KR20110111155A - An long-acting preparation of calcitonin using an immunoglobulin fragment - Google Patents

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임성인
박성희
이종수
임창기
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Abstract

본 발명은 칼시토닌, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결된 칼시토닌 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 칼시토닌 지속성 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 칼시토닌 지속성 제제는 칼시토닌의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다.The present invention relates to a calcitonin sustained preparation having improved sustainability and stability in vivo, including a calcitonin conjugate comprising a calcitonin, a non-peptidyl polymer and an immunoglobulin Fc region covalently linked to each other, and a method for preparing the same. The calcitonin long-acting formulation of the present invention has an effect of maintaining relatively high in vivo activity of calcitonin and significantly increasing blood half-life.

Description

면역글로불린 단편을 이용한 칼시토닌 지속성 제제 {An long-acting preparation of calcitonin using an immunoglobulin fragment}An long-acting preparation of calcitonin using an immunoglobulin fragment}

본 발명은 칼시토닌, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결된 칼시토닌 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 칼시토닌 지속성 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 칼시토닌 지속성 제제는 칼시토닌의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다.
The present invention relates to a calcitonin sustained preparation having improved sustainability and stability in vivo, including a calcitonin conjugate comprising a calcitonin, a non-peptidyl polymer and an immunoglobulin Fc region covalently linked to each other, and a method for preparing the same. The calcitonin long-acting formulation of the present invention has an effect of maintaining relatively high in vivo activity of calcitonin and significantly increasing blood half-life.

펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 펩타이드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되며, 따라서 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위하여 자주 주사하게 되는데, 이는 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 다양한 시도가 있어왔으며, 그 중 하나로 펩타이드의 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드의 약물을 체내로 전달하는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩타이드의 체내 전달 효율이 현저히 낮으며 따라서 펩타이드 약물의 체내 활성을, 요구되는 조건으로 유지하는데 아직까지는 어려움이 많다.Peptides generally have low stability, are easily denatured, degraded by proteolytic enzymes in the body, and lose their activity. Also, since peptides are relatively small and easily removed through the kidney, they are easily removed by the kidneys. To maintain titers, peptide drugs need to be frequently administered to patients. Peptide drugs, however, are mostly administered to patients in the form of injections, and therefore are frequently injected to maintain blood levels of bioactive peptides, which causes tremendous pain in the patient. Various attempts have been made to overcome this problem, and one of them has been an attempt to deliver the drug of the peptide into the body by inhalation through oral or nasal passages by increasing the biomembrane permeability of the drug of the peptide. However, this method is significantly lower in the body's delivery efficiency of the peptide compared to the injection and thus it is still difficult to maintain the body activity of the peptide drug in the required conditions.

펩타이드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔는데, 이러한 펩타이드 약물의 지속성 제제는 펩타이드 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.Efforts have been made to maximize the efficacy of peptide drugs by increasing their blood stability and by maintaining high blood drug concentrations for a long time. Such long-acting formulations of peptide drugs must increase the stability of the peptide drug and at the same time keep the titer of the drug itself high enough. Do not cause an immune response in the patient.

한편, 칼시토닌은 32개의 아미노산 잔기를 가지는 펩타이드 호르몬으로서, 1962년 Copp 와 Cheney에 의해서 처음 발견 되었다(Nature 1962;193:381-2). Calcitonin, on the other hand, is a peptide hormone with 32 amino acid residues, first discovered by Copp and Cheney in 1962 (Nature 1962; 193: 381-2).

사람에게서 칼시토닌의 분비는 혈중 칼슘과 인의 수준을 감소시키고, 뼈의 형성을 돕는 역할을 하는데, 칼시토닌은 세포표면상의 칼시토닌 수용체를 통하여 파골세포(oeteoclast)에 작용하여 파골세포의 활성을 막아 파골세포성 골의 흡수를 직접적으로 저해한다. 이는 골아세포(osteoblast)의 활성을 촉진시켜 뼈의 밀도 및 기능을 증가시키는 특성을 가진다. 이런 특성으로 인하여 칼시토닌은 골다공증 및 파제트 병을 포함하는 다양한 골질환을 치료하는데 유용하게 이용되고 있다(T.J. martin, 1999). In humans, the secretion of calcitonin reduces the levels of calcium and phosphorus in the blood and helps bone formation. Calcitonin acts on osteoclasts through the calcitonin receptors on the cell surface, blocking osteoclast activity, leading to osteoclast activity. Directly inhibits bone absorption. It has the property of promoting the activity of osteoblasts (osteoblast) to increase the density and function of bone. Because of this property, calcitonin is useful for treating various bone diseases including osteoporosis and Paget's disease (T. J. martin, 1999).

구조적으로 칼시토닌은 32개의 아미노산의 단일 사슬로, 아미노 말단의 1번 아미노산과 7번 아미노산 사이의 이황화 결합(disulfide bridge)으로 연결되어 있으며, 카복실 말단의 아미드화 된 프롤린아미딜 잔기(prolinamidyl residue)를 가지고 있다. 칼시토닌의 아미노산 서열은 종마다 다양하지만 아미노 말단의 이황화 결합 부근의 8개의 아미노산 잔기는 엄격하게 보존되어 있고 호르몬의 기능에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(E.J. Visser, 2005).Structurally, calcitonin is a single chain of 32 amino acids that is linked by a disulfide bridge between amino acids 1 and 7 at the amino terminus, and the carboxylated amidated prolinamidyl residue Have. The amino acid sequence of calcitonin varies from species to species, but the eight amino acid residues near the amino-terminal disulfide bonds are strictly conserved and are known to play an important role in hormone function (EJ Visser, 2005).

포유동물에서 칼시토닌은 갑상선 C 세포에서 주로 분비되며, 폐, 장관 같은 다른 조직에서도 합성된다. 또한 연어, 뱀장어 등에서도 합성된다고 보고되고 있다. 특히 연어에서 합성되는 칼시토닌은 구조적인 특성상 칼시토닌 수용체에 대한 결합 친화도가 높아 사람 유래의 천연형 칼시토닌에 비하여 30~50배 이상의 효능을 가지고 있다고 알려져 있다(E.J. Visser, 2005, pipline insight:osteoorosis, datamoniter). In mammals, calcitonin is secreted mainly in thyroid C cells and synthesized in other tissues such as the lungs and intestines. It is also reported to be synthesized in salmon and eel. In particular, calcitonin synthesized in salmon is known to have 30 to 50 times more efficacy than human-derived calcitonin due to its structural affinity for calcitonin receptor (EJ Visser, 2005, pipline insight: osteoteoosis, datamoniter). ).

또한 칼시토닌은 현재 재조합 DNA 기술을 이용하여 대장균으로부터 생산되고 있다. 대장균에는 카복실말단의 프롤린 잔기를 아미드화 시키는 효소가 존재하지 않기 때문에, 재조합 칼시토닌은 글리이신 융합 단백질(calcitonin-glycine fusion protein)의 형태로 대장균에서 발현 된다. 그 후, 재조합 CHO 세포주에서 발현 된 아미드화 효소, 펩티딜-글리이신 알파-아미데이팅 모노옥시제네이즈 (peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase; PAM)를 이용하여 글라이신 잔기(Gly-COOH)를 제거하고 아미드화를 시킨다. 이런 재조합 칼시토닌은 합성 된 칼시토닌과 동일한 서열과 구조를 가지며, 약제학적으로 동일하거나 동등한 수준을 나타낸다. 이는 Unigene 사가 가지고 있는 미국 특허 US 6,319,685, US 4,708,934, 그리고 US 5,789,234에 기술되어 있다.Calcitonin is also currently produced from E. coli using recombinant DNA technology. Recombinant calcitonin is expressed in E. coli in the form of a calcitonin-glycine fusion protein because E. coli does not have an enzyme that amidates a proline residue at the carboxyl end. Then, glycine residues (Gly-COOH) were removed using amidation enzyme, peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM), expressed in a recombinant CHO cell line. Amidation is carried out. Such recombinant calcitonin has the same sequence and structure as the synthesized calcitonin and shows pharmaceutically identical or equivalent levels. This is described in US Pat. Nos. 6,319,685, US 4,708,934, and US 5,789,234 to Unigene.

칼시토닌은 크기와 화학적 조성으로 인하여 조직 내로 흡수가 잘 되지 않고 체액에 의해 쉽게 분해되기 때문에 투여 방법의 개발이 쉽지 않아 주로 정맥주사나 피하주사로 투여되어 왔다. 이런 주사 투여 방법은 규칙적으로 투여해야 하며, 투여 시 주사 부위에서 통증, 홍조(flushing), 및 메스꺼움(nausea)을 포함한 부작용이 보고되고 있어 환자에게 불편함과 고통을 주고 있다(Eric J. Visser, 2005). Since calcitonin is not easily absorbed into tissues due to its size and chemical composition and is easily decomposed by body fluids, it is not easy to develop a method of administration. These injection methods should be administered regularly, and side effects including pain, flushing, and nausea have been reported at the injection site, causing discomfort and pain to patients (Eric J. Visser, 2005).

이런 단점을 극복하고 또한 효과적인 치료에 충분한 수준의 생물학적 이용가능성을 가진 투여 방법의 개발은 지난 수년간 진행 되어 왔으며, 현재 비강에 의하여 코의 점막으로 투여되는 방법이 개발되었다. 현재 골다공증 증상 치료를 위하여 코에 분무기 형태로 호르몬을 투여하는 방법이 승인되었으며, 호르몬을 투여할 때 신체에서 골 조직을 흡수하는 과정을 차단함으로써 치료 효과를 보고 있다. US 5,759,565와 US 6,440,392는 칼시토닌의 비강 투여(nasal administration)를 위한 제형 및 응용에 대해 기술하고 있다. 연어 칼시토닌 제형의 Novatis 사의 Miacalcin과 Unigene사의 Fortical이 현재 이용할 수 있는 승인된 약물이다.Overcoming these shortcomings and developing a method of bioavailability with sufficient levels of bioavailability for effective treatments has been underway for several years, and a method of administration to the nasal mucosa by the nasal cavity has been developed. Currently, a method of administering hormones in the form of a nebulizer to the nose has been approved for the treatment of osteoporosis symptoms, and the hormone effects the treatment by blocking the process of absorbing bone tissue from the body. US 5,759,565 and US 6,440,392 describe formulations and applications for nasal administration of calcitonin. It is an approved drug currently available from Novia's Miacalcin in salmon calcitonin formulation and Fortical from Unigene.

이런 비강(nasal route) 투여 방법은 간단하고 환자 스스로도 고통 없이 투여할 수 있는 방법을 제공하여 기존의 주사 투여 보다는 확실하게 선호 되고 있지만 , 미생물 및 병원균에 의한 오염, 안정성 및 내구성등 비강 투여에 알맞은 조성물을 준비하는데 어려움이 있다. 그리고 코의 점막에 분무기 형태로 호르몬을 투여하면 조직에 염증을 유발할 수 있는 부작용으로 인하여, 경구로 투여하는 방법이 개발되고 있다( Arthritis & Rheumatism, October 2006). This nasal route administration method is a simple and painless administration method that is clearly preferred over conventional injection administration, but is suitable for nasal administration such as contamination, stability and durability by microorganisms and pathogens. Difficult to prepare In addition, the administration of hormones in the form of a nebulizer to the mucous membrane of the nose causes inflammation in tissues, resulting in oral administration (Arthritis & Rheumatism, October 2006).

일반적으로 경구 투여가 선호됨에도 불구하고 경구로 칼시토닌 약물을 투여하는데 문제점 중 하나는 이 효소가 위장의 단백질 분해효소에 의해 불활성화되고, 이 약물의 분자량이 크며 전하가 분포되어 있어 내장벽을 통해 혈류로 약물이 통과하는 것이 쉽지 않다는 것이다. 이런 문제점을 해결하기 위해선 칼시토닌에 물리 화학적인 변형이나 보호가 필요하다.Although oral administration is generally preferred, one of the problems with oral administration of calcitonin drugs is that these enzymes are inactivated by gastrointestinal proteases, which have a high molecular weight and a charge distribution, which leads to blood flow through the visceral wall. The drug is not easy to pass. To solve this problem, physicochemical modification or protection of calcitonin is required.

경구 투여를 위한 칼시토닌의 변형 방법 중의 하나로, Unigene Laboratories는 칼시토닌과 같은 펩타이드 약물을 위장의 단백질 분해효소로부터 일시적으로 보호하는 특허를 가지고 있다. 이는 장내 분해효소가 제 기능을 하기에 필요한 것보다 낮은 장내 pH를 일시적으로 만들어 약물이 장내에서 흡수되는 것을 향상시키는 것이다. WO 02/072075, WO 02/043767에 따르면 장용정(enteric-coated) 캡슐에 장내 pH를 낮추기 위한 citric acid, 흡수 촉진제인 taurodeoxycholic acid 및 lauroylcarnitine와 칼시토닌을 포함하여 경구 투여할 경우 생체 이용률 (bioavailability)은 칼시토닌 단독 투여에 비해 10배나 증가한다고 한다. As one of the modifications of calcitonin for oral administration, Unigene Laboratories has a patent that temporarily protects peptide drugs such as calcitonin from gastrointestinal proteases. This temporarily creates lower intestinal pH than is needed for the intestinal lyase to function, thereby improving the absorption of the drug in the intestine. According to WO 02/072075 and WO 02/043767, the bioavailability of calcitonin when orally administered in enteric-coated capsules includes citric acid to reduce intestinal pH, taurodeoxycholic acid as an absorption promoter, and lauroylcarnitine and calcitonin It is 10 times higher than single administration.

또 다른 방법으로는 신장 소실과 효소에 의한 분해를 억제하기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG) 과 같은 용해도가 높은 고분자 물질을 펩타이드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되고 있다. As another method, a method of chemically adding a high solubility high molecular material such as polyethylene glycol (PEG) to the surface of a peptide is used to suppress kidney loss and degradation by enzymes.

PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, US 4,179,337 은 칼시토닌에 PEG를 결합하여 생리 활성 지속 및 막의 투과성을 높이는 것에 대해 기술하고 있으며, WO2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며 따라서 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가펩타이드(B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있다. 또한 US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.PEG is non-specifically bound to a specific site or various sites of the peptide of interest to increase the molecular weight of the peptide to suppress the loss by kidneys and to prevent hydrolysis and does not cause any special side effects. For example, US 4,179,337 describes PEG binding to calcitonin to increase physiological activity persistence and membrane permeability, and WO2006 / 076471 binds to NPR-A to activate cGMP production to reduce arterial blood pressure and thus It describes the binding of PEG to B-type natriuretic peptide (BNP), which is used as a treatment for congestive heart failure, to maintain physiological activity. US 6,924,264 also describes a method of increasing PEG in vivo duration by binding PEG to lysine residues of exendin-4. However, this method can extend the in vivo duration of the peptide drug by increasing the PEG molecular weight, while the titer of the peptide drug is significantly lowered as the molecular weight is increased, and also the yield is reduced due to the low reactivity with the peptide. .

이 밖에 덱스트란, 폴리 아미노산등 기타 다른 폴리머를 결합시키는 방법과 칼시토닌 서열내의 단백질 분해 효소에 민감한 특정 아미노산 서열을 변경하거나 제거하는 방법(US 6,617,423, US 6,410,707) 그리고 용액내에서의 안정성을 주기 위하여 이황화 결합(disulfide bridge)을 제거하는 시도 등이 있어 왔다(US 5,977,298, US 4,804,742).Other methods include combining dextran, polyamino and other polymers, altering or removing specific amino acid sequences sensitive to proteolytic enzymes in calcitonin sequences (US 6,617,423, US 6,410,707), and disulfide to give stability in solution. Attempts to remove disulfide bridges have been made (US 5,977,298, US 4,804,742).

사람의 칼시토닌은 혈액 내에서 약 60분 정도의 반감기를 가지고 있으며, 연어의 칼시토닌은 60~90분의 반감기를 가지고 있다(E.J. Visser, 2005). 칼시토닌의 생물학적 반감기가 짧기 때문에, 그와 같은 짧은 지속시간의 문제점을 해결하기 위하여 활성이 오래 지속되는 칼시토닌 유도체가 개발되어 왔다. 휴먼지놈사이언스 사(HGC)는 칼시토닌의 반감기를 증가시키기 위하여 자체의 펩타이드 및 단백질에 알부민을 결합시키는 기술을 이용하여 칼시토닌에 알부민을 융합시킨 알부토닌(albutonin)이라는 칼시토닌 유도체의 개발을 시도하였다. 또한 Journal of phamaceutical Sciences, 74 는 용액 내에서 칼시토닌-알부민 결합체에 아연을 첨가하여 늘어 난 생물학적 활성 지속기간에 대해 기술하고 있다. Human calcitonin has a half-life of about 60 minutes in the blood, and salmon calcitonin has a half-life of 60 to 90 minutes (E.J. Visser, 2005). Because of the short biological half-life of calcitonin, long-lasting calcitonin derivatives have been developed to solve such short duration problems. Human Genome Science Co., Ltd. (HGC) has attempted to develop a calcitonin derivative called albutonin (albutonin) in which albumin is fused to calcitonin using a technique of binding albumin to its peptide and protein to increase the half-life of calcitonin. The Journal of phamaceutical Sciences, 74, also describes the extended biological activity duration by adding zinc to calcitonin-albumin conjugates in solution.

이에, 본 발명자들은 칼시토닌의 혈중반감기 증가 및 생체 내 활성유지를 동시에 극대화할 수 있는 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 칼시토닌 유도체를 공유 결합에 의해 부위 선택적으로 상호 연결시키는 제조방법을 사용하였고, 펩타이드 결합체의 생체 내 효력 지속 효과가 획기적으로 증가됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors use a manufacturing method for site-selectively interconnecting immunoglobulin Fc regions, non-peptidyl polymers and calcitonin derivatives by covalent bonds in a manner that can simultaneously maximize blood half-life and maintain in vivo activity of calcitonin. And it was confirmed that the effect of sustaining the effect of the peptide conjugate in vivo significantly and completed the present invention.

본 발명의 목적은 칼시토닌의 생체 내 활성을 유지하면서 혈중 반감기를 연장시키는 효과가 월등히 우수한 칼시토닌 지속성 제제, 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a calcitonin sustained preparation, and a method for producing the same, having an excellent effect of prolonging blood half-life while maintaining calcitonin in vivo.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 칼시토닌 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 칼시토닌 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 칼시토닌의 지속성 제제에 관한 것이다.
As one aspect for achieving the above object, the present invention relates to a sustained preparation of calcitonin with increased in vivo persistence and stability, wherein the calcitonin and immunoglobulin Fc region comprises a calcitonin conjugate linked through a non-peptidyl linker.

본 발명의 칼시토닌은 칼슘과 인의 대사에 관여하는 펩타이드로서, 파골세포의 활성을 저해하여 골의 변형을 막고 골 밀도를 증가시키는 기능을 가진다. 본 발명의 칼시토닌은 바람직하게는 사람 칼시토닌, 연어 칼시토닌 그리고 이와 유사한 서열을 포함한다.Calcitonin of the present invention is a peptide involved in the metabolism of calcium and phosphorus, and has the function of inhibiting osteoclast activity to prevent bone deformation and increase bone density. The calcitonin of the invention preferably comprises human calcitonin, salmon calcitonin and similar sequences.

사람 칼시토닌과 연어 칼시토닌은 서로 약 50%의 아미노산 서열 유사성을 가지지만, 생리학적으로 체내 칼슘의 흐름을 조절하고 파골세포의 수와 활성을 감소시켜 뼈의 재흡수를 저해하는 동일한 기능을 보유한다. 사람 칼시토닌과 연어 칼시토닌의 아미노산 서열은 아래와 같다.Although human calcitonin and salmon calcitonin have about 50% amino acid sequence similarity with each other, they have the same physiological function of inhibiting bone resorption by regulating the flow of calcium in the body and reducing the number and activity of osteoclasts. The amino acid sequences of human calcitonin and salmon calcitonin are as follows.

사람 칼시토닌 (Human-calcitonin)Human calcitonin (Human-calcitonin)

CGNLS TCMLG TYTQD FNKFH TFPQT AIGVG AP
CGNLS TCMLG TYTQD FNKFH TFPQT AIGVG AP

연어 칼시토닌 (Salmon calcitonin)Salmon calcitonin

CSNLS TCVLG KLSQE LHKLQ TYPRT NTGSG TP
CSNLS TCVLG KLSQE LHKLQ TYPRT NTGSG TP

본 발명에 사용되는 칼시토닌은, 사람 칼시토닌 또는 연어 칼시토닌일 수 있으며, 또한 사람 칼시토닌 또는 연어 칼시토닌과 최소한 80% 이상 아미노산 서열의 상동성을 보이는 펩타이드로서, 화학적으로 수식된 형태이거나 칼시토닌 수용체와 결합하여 체내 칼슘의 흐름을 조절하고 골아세포(osteoblast)를 자극하여 골의 합성 및 골 밀도를 증가시키는 펩타이드일 수 있다.The calcitonin used in the present invention may be human calcitonin or salmon calcitonin, and is a peptide showing homology of at least 80% or more amino acid sequence with human calcitonin or salmon calcitonin, and is chemically modified or binds to the calcitonin receptor in the body. It may be a peptide that regulates the flow of calcium and stimulates osteoblasts to increase bone synthesis and bone density.

또한, 본 발명의 칼시토닌은 칼시토닌 아고니스트(agonist), 전구물질(precursors), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다. The calcitonin of the present invention also includes calcitonin agonists, precursors, derivatives, fragments, variants and the like.

칼시토닌 아고니스트는 칼시토닌 수용체와 결합하여 천연형 칼시토닌과 동일한 혹은 유사한 생리활성을 일으키는 물질을 말한다. 칼시토닌 단편은, 칼시토닌의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 펩타이드를 의미하며, 이 때 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산) 도 가능하다. 칼시토닌 변이체는 하나 이상의 아미노산이 치환된 펩타이드를 의미하며 천연형 아미노산 이외에 비 천연형 아미노산의 치환도 가능하다. 칼시토닌 유도체는 체내 칼슘의 흐름을 조절하고 골아세포(osteoblast)를 자극하여 골의 합성 및 골 밀도를 증가시키는 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며 아미노산의 acylation, alkylation등 화학적 수식을 포함한다 . Calcitonin agonists refer to substances that bind to calcitonin receptors and produce the same or similar physiological activity as native calcitonin. Calcitonin fragment refers to a peptide in which one or more amino acids are added or deleted at the amino terminus or carboxy terminus of calcitonin, wherein the added amino acid may be an amino acid (eg, a D-type amino acid) that does not exist in nature. Calcitonin variants refer to peptides in which one or more amino acids are substituted and non-natural amino acids can be substituted in addition to the natural amino acids. Calcitonin derivatives are peptides that have the function of regulating the flow of calcium in the body and stimulating osteoblasts to increase bone synthesis and bone density, and include chemical modifications such as acylation and alkylation of amino acids.

구체적인 일 양태로서 본 발명에서 사용한 칼시토닌은 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 아미노산을 이용한 칼시토닌 유도체는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.As a specific embodiment, the calcitonin used in the present invention may be synthesized through a solid phase synthesis method, and a calcitonin derivative using a natural amino acid may be produced by a recombinant method.

또한, 본 발명에서 사용된 칼시토닌은 다양한 부위에서 비펩타이드성 중합체와 결합될 수 있다. 예를 들어, 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와도 공유결합을 형성할 수 있다. 반응 pH를 달리하며 페길화(PEGylation) 반응을 진행한 후, 이온교환 컬럼을 사용하여 반응 혼합물로부터 위치이성질체를 분리할 수 있다. In addition, the calcitonin used in the present invention may be combined with the non-peptidyl polymer at various sites. For example, the aldehyde reactor selectively reacts to the amino terminus at low pH, and can form covalent bonds with lysine residues at high pH, for example pH 9.0 conditions. After the PEGylation reaction with different reaction pHs, the regioisomer can be separated from the reaction mixture using an ion exchange column.

두 개의 시스테인(Cystein) 잔기가 disulfide bond를 형성하여 만들어진 고리구조 이외의 위치에 커플링 할 경우, 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 말레이미드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있으며, 혹은 아미노산 잔기 위치에 반응성 있는 아민 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 알데히드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다. When two cysteine residues are coupled to a position other than the ring structure formed by forming a disulfide bond, the maleimide linker of the non-peptidyl polymer is introduced by introducing a reactive thiol group at the amino acid residue position to be modified in the amino acid sequence. Covalent bonds can be formed, or reactive amine groups can be introduced at amino acid residue positions to form covalent bonds using aldehyde linkers of non-peptidyl polymers.

비펩타이드성 중합체에 알데히드 링커를 사용하면 아미노 말단과 라이신 잔기에 있는 아민 그룹과 반응하며, 선택적으로 반응수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 칼시토닌 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 아미노말단을 블러킹하는 방법, 라이신 잔기 치환 방법, 카르복시 말단에 아민 그룹을 도입 방법 등을 사용하여 반응할 수 있는 아민 그룹을 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 페길화 및 커플링 수율을 향상시킬 수 있다. 아미노 말단의 보호방법은 디메틸화 (dimethylation) 외에 메틸화(methylation), 탈아미노화(deamination), 아세틸화(acetylation) 방법으로도 가능하며, 이러한 알킬화(alkylation) 방법에 한정되지 않는다. The use of aldehyde linkers in non-peptidyl polymers reacts with amine groups at the amino terminus and lysine residues, and can optionally use modified forms of calcitonin derivatives to improve reaction yield. For example, it is possible to maintain only one amine group at a desired position by using a method of blocking the amino terminus, a lysine residue substitution method, a method of introducing an amine group at the carboxy terminus, and the like. Can be improved. In addition to dimethylation, the amino terminal may be protected by methylation, deaminoation, and acetylation, and is not limited to the alkylation method.

구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 아미노 말단에 선택적으로 커플링하기 위한 방법으로, 칼시토닌에 PEG를 결합시킬 때 pH 5.2로 반응시켜 아미노 말단으로 페길화 반응을 유도하는 방법을 사용하였다.
As a specific example, the present inventors used a method for selectively coupling to the amino terminus, when PEG is bonded to calcitonin to pH 5.2 to induce a PEGylation reaction at the amino terminus.

면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분을 제거함으로써 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.Because immunoglobulin Fc regions are biodegradable polypeptides that are metabolized in vivo, they are safe for use as carriers of drugs. In addition, the immunoglobulin Fc region is advantageous in terms of preparation, purification and yield of the conjugate because of its relatively low molecular weight compared to the whole immunoglobulin molecule, as well as eliminating Fab moieties that exhibit high heterogeneity because the amino acid sequence varies from antibody to antibody. This can be expected to increase significantly and to reduce the likelihood of inducing blood antigenicity.

본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge)부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명 의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH 3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수 도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.In the present invention, the "immunoglobulin Fc region" refers to the heavy chain constant region 2 (CH2) and the heavy chain constant region 3, except for the heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region (CL1) of the immunoglobulin (CH3) portion, and may include a hinge portion in the heavy chain constant region. In addition, as long as the immunoglobulin Fc region of the present invention has a substantially equivalent or improved effect as the natural type, except for the heavy and light chain variable regions of the immunoglobulin, some or all heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant region It may be an extended Fc region including 1 (CL1). It may also be a region from which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and / or CH3 have been removed. In other words, the immunoglobulin Fc region of the present invention comprises (1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, (2) CH1 domain and CH2 domain, (3) CH1 domain and CH3 domain, (4) CH2 domain and CH3 Domain, (5) a combination of one or two or more domains with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), (6) heavy chain constant region and a dimer of each domain and light chain constant region.

또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.In addition, the immunoglobulin Fc regions of the present invention include not only native amino acid sequences but also sequence derivatives thereof. Amino acid sequence derivatives mean that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. For example, for IgG Fc amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331 which are known to be important for binding can be used as suitable sites for modification. In addition, various kinds of derivatives are possible, such as a site capable of forming disulfide bonds, a few amino acids at the N-terminus in the native Fc, or a methionine residue may be added at the N-terminus of the native Fc. Do. In addition, complement binding sites, such as C1q binding sites may be removed or ADCC sites may be removed to eliminate effector function. Techniques for preparing such sequence derivatives of immunoglobulin Fc regions are disclosed in WO 97/34631, WO 96/32478, and the like.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 197 9). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.

경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amylation, etc. may be modified.

상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.The above-described Fc derivatives are derivatives which exhibit the same biological activity as the Fc region of the present invention but increase structural stability against heat, pH, etc. of the Fc region.

또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.In addition, the Fc region may be obtained from natural types separated in vivo from humans and animals such as cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, and guinea pigs, and may be obtained from transformed animal cells or microorganisms. It may be recombinant or a derivative thereof. Here, the method obtained from the natural form can be obtained by separating the whole immunoglobulin from the human or animal living body, and then treating the protease. Papain is cleaved into Fab and Fc, and pepsin is cleaved into pF'c and F (ab) 2. This may be separated by Fc or pF'c using size-exclusion chromatography.

바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.Preferably, the recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism is an Fc region derived from a human.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다. In addition, the immunoglobulin Fc region may be in a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain or a sugar chain removed from the natural form. Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease such immunoglobulin Fc sugar chains. Herein, the immunoglobulin Fc region in which the sugar chain is removed from the Fc has a significant decrease in the binding capacity of the complement (c1q), and the antibody-dependent cytotoxicity or the complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, thereby not causing an unnecessary immune response in vivo. Do not. In this regard, a form more consistent with the original purpose as a carrier of the drug would be the immunoglobulin Fc region from which the sugar chains have been removed or unglycosylated.

본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.In the present invention, "Deglycosylation" refers to the Fc region from which sugar is removed by an enzyme, and "Aglycosylation" refers to an Fc region that is not glycosylated from prokaryotes, preferably E. coli. .

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.In addition, the immunoglobulin Fc region may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or combinations thereof or hybrids thereof. It is preferably derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood and most preferably from IgG known to enhance the half-life of ligand binding proteins.

본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.By “combination” in the present invention is meant that when forming dimers or multimers, polypeptides encoding the same origin single chain immunoglobulin Fc region form a bond with single chain polypeptides of different origin. That is, it is possible to prepare dimers or multimers from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.

본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.As used herein, the term "hybrid" is a term used to mean that there is a sequence corresponding to two or more immunoglobulin Fc fragments of different origins within an immunoglobulin Fc region of a single chain. In the case of the present invention, various types of hybrids are possible. That is, hybridization of a domain consisting of 1 to 4 domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and may include a hinge.

한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.On the other hand, IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and combinations or hybridization thereof are also possible in the present invention. Preferred are the IgG2 and IgG4 subclasses, most preferably the Fc region of IgG4 with little effector function such as Complementdependent cytotoxicity (CDC).

즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
That is, the most preferred immunoglobulin Fc region for a carrier of the drug of the present invention is a non-glycosylated Fc region derived from human IgG4. Human-derived Fc regions are preferred over non-human-derived Fc regions that can cause undesirable immune responses, such as acting as antigens in human living organisms to produce new antibodies against them.

본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.As used herein, "non-peptidyl polymer" refers to a biocompatible polymer having two or more repeating units linked thereto, and the repeating units are linked to each other through any covalent bonds, not peptide bonds.

본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준 에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. Non-peptidyl polymers usable in the present invention include polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxy ethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, PLA ( Biodegradable polymers such as polylactic acid, polylactic acid) and PLGA (polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid and combinations thereof, preferably polyethylene Glycol. Derivatives thereof known in the art and derivatives which can be easily prepared at the technical level in the art are also included in the scope of the present invention.

기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.The disadvantage of the peptidic linker used in the fusion protein prepared by the conventional inframe fusion method is that it is easily cleaved by protease in vivo, so that the effect of increasing the blood half-life of the active drug by the carrier cannot be expected. will be. However, in the present invention, it is possible to maintain the half-life of the peptides similar to the carrier by using a polymerase resistant polymer. Therefore, the non-peptidyl polymer that can be used in the present invention can be used without limitation as long as it is a polymer that is resistant to the above-described role, that is, protease in vivo. Non-peptidyl polymers preferably have a molecular weight in the range of 1 to 100 kDa, preferably 1 to 20 kDa. In addition, the non-peptidyl polymer of the present invention, which is combined with the immunoglobulin Fc region, may be used not only as one kind of polymer but also as a combination of different kinds of polymers.

본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.Non-peptidyl polymers used in the present invention have a reactor that can be combined with immunoglobulin Fc regions and protein drugs.

상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.Both terminal reactors of the non-peptidyl polymer are preferably selected from the group consisting of reaction aldehyde groups, propion aldehyde groups, butyl aldehyde groups, maleimide groups and succinimide derivatives. In the above, succinimidyl propionate, hydroxy succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate may be used as the succinimid derivative. In particular, when the non-peptidyl polymer has a reactor of reactive aldehyde groups at both ends, it is effective to minimize nonspecific reactions and to bind bioactive polypeptides and immunoglobulins at each end of the non-peptidyl polymer, respectively. The final product resulting from reductive alkylation by aldehyde bonds is much more stable than those linked by amide bonds. The aldehyde reactor selectively reacts at the amino terminus at low pH and can form covalent bonds with lysine residues at high pH, for example pH9.0 conditions.

상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
Both terminal reactors of the non-peptidyl polymer may be the same or different from each other. For example, one end may have a maleimide group and the other end may have an aldehyde group, a propion aldehyde group, or a butyl aldehyde group. When using poly (ethylene glycol) having a hydroxy reactor at both ends as a non-peptidyl polymer, the poly group having a modified reactor which is activated by the known chemical reaction or activates the hydroxy group to the various reactors ( Ethylene glycol) can be used to prepare the protein conjugates of the present invention.

본 발명의 지속성 제제는 생체 내 지속성 및 안정성을 유지시키는데 우수한 효과가 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 칼시토닌 지속성 제제는 천연형 칼시토닌에 비하여 반감기가 약 20배 가까이 증가하였다 (표 1). 또한, 마우스 골수세포에서 유래된 파골세포에 처리하여 뼈 재흡수율을 측정한 결과, 천연형 칼시토닌에 비하여 뼈 재흡수 억제 효과가 높음을 확인하였다 (표 2).Persistence formulations of the invention have an excellent effect in maintaining sustainability and stability in vivo. According to a specific embodiment of the present invention, the calcitonin long-acting formulations of the present invention have an increase in half-life of about 20 times compared to natural calcitonin (Table 1). In addition, as a result of measuring bone resorption rate by treating osteoclasts derived from mouse bone marrow cells, it was confirmed that the effect of inhibiting bone resorption is higher than that of natural calcitonin (Table 2).

본 발명의 지속성 제제는 칼시토닌이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 칼시토닌이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.The long-acting formulations of the invention may be administered via any general route so long as calcitonin can reach the desired tissue. Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration, rectal administration, and the like, but are not limited thereto. However, upon oral administration, since the peptide is digested, it is desirable to formulate the oral composition to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach. It may preferably be administered in the form of an injection. In addition, long-acting formulations may be administered by any device that allows calcitonin to migrate to target cells.

본 발명의 결합체를 포함한 지속성 제제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 지속성 제제의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.Sustained formulations comprising a conjugate of the invention may include a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavors, etc., in the case of injections, buffers, preservatives, analgesic A topical agent, a solubilizer, an isotonicity agent, a stabilizer, etc. can be mixed and used, and in case of topical administration, a base, an excipient, a lubricating agent, a preservative, etc. can be used. The formulations of the long-acting formulations of the present invention can be prepared in a variety of mixtures with the pharmaceutically acceptable carriers described above. For example, in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. Others may be formulated into solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release preparations and the like.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. Examples of suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, preservatives and the like may be further included.

본 발명의 지속성 제제는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 지속성 제제는 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 지속성 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.The long-acting formulations of the present invention are determined by the type of drug that is the active ingredient, along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient and the severity of the disease. Since the long-acting formulation of the present invention has excellent in vivo persistence and titer, the frequency and frequency of administration of the long-acting formulation of the present invention can be significantly reduced.

본 발명의 지속성 제제는 칼시토닌의 생체 내 지속성 및 안정성을 매우 높게 유지시키므로 칼시토닌에 의한 골다공증(Osteoporosis) 또는 만성고칼슘혈증 (hypercalcemia) 치료에 효과적이다.
The persistent formulations of the present invention maintain very high in vivo persistence and stability of calcitonin and are therefore effective in treating osteoporosis or chronic hypercalcemia by calcitonin.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 칼시토닌의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;In another aspect, the present invention provides a method for preparing a carboxyl group comprising: (1) covalently linking an amine group or a thiol group of calcitonin using a non-peptidyl polymer having an aldehyde, maleimide, or succinimide derivative reactor at both ends;

(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 칼시토닌을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및(2) separating the linker comprising calcitonin covalently bonded to the non-peptidyl polymer from the reaction mixture of (1); And

(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 칼시토닌과 결합된 칼시토닌 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 칼시토닌 지속성 제제의 제조방법을 제공한다.
(3) covalently linking an immunoglobulin Fc region to the other end of the non-peptidyl polymer of the isolated linker to produce a calcitonin conjugate wherein both ends of the non-peptidyl polymer are linked to an immunoglobulin Fc region and calcitonin, respectively. It provides a method for preparing a calcitonin sustained preparation comprising the step.

본 발명의 칼시토닌 유도체 결합체는 펩타이드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다.
The calcitonin derivative conjugate of the present invention has the effect of maintaining relatively high in vivo activity of the peptide and significantly increasing blood half-life.

도 1은 연어 칼시토닌-PEG-면역글로블린 Fc 결합체의 SD 랫드에서의 약물동태 시험이다.
도 2는 연어 칼시토닌 (salmon calcitonin), 칼시토닌 결합체 (HM11860A), 칼시토닌-30k PEG, 및 면역글로불린 Fc (Carrier A) 의 뼈 재흡수 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 마우스 골수세포에서 유도된 파골세포에 칼시토닌 결합체 (HM11860A)를 첨가하여 배양하였을 때 칼시토닌 결합체 (HM11860A)에 의해 마우스 칼시토닌 발현됨을 확인한 결과이다.1 is a pharmacokinetic test in SD rats of salmon calcitonin-PEG-immunoglobulin Fc conjugate.
Figure 2 shows the bone resorption inhibitory effect of salmon calcitonin, calcitonin conjugate (HM11860A), calcitonin-30k PEG, and immunoglobulin Fc (Carrier A).
Figure 3 shows that the mouse calcitonin is expressed by the calcitonin conjugate (HM11860A) when cultured by adding a calcitonin conjugate (HM11860A) to osteoclasts induced in mouse bone marrow cells.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1. 페길화된 칼시토닌 정제Example 1 PEGylated Calcitonin Tablets

3.4K PropionylALD(2) PEG(프로필알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG)를 연어 칼시토닌(AP, 미국)의 N-말단에 페길화시키기 위하여 칼시토닌과 PEG의 몰비 1 : 5, 칼시토닌 농도 3mg/ml로 4℃에서 60분간 반응하였다. 이 때 반응은 100mM NaOAc pH5.2 에서 이루어 졌으며 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 SP HP(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 통하여 모노페길화된(Mono-PEGylated) 칼시토닌를 정제하였다.
In order to PEGylate 3.4K PropionylALD (2) PEG (PEG having two propylaldehyde groups) to the N-terminus of salmon calcitonin (AP, USA), the molar ratio of calcitonin and PEG is 1: 5 and calcitonin concentration is 3 mg / ml. It reacted at 60 degreeC for 60 minutes. At this time, the reaction was performed at 100 mM NaOAc pH5.2 and reacted by adding 20 mM SCB (NaCNBH3) as a reducing agent. The reaction solution was purified mono-pegylated calcitonin through SP HP (XK 16ml, Amersham Bioscience).

Column : SP HP (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)Column: SP HP (XK 16ml, Amersham Bioscience)

유속 : 3.0ml/분Flow rate: 3.0ml / min

구배 : A 0 → 25% 80분 B (A: 20mM 포스페이트 pH6.0, B: A + 1M NaCl )
Gradient: A 0 → 25% 80 min B (A: 20 mM phosphate pH6.0, B: A + 1M NaCl)

실시예 2. Calcitonin(N)-PEG-면역글로블린 Fc 결합체(HM11860A) 제조Example 2. Preparation of Calcitonin (N) -PEG-immunoglobulin Fc conjugate (HM11860A)

실시예 1.의 방법을 이용하여 3.4K PropionylALD(2) PEG를 칼시토닌의 N-말단과 반응시킨 후 모노페길화된(Mono-PEGylated) 칼시토닌만을 정제하여 면역글로블린 Fc 와 커플링켜 지속형 칼시토닌 결합체인 HM11860A를 제조하였다. Peptide와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 4, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제하였다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로블린 Fc를 제거하기 위하여 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)이용하였다. 20mM Tris(pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 칼시토닌-면역글로블린 Fc 가 먼저 용츌되고 바로 뒤이어 다량의 면역글로블린 Fc 가 용출된다. 일차 정제를 통하여 어느 정도 면역글로블린 Fc가 제거 되지만 Ion Exchange Column에서 면역글로블린 Fc 와 칼시토닌-면역글로블린 Fc의 결합력 차이가 크지 않아 완전히 분리되지는 않는다. 따라서 두 물질의 Hydrophobicity를 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE ISO(HR 16ml,아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 1.5M Ammonium Sulfate를 이용하여 일차 정제된 시료를 결합 시킨 후 차츰 Ammonium Sulfate농도를 낮추면서 시료를 용출시킨다. HIC Column에 결합력이 약한 면역글로블린 Fc 가 먼저 용출되고 결합력이 강한 칼시토닌-면역글로블린 Fc 시료가 뒤쪽으로 용출된다. 이들의 Hydrophobicity 차이가 커 Ion exchange column보다 훨씬 분리가 용이하다. 하지만 몰 비 차이로 인한 과량의 면역글로블린 Fc가 반응에 투입되기 때문에 HIC 컬럼만 사용해서는 고순도 결합체를 얻을 수 없다. HPLC 역상분석결과 순도 90.6%를 나타내었다.
After reacting 3.4K PropionylALD (2) PEG with the N-terminus of calcitonin using the method of Example 1, only mono-PEGylated calcitonin was purified and coupled with immunoglobulin Fc to provide a sustained calcitonin conjugate. HM11860A was prepared. Peptide and immunoglobulin Fc molar ratio of 1: 4 and total protein concentration of 60 mg / ml were reacted at 4 ° C. for 20 hours. The reaction solution was 100 mM KP pH6.0 and 20 mM SCB, a reducing agent, was added. The coupling reaction solution was purified via two purification columns. First, SOURCE Q (XK 16ml, Amersham Bioscience) was used to remove large amounts of immunoglobulin Fc that did not participate in the coupling reaction. Salt gradients using 1M NaCl at 20 mM Tris (pH7.5) dissolve calcitonin-immunoglobulin Fc, which is relatively weak in binding, and elute a large amount of immunoglobulin Fc. Although the immunoglobulin Fc is removed to some extent through the primary purification, the binding force between immunoglobulin Fc and calcitonin-immunoglobulin Fc in the ion exchange column is not large enough to be completely separated. Therefore, the secondary purification using the hydrophobicity of the two materials. Combine the primary purified sample with SOURCE ISO (HR 16ml, Amersham Bioscience) using 20mM Tris (pH7.5) 1.5M Ammonium Sulfate, and then elute the sample while lowering the concentration of Ammonium Sulfate. Immunoglobulin Fc, which is weakly bound to the HIC column, is eluted first. Their difference in hydrophobicity makes them much easier to separate than ion exchange columns. However, since the excess immunoglobulin Fc due to the molar ratio difference is added to the reaction, high purity conjugates cannot be obtained using only HIC columns. HPLC reversed phase analysis showed purity 90.6%.

Column : SOURCE Q(XK16ml, 아머샴 바이오사이언스)Column: SOURCE Q (XK16ml, Amersham Bioscience)

유속 : 2.0ml/분Flow rate: 2.0ml / min

구배 : A 0 →20% 80분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1M NaCl )
Gradient: A 0 → 20% 80 min B (A: 20mM Tris pH7.5, B: A + 1M NaCl)

Column : SOURCE ISO(HR16ml, 아머샴 바이오사이언스)Column: SOURCE ISO (HR16ml, Amersham Bioscience)

유속 : 6.0ml/분Flow rate: 6.0ml / min

구배 :B 100 →0% 70분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1.5M Ammonium Sulfate )
Gradient: B 100 → 0% 70 min B (A: 20mM Tris pH7.5, B: A + 1.5M Ammonium Sulfate)

실시예 3. 지속형 칼시토닌 (HM11860A) 생체내 소실 반감기 측정Example 3. Continuous Calcitonin (HM11860A) In vivo Loss Half-Life Measurements

SD 랫드에 연어 칼시토닌과 HM11760A를 100 mg/kg 용량으로 단회 피하투여하여 계획된 계획된 시간에 채혈을 진행하여 plasma를 얻고 plasma에 존재하는 시험물질의 양을 측정하여 약물동태를 확인하는 시험을 진행하였다. 시험물질의 정량은 ELISA 방법을 사용하였다. 표 1과 도 1에서 알 수 있듯이 연어 칼시토닌와 동일한 용량으로 투여한 octreotide의 지속형 결합체인 HM11860A의 랫드에서 약물동태가 모든 파라미터에서 월등히 우월함을 알 수 있으며 반감기는 약 20배 가까이 증가한 것으로 확인 되었다.Salmon calcitonin and HM11760A were dosed subcutaneously in 100 mg / kg doses in SD rats and blood was collected at the scheduled time to obtain plasma and to measure the pharmacokinetics by measuring the amount of test substance present in plasma. Quantification of test substance was performed by ELISA method. As can be seen in Table 1 and Figure 1, the pharmacokinetics of rats of HM11860A, a sustained conjugate of octreotide administered at the same dose as salmon calcitonin, were found to be superior to all parameters, and the half-life was confirmed to increase by about 20 times.

Figure pat00001
Figure pat00001

실시예 3. 지속형 칼시토닌의 인비트로 효력시험 (Bone resorption assay)Example 3. Bone resorption assay of sustained calcitonin

마우스 골수세포에서 유래된 파골세포 (Osteoclast)에 연어 칼시토닌 (salmon calcitonin), 칼시토닌 결합체 (HM11860A), 칼시토닌-30k PEG, 면역글로불린 Fc (Carrier A)를 4 nM으부터 1/4배씩 연속적으로 희석하여 첨가한 후, 48 시간동안 배양하여 뼈 재흡수(osteoclastic bonne resoption) 과정에서 유래된 콜라겐 타입 1 파편을 IDS사의 ‘Crosslaps for culture ELISA kit'을 이용하여 뼈 재흡수율 (bone resorption rate)을 측정하였다. 그 결과 표 2와 도 2에서 알 수 있듯이 연어 칼시토닌에 비해 칼시토닌 결합체 (HM11860A), 칼시토닌-30k PEG이 뼈 재흡수 (Bone resorption) 억제 효과가 높음을 확인하였다.Osteoclast derived from mouse bone marrow cells (salmon calcitonin, calcitonin conjugate (HM11860A), calcitonin-30k PEG, immunoglobulin Fc (Carrier A) was diluted 1/4 times from 4 nM in succession After the addition, the bone resorption rate of the collagen type 1 fragments derived from bone resorption (osteoclastic bonne resoption) by IDS '' Crosslaps for culture ELISA kit 'was measured. As a result, as shown in Table 2 and FIG. 2, calcitonin conjugate (HM11860A) and calcitonin-30k PEG showed higher bone resorption inhibitory effect than salmon calcitonin.

InhibitorInhibitor CarrierCarrier A A 연어 salmon 칼시토닌Calcitonin HM11860AHM11860A 칼시토닌Calcitonin -30k -30k PEGPEG IC50IC50 N.A.N.A. 68.0568.05 6.156.15 11.6411.64 R2R2 -- 0.900.90 0.990.99 0.990.99

또한 마우스 골수세포에서 유도된 파골세포에 칼시토닌 결합체 (HM11860A)을 첨가하여 배양한 후, RNA를 회수하여 반정량 RT-PCR (Semi quantitative RT-PCR)을 실시한 결과 도3과 같이 칼시토닌 결합체 (HM11860A)에 의해 마우스 칼시토닌 발현됨이 확인할 수 있었다.In addition, after incubating the osteoclasts derived from mouse bone marrow cells with calcitonin conjugate (HM11860A), the RNA was recovered and subjected to semi-quantitative RT-PCR (Semi quantitative RT-PCR). Mouse calcitonin expression was confirmed by.

Claims (18)

칼시토닌 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 칼시토닌 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 칼시토닌의 지속성 제제.
Calcitonin and immunoglobulin Fc regions include polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymers, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinylethyl ether, biodegradable polymers, lipid polymers A sustained preparation of calcitonin having increased in vivo persistence and stability, comprising a calcitonin conjugate linked through a non-peptidyl linker selected from the group consisting of chitins, hyaluronic acid, and combinations thereof.
제 1항에 있어서, 칼시토닌은 사람의 칼시토닌 또는 연어의 칼시토닌임을 특징으로 하는 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein the calcitonin is human calcitonin or salmon calcitonin.
제1항에 있어서, 칼시토닌은 칼시토닌 아고니스트, 칼시토닌 단편(fragment), 변이체(variant), 유도체 (derivative)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein the calcitonin is selected from the group comprising calcitonin agonists, calcitonin fragments, variants, derivatives.
제1항에 있어서, 칼시토닌 아고니스트는 칼시토닌 수용체와 결합하여 칼시토닌과 유사한 생물학적 반응을 일으키는 물질임을 특징으로 하는 지속성 제제.
2. The long-acting formulation of claim 1, wherein the calcitonin agonist is a substance that binds to the calcitonin receptor and causes a biological response similar to calcitonin.
제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 칼시토닌의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 것인 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein both ends of the non-peptidyl polymer are each bound to an immunoglobulin Fc region and an amine group or thiol group of calcitonin.
제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein the immunoglobulin Fc region is unglycosylated.
제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 것인 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein the immunoglobulin Fc region consists of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3, and CH4 domains.
제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 지속성 제제.
8. The long-acting formulation of claim 7, wherein the immunoglobulin Fc region further comprises a hinge region.
제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein the immunoglobulin Fc region is an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, or IgM.
제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 지속성 제제.
8. The long-acting formulation of claim 7, wherein each domain of the immunoglobulin Fc region is a hybrid of domains with different origins derived from immunoglobulins selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM.
제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 지속성 제제.
8. The long-acting formulation of claim 7, wherein the immunoglobulin Fc region is a dimer or multimer consisting of short chain immunoglobulins consisting of domains of the same origin.
제7항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 지속성 제제.
8. The long-acting formulation of claim 7, wherein the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region.
제10항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 10, wherein the immunoglobulin Fc region is a human nonglycosylated IgG4 Fc region.
제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, wherein the reactor of the non-peptidyl polymer is selected from the group consisting of aldehyde groups, propion aldehyde groups, butyl aldehyde groups, maleimide groups, and succinimide derivatives.
제14항에 있어서, 석시니미드 유도체가 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 하이드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트인 지속성 제제.
15. The long-acting formulation of claim 14, wherein the succinimide derivative is succinimidyl propionate, succinimidyl carboxymethyl, hydroxy succinimidyl or succinimidyl carbonate.
제14항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 것인 지속성 제제.
15. The long-acting formulation of claim 14, wherein the non-peptidyl polymer has a reactor of reactive aldehyde groups at both ends.
제1항에 있어서, 골다공증(Osteoporosis) 또는 만성고칼슘혈증 (hypercalcemia) 치료용인 지속성 제제.
The long-acting formulation of claim 1, which is for the treatment of osteoporosis or chronic hypercalcemia.
(1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 칼시토닌의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 칼시토닌을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 칼시토닌과 결합된 칼시토닌 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 칼시토닌 지속성 제제의 제조방법.(1) covalently linking an amine group or thiol group of calcitonin using a non-peptidyl polymer having an aldehyde, maleimide, or succinimide derivative reactor at both ends;
(2) separating the linker comprising calcitonin covalently bonded to the non-peptidyl polymer from the reaction mixture of (1); And
(3) covalently linking an immunoglobulin Fc region to the other end of the non-peptidyl polymer of the isolated linker to produce a calcitonin conjugate wherein both ends of the non-peptidyl polymer are linked to an immunoglobulin Fc region and calcitonin, respectively. A method for preparing the calcitonin long-acting formulation of claim 1, comprising the step.
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