KR20110102788A

KR20110102788A - 합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포 및 이를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20110102788A
Application number: KR1020100021998A
Authority: KR
Inventors: 김인숙; 박선주
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2011-09-19
Also published as: WO2011111914A1

Abstract

본 발명은 합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포 및 이를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물과 혈관형성 촉진방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 합토글로빈 유전자가 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포는 세포내에서 발현된 합토글로빈에 의해 성숙한 혈관내피세포로의 분화가 촉진되는 효과가 있고, 혈관 형성을 촉진하는 활성이 우수하며, 세포의 관 형성도 우수한 특징이 있으므로 혈관 미형성으로 인해 유발되는 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포 및 이를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물{Haptoglobin gene introduced endothelial progenitor cells and compositions for promoting angiogenesis comprising the same}

본 발명은 합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포 및 이를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물과 혈관형성 촉진방법에 관한 것이다.

국소빈혈성 조직손상의 경우 조직이 회복되려면 손상된 위치에서 새로운 혈관이 형성되어야 한다. 출생 이후에 새로운 혈관은 신생혈관형성(angiogenesis), 동맥신생(arteriogenesis) 및 맥관형성(vasculogenesis) 과정에 의해 생성된다. 신생혈관형성 과정은 이미 존재하는 성숙한 혈관내피세포(endothelial cell)들로부터 자라나는 혈관내피세포의 증식 및 이동과 관련이 있으며, 동맥신생은 이미 존재하는 소동맥 연결(arteriolar connection)을 측부혈관(collateral vessels)으로 리모델링하는 과정이다(Carmeliet, P. (2000) Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat. Med. 6, 389.395). 반면에, 맥관형성은 내피 전구세포(endothelial progenitor cells (EPCs))가 성숙한 혈관 내피세포로 분화되는 과정을 통해 진행된다(Asahara, T. and Kawamoto, A. (2004) Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis. Am . J. Physiol . Cell Physiol . 287, 572.579.). 골수로부터 나와서 순환하는 EPCs는 혈관 손상 부위로 이동하고, 새롭게 형성되는 혈관으로의 직접적인 삽입 또는 다양한 신생혈관형성 및 영양 인자들의 분비를 통해 새로운 혈관 형성에 관여한다(Jujo, K., Ii, M. and Losordo, D.W. (2008) Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium. J. Mol . Cell . Cardiol. 45, 530.544., Urbich, C., Aicher, A., Heeschen, C., Dernbach, E., Hofmann, W.K., Zeiher, A.M. and Dimmeler, S. (2005) Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells. J. Mol . Cell . Cardiol . 39, 733.742.).

따라서 EPCs는 재혈관신생(revascularization)을 통한 치료목적에 잠재적인 표적으로 주목받고 있다(Jujo, K., Ii, M. and Losordo, D.W. (2008) Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium. J. Mol . Cell . Cardiol. 45, 530.544.).

또한, 최근의 연구들은 세포의 기능을 증가시키기 위한 생체 외(ex vivo) 유전자-변형 EPCs에 초점을 맞추고 있으며, 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor (VEGF)) 및 저산소증 유도인자-1α(hypoxia-inducible factor-1α)가 EPCs의 신생혈관형성 능력(pro-angiogenic capacity)을 증가시키는 활성이 있어 이를 사용하여 왔다(Iwaguro, H., Yamaguchi, J., Kalka, C., Murasawa, S., Masuda, H., Hayashi, S., Silver, M., Li, T., Isner, J.M. and Asahara, T. (2002) Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation 105, 732.738., Jiang, M., Wang, B., Wang, C., He, B., Fan, H., Guo, T.B., Shao, Q., Gao, L. and Liu, Y. (2008) Angiogenesis by transplantation of HIF-1a modified EPCs into ischemic limbs. J. Cell . Biochem . 103, 321.334.).

한편, 합토글로빈(haptoglobin: Hp)은 혈액순환 내의 급성기(acute-phase) 당단백질이며, 잘 알려져 있는 Hp의 생물학적 기능은 헤모글로빈(haemoglobin)의 포획이다. Hp는 Hp-헤모글로빈 복합체의 형성을 통해 혈관외 헤모글로빈-자극성 산화적 조직손상을 막는 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Lim, Y.K., Jenner, A., Ali, A.B., Wang, Y., Hsu, S.I., Chong, S.M., Baumman, H., Halliwell, B. and Lim, S.K. (2000) Haptoglobin reduces renal oxidative DNA and tissue damage during phenylhydrazine-induced hemolysis. Kidney Int . 58, 1033.1044., Buehler, P.W., Abraham, B., Vallelian, F., Linnemayr, C., Pereira, C.P., Cipollo, J.F., Jia, Y., Mikolajczyk, M., Boretti, F.S., Schoedon, G., Alayash, A.I. and Schaer, D.J. (2009) Haptoglobin preserves the CD163 hemoglobin scavenger pathway by shielding hemoglobin from peroxidative modification. Blood 113, 2578.2586).

또한, Hp는 동맥에서 발현될 수 있으며(Smeets, M.B., Pasterkamp, G., Lim, S.K., Velema, E., van Middelaar, B. and de Kleijn, D.P.V. (2002) Nitric oxide synthesis is involved in arterial haptoglobin expression after sustained flow changes. FEBS Lett. 529, 221.224.), 동맥 재구성(arterial restructuring)과 관련된 세포 이동 인자로서 작용하는 것으로 알려진 바 있다(de Kleijn, D.P.V., Smeets, M.B., Kemmeren, P.P.C.W., Lim, S.K., van Middelaar, B.J., Velema, E., Schoneveld, A., Pasterkamp, G. and Borst, C. (2002) Acutephase protein haptoglobin is a cell migration factor involved in arterial restructuring. FASEB J. 16, 1123.1125., Lohr, N.L., Warltier, D.C., Chilian, W.M. and Weihrauch, D. (2005) Haptoglobin expression and activity during coronary collateralization. Am . J. Physiol . Heart Circ . Physiol. 288, H1389.H1395).

그러나 지금까지 합토글로빈이 도입된 혈관내피 전구세포를 이용하여 신생혈관 형성을 유도하는 연구에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 합토글로빈 유전자가 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포가 혈관신생 작용을 촉진하는 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 합토글로빈(haptoglobin) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 형질전환된 혈관내피 전구세포를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 사람을 제외한 포유동물의 혈관형성이 필요로 하는 부위에 본 발명에 따른 상기 형질전환된 혈관내피 전구세포를 투여하는 단계를 포함하는 혈관형성을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 합토글로빈(haptoglobin) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 합토글로빈 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pMSCV-Hp 벡터인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형질전환된 혈관내피 전구세포는 발현된 합토글로빈에 의해 성숙한 혈관 내피세포로의 분화가 촉진되어 혈관형성을 촉진하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 합토글로빈(haptoglobin) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈관형성 부전-관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관형성 부전-관련 질환은 당뇨병성 궤양, 괴저, 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 심혈관 질환 및 국소빈혈로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 사람을 제외한 포유동물의 혈관형성이 필요로 하는 부위에 본 발명에 따른 상기 형질전환된 혈관내피 전구세포를 투여하는 단계를 포함하는 혈관형성을 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 합토글로빈 유전자가 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포는 세포내에서 발현된 합토글로빈에 의해 혈관내피 전구세포가 성숙한 혈관내피 세포로의 분화가 촉진됨에 따라 혈관 형성을 촉진하는 활성이 우수하고, 세포의 관 형성 또한 우수하므로 혈관 미형성으로 인해 유발되는 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 분리한 혈관내피 전구세포의 사진으로서, (A)는 배양 14일째 부착성 세포들이 DiI-acLDL 및 FITC-UEA lectin 으로 이중-표지된 것을 형광현미경으로 관찰하여 찍은 사진이고, (B)는 세포 배양에 의해 성장한 세포의 형태(자갈모양(cobblestone-like))를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에서 제작한 합토글로빈을 포함한 재조합 벡터로 형질전환된 세포에서 합토글로빈의 발현을 웨스턴 블럿을 통해 분석한 것을 나타낸 사진이고,
도 2b 및 2c는 본 발명의 일실시예에서 제작한 재조합 벡터로 형질전환된 세포에서 합토글로빈 및 혈관내피세포 특이적인 마커들(VEGF, KDR, Flt-1, vWF, VE-cadherin, eNOS, GAPDH)의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 각각 나타낸 것이며,
도 2d는 본 발명의 일실시예에서 제작한 재조합 벡터로 형질전환된 세포의 성장을 MTT 어세이(assay)로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a은 본 발명의 일실시예에서 합토글로빈을 포함하는 재조합 벡터 및 합토글로빈을 포함하지 않은 벡터를 이용하여 세포를 형질전환 시킨 후, Matrigel 상에서 튜브의 형성을 관찰한 사진을 나타낸 것이고,
도 3b는 형질전환된 혈관내피 전구세포의 관 구조(tubular structure)로의 삽입을 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 일실시예에서 사용한 각각의 벡터를 마우스 hindlimb ischaemia 모델에 투여한 후, 질환의 증상 정도를 3 가지 군으로 나눈 것을 나타낸 것이고,
도 4b는 각각의 벡터를 마우스 모델에 투여한 후, 질환의 증상 정도에 따른 마우스의 수를 비교하여 나타낸 그래프이며,
도 4c 및 4d는 국소빈혈성(ischaemic) 마우스 모델들의 LDPI 이미지들을 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명에 따른 합토글로빈을 발현하는 재조합 벡터, 합토글로빈이 없는 벡터를 국소빈혈 조직에 투여한 후 마우스 모델의 뒷다리로부터 얻은 근육 조직의 섹션들을 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)로 염색한 것을 정상 조직의 결과와 비교하여 나타낸 것이고,
도 5b는 상기의 근육 조직의 섹션들을 CD31로 염색한 것을 정상 조직의 결과와 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명은 합토글로빈(haptoglobin) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 제공함에 그 특징이 있다.

혈관신생(angiogenesis)은 성장인자, 사이토카인 및 기타 생리학적 분자뿐만 아니라 저산소증 및 낮은 pH와 같은 다양한 혈관신생 인자(angiogenic factor)에 반응하여 생기는 고도로 조절되는 과정을 말한다(Folkman and Shing, J. Biol . Chem., 267, 10931, 1992). 새로운 혈관이 발달하기 위한 혈관신생 메카니즘은 세포외 기질(ECM)의 분해 및 재구성, 이동, 증식, 분화 및 튜브(관) 형성을 조절하는 다양한 분자의 협동을 필요로 하며, 혈관신생 개시 이후에, VEGF, bFGF, PDGF 등을 비롯한 혈관신생 촉진 인자는 세포 표면 수용체의 자극을 통하여 내피세포를 활성화시키고, 활성화된 세포는 세포 증식과정, 세포 접착 분자의 발현 증가, 단백질 분해성 효소의 분비 증가, 세포 이동 및 침입의 증가를 거친다. 또한, 세포 부착을 위한 인테그린, 셀렉틴 및 면역글로불린 유전자 슈퍼 패밀리의 구성원뿐만 아니라 ECM을 분해하기 위한 매트릭스 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제와 같은 단백질 분해용 효소를 비롯한 다수의 분자가 증식 및 침입을 증진시키고(Brooks, Eur. J. Cancer, 32A, 2423, 1996), 나아가 ECM 성분 및 용해성 인자와 상호작용하는 세포 표면의 수용체로부터 유래한 신호 전달 메카니즘에 의해 관내강(Lumen) 형성 및 성숙 혈관으로의 분화가 유도됨으로써 혈관신생이 형성된다.

한편, 최근에는 혈관신생을 유도 또는 억제하는 인자를 이용하여 암, 류마티스 관절염, 건선, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 뇌혈관성 질환 등 혈관신생에 의존하는 질병을 치료하고자 하는 시도가 활발히 이루어지고 있다 (Folkman J., J. Nat . Med ., 1:27, 1995; Jackson J.R., et al., FASEB J., 11:457, 1997; Risau W., Nature , 386:671, 1997; Bussolino, F., et al., Trends Biochem . Sci ., 22:251, 1997; Hanahan D., et al., Cell , 86:353, 1996).

정상 성인의 경우, 혈관을 이루고 있는 내피세포의 교체 시간은 일반적으로 47일~20,000일로 다양하며, 매우 엄격한 조절을 받고 있다. 일반적으로 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1), 혈소판 인자-4(platelet factor-4), 엔지오스타틴(angiostatin) 등의 혈관신생 억제인자와, 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor), 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor) 등과 같은 혈관신생 촉진인자가 평상시에는 양적 평형 상태를 유지하여 혈관신생이 일어나지 않지만, 상처나 암이 발생한 경우, 상처 발병 조직의 재생 및 암의 성장을 위하여 혈관신생 억제인자와 촉진인자의 양적 평형상태가 깨어지고 새로운 혈관이 형성되는데, 이때 혈관신생 촉진인자의 과다 발현이 관여하게 된다.

따라서 과다한 혈관 형성은 질병 악화의 주원인이 되기도 하지만, 혈관의 미형성 또한 심각한 질병의 원인이 되고 있다. 혈관신생은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 예를 들어 혈관 형성이 미발달된 태반은 유산의 중요한 원인이 되며, 혈관의 미형성으로 인한 괴사, 궤양 및 허혈의 경우 조직이나 기관의 기능 이상을 유발하거나, 사망의 원인이 될 수 있다. 또한, 동맥경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병도 원활하지 못한 혈액 공급이 원인이 되고 있다.

그러므로 혈관의 미형성으로 인한 저산소 상태 또는 저영양 상태의 유발로 인한 조직 손상을 감소시키고, 원활한 조직 재생을 위해서는 새로운 혈관 형성을 유도하거나 촉진시키는 역할이 매우 중요하다.

특히, 혈관신생은 상처받은 피부 조직이 재생되기 위한 필수적인 상처 회복 과정에 반드시 수반되어야 한다. 상처의 초기 단계에는 세포의 괴사와 혈관의 파괴로 인한 염증 반응이 일어나게 되고, 이 염증 반응 이후에 혈액 성분의 탈혈관 현상, 혈소판의 활성화 및 혈액 응고와 함께, 칼리크레인, 트롬빈 및 플라스민 등과 같은 생물학적 매개 물질이 형성되는 일련의 과정을 거치게 된다.

또한, 혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생 치료라고 불리기도 하는데, 이미 혈관내피 성장인자와 같은 혈관신생 촉진인자는 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있다. 또한 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자(epidermal growth factor) 및 혈소판 유도 내피 성장인자(platelet-derived endothelial growth factor) 등의 혈관신생 촉진인자들도 임상 치료를 위하여 연구되고 있다.

한편, 본 발명에서는 상기와 같이 혈관의 미형성으로 인해 발생하는 질환을 치료하기에 합토글로빈이 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 합토글로빈이 도입된 혈관내피 전구세포의 경우, 혈관형성 촉진작용이 매우 우수함을 최초로 규명하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 합토글로빈이 내피전구세포의 분화에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 제대혈로부터 내피전구세포를 분리한 후, 합토글로빈이 세포내에서 발현될 수 있도록 제작한 재조합 벡터를 사용하여 상기 내피전구세포를 형질전환 시킨 후, 합토글로빈이 도입되지 않은 내피전구세포와의 세포분화를 비교한 결과, 합토글로빈으로 형질전환된 내피전구세포의 경우, 대조군 세포에 비해 내피세포의 마커들인 VEGF, KDR, Flt-1, vWF, VE-cadherin, 및 eNOS의 mRNA 발현이 증가한 것으로 나타났으며(도 2b 및 2c 참조),반면 합토글로빈의 도입으로 인해 합토글로빈이 과발현된 내피전구세포의 성장은 대조군과 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(도 2d 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 합토글로빈이 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell)의 경우, 세포 분화가 촉진된 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 합토글로빈이 내피전구세포에 의한 신생혈관 형성을 촉진시키는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 합토글로빈이 도입된 내피전구세포 및 합토글로빈이 도입되지 않은 내피전구세포를 대상으로 튜브형성 및 튜브 네트워크 형성 정도를 현미경으로 관찰한 결과, 합토글로빈이 도입된 내피전구세포의 경우, 대조군 세포에 비해 높은 모세관 유사 관(capillary-like tube) 형성 능력을 보여주었으며(도 3a 참고), 네트워크 구조로의 삽입도 증가된 것으로 나타났다(도 3b 참조).

상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 합토글로빈이 도입된 형질전환 혈관내피 전구세포가 튜브의 형성 및 혈관구조로의 삽입 효과가 우수하여 신생혈관의 형성을 촉진할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 제공할 수 있으며, 상기 합토글로빈은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 일 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포의 경우, 합토글로빈 유전자가 상기 전구세포내에 도입되어 발현된 합토글로빈 단백질을 포함할 수 있다.

상기 합토글로빈 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 합토글로빈 단백질 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있으며, 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 서열번호 1의 합토글로빈 단백질과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)를 포함할 수 있다.

상기 "기능적 동등물"에는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로 서열번호 1의 합토글로빈 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

상기 "기능적 유도체"는 상기 합토글로빈 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 서열번호 1의 합토글로빈 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 혈관내피 전구세포로 합토글로빈 유전자를 도입하는 방법은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 합토글로빈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 세포내로 도입시킬 수 있다.

본 발명에서 합토글로빈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 합토글로빈 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 염기서열에는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 표시되며, 가장 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 표시된다.

또한, 본 발명에서 상기 합토글로빈 단백질은 DNA 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있으며 이를 위하여 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 합토글로빈 단백질은 합토글로빈 유전자를 사용하여 세균, 효모 및 동물 세포주 내에서 재조합 방식으로 주입하는 유전공학 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 합토글로빈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 즉 합토글로빈 유전자가 삽입된 발현벡터를 말하며, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만, 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 레트로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

본 발명의 일실시예에서는 서열번호 2의 합토글로빈 유전자를 레트로바이러스 벡터를 사용하여 재조합 발현벡터를 제조하였고 이를 ‘pMSCV-Hp’로 명명하였으며, 내피전구세포 내로 형질감염(transfection)하여 세포에 도입하였다.

본 발명에 따른 합토글로빈이 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포는 발현된 합토글로빈에 의해 성숙한 혈관 내피세포로의 분화가 촉진되어 혈관신생을 촉진하는 활성을 갖는 특징이 있다.

또한, 본 발명은 사람을 제외한 포유동물의 혈관형성이 필요로 하는 부위에 본 발명에 따른 합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포를 투여하는 단계를 포함하는 혈관형성을 촉진시키는 방법을 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.

앞서 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 합토글로빈이 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포는 혈관내피세포로의 분화를 촉진시키는 활성이 우수할 뿐만 아니라 내피전구세포의 튜브 형성 및 혈관구조로의 삽입을 증가시키는 작용을 통해 신생혈관을 형성하는 특징이 있다.

따라서 본 발명에 따른 상기 혈관형성 촉진용 조성물은 혈관형성 부전과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로, 본 발명은 본 발명에 따른 합토글로빈 유전자가 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 부전-관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 혈관신생의 미형성으로 인해 발생하는 질환인 국소빈혈이 발병된 동물모델을 대상으로 합토글로빈이 도입된 내피전구세포를 투여한 후, 합토글로빈이 도입되지 않은 내피전구세포를 투여한 대조군과 국소빈혈 증상의 정도를 비교한 결과, 합토클로빈이 도입된 내피전구세포를 투여한 군이 대조군에 비해 심하게 다리가 손실된 마우스의 수가 감소된 것으로 나타났으며, 혈관밀도 또한 증가한 것으로 나타났다(도 4b 및 4c 참조).

상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 합토글로빈이 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포가 신생혈관 형성 작용을 촉진시킬 수 있는 활성을 통해 국소빈혈성 손상을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 상기 혈관형성 촉진용 조성물에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 혈관형성 부전-관련 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 당뇨병성 궤양, 괴저, 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 심혈관 질환 및 국소빈혈로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 혈관형성 촉진용 조성물 또는 혈관신생 부전-관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 생리활성 성분으로서 약학적으로 유효한 양의 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.

비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 생리활성 성분인 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 생리활성 성분의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 생리활성 성분을 혈관신생 부전-관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

합토글로빈(Hp)이 EPC 분화에 미치는 영향

<1-1> 세포배양

제대혈 및 탯줄은 강남성모병원(대한민국)에서 서면동의를 받은 기증자로부터 입수하였다. Histopaque-10771(Sigma, St. Louis, MO)을 사용설명서에 따라 사용하여, 농도구배 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 사람 제대혈(cord blood)로부터 단핵세포(mononuclear cell)를 분리하였다. 상기 세포들을 0.1 mg/ml 의 사람 피브로넥틴(fibronectin) (Sigma)으로 코팅된 6-웰(well) 플레이트에 분주하고, 5% 소태아혈청(fetal bovine serum) (FBS; Gibco Life Technology, Gaithersburg, MD)이 첨가된 EGM-2 BulletKit 배지(Clonetics, San Diego, CA) 에서 배양시켰다. 3일 후에 비-부착성(non-adherent) 세포들을 제거하고 배지를 교체하였다. 후기의(late) EPCs를 얻기 위해, 3일마다 새 배지로 바꿔주면서 부착성(adherent) 세포들을 25-45 일간 배양시켰다.

또한, 사람 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells (HUVECs))를 제대정맥(cord vein)으로부터 분리하고, 상기와 같은 배양액으로 배양하였다(Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G. and Minick, C.R. (1973) Culture of human endothelial cells derived from unbilical veins: identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin. Invest. 52, 2745.2756 참조).

<1-2> 아세틸화 저밀도 지질단백질( acetylated low - density lipoprotein )의 흡수 및 Ulex europaeus lectin 결합

상기 <1-1>의 방법으로 준비된 세포들을 14일간 배양한 후, 상기 세포들을 2.5 ㎍/ml의 1,1′-디옥타데실-3,3,3′,3′-테트라메틸인도카보시아닌-퍼클로레이트(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine-perchlorate)-표지된 아세틸화 저밀도 리포단백질(acetylated low-density lipoprotein) (DiI-acLDL; Molecular Probes, Eugene, OR)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양시키고, 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 고정시켰다. 상기 세포들을 다시 10 ㎍/ml 플루오레세인-이소티오시아네이트(fluorescein-isothiocyanate)-결합된 UEA 렉틴(Ulex europaeus agglutinin lectin) (Sigma) 으로 1시간 동안 배양시켰다. 그 후 이중표지된 세포들을 형광현미경으로 관찰하였다.

<1-3> 사람 Hp 유전자를 이용한 EPCs 의 변형( modification )

사람은 Hp에 대해 대립유전자 다형성(allelic polymorphism)을 보인다. 2개의 주요한 대립유전자인 Hp ¹ 및 Hp ² 에 따라, Hp는 Hp 1-1(Hp ¹ /Hp ¹ ), Hp 2-1 (Hp ¹ /Hp ² ) 및 Hp 2-2(Hp ² /Hp ² )의 3개의 주요한 형질들로 발현된다(Maeda, N., Yang, F., Barnett, D.R., Bowman, B.H. and Smithies, O. (1984) Duplication within the haptoglobin Hp2 gene. Nature 309, 131.135.). Hp 2-2 는 Hp 1-1에 비해 더 큰 신생혈관형성 활성을 가지고 있으며(Cid, et al. (1993) Identification of haptoglobin as an angiogenic factor in sera from patients with systemic vasculitis. J. Clin . Invest . 91, 977.985.), 따라서 본 발명에서도 사람 Hp ² 유전자가 형질도입 되었고, 발현된 Hp 2-2 가 EPC 기능에 미치는 영향을 조사하였다.

이를 위해 먼저, 재조합 플라스미드(MSCV-Hp)의 제조는 사람 Hp ² 유전자의 cDNA(Kim, I.S., Lee, I.H., Lee, J.H. and Lee, S.Y. (2001) Induction of haptoglobin by alltrans retinoic acid in THP-1 human monocytic cell line. Biochem . Biophys . Res . Commun . 284, 738.742.)를 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 포함하는 MSCVneoEB 레트로바이러스 벡터의 EcoRI 및 XhoI 위치에 서브클론하였다. FuGene 6 시료(Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 를 사용하여 293 T 세포들을 MSCVHp 플라스미드로 트랜스펙션(transfection)시켰다. 트랜스펙션 후 48, 60 및 72시간째, 바이러스가 함유된 상층액(supernatant)들을 수집하고, 0.45 ㎛ 시린지(syringe) 필터(Pall Corporation, East Hills, NY)를 통과시켰다. 바이러스 상층액들을 5 ㎍/ml 의 프로타민 황산염(protamine sulphate) (Sigma) 존재 하의 EPC 배지에 첨가하였다. 이후 72시간 후에 유세포분리기(FACS Vantage SE; BD Biosciences, San Diego, CA)를 사용하여 GFP-양성 세포들을 수집하였다.

<1-4> RT -PCR( reverse transcriptase - polymerase chain reaction )

하기 표 1의 프라이머들을 사용하여, 통상의 방법(Lee, M.Y., Kim, S.Y., Choi, J.S., Lee, I.H., Choi, Y.S., Jin, J.Y., Park, S.J., Sung, K.W., Chun, M.H. and Kim, I.S. (2002) Upregulation of haptoglobin in reactive astrocytes after transient forebrain ischemia in rats. J. Cereb . Blood Flow Metab . 22, 1176.1180.)에 따라 RT-PCR 을 수행하였고, RT-PCR은 실시간 PCR 기계(MX-3000P; Stratagene)를 사용하여 정량적 실시간(quantitative real-time) RT-PCR 을 FullVelocity SYBR Green QPCR master mix (Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 수행하였다.

RT-PCR에 사용된 프라이머

프라이머 명칭		프라이머 서열	서열번호
Hp	F	5'-ATGAGTGCCCTGGGAGCTGTCATT-3'	3
Hp	R	5'-GCATTAGTTCTCAGCTATGGTCTT-3'	4
VEGF	F	5'-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3'	5
VEGF	R	5'-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3'	6
KDR	F	5'-CTGGCATGGTCTTCTGTG-3'	7
KDR	R	5'-AATGGGATTGGTAAGGATG-3'	8
Flt-1	F	5'-AGCAAGTGGGAGTTTGC-3'	9
Flt-1	R	5'-AGGTCCCGATGAATGC-3'	10
vWF	F	5'-GAGGCTGAGTTTGAAGTGC-3'	11
vWF	R	5'-CTGCTCCAGCTCATCCAC-3'	12
VE-cadherin	F	5'-AAGACATCAATGACAACTTCC-3'	13
VE-cadherin	R	5'-CCTCCACAGTCAGGTTATACC-3'	14
eNOS	F	5'-AAGACATTTTCGGGCTCAC-3'	15
eNOS	R	5'-GGCACTTTAGTAGTTCTCC-3'	16
GAPDH	F	5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'	17
GAPDH	R	5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'	18

<1-5> 통계처리

실험 및 대조군 조건에서 얻은 값들 사이의 차이를 분석하기 위하여 Student's t-test 및 편차(variance)의 one-way 분석을 사용하였다. P < 0.05 를 유의성 있는 것으로 간주하였다.

<1-6> EPC 분화에 합토글로빈이 미치는 영향 분석

분리된 세포들을 EPCs의 전형적인 특징들로 동정하기 위하여, 상기 <1-1>의 조건으로 배양한 세포들을 배양 14일째, 상기 <1-2>의 방법에 따라 DiI-acLDL 흡수(uptake) 및 UEA-렉틴(lectin) 결합을 검출하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 세포들은 DiI-acLDL의 흡수 및 UEA-렉틴 결합에 양성인 것으로 나타났고, 이러한 결과는 상기 <1-1>에서 분리된 세포들이 EPCs의 특징을 갖는다는 것을 말해준다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 세포 분주 후 25-40일 후에, EPCs는 자갈과 같은 모양을 나타내었다. 한편, 일반적으로 EPCs들은 이질적인(heterogeneous) 세포군집으로 알려져 있으며, Hur 등에 의하면, 시간 경과에 따른 EPCs 의 모양은 낮은 증식능력을 가진 방추형의(spindle-shaped) 초기 EPCs 와 높은 확장능력을 가진 자갈형의(cobblestone-shaped) 후기 EPCs의 2가지 유형으로 분류할 수 있는데(Hur, J., Yoon, C.H., Kim, H.S., Choi, J.H., Kang, H.J., Hwang, K.K., Oh, B.H., Lee, M.M. and Park, Y.B. (2004) Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 288.293.), 본 발명에 따른 결과를 보면, 도 1b와 같이 세포의 모양이 자갈형을 나타내고 있어, 이는 높은 확장능력을 가진 세포의 형태로서 성숙한 내피세포로 빠르게 분화될 가능성이 있음을 예상할 수 있었다.

또한, 도 2의 결과를 살펴보면, 사람의 합토글로빈 유전자가 도입된 EPC 세포의 경우, 상기 세포 내에서 합토글로빈(Hp) 단백질이 발현되어 배양 배지로 분비된 것을 확인할 수 있었고(도 2a 참조), Hp가 발현된 EPC 세포는 다양한 내피세포의 마커들, 즉, VEGF, KDR, Flt-1, vWF, VE-cadherin, 및 eNOS의 mRNA 발현이 대조군에 비해 증가된 것으로 나타났다(도 2b 및 2c 참조). 한편, EPC 세포내로 Hp을 도입시킨 경우, Hp의 과발현은 EPC의 성장에는 큰 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다(도 2d 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명의 합토글로빈이 내피전구세포의 분화를 촉진시키는 활성이 있다는 사실을 알 수 있었고, 반면, 합토글로빈이 내피전구세포의 증식에는 영향을 미치지 않는다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

합토글로빈이 EPC 의 신생혈관형성에 미치는 영향 분석

세포 배양, EPC 세포변형, 통계처리 등 하기 실시예에 기재되지 않은 실험은 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 수행하였으며, 합토글로빈의 EPC 신생혈관형성에 미치는 영향은 Matrigel 상에서 합토글로빈에 의해 시험관 내에서 튜브 형성(in vitro tube formation) 정도를 관찰하는 방법을 수행하여 관찰하였는데, 상기 방법을 위해 먼저, 차가운 Matrigel(BD Biosciences, San Jose, CA)을 48-웰(well) 플레이트의 웰에 각각 넣고, 37℃에서 30분간 중합하였다. GFP-표지된 벡터-(대조군) 또는 Hp-DNA-형질전환된 EPCs (2× 10⁴ 세포/웰)를 상기 Matrigel에 깔고, 3% FBS가 포함된 EGM-2 배지에서 20 시간 동안 배양하였다. EPCs가 혈관구조에 삽입되었는지 알아보기 위하여, EPCs (1× 10⁴ 세포) 및 DiI-acLDL-표지된 HUVECs (2× 10⁴ 세포) 을 Matrigel 위에 함께 깔고, 3% FBS가 포함된 M199 배지에서 20시간 동안 공동배양하였다. 이후 튜브(tubular) 네트워크의 형성을 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, EPCs를 성장인자를 감소시킨 Matrigel에서 배양할 때, Hp이 발현된 EPCs는 대조군에 비해 높은 모세혈관과 유사한 튜브(capillary-like tube)가 형성되는 것으로 나타났다(도 3a 참조). 또한, EPCs의 내피세포 혈관구조로의 삽입을 측정하기 위하여, Matrigel에서 GFP-함유 EPCs를 DiI-AcLDL-표지된 HUVECs 와 공동배양하였는데, 그 결과, Hp-EPCs에서 EPCs(녹색)의 HUVECs (적색) 네트워크 구조로의 삽입이 증가되는 것으로 나타났고, HUVECs에서 튜브의 네트워크 구조가 대조군에 비해 Hp이 도입된 EPCs의 존재 하에서 더 잘 형성되는 것으로 나타났다(도 3b 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 합토글로빈이 내피전구세포의 혈관형성을 촉진시키는 활성이 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

합토글로빈이 EPC -유도 혈관신생( EPC - induced neovascularization )에 미치는 영향 분석

세포 배양, EPC 세포변형, 통계처리 등 하기 실시예에 기재되지 않은 실험은 상기 실시예 1 및 2에 기재된 방법으로 수행하였다.

<3-1> Mouse hindlimb ischaemia

모든 동물실험은 가톨릭대학교 윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다. 18-22 g의 수컷 athymic nude 마우스(6 주령)를 사용하였다. Zoletile 50 (10 mg/kg; Vibac, Carros, France) 으로 마취시키고, 우측 대퇴동맥(right proximal femoral artery) 및 말단복재동맥(distal saphenous artery)을 6.0 실크 봉합(Ethicon, Somerville, NJ)으로 접합시키고, 상기 대퇴동맥 및 부착된 측면 분지들을 절제하였다. 왼쪽 뒷다리(hindlimb)는 손을 대지 않고 그대로 두어 비-국소빈혈(non-ischaemic) 영역으로 사용하였다. 뒷다리 국소빈혈의 유도 24시간 후에, 상기 마우스를 임의로 3개의 그룹(1, 2, 및 3)으로 나누고, 마우스 당 5×10⁵ 의 운반체 벡터-EPCs 및 Hp-EPCs 세포를 그룹 1 (n = 8) 및 2 (n = 8) 마우스 각각의 국소빈혈이 있는 대퇴부 근육의 두 개의 다른 지점들에 국부적으로 주입하였다. 그룹 3 (n = 4) 마우스에 같은 부피의 PBS를 주입하였다. EPC 이식 4주 후에, laser Doppler blood perfusion imager (LDPI; Perimed PeriScan PIM III, Jarfalla, Sweden)를 사용하여 대퇴부 혈류를 측정하였다. 3회의 스캐닝 후, 국소빈혈 대 비-국소빈혈 대퇴부 혈액 관류값의 비율로 LDPI 지수를 결정하였다.

<3-2> 혈관 밀도 측정

국소빈혈 4주 후에, 국소빈혈 및 비-국소빈혈성 다리 근육들을 마우스로부터 제거하고, Tissue-Tek (Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, The Netherlands)에 넣었다. cryostat (Leica CM1800; Wetzlar, Germany)로 잘라서 냉동된 5 ㎛-두께의 조직 섹션들을 준비한 후 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 측정용 fast BCIP/NBT 용액(Sigma)을 사용하여 염색하였다. 상기 조직 섹션들을 또한 모노클로날 쥐 항-마우스(monoclonal rat anti-mouse) CD31 항체(Abcam, Cambridge, UK)와 Alexa-Fluor-555-표지된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 면역조직염색을 하였다.

<3-3> 마우스 hindlimb ischaemia 모델에서 Hp 의 EPC -유도 혈관 신생 증가 활성

본 발명의 합토글로빈이 생체 내(in vivo)에서 신생혈관형성(neovascularization)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 누드마우스에서 국소빈혈을 유도한 후에 Hp-변형된 EPCs를 뒷다리에 국부적으로 이식하였다. 그 결과에 따라, 본 발명자들은 상기 실험 마우스를 도 4a에 나타낸 바와 같이, 다리 구조(limb salvage), 약한 다리 손실(mild loss of limb) 및 심한 다리 손실(severe loss of limb)의 세 그룹으로 분류하였는데, 대조군인 EPC 마우스 및 PBS 마우스 그룹에 비해, Hp-EPCs 이식 마우스 그룹의 경우, 다리가 구조된 마우스의 수는 증가하고 심하게 다리가 손실된 마우스의 수는 감소되는 것으로 나타났다.

또한, 혈액 관류값의 비율 측정 결과, LDPI 지수가 대조군 EPC 그룹 (0.44 ± 0.19) 또는 PBS 그룹 (0.35 ± 0.08) 보다 Hp-EPC 그룹 (0.68 ± 0.22)에서 더 높은 것으로 나타났다(도 4b 및 4c 참조).

나아가 본 발명자들은 국소빈혈 뒷다리에서 신생혈관형성을 측정하기 위하여, 조직 섹션들에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 CD31에 대해 염색하여 관밀도(capillary density)를 측정하였다.

그 결과, Hp-EPCs를 처리한 다리들로부터 얻은 조직 섹션들에서 혈관 밀도가 다른 대조군에 비해 상당히 증가된 것으로 나타났다(도 5 참조).

이상과 같은 실험 결과들을 통해, 본 발명자들은 합토글로빈이 도입되어 형질전환된 혈관내피 전구세포의 경우, 신생혈관생성 인자들(pro-angiogenic factors)이 증가되고 EPCs의 활성이 증가되어 신생혈관 형성을 촉진시킴으로써 궁극적으로 혈관형성 부전-관련 질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Haptoglobin gene introduced endothelial progenitor cells and compositions for promoting angiogenesis comprising the same <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> haptoglobin amino acid sequence <400> 1 Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly 20 25 30 Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val 35 40 45 Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly 50 55 60 Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly 65 70 75 80 Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro 85 90 95 Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys 100 105 110 Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn 115 120 125 Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu 130 135 140 Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln 145 150 155 160 Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln 165 170 175 Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile 180 185 190 Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His 195 200 205 Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr 210 215 220 Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro 225 230 235 240 Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val 245 250 255 Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr 260 265 270 Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala 275 280 285 Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala 290 295 300 Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu 305 310 315 320 Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu 325 330 335 His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr 340 345 350 Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr 355 360 365 Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala 370 375 380 Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ala Glu Asn 405 <210> 2 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haptoglobin gene sequence <400> 2 atgagtgccc tgggagctgt cattgccctc ctgctctggg gacagctttt tgcagtggac 60 tcaggcaatg atgtcacgga tatcgcagat gacggctgcc cgaagccccc cgagattgca 120 catggctatg tggagcactc ggttcgctac cagtgtaaga actactacaa actgcgcaca 180 gaaggagatg gagtatacac cttaaatgat aagaagcagt ggataaataa ggctgttgga 240 gataaacttc ctgaatgtga agcagatgac ggctgcccga agccccccga gattgcacat 300 ggctatgtgg agcactcggt tcgctaccag tgtaagaact actacaaact gcgcacagaa 360 ggagatggag tgtacacctt aaacaatgag aagcagtgga taaataaggc tgttggagat 420 aaacttcctg aatgtgaagc agtatgtggg aagcccaaga atccggcaaa cccagtgcag 480 cggatcctgg gtggacacct ggatgccaaa ggcagctttc cctggcaggc taagatggtt 540 tcccaccata atctcaccac aggtgccacg ctgatcaatg aacaatggct gctgaccacg 600 gctaaaaatc tcttcctgaa ccattcagaa aatgcaacag cgaaagacat tgcccctact 660 ttaacactct atgtggggaa aaagcagctt gtagagattg agaaggttgt tctacaccct 720 aactactccc aggtagatat tgggctcatc aaactcaaac agaaggtgtc tgttaatgag 780 agagtgatgc ccatctgcct accttcaaag gattatgcag aagtagggcg tgtgggttat 840 gtttctggct gggggcgaaa tgccaatttt aaatttactg accatctgaa gtatgtcatg 900 ctgcctgtgg ctgaccaaga ccaatgcata aggcattatg aaggcagcac agtccccgaa 960 aagaagacac cgaagagccc tgtaggggtg cagcccatac tgaatgaaca caccttctgt 1020 gctggcatgt ctaagtacca agaagacacc tgctatggcg atgcgggcag tgcctttgcc 1080 gttcacgacc tggaggagga cacctggtat gcgactggga tcttaagctt tgataagagc 1140 tgtgctgtgg ctgagtatgg tgtgtatgtg aaggtgactt ccatccagga ctgggttcag 1200 aagaccatag ctgagaacta a 1221 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hp F-primer <400> 3 atgagtgccc tgggagctgt catt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hp R-primer <400> 4 gcattagttc tcagctatgg tctt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF F-primer <400> 5 aggagggcag aatcatcacg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF R-primer <400> 6 caaggcccac agggattttc t 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDR F-primer <400> 7 ctggcatggt cttctgtg 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDR R-primer <400> 8 aatgggattg gtaaggatg 19 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flt-1 F-primer <400> 9 agcaagtggg agtttgc 17 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flt-1 R-primer <400> 10 aggtcccgat gaatgc 16 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWF F-primer <400> 11 gaggctgagt ttgaagtgc 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWF R-primer <400> 12 ctgctccagc tcatccac 18 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VE-cadherin F-primer <400> 13 aagacatcaa tgacaacttc c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VE-cadherin R-primer <400> 14 cctccacagt caggttatac c 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eNOS F-primer <400> 15 aagacatttt cgggctcac 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eNOS R-primer <400> 16 ggcactttag tagttctcc 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F-primer <400> 17 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R-primer <400> 18 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 합토글로빈(haptoglobin) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 혈관내피 전구세포.
제1항에 있어서,
상기 합토글로빈 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 혈관내피 전구세포.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 pMSCV-Hp 벡터인 것을 특징으로 하는 혈관내피 전구세포.
제1항에 있어서,
상기 형질전환된 혈관내피 전구세포는 발현된 합토글로빈에 의해 성숙한 혈관 내피세포로의 분화가 촉진되어 혈관형성을 촉진하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 혈관내피 전구세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 혈관내피 전구세포를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 혈관형성 부전-관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 혈관형성 촉진용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 혈관형성 부전-관련 질환은 당뇨병성 궤양, 괴저, 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 심혈관 질환 및 국소빈혈로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관형성 촉진용 조성물.
사람을 제외한 포유동물의 혈관형성이 필요로 하는 부위에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 혈관내피 전구세포를 투여하는 단계를 포함하는 혈관형성을 촉진시키는 방법.