KR20110110072A - Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method - Google Patents

Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method Download PDF

Info

Publication number
KR20110110072A
KR20110110072A KR1020110080708A KR20110080708A KR20110110072A KR 20110110072 A KR20110110072 A KR 20110110072A KR 1020110080708 A KR1020110080708 A KR 1020110080708A KR 20110080708 A KR20110080708 A KR 20110080708A KR 20110110072 A KR20110110072 A KR 20110110072A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
slide
antigen
solution
reactive protein
antibody
Prior art date
Application number
KR1020110080708A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101195253B1 (en
Inventor
김남수
조용진
김종태
Original Assignee
한국식품연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국식품연구원 filed Critical 한국식품연구원
Priority to KR1020110080708A priority Critical patent/KR101195253B1/en
Publication of KR20110110072A publication Critical patent/KR20110110072A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101195253B1 publication Critical patent/KR101195253B1/en

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306Solid-phase reaction mechanisms
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명에 의하여, C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 스트렙트아비딘과 혼합하여 형광나노입자로 표지시키는 단계, 상기 항체를 혼합경쟁적으로 면역반응시키는 단계, 형광카메라로 분석하는 단계에 있어서, 상기 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정화하기 위하여, 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 제조하는 단계, 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 수화하는 단계, 글루타르 알데히드 용액을 사용하여 상기 개질된 슬라이드를 활성화시키는 단계, 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01-0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하는 단계, 스포팅 가이드 상에 상기 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 상기 제조한 항원용액을 1-100㎕ 적하점에 스포팅하는 단계, 및 상기 단계에 의하여 준비된 슬라이드를 1-6시간 반응시켜 항원을 고정화하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 이에 의하여 제조되는 면역형광 슬라이드가 개시된다.According to the present invention, a method of preparing a protein chip by immobilizing a C-reactive protein on a slide, mixing an antibody specifically binding to a protein to be analyzed with streptavidin and labeling it with fluorescent nanoparticles, the antibody Mixed competitive immunization step, analysis with a fluorescence camera, in order to immobilize the C-reactive protein on the slide, preparing a slide modified with 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyl Hydrating the modified slide with trimethoxysilane, activating the modified slide using a glutaraldehyde solution, adding the C-reactive protein in a 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) to 0.01-0.5 Dissolving to a mg / ㎖ concentration to prepare an antigen solution for immobilization, PET containing the slide on the spotting guide A method for preparing an antigen-immobilized immunofluorescent slide for immobilizing antigen by immobilizing the prepared antigen solution by spotting 1-100 μl dropping point and reacting the slide prepared by the above step 1-6 hours. An immunofluorescent slide prepared by the present invention is disclosed.

Description

항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드{PREPARATION METHOD OF ANTIGEN-IMMOBILIZED IMMUNO- FLUORESCENCE SLIDE AND THE IMMUNO-FLUOROSCENCE SLIDE MADE BY THE METHOD}FIELD OF THE INVENTION A method for producing an antigen-immobilized immunofluorescent slide and an immunofluorescent slide produced by the same, the present invention relates to an immunofluorescent slide prepared by the present invention and to an immunofluorescent slide prepared by the same.

본 발명은 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 스트립트아비딘과 혼합하여 형광나노입자로 표지시키는 단계, 상기 항체를 혼합경쟁적으로 면역반응시키는 단계, 형광카메라로 분석하는 단계로 이루어지는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드에 관한 것이다.The present invention provides a method for preparing a protein chip by immobilizing a C-reactive protein on a slide, mixing an antibody that specifically binds to a protein to be analyzed with striptevidin and labeling it with fluorescent nanoparticles. The present invention relates to a method for producing an antigen-immobilized immunofluorescence slide comprising an immunoreaction step and an analysis with a fluorescence camera, and an immunofluorescence slide produced thereby.

바이오칩(Biochip)은, 다양한 종류의 프로브를 단위 면적의 고체상 지지체의 표면에 고정화한 것으로, 이러한 바이오칩을 이용하면 소량의 시료로 질병의 진단, 고효율 스크리닝(High Throughput Screening; HTS), 효소활성측정 등의 실험을 대규모로 손쉽게 실시할 수 있다.Biochip is an immobilization of various types of probes on the surface of a solid-phase support of a unit area.By using such a biochip, a small amount of sample can be used to diagnose disease, high throughput screening (HTS), and enzyme activity measurement. Experiments can be easily performed on a large scale.

프로브를 슬라이드나 슬라이드에 고정시키는 방법의 대부분은 코팅물질로 표면을 전처리한 유리 슬라이드 상에 프로브를 고정시킴으로써 제작된다. 이를 위해 다양한 표면화학물질이 제안되었으며, 대표적으로 자기조립 단분자층(Self-assembled monolayer)등의 기술이 적용된다(대한민국 특허공개 제 2003-0038932호).Most of the methods of fixing a probe to a slide or slide are made by fixing the probe on a glass slide pretreated with a coating material. To this end, various surface chemicals have been proposed, and a technique such as a self-assembled monolayer is typically applied (Korean Patent Publication No. 2003-0038932).

이에 대해, 고정화되는 프로브의 양을 증대시키고 프로브의 활성을 유지하기 위한 시도로서 3 차원 고정화 방법이 개발되었다(Gill 및 Ballesteros, Trends in Biotechnology 18:282, 2000). 예컨대, 패커드 바이오사이언스(Packard Bioscience)의 히드로겔®(Hydrogel) 코팅 슬라이드, 바이오셉트사의 폴리에틸렌글리콜계 히드로겔, 및 LG화학의 솔겔 등을 이용한 3 차원의 고정화 방법을 예로 들 수 있다.In response, a three-dimensional immobilization method has been developed (Gill and Ballesteros, Trends in) in an attempt to increase the amount of probe immobilized and to maintain the activity of the probe. Biotechnology 18: 282, 2000). For example, a three-dimensional immobilization method using Packard Bioscience's Hydrogel ® coating slide, Biocept's polyethylene glycol-based hydrogel, LG Chem's Solgel, and the like can be mentioned.

면역센서용 슬라이드로서는 유리, 실리콘, 히드로겔, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인으로 구성된 그룹에서 선택된다.The slide for the immunosensor is selected from the group consisting of glass, silicone, hydrogel, metal, ceramic, porous membrane.

현재, 대응되는 항원 또는 항체의 특이적 반응성에 기초하여, 항체 또는 항원이 기재 상에 고정화된 항체 또는 항원 프로브-플레이트가, 검출하기 위해 널리 사용되고 있다. 이러한 사용을 위한 세 종류의 대표적 키트는, 래피트(rapid) 테스트 키트, 루틴(routine) 테스트 키트 및 바이오칩 키트이다.Currently, antibodies or antigen probe-plates on which an antibody or antigen is immobilized on a substrate based on the specific reactivity of the corresponding antigen or antibody are widely used for detection. Three representative kits for this use are rapid test kits, routine test kits and biochip kits.

이들은 고정화된 항체 프로브 또는 항원 프로브에 대응하는 타겟 항원 또는 타겟 항체를 검출하기 위해 사용된다.These are used to detect target antigens or target antibodies corresponding to immobilized antibody probes or antigen probes.

일부 경우에는 여러 반응기들이 한 프로브-플레이트로 조합되는데, 상기 반응기들 각각은 항원 또는 항체를 검출하는 테스트 스트립을 각각 포함한다In some cases, several reactors are combined into one probe-plate, each of which comprises a test strip that detects an antigen or an antibody, respectively.

한편, 최근 건강기능식품법이 발효되면서 국내에서도 천연물을 기반으로 식품소재 및 가공식품을 제조하고 이를 건강기능식품으로 인정받을 수 있는 문호가 개방되었다. 그러나 이를 위해서는 건강기능식품의 기능성, 예를 들면 심혈관계 질환예방, 노화억제, 암 예방, 비만방지, 면역조절, 위·장관 질환예방 등의 건강기능식품의 기능성을 과학적으로 입증하는 자료를 제시해야 하므로 식품기능성 평가의 중요성은 점점 증대되고 있고 그 결과로서 기능성평가 분야의 사업화 가능성도 매우 높은 실정이다.On the other hand, with the recent entry into force of the Health Functional Food Act, the door to manufacture food materials and processed foods based on natural products and be recognized as health functional foods has been opened in Korea. However, to this end, it is necessary to present data that scientifically demonstrate the functional functionality of health functional foods, such as cardiovascular disease prevention, anti-aging, cancer prevention, obesity prevention, immune regulation, and gastrointestinal disease prevention. Therefore, the importance of food functional evaluation is increasing, and as a result, the possibility of commercialization of functional evaluation field is very high.

식품의 기능성평가는 위의 6대 기능성 유형을 중심으로 생체외(in vitro) 기능성 평가, 쥐(rat)와 같은 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 기능성 평가 및 임상실험을 망라하고 있는데, 식품산업의 측면에서 볼 때 식품소재 및 기능성식품의 기능성평가를 효율적이고 신속하게 행하기 위한 실험동물을 이용한 생체내 기능성 검색기술 개발의 필요성이 증대되고 있다.Functional assessment of foods in vitro around six functional types above (in in vitro ) functional evaluation, in vivo using experimental animals such as rats ( in in vivo ) functional evaluation and clinical trials. From the perspective of the food industry, the necessity of the development of in vivo functional retrieval technology using laboratory animals for efficient and rapid evaluation of functional ingredients and functional foods is increasing. have.

기능성 식품으로서 인정되기 위해서는 심혈관계 기능성과 같은 목적하는 기능성이 과학적으로 입증되어야 하는데, 식품에 대한 기능성의 평가의 중요성은 아무리 강조해도 지나침이 없다(Kim 등, 직접결합 수정진동자 면역센서에 의한 C-reactive protein 검출, 한국생물공학회지, Vol. 22, p. 443, 2007). 임상실험에 앞서서 전 단계로서 행해지는 실험동물을 이용한 생체내 기능성 평가는 종래로부터 체중, 혈압, 및 기관 형태와 같은 신체적 요소의 변화를 측정하는 것이었다. 그러나, 이러한 방법은 불균일한 결과를 초래할 뿐만 아니라 평가 프로토콜의 다양성, 숙련된 전문가 및 값 비싼 분석기구 등이 필요하다는 단점이 있다. 생체내 식품 기능성에 대한 균일한 평가방법은 래트와 같은 실험동물 체내에서 특정 질환이나 대사증상과 관련된 특정 바이오마커 단백질의 상승 및 하강을 측정하는 것이다. 이 경우는 기능성 식품으로 인정받고자 하는 식품을 포함하는 것을 실험동물에 투여하게 된다. To be recognized as a functional food, the desired functionality, such as cardiovascular functionality, has to be scientifically proved, and the importance of assessing the functionality of the food cannot be overemphasized (Kim et al. Detection of reactive proteins, Journal of Biotechnology and Bioengineering , Vol. 22, p. 443, 2007). In vivo functional evaluation using laboratory animals as a preliminary step prior to clinical trials has traditionally been to measure changes in physical factors such as body weight, blood pressure, and organ morphology. However, these methods not only result in uneven results, but also require a variety of evaluation protocols, skilled experts, and expensive analytical instruments. A uniform assessment of food functionality in vivo is to measure the rise and fall of specific biomarker proteins associated with specific diseases or metabolic symptoms in laboratory animals such as rats. In this case, the animal containing the food to be recognized as a functional food is administered to the experimental animal.

대한민국 등록특허 10-921237호에서는 식품소재 및 기능성식품의 심혈관계 기능성을 신속하게 검색할 수 있는 생체내 기능성 평가를 위한 새로운 방법의 하나로서, 관상동맥질환, 고혈압 등에 대한 주요 바이오마커(biomarker)의 하나로 알려지고 있으며 포유동물의 간에서 인터류킨-6(interleukin- 6) 및 인터류킨-1베타(interleukin-1β)에 의한 유도자극으로 합성되는 분자질량 118 킬로달톤(killodalton, kDa) 정도의 펜타머 단백질인 C-반응성 단백(C-reactive protein)(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19, p. 1193, 2004; Clinical Chemistry, Vol. 47, p. 403, 2001; New England Journal of Medicine, Vol. 340, p. 448, 1999; Biochemical Journal, Vol. 327, p. 425, 1997)을 수정진동자 면역센서(quartz crystal microbalance immunosensor)를 이용하여 고감도로 검출하는 측정방법에 대하여 기술하였다. Korean Patent No. 10-921237 discloses a new method for evaluating in vivo functionality that can quickly detect cardiovascular functionality of food materials and functional foods, and is a major biomarker for coronary artery disease and hypertension. It is known as a pentameric protein with a molecular mass of about 118 kilodaltons (kDa), which is synthesized by induced stimulation by interleukin-6 and interleukin-1β in mammalian liver. C-reactive protein ( Biosensors and Bioelectronics , Vol. 19, p. 1193, 2004; Clinical Chemistry , Vol. 47, p. 403, 2001; New England Journal of Medicine , Vol. 340, p. 448, 1999; Biochemical Journal , Vol. 327, p. 425, 1997) have been described for a high sensitivity detection method using a quartz crystal microbalance immunosensor.

상기의 방법은 C-반응성 단백을 측정하기 위한 기존방법의 하나인 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(American Journal of Cardiology, Vol. 1, p. 155, 2005; American Journal of Veterinary Research, Vol. 1, p. 62, 2005; Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 18, p. 280, 2004)에 비하여 착색물질에 의한 측정저해를 받지 않으면서도 간편하게 사용할 수 있는 장점이 있고 측정감도도 기존의 다른 센서측정법에 비하여 우수하거나 비슷한 수준으로 나타났다(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, p. 973, 2007; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1987, 2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1631, 2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1141, 2006; Analytical Biochemistry, Vol. 328, p. 210, 2004).The above method is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which is one of the existing methods for measuring C-reactive protein.American Journal of Cardiology, Vol. 1, p. 155, 2005;American Journal of Veterinary Research, Vol. 1, p. 62, 2005;Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 18, p. 280, 2004), it has the advantage of being easy to use without being affected by the measurement of coloring matters, and the measurement sensitivity is superior to or similar to other sensor methods.Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, p. 973, 2007;Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1987, 2006;Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1631, 2006;Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1141, 2006;Analytical Biochemistry, Vol. 328, p. 210, 2004).

최근에 이르러 바이오센서를 이용한 센서계측에 금속 콜로이드(metallic colloid), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 형광 실리카 나노입자(fluorescent silica nanoparticle), 반도체 양자점(semiconductor quantum dot)과 같은 나노소재를 이용하는 빈도가 증가하고 있으며 그 적용을 통하여 센서신호의 감응성, 안정성, 선택성 등을 증진한 연구결과가 다수 보고되고 있다(Analytical Chemistry, Vol. 79, p. 630-707, 2007; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1900, 2006; Langmuir, Vol. 22, p. 4357, 2006; Nano Letters, Vol. 5, p. 113, 2005; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 20, p. 2454, 2005; Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 100, p. 4984, 2003; Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 274, p. 817, 2000). Recently, the use of nanomaterials such as metal colloids, carbon nanotubes, fluorescent silica nanoparticles, and semiconductor quantum dots for sensor measurement using biosensors has been increasing. Increasingly, a number of studies have been reported to improve the sensitivity, stability, and selectivity of sensor signals through its application.Analytical Chemistry, Vol. 79, p. 630-707, 2007;Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1900, 2006;Langmuir, Vol. 22, p. 4357, 2006;Nano Letters, Vol. 5, p. 113, 2005;Biosensors and Bioelectronics, Vol. 20, p. 2454, 2005;Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 100, p. 4984, 2003;Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 274, p. 817, 2000).

바이오센서에 의하여 실험동물의 혈액 중에 존재하는 바이오마커로서의 C-반응성 단백을 측정하여 식품의 생체내 심혈관계 기능성을 평가하고자 할 때, 센서 감도의 증대는 여전히 중요하며 또한 간편하게 측정할 필요성이 끊임없이 제기되어 왔다.When assessing the in vivo cardiovascular functionality of foods by measuring C-reactive protein as a biomarker present in the blood of experimental animals by biosensors, increasing sensor sensitivity is still important and the need for simple measurement is constantly raised. Has been.

본 발명은 바이오칩의 제작 및 측정에 바이오칩 어레이어나 마이크로-어레이 스캐너와 같이 복잡한 장치의 사용 없이 사용자가 마이크로 디스펜싱 피펫을 사용하여 슬라이드 상에 일정부피의 항원을 고정화하여 분석하고자 하는 단백질과 항체 및 형광나노입자의 접합체간의 면역반응 혹은 고정화된 항원과 형광성 나노프루브 및 특정 표적분자의 혼합물의 면역반응을 면역형광 슬라이드 상의 항원 코팅부위에서 행한 후 면역반응에 의하여 특이적으로 슬라이드 표면에 결합된 나노프루브를 형광현미경에 의하여 간편하게 형광강도나 형광입자 수를 측정하고 그 결과로서 생체지표와 같은 특정 표적분자의 농도를 알 수 있게 하는 센서의 감도가 높은 1회용 면역센서용 슬라이드를 제공하고자 한다. The present invention provides a protein, antibody and fluorescence to be analyzed by immobilizing a certain volume of antigen on a slide using a micro dispensing pipette without using complicated devices such as a biochip arrayer or a micro-array scanner for the fabrication and measurement of biochips. Immune reactions between conjugates of nanoparticles or immobilization of immobilized antigens and mixtures of fluorescent nanoprobes and specific target molecules were carried out at the antigen-coated sites on the immunofluorescent slides. The present invention aims to provide a slide for a single-use immunosensor with high sensitivity of a sensor that can easily measure fluorescence intensity or number of fluorescent particles by a fluorescence microscope, and as a result, know the concentration of a specific target molecule such as a biomarker.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 분석하고자 하는 단백질(항원)을 슬라이드에 고정시키고, 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지시키고, 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 세척시키고, 상기 슬라이드를 인큐베이터에 위치시켜 건조한 후, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하는 단계로 이루어진다. In order to solve the above problems, the present invention is to fix a protein (antigen) to be analyzed on a slide, to label the antibody specifically binding to the antigen with a fluorescent material, and to analyze the protein to be collected from a sample. After mixing with the fluorescently labeled antibody, the mixed mixture is reacted with the antigenic site immobilized on the slide, the unreacted antibody and antigen are washed with distilled water, the slide is placed in an incubator and dried, followed by fluorescence A microscope is used to measure the fluorescence intensity or the number of fluorescent particles.

시료를 분석하기 위하여 본 발명에서는 간접경합방법(indirect-competitive assay format)을 사용하는 것을 보여주고 있지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 직접경합방법(direct-competitive assay format)이나 샌드위치방법(sandwich assay format)에 의하여 행할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.Although the present invention shows the use of an indirect-competitive assay format for analyzing a sample, those skilled in the art to which the present invention pertains have a direct-competitive assay format. It will be readily understood that this can be done by a sandwich assay format.

본 발명에서 사용되는 면역센서용 슬라이드는 유리, 실리콘, 히드로겔, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인으로 구성된 그룹에서 선택되어지며 20~40X70~80mm의 가로, 세로 규격을 가진다.Slide for immunosensor used in the present invention is selected from the group consisting of glass, silicon, hydrogel, metal, ceramic, porous membrane and has a horizontal and vertical dimensions of 20 ~ 40X70 ~ 80mm.

본 발명에서는 분석하고자 하는 시료로서 C-반응성 단백(이하 "CRP"라 칭한다)을 사용하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 방법을 기타의 식품기능성 바이오마커인 엘디엘(LDL), 피브리노겐(fibrinogen), 안기오텐신 II(angiotensin II), 카디악 트로포닌(cardiac troponin) 등의 실혈관계 바이오마커와 노화억제, 암 예방, 비만 방지, 면역조절, 위ㆍ장관 질환예방 등과 관련된 바이오마커 단백질을 사용할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.In the present invention, C-reactive protein (hereinafter referred to as "CRP") was used as a sample to be analyzed, but a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs may use the method of other food functional biomarker ELD. Blood loss biomarkers such as LDL, fibrinogen, angiotensin II, and cardiac troponin, anti-aging, cancer prevention, obesity prevention, immunomodulation, gastrointestinal disorders It will be readily understood that biomarker proteins related to prophylaxis and the like can be used.

C-반응성 단백 항체는 쥐(rat), 마우스(mouse), 토끼, 원숭이, 사람 등 포유동물 유래의 C-반응성 단백을 사용하여 제조한 항체 중에서 선택된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.The C-reactive protein antibody may be any one selected from antibodies prepared using C-reactive proteins derived from mammals such as rats, mice, rabbits, monkeys, and humans.

검체에서 채취되는 시료는 C-반응성 단백이 반응완충용액에 용해된 표준용액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 체액, 간 등의 조직추출물 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.The sample collected from the sample may be any one selected from tissue extracts such as standard solution in which C-reactive protein is dissolved in the reaction buffer solution, blood, serum, plasma, saliva, body fluid, and liver.

항원이 고정화된 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹(blocking) 하기 위하여 사용되는 용액으로는 1-5%의 BSA(Bovine serum albumin), RSA(Rat serum albumin), HSA(Human serum albumin), MSA(Mouse serum almumin), GSA(goat serum albumin) 용액 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.      The solution used to block the sites that did not react with the antigen on the slide surface where the antigen is immobilized includes 1-5% of Bovine serum albumin (BSA), Rat serum albumin (RSA), and Human serum albumin (HSA). Any one selected from MSA (Mouse serum almumin) and GSA (goat serum albumin) solutions can be used.

이하 본 발명을 각 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail for each step.

본 발명의 슬라이드에 항원인 C-반응성 단백의 고정화는 하기의 두 가지 방법중 하나를 선택하여 실시할 수 있다.       Immobilization of the C-reactive protein as an antigen on the slide of the present invention can be carried out by selecting one of the following two methods.

첫째, 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane, 이하 "APTMS"라 칭한다)을 이용하여 항원을 고정화하는 방법이다. 이 방법을 이용하기 위하여 먼저, APTMS로 개질된 슬라이드를 제조한다. 상기 개질을 위하여 피란하 용액(Piranha solution, H2SO4:H2O2 = 2:1~4:1, 부피비율)에 슬라이드를 5~15분 침지한 후 꺼내 증류수로 헹군 다음 증류수내에서 3~10분간 초음파처리 하고 85~95℃의 열수로 30~90분간 수화시켜 세척한 후 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20~120분간 실온건조한다. 표면세척을 행한 준비된 슬라이드를 아세톤에 5~15% 농도로 용해된 APTMS 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 30~90분간 반응시킨다. 아세톤, 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8), 증류수로 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회씩 순차적으로 헹구고 증류수가 담긴 비커에서 1~60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에서 20~120분간 실온건조한 후 30~150℃ 대류오븐에서 3~7시간 열처리한 후 방냉하고 사용할 때까지 데시게이터에 건조한 상태로 보관한다.First, an antigen is immobilized using 3-aminopropyltrimethoxysilane (hereinafter referred to as "APTMS"). To use this method, first, a slide modified with APTMS is prepared. For the reforming, the slides were immersed in Piranha solution (Piranha solution, H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 2: 1-4: 1, volume ratio) for 5-15 minutes, then rinsed with distilled water and then distilled water After sonication for 3 ~ 10 minutes, hydrated with 85 ~ 95 ℃ hot water for 30 ~ 90 minutes, put slides on Kimwipers and dry at room temperature for 20 ~ 120 minutes. The prepared slides subjected to surface washing are placed in a Petri dish containing APTMS solution dissolved in acetone at a concentration of 5 to 15%, and reacted at room temperature for 30 to 90 minutes. Rinse sequentially with acetone, 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8), distilled water, 3-4 times in front of the slide, and soak for 1 to 60 minutes in a beaker containing distilled water. Take this out and dry it at room temperature for 20 ~ 120 minutes on Kimwipes, heat it for 3 ~ 7 hours at 30 ~ 150 ℃ convection oven, cool it and store it in desiccator until it is used.

APTMS로 개질된 슬라이드를 증류수에 10~20분간 침지하여 수화시킨다. 침지된 슬라이드를 꺼내서 글루타르알데히드 1~4% 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어서 30~90분간 반응시켜 슬라이드 표면에 단백질이 결합할 수 있도록 활성화시킨다. 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 활성화된 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한다. 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20~120분간 실온건조한다. The slides modified with APTMS are hydrated by soaking in distilled water for 10-20 minutes. Take out the immersed slide, put it in a petri dish containing glutaraldehyde 1-4% solution, and react for 30-90 minutes to activate the protein to bind to the slide surface. Wash the front and back of activated slide 3-4 times with 30-70mM phosphate buffer (pH 6.5-7.8). Dip the slide for 1 to 60 minutes in a beaker of distilled water. Take it out and place the slide on Kimwipes for 20 to 120 minutes at room temperature.

상기에서 사용되는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)는 46~49㎖의 증류수에 30-70% 농도의 글루타르 알데히드 1~4㎖를 가하여 30~70㎖로 정용하여 제조한다.Glutaraldehyde used in the above is prepared by adding 1 to 4 ml of glutaraldehyde in a concentration of 30-70% to 46 to 49 ml of distilled water and applying it to 30 to 70 ml.

분석하고자 하는 단백질, 예컨대, C-반응성 단백을 고정화하기 위하여 먼저 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01~0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조한다. 격자로 된 스포팅 가이드(Spotting guide)상에 글루타르알데히드 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 1~100㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅한 후 뚜껑을 덮고 1~6시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시킨다. 항원의 고정화를 행한 글루타르알데이드 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹하기 위하여 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 용해된 1~5% BSA 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1~5시간 반응시키며, 반응이 끝난 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 BSA 블로킹된 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1-60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20-120분간 실온건조한다.       In order to immobilize the protein to be analyzed, for example, C-reactive protein, first, the C-reactive protein was dissolved in a concentration of 0.01-0.5 mg / ml in 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) to prepare an antigen solution for immobilization. do. Place Petri dishes containing glutaraldehyde-activated slides on a grid spotting guide, 1-100 µl of the antigen solution prepared previously, and spot the lid on the slide corresponding to the dropping point on the spotting guide. Cover and react for 1 to 6 hours to immobilize the antigen, and then wash the front and back of the slide 3 ~ 4 times with 30-70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) and soak for 1 minute in a beaker containing distilled water. Small plastic petri dishes containing 1-5% BSA solution dissolved in 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) to block the sites that did not react with the antigen on the surface of the glutaraldehyde-activated slide that had immobilized the antigen. Put the slide on the lid and react for 1 ~ 5 hours.After the reaction, wash the front and back of BSA-blocked slide with 30-70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) 3 ~ 4 times and put it in the beaker with distilled water. Immerse the slide for 1-60 minutes. Remove it and place the slide on Kimwipes for 20-120 minutes at room temperature.

둘째, MPTMS-GMBS(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma- maleimidobutyryloxy succinimide ester)방법으로 고정화하는 방법을 사용한다. 먼저 표면세척을 위하여 슬라이드를 진한염산(18-36%)과 메탄올(50-100%)의 혼합용액(HCl:MtOH = 1:1~1:2, 부피비율)에 15~45분 침지시킨 후 증류수로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 헹군다. 85~95℃의 증류수로 슬라이드를 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 실온에서 20~120분간 건조한다. Second, the method of immobilization by MPTMS-GMBS (3-Mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma-maleimidobutyryloxy succinimide ester) method is used. First, the surface is immersed in a mixed solution of concentrated hydrochloric acid (18-36%) and methanol (50-100%) (HCl: MtOH = 1: 1 ~ 1: 2, volume ratio) for 15 to 45 minutes for surface cleaning. Rinse the front and back three to four times with distilled water. The slides are washed with distilled water at 85 ~ 95 ℃, placed on Kimwipes and dried at room temperature for 20 ~ 120 minutes.

이렇게 준비된 슬라이드를 실란화시키기 위하여 1-3%의 톨루엔, 디메틸 포름아미드, 및 아세톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유기용매 용액에 용해된 MPTMS 용액 50~500㎖를 준비한다. 상기 용액이 담긴 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 상기의 MPTMS 용액의 조제에 사용된 동일한 유기용매로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 20~120분간 실온건조한다.In order to silanize the slide thus prepared, 50 to 500 mL of MPTMS solution dissolved in an organic solvent solution selected from the group consisting of 1-3% toluene, dimethyl formamide, and acetone is prepared. Put the slide in the Petri dish containing the solution and react for 1 to 3 hours at room temperature. After washing the front and back of the slide three to four times with the same organic solvent used in the preparation of the MPTMS solution, place on a Kimwips and dried at room temperature for 20 to 120 minutes.

슬라이드 표면을 활성화시키기 위하여 1~3mM GMBS용액을 다음과 같이 제조한다. GMBS시료 14~42㎎을 100㎕의 DMF(N,N-Dimethylformamide; 시그마알드리치사, 미국)에 녹인 후 에탄올 49.9㎖를 가한다. 상기 실란화 단계를 거친 슬라이드를 GMBS용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 30~90분간 반응시킨다. 증류수와 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한다. 그 후 슬라이드를 킴와이프스에 놓고 20~120분간 실온건조한다. In order to activate the slide surface 1 ~ 3mM GMBS solution is prepared as follows. Dissolve 14-42 mg of GMBS sample in 100 μl of DMF (N, N-Dimethylformamide; Sigma-Aldrich, USA) and add 49.9 mL of ethanol. The silanized slide was put in a Petri dish containing GMBS solution and reacted at room temperature for 30 to 90 minutes. Wash the front and back of the slide three to four times with distilled water and 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8). The slides are then placed in Kimwipes and allowed to dry at room temperature for 20 to 120 minutes.

CRP 항원의 고정화는 다음과 같이 실시한다. 먼저 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01~0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화 항원용액을 제조한다. 상기의 스포팅 가이드 위로 GMBS 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 1~100㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅한 후 뚜껑을 덮고 1~6시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 헹구고 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시킨다. 분석의 정확도를 높이기 위하여 1~5% BSA용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1~5시간 반응시킨다. 상기와 같은 인산버퍼용액을 사용하여 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한다. 증류수가 담긴 비커에 1~60분간 침지시킨 후, 킴와이프스 위에 슬라이드를 위치시키고 20~120분간 실온건조한다.Immobilization of the CRP antigen is performed as follows. First, the immobilized antigen solution is prepared by dissolving C-reactive protein in a concentration of 0.01-0.5 mg / ml in a 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8). Place petri dishes containing GMBS activation slides on the spotting guide and spot 1-100 μl of the antigen solution prepared on the spotting guide on the slide corresponding to the dropping point on the spotting guide. After immobilization, rinse the front and back sides 3 ~ 4 times with 30-70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) and immerse the slide in beaker containing distilled water for 1 ~ 60 minutes. To increase the accuracy of the assay, place the slide in a small plastic Petri dish containing 1-5% BSA solution and cover and react for 1-5 hours. Using the phosphate buffer solution as above, wash the front and back of the slide three to four times. After soaking for 1 to 60 minutes in a beaker containing distilled water, place the slide on the Kimwipe and dry at room temperature for 20 to 120 minutes.

상기 두 가지 방법을 개략적으로 나타낸 것을 도 1로서 나타내었다       A schematic representation of the two methods is shown as FIG. 1.

본 발명의 면역센서용 슬라이드를 이용하여 특정 단백질을 분석함에 있어서는 슬라이드에 고정되는 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 표지시킨다. 상기 항체를 표지시키는 것은 민감성과 재현성이 높은 형광염색방법을 사용하며, 이를 위하여 본 발명에서는 형광 실리카 나노입자(Fluorescent silica nanoparticle, 이하 "FSNP"라 칭한다)를 사용한다. In analyzing a specific protein using the slide for immunosensor of the present invention, an antibody that specifically binds to an antigen immobilized on the slide is labeled. Labeling the antibody uses a highly sensitive and reproducible fluorescence staining method, and for this purpose, fluorescent silica nanoparticles (hereinafter referred to as "FSNP") are used in the present invention.

형광 실리카 나노입자(FSNP)를 제조하는 방법에 대하여 개략적으로 기술한다. 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 표지하는데 사용되는 FSNP는 유기형광색소를 실리카 구조내로 포함시키는 포괄법(Dye entrapment), 활성화 유기형광색소를 아미노실란(Amino silane) 화합물과 공유결합 시킨 후 이를 실리카 구조내로 포합시키는 코어-쉘법(Core shell method), 유기형광색소를 실리카 구조내로 포합시켜 형성된 입자를 유기실란 (Organosilane) 화합물과 반응시켜 관능기를 도입하여 기능화하는 역 코어-쉘법(Inverted core shell method) 등에 의하여 제조된 것을 사용할 수 있다. 이 때 유기형광색소로는 디클로로트리스(1,10-페난트롤린) 루테니움(II)일수화물(Dichlorotris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II)·hydrate), 플루오레신(Fluorescein), 로다민 B(Rhodamine B), 5(6)-카르복시테트라메틸로다민(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine) 등을 사용할 수 있고, 활성화 유기형광색소로는 플루오레신 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate), 5(6)-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester), 테트라메틸로다민 5-이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine 5-isothiocyanate), 비스(2,2'-비피리딘)-4'-메틸-4-카르복시비피리딘-루테니움 N-숙신이미딜 에스테르 헥사 플루오로포스페이트 (Bis(2,2'-bipyridine)-4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis(hexafluorophosphate)), 비스(2,2'-비피리딘)- 4,4'-디카르복시비피리딘-루테니움 디(N-숙신이미딜 에스테르)비스(헥사플루오로포스페이트)(Bis(2,2'-bipyridine)-4,4'-dicarboxybipyridine ruthenium di(N-Succinimidyl ester)bis(hexafluorophosphate)) 등을 사용할 수 있으며, 아미노실란 화합물로는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-Aminopropyl)triethoxysilane) 등을 사용할 수 있으며, 유기실란 화합물로는 카르복실레이트(Carboxylate), 아민(Amine), 아민/포스포네이트(Amine/phosphonate), 폴리(에틸렌글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 옥타데실(Octadecyl), 카르복실레이트/옥타데실(Carboxylate/ octadecyl) 관능기를 지닌 화합물을 사용할 수 있다. A method for producing fluorescent silica nanoparticles (FSNP) is outlined. FSNP, which is used to label antibodies that specifically bind to antigens, is a dye entrapment incorporating organofluorescence into the silica structure, and covalently binds the activated organofluorescence with an aminosilane compound and then silica. Core shell method for incorporation into the structure, Inverted core shell method for incorporating functional groups by reacting particles formed by incorporating organic fluorescent dyes into the silica structure with organosilane compounds What was manufactured by etc. can be used. The organic fluorescent dyes include dichlorotris (1,10-phenanthroline) ruthenium (II) monohydrate (dichlorotris (1,10-phenanthroline) ruthenium (II) hydrate), fluorescein, rhoda Rhodamine B, 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine (5 (6) -Carboxytetramethylrhodamine) and the like can be used, and as an activated organic fluorescent dye, Fluorescein isothiocyanate, 5 ( 6) -carboxytetramethylhodamine N-succinimidyl ester (5 (6) -Carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester), tetramethylrhodamine 5-isothiocyanate, bis (2,2 ' -Bipyridine) -4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester hexafluorophosphate (Bis (2,2'-bipyridine) -4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis (hexafluorophosphate), bis (2,2'-bipyridine) -4,4'-dicarboxybipyridine-ruthenium di (N-succinimi Diyl ester) bis (hexafluorophosphate) (Bis (2,2'-bipyridine) -4,4'-dicarboxybipyridine ruthenium di (N-Succinimidyl ester) bis (hexafluorophosphate)) and the like. The (3-aminopropyl) triethoxy silane ((3-Aminopropyl) triethoxysilane) and the like can be used, the organosilane compound carboxylate (Carboxylate), amine (Amine), amine / phosphonate (Amine / Compounds having phosphonate, poly (ethylene glycol), octadecyl, and carboxylate / octadecyl functional groups can be used.

FSNP를 사용하여 항체를 표지시키는 방법을 설명한다. 우선, FSNP를 비오틴(Biotin)과 특이적으로 결합하는 스트렙트아비딘(Streptavidin, 이하 "SA"라 칭한다)으로 개질하는 것이 필요한데, 이는 이하에서 설명하는 SA가 부착된 FSNP를 비오티닐화된 항체와 결합시키기 위함이다. FSNP를 SA로 개질하기 위하여 3-머캅토프로필트리메톡시 실란 ((3-Mercaptopropyl)trimethoxy silane, 이하 "MPTMS"라 칭한다)과 반응시켜 티올-개질된 FSNP를 먼저 제조한다. 10~70㎖ 용량의 캡 튜브에 상기의 FSNP 1~5㎎과 에탄올, 메탄올, 프로판올 등의 알코올 5~15㎖를 가하여 잘 흔들어 준 후 FSNP를 알코올에 완전히 용해시키기 위하여 10~30분간 초음파처리 한다. 이 후 캡 튜브에 MPTMS 30-70~200㎕를 첨가하고 실온에서 30-200rpm의 저속으로 교반하면서 2~6시간 반응시킨다. 반응혼합물을 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 반응에 사용된 동일한 알코올을 사용하여 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻는다. 튜브의 캡을 분리하고 알루미늄호일을 살짝 덮어 실온건조한다. 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 2~6㎖에 재용해하여 티올-개질된 FSNP 용액을 제조한다. The method of labeling antibodies using FSNP is described. First, it is necessary to modify the FSNP with streptavidin (hereinafter referred to as "SA") which specifically binds to biotin, which means that the SA-attached FSNP as described below is combined with a biotinylated antibody. To combine. Thiol-modified FSNPs are first prepared by reacting with 3-mercaptopropyltrimethoxy silane ((3-Mercaptopropyl) trimethoxy silane, hereinafter referred to as "MPTMS") to modify the FSNP to SA. Add 1 ~ 5mg of FSNP and 5 ~ 15ml of alcohol such as ethanol, methanol, propanol to 10 ~ 70ml cap tube, shake well, and sonicate for 10 ~ 30 minutes to completely dissolve FSNP in alcohol. . After that add MPTMS 30-70 ~ 200μl to the cap tube and react for 2-6 hours while stirring at a low speed of 30-200rpm at room temperature. The precipitate obtained by centrifuging the reaction mixture at 7000-17000 rpm for 20 to 40 minutes at 3 to 10 ° C. was washed 1 to 5 times using the same alcohol used in the reaction, and after each washing, a precipitate was obtained by centrifugation under the same conditions. . Remove the cap from the tube and allow it to dry at room temperature with a little aluminum foil. The precipitate is redissolved in 2-6 ml of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) to prepare a thiol-modified FSNP solution.

티올-개질된 FSNP에 말레이미드 활성화된(Maleimide-activated) SA를 부가하여 SA가 부착된 FSNP를 제조한다. 보다 구체적으로, 10-70㎖ 용량의 캡 튜브에 SA-말레이미드 0.1~0.5㎎과 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 3~7㎖를 가하여 용해시켜 SA-말레이미드 용액을 제조한다. 여기에 상기에서 제조한 티올-개질된 FSNP용액 0.5~2.0㎖를 가하여 30~200rpm의 저속으로 계속 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 침전물을 취한다. 상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻는다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 1~5㎖에 재현탁시킨다. 이를 캡 튜브에 담아 알루미늄호일을 감싼 후 냉장보관하여 이하에서 설명하는 비오티닐화된 항체와 반응시킨다.Maleimide-activated SA is added to thiol-modified FSNP to prepare SA-attached FSNP. More specifically, 0.1-0.5 mg of SA-maleimide and 3-7 ml of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) were added to a 10-70 ml cap tube to dissolve the SA-maleimide solution. . 0.5 to 2.0 ml of the thiol-modified FSNP solution prepared above was added thereto and the mixture was stirred at a low speed of 30 to 200 rpm for 1 to 3 hours at room temperature. The precipitate is taken by centrifugation at 7000-17000 rpm for 20-40 minutes at 3-10 ° C. The precipitate taken in the above step is washed 1 to 5 times with 30 ~ 70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) and centrifuged under the same conditions after each wash to obtain a precipitate. The precipitate washed in this step is resuspended in 1-5 mL of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8). This is wrapped in an aluminum foil in a cap tube and refrigerated to react with the biotinylated antibody described below.

C-반응성 단백 항체의 비오티닐화는 다음 두 가지 방법 중의 어느 하나를 이용하여 실시 할 수 있다.Biotinylation of C-reactive protein antibodies can be carried out using either of the following two methods.

첫 번째 방법으로서, C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액(Carbonate- bicarbonate buffer)을 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 탄산완충용액을 얻는 단계, 유기용매인 디메틸 포름아미드(Dimethyl formamide)에 용해한 비오틴화 시약인 비오틴아미도헥사노익산 N-히드록시석신이미드 에스테르(Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 탄산완충용액과 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 염화나트륨 용액에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어지는 방법을 들 수 있다.As a first method, a carbonic acid buffer solution is added to a C-reactive protein antibody to obtain a carbonic acid buffer solution containing a C-reactive protein antibody, and biotin dissolved in dimethyl formamide, an organic solvent. Reacting the biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester (NHS-LC-biotin) solution with the carbonate buffer solution of the above step, the solution obtained in the step And dialysis in sodium chloride solution to remove unreacted biotinylation reagent.

보다 구체적으로, C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액을 가하여 C-반응성 단백 항체의 농도가 1.0~3.0㎎/㎖인 탄산완충용액을 얻는 단계, 디메틸 포름아미드에 1~5㎎/㎖ 농도로 용해한 NHS-LC-비오틴 용액 30~100㎕를 상기 단계의 탄산완충용액 25~75㎕와 1 내지 5시간 얼음물 하에서 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액 75~175㎕를 0.1~0.3M 염화나트륨 용액에서 하룻밤 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어진다.More specifically, adding a carbonic acid buffer solution to the C-reactive protein antibody to obtain a carbonic acid buffer solution having a C-reactive protein antibody concentration of 1.0 ~ 3.0mg / ㎖, dissolved in 1 ~ 5mg / ㎖ concentration in dimethyl formamide Reacting 30-100 μl of NHS-LC-biotin solution with 25-75 μl of carbonic acid buffer solution of the above step under ice water for 1-5 hours, 75-175 μl of the solution obtained in the above step is 0.1-0.3 M Dialysis overnight in sodium chloride solution to remove unreacted biotinylation reagent.

두 번째 방법으로서, C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 인산완충식염수를 얻는 단계, 재증류수에 용해한 수용성 비오틴화 시약인 설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 인산완충식염수와 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 인산완충식염수에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어지는 방법을 들 수 있다.As a second method, phosphate buffered saline is added to C-reactive protein antibody to obtain phosphate-buffered saline containing C-reactive protein antibody, and sulfosuccinimidyl-6- (bioti, a water-soluble biotinylation reagent dissolved in re-distilled water). Amido) hexanoate (Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate, sulfo-NHS-LC-biotin) solution is reacted with phosphate buffered saline of the above step, the solution obtained in the step of dialysis in phosphate buffered saline The method which consists of removing a reaction biotinylation reagent is mentioned.

보다 구체적으로, C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체의 농도가 0.5~3.0㎎/㎖인 인산완충식염수를 얻는 단계, 재증류수에 2~20mM 농도로 용해한 설포-NHS-LC-비오틴 용액 5~20㎕를 상기 단계의 인산완충식염수 30~800㎕와 얼음물 하에서 1 내지 5시간 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액 55~820㎕를 0.05~0.25M 인산완충식염수에 대하여 하룻밤 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어진다.More specifically, phosphate buffered saline is added to the C-reactive protein antibody to obtain phosphate-buffered saline having a concentration of 0.5-3.0 mg / ml of the C-reactive protein, and sulfo-NHS- dissolved in 2-20 mM in re-distilled water. 5 to 20 µl of LC-Biotin solution is reacted with 30 to 800 µl of phosphate buffered saline in the above step for 1 to 5 hours under ice water, and 55 to 820 µl of the solution obtained in the step is 0.05 to 0.25 M. Dialysis against phosphate buffered saline overnight to remove unreacted biotinylation reagent.

다음 단계로서 나노물질이 부착된 항체를 제조한다. 상기에서 제조한 SA 개질된 FSNP와 비오틴화된 항체를 가하여 혼합하면 비오틴이 SA와 특이적으로 결합하기 때문에 형광물질로 표지된 항체가 제조된다.As a next step, an antibody to which a nanomaterial is attached is prepared. When the SA-modified FSNP prepared above and the biotinylated antibody are added and mixed, the biotin is specifically bound to SA, thereby producing an antibody labeled with a fluorescent material.

보다 구체적으로, 상기에서 제조한 SA-개질된 FSNP 용액을 10~30분간 초음파처리 한 후 이 중 200~600㎕를 상기에서 제조한 0.05~0.25㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 1~3㎖에 가하여 30분 간격으로 30~200rpm의 저속으로 2~7분씩 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 취한다. 상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻는다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 0.4~1.2㎖에 재현탁시킨다. More specifically, the SA-modified FSNP solution prepared above was sonicated for 10-30 minutes, 200-600 μl of the biotinylated antibody solution 1-3 prepared at the concentration of 0.05-0.25 mg / ml prepared above. Add ㎖ and react for 1 to 3 hours at room temperature while stirring for 2 to 7 minutes at a low speed of 30 to 200 rpm at 30 minute intervals. Centrifuge at 7000-17000rpm for 20-40 minutes at 3 ~ 10 ℃, discard supernatant and take off precipitate. The precipitate taken in the above step is washed 1 ~ 5 times with 30 ~ 70mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8), and after each washing, the precipitate is obtained by centrifugation under the same conditions as above. The precipitate washed in this step is resuspended in 0.4-1.2 ml of 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8).

본 발명의 CRP와 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지하는 개략적인 방법을 도 2로서 나타내었다.A schematic method of labeling an antibody specifically binding to CRP of the present invention with a fluorescent substance is shown as FIG. 2.

본 발명의 면역센서용 슬라이드를 이용하여 특정 단백질을 분석함에 있어서 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질을 상기와 같이 표지된 항체와 혼합시킨다. In analyzing the specific protein using the slide for immunosensor of the present invention, the protein to be collected from the sample is mixed with the labeled antibody as described above.

보다 구체적으로, 에펜도르프 튜브에 있는 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 사용하여 단계별로 희석하여 제조한 각각의 농도별 C-반응성 단백 시료용액에 비오틴과 SA의 특이적 결합에 의하여 상기와 같이 제조한, 나노물질로서 FSNP가 부착된 C-반응성 단백 항체용액을 동량 가하여 혼합시킨 후 실온에서 5~300분간 정치시킨다. More specifically, each concentration of C-reactive protein sample prepared by diluting stepwise using 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) in an Eppendorf tube by specific binding of biotin and SA As the nano-material prepared as described above, an equal amount of FSNP-attached C-reactive protein antibody solution was added and mixed, followed by standing at room temperature for 5 to 300 minutes.

다음 단계로 상기와 같이 혼합된 혼합물을 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시킨다. The next step is to react the mixture as described above with the antigenic site immobilized on the slide.

보다 구체적으로, 상기의 글루타르알데히드 공정이나 MPTMS-GMBS 공정에 의하여 항원인 C-반응성 단백을 고정화하고 BSA(bovine serum albumin) 블로킹 공정에 의하여 비선택적인 단백질 흡착을 최소화한 바이오트랜스듀서(bio-transducer)로서의 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 격자로 된 스포팅 가이드 위에 올려놓고 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 상기와 같이 혼합하여 실온에서 5~300분간 정치시킨 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질과 상기와 같이 표지된 항체의 혼합물 1~100㎕를 정확히 스포팅 한 후 뚜껑을 덮고 실온에서 0.5~16시간 반응시켜 FSNP로 표지된 항체 및 슬라이드상에 고정된 항원과 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질간의 간접경합반응을 행한다. 반응이 끝난 후 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시켜 제거한다. More specifically, the biotransducer immobilized C-reactive protein as an antigen by the glutaraldehyde process or the MPTMS-GMBS process and minimizing non-selective protein adsorption by a BSA (bovine serum albumin) blocking process. Put the Petri dish containing the slide as a transducer) on the spotting guide of the lattice and mix the above with the antigen-immobilized part on the slide as described above, and the protein to be analyzed obtained from the sample which was allowed to stand at room temperature for 5 to 300 minutes. After accurately spotting 1-100 μl of the labeled antibody mixture, react with the lid and react for 0.5 to 16 hours at room temperature. Indirectly between the antibody labeled with FSNP and the antigen immobilized on the slide and the protein to be analyzed A competition reaction is carried out. After the reaction, the unreacted antibody and antigen were washed three to four times before and after the slide using distilled water, and then immersed in the beaker containing distilled water for 1 to 60 minutes to remove.

본 발명 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 간접경합방식에 의하여 결합하는 방식을 설명하는 모양을 도 3에 나타내었으며, 검체에서 채취한 C-반응성 단백 대신 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 상기와 같이 표지된 항체와 혼합한 후 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 적하하여 경시적인 항원·항체반응을 행하였을 때 슬라이드에 결합된 형광입자수의 변화를 도 4에 나타내었다. Figure 3 illustrates how the antigens immobilized on the slides of the present invention and the fluorescently labeled antibodies bind by indirect competition. The 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5) is used instead of the C-reactive protein taken from the sample. -7.8) was mixed with the labeled antibody as described above, and then dropped into the site where the antigen on the slide was immobilized to change the number of fluorescent particles bound to the slide when antigen / antibody reaction was performed over time. .

상기 슬라이드를 인큐베이터에 넣고 20~120분간 건조한다. Place the slide in an incubator and dry for 20-120 minutes.

형광현미경을 사용하여 형광강도 및 형광입자 수를 측정한다. 검체 중의 CRP 농도가 높으면 형광표지된 항체와 반응을 많이 하기 때문에 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 결합하는 수가 적어 형광강도와 형광입자 수가 줄기 때문에 형광이 낮게 나타난다. 이와 같이 슬라이드에 고정된 항원과 검체 중의 항원은 형광표지된 항체와 경쟁적인 상호작용을 통하여 형광도가 다르게 나타나기 때문에 CRP를 단시간내에 간단히 측정할 수 있게 된다. Fluorescence microscopy is used to measure fluorescence intensity and number of fluorescent particles. If the CRP concentration in the sample is high, it reacts with the fluorescently labeled antibody so that the number of antigens immobilized on the slide and the fluorescently labeled antibody are less likely to bind. As described above, the antigens immobilized on the slides and the antigens in the sample show different fluorescence through competitive interaction with the fluorescently labeled antibody, so that the CRP can be easily measured in a short time.

본 발명에 의하여 관상동맥질환, 고혈압 및 염증에 대한 주요한 바이오마커의 하나로 알려지고 있는 C-반응성 단백을 슬라이드에 코팅하고 형광성 나노프로브와 결합되어 있는 항체를 반응시킴으로서 나노몰 수준으로 측정할 수 있어 특정한 생체내 식품기능성의 지표인 해당 바이오마커를 고감도로 간편하게 측정할 수 있는 면역센서용 슬라이드가 제공된다.According to the present invention, C-reactive protein, which is known as one of the major biomarkers for coronary artery disease, hypertension and inflammation, can be measured at nanomolar levels by coating a slide on a slide and reacting an antibody bound with fluorescent nanoprobes. Provided is a slide for an immunosensor that can easily measure the biomarker, an indicator of food functionality in vivo, with high sensitivity.

본 발명은 C-반응성 단백 이외에 향후 엘디엘(low density lipoprotein, LDL), 피브리노겐(fibrinogen), 안기오텐신 II(angiotensin II) 등 실험동물의 혈액 등에 다양한 농도범위로 존재하는 바이오마커에 대한 초고감도 고속 동시측정에 필요한 식품기능성 평가와 관련된 기반기술을 확립할 수 있다.The present invention, in addition to the C-reactive protein in the future ultra-high sensitivity for biomarkers present in various concentration ranges in the blood of experimental animals such as low density lipoprotein (LDL), fibrinogen, angiotensin II (angiotensin II) Underlying techniques for evaluating food functionality required for high-speed simultaneous measurements can be established.

도 1은 C-반응성 단백을 항원에 고정시키는 두 가지 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 CRP와 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 간접경합방식에 의하여 결합하는 방식을 설명하는 도이다.
도 4는 검체에서 채취한 C-반응성 단백 대신 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 본 발명에 의한 표지된 항체와 혼합한 후 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 적하하여 경시적인 항원·항체반응을 행하였을 때 슬라이드에 결합된 형광입자수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5의 a, b, c는 피란하용액 처리전 슬라이드의 표면에 존재하는 불순물 등 오염물질의 저해반점이 피란하처리를 통하여 제거됨을 나타내는 도로서, APTMS에 의한 실란화을 거친 후에도 형광영상상의 저해반점이 관찰되지 않음을 나타내는 도이다. 도 5의 d는 글루타르알데히드 2.5% 용액으로 처리한 기판을 처리하여 형광영상 사진을 찍어 저해반점이 발견되지 않음을 나타낸 도이다. 도 5의 e는 항원 고정화 후 BSA 블로킹 슬라이드 표면에서 저해반점은 발견되지 않음을 나타낸 도이다. 도 5의 f는 본 발명의 방법에 의하여 간접경합반응을 행한 슬라이드 표면에 결합한 형광 실리카 나노입자 표지항체의 형광반점을 나타낸 도이다.
도 6은 형광분석을 위한 장치를 나타낸 그림이다.
도 7은 항원고정화 면역형광 슬라이드 및 FSNP 표지항체 기반 C-반응성 단백의 검량선을 나타내는 그래프이다.
1 is a schematic representation of two methods of immobilizing C-reactive protein to antigen.
2 is a schematic diagram showing a method of labeling an antibody that specifically binds CRP with a fluorescent substance.
3 is a view illustrating a method in which an antigen immobilized on a slide of the present invention and a fluorescently labeled antibody bind by indirect competition.
Figure 4 shows the time-dependent antigen by dropping 30-70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) instead of the C-reactive protein collected from the sample with the labeled antibody according to the present invention to the site where the antigen on the slide is immobilized. • A graph showing the change in the number of fluorescent particles bound to a slide when an antibody reaction was performed.
5, a, b, and c are diagrams showing that the inhibitory spots of contaminants such as impurities present on the surface of the slide before the treatment of the piranha solution are removed by the piranha treatment, and the inhibition of the fluorescence image even after silencing by APTMS Figure showing that no spots are observed. 5D is a diagram showing that no inhibitory spots are detected by taking a fluorescence image by treating a substrate treated with a glutaraldehyde 2.5% solution. 5E shows that no inhibition spots were found on the surface of the BSA blocking slide after antigen immobilization. Figure 5f is a diagram showing the fluorescence spot of the fluorescent silica nanoparticle-labeled antibody bound to the slide surface subjected to indirect competition by the method of the present invention.
6 shows an apparatus for fluorescence analysis.
FIG. 7 is a graph showing the calibration curve of antigen-immobilized immunofluorescence slides and FSNP labeled antibody based C-reactive protein.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 설명한다. 그러나 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되지 아니한다.Hereinafter, a specific method of the present invention will be described with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited only to these examples.

본 실험에서 사용되는 재료는 다음과 같다:The materials used in this experiment are as follows:

마우스 골수종 세포주(NSO)에서 발현된 재조합 히스티딘 태그된 래트 CRP(순수한 상태)는 R&D Systems, Inc.(미니아폴리스, MN, 미합중국)에서 입수하여 본 실험 전 과정에서 사용하였다. 이의 호모펜타메릭(homopentameric)구조는 세 개의 비공유 및 두 개의 공유결합된 서브유니트로 이루어져 있다. 마우스 골수종과 정제된, NSO-유래로부터 얻어진 재조합 래트 CRP로 면역된 마우스로부터 얻은 B셀을 융합한 것으로부터 나온 하이브리도마로부터 생성된 단일클론 항-래트 CRP항체도 상기 R&D Systems Inc.로부터 입수하였다. 글라스 슬라이드는 Coring Inc.(Kennebunk, ME, 미합중국)에서 입수하였다. 수용성 비오틸화 시약(설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(설포-NHS-LC-비오틴)은 Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, IL, 미합중국)으로부터 구입하였다. 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 글루타르알데히드 및 소 혈청 알부민(BSA)은 Sigma- Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, 미합중국)에서 입수하였다. 모든 다른 화합물들은 다양한 공급자로부터 보증된 것들이며 실험의 전 과정에서 이중 증류수를 사용하였다.Recombinant histidine tagged rat CRP (pure state) expressed in mouse myeloma cell line (NSO) was obtained from R & D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, United States) and used throughout the experiment. Its homopentameric structure consists of three non-covalent and two covalently bonded subunits. Monoclonal anti-rat CRP antibodies generated from hybridomas derived from fusion of mouse myeloma with purified B cells from mice immunized with purified, recombinant rat CRP derived from NSO-derived were also obtained from the above R & D Systems Inc. . Glass slides were obtained from Coring Inc. (Kennebunk, ME, United States). Aqueous biotylation reagent (sulfosuccinimidyl-6- (biothiamidido) hexanoate (sulfo-NHS-LC-biotin) was purchased from Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, United States). Propyltrimethoxysilane (APTMS), glutaraldehyde and bovine serum albumin (BSA) were obtained from Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, United States) All other compounds are warranted from various suppliers Double distilled water was used throughout the experiment.

실시예Example 1:  One: APTMSAPTMS -- GAGA 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화 Antigen Immobilization on Treatment Slides

항원을 슬라이드에 고정하는 것은 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비하였다. 즉, 표면클리닝을 위하여 슬라이드를 피란하 용액(H2SO4:H2O2 = 3:1, 부피비율)에 10분간 침지한 후, 증류수로 헹군 다음 증류수내에서 5분간 초음파처리 하고 90℃의 열수로 1시간 수화시켜 세척한 후 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 30분간 실온건조하였다. Fixing the antigen to the slide was prepared by the following procedure. In other words, the surface was immersed in a piranha solution (H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 3: 1, volume ratio) for 10 minutes, rinsed with distilled water, sonicated in distilled water for 5 minutes and 90 ℃ After hydrated with hot water for 1 hour, the slide was placed on a Kimwipers and dried at room temperature for 30 minutes.

항원의 고정화에 필요한 반응기인 아미노기(-NH2)를 슬라이드 표면에 도입하기 위한 실란화를 행하기 위하여 표면세척을 행한 준비된 슬라이드를 아세톤에 10% 농도로 용해된 APTMS 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 아세톤, 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4), 증류수로 슬라이드 앞, 뒤를 3회씩 순차적으로 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에서 30분간 실온건조한 후 120℃ 대류오븐에서 5시간 열처리한 후 방냉하고 형광영상 사진을 찍었다(도 5의 a, b, c). 도 5의 a, b, c에서 볼 수 있는 것처럼 피란하처리 전 슬라이드의 표면에 존재하는 불순물 등 오염물질의 저해반점이 피란하처리를 통하여 제거됨을 알 수 있었고 APTMS에 의한 실란화를 거친 후에도 형광영상상의 저해반점이 관찰되지 않음을 알 수 있었다. In order to perform silanization for introducing the amino group (-NH 2 ), which is a reactor required for immobilization of the antigen, to the slide surface, the prepared slides subjected to surface washing are placed in a petri dish containing APTMS solution dissolved in acetone at 10% concentration. Reaction was carried out for 1 hour. Acetone, 50mM phosphate buffer solution (pH 7.4), distilled water was washed sequentially three times before and after the slide and immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute. This was taken out, dried at room temperature for 30 minutes on a Kimwips, and then heat-treated in a convection oven at 120 ° C. for 5 hours to cool, and a fluorescent image was taken (FIG. 5 a, b, c). As shown in a, b, and c of FIG. 5, it can be seen that the inhibitory spots of contaminants such as impurities present on the surface of the slide before the Piranha treatment are removed through the Piranha treatment and fluorescence even after silanization by APTMS. It was found that no inhibition spot was observed on the image.

APTMS로 개질된 슬라이드를 활성화시키기 위하여 증류수에 15분간 침지하여 수화시켰다. 침지된 슬라이드를 꺼내서 글루타르알데히드 2.5% 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어서 1시간 반응시켜 슬라이드 표면에 단백질이 결합할 수 있도록 활성화시켰다. 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 활성화된 슬라이드 앞, 뒤를 3회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1분간 침지시켰다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 30분간 실온건조하였으며, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 GA활성화 슬라이드 표면에서도 저해반점은 발견되지 않았다(도5의 d).        Hydrated by soaking in distilled water for 15 minutes to activate the slide modified with APTMS. The immersed slide was taken out and placed in a petri dish containing 2.5% glutaraldehyde solution for 1 hour to activate the protein to bind to the slide surface. The slides were washed three times before and after the slides activated with a 50 mM phosphate buffer (pH 7.4), and the slides were immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute. This was taken out and placed on a slide on Kimwipes, dried for 30 minutes at room temperature, and confirmed by taking a fluorescence image, no inhibition spot was found on the surface of the GA-activated slide (Fig. 5d).

항원(CRP, C-반응성 단백)을 슬라이드상에 고정시키기 위하여 먼저 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 C-반응성 단백을 0.1㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하였다. 격자로 된 스포팅 가이드(Spotting guide)상에 글루타르알데히드 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 20㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅(적하, spotting)한 후 뚜껑을 덮고 1시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 항원의 고정화를 행한 글루타르 알데히드 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹(blocking)하기 위하여 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 용해된 1% BSA(bovine serum albumin) 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1시간 반응시켰다. 이 슬라이드를 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 앞, 뒤를 3회 세척하고, 증류수가 담긴 비커에 1분간 침지시키고, 킴와이프스 위에 위치시킨 후 30분간 실온건조하였으며, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 항원 고정화 후 BSA 블로킹 슬라이드 표면에서도 저해반점은 발견되지 않았다(도5의 e).        In order to immobilize the antigen (CRP, C-reactive protein) on a slide, the immobilized antigen solution was prepared by dissolving C-reactive protein at a concentration of 0.1 mg / ml in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4). Place Petri dishes containing glutaraldehyde-activated slides on a grid spotting guide, and place 20 µl of the prepared antigen solution on the slide corresponding to the dropping point on the spotting guide. After the lid was capped and reacted for 1 hour to fix the antigen, the front and rear surfaces of the slide were washed three times with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) and immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute. A small plastic petri containing 1% BSA (bovine serum albumin) solution dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) to block the sites that did not react with the antigen on the surface of the glutaraldehyde-activated slide that had immobilized the antigen. The slide was placed in a dish and the lid was covered for 1 hour. The slides were washed three times in the front and the back with 50mM phosphate buffer (pH 7.4), immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute, placed on a Kimwipe, dried at room temperature for 30 minutes, and photographed for fluorescence imaging. No inhibition spots were also found on the surface of the BSA blocking slide after antigen immobilization (FIG. 5E).

실시예Example 2:  2: MTSMTS -- GMBSGMBS 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화 Antigen Immobilization on Treatment Slides

항원을 슬라이드에 고정하는 것은 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비하였다. 즉, 표면클리닝을 위하여 슬라이드를 진한염산(35%)과 메탄올(70%)이 1:1의 부피비율로 혼합된 용액에 30분간 침지한 후, 증류수로 슬라이드를 3회 세척하였다. 진한황산에 30분 침지한 후 증류수로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고, 끓는 증류수로 슬라이드를 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 실온에서 30분간 건조하였다. Fixing the antigen to the slide was prepared by the following procedure. That is, the surface was immersed for 30 minutes in a solution of concentrated hydrochloric acid (35%) and methanol (70%) in a volume ratio of 1: 1 for surface cleaning, and then washed the slide three times with distilled water. After immersing in concentrated sulfuric acid for 30 minutes, the front and rear sides of the slides were washed three times with distilled water.

항원의 고정화에 필요한 반응기인 티올기(-SH)를 슬라이드 표면에 도입하기 위한 실란화를 행하기 위하여 톨루엔 98㎖에 MPTMS ((3-Mercaptopropyl)trimethoxy silane) 2㎖을 첨가하여 2% MPTMS 용액을 제조하였다. 상기의 용액이 담긴 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이 후 톨루엔으로 슬라이드를 3회 세척한 후, 킴와이프스에 슬라이드를 위치시키고 30분간 실온에서 건조하였다.2 ml of MPTMS solution was added to 98 ml of toluene by adding 2 ml of MPTMS ((3-Mercaptopropyl) trimethoxy silane) to 98 ml of toluene for silanization to introduce thiol group (-SH), which is a reactor required for immobilization of antigen, to the slide surface. Prepared. The slide was placed in a Petri dish containing the above solution and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, the slides were washed three times with toluene, and then the slides were placed in Kimwipes and dried at room temperature for 30 minutes.

MPTMS로 개질된 슬라이드를 활성화시키기 위하여 28㎎의 GMBS를 100㎕의 DMF(N,N-Dimethylformamide, chromosllvr®Plus, St. Louis, MO, 미합중국, HPLC≥99.9%)에 용해한 후 여기에 에탄올 49.9㎖를 가하여 2mM GMBS용액을 제조하였다. 실란화된 슬라이드를 2mM GMBS용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 증류수와 50mM 인산완충용액(pH 7.4)로 슬라이드의 앞, 뒤를 3회 세척하고 킴와이프스에서 30분간 실온건조하였다.To activate the slides modified with MPTMS, 28 mg of GMBS was dissolved in 100 μl of DMF (N, N-Dimethylformamide, chromosllvr ® Plus, St. Louis, MO, United States, HPLC≥99.9%) followed by 49.9 mL of ethanol. 2 mM GMBS solution was prepared by adding thereto. The silanized slides were placed in a Petri dish containing 2 mM GMBS solution and allowed to react at room temperature for 1 hour. The front and rear surfaces of the slides were washed three times with distilled water and 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) and dried at room temperature for 30 minutes in Kimwipes.

항원(CRP, C-반응성 단백)을 슬라이드상에 고정시키기 위하여 먼저 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 C-반응성 단백을 0.1㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하였다. 상기의 스포팅 가이드 위에 GMBS 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 20㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 적하한 후 뚜껑을 덮고 1시간 반응시켜 항원의 고정화를 행하였다. 이 슬라이드를 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 항원의 고정화를 행한 GMBS 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹하기 위하여 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 용해된 1% BSA 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1시간 반응시켰다. 이 슬라이드를 50mM 인산완충용액(pH 7.4)으로 앞, 뒤를 3회 세척하고, 증류수가 담긴 비커에 1분간 침지시키고, 킴와이프스 위에 위치시킨 후 30분간 실온건조시켰다.        In order to immobilize the antigen (CRP, C-reactive protein) on a slide, the immobilized antigen solution was prepared by dissolving C-reactive protein at a concentration of 0.1 mg / ml in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4). Place petri dishes containing GMBS activation slides on the spotting guides, and add 20 µl of the antigen solution previously prepared to the slide site corresponding to the dropping point on the spotting guide, cover the lid, and react for 1 hour to immobilize the antigen. It was. The slides were washed three times in front of the slides with a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) and immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute. To block antigen-unreacted sites on the surface of the GMBS-activated slides with immobilized antigen, place the slide in a small plastic Petri dish containing 1% BSA solution dissolved in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) and cover the lid for 1 hour. Reacted. The slides were washed three times, front and back, with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4), immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute, placed on a Kimwipe and dried at room temperature for 30 minutes.

MTS-GMBS 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화과정의 각 단계인 표면클리닝, 실란화, 활성화, 항원 고정화 및 BSA 블로킹을 행한 슬라이드에 대하여 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 진한염산과 메탄올 혼합용액(1:1, 부피비율) 처리전 슬라이드의 경우를 제외하고는 슬라이드 표면에서 센서계측을 저해하는 저해반점은 발견되지 않았다.        Fluorescence images were taken on slides subjected to surface cleaning, silanization, activation, antigen immobilization and BSA blocking, which are the stages of the antigen immobilization process on the MTS-GMBS treatment slide. , Volume ratio) No inhibition spot was detected on the slide surface except for the slide before treatment.

실시예Example 3:  3: SASA in 개질된Modified FSNPFSNP 의 제조Manufacture

25㎖ 용량의 캡 튜브에 상기의 FSNP 2㎎과 에탄올 10㎖를 가하여 잘 흔들어 준 후 FSNP를 에탄올에 완전히 용해시키기 위하여 15분간 초음파처리 하였다. 이 후 캡 튜브에 MPTMS 100㎕를 첨가하고 실온에서 100rpm으로 저속교반하면서 4시간 반응시켰다. 반응혼합물을 4℃에서 30분간 13000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 에탄올로 3회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 튜브의 캡을 분리하고 알루미늄호일을 살짝 덮어 실온건조시켰다. 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 4㎖에 재용해하여 티올-개질된 FSNP 용액을 제조하였다. 2 mg of FSNP and 10 ml of ethanol were added to a 25 ml cap tube, followed by shaking for 15 minutes to completely dissolve FSNP in ethanol. Thereafter, 100 µl of MPTMS was added to the cap tube, and reacted for 4 hours while stirring at low speed at 100 rpm at room temperature. The precipitate obtained by centrifuging the reaction mixture at 13000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. was washed three times with ethanol and centrifuged under the same conditions after each wash to obtain a precipitate. The cap of the tube was removed and slightly dried with aluminum foil. The precipitate was redissolved in 4 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) to prepare a thiol-modified FSNP solution.

25㎖ 용량의 캡 튜브에 SA-말레이미드 0.25㎎과 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 5㎖를 가하여 용해시켜 SA-말레이미드 용액을 제조하였다. 여기에 상기의 티올-개질된 FSNP용액 1㎖를 가하여 100rpm의 저속으로 계속 저어주면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 4℃에서 20분간 10000rpm으로 원심분리하여 침전물을 취하였다. 상기 단계에서 취한 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 3회 세척하고, 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH7.4) 2㎖에 재현탁시켰다. 이를 캡 튜브에 담아 알루미늄호일을 감싼 후 냉장보관하여 이하에서 설명하는 비오티닐화된 항체와 반응시켰다.SA-maleimide solution was prepared by dissolving 0.25 mg of SA-maleimide and 5 ml of 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) in a 25 ml cap tube. 1 ml of the thiol-modified FSNP solution was added thereto, followed by reaction at room temperature for 2 hours while stirring was continued at a low speed of 100 rpm. The precipitate was taken by centrifugation at 10000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. The precipitate taken in the above step was washed three times with 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4), and after each washing, the precipitate was obtained by centrifugation under the same conditions as above. The precipitate washed in this step was resuspended in 2 ml of 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4). This was wrapped in aluminum foil in a cap tube and refrigerated to react with the biotinylated antibody described below.

실시예Example 4: 항체의  4: of antibody 비오티닐화Biotinylation

냉장보관하는 수용성 비오틴화 시약인 설포석신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS- LC-비오틴) 1㎎ 바이알(vial)을 실험 당일 냉장고에서 꺼내 실온조건으로 옮겨주고 단일클론 항-래트 CRP항체 30-700㎍ 바이알에 0.1M 인산완충식염수(pH 7.2) 30-700㎕를 가하여 용해시켰다. 상기의 설포-NHS-LC-비오틴 1㎎ 바이알에 증류수 180㎕를 가하여 10mM 설포-NHS-LC-비오틴 용액을 제조한 후 이 중 6.67㎕를 상기의 항체용액에 가하여 비오틴과 항체의 분자비율을 20:1로 조정하였다. 반응혼합물이 담긴 바이알을 가볍게 흔들어 섞어준 후 에펜도르프 튜브 랙에 담아 얼음물에 넣어 2시간 반응시켰다. Slide-A-lyzer kit(Pierce Biotechnology, Inc)에 반응혼합물을 넣은 후 0.1M 인산완충식염수(pH 7.2)에 대하여 하룻밤 투석하여 미반응시약을 제거하고, 투석막내의 내용물을 회수한 후 동일한 인산완충식염수를 사용하여 총 부피를 1㎖로 조절하여 비오티닐화 항체를 제조하였다. 1 mg vial of sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate, sulfo-NHS-LC-biotin, a refrigerated water-soluble biotinylation reagent On the day of the experiment, the resultant was removed from the refrigerator to room temperature, and dissolved in 30-700 µl of monoclonal anti-rat CRP antibody by adding 30-700 µl of 0.1 M phosphate buffered saline (pH 7.2). 180 μl of distilled water was added to the 1 mg vial of sulfo-NHS-LC-biotin to prepare a 10 mM sulfo-NHS-LC-biotin solution, and 6.67 μl of the solution was added to the antibody solution to determine the molecular ratio of biotin and antibody 20. It adjusted to: 1. The vial containing the reaction mixture was gently shaken and mixed, put in an Eppendorf tube rack, and placed in iced water for 2 hours. The reaction mixture was placed in a Slide-A-lyzer kit (Pierce Biotechnology, Inc), and then dialyzed overnight with 0.1 M phosphate buffered saline (pH 7.2) to remove the unreacted reagent, and the contents of the dialysis membrane were recovered. Biotinylated antibodies were prepared by adjusting the total volume to 1 ml using saline.

실시예Example 5:  5: 나노물질이Nanomaterial 부착된 항체의 제조 Preparation of Attached Antibodies

SA-개질된 FSNP 용액을 15분간 초음파처리 한 후 이 중 400㎕를 0.1㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 2㎖에 가하여 30분 간격으로 100rpm의 저속으로 5분씩 저어주면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 4℃에서 20분간 10000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 취하였다. 상기 단계에서 취한 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH7.4)으로 3회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 0.8㎖에 재현탁시켰다. After sonicating the SA-modified FSNP solution for 15 minutes, 400 μl of this solution was added to 2 ml of the biotinylated antibody solution at a concentration of 0.1 mg / ml, and stirred for 5 minutes at a low speed of 100 rpm at 30 minute intervals for 2 hours at room temperature. I was. The supernatant was discarded by centrifugation at 10000 rpm for 20 minutes at 4 ° C, and a precipitate was taken. The precipitate taken in the above step was washed three times with 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4), and after each washing, the precipitate was obtained by centrifugation under the same conditions as above. The precipitate washed in this step was resuspended in 0.8 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.4).

실시예Example 6:  6: 검체용액과Sample solution 표지항체의 혼합 Blend of labeled antibodies

에펜도르프 튜브에 있는 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)을 사용하여 단계별로 희석하여 제조한 각각의 농도별 C-반응성 단백 시료용액에 비오틴과 SA의 특이적 결합에 의하여 상기와 같이 제조한, 나노물질로서 FSNP가 부착된 C-반응성 단백 항체용액을 동량 가하여 혼합시킨 후 실온에서 1시간 정치시켰다.Nanomaterial prepared as above by specific binding of biotin and SA to each concentration of C-reactive protein sample solution prepared by diluting stepwise using 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) in Eppendorf tubes. As a mixture, an equal amount of C-reactive protein antibody solution with FSNP was added thereto, followed by mixing for 1 hour at room temperature.

실시예Example 7: 간접경합반응 7: indirect competition

상기의 실시예 1과 실시예 2에 의하여 항원인 C-반응성 단백을 고정화하고 BSA 블로킹 공정에 의하여 비선택적인 단백질 흡착을 최소화한 바이오트랜스듀서로서의 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 격자로 된 스포팅 가이드위에 올려놓고 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 상기와 같이 혼합하여 실온에서 1시간 정치시킨, 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질과 상기와 같이 표지된 항체의 혼합물 20㎕를 정확히 적하한 후 뚜껑을 덮고 실온에서 2시간 반응시켜 FSNP로 표지된 항체 및 슬라이드상에 고정된 항원과 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질간의 간접경합반응을 행하였다. 반응이 끝난 후 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 슬라이드 앞, 뒤를 3회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1분간 침지시켜 제거하였다.The Petri dishes containing the slides as biotransducers immobilizing the C-reactive protein as an antigen and minimizing non-selective protein adsorption by the BSA blocking process according to Examples 1 and 2 above were placed on a lattice spotting guide. Place it on the slide where the antigen on the slide is immobilized and mix as above and let stand for 1 hour at room temperature. Accurately add 20 µl of the mixture of the protein to be analyzed and the labeled antibody as described above, and close the lid. The reaction was carried out at room temperature for 2 hours to perform an indirect competition reaction between the antibody labeled with FSNP and the antigen immobilized on the slide and the protein to be analyzed. After the reaction, the unreacted antibody and antigen were washed three times before and after the slide using distilled water, and then, the slide was immersed in a beaker containing distilled water for 1 minute and removed.

실시예Example 8: 형광영상 분석 8: Fluorescence Image Analysis

간접경합반응을 행한 실시예 7의 슬라이드를 인큐베이터에 넣고 건조하였다. 건조한 슬라이드를 형광현미경을 사용하여 형광영상 분석을 행하고 형광강도 및 형광입자 수를 측정하였다. 도 6은 형광분석을 위한 장치를 나타내고, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 간접경합반응을 행한 슬라이드 표면에 결합한 FSNP 표지항체의 형광반점을 확인할 수 있었다(도 5의 f). 도 7은 FSNP 표지항체를 이용한 C-반응성 단백의 농도 의존적 형광영상으로부터 상대형광도를 측정하여 작성한 검량선을 나타내는데, 검체 중의 CRP 농도가 증가하면 표지항체와의 반응정도가 높아지므로 슬라이드에 고정화된 항원과 표지항체와의 결합정도는 줄어들어 형광이 낮게 나타났으며, 매우 낮은 C-반응성 단백의 농도범위에서 직선성을 보여주어 본 면역형광 슬라이드에 의한 CRP 계측 시의 검출한계가 0.1~1.0 ng/㎖에 이를 정도로 감도가 매우 높음을 알 수 있었다. The slide of Example 7 subjected to indirect competition was placed in an incubator and dried. The dried slides were analyzed by fluorescence microscopy to measure fluorescence intensity and number of fluorescence particles. FIG. 6 shows a device for fluorescence analysis, and the fluorescence spots of the FSNP-labeled antibody bound to the slide surface subjected to indirect competition were confirmed by taking fluorescence image photographs (FIG. 5 f). Figure 7 shows the calibration curve prepared by measuring the relative fluorescence from the concentration-dependent fluorescence image of the C-reactive protein using the FSNP-labeled antibody. As the CRP concentration in the sample increases, the degree of reaction with the labeling antibody is increased, the antigen immobilized on the slide The degree of fluorescence was low due to the decrease in the degree of binding to the labeled antibody and the linearity in the concentration range of very low C-reactive protein. The limit of detection for CRP measurement by immunofluorescent slide was 0.1 ~ 1.0 ng / ml. The sensitivity was very high.

실시예Example 9:  9: 면역형광Immunofluorescence 슬라이드 제조 Slide manufacturer

실시예 1내지 8의 방법을 적용하여 30X70mm의 가로, 세로 규격을 지닌 투명한 현미경용 슬라이드를 사용하여 1회용의 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필트리메톡시실란-N-감마 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르로 슬라이드 표면이 개질되고, 0.01-0.5㎎/㎖의 농도인 C-반응성 단백을 1-100㎕ 포함하는 면역형광 슬라이드를 제조하였다.Disposable 3-aminopropyltrimethoxysilane or 3-mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma using a transparent microscope slide having a horizontal and vertical dimension of 30 × 70 mm using the method of Examples 1-8. An immunofluorescent slide was prepared by modifying the slide surface with maleimidobutyryloxy succinimide ester and containing 1-100 μl of C-reactive protein at a concentration of 0.01-0.5 mg / ml.

Claims (3)

C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 상기 C-반응성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광나노입자로 표지시키는 단계, 검체에서 채취한 상기 C-반응성 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하여 분석하는 단계에 있어서,
항체를 형광 나노입자로 표지시키기 위하여,
스트렙트아비딘-개질된 형광 실리카 나노입자 용액을 10~30분간 초음파처리 하는 단계;
상기 단계에서 제조한 용액 200~600㎕를 0.05~0.25 ㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 1~3㎖에 가하여 30분 간격으로 30~200rpm의 저속으로 2~7분씩 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시키는 단계;
3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 수득하는 단계;
상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 수득하는 단계; 및
상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 0.4~1.2㎖에 재현탁시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
Manufacturing a protein chip by immobilizing the C-reactive protein on a slide, labeling an antibody that specifically binds the C-reactive protein with fluorescent nanoparticles, and labeling the C-reactive protein obtained from a sample with the fluorescent label In the step of mixing with the prepared antibody, the mixed mixture is reacted with the antigenic site fixed on the slide, and analyzed by measuring the fluorescence intensity or the number of fluorescent particles using a fluorescence microscope,
In order to label antibodies with fluorescent nanoparticles,
Sonicating the streptavidin-modified fluorescent silica nanoparticle solution for 10-30 minutes;
200-600 μl of the solution prepared in the above step was added to 1-3 mL of the biotinylated antibody solution of 0.05-0.25 mg / ml concentration, and stirred at a low speed of 30-200 rpm for 2-7 minutes at 30-minute intervals. Reacting for 3 hours;
Centrifuging at 7000-17000 rpm for 20-40 minutes at 3-10 ° C. to discard the supernatant to obtain a precipitate;
Washing the precipitate taken in the step 1 to 5 times with 30 to 70 mM phosphate buffer solution (pH 6.5-7.8) and centrifuging under the same conditions as above after each washing to obtain a precipitate; And
The method of producing an antigen-immobilized immunofluorescence slide comprising the step of resuspending the precipitate washed in the step in 0.4 ~ 1.2ml 30-70mM phosphate buffer (pH 6.5-7.8).
제 1항의 방법에 의하여 제조되는 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필트리메톡시실란-N-감마 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르로 슬라이드 표면이 개질되고, 0.01-0.5㎎/㎖의 농도인 C-반응성 단백을 1-100㎕ 포함하는 면역형광 슬라이드.The slide surface is modified with 3-aminopropyltrimethoxysilane or 3-mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma maleimidobutyryloxy succinimide ester prepared by the method of claim 1, and 0.01-0.5 mg Immunofluorescence slide containing 1-100 μl of C-reactive protein at a concentration of / ml. 제 2항에 의한 면역형광 슬라이드를 사용하여 검체중의 C-반응성 단백질을 측정하는 방법.

A method for measuring a C-reactive protein in a sample using the immunofluorescent slide according to claim 2.

KR1020110080708A 2011-08-12 2011-08-12 Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method KR101195253B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110080708A KR101195253B1 (en) 2011-08-12 2011-08-12 Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110080708A KR101195253B1 (en) 2011-08-12 2011-08-12 Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100016157A Division KR101140029B1 (en) 2010-02-23 2010-02-23 Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110110072A true KR20110110072A (en) 2011-10-06
KR101195253B1 KR101195253B1 (en) 2012-10-29

Family

ID=45026915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110080708A KR101195253B1 (en) 2011-08-12 2011-08-12 Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101195253B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109946531A (en) * 2019-04-19 2019-06-28 温州大学 The measuring device and its measurement method of remaining capacity after a kind of λ-DNA is neutralized
CN114660018A (en) * 2022-02-28 2022-06-24 浙江理工大学 Near-infrared light response spring-shaped photoelectric detector for silk fibroin detection

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6998241B2 (en) 2002-09-11 2006-02-14 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Antibody pair screening methods

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109946531A (en) * 2019-04-19 2019-06-28 温州大学 The measuring device and its measurement method of remaining capacity after a kind of λ-DNA is neutralized
CN109946531B (en) * 2019-04-19 2024-02-23 温州大学 Device and method for measuring residual electric quantity after lambda-DNA neutralization
CN114660018A (en) * 2022-02-28 2022-06-24 浙江理工大学 Near-infrared light response spring-shaped photoelectric detector for silk fibroin detection
CN114660018B (en) * 2022-02-28 2024-05-03 浙江理工大学 Near-infrared light response spring-shaped photoelectric detector for detecting silk fibroin

Also Published As

Publication number Publication date
KR101195253B1 (en) 2012-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101140029B1 (en) Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method
US9260656B2 (en) Fluorescent silica nano-particle, fluorescent nano-material, and biochip and assay using the same
Wang et al. A piezoelectric immunoagglutination assay for Toxoplasma gondii antibodies using gold nanoparticles
JP5853703B2 (en) Analyte detection probe, analyte detection reagent, and analyte detection method using the same
JP2000513436A (en) Affinity arrays with a wide range of specificities: quantitative methods for the identification of complex samples
KR101169418B1 (en) Magnetophoresis Nanobiosensor for immunoassays
Satija et al. A dendrimer matrix for performance enhancement of evanescent wave absorption-based fiber-optic biosensors
Yang et al. Cancer biomarkers detection using 3D microstructured protein chip: Implementation of customized multiplex immunoassay
RU2597768C2 (en) Method of functionalising surfaces for detecting analytes
NL2017204B1 (en) Solid substrate comprising antigens immobilised thereto, biosensor comprising said solid substrate and method for detecting the presence of mycobacterial material in a sample
KR101195253B1 (en) Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method
KR101195254B1 (en) Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method
JP2014062814A (en) Method for manufacturing antigen fixed immunity fluorescent slide and immunity fluorescent slide manufactured by the same
EP4119945A1 (en) Highly sensitive immunoconjugate, preparing method thereof, in vitro diagnostic reagent and in vitro diagnostic kit including the same
CN110832323A (en) Method for detecting aggregates of biotherapeutic substances in a sample
Herranz et al. Dextran–lipase conjugates as tools for low molecular weight ligand immobilization in microarray development
JP4742342B2 (en) Method for detecting antigen-antibody reaction and kit for detecting antigen-antibody reaction
KR20110104461A (en) Preparation method of antigen-immobilized immuno- fluorescence slide and the immuno-fluoroscence slide made by the method
JP2014149172A (en) New bead assay system
Wang et al. Aspects of recent development of immunosensors
Phuong et al. Application of hybrid Au@ Ag nanostructures in fiber optic biosensor for rapid detection of C-reactive protein
Sun Label-free sensing on microarrays
JP3774460B2 (en) Substance detection method
Qi et al. Detection and analysis of phage M13KO7 using biosensor based on imaging ellipsometry
Xu et al. Development of ultrasensitive new sensor based on functionalized triangular gold nanosheets layers for SARS-CoV-2 detection

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150923

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161007

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180423

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190402

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190925

Year of fee payment: 8