KR20110097064A

KR20110097064A - 무혈청 줄기 세포 배양 조성물, 이를 함유한 조직 재생용 조성물 및 이를 이용한 조직 재생 방법

Info

Publication number: KR20110097064A
Application number: KR1020100016692A
Authority: KR
Inventors: 이순례; 박현숙; 김경혜; 강태훈; 노영호
Original assignee: (주) 아크스템
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2011-08-31
Also published as: WO2011105821A2; WO2011105821A3

Abstract

본 발명은 개체의 피부, 연부 조직의 미용적 또는 퇴행적 결함을 교정하기 위한 무혈청 줄기 세포 배양 조성물 및 이를 함유한 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는 인간 지방 유래 줄기세포를 무혈청 줄기 세포 배양 조성물에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물 및 이를 이용한 조직 재생 방법에 관한 것이다.

Description

무혈청 줄기 세포 배양 조성물, 이를 함유한 조직 재생용 조성물 및 이를 이용한 조직 재생 방법{SERUM FREE MEDIA FOR STEM CELL CULTURE, TISSUE REGENERATION COMPOSITION INCLUDING THE SAME, AND METHOD OF TISSUE REGENERATION USING THE SAME}

본 발명은 개체의 피부, 연부 조직의 미용적 또는 퇴행적 결함을 교정하기 위한 무혈청 줄기 세포 배양 조성물 및 이를 함유한 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게는 인간 지방 유래 줄기세포를 자체 개발한 무혈청 줄기 세포 배양 조성물에서 1일 이상 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물 및 이를 이용한 조직 재생 방법에 관한 것이다.

생체에서와는 달리, 체외에서 인위적으로 동물 세포를 배양하기 위하여 배양 배지를 공급하려면, 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주어야 한다. 따라서, 체액을 근거로 배양 배지 조성을 결정하고 이 결정된 배양 배지를 선택하여 혈청을 적정 비율로 세포에 맞게 첨가한 뒤 세포 배양에 이용하여 왔다. 이런 방법으로서, 배지 개발 초기에는 1950년경 모건(Morgan) 등이 체액 조성을 근거로 M199 배지를 만들어 태아 세포(primary chick)를 배양하였다(Morgan, et al., 1950). 이어서 개발된 주요 배지로는, 이글(Eagle)이 사람과 쥐의 태아 세포 배양에 이용한 기초 배양액(basal medium)(Eagle, 1955), 쥐의 태아 세포 배양에 이용한 배양액(Dulbecco's modified eagles medium, Dulbecco, et al., 1959), Ham's F-12(Ham, 1965)와 모르(Moore) 등이 햄스터 종양 세포 배양에 이용한 RPMI-1640(Moore et al., 1967) 등이 있다.

세포 배양시, 세포의 영양 요구성에 따라 상기의 기본 배지에 5내지 20%의 동물혈청을 첨가하여 사용한다. 혈청에는 세포의 성장과 기능을 촉진하는 인슐린 또는 폴리펩티드계통의 다양한 호르몬과 세포의 분열과 기능을 조절하는 성장 인자들, 그리고 피브로넥틴과 같은 부착 및 확산 인자들, 결합 단백질로 트랜스페린이 있으며, 지질, 무기질 등 미량 요소들이 다수 포함되어 있다. 혈청은 또한 완충액으로서 배양액의 삼투압과 pH를 조절하며, 단백질 분해 저해 및 물리적 충격에서 세포를 보호할 수 있는 점성 작용도 가지고 있다(Griffiths, 1987). 따라서, 기본 배지에 일정 농도의 혈청을 넣어 배양용 배지를 만들고 있다. 이처럼 다양한 기능을 가진 물질들이 포함된 혈청을 사용하여 동물 세포를 배양할 수 있다.

줄기세포는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분될 수 있다. 인간 배아줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화 능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 얻을 수 있어 윤리적인 문제가 적으나 배아 줄기세포가 전분화능(Plueripotency)을 가진 것에 비하여 한정된 분화능력(Multipotency)을 가지고 있다. 성체 줄기세포 중 가장 연구가 많이 진행된 것은 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)이며 최근 다양한 생체 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 대한 연구들도 활기를 띠고 있다.

지방유래 줄기세포(adipose derived stem cell)는 척수유래 중간엽줄기세포 (Bone marrow derived stem cell) 처럼 중간엽줄기세포와 비슷한 특성을 가지고 있으며, 채취 방법 및 분리 배양법 덜 까다로워 미용 목적으로 일선 병원에서 시술이 실시되고 있으며 세포치료제로의 개발에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 뿐만 아니라, 지방으로부터 분리한 줄기세포는 상당량의 세포수를 배양과정을 통해서 안정적으로 증식시켜 얻을 수 있고 배양된 세포는 중배엽성(Mesoderm) 조직뿐만 아니라 다른 여타의 조직으로도 분화가 가능한 것으로 알려져 있다. 이러한 성체 줄기세포의 다양한 분화가능성을 활용하면 불치 및 난치 등의 질환 치료에의 보다 더 가깝게 접근할 수 있으며, 이을 위해 체외 배양 또는 분화 조건을 적절하게 조절해야 하며 더 나아가 확립한 실험동물 질환 모델을 대상으로 세포 및 유전자를 동반한 세포 치료 방법을 구축하는데 힘써야 할 것이다.

그러나, 이러한 인간줄기세포를 배양하기 위해 동물혈청 (우태아혈청)을 함유하는 배지를 이용하는 경우, 우태아혈청으로 배양한 세포를 태아혈청이 없는 용액으로 세척하더라도 상당량의 우태아혈청이 세포내 잔류하여 강력한 이종항원으로 작용하며 광우병등 소의 질환의 인체감염가능성등으로 우태아혈청으로 배양한 세포의 인체이식이 미국에서는 금지되어 있는 상황이다. 인간 골수로부터 중간엽줄기세포의 분리를 위한 기법과 지방조직에서 중간엽줄기세포를 분리하는 기법은 각각 Pittenger 등 (Science 284: 143-147, 1997)와 van등 (J Clin Invest. 58: 699-704, 1976)의 문헌에서 개시되었다. 이들에서는 세포배양을 위하여 α-MEM이나 DMEM배지 및 10-20% 우태아혈청을 사용하였다. 그러나 이들 배지에 동물혈청(우태아혈청)이 이용됨으로서 인체이식에 많은 안전성 문제를 발생해 왔다.

이를 극복하기 위해 종래 세포배양배지에서 우태아 혈청대신에 인간혈청을 사용하는 시도가 있었으나 (Kuznetsov SA, Mankani MH, Robey PG. Effect of serum on human bone marrow stromal cells: ex vivo expansion and in vivo bone formation. Transplantation. 2000 Dec 27;70(12):1780-7) 줄기세포의 증식능의 저하와 분화능의 감소나 골세포로의 분화가 촉진되는등 줄기 세포로의 특성소실로 인하여, 일반 세포배양용액에 인간혈청을 그대로 사용되기 어려웠다. 또한, 실제 줄기세포를 생체에 이식했을 때 그 생존력(viability)이 매우 낮고 이식된 세포가 자체의 효과를 충분히 나타내지 못하는 등 여러 제한점을 가지고 있다는 점이 문제점으로 내재되어 왔다. 이러한 성체 줄기세포의 조직 재생능을 최적화하기 위해 줄기세포 이식시의 생존률을 증대하고 이식의 효과를 최적화하고 이를 활성화하기 위한 기술에 대한 연구 또한 아직까지 미진한 상태이다.

따라서, 본 발명에서는 줄기 세포의 대사체의 생성과 세포독성을 최소화 할 수 있는 무혈청 배지와 이러한 무혈청 배지를 이용하여 줄기 세포를 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물을 개발하였다.

본 발명은 임상 적용을 위하여 줄기 세포의 대사체의 생성과 세포독성을 최소화 할 수 있는 무혈청 배지와 상기 무혈청 배지를 이용하여 줄기 세포를 배양한 배양액과 줄기세포 단백질 성분을 함유하는 조직 재생용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명을 구성하는 조직 재생용 조성물은 피부 및 지방 줄기세포 자체를 최적화 하기 위한 무혈청 배양액 및 배양 조건을 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 조직 재생용 조성물은 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 무혈청 배지는 아미노산 또는 그 유사체, 비타민 또는 그 유사체 및 무기질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 무혈청 배지에 포함되는 아미노산 또는 그 유사체는 L-glutamin 350 내지 380 mg/L, L-isoleucine 240 내지 270 mg/L, L-Valine 190 내지 220 mg/L 또는 L-proline 230 내지 260 mg/L, L-Threonine 190 내지 220 mg/L 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 무혈청 배지에 포함되는 비타민 또는 그 유사체는 Ascorbic acid-2-PO₄10 내지 30 mg/L, i-inositol 10 내지 30 mg/L, Choline Chloride 10 내지 20 mg/L, Thiamine HCl 3 내지 10 mg/L 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물은 항산화제 또는 그 유사체, 성장인자 또는 그 유사체, 콜라겐 또는 그 유사체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물은 상기 항산화제 또는 그 유사체로서 L-리포산, 보조효소 Q-10, C-MED 100, Trolox, GSH 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물은 상기 성장인자 또는 그 유사체로 혈관내피 성장인자, 간세포 성장인자, 형질전환 성장인자-베타, 혈소판 유래 성장인자-에이, keratin sulfate, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor) 또는 cadherin(외피성 성장인자-2와 유사) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물은 상기 콜라겐 또는 그 유사체로 콜라겐 I~XIII, XVII , 파이브로넥틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직재생용 주사제 조성물을 지방 줄기세포와 함께 피부 조직에 주사하여 피부 조직을 재생시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포 배양액을 단독 이용하거나 줄기세포에서 추출된 단백질과 함께 이용하여 피부와 연부조직 등의 손상된 부위의 결함을 치료하는 실제 치료 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "피부 유래 줄기세포(skin tissue-derived progenitor cell; SPC)"는 인간 및 동물의 피부에서 분리한 피부 유래 줄기세포로 지방세포, 조골세포, 연골세포, 신경세포 등의 다양한 조직의 세포로 분화가 가능한 세포를 의미하며, "지방줄기세포(adipose derived stem cell)"는 인간 및 동물의 피부에서 분리한 지방유래 줄기세포로 지방세포, 조골세포, 연골세포, 조혈세포 등으로 분화가 가능한 세포를 의미한다.

본 발명의 제1 형태는 아미노산 또는 그 유사체, 비타민 또는 그 유사체, 및 무기질을 포함하는 무혈청 배양 배지에 관한 것이다.

아미노산 또는 그 유사체는 L-Alanine, L-Asparitic acid, L-Histdine, L-leucine 또는 L- 글루타민 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질들은 산화영양원 및 여러 가지 신진 대사에 도움이 된다(Kaori Shigemitsu. et al., J. Biol. Chem., 274: 1058 (1999)). 본 발명에 있어서 상기 무혈청 배지에는 상기 아미노산 또는 그 유사체가 L-glutamin 350 내지 380 mg/L, L-isoleucine 240 내지 270 mg/L, L-Valine 190 내지 220 mg/L 또는 L-proline 230 내지 260 mg/L, L-Threonine 190 내지 220 mg/L 인 것을 특징으로 한다.

비타민 또는 그 유사체는 비타민 A, B, C, D 또는 비타민 E로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 비타민 A는 일차적인 면역반응과 그에 관계된 세포발달과정들, 계획화된 아포토시스의 일련 반응들에 관여한다고 알려져 있으며, 대표적인 물질로는 retinoic acid가 알려져 있으며, 이는 retinoic acid receptor(RAR)에 결합하여 이에 관련된 대사과정을 조절하고 활성화시킨다. 그 중 RAR-alpha, RXR-alpha, RXR-beta에 결합된 복합체들은 주요 면역세포인 T lymphocyte의 발달에 관여하는 128여개 유전자의 발현을 촉진 혹은 억제된다고 발표되었다. 특히 아포토시스 기작에서 대표적인 anti-apoptotic protein으로 알려진 bcl2 family 유전자들이 확연히 증가됨을 보여주고 있다(Rasooly, R. et al., J. Immunol., 175: 7916 - 7929 (2005); Spilianakis,C.G. et al., Eur. J. Immunol., 35(12): 3400-4 (2005); Evans T, Exp. Hematol., 33(9): 1055-61 (2005)). 이것은 비타민 A가 아포토시스반응을 억제하는 효과를 보여줄 수 있음을 시사하고 있다.

비타민 B는 흔히 riboflavin이라고 알려져 있으며, 인간의 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하며, 일차적 면역세포들의 이동으로 인한 확장된 초기 면역반응 효과를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.

비타민 C의 세포내 가장 중요한 기능은 콜라겐 합성과 새로운 섬유아세포의 합성을 촉진한다는 것으로, 대표적으로 ascorbic acid가 있다. 다른 사이토카인인 TGF-β와 IFN-γ와 동시 처리는 그 효과를 배가시킨다(Chung, J.H. et al., J. Dermatol. Sci., 15(3): 188-200 (1997)). 다른 비타민들보다 세포 발달과 분화에 영향을 준다고 알려져 있어 많이 사용되어 왔던 비타민 D3는 세포성장과 분화발달과정, 특히 표피(epidermis)의 각질형성세포(keratinocytes) 및 골격형성세포인 뼈모세포 (osteoblasts)와 뼈파괴세포(osteoclasts)들의　형성 과정에 중요한 신호전달체계를 매개하고 있다. 또한 염증반응에 포함된 여러 가지의 사이토카인인 가령 IL-1α, IL-6, IL-8등에 억제효과를 가진다(Alper, G. et al., Endocr. Rev., 23: 763 (2002))

본 발명에 있어서, 상기 무혈청 배지에는 비타민 또는 그 유사체가 Ascorbic acid-2-PO₄10 내지 30 mg/L, i-inositol 10 내지 30 mg/L, Choline Chloride 10 내지 20 mg/L, Thiamine HCl 3 내지 10 mg/L 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 형태는 상기 비타민 또는 그 유사체, 아미노산 또는 그 유사체, 및 무기질을 포함하는 무혈청 배양 배지에서 줄기세포를 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제2 형태에 따른 조직 재생용 조성물은 치료 조직에 투여하였을 때 이식된 줄기세포의 생존력과 활성을 증대시켜 치료 효과를 극대화하기 위하여 최적화된 조성물을 함유한다.

본 발명에서는 인간지방조직으로부터 줄기세포를 분리 배양하여 배양된 지방 유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하고, 그로부터 조직 재생용 조성물을 얻었다. 분리된 줄기세포는 혈청을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)의 비유도성 배지에 배양하여 기본적으로 비접착성 세포들을 제거한다. 그 후 본 발명의 무혈청 배양배지에서 줄기세포를 배양하면 본 발명에 따른 조직 재생용 조성물을 얻을 수 있다.

이후 인간 줄기세포를 상기 무혈청 배지에서 무혈청 상태로 계대 배양한 후 그 배양액을 얻는다. 조직 재생용 조성물은 무혈청 배지에서 배양된 줄기 세포로부터 유래된 성장인자 또는 그 유사체, 항산화제, 및 콜라겐 또는 그 유사체가 포함된다.

항산화제 또는 그 유사체는 L-리포산, 보조효소 Q-10, C-MED 100, 레티노산, 빈포세틴, 피카밀론, 퀸산, 퀸산염, 아데닌 디뉴클레오티드, 아세틸-L-카르니틴, 디메틸아니모 에탄올 또는 L-하이드록시산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 항산화제는 세포 노화와 관련된 레티노산과 그 전 단계 산물인 빈포세틴과 이러한 사이클의 보조역할을 하는 피카밀론이 있으며, 단백질 키나아제의 역할을 수행하는 퀸산과 퀸산염이 있다. 그 외에 아데닌 디뉴클레오티드, 아세틸-L-카르니틴 등 신진대사에 관여하는 탄수화물 합성의 인자들은 세포에 중요한 영양 작용을 하며, 아포토시스(apoptosis) 중지 역할을 하는 디메틸아니모 에탄올, 세포 증식에 관여하는 L-리포산, L-하이드록시산 그리고, 아미노산 생산에 관여하는 보조효소 Q-10 같은 다른 촉진성 첨가제 등을 포함한다.

성장 인자 또는 그 유사체는 혈관 내피 세포, 간세포성 성장인자, 형질 전환 인자, 혈소판 유래 성장 인자, keratin sulfate, 섬유아세포 성장 인자 또는 cadherin(외피성 성장인자-2와 유사)등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 성장 인자들은 세포 표면에 있는 수용체와 결합하여 단백질로서 세포의 증식과 분화를 활성화 시키는 작용을 한다 (Connolly, D.T. J. Cell. Biochem, 47(3): 219-23 (1991);Schott, R.J. and Morrow, L.A. Cardiovasc, Res., 27(7): 1155-61 (1993); Neufeld, G. et al., Prog. Growth Factor Res., 5(1): 89-97 (1994); Senger, D.R. et al., Cancer and Metastasis Reviews, 12(3-4): 303-24 (1993)). 특이적 수용체에 성장인자가 결합하게 되면 신호 전달 사슬이 활성화되어 세포의 외부로부터 내부의 핵으로 신호가 전달된다. 신호 전달이 계속되면 다량의 다른 전달자와 같이 작용하여 최종적으로 새로운 단백질이 합성화된다. 이와 같은 방법으로 성장인자는 세포간 상호작용의 전달, 기능, 제어에 있어서 중요한 신호 전달 체계를 형성한다(Lawrence, D.A. Eur. Cytokine Netw, 7(3): 363-74 (1996); Cox, D.A. and Maurer, T., Clin. Immunol. Immunopathol, 83(1): 25-30 (1997); Alevizopoulos, A. and Mermod, N., Bioessays. 19(7): 581-91 (1997)).

콜라겐 또는 그 유사체는 콜라겐 I~XIII, XVII 등과 파이브로넥틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것으로 콜라겐은 동물의 체내에 가장 많이 포함되는 단백질로, 인체의 전 단백질의 약 30%를 차지하고 있다. 세포 내의 단백질이나 혈액의 단백질은 물에 녹은 상태로 존재하고 있지만, 콜라겐은 섬유나 막 등과 같은 구조체로서 체내에 존재하고 있다(Bell, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76: 1274-1278 (1979)). 따라서 콜라겐의 제 1의 역할은 체내 장기의 형태를 만들고 지지하는 것으로 몸의 골조를 만드는 데 있다. 제 2콜라겐의 역할은 몸의 세포와 세포 사이를 충진하는 것으로 세포의 접착제로서 작용하여 콜라겐에 의해 지방 줄기세포의 생착이 증가될 것이다. 체내에서는 끊임없이 콜라겐의 분해와 합성이 반복하지만 노화가 진행되면서 분해보다 합성이 늦어져 신체 내의 균형이 무너져 체내의 콜라겐 양은 감소된다. 예를 들어 피부에서는 진피의 콜라겐이 기본구조를 형성하여 얽혀 있는 그물 구조를 만들고 있다. 이것이 탄력성, 신축성의 토대가 되며, 힘이 가해지면 그 그물구조는 그 힘에 따라 변형된다. 그리고 힘이 가해지지 않게 되면 원래의 형태로 복원된다. 그러나 노화가 진행됨에 따라 콜라겐 양이 줄어들어 그물 구조가 약화되어 개개의 콜라겐이 가늘어지거나 파괴되면, 피부의 탄력성이나 신축성이 불충분하여 피부가 처지거나 주름이 유발(Leung, D. Y. et al., Science., 191: 475-477 (1976); Stopak, D., and Harris, A. K., Dev. Biol. 90: 383-398 (1982))되며 상기 세포 활성화 화합물은 이것의 방지에 도움이 될 것이다.

본 발명에 따른 무혈청 배지에서의 줄기세포 배양과 성장인자의 생산력은 일반적인 동물 혈청을 포함하고 있는 혈청 배지의 조건과 비교하였을 때, 전혀 감소되거나 혹은 부정적인 효과를 볼 수 없으며, 일부 성장인자는 무혈청 배지에서 더 높은 생산력을 보이고, 혈청에 의한 미지의 성분을 가진 혈청 배지와는 달리 배양 배지의 모든 성분 함량을 확인할 수 있다. 이는 혈청배지에 포함된 동물혈청에서 올 수 있는 여러 가지 변수들을 최소화할 수 있음을 시사하는 것이고, 적은 비용으로 본 발명이 목적하는 효능을 달성할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 제3 형태는 배양된 지방 줄기세포를 함유하는 무혈청 배양 배지에서 1일 이상 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물을 줄기세포와 함께 치료 부위에 투여하여 피부와 연부조직, 치아와 뼈 결함을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 지방 줄기세포 최적화 구성물을 계대 배양 및 미계대 배양한 지방 줄기세포와 혼합하여 주사 혹은 이식하면 지방 줄기세포를 활성화하여 주변 환경에 좋은 영향을 주어 개체의 피부, 연부 조직, 뼈의 미용적 또는 퇴행적 결함을 빠르게 교정하는 것이 가능하다.

피부, 뼈, 연부 조직, 치아 조직의 결함은 상처, 질병, 노화 등의 원인으로 인해 발생할 수 있다. 따라서 흉터나 상처를 피하면서 결함이 발생된 조직의 성장을 회복 강화시키기 위한 방법이 필요하다.

본 발명의 방법은 결함에 인접한 부위 또는 결함부위의 조직에 지방 줄기세포 및 본 발명에 따른 조직 재생용 조성물의 주사 또는 이식을 수반한다. 이런 방법으로 교정될 수 있는 결함은 주름, 튼살, 파인 흉터, 비외상성 피부함몰, 여드름 흉터, 건선등과 같은 피부염, 입술의 형성 부전, 치주 결함, 연부 조직 결함, 뼈 결함, 화상, 피부 궤양 등이다. 본 발명에 제시된 바와 같이 조직 재생용 배양물에 포함되는 줄기세포 단백질은 개체와의 거부 반응이 없고, 필요한 양의 줄기세포는 세포 배양 시스템에서 계대배양으로 확대할 수 있다.

또한, 줄기세포 및 본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 생물 분해성 무세포 기질과 함께 투여될 수 있는데 이는 투여된 줄기세포가 구조적 역할을 하는 기질에 의해 시험관 내에서도 생체 조직과 유사한 환경을 얻게 되므로 주사 또는 이식과 같은 시술시 주변조직과의 생착력을 높여주고 정상 세포의 기능을 하기 위한 안정성을 제공한다.

흡수 가능한 무세포 기질로는 세포 지지체의 용도에 따라 겔이나 비드, 스폰지, 시트, 골격형으로 나뉘어 지는데 콜라겐 스펀지, 키토산 알지네이트 스펀지, 키토산 비드, 하이알루로닉산 스펀지 등의 시판되고 있는 기질을 이용하여 활용한다.

본 발명에 따른 인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물은 실제 시술시 섬유아세포 및 지방 줄기세포의 증식력과 줄기세포의 생존력을 증대하며, 성장인자와 그 유사체 등의 발현을 높임으로서 시술효과를 최대화하는 효과를 제공한다.

도 1은 본 발명의 실시예와 비교예에서 배양된 줄기 세포의 세포수의 측정과 viability 검사 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 지방줄기세포를 배양한 무혈청배지에 의한 피부줄기세포의 줄기세포능의 유지 및 증대에 대한 확인을 위하여 계대 배양한 인간 피부줄기세포를 6 well plate에 500 개씩 접종한 후 Rhodamin Red/Nile blue 로 30분간 염색하고 colony 수를 계수하고 구한 CFU 값을 나타낸다.
도 3 은 본 발명의 지방줄기세포를 배양한 무혈청 배지에서 피부줄기세포를 배양한 경우 합성된 콜라겐을 양을 비교예와 대비하여 나타낸다.
도 4는 본 발명의 지방줄기세포를 배양한 무혈청 배지에서 피부줄기세포를 배양한 경우 bFGF, TGFb 의 발현양을 비교예와 대비하여 나타낸다.
도 5는 본원 발명의 무혈청 배양액을 사용한 경우와 비교예의 경우 상처 치유 촉진 효과를 나타낸다.
도 6은 피부에 발진 및 가려움증을 동반하고, 피부 조직이 각질화되어 떨어지는 증상을 갖는 환자를 대상으로 본 발명의 조직 재생용 배양물을 바르기 전과 후의 사진을 나타낸다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같으며, 이는 본 발명의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 자가 피부 조직으로부터 줄기세포의 분리

피부 유래 줄기세포를 분리하기 위하여, 표피와 같은 인간 피부조직 등에서 조직을 적출하였다. 적출된 피부조직에서 피하지방을 제거한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세척하였다.

피하지방이 제거된 피부조직에 0.075%의 콜라겐 분해효소를 첨가하여 37℃, 30분간 반응시켜 피부조직에서 세포를 분리시켰다.

반응이 끝난 세포액에 10% FBS(GIBCO, 미국)을 포함하는 DMEM (α- Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 첨가하여 원심 분리하여, 기질세포층을 10% 혈청(우 태아혈청)을 포함하는 DMEM에 부유시켜 일차배양 세포가 70-80%의 밀도에 이를 때까지, 48~72 시간 동안 배양한 후, 0.025% 트립신 용액을 이용하여 계대 배양하여, 피부조직 유래 줄기세포를 수득하였다.

실시예 2: 인간피부 조직으로부터 분리된 줄기세포의 배양 및 줄기세포의 생존력 증대 확인

상기 실시예 1에서와 같이 얻어진 피부 조직 유래 줄기세포를 6 well plate 에 5300 개씩 접종하고, 본 발명의 무혈청 배양액으로 배양하였으며, 일정 시간 간격으로 세포를 수거하여 Trypan blue 로 염색하고 살아있는 세포수를 계수하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 배양액은 아미노산 또는 그 유사체, 비타민 또는 그 유사체 및 무기질로 구성되며, 각각 아래 표 1, 표 2 및 표 3으로 나타내었다.

Components	Concentration
L-glutamine	365.00
L-isoleucine	259.47
L-valine	204.18
L-proline	240.48
L-Threonine	195.12
L-arginine HCl	147.5
L-phenylalanine	147.48
L-histidine HCl H2O	92.48
Glycine	36.42
L-Tyrosine disodium salt dihydrate	83.79
L-Tryptophan	36.35
L-methionine	31.91

Components	Concentration
Choline Cholide	8.98
i-Inositol	12.60
Thiamine HCl	5.17
Ascorbic acid 2-PO4(Mg salt)	16.67
Folic Acid	2.65
D-Ca pantothenate	2.24
Niacinamide	2.02
Pirudixine HCl	2.031
vitamin B12	0.68

Components	Concentration
CaCl₂(anhyd)	116.6
KCl	311.8
MgCl₂	28.64
MgSO₄	48.84
NaCl	6995.5
NaHCO₃	2438
NaH₂PO₄ H₂O	62.5
CdSO₄ 8H₂O	0.0033
Na₂SiO₃ 9H₂O	0.067

비교예로서 실시예 1에서 얻어진 피부줄기세포를 6 well plate 에 단위면적당 약 5300 개씩 접종하고, 종래 사용되는 배양액 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 5~10% fetal bovine serum(FBS)로 배양하였다.

상기 실시예와 비교예에서 배양된 줄기 세포의 세포수의 측정과 viability 검사는 0.1ml의 세포 부유액과 동량의 0.2% trypan blue를 혼합한 후 hemocytometer를 이용하여 현미경 시야에서 염색된 세포를 계수하고 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 지방줄기세포를 배양한 무혈청 배지를 이용하여 피부 줄기 세포를 배양한 경우 종래 사용되는 배양액으로 배양한 경우에 비하여 세포성장률이 좋은 것으로 나타났다.

실시예 3: 인간 피부 조직으로부터 분리된 줄기세포의 줄기세포능 관찰

또한, 본 발명에 따른 지방줄기세포를 배양한 무혈청배지에 의한 피부줄기세포의 줄기세포능의 유지 및 증대에 대한 확인을 위하여 계대 배양한 인간 피부줄기세포를 6 well plate에 500 개씩 접종한 후 Rhodamin Red/Nile blue 로 30분간 염색하고 colony 수를 계수하고 CFU 값을 구하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 왼쪽 열의 대조군 사진에 비하여 오른쪽 열의 사진은 CFU가 증가하는 것을 확인하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 무혈청 배양액을 사용한 경우 일반적인 DMEM 배양액을 사용한 경우보다 3배 이상의 줄기세포능을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 4: 조직 재생 배양액의 활성화 분자의 확인

상기 실시예 1 및 비교예에서 분리된 피부 줄기 세포를 본 발명의 무혈청 배지 및 비교예의 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 세포를 phosphate buffer saline 으로 washing 한 후 trizol 방법을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PreMix를 이용하여 cDNA를 만들었으며, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 25 싸이클 PCR 진행하였다.

도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 본원 발명의 무혈청 배양액을 사용하여 줄기 세포를 배양한 조식 재생 배양액의 경우 콜라겐 합성 및 bFGF, TGFb 의 발현 양이 비교예의 경우보다 높다는 것을 알 수 있다.

실시예 5: 조직 재생 배양액의 in - vitro wounding 개선 효과 측정

상기 실시예 1 에서 분리된 피부 줄기 세포를 2개의 6 well plate 에 2 ×10 ⁵ 접종하고, 24시간 후에 wounding 을 만들었다.

이후 각각의 plate 에 본 발명의 무혈청 배양액 및 비교예의 배양액(DMEM)을 첨가하여 배양하면서 24시간, 48시간 후 상처 치유 효과를 측정하였으며 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이 본원 발명의 무혈청 배양액을 사용하여 줄기 세포를 배양한 조직 재생용 배양액의 경우 상처 치유를 촉진하는 것을 알 수 있다.

실시예 6: 조직 재생 배양액의 in - vivo wounding 개선 효과 측정

피부에 발진 및 가려움증을 동반하고, 피부 조직이 각질화되어 떨어지는 증상을 갖는 환자를 대상으로 상기 실시예 2에서 만들어진 조직 재생용 배양물을 거즈에 적셔 2일 간격으로 2회에 걸쳐 발라주었으며, 본 발명의 조직 재생용 배양물을 바르기 전과 후의 사진을 도 6으로 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이 본 발명의 조직 재생용 배양물을 바른 후 증상완화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

인간 지방 줄기세포를 무혈청 배양 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 무혈청 배양배지는 아미노산 또는 그 유사체, 비타민 또는 그 유사체 및 무기질을 포함하는 것인 조직 재생용 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 아미노산 또는 그 유사체는 L-glutamin 350 내지 380 mg/L, L-isoleucine 240 내지 270 mg/L, L-Valine 190 내지 220 mg/L 또는 L-proline 230 내지 260 mg/L, L-Threonine 190 내지 220 mg/L 인 것인 조직 재생용 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 비타민 또는 그 유사체는 Ascorbic acid-2-PO₄ 10 내지 30 mg/L, i-inositol 10 내지 30 mg/L, Choline Chloride 10 내지 20 mg/L, Thiamine HCl 3 내지 10 mg/L 인 것인 조직 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조직재생용 조성물은 항산화제 또는 그 유사체, 성장인자 또는 그 유사체, 콜라겐 또는 그 유사체를 포함하는 것인 조직 재생용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 항산화제 또는 그 유사체는 L-리포산, 보조효소 Q-10, C-MED 100, Trolox, GSH 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 조직 재생용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 성장인자 또는 그 유사체는 혈관내피 성장인자, 간세포 성장인자, 형질전환 성장인자-베타, 혈소판 유래 성장인자-에이, keratin sulfate, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor) 또는 cadherin(외피성 성장인자-2와 유사) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 조직 재생용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 콜라겐 또는 그 유사체는 콜라겐 I~XIII, XVII , 파이브로넥틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 조직 재생용 조성물.
인간 지방 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 배양액을 함유하는 제 1 항의 조직재생용 주사제 조성물을 지방 줄기세포와 함께 피부 조직에 주사하여 피부 조직을 재생시키는 방법.