KR20110132080A

KR20110132080A - 불등가사리 유래 화합물 및 이를 포함한 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110132080A
Application number: KR1020100051895A
Authority: KR
Inventors: 우미희; 최재수
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2011-12-07
Also published as: KR101178500B1

Abstract

본 발명은 불등가사리로부터 분리한 신규한 화학식 11의 화합물과 공지의 화합물 2 내지 18 및 이들을 유효성분으로 함유하여 항콜린에스테라아제 활성을 통한 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 알츠하이머 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 불등가사리 유래 화합물들은 적절한 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부틸콜린에스테라아제(BChE)에 대한 저해 활성을 통한 항콜린에스테라아제 활성을 나타냄으로써 알츠하이머 질환의 예방 및 치료를 잠재적 치료제로서 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

불등가사리 유래 화합물 및 이를 포함한 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 조성물{Compounds from Gloiopeltis furcata and Composition for the prevention and treatment of Alzheimer's disease}

본 발명은 불등가사리 유래 화합물 및 이를 포함한 알츠하이머 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 불등가사리로부터 분리한 신규한 화학식 11의 화합물과 공지의 화합물 2 내지 18 및 이들을 유효성분으로 함유하여 항콜린에스테라아제 활성을 통한 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 알츠하이머 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

불등가사리[Gloiopeltis furcata(Postels et Ruprecht) J. Agardh]는 다년생 홍조류(Rhodophyta)로 풀가사리과(Endocladiaceae)에 속하고, 대한민국 및 일본을 포함한 태평양 북부 연안에 분포하고 있다. 불등가사리의 다양한 생물학적 활성, 예를 들어, 암 예방, 변비 개선, 라디칼 소거, 콜레스테롤 제거, 치아의 재석회화, 티로시나아제 저해, 모발 성장 저해, 항종양, 항균, 항노화 및 주름 예방, 항경구박테리아, β-D-글로코시다아제 저해 및 혈액 항응고 활성 등을 밝힌 다양한 연구가 행하여져 왔다.

불등가사리와 관련하여 대한민국 특허출원 제10-2000-0078129호 '불등가사리 물 추출물을 환경호르몬 다이옥신 억제작용제로의 이용'에는 불등가사리(Gloiopeltis furcata)의 열수추출물을 환경호르몬인 TCDD를 주사한 쥐에 섭취시켰을 때 TCDD에 의한 체중감소, 식이섭취량 감소 그리고 대표적인 골격근인 gastrocnemius muscle 무게의 감소 등이 억제되었으며, 간, 심장, 신장 등의 장기세포가 파괴되어 혈액으로 유출되는 GOT와 GPT가 불등가사리 첨가 식이 섭취에 의해 감소하였음이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0820291호 '발효된 해조류의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물 및 그 제조방법'에는 불등가사리(Gloiopeltis furcata) 발효물의 상등액을 에탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물이 개시되어 있다.

그러나 불등가사리로부터 유도된 화학물질에 대한 연구는, 갈락탄과 다당류에 대한 연구를 제외하고, 제한되어 있다.

한편, 알츠하이머 질환(AD)은 만성 신경퇴행성 질환으로, 뇌를 손상시켜 통상적으로 노년기에 보여지는 기억 손실 및 학습 장애를 포함한 인식력 손상을 가져온다. AD의 병인에 대해 많은 다양한 이론들이 개진되어 왔으며, 잘 정립된 이론들 중 하나가 콜린성 경로의 연관성을 제안하고 있으며, 이는 AD의 궁극적 발생 과정으로서 신경전달물질 아세틸콜린의 수준의 점진적 감소를 지시한다. AD는 또한 퍼옥시나이트라이트(peroxynitrite; ONOO^-) 및 수퍼옥사이드 이온(ㅇO₂ ^-)에의 노출과 같은 산화적 스트레스 상태와 통상적으로 관련된 아밀로이드 플래크 및 타우-관련 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangles)의 존재를 병리적 특징으로 한다.

상기한 바와 같이 지금까지 불등가사리의 화학 성분들이 항콜린에스테라제 활성 및 항산화 활성을 나타낸다는 사실에 대한 연구는 행해진 바 없으며, 그에 따라 본 발명자들은 불등가사리에서 생활성 성분을 분리하여 특징화하고, 이들의 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부틸콜린에스테라아제(BChE)에 대한 저해 활성을 통한 항콜린에스테라아제 활성을 평가하고, DHHP 라디칼 및 ONOO^- 이온 에 대한 소거 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 불등가사리 유래 신규 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 불등가사리 유래 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 불등가사리 유래 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 불등가사리로부터 18종의 화합물을 분리하고, 분리된 화합물이 콜린성 손상을 완화시켜 신경전달을 개선시킴으로써 콜린에스테라아제(ChEs) 저해제로서 유용함으로 확인하고, 이들의 항산화 특성을 산화적 스트레스의 완화에 이용함으로써 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있음을 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 불등가사리 유래 하기 화학식 11의 화합물 (5E, 7E)-9-옥소데카-5,7-디엔산[(5E, 7E)-9-oxodeca-5,7-dienoic acid] 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

<화학식 11>

본 발명의 또한 하기 화학식 1 내지 18의 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

2-(3-하이드록시-5-옥소테트라하이드로푸란-3-일) 아세트산

[2-(3-hydroxy-5-oxotetrahydrofuran-3-yl) acetic acid]

<화학식 2>

글루타르산(glutaric acid)

<화학식 3>

숙신산(succinic acid)

<화학식 4>

니코틴산(nicotinic acid)

<화학식 5>

(E)-4-하이드록시헥스-2-엔산 [(E)-4-hydroxyhex-2-enoicacid]

<화학식 6>

콜레스테롤(cholesterol)

<화학식 7>

7-하이드록시콜레스테롤(7-hydroxycholesterol)

<화학식 8>

우리딘(uridine)

<화학식 9>

글리세롤(glycerol)

<화학식 10>

5-(하이드록시메틸)-2-메톡시벤젠-1,3-디올

[5-(hydroxymethyl)-2-methoxybenzene-1,3-diol]

<화학식 11>

(5E, 7E)-9-옥소데카-5,7-디엔산

[(5E, 7E)-9-oxodeca-5,7-dienoic acid]

<화학식 12>

(Z)-3-에틸레딘-4-메틸피롤리딘-2,5-디온

[(Z)-3-ethylidene-4-methylpyrrolidine-2,5-dione]

<화학식 13>

데하이드록보니폴리올(dehydrovomifoliol)

<화학식 14>

롤리올라이드(loliolide)

<화학식 15>

콜레스테릴스테아레이트(cholesterylstearate)

<화학식 16>

팔미트산(palmitic acid)

<화학식 17>

cis-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid)

<화학식 18>

α-리놀렌산(α-linolenic acid)

본 발명의 또한 상기 화학식 1 내지 18의 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 불등가사리 유래 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 불등가사리 유래 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 불등가사리 유래 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 불등가사리 유래 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 불등가사리 유래 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 불등가사리 유래 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 피부에 직접 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 불등가사리 유래 화합물은 알츠하이머 질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 불등가사리 유래 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 불등가사리 유래 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 불등가사리 유래 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 불등가사리 유래 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 불등가사리 유래 화합물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 불등가사리 유래 화합물은 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에서는 불등가사리를 95% 에탄올(EtOH)로 추출하여 진공에서 농축하였다. 이어서, 상기 불등가사리 EtOH 추출물을 n-헥산, 메틸렌 클로라이드(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc), n-부탄올(BuOH) 및 물로 분획하여 각각의 분획물을 수득하였다.

본 발명에서는 또한 상기 각 분획물의 AChE 및 BChE에 대한 저해 활성뿐만 아니라 DPPH 라디칼 및 ONOO^-에 대한 소거 활성을 통해 항콜린에스테라아제 및 항산화 활성을 조사하였다. 그 결과, EtOAc 분획이 가장 강력한 DPPH 라디칼 및 ONOO^-소거 활성을 나타내었고, n-헥산 및 EtOAc 분획이 BChE 저해 활성을 나타내었다.

상기에서 DPPH 라디칼 및 ONOO^-소거 활성과 BChE 저해 활성을 확인한 EtOAc, CH₂Cl₂, 및 n-헥산 분획에 대한 RP-C18 및 실리카겔, 세파덱스 LH-20 겔 컬럼, 및 HPLC 크로마토그래피를 통해 EtOAc 분획으로부터 화합물 1 내지 10, CH₂Cl₂ 분획으로부터 화합물 11 내지 14, n-헥산 분획으로부터 화합물 15 내지 20을 수득하였다.

상기 화합물 중 화합물 11이 신규 화합물로 밝혀졌다. 화합물 1은 천연 공급원에서 최초로 분리된 것이었으며, 그의 생리화학적 데이터 또한 종래 보고된 바 없다.

상기 화합물 1에 대한 EIMS 스펙트럼 분석으로부터 [M]⁺at m/z 160에서 [M]⁺가 나타났으며, FABMS 스펙트럼 분석으로부터 m/z 161에서 [M+H]⁺가 나타났고, 이는 분자식 C₆H₉O₅에 상응한 것이며, m/z 161.0448에서 분자 이온 피크 [M+H]⁺ (calcd. 161.0450)를 이용한 HRFABMS 스펙트럼 분석에 의해 추가로 지지되었다.

화합물 1의 IR 스펙트럼은 3444 cm^-1(OH), 1719 cm^-1(ester), 1636 cm^-1(COOH), 및 1067 cm^-1(C-O)에서 흡수 밴드를 나타내었다. 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼은 δ 2.63 (1H, d, J=17.4Hz) 및 δ 2.84 (1H, d, J=17.4Hz)에서 이중선을 나타내었으며, 이는 H-2a 및 H-2b에 기인한 것이다. 이 스펙트럼은 또한 δ 2.72 (1H, d, J=16.0Hz) 및 δ 2.78 (1H, d, J=16.0Hz)에서 wo 신호를 지시하며, 이는 H-4′a 및 H-4′b에 할당되는 것이다. 두 개의 이중선이 두 개의 양성자(H-2′a 및 H-2′b)를 통합한 δ 4.30 (1H, d, J=10.0Hz) 및 δ 4.38 (1H, d, J=10.0Hz)에서 나타났다. 화합물 1의 ¹³C NMR 스펙트럼은 δ 177.1 (C-1)에서 하나의 카르복실 탄소 신호와 δ 172.4 (C-5′)에서 하나의 에스테르 탄소 신호의 존재를 지시한다. C-2′의 하이드록실화 탄소 신호는 δ 74.4 (C-3′)에서 나타났으며, 탄소 신호는 δ 78.7에서 나타났다. 또한 C-2 및 C-4′ 의 두 개의 탄소 피크는 δ 41.7에서 하나의 탄소 신호로 나타났다. 양성자 및 탄소 신호는 HSQC, HMBC 및 COSY 실험을 통해 설정되었다. 화합물 1의 HMBC 스펙트럼에서(도 2 참조), C-1와 H-2ab 사이, C-5′와 H-4′ 사이, C-3′와 H-2′ab 사이, 및 H-4′ab와 H-2ab 사이에서 연결성이 관찰되었다. COSY 스펙트럼(도 2)에서의 상관관계는 H-2′ab, H-2ab 및 H-4′ab 사이에서 연결성을 보여주었다. 따라서, 화합물 1의 구조는 하기 화학식 1의 2-(3-하이드록시-5-옥소테트라하이드로푸란-3-일) 아세트산[2-(3-hydroxy-5-oxotetrahydrofuran-3-yl) acetic acid]으로 결정되었다.

<화학식 1>

화합물 11의 FABMS 스펙트럼 분석은 m/z183.1에서 [M+H]⁺를 나타내었고, HRFABMS 스펙트럼 분석은 m/z183.1에서 [M+H]⁺를 나타내었으며, 이는 분자식 C₁₀H₁₄O₃에 상응하는 것이고, m/z183.1021에서 [M+H]⁺ 의 HRFABMS 스펙트럼 분석으로 추가로 지지되었다(calcd. 183.1023). 화합물 11의 IR 스펙트럼은 3434 cm^-1(O-H), 1719 cm^-1(C=O), 1654 cm^-1(COOH) 및 1077 cm^-1(C-O)에서 흡수 밴드를 나타내었다. 화합물 11의 ¹H-NMR 스펙트럼은 δ 6.10 (1H, d, J=15.6Hz), δ 6.18 (1H, dd, J=15.6,10.0Hz), δ 7.10 (1H, dd, J=15.2,10.0Hz) 및 δ 6.19 (1H, td, J=15.2,7.2Hz)에서 네 개의 공액화 올레핀 양성자를 나타내었고, 이는 H-8, H-7, H-6 및 H-5에 기인한 것이었다. 상기 스펙트럼은 또한 δ 2.39 (2H, t, J=7.2Hz) 및 δ 1.80 (2H, quintet, J=7.2Hz)에서 두 개의 신호를 나타내었는데, 이는 H-2 및 H-3에 할당된 것이라 할 수 있다. 양성자 H₂-4는 δ 2.25-2.30에서 다중선으로 존재하였으며, 하나의 단일선 메틸 양성자가 δ 2.28에서 존재하였다. 화합물 11의 ¹³CNMR 스펙트럼은 δ 179.1 (C-1)에서 하나의 카르복실 탄소, δ 199.3 (C-9)에서 케톤 탄소 및 δ 23.8에서 하나의 메틸 탄소 신호의 존재를 지시하였다. 네 개의 이중선 탄소 신호가 δ 144.0 (C-5), δ 130.0 (C-6), δ 143.9 (C-7) 및 δ 129.5 (C-8)에서 얻어졌다. 또한, 세 개의 탄소 피크 C-2, C-3 및 C-4가 각각 δ 33.4, δ 23.8 및 δ 32.4에서 존재하였다. 양성자 및 탄소 신호가 HSQC, HMBC 및 COSY 실험을 통해 할당되었다. 화합물 11의 HMBC 스펙트럼(도 3)에서, C-1와 H-2 및 H-3 사이, C-9와 H-7, H-8 및 H-10 사이, C-5와 H-7, H-6, H-4 및 H-3 사이, C-8과 H-7, H-6 및 H-10 사이, 및 C-1과 H-2 및 H-3 사이에서 연결성이 관찰되었다. COSY 스펙트럼(도 3)에서의 상관관계가 H-5와 H-4, H-6 사이, H-8와 H-7, H-6 사이, H-3와 H-2, H-4 사이의 연결성을 나타내었다. 따라서 화합물 11의 구조는 하기 화학식 11의 (5E, 7E)-9-옥소데카-5,7-디엔산[(5E, 7E)-9-oxodeca-5,7-dienoic acid]으로 결정되었다.

<화학식 11>

상기 화합물 1 및 11 이외의 공지 화합물 2내지 10 및 12 내지 18은 이들을 인증된 시료와 직접 비교하거나 또는 이들의 물리적 데이터와 스펙트럼 데이터를 문헌의 데이터와 비교하여 결정하였으며, 이는 다음과 같다:

<화학식 2>

화합물 2 : 글루타르산(glutaric acid)

<화학식 3>

화합물 3 : 숙신산(succinic acid)

<화학식 4>

화합물 4 : 니코틴산(nicotinic acid)

<화학식 5>

화합물 5 : (E)-4-하이드록시헥스-2-엔산[(E)-4-hydroxyhex-2-enoicacid]

<화학식 6>

화합물 6 : 콜레스테롤(cholesterol)

<화학식 7>

7-하이드록시콜레스테롤(7-hydroxycholesterol)

<화학식 8>

우리딘(uridine)

<화학식 9>

글리세롤(glycerol)

<화학식 10>

5-(하이드록시메틸)-2-메톡시벤젠-1,3-디올

[5-(hydroxymethyl)-2-methoxybenzene-1,3-diol]

<화학식 12>

(Z)-3-에틸레딘-4-메틸피롤리딘-2,5-디온

[(Z)-3-ethylidene-4-methylpyrrolidine-2,5-dione]

<화학식 13>

데하이드록보니폴리올(dehydrovomifoliol)

<화학식 14>

롤리올라이드(loliolide)

<화학식 15>

콜레스테릴스테아레이트(cholesterylstearate)

<화학식 16>

팔미트산(palmitic acid)

<화학식 17>

<화학식 18>

α-리놀렌산(α-linolenic acid)

상기의 모든 화합물은 식물에서 최초로 분리된 것이었다.

이어서, 상기 불등가사리 유래 화합물 1 내지 18의 항콜린에트세라아제 및 항산화 활성을 AChE 및 BChE 저해 분석, DPPH 라디칼 및 ONOO^- 소거 활성 분석을 통해 평가하였다.

화합물 1 내지 18 모두는 1.14-12.50 μg/ml 범위의 IC₅₀ 값을 통해 적절한 AChE 저해 활성을 나타내었다. AChE 분석에서 이들 중 화합물 1, 4, 6, 8 및 9가 갈란타민(IC₅₀=0.02μg/ml)과 비교하여 각각 1.40, 1.14, 1.15, 1.63 및 1.61μg/mL의 IC₅₀ 값으로 우수한 저해 활성을 나타내었다. BChE 분석에서는, 화합물 1, 7, 9, 17 및 18 만이 갈란타민(IC₅₀=0.18μg/ml)과 비교하여 각각 12.61, 5.57, 8.00, 6.56, 및 15.89 μg/ml의 IC₅₀값으로 적절한 저해 활성을 나타내었다.

항산화 분석에서는, 화합물 5 및 10이 l-아스코르브산(IC₅₀=2.66μg/ml)과 비교하여 각각 37.81 및 14.66μg/ml의 IC₅₀값으로 적절한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 화합물 5, 10 및 16이 l-페니실라민(IC₅₀=0.63μg/ml)과 비교하여 각각 1.10 및 0.78μg/ml의 IC₅₀ 값으로 강한 ONOO^- 소거 활성을 나타내었다.

결론적으로, 본 발명에서는 불등가사리로부터 신규 화합물 11과 공지 화합물(1 내지 10 및 12 내지 18)을 포함한 18 가지의 화합물을 최초로 분리하였다. 분리된 화합물 1 내지 18 모두가 1.14-12.50 μg/ml의 IC₅₀ 값으로 적절한 AChE 저해 활성을 나타낸 반면 화합물 1, 7, 9, 17 및 18이 5.57 내지 15.89 μg/ml의 IC₅₀ 값으로 적절한 BChE 저해 활성을 나타내었다.

그러나 화합물 5 및 10이 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 화합물 5, 10 및 16이 강한 ONOO^- 소거 활성을 나타낸 것을 제외하고, 분리된 화합물 대부분이 DPPH 라디칼 및 ONOO^-소거 활성을 나타내지 못했다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 불등가사리 유래 화합물들은 적절한 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부틸콜린에스테라아제(BChE)에 대한 저해 활성을 통한 항콜린에스테라아제 활성을 나타냄으로써 알츠하이머 질환의 예방 및 치료를 잠재적 치료제로서 이용할 수 있는 효과가 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서 불등가사리는 대한민국 전라남도 무안에서 2007년 6월에 구입한 것을 이용하였다. 융점은 야나코 마이크로 융점 측정기(Yanaco micro melting point apparatus; Kyoto,Japan)를 이용하여 측정하였다. 선광도는 편광계(Jasco DIP-370 digital polarimeter; Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. UV 스펙트럼은 분광계(Shimadzu UV-160A spectrometer ; Kyoto,Japan)를 이용하여 측정하였다. IR (KBr disk) 스펙트럼은 분광광도계(Mattson Genesis II; Madison, WI, USA, 및 Jasco-300 EFT-IR spectrophotometers; Tokyo, Japan)을 이용하여 측정하였다.

EI-MS 및 HR-FAB-MS는 분광계(Quattro II spectrometer; Micromass, Altrincham, UK)를 이용하여 수행하였다. NMR 스펙트럼은 기록장치(Varian OXFORD-AS400MHz instrument; Palo Alto, CA, USA)로 CD₃OD, CDCl₃ 및 C₅D₅N에 기록하였다.

실시예 1 : 불등가사리로부터 화합물의 분리

불등가사리 30 kg을 분쇄한 후, 이를 추출용매로 95% EtOH를 사용하여 80℃에서 추출한 다음, 용매를 제거하여 추출물 1.9kg을 수득하였다. 이를 헥산-H₂O(1:1) 사이에서 분획하여 n-헥산-가용성 분획(119.0g) 및 H₂O 용매를 수득하였다. 상기H₂O 용매를 CH₂Cl₂-H₂O(1:1) 사이에서 분획하여 CH₂Cl₂-가용성 분획 4.0g) 및 H₂O 용매를 수득하였다. 상기H₂O 용매를 EtOAc-H₂O(1:1) 사이에서 분획하여 EtOAc-가용성 분획(13.4g) 및 H₂O 용매를 수득하였다. 상기 H₂O 용매를 n-BuOH-H₂O(1:1) 사이에서 분획하여 n-BuOH-가용성 분획(38.8g) 및 H₂O 가용성 분획(1.4kg)을 수득하였다.

상기 EtOAc 가용성 분획(13.4 g)으로 헥산-아세톤 및 아세톤-MeOH 구배로 용리시키는 실리카겔(60 g) 위로 오픈 컬럽 크로마토그래피를 수행하였다. 다른 분획(GF-EA-A 내지 GF-EA-Y)은 유사한 TLC 패턴에 따라 수집하여 혼주하였다.

GF-EA-XY 분획(756 mg)을 MeOH-H₂O(15:85 내지 30:70 구배)로 역상 컬럼(2.0ㅧ50 cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 GF-EA-XY-1, GF-EA-XY-2 및 GF-EA-XY-20을 수득하였다. 상기 GF-EA-XY-2을 MeOH-H₂O(15:85)로 역상 컬럼(1.2ㅧ45cm, RP-C18)으로 정제하여 (R)-2-(3-hydroxy-5-oxotetrahydrofuran-3-yl)acetic acid (화합물 1, 20mg)을 수득하였다. GF-EA-XY-20을 MeOH-H₂O(15:85)로 역상 컬럼(1.2ㅧ45cm, RP-C18)으로 정제하여 니코틴산(화합물 4, 37mg)을 수득하였다. GF-EA-XY-1를 MeOH-H₂O(20:80)로 역상 컬럼(1.2ㅧ45cm, RP-C18)으로 정제하여 글리세롤(화합물 9, 50mg)을 수득하였다.

GF-EA-Q 분획(1.2g)을 MeOH-H₂O(15:85 내지 100:0의 구배로 역상 컬럼(2.0ㅧ40cm, RP-C18) 상에 크로마토그래피하여 GF-EA-Q-A 내지 GF-EA-Q-F로 분획하였다.

GF-EA-Q-B 및 GF-EA-R 분획을 재결정화시켜 각각 글루타르산(화합물 2, 50mg) 및 숙신산(3, 100mg)을 수득하였다. 분획 GF-EA-Q-C를 n-헥산-아세톤(5:1)을 이용한 실리카-상 컬럼(1.2ㅧ40cm)으로 크로마토그래피하여 7-hydroxycholesterol (화합물 7, 29mg)을 수득하였다.

GF-EA-Q-D 분획(80 mg)을 MeOH-H₂O(5:95 내지 30:70 구배)를 이용한 세파덱스 컬럼(1.5ㅧ70 cm, LH-20) 상에서 크로마토그래피하여 GF-EA-Q-D-3 및 GF-EA-Q-D-4을 수득하였다. 상기 GF-EA-Q-D-3(65mg)를 HPLC(Waters 600 pump, Waters 486 UV detector, PrepNova-PacHR-C 187.8ㅧ300mm column, MeOH:H₂O=15:85)로 정제하여 (E)-4-hydroxyhex-2-enoicacid(화합물 5, 10mg)을 수득하였다. 상기 GF-EA-Q-D-4(180mg)를 HPLC(Waters 600 pump, Waters 486 UV detector, PrepNova-PacHR-C187.8ㅧ300mm column, MeOH:H₂O=15:85)으로 정제하여 5-(hydroxymethyl)-2-methoxybenzene-1,3-diol(화합물 10, 50mg)을 수득하였다.

GF-EA-G 분획(50.1mg)을 MeOH-H₂O(20:80 내지 50:50 구배)를 이용한 역상 컬럼(1.5ㅧ50cm,RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 GF-EA-G-1를 수득하였다. 상기GF-EA-G-1(39mg)를 n-헥산-아세톤(5:2)을 이용한 실리카-상 컬럼(1.2ㅧ40cm)으로 정제하여 콜레스테롤(화합물 6, 29mg)을 수득하였다.

GF-EA-Z 분획(202.1 mg)을 n-헥산-아세톤(7:1)을 이용한 실리카-상 컬럼(1.5ㅧ70 cm) 상에서 크로마토그래피하여 GF-EA-Z-12를 수득하였다. 상기 GF-EA-Z-12(50mg)를 n-헥산-아세톤(4:1)을 이용한 실리카-상 컬럼(1.3ㅧ45cm) 상에서 정제하여 우리딘(화합물 8, 10mg)을 수득하였다.

CH₂Cl₂-가용성 분획(4.0g)을 n-헥산-아세톤 구배로 용리시키는 실리카겔(30g) 상에서 오픈 컬럼 크로마토그래피하였다. 분획(GF-MC-AtoGF-MC-U)을 TLC 패턴에 따라 수집하여 혼주하였다.

GF-MC-G(176mg)를 MeOH-H₂O(55:45)를 이용한 역상 컬럼(1.6ㅧ45cm,RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 GF-MC-G-1를 수득하였다. 상기 GF-MC-G-1를 n-헥산-아세톤(8:1)을 이용한 실리카-상 컬럼(1.5ㅧ45cm)으로 정제하여 (5E,7E)-9-oxodeca-5,7-dienoicacid(화합물 11, 25mg)를 수득하였다.

GF-MC-E(175mg)를 MeOH-H₂O(80:20)를 이용한 역상 컬럼(1.5ㅧ40cm,RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 GF-MC-E-2를 수득하였다. 상기 GF-MC-E-2을 n-헥산-아세톤(10:1)을 이용한 실리카-상 컬럼(1.2ㅧ40cm)으로 정제하여 (Z)-3-ethylidene-4-methylpyrrolidine-2,5-dione(화합물 12, 10mg)를 수득하였다.

GF-MC-E(466mg)를 MeOH-H₂O(60:40)를 이용한 역상 컬럼(2.0ㅧ45cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 GF-MC-F-3 및 GF-MC-F-4를 수득하였다. 상기 GF-MC-F-4를 MeOH-H₂O(75:25)를 이용한 역상 컬럼(1.2ㅧ40cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 데하이드로보미폴리올(화합물 13, 30mg)을 수득하였다. 상기 GF-MC-F-3을 MeOH-H₂O(75:25)을 이용한 역상 컬럼(1.2ㅧ40cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 롤리올라이드(화합물 14, 20mg)를 수득하였다.

n-헥산 가용성 분획(119.1g)을 n-헥산-아세톤 구배로 용리시키는 실리카겔(2.0kg) 상에어 플래쉬 컬럼 크로마토그래피하였다. 분획(GF-HE-AtoGF-HE-U)를 TLC 패턴에 따라 수집하여 혼주하였다.

GF-HE-C(12.0g)를 n-헥산-아세톤(10:1 내지 1:1 구배)을 이용한 실리카-상 컬럼(7.8ㅧ50cm) 상에서 크로마토그래피하여 GF-HE-C-1 및 GF-HE-C-4를 수득하였다. 상기 GF-HE-C-1을 MeOH-H₂O(75:25)를 이용한 역상 컬럼(1.2ㅧ40cm,RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 콜레스테릴스테아레이트(화합물 15, 5mg)를 수득하였다. 상기 GF-HE-C-4를 MeOH-H₂O(77:23)을 이용한 역상 컬럼(3.0ㅧ50cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 팔미트산(화합물 16, 4.0g)을 수득하였다.

GF-HE-D(6.0g) 및 GF-HE-E(6.1g)를 재결정화시켜 각각 1.0g 및 3.0g의 콜레스테롤(화합물 6)을 수득하였다. GF-HE-F (3.1 g)를 MeOH-H₂O(80:20)을 이용한 역상 컬럼(3.5ㅧ50 cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 GF-HE-F-11 및 GF-HE-F-13을 수득하였다. 상기 GF-HE-F-13을 MeOH-H₂O(76:24)를 이용한 역상 컬럼(2.4ㅧ40cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (화합물 17, 60mg)을 수득하였다. 상기GF-HE-F-11를 MeOH-H₂O(75:25)를 이용한 역상 컬럼(1.5ㅧ40cm, RP-C18) 상에서 크로마토그래피하여 α-리놀렌산(화합물 18, 45mg)을 수득하였다.

화합물 1: [α]: -10.8ㅀ (c=0.10,MeOH). UV λ_max(MeOH)nm(logε):210(2.41), 247(1.77). IR(KBr)cm^-1:3444(O-H), 2930(C-H), 1067(C-O), 1719(C=O), 1636(C=O). EI-MS m/z:160[M]⁺, 142[M-H₂O]⁺. FAB-MS m/z:161[M+H]⁺. HR-FAB-MS m/z:161.0448[M+H]⁺(calcd.for C₆H₉O₅:161.0450). ¹H-NMR(CD₃OD, 400MHz) δ:2.63(1H, d, J=17.4 Hz, H-2a), 2.72(1H, d, J=16.0 Hz, H-4′a), 2.78(1H, d, J=16.0 Hz, H-4′b), 2.84(1H, d, J=17.4 Hz, H-2b), 4.30(1H, d ,J=10.0 Hz, H-2′a), 4.38(1H, d, J=10.0 Hz, H-2′b). ¹³C-NMR(CD₃OD,100MHz) δ:41.7(C-2,-4′), 74.4(C-3′), 78.7(C-2′), 172.4(C-5′), 177.1(C-1).

화합물 11: [α]: 0.6ㅀ (c=0.10,MeOH); UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 209 (2.20), 265 (1.76). IR (KBr) cm^-1:3434(O-H), 2921(C-H), 1719(C=O), 1654(C=O), 1077(C-O). FAB-MS m/z:183.1[M+H]⁺, 165.2[M-H₂O]⁺. HR-FAB-MS m/z:183.1021[M+H]⁺(calcd.for C₁₀H₁₄O₃:183.1023). ¹H-NMR(CDCl₃,400MHz) δ: 7.10 (1H, dd, J=15.2, 10.0Hz, H-7), 6.19(1H, td, J=15.2, 7.2Hz, H-5), 6.18(1H, dd, J=15.6, 10.0Hz, H-6), 6.10(1H, d, J=15.6Hz, H-8), 2.39(2H, t, J=7.2Hz, H-2), 2.25~2.30(2H, m, H-4), 2.28(1H, s, H-10), 1.80(2H, quintet, J=7.2Hz, H-3). ¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz) δ: 199.3 (C-9), 179.1 (C-1), 144.0 (C-5), 143.9 (C-7), 130.0 (C-6), 129.5 (C-8), 33.4 (C-2), 32.4 (C-4), 27.4 (C-10), 23.8 (C-3).

실험예 1 : DPPH 라디칼 소거 활성 측정

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 분리한 각 화합물에 대해 종래 블로이스(Blois)의 방법[Blois M. S., Nature, 181,1199-1200 (1958)]을 변형하여 DPPH 라디칼 소거 효과를 평가하였다. 하기에 지시된 바와 같이 DPPH를 환원시킨 후, 반응 동안 특정 파장에서의 흡수능 감소를 모니터링하였다. DPPH는 라디칼 형태에서는 520nm에서 흡수되지만 항산화제 또는 라디칼 종에 의한 환원 후에는 상기 흡수능이 사라진다.

MeOH 용액(최종 농도 50μg/ml) 160mL를 DPPH 메탄올 용액(1.5ㅧ10^-4M) 40 μL에 가하였다. 혼합물을 가볍게 교반하고 실온에서 30분 동안 정치시킨 후, 마이크로플레이트 리더 분광광도계 VERSAmax(Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 530nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 각 시료의 항산화 활성을 로그-용량 저해 곡선으로부터 계산된 IC₅₀(DPPH 라디칼 형성을 50% 저해하는데 필요한 양, μg/ml) )으로 환산하여 나타내었다. l-아스코르브산을 양성 대조군으로 이용하였다.

실험예 2 : ONOO ^- 소거활성 측정

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 분리한 각 화합물에 대해 쿠이(Kooy) 등의 방법[Kooy N. W., Royall J. A., Ischiropoulos H., Beckman S. J., Free Radic. Biol. Med., 16, 149-156 (1994)]을 변형하여 DHR 123의 산화를 모니터링함으로써 ONOO^- 소거 활성을 측정하였다. 원료 용액으로 질소를 충전한 디메틸포름아미드 중 DHR 123 (5 mM)를 -80℃에서 보관하였다. 이어서 상기 용액을 사용 전까지 얼음 속에서 직사광선을 피해 보관하였다. 시료를 10% DMSO (f.c. 50μg/ml)에 용해시켰다. 사용된 완충액은 pH 7.4에서 90 mM 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, 5 mM 염화칼륨 및 100 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)로 이루어져 있으며, 이들은 고순도 탈이온수로 제조되었고 질소 충전되었다. DHR 123의 최종 농도는 5 mM이었다. 인증된 ONOO^-의 첨가 또는 첨가하지 않은 상태에서 5분 후 배경 및 최종 형광 강도를 측정하였다.

DHR 123는 인증된 ONOO^-,에 의해 빠르게 산화되었으며, 그의 최종 형광 강도는 변하지 않고 남아있었다. 산화된 DHR 123의 형광 강도를 각각 480nm 및 530nm의 여기 및 방출 파장에서 마이크로플레이트 형광 리더기(microplate fluorescence reader; FL 500, Bio-Tek Instruments)로 측정하였다.

상기 결과를 최종 형광 강도에서 배경 형광 강도를 빼 평균 ㅁ SEM (n=3)으로 나타내었다. 효과는 DHR 123의 산화 저해율(%)로서 나타내었다. 페니실라민을 양성 대조군으로 사용하였다.

실험예 3 : 콜린에스테라아제 저해 활성 측정

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 분리한 각 화합물에 대해 ChEs에 대한 저해 활성을 엘만 등의 분광광도법으로 측정하였다.

ACh(아세틸콜린) 및 BCh(부티릴콜린)을 각각 AChE 및 BChE의 저해 활성 분석을 위한 기재로 사용하였다. 인산나트륨 완충액(pH8.0) 140μl, 시험 시료 용액 20μl 및 AChE 또는 BChE 용액 20μl으로 반응 혼합물을 구성하고, 이를 혼합하여 실온에서 15분 동안 배양하였다. 각각 DTNB 10μl 및 ACh 또는 BCh 10μl를 가하여 반응을 개시하였다. 각각 ACh 또는 BCh의 효소적 가수분해에 의해 방출된 DTNB와 티오클로라인의 반응에서 생성된, 황색 5-티오-2-니트로벤조에이트 음이온이 형성된 후, 412nm에서 15분 동안 ACh 또는 BCh의 가수분해를 모니터링하였다. 시험 시료와 양성 대조군(갈란타민)을 10% 분석등급 에탄올에 용해시켰다. 모든 반응은 VERSA max(Molecular Devices, CA, U.S.A.)를 이용하여 96-웰 플레이트에서 3회 수행하였다. 저해율(%)을 하기 식으로 계산하였다:

(E-S)/E×100

상기 식에서, E는 시험 시료 없는 효소 활성을 나타내며, S는 시험 시료를 포함한 효소 활성을 나타낸다.

각 시료의 ChEs 저해 활성을 로그-용량 저해 곡선으로부터 계산된 IC₅₀(기질 ACh 또는 BCh의 가수분해를 50% 저해하는데 필요한 양, μg/ml) )으로 환산하여 나타내었다.

상기 실험예 1 내지 3을 통해 하기 표 1과 같은 결과를 얻었다.

<표 1>

Claims

불등가사리 유래 하기 화학식 11의 화합물 (5E, 7E)-9-옥소데카-5,7-디엔산[(5E, 7E)-9-oxodeca-5,7-dienoic acid] 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
<화학식 11>
하기 화학식 1 내지 18의 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
<화학식 1>

2-(3-하이드록시-5-옥소테트라하이드로푸란-3-일) 아세트산
[2-(3-hydroxy-5-oxotetrahydrofuran-3-yl) acetic acid]
<화학식 2>

글루타르산(glutaric acid)
<화학식 3>

숙신산(succinic acid)
<화학식 4>

니코틴산(nicotinic acid)
<화학식 5>

(E)-4-하이드록시헥스-2-엔산 [(E)-4-hydroxyhex-2-enoicacid]

<화학식 6>

콜레스테롤(cholesterol)
<화학식 7>

7-하이드록시콜레스테롤(7-hydroxycholesterol)
<화학식 8>

우리딘(uridine)
<화학식 9>

글리세롤(glycerol)
<화학식 10>

5-(하이드록시메틸)-2-메톡시벤젠-1,3-디올
[5-(hydroxymethyl)-2-methoxybenzene-1,3-diol]
<화학식 11>

(5E, 7E)-9-옥소데카-5,7-디엔산
[(5E, 7E)-9-oxodeca-5,7-dienoic acid]
<화학식 12>

(Z)-3-에틸레딘-4-메틸피롤리딘-2,5-디온
[(Z)-3-ethylidene-4-methylpyrrolidine-2,5-dione]
<화학식 13>

데하이드록보니폴리올(dehydrovomifoliol)
<화학식 14>

롤리올라이드(loliolide)
<화학식 15>

콜레스테릴스테아레이트(cholesterylstearate)
<화학식 16>

팔미트산(palmitic acid)
<화학식 17>

cis-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid)
<화학식 18>

α-리놀렌산(α-linolenic acid)
상기 제2항에 따른 화학식 1 내지 18의 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.