26 (1984)]; 및 [Walsh et al., "Clumping factor B, a fibrinogen binding MSCRAMM (microbial surface component recognizing adhesive matrix molecules) adhesin of Staphylococcus aureus also binds the tail region of type I cytokeratin 10" J. Biol. Chem. 279:50691-50699 (2004)]).

클로스트리듐 디피실레를 적절한 경우에 카나마이신 (50 ㎍/ml)을 사용한 선택을 이용하여 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 배지 내에서 성장시켰다. 씨. 디피실레 균주를 뇌 심장 주입 배지 (옥소이드 (Oxoid)) 또는 화학적으로 규정된 CL 배지에서 성장시켰다 (Horsburgh et al., "In Staphylococcus aureus, Fur is an interactive regulator with PerR, contributes to virulence, and is necessary for oxidative stress resistance through positive regulation of catalase and iron homeostasis" J. Bacteriol. 183:468-75 (2001)). 포함될 때 항생제는 다음 농도로 첨가하였다: 에리트로마이신, 5 ㎍/ml; 링코마이신, 25 g/ml; 및 테트라시클린, 2.5 ㎍/ml. 씨. 디피실레 배양액을 37℃에서 성장시킬 수 있다.

인볼루크린 유전자의 클로닝

인볼루크린에 대한 코딩 서열을 Pfu 중합효소, 및 BamHI 부위 (밑줄침)를 포함하는 서열 446의 전방향 프라이머 및 HindIII 부위 (밑줄침)를 포함하는 서열 447의 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 pCMV-SPORT6-INV로부터 증폭시켰다:

CGCGGATCCATGTCCCAGCAA CACACAC (서열 446)

CCCAAGCTTTATTTATGTTTGGG TGGCCAC (서열 447).

단편을 BamHI 및 HindIII으로 절단한 pQE30 내로 클로닝하여, pQE30-INV를 형성하였다.

재조합 단백질의 발현 및 정제.

헥사히스티딘-태깅된 재조합 IsdA (rIsdA), 세포각질 10 및 인볼루크린의 발현은 성장하는 세포에 100 μΜ 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 유도하였다. 정제는 Hi-Trap 시스템 (아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences))을 사용하는 니켈 킬레이트 크로마토그래피를 사용하여 달성하였다. 재조합 로리크린은 용해된 이. 콜라이 T4037로부터 친화도 태깅되거나 정제될 수 있다.

리간드 결합의 ELISA 분석.

효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)을 이용하여, 리간드에 결합하는 rIsdA의 능력을 분석하였다 (Clarke et al., "Analysis of Ebh, a 1.1-megadalton cell wall-associated fibronectin-binding protein of Staphylococcus aureus" Infect. Immun. 70:6680-6687 (2002)). 간단히 설명하면, 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중 적절한 리간드 또는 소 혈청 알부민 (BSA) (5 ㎍/ml) 100 ㎕을 96-웰 미세적정 플레이트 (넝크 (Nunc))의 웰에 4℃ 철야 첨가한다. 플레이트를 PBST (0.05% [vol/vol] 트윈 20을 함유하는 PBS)로 3회 세척하고, 잔여 단백질-결합 부위를 PBS 중의 5% (wt/vol) BSA로 2 h 동안 실온에서 차단한다. 플레이트를 다시 PBST 내에서 3회 세척하고, PBS-0.1% (wt/vol) BSA 내에 희석된 상이한 농도의 정제된 rIsdA (즉, 예를 들어, 0 내지 15 μΜ)를 첨가한다. 플레이트를 추가로 1 h 동안 인큐베이팅한 후 3회 세척하고, 항-IsdA (1:1,000으로 희석된)를 PBS-0.1% (wt/vol) BSA 내에서 첨가한 후, 1 h 인큐베이팅한다.

결합된 IsdA의 검출을 위해 사용되는 마우스 항체는 보고된 방법에 따라 생성시킬 수 있다 (Clarke et al., "IsdA of Staphylococcus aureus is a broad spectrum, iron-regulated adhesin" Mol. Microbiol. 51:1509-1519 (2004)). 플레이트를 추가로 3회 세척하고, PBS-0.1% (wt/vol) BSA 내에 1:30,000으로 희석된 알칼리성 포스파타제 접합된 항-마우스 항체를 첨가하고, 플레이트를 1 h 동안 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 결합된 항체는 시그마 패스트 (Fast) p-니트로페닐 포스페이트 시스템 (시그마)을 사용하여 검출하였다. 플레이트를 빅터 (Victor) 미세적정 플레이트 판독기 (월락 (Wallac))에서 405 nm에서 판독하였다.

결합 억제의 연구는 rIsdA를 PBS-0.1% (wt/vol) BSA 내에서 다양한 농도의 억제제 또는 BSA (0 내지 10 μΜ)와 함께 1 h 동안 실온에서 인큐베이팅함으로써 수행하였다. 이어서, 반응 혼합물을 리간드-코팅된 웰에 첨가하고, 결합된 단백질을 검출하였다.

원자력 현미경

원자력 현미경 (AFM) 팁 및 지지체를 IsdA 및 로리크린 분자로 다음과 같이 관능화시켰다. AFM 캔틸레버 (cantilever) (마이크로레버 (Microlever); 비코 메트롤로지 그룹 (Veeco Metrology Group, 미국 캘리포니아주 산타바바라)) 및 실리콘 웨이퍼 (실트로닉스 (Siltronix, 프랑스))를 5-nm 두께 Cr 층, 이어서 30-nm 두께 Au 층으로 전자 빔 열 증착을 이용하여 코팅하였다. 사용 전에, 금-코팅된 표면을 에탄올로 세정하고, 부드러운 질소 유동으로 건조시키고, 15 min 동안 UV/오존 처리 (제라이트 코. (Jelight Co., 미국 캘리포니아주 어빈))에 의해 세척하였다. 금 팁 및 금 지지체를 0.05 mM 니트릴로트리아세테이트-말단 (5%) (프로키미아 (Prochimia)) 및 트리(에틸렌 글리콜)[트리(EG)]-말단 (95%) 알칸티올을 함유하는 에탄올 용액 내에 철야로 담그고 에탄올로 세정하였다. 초음파 분해를 잠깐 동안 적용하여 흡착될 수 있는 알칸티올 응집체를 제거하였다. 이어서, SAM (자가-조립된 단일층)-코팅된 표면을 NiSO₄ (pH 7.2)의 40 mM 수용액에 1 h 동안 담그고 PBS로 세정하였다. 마지막으로, 샘플을 PBS 내에서 2 μΜ His-태깅된 IsdA와 함께 2 h 동안 인큐베이팅하고, PBS로 추가로 수회 세정하였다. 로리크린 및 BSA에 대해, 금 지지체를 36 h 동안 에탄올 올리고(EG) (OEG) 및 OEG 프로피온산으로 종결된 알칸티올의 20 μΜ 혼합물 (95:5, mol/mol)을 함유하는 용액에 담갔다. 에탄올로 세정한 후, 초음파 분해를 잠깐 동안 적용하여 흡착될 수 있는 알칸티올 응집체를 제거하였다. 지지체를 30 min 동안 20 g/리터 N-히드록시숙신이미드 (NHS) (알드리치) 및 50 g/리터 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC) (시그마)를 함유하는 MilliQ 물 (밀리포어) 내에 담그고, MilliQ 물로 세정하고, PBS 중의 10 ㎍/리터 로리크린 또는 BSA (시그마)와 함께 3 h 동안 인큐베이팅하고, 추가로 세정한 후, 즉시 사용하였다.

AFM 영상 및 힘-거리 곡선을 피코포스 멀티모드 (Picoforce Multimode) AFM (비코 메트롤로지 그룹, 미국 캘리포니아주 산타바바라)을 사용하여 PBS 내에서 실온에서 얻었다. 지지체를 작은 접착 테이프 조각을 사용하여 스틸 샘플 퍽 (puck) 상에 고정시켰다. 탑재된 샘플을 탈수분 (dewetting)을 피하기 위해 AFM 액체 셀 (cell) 내로 즉시 전달하였다. 450 pN의 최대 적용력을 이용하여 모든 힘 곡선을 기록하였다. 캔틸레버의 스프링 (spring) 상수를 열 잡음 (thermal noise) 방법 (피코포스; 비코 메트롤로지 그룹)을 이용하여 측정하였고, 제조자가 공지한 값 (0.01 N/m)보다 약간 더 큰 값 (0.011 N/m)을 얻었다. 생물분자의 유연성을 설명하기 위해, 로딩 속도 (피코뉴턴/초)를 팁 철수 속도 (나노미터/초)에 파열 (rupture) 피크의 기울기 (피코뉴턴/나노미터)를 곱하여 추정하였다.

고정된 리간드와 미생물 상호작용

고정된 리간드에 대한 중간-로그 (mid-log) 성장기 세포의 결합을 이전에 설명된 방법을 이용하여 측정할 수 있다 (Ni Eidhin et al., Clumping factor B (ClfB), a new surface-located fibrinogen binding adhesin of Staphylococcus aureus'" Mol. Microbiol. 30:245-257 (1998)). 또한, 건강한 공여자의 앞콧구멍으로부터 편평 세포를 수거할 수 있고, 철-비함유 배지 내에서 성장시킨 씨. 디피실레의 결합을 분석하였다 (O'Brien et al., Staphylococcus aureus clumping factor B (ClfB) promotes adherence to human type I cytokeratin 10: implications for nasal colonization" Cell. Microbiol. 4:759-770 (2002)). 균주 사이의 비교는 스튜던트 (Student) 시험을 사용하여 수행하였다.

실시예 XII

재조합 포자외막 단백질의 발현 및 정제

N-말단 폴리-히스티딘 태그를 갖는 재조합 포자외막 단백질을 함유하는 발현 구성체를 생성하고, 이. 콜라이 균주 내에 형질전환시켰다. 루리아 브로쓰 (100 ㎍/ml 암피실린 보충)의 1리터 배양액에 상기한 발현 구성체의 철야 배양액 10 ml을 접종함으로써 재조합 단백질을 생산시켰다. 37℃에서 2.5 h의 성장 후에, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 배양액을 추가로 3 h 동안 성장시켰다. 세균을 원심분리에 의해 수거하고, 상등액을 따라 내고, 세포 펠렛을 PBS 내에 재현탁시킨 후 -80℃에서 보관하였다. 나중에 현탁액을 주변-온도 수조 내에서 30 min 동안 해동시키고, 세포를 프렌치 프레스를 사용하여 용해시켰다. 불용성 세포 파편은 28,000 x g에서 20 min 동안 원심분리한 후 0.45-mm 막을 통해 여과함으로써 제거하였다. 이어서, 재조합 포자외막 단백질을 먼저 금속-킬레이팅 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 세균 용해액을 5-ml Ni₂-충전된 HiTrap 킬레이팅 컬럼 (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech))에 적용하고, 결합된 단백질을 4 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl (pH 7.9) 중의 200-ml 선 구배의 0-200 mM 이미다졸을 사용하여 5 ml/min의 유속에서 용출하였다. SDS-PAGE에 의해 결정할 때 재조합 포자외막 단백질에 상응하는 분획을 모으고 25 mM 트리스-HCl (pH 8.0)에 대해 투석한 후 이온-교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 투석된 단백질을 5 -ml HiTrap Q 컬럼 (아머샴 파마시아 바이오테크)에 적용하고, 결합된 단백질을 25 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 중의 200-ml 선 구배의 0-0.5 M NaCl을 사용하여 5 ml/min의 유속에서 용출시켰다. 정제된 포자외막 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE에 의해 확인하였고, 순도 90%인 것으로 추정되었다.

실시예 XIII

포자외막 단백질 부착 분석

인간 피부 단백질 및/또는 에피덤 분화된 인간 각질세포에 대한 포자외막 단백질의 결합을 본질적으로 상기 실시예 X 및 XI에 기재된 바와 같이 수행하되, FITC 접합된 포자를 포자외막 단백질로 교체하였다. 결합된 단백질의 검출은 플루오레세인 접합된 스트렙타비딘 (록랜드 이뮤노케미칼스 (Rockland Immunochemicals))을 사용하여 달성하였다. 웰 당 총 형광 (F_total)을 1-h 인큐베이션 후에 λ_ex = 495 nm 및 X_em = 528 nm로 플루오로스캔 II 형광 판독기 (랩시스템즈, 미국 매사추세츠주 베벌리)를 사용하여 측정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Gojo Industries, Inc. Macinga, David R. <120> Compositions And Methods For Screening And Using Compounds Antagonizing Spore-Surface Interactions <130> GOJO-16755 <140> US 12/784011 <141> 2010-03-26 <150> US 60/964976 <151> 2007-08-16 <150> US 61/164154 <151> 2009-03-27 <160> 447 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 1 Met Glu Asn Lys Lys Cys Tyr Ser Glu Asp Trp Tyr Glu Arg Gly Glu 1 5 10 15 Ser Thr Ala Lys Trp Phe Gln Asn Asp Arg Glu Glu Tyr Glu Arg Glu 20 25 30 Ala Tyr Asp Glu Asp Arg Glu Arg Arg Gly Ser Asn Cys Gly Cys Ser 35 40 45 Asp Ser Gly Glu Asn Arg Pro Arg Asn Cys Glu Arg Phe Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Ile Arg Glu Arg Glu Ala Arg Glu Ala Phe Cys Glu Ser Ser 65 70 75 80 Glu Lys Lys Lys Glu Ala Leu Ala Tyr Glu Cys Glu Ala Arg Lys Leu 85 90 95 Trp Glu Glu Ala Glu Lys Tyr Trp Asp Glu Tyr Ser Lys Tyr Asn Tyr 100 105 110 Lys Gly Ile Glu Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Arg Leu Phe Asp Glu Gly 115 120 125 Met Glu Cys Glu Ala Arg Arg Asn Gly Asn Asn Gly Gly Asn 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ggtcccagaa taattctatt tctttagcgt tttttgactc 360 aatatctatt ttattttcaa ggtcaactac ataagaacga tataaatttg cttcatgtat 420 tatatgttca agaagtagag ggtagtttga tgtaaatata gtacatgata gtacaccatc 480 taagactctt tctttaaaat taataagccc atcaagtaat cttattgcat cagagttaag 540 ttgagctaca tagttcacta aatcttgacc aacttgtggg tttacaccac tttgtagatt 600 taattctctt gtagtgatgt ttttgtttat ttctatccct gtaaactctt ctgttttttg 660 ttctgcaact gatgtgagag tagttacaag ttcttctgaa tataatatat caggtctaat 720 tataccatta ctagcactaa cagtgtatga taataaatct tcaaattgct ttttatagtg 780 gtcagcttcc atagcaagat tataattttt atttgtgaat cctgcttcta aaaaaagagc 840 atgctctttc ataattcttg aaaaaaataa atgtaattct agtgataaaa taacatattt 900 ttgattatct atcat 915 <210> 15 <211> 693 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 15 Met Arg Asn Ile Ile Leu Tyr Leu Asn Asp Asp Thr Phe Ile Ser Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Pro Asp Lys Asn Phe Ser Asn Leu Asp Tyr Cys Leu Ile Gly 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Asn Ser Phe Val Lys Glu Lys Leu Ile Thr Phe Phe 35 40 45 Lys Val Arg Ile 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gcgacaggag taacaggacc aacaggtcca 1620 acaggagcaa caggcaattc ctctcagcca gttgctaact tcctcgtaaa tgcaccatct 1680 ccacaaacac taaataatgg agatgctata acaggttggc aaacaataat aggaaatagt 1740 tcaagtataa cagtagatac aaatggtacg tttacagtac aagaaaatgg tgtgtattat 1800 atatcagttt cagtagcatt acaaccaggt tcatcaagta taaatcaata ttctttcgct 1860 atcctattcc caattttagg aggaaaagat ttggcagggc ttactactga gccaggaggc 1920 ggaggagtac tttctggata ttttgctggt tttttatttg gtgggactac ttttacaata 1980 aataattttt catctacaac agtagggata cgaaatgggc aatcagcagg aactgcggct 2040 actttgacga tatttagaat agctgatact gttatgactt aa 2082 <210> 17 <211> 661 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 17 Met Leu Leu Ile Met Ser Arg Asn Lys Tyr Phe Gly Pro Phe Asp Asp 1 5 10 15 Asn Asp Tyr Asn Asn Gly Tyr Asp Lys Tyr Asp Asp Cys Asn Asn Gly 20 25 30 Arg Asp Asp Tyr Asn Ser Cys Asp Cys His His Cys Cys Pro Pro Ser 35 40 45 Cys Val Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Pro 50 55 60 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Gly Val Gly Ala 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difficile <400> 20 ctattgtatt ctataaactg atacatatcc agctgcagaa gtacctgtcg tgcctgaacc 60 aaatgtaaaa cttaaagtaa cagctgctgc tctagcatca actaaaaagc ttaaacttac 120 acttacatct gatgaagtaa gtgtatttac tgcttttgca ataaagttat tttgagttac 180 tccattaaag ttagtagtaa ttgacataaa tcctgcaagt gaaagtgtgg cacgtatacc 240 gaaagataca ttgtatatcc ctccaactgc aagatttata gtactacttg ttggaaaagt 300 tatattagtt ccatttataa atgatgaatt aaatgtcact aatgtattat tcactaaact 360 tgaagaggac actgtaaatt gtgcattgtt tgctgctaac actcctgttg ctcctgtcgc 420 tccggttgga cctgttgctc catttgctcc tgttgctcct gtcgcccctg ttgctcctgt 480 cgctccattt gctccggttg ggcctgttgg tcctatcgct cctgctactc catttgctcc 540 cgttgctcct actgctcctg ttgggcctgt tgctccattt gcccctgttg ctcctgtcgc 600 tcctgttgct cctgctactc cattttctcc cgttggacct gttggaccta ttggacctgc 660 tactccattc gctcccgttg ctcctactgc tcccgttggg cctgttgctc catttgcccc 720 tgttgctcct gtcgctcctg ttggacctac tgctccatct gctcccgttg ggcctgttgc 780 tcctactgct cccgttggac ctattgcccc agctactcct gttgctcctg tcgctcctgt 840 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difficile <400> 22 atgtggatat atcagaaaac tatacaacac ccagttaata taaaaacttg tgaccctaga 60 atggctaaat ttcttataac tcaatttggt gggccaaatg gggaacttgc tgcatcttta 120 agatatttaa gccaaagata tacaatgcct actggtaata tgcgtgcact tttaacagat 180 attggtacag aagaactagc tcacgttgag cttatatgta ctatggttta tcagttaact 240 tctgatgcaa gcccagaaga gttaaaagct gcaggtcttg gttcaaacta tgctcaaaat 300 ggatatggaa tttatccaac agattcaaat ggtgttccat ttgatgtaag acctatagca 360 gttatgtcaa atcccgtaac cgatttacat gaggatatgg cagctgaaca aaaagcactt 420 gcaacttatt atcaacttat aaacctaaca gatgacgttg atgttataga tgtattaaaa 480 ttcttgggtc aaagagaaat aattcactat caaagatttg gtgaagcttt aatggatgct 540 tacgagttag aagaatctca aaaaatgttc taa 573 <210> 23 <211> 190 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 23 Met Trp Ile Tyr Gln Lys Thr Leu Glu His Pro Val Asn Ile Arg Gln 1 5 10 15 Ala Asp Pro Arg Met Ala Lys Tyr Ile Met Thr Gln Leu Gly Gly Pro 20 25 30 Asn Gly Glu Leu Ala Ala Ala Thr Arg Tyr Leu Gln Gln Arg Tyr Thr 35 40 45 Met Pro Thr Gly Lys Ser 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ttactaattc tttagctttt tcatctgtac aatcacaagc 720 tggtttttct aataattcaa caaccttagc acttgctact ttagaagctt ctccatcatt 780 tctagaatct aaccactctg taaatactgc tttagcatct tcacagatat ccatagaaac 840 taactctgtc atagcatcta ctattttatt tcttatttgc ttaacagctg tgtacatacc 900 aaatccatat tcagcattat cctcgaataa agagtttgcc caagatggac ctttaccttc 960 atggttacaa gtataaggaa ttgatggtgc agaagctccc catatagaag aacatccagt 1020 agcattagct atcatcattc tatctccata taattgtgta actactttaa tgtacgcagt 1080 ttctccacat ccagcacatg ctcctgaaaa ctccattaat ggttgtctaa attgacttcc 1140 tttaacagta tttgcaggca taacatcaac ttttggagct acttcatcag gatttactgc 1200 aaatgcccaa ttatctaact ctgtatcaag ttgagtatct attggcttca taactaaagc 1260 tttttcttta gctggacata tgtcagcaca gtttccacat cctgtacagt caagtggact 1320 aacttgaatt ctatatttta atccttctaa tcctttacct aatgcttttt tagcttcaaa 1380 tccttctgga gcattagcta attcttcttc agtaactaat actggtctta tacatgcatg 1440 aggacatata aaagaacatt ggttacattg aatacagtta tctattatcc attcaggaac 1500 atcaacagct ataccacgtt tttcataagc tgcagtacca caagggaatg ttccatcttc 1560 tataccattg aatgtactta ctggtaagtt gtttccttct tgtgcagtca ttggtcttag 1620 tatatttttt ataaattctg gttctttaac ttctccttta tctgcatcaa cagcattttc 1680 ccaagaagct ggaacttcaa ctttaactaa agcatttatt cctgcatcaa cagcagcata 1740 gttcatatta actatttttt cacctttttt accataagct ttaactatag aatcttttaa 1800 gtatttaaca gcatcttctt ctggtattat ttcagctaat ttaaagaatg cagattgcat 1860 tatcatgttt attctgtttc caagacctat ttcttgtcct agtttaacag cgttaactgt 1920 atagaatttt atatcatttt tagctatata ttgtttcata tgagctggta aatgttcttc 1980 aagtcctgct tggtcccata tagtgttaag tacaaatgta ccaccttttt taagaccttt 2040 taataaatca tattgataaa catatgattg tttatgacag gcaatataat cagcttcatc 2100 tattaaataa gtagctctta ttggagtatc accaaatctt aagtgagaca tagttatacc 2160 accagatttt ttagagtcat aatcaaagta agcttgagca tatttttcag tatggtcacc 2220 gattattttg atagcttgtt tattagctcc aacagtaccg tcagaaccta atccccagaa 2280 cttacatctt atagttcctt tagaagctat ttttattggc tcagatggag ttaaagaagt 2340 attagttaca tcatcaacta tacctactgt 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atggaatact cctggtaata actctcctgc 3240 aactttatac atgttaggta tcattaataa taaaccttga gatgctgtaa aagtagaagt 3300 taaagctcct ccttgtaaag aaccgtggaa tgttcctgat gcacctgctt ctgactgcat 3360 ttcaacaaca ttaactgttt gtccaaatat attttttctt ccttgtgatg cccactcatc 3420 aactacttca gccatagttg aagatggtgt gattggatat atagctgcta catctgtaaa 3480 cgcataggca acatgagctg cagctgtatt tccatcaagt gttttcataa acttagccat 3540 <210> 27 <211> 498 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 27 Met Ala Leu Met Thr Gly Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Leu Arg Lys Leu 1 5 10 15 Asn Thr Lys Val Tyr Met Phe Gly Glu Glu Val Lys Asn Trp Val Asp 20 25 30 His Pro Met Ile Arg Pro Ser Ile Asn Cys Val Ala Ala Thr Tyr Asp 35 40 45 Leu Ala His Asp Pro Glu Tyr Ala Asp Leu Met Thr Val Thr Ser Asn 50 55 60 Ile Thr Gly Glu Lys Ile Asn Arg Phe Gly His Leu His Gln Ser Val 65 70 75 80 Asp Asp Leu Ile Lys Lys Val Lys Met Gln Arg Leu Cys Gly Gln Lys 85 90 95 Thr Ala Ser Cys Phe Gln Arg Cys Val Gly Met Asp Ala Phe Asn Ala 100 105 110 Val Tyr Ser Thr Thr Phe 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tattctttga gcttgtggtg aacctgcccc 120 atgcattgac tcagttctat aaccaacagc agatgaacca aggcatatat tttctaagaa 180 tcttaatatt ctcattcttt cttctgttga agccactgaa gaagctttaa aatacttgtt 240 acatacttcg ccaatagtca ttccacttgt tccaacttta aggtctgatt taaagtcttt 300 ttctgaaggc atagtaacca taagccctcc agctatatct tctgcaagtc ttactatttc 360 ataaggaaat ctagttacat tttgtttaca cacatttgca agaagtaaat ctatttgata 420 gtttccagct tctgttttgt gaccttctga tgaacatgct ataccacagc aatataagct 480 ttcattaagg tgagtcattt ctattagttt atcttttata tgtgaagctt tgtttgctcc 540 attataatca gctgctaaag ctgctgctcc tattattaca tcacctactc ctactttaca 600 tccaccataa ctttgtctat ggtatcctgc aaatctctct actaacatac cagagaaatc 660 ccattctcca cataagaaaa ttctatcatt tggaacaaat acattatcaa atactactaa 720 agcttcttga cctccaaact ccttatttcc taaatcaaca tctgcacctt cttctaattt 780 tctagtgtca caagattgtc ttccataaat cataaacact ccttcagcat ctgaaggaac 840 tgcaaatgat acagcgtagt ctttatctgc ttcagtcata cttatagtag gcattataag 900 gtgctcatgt gaatttattg aaccagtttg atgtgccttt gctcctctta caattatccc 960 atcttctctt ctttctacta tatgaaggaa catatctggg tcaggttgag cactaggtga 1020 tagacttcta tctcccttag ggtcagtcat agctccatca actactaaat cgttttcttg 1080 tatataagtt aagtatttta caaaattatc atgataatta gttccatggg ctttatcaca 1140 ctcaaatgtt gttgaataca ctgcattaaa cgcatccata ccaacacatc tttggaaaca 1200 agaagctgtt ttttgaccac atagtctttg catttttact ttttttatca aatcatcaac 1260 actttgatga agatgaccaa atctatttat tttttcacct gtgatatttg aagtaactgt 1320 cattaaatct gcatattctg ggtcatgagc taagtcataa gttgctgcta cacaatttat 1380 agatggtcta atcataggat ggtcaaccca attcttaacc tcttcaccaa acatataaac 1440 cttagtattt aattttctca aactttcaat atattgagct cctgtcatta atgccat 1497 <210> 29 <211> 378 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 29 Met Asp Leu Asn Ser Lys Lys Tyr Gln Met Leu Lys Glu Leu Tyr Val 1 5 10 15 Ser Phe Ala Glu Asn Glu Val Lys Pro Leu Ala Thr Glu Leu Asp Glu 20 25 30 Glu Glu Arg Phe Pro Tyr Glu Thr Val Glu Lys Met Ala Lys Ala Gly 35 40 45 Met Met Gly Ile Pro Tyr Pro Lys Glu Tyr Gly Gly Glu 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atatttttta taccttctat 60 tattttttct tctggcatat ttgaatagtt aagtctgaaa gtattttctc taccaccatt 120 agggaagaat cctcctccag caacataagc aacattctta tctaaacatt ttggcattaa 180 ttctttagca tttaaattac ttggaagctc tacccatgta aataatccac cttctggatg 240 agtaaatact aatccttctg ggaactcttc ttccatagtc ttaagcatta catctctacg 300 tttaacataa actgctttta ttttgtcaac atgtgcatct aggtcataca tatccataaa 360 tttgcttact tccatttgag atatagttga tgcttgtaag tctgcacctt gttttgcaaa 420 gttaaactta gataaaattt ctggagaagc acaagtccat cctaatctgt atcctgggca 480 gaatatttta gagaaagttc ctaagaatat tactaatcct tttgtatcca ttgattttaa 540 agatggtaaa gtctctcctt caaatcttaa atctccatat ggattatctt ctattactgg 600 tatttcaaat ttatttacta tttccatgaa ttttttacgt ctttcaagtg gccaagttct 660 tcctgttgga ttttggaagt caggtattac gtaaatcatt tttattctat cagttgtttc 720 tagtatcttt tctaattctt ccattatcat tccatcagaa tctgttggaa catctatgaa 780 tttaggttga taagatttaa atgcgtttat agctcctatg taagatggac tttcacataa 840 aattacatca ccctcatcaa tgaatacttt tcctgcaaaa tctagacctt gttgagaacc 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gtatagatac actatgtcct tttccttcta catttaaatt 300 tgcttttgca atagctacac cttcttcaaa acttttatac ttgtatgcag atataactgg 360 acacattttt tcttttgcaa taatatcctc ttctcctggt ccatcagctt ctattactat 420 tatttttgta tcttctggta tctcaacacc tgcaattttt gcaattgtat gaactgattg 480 acctactgca tctttattca tagatttatt tacaaacata gcatttctga aagcttcttt 540 ttgtacttta tctctaacta taaaaccttt gttattttta aattcatcca ttattttatc 600 aaacatttct tctgctacta ttactgactg ttcacctgaa caaatgatac cattatcaaa 660 aattcttcct gctatgattt taggtactgc ttctttaatg tctacatctc tatctatgat 720 acattgaaca tttcctgccc ctacaccaag tgctggtttt ccacttgagt acgcagcttt 780 taccattccc attcctccag tggcaattac tacatctgct gatgaaatta aatttcttgt 840 attttctctt gattgttggt caagtatttg tattaaattt tctggagctc ctattttttc 900 taattcttca ttaatcatct ctacagtttt tgtactacat ccaattgctt tatgatgagg 960 tgtgataata attgcatttc ttcccttaag tgcaaacatt gcattgctca taggtgtaac 1020 gattggattt gtacaaggag ttattgccgc tactactcca actggtttag ctacctttgt 1080 tattccagtt tctctatcta tatcaattat accaactgat tttttatctt ttaaattgtt 1140 atatataact tttgctttgc ttttattttt agctacctta tcttcatata ctcccattcc 1200 agtctcttct acagcaagtt tagctaaata ttcagcatta taatacacta cttttccaac 1260 tatttttact attttatcta cttgttcttg agtataacat tcaaactctc tttgagcttt 1320 tcttgctctc tcaatataac cattaatgta ttccttactt aaatcttcaa agttttccac 1380 tgctttttcc at 1392 <210> 35 <211> 181 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 35 Met Lys Lys Phe Val Cys Thr Val Cys Gly Tyr Ile His Glu Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ala Gln Cys Pro Val Cys Lys Val Gly Ala Asp Lys Phe 20 25 30 Glu Glu Met Lys Gly Glu Met Val Trp Ala Asp Glu His Arg Ile Gly 35 40 45 Val Ala Gln Gly Val Asp Ala Glu Ile Ile Glu Gly Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Phe Thr Gly Glu Cys Thr Glu Val Gly Met Tyr Leu Ala Met Ser Arg 65 70 75 80 Gln Ala Asp Arg Glu Gly Tyr Pro Glu Val Ala Glu Ala Tyr Lys Arg 85 90 95 Ile Ala Phe Glu Glu Ala Glu His Ala Ala Lys Phe Ala Glu Leu Leu 100 105 110 Gly Glu Val Val Val Ala Asp Thr Lys Glu Asn Leu Arg Val Arg Val 115 120 125 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Clostridium difficile <400> 37 Met Gly Asn Val Leu Val Val Ile Glu Gln Arg Glu Asn Val Ile Gln 1 5 10 15 Thr Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Ala Thr Glu Ile Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Asp Thr Lys Val Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ser Lys Val Glu Gly 35 40 45 Leu Ile Asp Thr Leu Ala His Tyr Gly Ala Asp Glu Val Ile Val Val 50 55 60 Asp Asp Glu Ala Leu Ala Val Tyr Thr Thr Glu Pro Tyr Thr Lys Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Ala Ile Lys Ala Ala Asp Pro Ile Val Val Leu Phe Gly 85 90 95 Ala Thr Ser Ile Gly Arg Asp Leu Ala Pro Arg Val Ser Ala Arg Ile 100 105 110 His Thr Gly Leu Thr Ala Asp Cys Thr Gly Leu Ala Val Ala Glu Asp 115 120 125 Thr Lys Leu Leu Leu Met Thr Arg Pro Ala Phe Gly Gly Asn Ile Met 130 135 140 Ala Thr Ile Val Cys Lys Asp Phe Arg Pro Gln Met Ser Thr Val Arg 145 150 155 160 Pro Gly Val Met Lys Lys Asn Glu Pro Asp Glu Thr Lys Glu Ala Val 165 170 175 Ile Asn Arg Phe Lys Val Glu Phe Asn Asp Ala Asp Lys Leu Val Gln 180 185 190 Val Val Gln Val Ile Lys Glu Ala Lys Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp 195 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agctgaccct atagttgtat tatttggtgc aacttcaata 300 ggtagagatt tagctcctag agtttctgct agaatacata caggtcttac tgctgactgt 360 acaggtcttg cagtagctga agatacaaaa ttattattaa tgacaagacc tgcatttggt 420 ggaaatataa tggcaacaat agtttgtaaa gatttcagac ctcaaatgtc tacagttaga 480 ccaggggtta tgaagaaaaa tgaacctgat gaaactaaag aagctgtaat taaccgtttc 540 aaggtagaat ttaatgatgc tgataaatta gttcaagttg tacaagtaat aaaagaagct 600 aaaaaacaag ttaaaataga agatgctaag atattagttt ctgctggacg tggaatgggt 660 ggaaaagaaa acttagacat actttatgaa ttagctgaaa ttataggtgg agaagtttct 720 ggttctcgtg ccactataga tgcaggttgg ttagataaag caagacaagt tggtcaaact 780 ggtaaaactg taagaccaga cctttatata gcatgtggta tatctggagc aatacaacat 840 atagctggta tggaagatgc tgagtttata gttgctataa ataaaaatcc agaagctcca 900 atatttaaat atgctgatgt tggtatagtt ggagatgttc ataaagtgct tccagaactt 960 atcagtcagt taagtgttgc aaaagaaaaa ggtgaagttt tagctaacta a 1011 <210> 39 <211> 359 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 39 Met Ala Lys Ile Leu Met Lys Gly Asn Glu Ala Phe Gly 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ggagttgctt taaagcaaga aggtataaca tatgcagtag gagcagaagt tccttgtgtt 300 gtacttaatg taatgagagg tggtccagga cttggaagta tacaaccttc acaagctgac 360 tactttatgt ctacaagagg tggaggaaat ggagactaca gaactccagt attcgcacca 420 gctacagttc aagaagctgt tgatatgata atggaagctt ttgacgttgc agattattac 480 agatcaccag ttatggtagt tgcagatggt atgataggtc aaatgatgga gccagttgaa 540 tttagagctc ctgagaagaa aagagaattg cctcctaaag attgggcaac tgttggaact 600 aaaggaaaaa gaaaacctaa tgtaataaac tctctatact tagagccaga agtactagaa 660 gaccattgtt ggcatttaca agaaaaattt gatgcaatgg aaaagaatga agtacaatac 720 gaaatgtaca aaacagaaga tgctgaattt gtatttgcag cttatggaac tacttcaaga 780 gtagtaaaaa gcgcaattga tatattaaga gaagaaggaa taaaagcagg tcttataaga 840 cctaaagtat tatggccatt cccattcgaa gcattcaacc aaattcctaa tgctagaaac 900 atattgactg ttgaaatgag tatgggacaa atggtggaag atgttaaaat ggcagtagaa 960 ggtaaattac cagtttactt ccatggaaga ccaggaggaa tgactccaac accagcagaa 1020 atagttgaaa aagctaaaaa aattattgcc ggagaattgg ttgcaggagg tgctagataa 1080 <210> 41 <211> 388 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 41 Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 35 40 45 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 50 55 60 Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr 85 90 95 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 100 105 110 Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 115 120 125 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 130 135 140 Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 145 150 155 160 Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 165 170 175 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp 180 185 190 Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 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aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 240 ccgactgggc caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact 300 gggccaactg gaccaactgg gccgactggg ccaactggac caactgggcc gactgggcca 360 actggaccaa ctgggccaac tggaccaact ggaccaactg ggccaactgg accaactgga 420 ccaactgggc caactggaga cactggtact actggaccaa ctgggccaac tggaccaact 480 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 540 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 600 ccaactggac caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact 660 gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggac caactgggcc aactggtgct 720 accggactga ctggaccgac tggaccgact gggccatccg gactaggact tccagcagga 780 ctatatgcat ttaactccgg tgggatttct ttagatttag gaattaatga tccagtacca 840 tttaatactg ttggatctca gtttggtaca gcaatttctc aattagatgc tgatactttc 900 gtaattagtg aaactggatt ctataaaatt actgttatcg ctaatactgc aacagcaagt 960 gtattaggag gtcttacaat ccaagtgaat ggagtacctg taccaggtac tggatcaagt 1020 ttgatttcac tcggagcacc tatcgttatt caagcaatta cgcaaattac gacaactcca 1080 tcattagttg aagtaattgt tacagggctt ggactatcac tagctcttgg cacgagtgca 1140 tccattatta ttgaaaaagt tgcttaa 1167 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 43 Gly Asp Thr Gly Asp Thr Gly Asp Thr Gly Asp Thr Gly Asp Thr Gly 1 5 10 15 Asp Thr Gly Thr Thr 20 <210> 44 <211> 400 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 44 Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 35 40 45 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 50 55 60 Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 65 70 75 80 Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 85 90 95 Thr Gly Pro 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ttactgaacc gattttagtg ttaggtccct cgccgccgcg tgatgtaaat 660 gtagctgctg aaaatgatgt agcgctaact gtttttcaaa aagaatgggt ggaagaagca 720 attaaacttt gggatggttc atctgtaatg aaattccata ttaactttga tagtggtatg 780 gggagaattg gaatacgtga aagaaaagag ctaaaagaat ttttaaagag tttagagggt 840 gcaccgtttt tagagttaga aggagtatac acgcattttg caacggcaga tgaggttgag 900 acttcgtatt ttgataagca atataacacg ttcttggagc agttaagttg gttgaaagaa 960 ttcggagtgg atcctaagtt tgttcataca gctaatagtg ctgcgacgtt acgttttcaa 1020 gggattacat ttaatgcagt gcgaattggg attgcaatgt atggattatc tccttctgta 1080 gaaatacgtc cttttttacc atttgaatta gaaccggcgc tatcacttca tacgaaagtt 1140 gctcatatta aacaggtaat taaaggtgat ggaattagtt ataacgtcac ctatcgaacg 1200 aaagctgaag aatggattgc gactgtagcg attggctatg cagatgggtg gcttagaagg 1260 ttacaaggat ttgaagtgct tataaatggt aaaagggtac cgattgtagg gcgagtaaca 1320 atggatcagt tcatgattca tcttccttgt gaagtgccac ttggtacgaa agttacgctt 1380 attggaaggc aaggagatga gtatattagc gctacagagg ttgcggaata ctcagggact 1440 attaattatg aaattattgc aacgatcagt ttccgtgtgc caagaatatt tatacggaat 1500 ggtaaggttg tagagataat taattacttg aacaatatat agaaggtagt atgattgctt 1560 cttgtcattg gagtgactgt tcattgctgg ataataagct ctttttgatg agaagctttt 1620 tacttataat cattttttat ataagttgca cgtaagtttt gaagaggagt tctattgttt 1680 ttagttagtt atgagataaa aaatttaaga agatgaatgt tttgtttgtg aattggaaaa 1740 cataagcaag gaataaggaa gtctttgcaa caggctccat acaatggtat tattacaata 1800 ggtgtcatat atatatttgg gtgtgtagtt gacggtggag gtgtattttt gtgtccgaat 1860 caagtgtaac tactgaaatc gtggttcggt tgccaaagca aatggtaacg gaattggacg 1920 gaattggaaa acaagagaat aagaatcgcc atgaactaat ttgccaggca acacaattgt 1980 tattgcgtca acataagacg aagaaacgct accaacatga atcaatgcga cgtgggtaca 2040 ttgaaatggg aaaaattaat cttggtattg catctgaagc tttcttagca gagtatgaag 2100 cagctcatac agtagaacgc ttagttagc 2129 <210> 49 <211> 209 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 49 Met Ser Glu Lys Tyr Ile Ile Leu His Gly Thr Ala Leu Glu Pro Asn 1 5 10 15 Leu Ile Gly Pro Thr Leu Pro Pro Ile Pro Pro Phe Thr Phe Pro Asn 20 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tacaaggcgc acctctttta ttaacaccag catttgccgc aatagcgatt ggttctacag 1200 catcaggtat catagctgaa gctattccag tagctgctgg agataaaata ctactgtatg 1260 tttcattaac agcagcaagt ccaatagctg cagttgctgg atttgtaagt gcaggtatta 1320 atatcgttta atttgttaca atgtttagta ggaaattaaa caggggtttg tatatagtcc 1380 ctcctaaata aatttaggaa ggactatatt t 1411 <210> 58 <211> 430 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 58 Met Lys His Asn Asp Cys Phe Asp His Asn Asn Cys Asn Pro Ile Val 1 5 10 15 Phe Ser Ala Asp Cys Cys Lys Asn Pro Gln Ser Val Pro Ile Thr Arg 20 25 30 Glu Gln Leu Ser Gln Leu Ile Thr Leu Leu Asn Ser Leu Val Ser Ala 35 40 45 Ile Ser Ala Phe Phe Ala Asn Pro Ser Asn Ala Asn Arg Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Leu Phe Asn Gln Phe Leu Ile Phe Leu Asn Ser Leu Leu Pro 65 70 75 80 Ser Pro Glu Val Asn Phe Leu Lys Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ile Val 85 90 95 Leu Leu Gln Ser Pro Ala Pro Asn Leu Gly Gln Leu Ser Thr Leu Leu 100 105 110 Gln Gln Phe Tyr Ser Ala Leu Ala Gln Phe Phe Phe Ala Leu Asp Leu 115 120 125 Ile Pro Ile Ser Cys 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tttattacaa caattctaca gtgctcttgc accattcttc ttctctttaa 480 ttattgaccc tgcaagttta caacttttat taaacttatt aactcaatta attggtgcta 540 ctccaggagg cggagcaaca ggtccaacag gtccaacagg tccaggaggc ggagcaacag 600 gtccaacagg tccaacaggt ccaggaggcg gagcgacagg tccaacaggc ccaacaggag 660 cgacaggtcc agcaggtact ggtggagcaa caggtttaac aggagcaaca ggtttaacag 720 gagcaacagg cttaacagga gcgacaggcc caacgggagc aacaggttta acaggagcaa 780 caggtttaac aggagcaaca ggcttaacag gagcgacagg tccaacagga gcaacaggtc 840 caacaggagc aacaggttta acaggagcaa ctggtgcaac tggtggcgga gctattattc 900 catttgcttc aggtacaaca ccatctgcgt tagttaacgc gttaatagct aatacaggaa 960 ctcttcttgg atttggattt agtcagcctg gtgtagcttt aactggtgga acaagtatca 1020 cattagcatt aggtgtaggt gattatgcat ttgtagcacc acgcgcaggg gttattacgt 1080 cattagctgg tttctttagt gcaacagctg cattagctcc attatcacct gttcaagtgc 1140 aaatacaaat attaactgca cctgcagcaa gcaatacgtt tacagtacaa ggcgcacctc 1200 ttttattaac accagcattt gccgcaatag cgattggttc tacagcatca ggaatcatac 1260 ctgaagctat tccagtagca gctggggata aaatactgtt atatgtttca ttaacagcag 1320 caagtccaat agctgcagtt gctggatttg taagtgcagg tattaatatc gtttaatttg 1380 ttacaatgtt ta 1392 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 60 Met Ser Lys Arg Arg Met Lys Tyr His Ser Asn Asn Glu Ile Ser Tyr 1 5 10 15 Tyr Asn Phe Leu His Ser Met 20 <210> 61 <211> 217 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 61 gatcatttaa gtattttatg aatgcgtgaa aatgggtatt cgcggaaaaa gcgacaatta 60 ggctattgaa ttagttcaac aaataaatgt gacacgtata tatgcagtat gtttatcatc 120 tatgtataag tgactaggag gaatttgaat gagcaagagg agaatgaaat atcattcaaa 180 taatgaaata tcgtattata actttttgca ctcaatg 217 <210> 62 <211> 155 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 62 Met Ser Cys Asn Cys Asn Glu Asp His Gln His Glu Cys Asp Phe Asn 1 5 10 15 Cys Val Ser Asn Val Val Arg Phe Ile His Glu Leu Gln Glu Cys Ala 20 25 30 Thr Thr Thr Cys Gly Ser Gly Cys Glu Val Pro Phe Leu Gly Ala His 35 40 45 Asn Asn Ala Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr Lys 50 55 60 Thr Gly Glu Pro Phe Glu 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atcttcaagc cttactagtt gccgatctcc 480 cattttccgc gtagaaagta tagatgatga cgactgtgct gtattgcgtg tattaactgt 540 agttttaggt gatggtaccg ctgtaccacc tggtgacgac ccaatctgta cgtttttagc 600 tgtaccaaat gcaagactaa tatcaacctc cacttgcatt actgttgatt taagttgctt 660 ctgcgctatt caatgcttac gtgatgtttc tatttaa 697 <210> 64 <211> 154 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 64 Met Ser Cys Asn Glu Asn Lys His His Gly Ser Ser His Cys Val Val 1 5 10 15 Asp Val Val Lys Phe Ile Asn Glu Leu Gln Asp Cys Ser Thr Thr Thr 20 25 30 Cys Gly Ser Gly Cys Glu Ile Pro Phe Leu Gly Ala His Asn Thr Ala 35 40 45 Ser Val Ala Asn Thr Arg Pro Phe Ile Leu Tyr Thr Lys Thr Gly Glu 50 55 60 Pro Phe Glu Ala Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu Thr Ser Cys Arg Ser 65 70 75 80 Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Val Asp Asp Asp Ser Cys Ala Val Leu 85 90 95 Arg Val Leu Thr Val Val Leu Gly Asp Ser Ser Pro Val Pro Pro Gly 100 105 110 Asp Asp Pro Ile Cys Thr Phe Leu Ala Val Pro Asn Ala Arg Leu Ile 115 120 125 Ser Thr Thr Thr Cys Ile Thr Val Asp Leu Ser Cys Phe Cys Ala Ile 130 135 140 Gln Cys Leu Arg Asp Val Ser Ile Val Lys 145 150 <210> 65 <211> 822 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 65 aaatagtatg agagatatta ggttgtctat agatgatatc caatcgatta gtatggccgg 60 tttttaaata tgtaaaggtg gtagaaagct tctaccaccc caatagtttt ttagtttact 120 ttacgataga aacgtcgcgt aagcattgaa tcgcacagaa acagcttaaa tcaacagtaa 180 tgcaagtagt tgtagatatt aatcttgcat ttggtacagc taaaaacgta caaattggat 240 cgtcaccagg tggtactgga gaactgtcac ctaatactac agttaataca cgtagcacag 300 cacagctatc atcatctaca ctttccacac ggaaaattgg agatcggcag ctagtaaggc 360 ttgctgatgg tgcgaatgct tcaaaaggtt ctccagtttt tgtgtataaa ataaaagggc 420 gtgtatttgc tactgatgca gtattgtgtg cacctaaaaa tgggatttca caaccagatc 480 cacatgttgt tgtagaacaa tcttgtaatt cattgatgaa ttttacaacg tcaactacac 540 aatgagaaga gccatggtgt ttattttcgt tacaactcat taatgtcact ccttatcttc 600 ttgtttgtat ttacattaat aagatattgg agtcgaggag atttggtcac aatctcaaga 660 cctttttttt taaataggcg aaagaggata agggaaggtg aaattatgct gtttacaagc 720 tggcttttat tttttatttt cgcgttagca gcttttaggc tcactcgttt aattgtatat 780 gataaaataa cagccttttt gcgaagacca tttattgatg aa 822 <210> 66 <211> 400 <212> PRT <213> Clostridium perfringes <400> 66 Met Ile Arg Lys Ile Tyr Asn Pro Asn Arg Tyr Tyr Asp Asp Tyr Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Asn Cys Tyr Asp Arg Tyr Asn Cys Tyr Asp Asp Glu Tyr Cys 20 25 30 Gln Asp Asp Tyr Tyr Cys Lys Glu Asp Cys Tyr Cys Lys Asp Asp Cys 35 40 45 Tyr Leu Glu Ile Asn Cys Asn Cys Cys Asp Cys Cys Lys Pro Gly Pro 50 55 60 Arg Gly Pro Arg Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Pro Gln Gly Pro Arg 65 70 75 80 Gly Pro Met Gly Cys Gln Gly Glu Arg Gly Pro Ile Gly Pro Met Gly 85 90 95 Pro Met Gly Pro Ile Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Asp Gln Gly Leu 100 105 110 Thr Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Glu Gln Gly Pro Gln 115 120 125 Gly Asp Gln Gly Pro Val Gly Pro Ile Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly 130 135 140 Glu Gln Gly Leu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Ser Gln Gly Pro 145 150 155 160 Glu Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ala Thr Gly Pro Gln Gly Pro Glu 165 170 175 Gly Pro 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Arg Ala Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 111 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 111 Cys Lys Arg Arg Val Asp Tyr Val Glu Phe 1 5 10 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 112 Thr Phe Asn Thr Leu Ser Ala Pro Ile Cys 1 5 10 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 113 Leu Pro Ala Asp Gly Arg Ala Val Thr Leu 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 114 Arg Gln Glu Tyr Gln Thr Asn Leu Thr Val 1 5 10 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 115 Asp Cys Ile Gly Lys Ser Ile Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 116 Glu Cys Asn Glu Cys Cys Glu Pro Phe Tyr 1 5 10 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 117 Glu Leu Ile Ile Pro Asn Asp Ile Asp Leu 1 5 10 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 118 Val Leu Cys Leu Gln Glu Thr Val Ser Thr 1 5 10 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 119 Leu Ile Ser Glu Gln Ile Val Val Leu Ala 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 120 Ser Pro Asn Pro Ile Gln Pro Arg Leu Val 1 5 10 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 121 Asp Thr Phe Ser Lys Val Cys Asp Phe Ser 1 5 10 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 122 Gln Cys Gly Pro Asn His Gly Ser Gly Lys 1 5 10 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 123 Pro Ser Cys His Arg 1 5 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 124 Met Tyr Asp Asp Tyr Lys Tyr Asn Lys Cys 1 5 10 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 125 Asn Lys Cys Tyr Asn Asp Tyr Glu Glu Met 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 126 Thr His Val His Glu Tyr Ser Glu Ser Val 1 5 10 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 127 Lys Leu Ala Glu Glu Cys Glu Asp Arg His 1 5 10 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 128 Asn His Arg Ala Ala Gly Val Thr Gly Glu 1 5 10 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 129 Ala Ile Pro Ile Asn Gly Gly Thr Asn His 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 130 Val His Lys Ile Asn Asp Asn Val Asp Phe 1 5 10 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 131 Leu Asp His Phe His Lys Ile Cys Val Thr 1 5 10 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 132 Thr Gly Pro Ala Ile Arg Ile Pro Gly Thr 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 133 Asp Lys His Ile His Leu Ile Cys Gly Glu 1 5 10 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 134 Thr Thr Val Asn Asp Gly His Cys His Lys 1 5 10 <210> 135 <211> 12 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 135 Phe Leu Phe Thr Thr Gln Ile Glu Ala Pro Leu Val 1 5 10 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 136 Met Glu Asn Asn Lys Cys Arg Glu Asp Phe 1 5 10 <210> 137 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Asp Phe Ile Leu Ala Ala Ser Thr Pro 1 5 10 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 155 Leu Ala Asn Val Asp Leu Ala Ser Leu Cys 1 5 10 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 156 Asn Leu Lys Ala Val Ala Phe Asp Ile Thr 1 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 157 Pro Ala Asp Tyr Glu Asp Phe Ile Ala Ser 1 5 10 <210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 158 Leu Gly Tyr Tyr Leu Asp Lys Lys His Tyr 1 5 10 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 159 Lys Glu Cys Asn Cys Asn Cys Asp Cys Asp 1 5 10 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 160 Asp Cys Cys Cys Asn Lys Gly Ile Leu Asp 1 5 10 <210> 161 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 161 Asn Leu Tyr Met Ser Asn Ile Asn Asn Gln 1 5 10 <210> 162 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 162 Val Thr Val Val Ala Gly Ser Leu Val Leu 1 5 10 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 163 Thr Gly Val Glu Val Leu Gly Lys Lys Asn 1 5 10 <210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 164 Asp Val Ile Val Leu Gly Asn Ser Asn Asp 1 5 10 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 165 Ser Arg Ile Tyr Phe Val Cys Val Asp Ser 1 5 10 <210> 166 <211> 5 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 166 Ile Asp Tyr Ile Ala 1 5 <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 167 Met Leu Ile Val Thr Thr Glu Lys Val Glu 1 5 10 <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 168 Gly Lys Lys Ile Ser Lys Val Leu Gly Leu 1 5 10 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 169 Val Arg Gly Ser Thr Ile Arg Ala Lys His 1 5 10 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 170 Val Gly Lys Asp Ile Gly Ala Ser Phe Lys 1 5 10 <210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 171 Asn Leu Val Gly Gly Glu Leu Thr Gly Tyr 1 5 10 <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 172 Asn Glu Met Leu Thr Glu Ala Arg Gln Ile 1 5 10 <210> 173 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 173 Ala Ile Gly Arg Met Val Glu Asp Ala Glu 1 5 10 <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 174 Ala Lys Gly Ala Asn Ala Val Ile Ala Phe 1 5 10 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 175 Arg Leu Ser Ser Ala Ser Val Met Gln Gly 1 5 10 <210> 176 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 176 Ala Ala Glu Met Leu Ala Tyr Gly Thr Ala 1 5 10 <210> 177 <211> 12 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 177 Val Val Leu Glu Asp Asp Asn Ser Ile Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 178 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 178 Met Gly Thr Lys Ile Val Leu Ser Ile Val 1 5 10 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 179 Leu Ile Val Val Val Val Ala Ile Ser Leu 1 5 10 <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 180 Thr Cys Ile Arg Val Ile Lys Gln Ser Lys 1 5 10 <210> 181 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 181 Val Gly Ile Ile Met Arg Leu Gly Lys Phe 1 5 10 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 182 Gln Lys Val Ala Glu Thr Gly Val His Phe 1 5 10 <210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 183 Leu Ile Pro Phe Leu Asp Lys Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 184 Val Ile Asp Leu Arg Glu Ile Val Ile Asp 1 5 10 <210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 185 Phe Pro Pro Gln Pro Val Ile Thr Lys Asp 1 5 10 <210> 186 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 186 Asn Val Thr Met Gln Ile Asp Thr Val Val 1 5 10 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 187 Tyr Tyr Lys Val Thr Asp Pro Val Arg Tyr 1 5 10 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 188 Val Phe Glu Ile Ala Asn Pro Ile Ala Ala 1 5 10 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 189 Ile Glu Asn Leu Thr Ala Thr Thr Leu Arg 1 5 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 190 Asn Ile Ile Gly Glu Leu Asp Leu Asp Glu 1 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 191 Thr Leu Thr Ser Arg Asp Ile Ile Asn Val 1 5 10 <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 192 Lys Met Arg Thr Ile Leu Asp Glu Ala Thr 1 5 10 <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 193 Asp Lys Trp Gly Ile Lys Val Asn Arg Val 1 5 10 <210> 194 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 194 Glu Leu Lys Asn Ile Met Pro Pro Gln Asp 1 5 10 <210> 195 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 195 Ile Gln Val Ala Met Glu Lys Gln Met Arg 1 5 10 <210> 196 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 196 Ala Glu Arg Glu Arg Arg Glu Ala Ile Leu 1 5 10 <210> 197 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 197 Gln Ala Glu Gly Asn Lys Ser Ala Ala Ile 1 5 10 <210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 198 Leu Gln Ala Glu Gly Glu Lys Gln Ser Ala 1 5 10 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 199 Met Val Arg Val Ala Glu Gly Glu Lys Glu 1 5 10 <210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 200 Pro Asn Lys Tyr Lys Glu Pro Lys Ile Lys 1 5 10 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 201 Ser Ala Ile Leu Val Ala Glu Gly Glu Ala 1 5 10 <210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 202 Glu Ala Ile Arg Gln Thr Ala Ile Ala Lys 1 5 10 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 203 Ala Gln Gly Glu Ala Glu Met Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 204 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 204 Thr Gln Met Ala Thr Ala Glu Gly Leu Lys 1 5 10 <210> 205 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 205 Leu Val Phe Ser Ala Met Lys Glu Ala Asp 1 5 10 <210> 206 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 206 Ile Asp Asn Asn Ile Leu Ala Leu Lys Ser 1 5 10 <210> 207 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 207 Met Glu Ala Leu Glu Lys Met Ala Glu Gly 1 5 10 <210> 208 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 208 Lys Ser Thr Lys Leu Val Leu Pro Ser Glu 1 5 10 <210> 209 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 209 Ala Val Asn Phe Leu Gly Thr Phe Lys Gly 1 5 10 <210> 210 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 210 Ile Lys Glu Val Met Ser Asp Asp Asn Lys 1 5 10 <210> 211 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 211 Glu Val Leu Asp Ile Lys Glu Val Leu Asn 1 5 10 <210> 212 <211> 7 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 212 Asp Asn Glu Ser Leu Lys Lys 1 5 <210> 213 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 213 Met Ile Asp Asn Gln Lys Tyr Val Ile Leu 1 5 10 <210> 214 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 214 Ser Leu Glu Leu His Leu Phe Phe Ser Arg 1 5 10 <210> 215 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 215 Ile Met Lys Glu His Ala Leu Phe Leu Glu 1 5 10 <210> 216 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 216 Ala Gly Phe Thr Asn Lys Asn Tyr Asn Leu 1 5 10 <210> 217 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 217 Ala Met Glu Ala Asp His Tyr Lys Lys Gln 1 5 10 <210> 218 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 218 Phe Glu Asp Leu Leu Ser Tyr Thr Val Ser 1 5 10 <210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 219 Ala Ser Asn Gly Ile Ile Arg Pro Asp Ile 1 5 10 <210> 220 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 220 Leu Tyr Ser Glu Glu Leu Val Thr Thr Leu 1 5 10 <210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 221 Thr Ser Val Ala Glu Gln Lys Thr Glu Glu 1 5 10 <210> 222 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 222 Phe Thr Gly Ile Glu Ile Asn Lys Asn Ile 1 5 10 <210> 223 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 223 Thr Thr Arg Glu Leu Asn Leu Gln Ser Gly 1 5 10 <210> 224 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 224 Val Asn Pro Gln Val Gly Gln Asp Leu Val 1 5 10 <210> 225 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 225 Asn Tyr Val Ala Gln Leu Asn Ser Asp Ala 1 5 10 <210> 226 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 226 Ile Arg Leu Leu Asp Gly Leu Ile Asn Phe 1 5 10 <210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 227 Lys Glu Arg Val Leu Asp Gly Val Leu Ser 1 5 10 <210> 228 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 228 Cys Thr Ile Phe Thr Ser Asn Tyr Pro Leu 1 5 10 <210> 229 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 229 Leu Leu Glu His Ile Ile His Glu Ala Asn 1 5 10 <210> 230 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 230 Leu Tyr Arg Ser Tyr Val Val Asp Leu Glu 1 5 10 <210> 231 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 231 Asn Lys Ile Asp Ile Glu Ser Lys Asn Ala 1 5 10 <210> 232 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 232 Lys Glu Ile Glu Leu Phe Trp Asp His Ile 1 5 10 <210> 233 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 233 Met Met Glu His Ala Leu Phe Met Arg Gly 1 5 10 <210> 234 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 234 Leu Leu Asp Pro Ser Glu Gly Glu Leu Ile 1 5 10 <210> 235 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 235 Asn Thr Ser Asn Asp Phe Ala Ile Lys Phe 1 5 10 <210> 236 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 236 Asn Glu Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Met 1 5 10 <210> 237 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 237 Thr Asp Ser Asn Ile Lys Asn Ile Thr Glu 1 5 10 <210> 238 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 238 Glu Thr Leu Asn Glu Thr Val Glu Phe Lys 1 5 10 <210> 239 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 239 Asp Phe Lys Glu Ala Gly Ala Ser Gly Ile 1 5 10 <210> 240 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 240 Glu Gln Cys Lys Ile Lys Ser Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 241 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 241 Pro Leu Leu Ala Asp His Val Leu Arg Glu 1 5 10 <210> 242 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 242 Ala Asn His Tyr Ile Arg Ile Leu Glu Ser 1 5 10 <210> 243 <211> 4 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 243 Tyr Lys Asn Met 1 <210> 244 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 244 Met Arg Asn Ile Ile Leu Tyr Leu Asn Asp 1 5 10 <210> 245 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 245 Asp Thr Phe Ile Ser Lys Lys Tyr Pro Asp 1 5 10 <210> 246 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 246 Lys Asn Phe Ser Asn Leu Asp Tyr Cys Leu 1 5 10 <210> 247 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 247 Ile Gly Ser Lys Cys Ser Asn Ser Phe Val 1 5 10 <210> 248 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 248 Lys Glu Lys Leu Ile Thr Phe Phe Lys Val 1 5 10 <210> 249 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 249 Arg Ile Pro Asp Ile Leu Lys Asp Lys Ser 1 5 10 <210> 250 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 250 Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ile His Ile 1 5 10 <210> 251 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 251 Asp Ser Asn Lys Asn His Ile Phe Lys Glu 1 5 10 <210> 252 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 252 Lys Val Asp Ile Glu Ile Lys Arg Ile Ser 1 5 10 <210> 253 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 253 Glu Tyr Tyr Asn Leu Arg Thr Ile Thr Trp 1 5 10 <210> 254 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 254 Asn Asp Arg Val Ser Met Glu Asn Ile Arg 1 5 10 <210> 255 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 255 Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ile Ser Asp Thr 1 5 10 <210> 256 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 256 Ser Asn Tyr Ile Cys Leu Asn Ile Thr Gly 1 5 10 <210> 257 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 257 Thr Ile Lys Ala Trp Ala Met Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 258 Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 259 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 259 Tyr Pro Tyr Gln Ile Leu Glu Phe Thr Ser 1 5 10 <210> 260 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 260 Ser Arg Gly Cys Asn Lys Pro Tyr Ile Leu 1 5 10 <210> 261 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 261 Val Thr Phe Glu Asp Arg Ile Ile Asp Asn 1 5 10 <210> 262 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 262 Cys Tyr Pro Lys Cys Glu Cys Pro Pro Ile 1 5 10 <210> 263 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 263 Arg Ile Thr Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly 1 5 10 <210> 264 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 264 Ala Thr Gly Ser Thr Gly Pro Met Gly Val 1 5 10 <210> 265 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 265 Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 266 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 266 Gly Ser Ile Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 267 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 267 Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Pro 1 5 10 <210> 268 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 268 Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ser Thr 1 5 10 <210> 269 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 269 Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 270 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 270 Val Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Val 1 5 10 <210> 271 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 271 Thr Gly Ser Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 272 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 272 Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Val Thr Gly 1 5 10 <210> 273 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 273 Ser Ile Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 274 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 274 Thr Gly Asn Thr Gly Glu Ile Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 275 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 275 Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly 1 5 10 <210> 276 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 276 Ser Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 277 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 277 Thr Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 278 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 278 Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Val 1 5 10 <210> 279 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 279 Thr Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Glu Ile 1 5 10 <210> 280 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 280 Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 281 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 281 Val Thr Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 282 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 282 Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Val Thr 1 5 10 <210> 283 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 283 Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 284 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 284 Pro Thr Gly Asn Thr Gly Val Thr Gly Glu 1 5 10 <210> 285 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 285 Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 286 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 286 Gly Val Thr Gly Glu Ile Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 287 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 287 Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Pro 1 5 10 <210> 288 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 288 Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 289 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 289 Gly Ser Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 290 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 290 Ala Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 291 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 291 Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ser Ser Gln Pro 1 5 10 <210> 292 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 292 Val Ala Asn Phe Leu Val Asn Ala Pro Ser 1 5 10 <210> 293 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 293 Pro Gln Thr Leu Asn Asn Gly Asp Ala Ile 1 5 10 <210> 294 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 294 Thr Gly Trp Gln Thr Ile Ile Gly Asn Ser 1 5 10 <210> 295 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 295 Ser Ser Ile Thr Val Asp Thr Asn Gly Thr 1 5 10 <210> 296 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 296 Phe Thr Val Gln Glu Asn Gly Val Tyr Tyr 1 5 10 <210> 297 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 297 Ile Ser Val Ser Val Ala Leu Gln Pro Gly 1 5 10 <210> 298 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 298 Ser Ser Ser Ile Asn Gln Tyr Ser Phe Ala 1 5 10 <210> 299 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 299 Ile Leu Phe Pro Ile Leu Gly Gly Lys Asp 1 5 10 <210> 300 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 300 Leu Ala Gly Leu Thr Thr Glu Pro Gly Gly 1 5 10 <210> 301 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 301 Gly Gly Val Leu Ser Gly Tyr Phe Ala Gly 1 5 10 <210> 302 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 302 Phe Leu Phe Gly Gly Thr Thr Phe Thr Ile 1 5 10 <210> 303 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 303 Asn Asn Phe Ser Ser Thr Thr Val Gly Ile 1 5 10 <210> 304 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 304 Arg Asn Gly Gln Ser Ala Gly Thr Ala Ala 1 5 10 <210> 305 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 305 Met Leu Leu Ile Met Ser Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 306 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 306 Ile Asp Asn Asn Ile Leu Ala Leu Lys Ser 1 5 10 <210> 307 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 307 Phe Gly Pro Phe Asp Asp Asn Asp Tyr Asn 1 5 10 <210> 308 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 308 Asn Gly Tyr Asp Lys Tyr Asp Asp Cys Asn 1 5 10 <210> 309 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 309 Asn Gly Arg Asp Asp Tyr Asn Ser Cys Asp 1 5 10 <210> 310 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 310 Cys His His Cys Cys Pro Pro Ser Cys Val 1 5 10 <210> 311 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 311 Gly Pro Thr Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly 1 5 10 <210> 312 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 312 Arg Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 313 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 313 Thr Gly Pro Gly Val Gly Ala Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 314 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 314 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 315 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 315 Gly Asn Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 316 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 316 Leu Arg Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 317 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 317 Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ile 1 5 10 <210> 318 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 318 Gly Phe Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 319 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 319 Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asp 1 5 10 <210> 320 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 320 Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 321 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 321 Ala Thr Gly Ala Asp Gly Ile Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 322 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 322 Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Phe Gly 1 5 10 <210> 323 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 323 Val Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 324 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 324 Thr Gly Val Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 325 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 325 Leu Ile Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Thr 1 5 10 <210> 326 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 326 Pro Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ile 1 5 10 <210> 327 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 327 Gly Ala Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 328 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 328 Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asp 1 5 10 <210> 329 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 329 Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 330 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 330 Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asp Gly Val 1 5 10 <210> 331 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 331 Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 332 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 332 Gly Ile Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 333 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 333 Thr Gly Ala Thr Gly Ile Gly Ile Thr Gly 1 5 10 <210> 334 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 334 Ala Thr Gly Leu Ile Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 335 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 335 Thr Gly Thr Pro Gly Ala Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 336 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 336 Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Val Gly Val 1 5 10 <210> 337 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 337 Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 338 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 338 Gly Ala Asp Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly 1 5 10 <210> 339 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 339 Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 340 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 340 Asn Gly Leu Val Gly Pro Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 341 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 341 Gly Ala Ala Gly Thr Pro Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 342 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 342 Pro Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Val 1 5 10 <210> 343 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 343 Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 344 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 344 Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala Asp Gly Ala 1 5 10 <210> 345 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 345 Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Thr 1 5 10 <210> 346 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 346 Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 347 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 347 Ala Thr Gly Asn Thr Gly Ala Asp Gly Ala 1 5 10 <210> 348 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 348 Thr Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 349 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 349 Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 350 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 350 Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 351 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 351 Thr Gly Ala Ser Ala Ile Ile Pro Phe Ala 1 5 10 <210> 352 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 352 Ser Gly Ile Pro Leu Ser Leu Thr Thr Ile 1 5 10 <210> 353 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 353 Ala Gly Gly Leu Val Gly Thr Pro Gly Phe 1 5 10 <210> 354 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 354 Val Gly Phe Gly Ser Ser Ala Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 355 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 355 Ser Ile Val Gly Gly Val Ile Asp Leu Thr 1 5 10 <210> 356 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 356 Asn Ala Ala Gly Thr Leu Thr Asn Phe Ala 1 5 10 <210> 357 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 357 Phe Ser Met Pro Arg Asp Gly Thr Ile Thr 1 5 10 <210> 358 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 358 Ser Ile Ser Ala Tyr Phe Ser Thr Thr Ala 1 5 10 <210> 359 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 359 Ala Leu Ser Leu Val Gly Ser Thr Ile Thr 1 5 10 <210> 360 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 360 Ile Thr Ala Thr Leu Tyr Gln Ser Thr Ala 1 5 10 <210> 361 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 361 Pro Asn Asn Ser Phe Thr Ala Val Pro Gly 1 5 10 <210> 362 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 362 Ala Thr Val Thr Leu Ala Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 363 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 363 Gly Ile Leu Ser Val Gly Ser Ile Ser Ser 1 5 10 <210> 364 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 364 Gly Ile Val Thr Gly Leu Asn Ile Ala Ala 1 5 10 <210> 365 <211> 11 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 365 Thr Ala Gln Thr Pro Asp Arg Gln Tyr Ala Ile 1 5 10 <210> 366 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 366 Met Ser Asp Ile Ser Gly Pro Ser Leu Tyr 1 5 10 <210> 367 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 367 Gln Asp Val Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 368 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 368 Ala Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 369 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 369 Arg Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asn 1 5 10 <210> 370 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 370 Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly 1 5 10 <210> 371 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 371 Ala Thr Gly Ala Asn Gly Ile Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 372 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 372 Thr Gly Asn Met Gly Ala Thr Gly Pro Asn 1 5 10 <210> 373 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 373 Gly Thr Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 374 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 374 Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly Ile 1 5 10 <210> 375 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 375 Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 376 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 376 Gly Ala Asn Gly Ile Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 377 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 377 Asn Lys Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly Ile 1 5 10 <210> 378 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 378 Thr Gly Ser Thr Gly Pro Thr Gly Asn Thr 1 5 10 <210> 379 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 379 Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly Ile Thr Gly 1 5 10 <210> 380 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 380 Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 381 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 381 Thr Gly Pro Thr Gly Leu Thr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 382 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 382 Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly Ile Thr Gly 1 5 10 <210> 383 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 383 Pro Thr Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 384 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 384 Asn Gly Val Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 385 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 385 Gly Asn Thr Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 386 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 386 Ser Ile Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr 1 5 10 <210> 387 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 387 Thr Gly Ala Thr Gly Pro Ile Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 388 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 388 Gly Ala Thr Gly Ala Asp Gly Glu Val Gly 1 5 10 <210> 389 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 389 Pro Thr Gly Ala Val Gly Ala Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 390 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 390 Asp Gly Leu Val Gly Pro Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 391 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 391 Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly 1 5 10 <210> 392 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 392 Leu Val Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 393 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 393 Thr Gly Ala Asn Gly Leu Val Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 394 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 394 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Val Ala Gly 1 5 10 <210> 395 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 395 Ala Ile Gly Pro Thr Gly Ala Val Gly Ala 1 5 10 <210> 396 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 396 Thr Gly Pro Thr Gly Ala Asp Gly Ala Val 1 5 10 <210> 397 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 397 Gly Pro Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 398 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 398 Ala Asn Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 399 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 399 Val Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly Val Ala 1 5 10 <210> 400 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 400 Gly Pro Ile Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 401 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 401 Glu Asn Gly Val Ala Gly Ala Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 402 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 402 Thr Gly Ala Thr Gly Ala Asn Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 403 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 403 Gly Pro Thr Gly Ala Val Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 404 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 404 Ala Asn Gly Val Ala Gly Ala Ile Gly Pro 1 5 10 <210> 405 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 405 Thr Gly Pro Thr Gly Ala Asn Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 406 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 406 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 407 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 407 Ala Asn Gly Ala Thr Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 408 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 408 Thr Gly Ala Thr Gly Val Leu Ala Ala Asn 1 5 10 <210> 409 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 409 Asn Ala Gln Phe Thr Val Ser Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 410 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 410 Leu Val Asn Asn Thr Leu Val Thr Phe Asn 1 5 10 <210> 411 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 411 Ser Ser Phe Ile Asn Gly Thr Asn Ile Thr 1 5 10 <210> 412 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 412 Phe Pro Thr Ser Ser Thr Ile Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 413 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 413 Val Gly Gly Ile Tyr Asn Val Ser Phe Gly 1 5 10 <210> 414 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 414 Ser Leu Glu Leu His Leu Phe Phe Ser Arg 1 5 10 <210> 415 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 415 Met Ser Ile Thr Thr Asn Phe Asn Gly Val 1 5 10 <210> 416 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 416 Thr Gln Asn Asn Phe Ile Ala Lys Ala Val 1 5 10 <210> 417 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 417 Asn Thr Leu Thr Ser Ser Asp Val Ser Val 1 5 10 <210> 418 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 418 Ser Leu Ser Phe Leu Val Asp Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 419 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 419 Ala Ala Val Thr Leu Ser Phe Thr Phe Gly 1 5 10 <210> 420 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 420 Ser Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ala Gly 1 5 10 <210> 421 <211> 8 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 421 Tyr Val Ser Val Tyr Arg Ile Gln 1 5 <210> 422 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 422 Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu 1 5 10 <210> 423 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 423 Asn Pro Asp Glu Ser Leu Ser Ala Ser Ala 1 5 10 <210> 424 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 424 Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu 1 5 10 <210> 425 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 425 Pro Pro Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr 1 5 10 <210> 426 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 426 Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 427 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 427 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 428 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 428 Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 429 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 429 Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Gly 1 5 10 <210> 430 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 430 Thr Gly Asp Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 431 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 431 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asp Thr Gly Thr 1 5 10 <210> 432 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 432 Pro Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Ala 1 5 10 <210> 433 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 433 Thr Gly Leu Thr Gly Pro Thr Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 434 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 434 Gly Pro Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ala Gly 1 5 10 <210> 435 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 435 Leu Tyr Ala Phe Asn Ser Gly Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 436 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 436 Phe Asn Thr Val Gly Ser Gln Phe Gly Thr 1 5 10 <210> 437 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 437 Ala Ile Ser Gln Leu Asp Ala Asp Thr Phe 1 5 10 <210> 438 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 438 Val Ile Ser Glu Thr Gly Phe Tyr Lys Ile 1 5 10 <210> 439 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 439 Thr Val Ile Ala Asn Thr Ala Thr Ala Ser 1 5 10 <210> 440 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 440 Gly Val Pro Val Pro Gly Thr Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 441 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 441 Leu Ile Ser Leu Gly Ala Pro Ile Val Ile 1 5 10 <210> 442 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 442 Gln Ala Ile Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 443 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 443 Ser Leu Val Glu Val Ile Val Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 444 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 444 Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Thr Ser Ala 1 5 10 <210> 445 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 445 Ser Ile Ile Ile Glu Lys Val Ala 1 5 <210> 446 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 446 cgcggatcca tgtcccagca acacacac 28 <210> 447 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 447 cccaagcttt atttatgttt gggtggccac 30

Claims

기질 표면에 대한 미생물 포자의 결합을 차단 및/또는 억제할 수 있는 감염 제어 조성물.
제1항에 있어서, 작은 유기 분자를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 단백질을 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 단백질이 포자 표면 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 펩티드가 클로스트리듐 (Clostridium) 포자 표면 단백질로부터 유래되는 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 클로스트리듐 표면 단백질이 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile) 포자 표면 단백질을 포함하는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 펩티드가 서열 1 또는 서열 1의 상동체를 포함하는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 펩티드가 서열 3, 서열 5, 서열 7, 및 서열 15를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항체를 포함하는 조성물.
제9항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 조성물.
제1항에 있어서, 합성 펩티드를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 무기 이온 복합체를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 단백질 모방체를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 기질 표면이 무생물 표면을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 기질 표면이 생물 표면을 포함하는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 생물 표면이 체조직 표면을 포함하는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 상기 체조직 표면이 상피 표면을 포함하는 것인 조성물.
제17항에 있어서, 상기 상피 표면이 포유동물 피부 표면을 포함하는 것인 조성물.
제14항에 있어서, 상기 무생물 표면이 스테인레스 스틸, 세라믹, 비닐 또는 타일을 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 인간 투여에 적합한 조성물.
제1항에 있어서, 항미생물 피부 세정제를 추가로 포함하는 조성물.
제22항에 있어서, 상기 피부 세정제가 손세척 (handwash) 세정제를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 항미생물 표면 세정제를 추가로 포함하는 조성물.
a) i) 적어도 하나의 포자 표면 단백질을 포함하는 세균 포자에 노출될 위험이 있는 대상체 (여기서, 노출은 미생물 감염 및/또는 콜로니 형성을 일으킬 가능성이 있음); 및 ii) 상기 포자 표면 단백질로부터 유래되는 적어도 하나의 길항제를 포함하는 감염 제어 조성물을 제공하고; b) 조성물을 미생물 노출 전에 대상체에게 미생물 감염 장벽이 형성되도록 하는 조건 하에 투여하는 것을 포함하는, 세균 포자의 기질 표면에 대한 결합을 차단하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 미생물 감염 장벽이 상기 미생물 감염을 감소시키는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 미생물 감염 장벽이 상기 미생물 감염을 방지하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 포자 표면 단백질이 씨. 디피실레 포자 표면 단백질인 방법.
제25항에 있어서, 상기 포자 표면 단백질이 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 길항제가 상기 포자 표면 단백질로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 길항제의 상기 아미노산 서열이 상기 포자 표면 단백질의 상기 아미노산 서열에 실질적인 상동성을 갖는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 길항제 화합물이 상기 포자 표면 단백질 아미노산 서열에 대한 친화도를 갖는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 조성물이 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 감염 제어 조성물이 적어도 하나의 항미생물 약물을 추가로 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 위험이 있는 상기 대상체가 의료계 종사자, 의료 최초 반응자 (first responder), 의료계 환경 하의 의료 환자, 적어도 하나의 항생제를 투여받은 환자, 소방관, 경찰관, 군인, 식품 취급자 또는 무생물 표면인 방법.
제25항에 있어서, 상기 투여가 국소, 경구, 비경구, 폐, 직장내, 질내, 눈, 및 비내로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
a) i) 클로스트리듐 디피실레 포자 표면 단백질을 포함하는 미생물 포자 표면 단백질로부터 유래하는 단리된 펩티드; 및 ii) 상기 펩티드와 상호작용을 하는 것으로 의심되는 감염 제어 시험 화합물을 제공하고; b) 펩티드를 감염 제어 시험 화합물과 접촉시키고; c) 펩티드와 감염 제어 시험 화합물의 상호작용을 검출하는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
제37항에 있어서, 단리된 펩티드에 부착할 수 있는 기질 표면을 추가로 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 기질 표면이 돈피 (pigskin)를 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 펩티드가 포자 표면 펩티드를 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 상기 포자 표면 펩티드가 서열 1, 서열 1의 상동체, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 및 서열 15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.