KR20110092328A

KR20110092328A - Ｉｌ-13에 결합하는 리간드

Info

Publication number: KR20110092328A
Application number: KR1020117014679A
Authority: KR
Inventors: 루돌프 엠 티 드 빌트; 이누샤 드 실바; 밀란 오베카
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드; 도만티스 리미티드
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2011-08-17
Also published as: EA201100653A1; AU2008364461A1; US20110236380A1; SG171733A1; ZA201103692B; WO2010060486A1; CA2744588A1; CN102292351A; MX2011005541A; EP2358754A1; IL212812A0; BRPI0823231A2; JP2012509658A

Abstract

인터루킨-13(IL-13) 또는 IL-4 및 IL-13에 대한 결합 특이성을 갖는 리간드가 개시된다. 또한, 이들 리간드의 이용 방법이 개시된다. 특히, 폐질환과 같은 IL-13 매개 질환, 예를 들어, 알러지성 천식의 치료를 위한 이들 리간드의 용도가 기재된다. 상기 리간드는 강력한 IL-13 결합 동역학을 갖는다. 인간 IL-13과 하나 이상의 영장류 IL-13 간에 교차-반응성인 리간드가 기재된다. 리간드는 원핵 세포에서 잘 발현된다.

Description

ＩＬ-13에 결합하는 리간드{LIGANDS THAT BIND IL-13}

발명의 배경

Th2-형 면역 반응은 항체 생성 및 체액성 면역성을 촉진시키며, 세포외 병원체와 싸우도록 만들어진다. Th2 세포는 Ig 생성의 매개체이며(체액성 면역성), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13을 생성한다(문헌[Tanaka, et, al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)]). Th2-형 면역 반응은 특정 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-13) 및 특정 유형의 항체(IgE, IgG4)의 생성을 특징으로 하며, 유루안(watery eye) 및 천식 증후, 예를 들어, 기도 염증 및 폐에서의 기도 근육 세포 의 수축을 야기할 수 있는 전형적인 알러지성 반응이다.

인터루킨-13(IL-13)은 면역글로불린 아이소형(isotype)의 IgG4 및 IgE로의 전환, CD23 상향 조절, VCAM-1 발현을 유도하며, 예를 들어, 호산구 vv 및 비만 세포를 직접적으로 활성화시키는 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이다. IL-13은 주로 Th2 세포에 의해 생성되며, LPS-자극된 단핵구에 의해 염증성 사이토카인(IL-1, IL-6, TNF, IL-8)의 생성을 억제한다. IL-13은 IL-4와 밀접하게 연관되며, IL-13은 IL-4와 아미노산 수준에서 20-25% 서열 유사성을 공유한다(문헌[Minty et. al., Nature, 363(6417):248-50 (1993)]). IL-13의 많은 활성이 IL-4의 활성과 유사하지만, IL-13은 IL-4가 하는 것과 같이 활성화된 T 세포 또는 T 세포 클론 상에 성장 촉진 효과를 갖지 않는다(문헌[Zurawski et al., EMBO J. 12:2663 (1993)]).

세포 표면 수용체 및 수용체 복합체는 상이한 친화성으로 IL-13에 결합한다. IL-13에 결합하는 수용체 및 수용체 복합체의 주요 성분은 IL-4Rα, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2이다. 이들 사슬은 세포의 표면상에 IL-4Rα/IL-13Rα1 또는 IL-4Rα/IL-13Rα2의 헤테로다이머 또는 모노머로서 발현된다. IL-4Rα 모노머는 IL-4에 결합하나, IL-13에는 결합하지 않는다. IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 모노머는 IL-13에 결합하나, IL-4에는 결합하지 않는다. IL-4Rα/IL-13Rα1 및 IL-4Rα/IL-13Rα2 헤테로다이머는 IL-4 및 IL-13 둘 모두에 결합한다.

IL-13은 그의 생물학적 기능을 근거로 치료적으로 중요한 단백질이다. IL-13은 항-종양 면역 반응을 증진시킬 가능성을 보여준다. IL-13이 알러지성 질병의 발병기전에 수반되기 때문에, 이 사이토카인의 억제제는 치료적 혜택을 제공할 수 있다. IL-13 억제제는 제WO2007085815호에 개시되어 있으며, 그 개시물은 본 명세서에 참조로 포함된다. 제WO2007085815호는 우수한 항-IL-13 항체 단일 가변 도메인인 DOM10-53-474를 개시한다. IL-13을 억제하는 개선된 제제가 필요하며, 따라서, 본 발명자들은 심지어 DOM10-53-474보다 더 잘 수행하는 IL-13 억제제, 특히 개선된 IL-13 결합 동역학(binding kinetics) 및/또는 중화력 및/또는 IL-13 종 교차-반응성을 갖는 억제제를 찾으려고 노력하였다. 본 발명자들은 이러한 이점이 개선된 치료적 및 예방적 항-IL-13 약물 및 이들의 개발을 제공할 것임을 인식하였다.

발명의 요약

본 발명은 개선된 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인, 이들을 포함하는 길항제 및 조성물, 방법 및 용도를 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖는 것을 제외하고, DOM10-53-474(서열 번호 1)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 단일 가변 도메인은 카바트(Kabat) 넘버링(numbering)에 따른 위치 28에 발린을 가지며, 임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

제2의 양태에서, 본 발명은 DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖는 것을 제외하고, DOM10-53-474와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 단일 가변 도메인은 서열 XGX'X"를 가지며, 여기서, G는 카바트 넘버링에 따른 위치 54에 있고,

X는 H 또는 K이며,

X'는 G 또는 K이고,

X"는 K 또는 I이며,

임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

추가의 양태에서, 본 발명은 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 가변 도메인은 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 가변 도메인은 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3) 또는 DOM10-53-568(서열 번호 4)이다.

본 발명의 일 양태는 DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); DOM10-53-568(서열 번호 8); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된(encoded) 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 임의로, 여기서 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

본 발명의 일 양태는 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)과 99% 이상 동일하거나 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 임의로, 여기서 폴리펩티드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다.

또한, 본 발명은 이러한 단일 가변 도메인을 포함하는 길항제, 융합 단백질 및 장치, 용도, 방법, 및 조성물에 관한 것이다. 상기 길항제는 예를 들어, 천식, COPD 또는 인플루엔자와 같은 폐질병을 치료 및/또는 예방하기 위하여 환자, 예를 들어 인간 환자에서 IL-13-매개 질병 및 질환을 처리하기에 유용하다.

상이한 범주의 본 발명의 추가의 실시형태가 본 명세서에서 고려되며, 다음과 같이 개시된다.

도면의 간단한 설명

도 1: pDOM5 벡터의 맵(map).

도 2: (a) 본 발명의 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인뿐 아니라 종래 기술의 항-IL-13 단일 가변 도메인 DOM10-53-474(서열 번호 1)의 아미노산 서열; 및 (b) 단일 가변 도메인의 CDR의 뉴클레오티드 서열(카바트에 따른).

도 3: 본 발명의 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인뿐 아니라 종래 기술의 항-IL-13 단일 가변 도메인 DOM10-53-474를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열.

도 4: (a) 및 (b) 본 발명의 항-IL-13 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열 대 DOM10-53-474(서열 번호 1)의 아미노산 서열의 정렬. 넘버링은 카바트에 따른다. DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비한 아미노산 잔기 차이는 차이가 발생하는 위치에 아미노산(단일 문자 포맷)으로 표시되어 있다. 특정 위치에서 DOM10-53-474에 비한 아미노산의 차이가 없는 경우, 이는 "."로 표시되어 있다. CDR에는 밑줄쳐 있다.

(c) 및 (d) 본 발명의 항-IL-13 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열 대 DOM10-53-474(서열 번호 1)의 아미노산 서열의 정렬. 넘버링은 초티아(Chothia)에 따른다. DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비한 아미노산 잔기 차이는 차이가 발생하는 위치에 아미노산(단일 문자 포맷)으로 표시되어 있다. 특정 위치에서 DOM10-53-474에 비한 아미노산의 차이가 없는 경우, 이는 "."로 표시되어 있다. CDR에는 밑줄쳐 있다.

도 5: 본 발명의 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인뿐 아니라 종래 기술의 항-IL-13 단일 가변 도메인 DOM10-53-474(서열 번호 1)의 트립신 분해.

상세한 설명

본 명세서 내에서, 본 발명은 명확하고 정확한 명세서가 기재될 수 있도록 하는 방식으로, 실시형태를 참조하여 기재되었다. 상기 실시형태는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양하게 조합되고 분리될 수 있도록 의도되며 그럴 수 있음이 이해되어야 한다.

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 해당 분야(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기법 및 생화학 분야)의 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기법은 분자적, 유전학적 및 생화학적 방법(일반적으로, 참고문헌으로 본 명세서에 포함되는 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.] 및 문헌[Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4^th Ed, John Wiley & Sons, Inc.]을 참조)과 화학적 방법에 사용된다.

용어 "DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비한 아미노산 변화"는 각 변화가 아미노산 치환, 결실 또는 첨가 중 하나인 아미노산 변화를 그 범주에 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 오직 아미노산 치환만을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "리간드"는 IL-13에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 부분(moiety)을 포함하는 화합물을 지칭한다. 본 발명에 따른 리간드는 상이한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 가변 도메인을 임의로 포함하며, 함께 표적 화합물에 대한 결합 부위를 형성하는 가변 도메인 쌍을 함유하지 않는다(즉, 함께 IL-13에 대한 결합 부위를 형성하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하지 않는다). 임의로, 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 각각의 도메인은 원하는 표적(예를 들어, IL-13)에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인(예를 들어, V_H, V_HH), 면역글로불린 단일 경쇄 가변 도메인(예를 들어, V_L))이다. 또한, 표적(예를 들어, IL-13)에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 각각의 폴리펩티드 도메인은 원하는 표적(예를 들어, IL-13)에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 적절한 포맷으로 포함하여, 결합 도메인이 표적에 대한 결합 특이성을 갖게 할 수 있다. 예를 들어, CDR은 적합한 단백질 스캐폴드(scaffold) 또는 골격, 예를 들어, 친화체(affibody), SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인 상으로 이식될 수 있다. 추가로, 리간드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 2가(이종 2가(heterobivalent)) 또는 다가(이종 다가(heteromultivalent))일 수 있다. 따라서, "리간드"는 각각의 dAb가 상이한 표적(예를 들어, IL-4, IL-13)에 결합하는 2개의 dAb를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 리간드는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체 포맷(예를 들어, IgG-형 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')₂)과 같은 적합한 포맷, 또는 친화체, SpA 골격, LDL 수용체 클래스 A 도메인, EGF 도메인, 아비머(avimer) 및 이중- 및 다중특이적 리간드와 같은 적절한 단백질 스캐폴드 또는 골격의, 상이한 표적(또는 dAb의 CDR)과 결합하는 2개 이상의 dAb를 포함하는 폴리펩티드도 포함한다.

또한, 표적(예를 들어, IL-13)에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인은 원하는 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인일 수 있고, 예를 들어, 단백질 도메인은 친화체, SpA 도메인, LDL 수용체 클래스 A 도메인, 아비머로부터 선택된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2005/0053973호, 제2005/0089932호, 제2005/0164301호 참조). 필요에 따라, "리간드"는 하나 이상의 부가 부분을 추가로 포함할 수 있고, 상기 부분은 각각 독립적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 부분 또는 펩티드가 아닌 부분(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 지질, 탄수화물)일 수 있다. 예를 들어, 리간드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 반감기 연장 부분(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 부분, 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체를 포함하는 부분, 트랜스페린(transferrin), 트랜스페린 단편 또는 트랜스페린 변이체를 포함하는 부분, 알부민에 결합하는 부분, 신생아(neonatal) Fc 수용체에 결합하는 부분)을 추가로 포함할 수 있다.

"이중-특이적 리간드"는 제1 항원 또는 에피토프 결합 부위(예를 들어, 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인) 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 부위(예를 들어, 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인)을 포함하는 리간드를 지칭하며, 여기서, 결합 부위 또는 가변 도메인은 단일특이적 면역글로불린에 의해 보통은 결합되지 않는 2개의 항원(예를 들어, 상이한 항원 또는 2 카피(copy)의 동일한 항원) 또는 동일한 항원 상의 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 2개의 에피토프는 동일한 항원 상에 있을 수 있으나, 동일한 에피토프가 아니거나 단일특이적 리간드에 의해 결합되기에 충분히 인접해 있지 않다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 상이한 특이성을 갖는 결합 부위 또는 가변 도메인으로 이루어지며, 동일한 특이성을 갖는 서로 상보적인 가변 도메인 쌍(즉, V_H/V_L 쌍)을 함유하지 않는다(즉, 하나의 결합 부위를 형성하지 않는다).

본 명세서에서 사용되는 어구 "표적"은 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인이 결합할 수 있는 생물학적 분자(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물)를 지칭한다. 표적은 예를 들어, 세포내 표적(예를 들어, 세포내 단백질 표적), 용해성 표적(예를 들어, IL-4, IL-13과 같은 분비 단백질), 또는 세포 표면 표적(예를 들어, 막 단백질, 수용체 단백질)일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적은 IL-4 또는 IL-13이다.

어구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 상이한 또는 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(V_H, V_HH, V_L)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종다합체 또는 이종다합체)으로 존재할 수 있고, 여기서 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합하는 경우). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"이다. "단일 면역글로불린 가변 도메인"은 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 항체 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일 실시형태에서 인간 항체 가변 도메인이나, 이는 또한 설치류(예를 들어, 전문이 참고문헌으로 본 명세서에 포함되는 제WO 00/29004호에 기재된 것과 같다), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) V_HH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 V_HH는 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. V_HH는 인간화될 수 있다.

본 명세서에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)은 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. CDR 및 프레임워크(FR) 영역의 위치 및 넘버링 시스템은 카바트 등에 의해 정의되었다(문헌[Kabat, E.A. et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)]). 본 명세서에 기재된 V_H 및 V_L(V_κ) dAb의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3)의 아미노산 서열은 잘 알려져 있는 카바트 아미노산 넘버링 시스템 및 CDR의 정의에 기초하여, 해당 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 카바트 넘버링 시스템에 따라, 중쇄 CDR-H3은 다양한 길이를 가지며, 잔기 H100과 H101 사이의 삽입을 K까지의 문자로 넘버링한다(즉, H100, H100A ... H100K, H101). 대안적으로, CDR은 다음과 같은 AbM에 따라, 또는 접촉 방법에 따라, 초티아 시스템을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342 (6252), p877-883]). CDR을 결정하는 적합한 방법에 대해서는 http://www.bioinf.org.uk/abs/를 참조하라.

일단 각각의 잔기가 넘버링되면, 하기의 CDR 정의를 적용할 수 있다("-"는 카바트에 대해 나타낸 바와 동일한 잔기 번호를 의미한다):

카바트-서열 가변성에 기초하여 가장 통상적으로 사용되는 방법

(카바트 넘버링 사용)

CDR H1: 31-35/35A/35B

CDR H2: 50-65

CDR H3: 95-102

CDR L1: 24-34

CDR L2: 50-56

CDR L3: 89-97

초티아: 구조적 루프 영역의 위치에 기초

(초티아 넘버링 사용)

CDR H1: 26-32

CDR H2: 52-56

CDR H3: 95-102

CDR L1: 24-34

CDR L2: 50-56

CDR L3: 89-97

AbM: 카바트와 초티아 간의 절충

(카바트 넘버링 사용): (초티아 넘버링 사용):

CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35

CDR H2: 50-58 -

CDR H3: 95-102 -

CDR L1: 24-34 -

CDR L2: 50-56 -

CDR L3: 89-97 -

접촉: 결정 구조 및 항원과의 접촉 잔기의 예측에 기초

(카바트 넘버링 사용): (초티아 넘버링 사용):

CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35

CDR H2: 47-58 -

CDR H3: 93-101 -

CDR L1: 30-36 -

CDR L2: 46-55 -

CDR L3: 89-96 -

본 명세서에서 사용되는 "인터루킨-4"(IL-4)는 천연적으로 발생하거나 내인성인 포유동물 IL-4 단백질, 및 천연적으로 발생하거나 내인성인 상응하는 포유동물 IL-4 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질(예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질(즉, 합성 유기화학의 방법을 사용하여 생성)을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 이 용어는 성숙 IL-4 단백질, 다형체 또는 대립형질 변이체, 및 IL-4의 다른 아이소형 및 전술한 것의 변형되거나 변형되지 않은 형태(예를 들어, 지질화, 글리코실화)를 포함한다. 천연적으로 발생하거나 내인성인 IL-4는 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연적으로 발생하는 성숙 IL-4, 다형체 또는 대립형질 변이체 및 다른 아이소형 및 돌연변이 형태와 같은 야생형 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 예를 들어, 천연적으로 IL-4를 생성하는 공급원으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이들 단백질, 및 천연적으로 발생하거나 내인성인 상응하는 IL-4와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유동물의 이름에 따라서 지칭된다. 예를 들어, 상응하는 포유동물이 인간인 경우에, 단백질은 인간 IL-4로 지정된다. 제WO 03/038041호에 개시된 것과 같은 몇 가지 돌연변이체 IL-4 단백질이 해당 분야에 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "인터루킨-13"(IL-13)은 천연적으로 발생하거나 내인성인 포유동물 IL-13 단백질, 및 천연적으로 발생하거나 내인성인 상응하는 포유동물 IL-13 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질(예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질(즉, 합성 유기화학의 방법을 사용하여 생성))을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 이 용어는 성숙 IL-13 단백질, 다형체 또는 대립형질 변이체, 및 IL-13의 다른 아이소형(예를 들어, 선택적 스플라이싱(splicing) 또는 다른 세포 과정에 의해서 생성), 및 전술한 것의 변형되거나 변형되지 않은 형태(예를 들어, 지질화, 글리코실화)를 포함한다. 천연적으로 발생하거나 내인성인 IL-13은 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연적으로 발생하는 성숙 IL-13, 다형체 또는 대립형질 변이체 및 다른 아이소형 및 돌연변이 형태와 같은 야생형 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, IL-13은 천식(아토피성 및 비아토피성 천식)과 연관된 것으로서, 성숙 인간 IL-13의 위치 110에서 Arg이 Gln(성숙 IL-13의 위치 110은 전구체 단백질의 위치 130에 상응한다)에 의해서 대체된 인간 IL-13 변이체, 및 IL-13의 다른 변이체를 포함한다(문헌[Heinzmann el al., Hum Mol Genet. 9:549-559 (2000)]. 이러한 단백질은 예를 들어, 천연적으로 IL-13을 생성하는 공급원으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이들 단백질, 및 천연적으로 발생하거나 내인성인 상응하는 IL-13과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유동물의 이름에 따라서 지칭된다. 예를 들어, 상응하는 포유동물이 인간인 경우에, 단백질은 인간 IL-13으로 지정된다. 제WO 03/035847호에 개시된 것과 같은 몇 가지 돌연변이체 IL-13 단백질이 해당 분야에 공지되어 있다.

"친화성(affinity)" 및 "결합력(avidity)"는 결합 상호작용의 세기를 기재하는 해당 분야의 용어이다. 본 발명의 리간드와 관련하여 결합력은 세포 상의 표적(예를 들어, 제1 표적 및 제2 표적)과 리간드 간의 결합의 총체적인 세기를 지칭한다. 결합력은 개별 표적에 대한 개별 친화성의 합계보다 더 많다.

본 명세서에 사용된 "독소 부분"은 독소를 포함하는 부분을 지칭한다. 독소는 유해한 효과를 갖고/거나, 세포 생리기작을 변경(예컨대, 세포 괴사, 아폽토시스(apoptosis)의 유발, 혹은 세포분열의 억제)시키는 제제이다.

본 명세서에 사용된 용어 "용량"은 한번에 모두(단위 용량), 또는 규정된 시간 간격에 걸쳐 2회 이상의 투여로 대상체에게 투여되는 리간드의 양을 지칭한다. 예를 들어, 용량은 1일(24시간)(매일 용량), 2일, 1주, 2주, 3주, 또는 1개월 이상의 기간에 걸쳐(예컨대, 단일 투여, 또는 2회 이상의 투여로) 개체에게 투여되는 리간드(예컨대, IL-13에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드)의 양을 지칭할 수 있다. 투여 간의 간격은 임의의 요망되는 기간일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "상보적"은 두 면역글로불린 도메인이 동족쌍(cognate pairs) 또는 그룹을 형성하는 구조의 패밀리에 속하거나, 이러한 패밀리로부터 유래되며, 이러한 특징을 보유하는 경우를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 V_H 도메인 및 V_L 도메인은 상보적이고; 2개의 V_H 도메인은 상보적이지 않고, 2개의 V_L 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 구성원, 예를 들어 T 세포 수용체의 Vα 및 Vβ (또는 γ 및 δ) 도메인에서 발견될 수 있다. 인공적인 도메인, 예를 들어 그렇게 되도록 조작되지 않는 한 에피토프에 결합하지 않는 단백질 스캐폴드에 기초한 도메인은 비-상보적이다. 마찬가지로, (예를 들어) 면역글로불린 도메인 및 피브로넥틴 도메인에 기초한 2개의 도메인은 상보적이지 않다.

본 명세서에 사용되는 "면역글로불린"은 2개의 β 시트 및 보통 보존된 이황화 결합을 함유하는, 항체 분자의 면역글로불린 폴드(fold) 특성을 보유하는 폴리펩티드 패밀리를 지칭한다. 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원은 면역계에서의 광범위한 역할(예를 들어, 항체, T 세포 수용체 분자 등), 세포 부착(예를 들어, ICAM 분자) 및 세포내 신호전달(예를들어, 수용체 분자, 예를 들어 PDGF 수용체)에서의 연구를 포함하는 생체 내 세포 및 비세포 상호작용의 다양한 양태에 수반된다. 본 발명은 결합 도메인을 지니는 모든 면역글로불린 수퍼패밀리 분자에 적용가능하다. 일 실시형태에서, 본 발명은 항체에 관한 것이다.

본 명세서에 사용되는 "도메인"은 단백질의 나머지와는 독립적인 그 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 책임지며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능 소실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 전달될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 절두형(truncated) 항체 가변 도메인, 또는 N-말단 신장 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 부분적으로 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 따라서, 각각의 리간드는 2개 이상의 상이한 도메인을 포함한다.

용어 "라이브러리"는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 지칭한다. 라이브러리는 구성원들로 구성되고, 이들 구성원 각각은 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는다. 본 명세서에서, 라이브러리는 레퍼토리와 동의어이다. 라이브러리 구성원 간의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성의 원인이다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 임의로, 각각의 개별 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 한정된 수의 라이브러리 구성원을 함유한다. 유리하게는, 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하기 위해 핵산은 발현 벡터로 통합된다. 일 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있고, 이러한 각각의 유기체는 핵산의 해당 폴리펩티드 구성원을 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일 구성원을 함유하는 하나 이상의 카피의 발현 벡터를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 큰 레퍼토리를 엔코딩하는 능력을 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 "항체"는 항체를 천연적으로 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성되었는지의 여부에 상관없이; 또한 혈청, B-세포, 하이브리도마, 이입세포(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리되었는지의 여부에 상관없이, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 단편(예를 들어, Fab, F(ab')₂, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 닫힌 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody))을 지칭한다.

본 명세서에 기재된 "항원"은 본 발명에 따른 결합 도메인에 의해 결합되는 분자이다. 통상적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체 내에서 항체 반응을 일으킬 수 있다. 이는 예를 들어, 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 분자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 2개의 특정 표적(예컨대, 항원)에 대한 표적 특이성에 대해 선택된다. 통상적인 항체 및 이의 단편의 경우, 가변 루프 (L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)로 규정된 항체 결합 부위가 항원에 결합할 수 있다.

"에피토프"는 면역글로불린 V_H/V_L 쌍에 의해 통상적으로 결합된 구조의 단위이다. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체의 특이성 표적을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 경우에, 에피토프는 분리시 가변 도메인에 의해 결합된 구조의 단위를 나타낸다.

"유니버셜 프레임워크(universal framework)"는 카바트(문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services])에 의해 정의된 서열에 보존된 항체의 영역에 상응하거나 또는 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 정의된 인간 생식계 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열을 지칭한다. 본 발명은 단독의 과변이 영역에서의 변이를 통하여 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진, 단일 프레임워크, 또는 이러한 프레임워크의 세트의 용도를 제공한다.

어구 "반감기"는 예를 들어 천연 메커니즘에 의한 리간드의 분해 및/또는 이중-특이적 리간드의 제거 또는 분리로 인해, 생체 내에서 리간드의 혈청 농도가 50%로 감소되는데 걸리는 시간을 지칭한다. 본 발명의 리간드는 생체 내에서 안정적이고, 이들의 반감기는 분해 및/또는 제거 또는 분리에 내성인 분자로의 결합에 의해 증가된다. 전형적으로, 이러한 분자는 스스로 생체 내에서 긴 반감기를 지니는 천연 발생 단백질이다. 리간드의 반감기의 기능 활성이 반감기 증가 분자에 대해 특이적이지 않은 유사한 분자보다 긴 기간 동안 생체 내에서 지속된다면, 리간드의 반감기는 증가된다. 따라서, HSA 및 2개의 표적 분자에 특이적인 리간드는 HSA에는 결합하지 않지만 다른 분자에는 결합하는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는 동일한 리간드와 비교된다. 예를 들어, 리간드는 세포 상의 제3 표적에 결합할 수 있다. 통상적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 증가된다. 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 그 이상의 범위의 반감기의 증가가 가능하다. 대안적으로 또는 추가로, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x 이하의 범위의 반감기의 증가가 가능하다.

본 명세서에 사용되는 용어 "낮은 엄격성(low stringency)", "중간 엄격성", "높은 엄격성" 또는 "매우 높은 엄격성" 조건은 핵산 혼성화 및 세척에 대한 조건을 기술한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 본 명세서에서 전문이 참고문헌으로 포함되는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다. 수성과 비수성 방법이 상기 참고문헌에 기재되어 있으며, 둘 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재되는 특정 혼성화 조건은 다음과 같다: (1) 약 45 ℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)의 낮은 엄격성 혼성화 조건에 이어서 50 ℃ 이상(세척 온도는 낮은 엄격성 조건을 위해 55 ℃까지 올릴 수 있다)에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 2회의 세척; (2) 약 45 ℃에서 6X SSC의 중간 엄격성 혼성화 조건에 이어서 60 ℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척; (3) 약 45 ℃에서 6X SSC의 높은 엄격성 혼성화 조건에 이어서 65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척; (4) 65 ℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS의 매우 높은 엄격성 혼성화 조건에 이어서 65 ℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상의 세척. 매우 높은 엄격성 조건(4)이 바람직한 조건이며 다른 것으로 특정이 되지 않는다면 사용되어야 한다.

본 명세서에서 개시된 서열과 유사한 서열 또는 상동성 서열(예컨대, 약 70% 이상의 서열 동일성)도 또한 본 발명의 일부이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 수준에서 서열 동일성은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 핵산 수준에서는, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 핵산 세그먼트(segment)가 선택적인 혼성화 조건(예컨대, 매우 높은 엄격성 혼성화 조건) 하에서 상보적 가닥에 혼성화되는 경우에 실질적인 동일성이 존재한다. 핵산은 전세포 내, 세포 용해물 내, 또는 부분적으로 정제 또는 실질적으로 정제된 형태에 존재할 수 있다.

두 서열 간에 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성"(본 명세서에서 상호 교환하여 사용될 수 있는 용어)의 계산은 하기와 같이 실시된다. 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬한다(예컨대, 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교를 목적으로 무시할 수 있다). 일 실시형태에서, 비교를 목적으로 정렬한 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 약 30%, 임의로 적어도 약 40%, 임의로 적어도 약 50%, 임의로 적어도 약 60% 및 임의로 적어도 약 70%, 80%, 90%, 또는 100%일 수 있다. 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 한 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산으로 채워져 있는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등하다). 2개 서열 간에 동일성 백분율은 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어질 필요가 있는 각 갭의 길이, 갭의 수를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다.

본 명세서에서 정의된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 임의로 알고리듬 BLAST 2 서열을 이용하고 디폴트 파라미터를 이용하여 작성되고 결정된다(문헌[Tatusova, T. A. et al ., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188(1999)]). 대안적으로, BLAST 알고리듬(버젼 2.0)을 디폴트 값으로 설정된 파라미터를 이용하여 서열 정렬에 사용한다. BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 학습 검색 알고리듬이며; 이들 프로그램은 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8]의 통계 방법을 이용한 이들의 발견에 의의를 둔다.

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 해당 분야(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기법 및 생화학 분야)의 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기법은 분자적, 유전학적 및 생화학적 방법(일반적으로, 참고문헌으로 본 명세서에 포함되는 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.] 및 문헌[Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4^th Ed, John Wiley & Sons, Inc.]을 참조)과 화학적 방법에 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "IL-13의 길항제" 또는 "항-IL-13 길항제" 등은 IL-13에 결합하며, IL-13의 (즉, 하나 이상의) 기능을 억제할 수 있는 제제(예를 들어, 분자, 화합물)를 지칭한다. 예를 들어, IL-13의 길항제는 IL-13에 대한 수용체로의 IL-13의 결합을 억제하고/거나 IL-13에 대한 수용체를 통하여 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있다. 따라서, IL-13-매개 과정 및 세포 반응은 IL-13의 길항제로 억제될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 약 2개 내지 약 50개의 아미노산을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 약 50개 이상의 아미노산을 지칭한다. 폴리펩티드는 일반적으로 3차 구조를 포함하며 기능성 도메인으로 폴딩된다.

본 명세서에 사용되는 "프로테아제(protease) 분해에 내성인" 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 도메인 항체(dAb))는 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 프로테아제 활성에 적합한 온도, 예를 들어 37 ℃ 또는 50 ℃에서 약 1시간 동안 프로테아제와 함께 인큐베이션된 후에, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하의 단백질이 프로테아제에 의해 분해되거나 실질적으로 단백질이 프로테아제에 의해 분해되지 않는 경우에, 폴리펩티드(예를 들어, dAb)는 실질적으로 분해되지 않는다. 단백질 분해는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, SDS-PAGE에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능 검정(예를 들어, 리간드 결합)을 사용하여 평가할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "디스플레이 시스템"은 폴리펩티드 또는 펩티드의 집합체(collection)가 원하는 특징, 예컨대, 물리적, 화학적 또는 기능적 특징에 기초한 선택을 위해 접근가능한 시스템을 의미한다. 디스플레이 시스템은 (예를 들어, 용액 중의, 적합한 지지체에 고정된) 폴리펩티드 또는 펩티드의 적합한 레퍼토리일 수 있다. 디스플레이 시스템은 또한 세포 발현 시스템(예를 들어, 형질변환되거나, 감염되거나, 트랜스펙션되거나 형질도입된 세포내에서 핵산 라이브러리의 발현 및 세포의 표면 상의 엔코딩된 폴리펩티드의 디스플레이) 또는 무세포 발현 시스템(예를 들어, 에멀젼 구획화 및 디스플레이)을 이용하는 시스템일 수 있다. 예시적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 상기 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결시킨다. 이와 같은 디스플레이 시스템이 이용되는 경우, 원하는 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 지니는 폴리펩티드 또는 펩티드가 선택될 수 있고, 선택된 폴리펩티드 또는 펩티드를 엔코딩하는 핵산은 용이하게 분리되거나 회수될 수 있다. 핵산의 코딩 기능과 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결시키는 다수의 디스플레이 시스템이 해당 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이(파지 디스플레이, 예를 들어, 파지미드 디스플레이), 리보좀 디스플레이, 에멀젼 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드상의 디스플레이, 공유결합성 디스플레이 등이 있다(예를 들어, 제EP 0436597호(Dyax), 미국 특허 제6,172,197호(McCafferty 등), 미국 특허 제6,489,103호(Griffiths 등)를 참조).

본 명세서에서 사용되는 "레퍼토리"는 아미노산 서열 다양성을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 펩티드의 집합체를 지칭한다. 레퍼토리의 개별 구성원은 공통의 특징, 예를 들어, 공통의 구조적 특징(예를 들어, 공통의 코어 구조) 및/또는 공통의 기능적 특징(예를 들어, 공통의 리간드(예를 들어, 제네릭(generic) 리간드 또는 표적 리간드, IL-13)에 결합하는 능력)을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "기능적"은 생물학적 활성, 예컨대, 특정 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티드를 기술한다. 예를 들어, 용어 "기능적 폴리펩티드"는 항원 결합 부위를 통해 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "제너릭 리간드"는 제공된 레퍼토리의 기능적 구성원의 상당한 부분(예를 들어, 실질적으로 모든 부분)에 결합하는 리간드를 지칭한다. 제너릭 리간드(예를 들어, 공통의 제너릭 리간드)는 제공된 레퍼토리의 많은 구성원에 결합할 수 있는데, 상기 구성원이 공통의 표적 리간드에 대해 결합 특이성을 갖지 않더라도 상기 구성원에 결합할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 상의 기능적 제너릭 리간드 결합 부위의 존재(제너릭 리간드에 결합하는 능력에 의해 나타남)는 폴리펩티드가 정확하게 폴딩되었고 기능성임을 나타낸다. 제너릭 리간드의 적합한 예는 초항원(superantigen), 레퍼토리의 기능적 구성원의 상당한 부분에서 발현된 에피토프에 결합하는 항체 등을 포함한다.

"초항원"은 단백질의 표적 리간드 결합 부위와 다른 부위에서 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원과 상호작용하는 제너릭 리간드를 지칭하는 해당 분야의 용어이다. 포도구균 장독소가 T 세포 수용체와 상호작용하는 초항원의 예이다. 항체에 결합하는 초항원은 IgG 불변 영역에 결합하는 단백질 G(문헌[Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)]); IgG 불변 영역 및 V_H 도메인에 결합하는 단백질 A(문헌[Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)]); 및 V_L 도메인에 결합하는 단백질 L(문헌[Bjorck, J. Immunol, 140:1194 (1988)])을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "항체 포맷"은 하나 이상의 항체 가변 도메인이 항원에 대한 특이성을 구조에 부여하도록 통합될 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편), 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, dAb, V_H, V_HH, V_L), 및 상기 중 임의의 것의 변형된 형태(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체 또는 인간화 V_HH의 공유 결합에 의해 변형됨)와 같은 다양한 적합한 항체 포맷이 해당 분야에 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "유체역학 크기"는 수용액을 통한 분자의 확산에 기초한 분자(예를 들어, 단백질 분자, 리간드)의 명백한 크기를 지칭한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 운동은 단백질의 명백한 크기를 유도하도록 처리될 수 있고, 여기서 상기 크기는 단백질 입자의 "스톡스 반경(Stokes radius)" 또는 "유체역학 반경"에 의해 제공된다. 단백질의 "유체역학 크기"는 질량 및 형상(형태) 둘 모두에 좌우되어, 동일한 분자 질량을 갖는 2개의 단백질이 단백질의 종합적인 형태에 기초하여 상이한 유체역학 크기를 가질 수 있다.

본 명세서에서 언급되는 용어 "경쟁하다"는 동족체 표적 결합 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)에 대한 제1 표적(예를 들어, IL-13)의 결합이 동족체 표적에 대해 특이적인 제2 결합 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 존재하에서 억제되는 것을 의미한다. 예를 들어, 결합 도메인의 물리적 차단, 또는 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체구조적으로 결합 억제되어, 표적에 대한 친화성 또는 결합력이 감소될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인 간의 경쟁을 결정하기 위한 경쟁 ELISA 및 경쟁 비아코어(BiaCore) 실험을 수행하기 위한 방법의 상세사항은 제WO2006038027호를 참조하며, 이 상세사항은 본 발명에 사용하기 위한 명시적인 개시물을 제공하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

본 발명자들은 DOM10-53-474(서열 번호 1) 내의 위치 28(카바트 넘버링)의 돌연변이가 IL-13 결합에 훨씬 더 강력한 dAb 유도체를 제공하는 것을 알아냈다. 또한, 인간과 하나 이상의 비-인간 영장류 IL-13(예를 들어, 사이노몰구스(cyno) 및/또는 레수스(rhesus)) 간의 교차 반응성과 같은 추가의 이점이 생길 수 있다. 게다가, 원핵 세포에서의 우수한 발현도 또한 생길 수 있다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖는 것을 제외하고, DOM10-53-474(서열 번호 1)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 상기 단일 가변 도메인은 카바트 넘버링에 따른 위치 28에 발린을 가지며, 임의로, 상기 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

본 발명자들은 또한 본 명세서에서 용어 "dAb"(도메인 항체)를 언급한다. dAb는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"이다.

또한, 본 발명자들은 서열 모티브 XGX'X"(여기서, G는 카바트 넘버링에 따른 위치 54에 있으며, X는 H 또는 K이고; X'는 G 또는 K이며; X"는 K 또는 I임)를 갖는 DOM10-53-474 dAb 유도체가 IL-13 결합에 훨씬 더 강력한 것을 알아냈다. 또한, 인간과 하나 이상의 비-인간 영장류 IL-13(예를 들어, 사이노몰구스(cynomolgus) 및/또는 레수스) 간의 교차 반응성과 같은 추가의 이점이 생길 수 있다. 게다가, 원핵 세포에서의 발현 증가의 이점도 또한 생길 수 있다.

제2의 양태에서, 본 발명은 DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖는 점을 제외하고, DOM10-53-474와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, 상기 단일 가변 도메인은 서열 XGX'X"를 가지며, 여기서 G는 카바트 넘버링에 따른 위치 54에 있고,

X는 H 또는 K이며,

X'는 G 또는 K이고,

X"는 K 또는 I이며,

임의로, 상기 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

제2의 양태의 일 실시형태에서, 가변 도메인은 카바트 넘버링에 따른 위치 28에 발린을 갖는다.

제2의 양태의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은

KGGK;

XGKI; 또는

HGKI를 포함하며; 여기서, G(또는 KGGK에 대한 첫번째 G)는 카바트 넘버링에 따른 위치 54이다.

제2 양태의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인의 CDR2(카바트에 따름)는 서열 SIDW[Z]TYYADSVKG를 가지며, 여기서, [Z]는 상기 정의된 바와 같은 XGX'X", KGGK, XGKI 및 HGKI로부터 선택된다.

어느 하나의 양태에서, 가변 도메인은 임의로 위치 30, 53, 55 및 56(카바트 넘버링에 따른)의 하나 이상에서 아미노산 변화(DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비한)를 가질 수 있다. 가변 도메인은 임의로

a) 위치 30(카바트 넘버링에 따른)에 프롤린 및/또는

b) 위치 53(카바트 넘버링에 따른)에 라이신 및/또는

c) 위치 55(카바트 넘버링에 따른)에 글리신 또는 라이신 및/또는

d) 위치 56(카바트 넘버링에 따른)에 아이소류신 또는 라이신을 갖는다.

일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 위치 55에 라이신 및 위치 56에 아이소류신을 갖는다(카바트 넘버링에 따른).

일 양태에서, 본 발명은 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, CDR(예를 들어, 카바트에 의해 결정된 바와 같은)은 DOM10-53-474(서열 번호 1)의 CDR과 동일하며, 단일 가변 도메인은 카바트 넘버링에 따른 위치 28에 발린을 포함한다. 임의로, 단일 가변 도메인의 아미노산 서열은 DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖고, 하나 이상의 변화는 임의로 CDR, 예를 들어, 카바트 또는 초티아에 따른 CDR2 내에 있다. 임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

일 양태에서, 본 발명은 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서, CDR(예를 들어, 카바트에 의해 결정된)은 단일 가변 도메인이 상기 정의된 바와 같은 SIDW[Z]TYYADSVKG, XGX'X", KGGK; XGKI 또는 HGKI 모티브를 포함하는 것을 제외하고, DOM10-53-474(서열 번호 1)의 CDR과 동일하다. 임의로, 단일 가변 도메인은 카바트 넘버링에 따른 위치 28에 발린을 갖는다. 임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

본 발명의 일 양태는 DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); DOM10-53-568(서열 번호 8); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

본 발명의 일 양태는 인간 IL-13 및 하나 이상의 비-인간 영장류 IL-13에 특이적으로 결합하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 예를 들어, 가변 도메인은 인간 IL-13 및 사이노몰구스 원숭이 및/또는 레수스 IL-13 및/또는 비비(baboon) IL-13, 예를 들어, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13, 또는 인간 및 레수스 IL-13, 또는 인간 및 비비 IL-13, 또는 인간, 레수스 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13에 특이적으로 결합한다. 단일 가변 도메인은 임의로 본 발명의 임의의 선행의 양태에 따를 수 있다. 임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 약 5nM 이하, 임의로 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 또는 약 2 nM 이하 또는 약 1 nM 이하의 해리 상수(Kd)로, 인간 IL-13 및 상기 또는 각각의 비-인간 영장류 IL-13에 결합한다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 (i) 약 1 nM 이하, 임의로 약 500 pM 이하, 임의로 약 250 pM 이하, 임의로 약 150 pM 이하, 임의로 약 100 pM 이하, 임의로 약 1 nM 내지 약 10 pM, 약 1 nM 내지 약 50 pM 또는 약 1 nM 내지 약 70 pM, 임의로 약 500 pM 내지 약 10 pM, 약 500 pM 내지 약 50 pM 또는 약 500 pM 내지 약 70 pM, 임의로 250 pM 내지 약 10 pM, 약 250 pM 내지 약 50 pM 또는 약 250 pM 내지 약 70 pM, 임의로 약 150 pM 내지 약 10 pM, 약 150 pM 내지 약 50 pM 또는 약 150 pM 내지 약 70 pM, 또는 임의로 약 100 pM 내지 약 10 pM, 약 100 pM 내지 약 50 pM 또는 약 100 pM 내지 약 70 pM의 해리 상수(Kd)로 인간 IL-13에 결합하며; (ii) 5 nM 이하, 임의로 4, 3, 2 또는 1 nM 이하, 임의로 5 내지 1 nM의 해리 상수(Kd)로 비-인간(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비) IL-13에 결합한다. 일 실시형태에서, 추가로 또는 대안적으로, 단일 가변 도메인은 카바트 넘버링에 따른 위치 28에 발린을 포함한다. 일 실시형태에서, 추가로 또는 대안적으로, 단일 가변 도메인은 서열 XGX'X"를 포함하며, 여기서 G는 카바트 넘버링에 따른 위치 54에 있고,

X는 H 또는 K이며,

X'는 G 또는 K이고,

X"는 K 또는 I이다.

일 실시형태에서, 추가로 또는 대안적으로, 가변 도메인은

a) 위치 30(카바트 넘버링에 따른)에 프롤린 및/또는

b) 위치 53(카바트 넘버링에 따른)에 라이신 및/또는

일 실시형태에서, 추가로 또는 대안적으로 가변 도메인은 위치 55에 라이신을 가지며, 위치 56에 아이소류신을 갖는다(카바트 넘버링에 따른).

모든 양태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 이들이 하기의 이점의 하나 이상을 나타내기 때문에 유익하다:

(i) 인간 IL-13에 대한 우수한 역가(DOM10-53-474보다 더 나은 역가);

(ii) 사이노몰구스 원숭이 IL-13에 대한 우수한 역가(DOM10-53-474보다 더 나은 역가);

(iii) 레수스 IL-13에 대한 우수한 역가(DOM10-53-474보다 더 나은 역가);

(iv) 인간 및 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비) IL-13에 대한 우수한 역가(DOM10-53-474보다 더 나은 역가);

(v) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13에 대한 우수한 역가(DOM10-53-474보다 더 나은 역가);

(vi) 원핵 세포에서의 우수한 발현(임의로, DOM10-53-474보다 더 나은);

(vii) 인간 IL-13의 우수한 중화(DOM10-53-474보다 더 나은);

(viii) 사이노몰구스 원숭이 IL-13의 우수한 중화(DOM10-53-474보다 더 나은);

(ix) 레수스 IL-13의 우수한 중화(DOM10-53-474보다 더 나은);

(x) 인간 및 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비) IL-13의 우수한 중화(DOM10-53-474보다 더 나은);

(xi) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13의 우수한 중화(DOM10-53-474보다 더 나은);

(xii) 1종 초과의 영장류 IL-13 간의 교차-반응성(임의로, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 및/또는 레수스 IL-13, 예를 들어 인간 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13; 또는 인간 및 레수스 IL-13; 또는 인간 및 비비 IL-13); 및

(xiii) 프로테아제 안정성(임의로 트립신 안정성).

일 실시형태에서, 이점 (i) 내지 (v)는 예를 들어, 비아코어(Biacore™)에 의하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 더 나은 역가는 더 나은 해리 상수(Kd)로 나타난다.

일 실시형태에서, 이점 (vi)은 에스케리키아 콜라이(E coli)에서의 발현에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 에스케리키아 콜라이에서 잘 발현한다(3 ㎎/ℓ 이상, 예를 들어, 5, 10, 15, 20 ㎎/ℓ 이상).

일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces)에서 잘 발현한다.

일 실시형태에서, 이점 (vii) 내지 (xi)은 ELISA 또는 표준 HEK STAT 검정 의해 결정되는 중화로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 중화는 EC₅₀으로 나타난다.

일 실시형태에서, 이점 (xii)는 ELISA, 비아코어™ 또는 표준 HEK STAT 검정에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 교차-반응성은 해리 상수(Kd)로 나타난다.

일 실시형태에서, 이점 (xiii)은 다음과 같이 결정될 수 있다:

0.3mg/㎖의 단일 가변 도메인을 PBS 완충액에서 25:1의 dAb:트립신의 비로 트립신(예를 들어, 5000 units/㎎ 초과의 트립신 활성)과 혼합한다. 섭씨 30도에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이션 후에 남아있는 활성 dAb의 존재를 결정한다.

일 실시형태에서, 활성 dAb의 존재는 남아있는 dAb 활성 백분율로 결정되며, 이는 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, 비아코어™)에 의해 결정된다. 24시간 후의 20% 이상(예를 들어, 30%, 40% 또는 50% 이상)의 활성 백분율은 프로테아제-안정성 dAb를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 프로테아제-안정성 dAbd의 존재는 ELISA를 사용하여 결정되며, 여기서, 프로테아제-안정성 가변 도메인은 인큐베이션 후에 ELISA에서 0.404 이상의 OD₄₅₀ 판독치를 갖는다. 다른 실시형태에서, dAb가 인큐베이션 후에 단백질 A 또는 단백질 L에 특이적으로 결합한다면, 활성 dAb의 존재가 결정된다. 다른 실시형태에서, 활성 dAb의 존재는 겔 전기영동에 의해 결정되며, 프로테아제-안정성 가변 도메인은 인큐베이션 후에 겔 전기영동에서 실질적으로 단일의 밴드를 나타낸다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 이점 (iv) 및 (x)을 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 이점 (v) 및 (xi)을 갖는다. 임의로, 단일 가변 도메인은 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명은 임의의 용도, 임의의 이점, 본 명세서에 기재된 임의의 질병 또는 질환의 임의의 치료 및/또는 예방을 위해 본 발명에 따른 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 임의의 용도, 임의의 이점, 본 명세서에 기재된 임의의 질병 또는 질환의 임의의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명에 따른 단일 가변 도메인의 용도를 제공한다. 이들 기재는 본 명세서의 청구범위로의 도입을 위한 명백한 기반을 제공한다.

본 발명의 단일 가변 도메인(DOM10-53-546, DOM10-53-567, DOM10-53-568 및 DOM10-53-616)은 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, 비아코어™)에 의해 결정된 IL-13 결합에 대한 이들의 해리 상수(Kd)로 나타난 바와 같이, 인간 및 사이노몰구스(cyno) 원숭이 IL-13 둘 모두에 대하여 우수한 역가를 나타낸다. 본 발명의 단일 가변 도메인은 DOM10-53-474보다 훨씬 더 강력하다. DOM10-53-567 및 DOM10-53-568은 인간 및 사이노몰구스 IL-13 둘 모두에 대하여 최적의 역가를 갖는다.

본 발명의 단일 가변 도메인(DOM10-53-546, DOM10-53-567, DOM10-53-568 및 DOM10-53-616)은 1종 초과의 영장류 IL-13 간에 교차-반응성을 나타낸다. 일 양태에서, 본 발명은 1종 초과의 영장류 IL-13 간에, 임의로, 인간과 비-인간 영장류 IL-13 간에, 임의로, (i) 인간과 사이노몰구스 원숭이 IL-13 종, (ii) 인간과 레수스 IL-13 종, (iii) 인간, 사이노몰구스 원숭이과 레수스 IL-13 종 또는 (iv) 인간과 비비 IL-13 종 간에 교차-반응성인 단일 가변 도메인을 제공하기 위한 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 1종 초과의 영장류 IL-13 간에, 임의로, 인간과 비-인간 영장류 IL-13 간에, 임의로, (i) 인간과 사이노몰구스 원숭이 IL-13 종, (ii) 인간과 레수스 IL-13 종, (iii) 인간, 사이노몰구스 원숭이과 레수스 IL-13 종 또는 (iv) 인간과 비비 IL-13 종 간에 교차-반응성인 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공한다. 가변 도메인은 인간 및 비-인간 영장류 IL-13(예를 들어, 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13 종이 가변 도메인에 의해 결합된다)에 특이적으로 결합한다. 교차-반응성은 특히 유용한데, 이는 약물 개발이 전형적으로 약물을 인간에서 시험하기 전에 사이노몰구스 원숭이 및 레수스와 같은 비-인간 영장류에서 선도 약물(lead drug) 후보물질의 시험을 필요로 하기 때문이다. 인간 및 다른 영장류 IL-13 종에 결합할 수 있는 약물의 준비는 이들 시스템에서 결과를 시험하고, 동일한 약물을 사용하여 데이터의 대조 비교를 실행할 수 있게 한다. 이는 비-인간 IL-13에 대해 작용하는 약물과 인간 IL-13에 대해 작용하는 별개의 약물을 찾아내야 하는 복잡한 문제를 방지하며, 또한 동일하지 않은 약물을 사용한 인간 및 비-인간 영장류에서의 결과를 비교해야 함을 방지한다.

임의로, 하나 이상의 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 및/또는 레수스 및/또는 비비) IL-13에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 친화성 및 인간 IL-13에 대한 결합 친화성은 10, 50, 100, 500 또는 1000 이하의 계수까지 상이하다. 일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 및/또는 레수스 및/또는 비비) IL-13에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성을 제공하기 위한 본 발명에 따른 단일 가변 도메인을 제공하며, 인간 IL-13에 대한 결합 친화성은 10, 50, 100, 500 또는 1000 이하의 계수까지 상이하다. 본 발명의 일 양태는 IL-13 길항제의 제조를 위한 본 발명에 따른 단일 가변 도메인의 용도를 제공하며, 여기서, 하나 이상의 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 및/또는 레수스 및/또는 비비) IL-13에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성 및 인간 IL-13에 대한 결합 친화성은 10, 50, 100, 500 또는 1000 이하의 계수까지 상이하다.

본 발명의 단일 가변 도메인(DOM10-53-546, DOM10-53-567, DOM10-53-568 및 DOM10-53-616)은 1종 초과의 영장류 IL-13을 중화시킬 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 1종 초과의 영장류 IL-13을 중화시키기 위한, 임의로 (i) 인간 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13 종, (ii) 인간 및 레수스 IL-13 종, (iii) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13 종, 또는 (iv) 인간 및 비비 IL-13 종을 중화시키기 위한 본 발명에 따른 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 1종 초과의 영장류 IL-13을 중화시키기 위한, 임의로 (i) 인간 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13 종, (ii) 인간 및 레수스 IL-13 종, (iii) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13 종, 또는 (iv) 인간 및 비비 IL-13 종을 중화시키기 위한, IL-13 길항제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 단일 가변 도메인을 제공한다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, DOM10-53-546, DOM10-53-567, DOM10-53-568 및 DOM1O-53-616은 ELISA 또는 HEK STAT 검정에서 시험한 모든 형태의 IL-13(인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13)의 중화를 나타냈다. DOM10-53-546, DOM10-53-567 및 DOM10-53-568은 DOM10-53-474보다 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13에 대하여 훨씬 더 많은 중화 능력을 나타냈다. DOM10-53-616은 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13에 대하여 DOM10-53-474보다 훨신 더 강력한 중화제(neutralizer)였으며, 인간 IL-13에 대해서는 대략 유사하였다.

단일 가변 도메인(DOM10-53-567 및 DOM10-53-568)은 특히 프로테아제 안정성이다. 일 양태에서, 본 발명은 프로테아제 안정성 단일 가변 도메인 또는 IL-13 길항제를 제공하기 위하여, 본 발명의 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 프로테아제 안정성 IL-13 길항제를 제공하기 위한 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공한다. 프로테아제 안정성은 다음과 같이 결정된다:

0.3mg/㎖의 단일 가변 도메인을 PBS 완충액에서 25:1의 dAb:트립신의 비로 트립신(예를 들어, 5000 units/㎎ 초과의 트립신 활성)과 혼합한다. 섭씨 30도에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이션 후에 남아있는 활성 dAb의 백분율을 결정한다(예를 들어, 비아코어™를 사용하여). 24시간 후의 20% 이상(예를 들어, 30%, 40% 또는 50% 이상)의 활성 백분율은 프로테아제-안정성 dAb를 나타낸다.

제WO2008149143호를 참조하라. 이 출원의 전문은 본 명세서에서 프로테아제-내성 폴리펩티드 및 dAb; 이들의 선택 방법(사용될 수 있는 상이한 프로테아제 및 선택 조건의 개시물 포함); 이들의 용도; 이들을 포함하는 조성물, 리간드 및 제품; 및 이러한 폴리펩티드 및 dAb의 이점의 추가의 개시물을 제공하기 위하여, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 이들 개시물은 명백하게 포함되며, 본 발명과 함께 사용하기 위하여 본 명세서의 일부를 형성한다.

폴리펩티드 및 펩티드는 산업상 응용 및 의료적, 치료적 및 진단적 제제로서의 용도를 비롯한 다양한 응용에서 점점 더 중요한 제제가 되어 왔다. 그러나, 특정 생리학적 상태, 이를 테면 염증 상태(예를 들어, COPD) 및 암에서, 조직, 기관 또는 동물(예를 들어, 폐 내, 종양 내, 또는 종양 근처) 내에 존재하는 프로테아제의 양이 증가할 수 있다. 이러한 프로테아제의 증가는 내재성 단백질 및 질병을 치료하기 위해 투여되는 치료적 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 가속화된 분해 및 불활성화를 야기할 수 있다. 따라서, 생체 내에서 이용(예를 들어, 인간과 같은 포유동물에서 질병의 치료 진단 또는 예방에서의 이용)하기 위한 효능을 갖는 일부 제제는 오직 제한된 효능만을 갖는데, 이는 이들이 프로테아제에 의해 빠르게 분해되고 불활성화되기 때문이다.

프로테아제 내성 폴리펩티드는 몇가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 프로테아제 내성 폴리펩티드는 생체 내에서 프로테아제 감수성 제제보다 더 길게 활성인 채로 남아있고, 이에 따라, 생물학적 효과를 생성하기에 충분한 기간의 시간 동안 작용성인 채로 남아있다. 프로테아제 분해에 대해 내성이 있고, 또한 요망되는 생물학적 활성도 갖는 폴리펩티드를 선택하는 개선된 방법이 필요하다. 위장관(GI 관) 및/또는 폐를 비롯한 폐기관계의 체액 및 조직에서 관찰되는 프로테아제에 내성인 펩티드 및 폴리펩티드를 제공하는 것이 특히 유용할 것이다. GI 관 및 폐기관계 둘 모두는 포유동물, 예를 들어, 인간의 질병 및 불리한 질환에 대한 부위이며; 프로테아제 내성 펩티드 및 폴리펩티드 약물이 이러한 문맥에서 유익할 것이다.

본 발명의 단일 가변 도메인(DOM10-53-546 및 DOM10-53-616)은 원핵 세포에서 DOM10-53-474보다 훨씬 더 나은 발현 수준을 나타내었다. 일 양태에서, 본 발명은 원핵 세포에서 DOM10-53-474의 발현보다 더 나은 발현을 갖는 단일 가변 도메인을 제공하기 위한 본 발명의 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-546 및 DOM10-53-616)을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-546 및 DOM10-53-616)의 용도를 제공하며, 여기서, 단일 가변 도메인은 원핵 세포에서 DOM10-53-474의 발현보다 더 나은 발현을 갖는다.

본 발명의 임의의 선행 양태의 일 실시형태에서, 단일 가변 도메인은 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13에 특이적으로 결합한다. 특이적인 결합은 10 마이크로몰 이하, 임의로 1 마이크로몰 이하의 해리 상수 Kd로 나타난다. 항원-결합 단백질의 항원 또는 에피토프에 대한 특이적인 결합은 예를 들어, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적인 결합 검정, 예컨대 방사면역검정(RIA), ELISA와 같은 효소면역검정 및 샌드위치 경쟁 검정을 포함하는 적합한 검정 및 이들의 상이한 변형에 의해 결정될 수 있다.

결합 친화성은 임의로 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 비아코어(문헌[Karlsson et al., 1991])를 이용하여, 결정된다. 비아코어 시스템은 생체 분자의 상호작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 표면 플라즈몬 공명(문헌[SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1]; 문헌[Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268])을 이용하고, 300 nm 이하만큼 떨어진 표면의 굴절율 변화의 결과로서 유리 지지체 상에 있는 얇은 금 필름의 표면에서 빛의 공명 각의 변화를 검출할 수 있는 표면 플라즈몬 공명을 이용한다. 비아코어 분석은 편리하게 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 평형 해리 상수, 및 친화성 상수를 생성한다. 결합 친화성은 비아코어 표면 플라즈몬 공명 시스템(Biacore, Inc.)을 이용하여 결합 및 해리 속도 상수를 평가함에 의해 수득된다. 바이오센서 칩은 제조처(Biacore)의 지시에 따라 표적의 공유 커플링을 위해 활성화한다. 이후 표적을 희석하고 칩 상에 주입하여 고정된 물질의 반응 유닛의 신호를 수득한다. 공명 유닛(RU)의 신호가 고정된 물질의 질량에 비례하기 때문에, 이것은 매트릭스 상에서 고정된 표적 밀도의 범위를 나타낸다. 해리 데이터를 1-부위 모델에 핏팅하여 k_off +/- s.d.(측정치의 표준 편차)를 수득한다. 슈도(pseudo)-1차 속도 상수(Kd's)는 각 회합 곡선으로부터 산출하고 단백질 농도의 함수로서 플롯팅하여 k_on +/- s.e.(핏의 표준 오차)를 생성한다. 결합에 대한 평형 해리 상수 Kd's는 SPR 측정치로부터 k_off/k_on로서 산출한다.

본 발명의 임의의 선행 양태의 일 실시형태에서, 가변 도메인은 표준 HEK STAT 검정에서 약 0.1 내지 약 2.0 nM, 임의로 약 0.2 내지 약 2.0 nM, 약 0.3 내지 약 1.5 nM, 약 0.2 내지 약 1.0 nM 또는 약 0.3 내지 약 1.0 nM의 EC₅₀으로 인간 IL-13을 중화시킨다. 일 양태에서, 본 발명은 표준 HEK STAT 검정에서 약 0.1 내지 약 2.0 nM, 임의로 약 0.2 내지 약 2.0 nM, 약 0.3 내지 약 1.5 nM, 약 0.2 내지 약 1.0 nM 또는 약 0.3 내지 약 1.0 nM의 EC₅₀으로 인간 IL-13을 중화시키기 위한 본 발명의 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공하며, 여기서, 가변 도메인 또는 길항제는 표준 HEK STAT 검정에서 약 0.1 내지 약 2.0 nM, 임의로 약 0.2 내지 약 2.0 nM, 약 0.3 내지 약 1.5 nM, 약 0.2 내지 약 1.0 nM 또는 약 0.3 내지 약 1.0 nM의 EC₅₀으로 인간 IL-13을 중화시킨다.

본 발명의 임의의 선행 양태의 일 실시형태에서, 가변 도메인은 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 1 내지 약 15 nM, 약 2 내지 약 15 nM 또는 약 2 내지 약 11.5 nM의 EC₅₀으로 레수스 IL-13을 중화시킨다. 일 양태에서, 본 발명은 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 1 내지 약 15 nM, 약 2 내지 약 15 nM 또는 약 2 내지 약 11.5 nM의 EC₅₀으로 레수스 IL-13을 중화시키기 위한 본 발명의 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공하며, 여기서, 가변 도메인 또는 길항제는 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 1 내지 약 15 nM, 약 2 내지 약 15 nM 또는 약 2 내지 약 11.5 nM의 EC₅₀으로 레수스 IL-13을 중화시킨다.

본 발명의 임의의 선행 양태의 일 실시형태에서, 가변 도메인은 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 5 내지 15 nM 또는 약 5 내지 약 10 nM의 EC₅₀으로 사이노몰구스 원숭이 IL-13을 중화시킨다. 일 양태에서, 본 발명은 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 5 내지 15 nM 또는 약 5 내지 약 10 nM의 EC₅₀으로 사이노몰구스 원숭이 IL-13을 중화시키기 위한 본 발명의 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공하며, 여기서, 가변 도메인 또는 길항제는 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 5 내지 15 nM 또는 약 5 내지 약 10 nM의 EC₅₀으로 사이노몰구스 원숭이 IL-13을 중화시킨다.

표준 HEK STAT 검정의 일 예는 다음과 같다:

(i) 항-IL-13 dAb(또는 항-IL-13 dAb를 포함하는 길항제)를 37 ℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 6ng/㎖의 IL-13과 함께 인큐베이션하고;

(ii) 상기 인큐베이션 혼합물을 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에서 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 중에 웰당 5 x 10⁴개의 HEKBlue™-STAT6 세포(STAT6 유전자 및 분비형 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 리포터 유전자로 트랜스펙션된 HEK293 세포)에 첨가하고;

(iii) 상기 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션하고;

(iv) 상기 리포터 유전자 생성물을 검출하고 정량화한다.

단계 i)에서, 임의로 사전-인큐베이션을 동 부피의 dAb 및 재조합 IL-13을 사용하여 수행한다. 임의로, dAb는 400nM의 최고 농도(검정에서 2X 최종 농도)로부터 1/2 로그 희석을 사용하여 적정하여, 8-점 용량-반응 곡선을 만든 다음, IL-13과 함께 인큐베이션한다. 단계 (iv)에서, 임의로 배양 상층액을 퀀티블루(QuantiBlue, Invivogen)와 혼합하고, 640nm에서 흡광도를 판독한다.

항-IL-13 dAb 활성은 IL-13 자극에 비해 STAT6 활성화의 감소 및 상응하는 A₆₄₀의 감소를 야기한다. EC_5O 값은 숙련자에게 알려져 있는 기법을 사용하여 계산할 수 있다.

"HEK 293 세포"는 293으로 명명된 인간 배아 신장 세포주(ATCC 번호 CRL-1573) 또는 이의 유도체를 지칭한다. 예를 들어, 293/SF 세포(ATCC 번호 CRL-1573.1)는 무혈청 배지에서 성장하도록 적응시킨 HEK 293 세포이다. 또한, 다른 배양 조건에서 성장하도록 적응시킨 HEK 293 세포, 또는 임의의 종류의 HEK 293 세포 또는 유도체도 또한 본 발명에 고려된다. HEK-Blue™ STAT6 세포는 4개의 STAT6 결합 부위에 융합된 IFNβ 최소 프로모터(minimal promoter)의 제어 하에 리포터 유전자 분비형 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP)를 안정적으로 발현한다. 또한, HEK 293 세포의 조작(engineering), 및 STAT6 유전자 및 분비형 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 리포터 유전자가 트랜스펙션된 HEK 293 세포를 조작하기 위해 적응시킬 수 있는 적합한 작제물의 상세사항에 대해서는 문헌[Loignon et al, "Stable high volumetric production of glycosylated Human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells", BMC Biotechnology 2008, 8:65]을 참조하라.

일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 인터루킨-13(IL-13) 길항제를 제공한다. 임의로, 길항제는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 길항제는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 길항제는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

일 실시형태에서, 길항제는 IL-13에 결합하기 위해 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)과 경쟁한다. 임의로, 길항제는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 길항제는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 길항제는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다. 일 실시형태에서, IL-13은 인간 IL-13이다. 다른 실시형태에서, IL-13은 사이노몰구스 원숭이 IL-13이다. 다른 실시형태에서, IL-13은 레수스 IL-13이다. 일 실시형태에서, 길항제는 인간 IL-13 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13에 결합하기 위해 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)과 경쟁한다.

다른 실시형태에서, 길항제는 인간 IL-13, 사이노몰구스 원숭이 IL-13 및 레수스 IL-13에 결합하기 위해 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)과 경쟁한다. 임의로, 길항제는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 길항제는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 길항제는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

일 양태에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 본 발명에 따른 임의의 항-IL-13 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616) 또는 길항제, 조성물 또는 융합 단백질을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 폐로의 전달을 위한 항-IL-13 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 폐 전달용 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 임의의 항-IL-13 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616) 또는 길항제, 조성물 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 폐로의 전달을 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 임의의 항-IL-13 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616) 또는 길항제, 조성물 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 그 자체로 또는 길항제 또는 융합 단백질의 일부의 경우 류코자임(leucozyme) 및/또는 트립신에 대하여 내성이다.

본 발명은 다른 폐질병, 예를 들어, 만성 폐쇄폐병(COPD) 또는 폐렴을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 치료되거나, 억제되거나 또는 예방될 수 있는 다른 폐질병에는 예를 들어, 낭성 섬유증 및 천식(예를 들어, 스테로이드 내성 천식)이 포함된다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 길항제 또는 조성물의 치료적 유효 용량 또는 유효량을 폐질병의 치료, 억제 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 폐질병을 치료하거나 억제하거나 또는 예방하는 방법이다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 길항제 또는 조성물을 전신 전달(예를 들어, 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하)에 의해 또는 폐 전달을 통해, 예를 들어 흡입(예를 들어, 기관지내, 비강내 또는 경구 흡입), 또는 비강내 점적액(drop)에 의해 투여한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 조성물, 또는 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 조성물, 또는 길항제를 이용한, 질병의 치료 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 질병은 암 또는 염증 질병, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 천식 또는 크론병이다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 조성물, 또는 길항제는 인간에서 IL-13-매개 질환의 치료법 및/또는 예방을 위해 제공된다. 다른 양태에서, 인간에서 IL-13-매개 질환의 치료법 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제의 용도가 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 조성물, 또는 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 인간 환자에서의 IL-13-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, IL-13-매개 질환은 호흡기 질환이다. 일 실시형태에서, IL-13-매개 질환은 폐 염증, 만성 폐쇄폐병, 천식, 폐렴, 과민성 폐간질염, 호산구증가증을 갖는 폐 침윤물, 환경성 폐질병, 폐렴, 기관지 확장증, 낭성 섬유증, 간질성 폐질병, 원발성 폐고혈압, 폐혈전색전증, 늑막 장애, 종격 장애, 횡경막 장애, 호흡저하, 과다호흡, 수면 무호흡, 급성 호흡곤란 증후군, 중피종, 육종, 이식거부, 이식편대숙주병, 폐암, 알러지성 비염, 알러지, 석면증, 아스페르길루스종, 아스페르길루스증, 기관지확장증, 만성 기관지염, 폐기종, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 침습성 폐렴구균 질병, 인플루엔자, 비결핵성 미코박테리아, 흉막삼출, 진폐증, 뉴모시스티스병, 폐렴, 폐방선균증, 폐포단백증, 폐탄저병, 폐부종, 폐색전, 폐염증, 폐 조직구증 X, 폐고혈압, 폐 노카르디아증, 폐결핵, 폐정맥폐쇄병, 류머티스성 폐질병, 사르코이드증 및 베게너 육아종증을 포함한다.

본 발명의 일 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 조성물, 또는 길항제를 함유하는 폐 전달 장치를 제공한다. 장치는 흡입기 또는 비강내 투여 장치일 수 있다.

본 발명의 리간드(예를 들어, 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제)는 IL-13의 IL-13Rα1 및/또는 IL-13Rα2로의 결합을 억제할 수 있고, IL-13의 활성을 억제할 수 있고/거나 IL-13의 IL-13Rα1 및/또는 IL-13Rα2로의 결합을 실질적으로 억제하지 않고, IL-13의 활성을 억제할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13의 IL-13Rα1 및/또는 IL-13Rα2로의 결합을 억제하고, IL-13의 활성을 억제하고/거나 IL-13의 IL-13Rα1 및/또는 IL-13Rα2로의 결합을 실질적으로 억제하지 않고, IL-13의 활성을 억제하기 위한 본 발명에 따른 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616)을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13의 IL-13Rα1 및/또는 IL-13Rα2로의 결합을 억제하고, IL-13의 활성을 억제하고/거나 IL-13의 IL-13Rα1 및/또는 IL-13Rα2로의 결합을 실질적으로 억제하지 않고, IL-13의 활성을 억제하기 위한 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명에 따른 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616)의 용도를 제공한다.

일 실시형태에서, IL-13에 결합하는 리간드(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)는 약 10 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 500 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 100 pM 이하, 또는 약 10 pM 이하의 억제 농도 50(IC50)으로 IL-13의 IL-13 수용체(예를 들어, IL-13Rα1, IL-13Rα2)로의 결합을 억제한다. IC50은 임의로 시험관 내 수용체 결합 검정, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 결정된다.

또한, 리간드(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)가 임의로 적합한 시험관 내 검정에서 약 10 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 500 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 1 pM 이하, 약 500 fM 이하, 약 300 fM 이하, 약 100 fM 이하, 약 10 fM 이하의 중화 용량 50(ND50)으로 IL-13 유도성 기능을 억제하는 것이 고려된다. 예를 들어, 리간드는 시험관 내 검정, 예를 들어 TF-1 세포를 5 ng/㎖의 최종 농도의 IL-13과 혼합하는 본 명세서에 기재된 검정에서 TF-1 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-2003)의 IL-13 유도성 증식을 억제할 수 있다.

리간드가 임의로 시험관 내 검정, 예를 들어 1 x 10⁵개 B 세포를 10 또는 100nM의 항-IL-13 dAb와 인큐베이션하는 본 명세서에 기재된 검정에서 IL-13 유도성 B 세포 증식을 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상까지 억제하는 것이 고려된다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 단일 가변 도메인을 포함하는 이중-특이적 리간드가 제공된다. 더욱 특정한 실시형태에서, 리간드는 IL-4 및 IL-13에 대한 결합 특이성을 가지며, IL-4에 결합하기 위해 제WO2007085815호에 개시된 항-IL-4 dAb의 군으로부터 선택되는 항-IL-4 도메인 항체(dAb)와 경쟁하는 IL-4에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, 상기 dAb의 서열은 본 발명에 따른 이중-특이적 리간드로의 응용을 위해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

본 발명의 모든 양태에서, 상기 또는 각각의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 독립적으로 항체 중쇄 및 경쇄 단일 가변 도메인, 예를 들어, V_H, V_L 및 V_HH로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 이중-특이적 리간드는 IL-13에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(서로 동일한 2개의 도메인) 및 다른 표적, 예를 들어 IL-4에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 IgG-형 포맷일 수 있다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

일부 실시형태에서, 이중-특이적 리간드는 항체 Fc 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

일부 실시형태에서, 이중-특이적 리간드는 IgG 불변 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인) 중 임의의 것은 반감기 연장 부분, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 그의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 그의 트랜스페린-결합 부분, 또는 생체 내 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 부분이, 친화체, SpA 도메인, LDL 수용체 클래스 A 도메인, EGF 도메인 및 아비머로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생체 내 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 부분이다.

다른 실시형태에서, 반감기 연장 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분이다. 일 실시형태에서, 길항제는 폴리에틸렌 글리콜 부분(임의로, 여기서 상기 부분은 크기가 약 20 내지 약 50 kDa, 임의로 약 40 kDa 선형 또는 분지형 PEG임)에 연결된 본 발명의 단일 가변 도메인을 포함한다(임의로, 이로 이루어진다). dAb의 페길화(PEGylation) 및 결합 부분에 대한 더욱 상세사항에 대해서는 제WO04081026호를 참조하라. 일 실시형태에서, 길항제는 PEG에 연결된 dAb 단량체로 이루어지며, 여기서, dAb 단량체는 본 발명에 따른 단일 가변 도메인, 임의로 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)이다. 이 길항제는 염증 질병, 폐 질환(예를 들어, 천식, 인플루엔자 또는 COPD) 또는 암의 치료를 위해 제공될 수 있으며, 임의로 이는 정맥내 투여용이다.

다른 실시형태에서, 반감기 연장 부분은 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)이다.

또한, 본 발명은 치료법 또는 진단에 사용하기 위한 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인), 및 본 명세서에 기재된 질병(예를 들어, 알러지성 질병, Th2-매개 질병, 천식, 암)의 치료, 예방 또는 억제용 약제의 제조를 위한 본 발명의 리간드의 용도에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

또한, 본 발명은 Th2-형 면역 반응을 치료하거나, 억제하거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인)에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인)의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 리간드의 치료적 유효량을 Th2-형 면역 반응의 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, Th2-형 면역 반응의 억제 방법에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인)의 치료적 유효량을 천식의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 천식의 치료 방법에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인)의 치료적 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인) 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내, 근육내, 복강내, 동맥내, 척추강내, 관절내, 피하 투여, 폐, 비강내, 질, 또는 직장 투여용 비히클을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함하는 약물 전달 장치에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 약물 전달 장치는 다수의 치료적 유효 용량의 리간드를 포함한다.

다른 실시형태에서, 약물 전달 장치는 비경구 전달 장치, 정맥내 전달 장치, 근육내 전달 장치, 복강내 전달 장치, 경피 전달 장치, 폐 전달 장치, 동맥내 전달 장치, 척수강내 전달 장치, 관절내 전달 장치, 피하 전달 장치, 비강내 전달 장치, 질 전달 장치, 직장 전달 장치, 주사기, 경피 전달 장치, 캡슐, 정제, 뉴블라이저(nebulizer), 흡입기, 분무기(atomizer), 에어로졸화 장치, 미스터(mister), 건조 분말 흡입기, 계량 투여 흡입기, 계량 투여 스프레이, 계량 투여 미스터, 계량 투여 분무기, 카테터(catheter)로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 리간드는 몇가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 리간드는 요망되는 생체 내 혈청 반감기를 갖도록 맞춰질 수 있다(tailored). 도메인 항체는 통상의 항체보다 훨씬 더 작으며, 통상의 항체보다 더 나은 조직 침투력을 달성하기 위하여 투여될 수 있다. 따라서, dAb 및 dAb를 포함하는 리간드는 Th2-매개 질병, 천식, 알러지성 질병, 암(예를 들어, 신세포암)과 같은 질병을 치료하기 위하여 투여되는 경우, 통상적인 항체에 비해 이점을 제공한다. 예를 들어, 천식(예를 들어, 알러지성 천식)은 IgE-매개이거나 또는 IgE-매개가 아닐 수 있으며, IL-4, IL-13 또는 IL-4 및 IL-13에 대한 결합 특이성을 갖는 리간드가 IgE-매개 천식 및 IgE-매개가 아닌 천식 둘 모두를 치료하기 위하여 투여될 수 있다.

유사하게, IL-4 및 IL-13의 생물학적 활성에서의 중복 및 유사성 때문에, IL-4 및 IL-13에 대한 결합 특이성을 갖는 리간드를 사용한 치료법을 환자(예를 들어, 알러지성 질병(예컨대, 알러지성 천식) 환자)에게 실행하여, 단일의 치료제를 사용하여 뛰어난 치료법을 제공할 수 있다.

본 발명의 리간드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 포맷화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리간드는 생체내 혈청 반감기를 맞추도록 포맷화될 수 있다. 필요에 따라, 리간드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 독소 또는 독소 부분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는 자유 라디칼 생성체(예를 들어, 셀레늄 함유 독소) 또는 방사성핵종(radionuclide)과 같은 표면 활성 독소를 포함한다. 다른 실시형태에서, 독소 또는 독소 부분은 세포내 표적에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인(예를 들어, dAb)이다. 특정 실시형태에서, 리간드는 IL-13(예를 들어, 인간 IL-13)에 대한 결합 특이성을 갖는 IgG-형 포맷이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제 또는 단일 가변 도메인) 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 알레르겐(allergen)-감작화된(sensitized) 대상체에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 알레르겐은 집먼지진드기, 고양이 알레르겐, 풀 알레르겐, 몰드(mold) 알레르겐 및 꽃가루 알레르겐으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 리간드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 B 세포의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 리간드를 활성 성분으로 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병(예를 들어, Th2-매개 질병, 알러지성 질병, 천식, 암)을 치료하거나 예방하거나 또는 억제하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단일 가변 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 가변 도메인은 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단백질에 융합될 수 있다. 일 실시형태에서, 가변 도메인은 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 모노클로날 항체에 융합된다. 일반적으로, 융합은 단일 핵산 서열로부터 융합 생성물을 발현하거나, 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현한 다음, 이 폴리펩티드를 통상적인 기법을 사용하여 더 큰 단백질 또는 항체 포맷으로 어셈블링(assembling)함으로써, 달성될 수 있다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)으로 이루어지지 않는다. 임의로, 리간드는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않는다. 임의로, 리간드는 모노클로날 항체(mAb)에 연결된 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하지 않으며, 임의로, 여기서 mAb는 항-IL-4 mAb 또는 항-IL-5 mAb이다.

일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질은 항체 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질은 항체 Fc를 포함하며, 임의로, 여기서 Fc의 N-말단은 가변 도메인의 C-말단에 연결된다(임의로 직접 연결). 일 실시형태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질은 반감기 연장 부분을 포함한다. 반감기 연장 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린-결합 부분, 또는 생체 내에서 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 반감기 연장 부분은 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 반감기 연장 부분은 dAb, 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일 실시형태에서, 가변 도메인(또는 길항제 또는 융합 단백질이 포함하는 가변 도메인)이 폴리알킬렌 글리콜 부분을 추가로 포함하도록 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질이 제공된다. 폴리알킬렌 글리콜 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분일 수 있다. 추가의 검토가 하기에 제공된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 10 내지 약 150 pM, 임의로 약 50 내지 약 150 pM, 임의로 약 70 내지 약 150 pM의 해리 상수(Kd)로, 인간 IL-13에 결합한다. 일 양태에서, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 10 내지 약 150 pM, 임의로 약 50 내지 약 150 pM, 임의로 약 70 내지 약 150 pM의 해리 상수(Kd)로, IL-13에 결합하기 위한 본 발명의 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공하며, 여기서, 가변 도메인 또는 길항제는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 10 내지 약 150 pM, 임의로 약 50 내지 약 150 pM, 임의로 약 70 내지 약 150 pM의 해리 상수(Kd)로 인간 IL-13에 결합한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 내지 약 5 nM의 해리 상수(Kd)로 사이노몰구스 원숭이 IL-13에 결합한다. 일 양태에서, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 내지 약 5 nM의 해리 상수(Kd)로 사이노몰구스 원숭이 IL-13에 결합하기 위한 본 발명의 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-13 길항제의 제조에서의 본 발명의 단일 가변 도메인의 용도를 제공하며, 여기서, 가변 도메인 또는 길항제는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 내지 약 5 nM의 해리 상수(Kd)로 사이노몰구스 원숭이 IL-13에 결합한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616)은 임의로, 흡입에 의한 환자로의 전달(예를 들어, 폐 전달)을 위한, 임의로 폐 질환(예를 들어, 천식, COPD 또는 인플루엔자)을 치료 및/또는 예방하기 위한 임의로 건식 분말 제제로서의, 임의로 포맷화되지 않거나(페길화되지 않거나 반감기 연장되지 않거나) PEG에 연결된 dAb 단량체로 제공된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 흡입에 의한 환자로의 전달(예를 들어, 폐 전달)을 위한, 임의로 폐 질환(예를 들어, 천식, COPD 또는 인플루엔자)의 치료 및/또는 예방을 위한 dAb 단량체(페길화되지 않거나 반감기 연장되지 않은)로 제공된다.

일 양태에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 제공하기 위한 본 발명의 임의의 양태 또는 실시형태의 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 단백질, 폴리펩티드, 길항제, 조성물 또는 장치를 제공한다(하기의 목적 중 둘 이상의 명백한 조합이 본 명세서에 개시되며, 청구범위의 대상일 수 있다):

(i) 인간 IL-13의 강력한 결합(예를 들어, 약 1 nM 이하, 임의로 약 500 pM 이하, 임의로 약 250 pM 이하, 임의로 약 150 pM 이하, 임의로 약 100 pM 이하, 임의로 약 1 nM 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 500 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 250 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 150 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 또는 임의로 약 100 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM의 해리 상수(Kd)로);

(ii) 비-인간 영장류 IL-13의 강력한 결합(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비 IL-13)(예를 들어, 약 5 nM 이하, 임의로 약 4, 약 3, 약 2 또는1 nM 이하, 임의로 약 1 내지 약 5 nM의 해리 상수(Kd)로);

(iii) 인간 IL-13의 강력한 결합(예를 들어, 약 1 nM 이하, 임의로 약 500 pM 이하, 임의로 약 250 pM 이하, 임의로 약 150 pM 이하, 임의로 약 100 pM 이하, 임의로 약 1 nM 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 500 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 250 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 150 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 또는 임의로 약 100 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM의 해리 상수(Kd)로) 및 비-인간 영장류 IL-13의 강력한 결합(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 레수스 또는 비비 IL-13)(예를 들어, 약 5 nM 이하, 임의로 약 4, 약 3, 약 2 또는 약 1 nM 이하, 임의로 약 1 내지 약 5 nM의 해리 상수(Kd)로);

(iv) 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13의 강력한 결합(예를 들어, 약 1 nM 이하, 임의로 약 500 pM 이하, 임의로 약 250 pM 이하, 임의로 약 150 pM 이하, 임의로 약 100 pM 이하, 임의로 약 1 nM 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 500 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 250 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 임의로 약 150 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM, 또는 임의로 약 100 내지 약 10, 약 50 또는 약 70 pM의 해리 상수(Kd)로 인간 IL-13에 결합; 및 약 5 nM 이하, 임의로 약 4, 약 3, 약 2 또는 약 1 nM 이하, 임의로 약 1 내지 약 5 nM의 해리 상수(Kd)로 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 IL-13 각각에 결합);

(v) 원핵 세포에서의 우수한 발현(예를 들어, 약 3㎎/ℓ 이상의 원핵 세포(예컨대, 에스케리키아 콜라이)에서의 발현);

(vi) 환자에서의 인간 IL-13의 강력한 중화, 예를 들어, 표준 HEK STAT 검정에서 약 0.1 내지 약 2.0 nM, 임의로 약 0.2 내지 약 2.0 nM, 약 0.3 내지 약 1.5 nM, 약 0.2 내지 약 1.0 nM 또는 약 0.3 내지 약 1.0 nM의 EC₅₀으로 인간 IL-13을 중화시키는 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;

(vii) 환자에서의 인간 IL-13의 강력한 중화, 예를 들어, 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 5 내지 약 15 nM 또는 약 5 내지 약 10 nM의 EC₅₀으로 사이노몰구스 원숭이 IL-13을 중화시키는 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;

(viii) 환자에서의 인간 IL-13의 강력한 중화, 예를 들어, 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 15 nM, 약 2 내지 약 15 nM 또는 약 2 내지 약 11.5 nM의 EC₅₀으로 레수스 IL-13을 중화시키는 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;

(ix) 인간 및 비-인간 영장류 IL-13의 강력한 중화, 예를 들어, 표준 HEK STAT 검정에서 약 0.1 내지 약 2.0 nM, 임의로 약 0.2 내지 약 2.0 nM, 약 0.3 내지 약 1.5 nM, 약 0.2 내지 약 1.0 nM 또는 약 0.3 내지 약 1.0 nM의 EC₅₀으로 인간 IL-13을 중화시키고; 표준 HEK STAT 검정에서 약 1 내지 약 20 nM, 임의로 약 5 내지 약 15 nM 또는 약 5 내지 약 10 nM의 EC₅₀으로 비-인간 영장류 IL-13을 중화시키는 단일 가변 도메인, 단백질, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물을 이용한 중화;

(x) 1종 초과의 영장류 IL-13(인간 및 사이노몰구스 원숭이 및/또는 레수스 IL-13, 예를 들어, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 IL-13, 또는 인간 및 레수스 IL-13, 또는 인간 및 비비 IL-13) 간의 교차-반응성 제공; 및

(xi) 프로테아제 안정성(임의로, 트립신 안정성) 제공.

일 양태에서, 본 발명은 직전 단락에서 (i) 내지 (xi) 중 하나 이상을 제공하기 위한 본 발명의 임의의 양태 또는 실시형태의 단일 가변 도메인(예를 들어, DOM10-53-616), 단백질, 폴리펩티드, 길항제, 조성물 또는 장치의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상응하는 방법을 제공한다.

제WO2007085815호를 참조하며, 이는 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인을 개시한다. 이 참고문헌의 개시물은 특히 본 명세서의 청구범위로의 도입을 위한 명시적인 설명을 제공하는 것을 비롯하여, 항-IL-13 단일 가변 도메인, 리간드, 길항제 등에 대한 용도, 포맷, 선택 방법, 생성 방법, 제제화 방법 및 검정을 제공하여, 이들 개시물이 본 발명의 문맥에 특별히 그리고 명시적으로 적용될 수 있도록 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.

항-IL-13은 면역글로불린 단일 가변 도메인이며, 임의의 적합한 면역글로불린 가변 도메인일 수 있고, 임의로 인간 가변 도메인이거나 인간 프레임워크 영역(예를 들어, DP47 또는 DPK9 프레임워크 영역)을 포함하거나 이로부터 유래되는 가변 도메인이다. 특정 실시형태에서, 가변 도메인은 본 명세서에 기재된 유니버셜 프레임워크를 기반으로 한다.

특정 실시형태에서, IL-13에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)은 내응집성이며, 가역적으로 언폴드(unfold)된다(그 교시가 본 명세서에 참고문헌로 포함되는 제WO04101790호를 참조하라).

핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명에 기재된 바와 같은 리간드(단일 가변 도메인, 융합 단백질, 폴리펩티드, 이중특이적 리간드 및 다중특이적 리간드)를 엔코딩하는 분리된 핵산 분자 및/또는 재조합 핵산 분자를 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); DOM10-53-568(서열 번호 8); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7) 또는 DOM10-53-568(서열 번호 8)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 핵산은 DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); DOM10-53-568(서열 번호 8); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 핵산은 IL-13에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 임의로, 핵산은 뉴클레오티드 서열 DOM10-53-616(서열 번호 9)으로 이루어지지 않거나, 이를 포함하지 않는다.

일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포를 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 유지시킴으로써, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 생성되는 단계를 포함하여, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성시키는 방법이 제공된다. 임의로, 이 방법은 폴리펩티드를 분리하고, 임의로 분리된 폴리펩티드보다 표준 HEK STAT 검정에서 개선된 친화성(Kd); IL-13 중화에 대한 EC₅₀을 갖는 변이체, 예를 들어 돌연변이된 변이체를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명에서 "분리된" 핵산은 그들의 기원(예를 들어, 세포 또는 라이브러리와 같은 핵산 혼합물의 존재)의 세포 RNA 또는 게노믹(genomic) DNA의 핵산으부터 분리된 핵산이며, 이는 본 발명에 기술된 방법으로 수득된 핵산 또는 본질적으로 순수한 핵산, 화학적 합성을 포함하는 기타 적절한 방법으로 수득된 핵산, 생물학 및 화학적 방법의 조합으로 수득된 핵산, 및 분리된 재조합 핵산을 포함한다(예를 들어, 문헌[Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991)]; 문헌[Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)]을 참조하라).

본 명세서에서 “재조합” 핵산은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 핵산을 말하며, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한효소를 이용한 벡터로의 클로닝과 같은 인공 재조합 방법에 의존하는 절차에 의하여 생성되는 핵산을 포함한다.

특정 실시형태에서, 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은 본 명세서에서 기재된 리간드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 상기 리간드는 본 명세서에 개시된 IL-13에 결합하는 dAb의 아미노산 서열, 예를 들어 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 동일성은 선택된 항-IL-13 dAb를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시형태에서, 벡터는 본 발명의 재조합 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 엘리먼트(element) 또는 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 적합한 벡터(예를 들어, 플라스미드, 파지미드), 발현 제어 엘리먼트, 숙주 세포 및 본 발명의 재조합 숙주 세포를 생성시키는 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있고, 실시예가 본 명세서에 추가로 설명되어 있다.

적합한 발현 벡터는 다수의 성분, 예를 들어 복제 오리진(origin), 선택가능한 마커 유전자, 하나 이상의 발현 제어 엘리먼트, 예를 들어 전사 제어 엘리먼트(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 터미네이터) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 제어 엘리먼트 및 신호 서열은 존재하는 경우 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 제어 서열이 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다.

프로모터는 요망되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성성(constitutive) 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 핵산의 전사를 유도하도록 항체, 항체 사슬 또는 이의 부분을 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 원핵(예를 들어, 에스케리키아 콜라이의 경우 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵(예를 들어, 시미안(simian) 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터) 숙주에 대한 다양한 적합한 프로모터가 이용가능하다.

또한, 발현 벡터는 전형적으로 벡터를 수반하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하며, 복제가능한 발현 벡터의 경우, 복제 오리진을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전자는 공통의 선택가능한 마커이며, 원핵 세포(예를 들어, 락타마아제 유전자(암피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(마이코페놀산), 암피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에 사용될 수 있다. 다이하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트로의 선택을 가능하게 한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)는 종종 효모의 선택가능한 마커로서 사용된다. 바이러스 (예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터 및 숙주 세포의 게놈으로 통합할 수 있는 벡터 예컨대, 레트로바이러스 벡터의 이용이 또한 고려된다. 포유동물 세포 및 원핵 세포(에스케리키아 콜라이), 곤충 세포(드로소필라 슈나이더(Drosphila Schnieder) S2 세포, Sf9) 및 효모(피키아 메타놀리카(P. methanolica), 피키아 파스토리스(P. pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae))에서 발현하기에 적합한 발현 벡터는 해당 분야에 널리 공지되어 있다.

적합한 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및/또는 다른 적합한 박테리아와 같은 박테리아 세포를 포함하는 원핵 세포; 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼길루스 종(Aspergillus sp.), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))와 같은 진핵 세포, 또는 다른 하등 진핵 세포, 및 고등 진핵생물의 세포, 예를 들어 곤충(예를 들어, 드로소필라 슈나이더 S2 세포, Sf9 곤충 세포(제WO94/26087호(O'Connor)), 포유동물(예를 들어, COS-1(ATCC 수탁 번호 CRL-1650) 및 COS-7(ATCC 수탁 번호 CRL-1651)와 같은 COS 세포, CHO(예를 들어, ATCC 수탁 번호 CRL-9096, CHO DG44(문헌[Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. ScL USA, 77(7):4216-4220 (1980)])), 293(ATCC 수탁 번호 CRL-1573), HeLa(ATCC 수탁 번호 CCL-2), CV1(ATCC 수탁 번호 CCL-70), WOP(문헌[Dailey, L., et al, J. Virol, 54:739-749 (1985)]), 3T3, 293T(문헌[Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)]) NS0 세포, SP2/0, HuT 78 세포 등), 또는 식물(예를 들어 담배)로부터의 세포일 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)] 참조). 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 분리된 숙주 세포이며, 다세포 생물(예를 들어, 식물 또는 동물)의 일부가 아니다. 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 비인간(non-human) 숙주 세포이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건 하에서 유지시킴으로써 재조합 핵산이 발현되어 리간드가 생성되는 단계를 포함하여 본 발명의 리간드(예를 들어, 이중 특이적 리간드, 다중특이적 리간드)를 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 리간드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 실시형태에 적용가능한 개시물의 상세사항을 위하여 제WO200708515호, 161 페이지, 24줄 내지 189 페이지 10줄을 참조하라. 이러한 개시물은 이것이 본 명세서의 본문에 명시적으로 나타나고, 본 발명의 실시형태에 관련된 것처럼 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 그리고 하기 청구범위로 도입되는 개시물에 대한 명시적인 지원을 제공하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 이는 "면역글로불린 기반의 리간드의 제조", "라이브러리 벡터 시스템", "라이브러리 작제", "단일 가변 도메인의 결합", "리간드의 특성화", "리간드의 구조", "골격", "단백질 스캐폴드", "리간드의 작제에 사용하기 위한 스캐폴드", "정규 서열(Canonical sequence)의 다변화" 및 "치료 및 진단 조성물 및 용도", 뿐만 아니라 "작동가능하게 연결된", "나이브(naive)", "예방", "억제", "치료", "알러지성 질병", "Th2-매개 질병", "치료적 유효 용량" 및 "유효한"의 정의에 대한 상세사항을 제공하는 제WO200708515호 161 페이지, 24줄부터 189 페이지 10줄에 나타난 개시물을 포함한다.

포맷

증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체 및 가장 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체 내 적용에 유용하다. 이러한 단편(Fvs, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터의 신속한 제거를 경험하므로, 이들은 신체의 대부분에 신속하게 도달하고 생성이 빠르며 다루기가 용이한 한편, 이들의 생체내 적용은 생체내에서의 이들의 짧은 지속성에 의해 제한되어 왔다. 본 발명의 일 실시형태는 생체 내에서 리간드의 반감기 증가 및 결과적으로 리간드 기능 활성의 신체에서의 보다 긴 지속 시간을 제공함으로써 이러한 문제를 해결한다.

리간드 반감기를 약물동력학적으로 분석하고 결정하는 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 상세사항은 문헌[Kenneth, A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 찾아볼 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 면적(AUC)과 같은 약물동력학적 파라미터를 기술하고 있는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2^nd Rev. ex edition (1982)]도 참조하라.

반감기 (t½ 알파 및 t½ 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 곡선을 모델링하기 위해 윈논린(WinNonlin) 분석 패키지(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA로부터 시판됨)를 이용할 수 있다. 제1 상(알파 상)에서, 리간드는 일부 제거와 함께 환자에서의 분포를 주로 진행한다. 제2 상(베타 상)은 리간드가 분포되고 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 혈청 농도가 감소하는 말단 상이다. t 알파 반감기는 제1 상의 반감이기고 t 베타 반감기는 제2 상의 반감기이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 tα 반감기가 15분 이상의 범위인 리간드 또는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12시간 이하 및 12시간을 포함하는 범위의 tα 반감기를 가질 것이다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간, 또는 3 내지 4시간이다.

일 실시형태에서, 본 발명은 tβ 반감기가 약 2.5 시간 이상의 범위인 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드(폴리펩티드, dAb 또는 길항제)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 약 21일 이하 및 약 21일을 포함하는 범위의 tβ 반감기를 지닌다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 10일, 약 15일 또는 약 20일이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물이 약 12 내지 약 60시간 범위의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 실시형태에서, 이것의 범위는 약 12 내지 약 48시간일 것이다. 여전히 추가의 실시형태에서, 이것의 범위는 약 12 내지 약 26시간일 것이다.

상기 기준에 추가하여 또는 대안적으로, 본 발명은 AUC 값(곡선하 면적)이 1 mg·분/㎖ 이상인 리간드 또는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 하한은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 100, 약 200 또는 약 300 mg·분/㎖이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 약 600 mg·분/㎖ 이하의 AUC를 갖는다. 일 실시형태에서, 상기 범위의 상한은 약 500, 약 400, 약 300, 약 200, 약 150, 약 100, 약 75 또는 약 50 mg·분/㎖이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 리간드가 약 15 내지 약 150 mg·분/㎖, 약 15 내지 약 100 mg·분/㎖, 약 15 내지 약 75 mg·분/㎖, 및 약 15 내지 약 50 mg·분/㎖로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 AUC를 가질 것이다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb 및 이들을 포함하는 길항제는 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착에 의해, 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해, 더 큰 유체역학 크기를 갖도록 포맷화될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 dAb 및 길항제는 항체의 더 큰 항원-결합 단편으로 또는 항체로 포맷화된다(예컨대, Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, IgG, scFv로 포맷화됨).

본 발명의 리간드(예를 들어, dAb 단량체 및 다량체)의 유체역학 크기는 해당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 리간드의 유체역학 크기를 결정하는 데에 이용될 수 있다. 리간드의 유체역학 크기를 결정하기 위한 적합한 겔 여과 매트릭스, 예를 들어, 교차 결합된 아가로스 매트릭스는 잘 알려져 있고, 바로 구할 수 있다.

리간드 포맷의 크기(예를 들어, dAb 단량체에 부착된 PEG 부분의 크기)는 원하는 적용에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어, 리간드가 순환계를 벗어나 말초 조직에 들어가기를 의도하는 경우, 혈류로부터의 유출을 촉진하기 위해 리간드의 유체역학 크기를 작게 하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 리간드가 전신 순환계에서 더 오랜 시간 동안 남아 있기를 원하는 경우, 예를 들어, Ig형 단백질로서 포맷화함으로써 리간드의 크기를 증가시킬 수 있다.

생체 내에서 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프의 표적화에 의한 반감기 연장

또한, 리간드의 유체역학 크기 및 이의 혈청 반감기는 본 발명의 IL-13 결합 폴리펩티드 dAb 또는 길항제를 본 명세서에서 기재된 바와 같은 생체 내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)으로 컨쥬게이트시키거나 또는 회합시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, IL-13 결합제(예를 들어, 폴리펩티드)는 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 친화체, 아비머, GroEl 및 피브로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는 스캐폴드를 포함하는 항혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 친화체 또는 항-신생아 Fc 수용체 친화체 또는 항-SA 아비머, 또는 항-SA 결합 도메인에 컨쥬게이트되거나 연결될 수 있다(이들 결합 도메인의 상세사항에 대해서는 WO2008096158호를 참조하길 바라며, 이 도메인 및 이들의 서열은 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다). 컨쥬게이팅은 혈청 알부민에 결합하는 결합 도메인에 결합된(공유적으로 또는 비공유적으로) 본 발명의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 포함하는 조성물을 지칭한다.

생체내 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 예를 들어, 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질(미국 특허 제5977307호 참조, 상기 문헌의 개시물은 본 발명에 참고문헌으로 포함됨), 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체(예를 들어, 용해성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린-유사 성장인자 1(IGF1) 수용체, 인슐린-유사 성장인자 2(IGF2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-안티트립신 및 HNF 1α를 포함한다. 또한, 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 알파-1 당단백질(오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 안티키모트립신(ACT), 알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC, AIM), 안티트롬빈 III(AT III), 아포리포프로테인 A-1(Apo A-1), 아포리포프로테인 B(Apo B), 세루로플라스민(Cp), 보체 성분 C3(C3), 보체 성분 C4(C4), C1 에스테라제 억제제(C1 INH), C-반응성 단백질(CRP), 페리틴(FER), 헤모펙신(HPX), 리포프로테인(a) (Lp(a)), 만노스-결합 단백질(MBP), 미오글로빈(Myo), 프레알부민(트랜스티레틴, PAL), 레티놀-결합 단백질(RBP) 및 류마토이드 인자(RF)도 포함한다.

세포외 매트릭스로부터의 적합한 단백질은 예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴을 포함한다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주된 단백질이다. 약 15종의 콜라겐 분자가 현재 알려져 있고, 신체의 다른 부분, 예를 들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부기관에서 제1형 콜라겐(신체 콜라겐의 90%를 차지함) 또는 연골, 척추 디스크, 척색 및 눈의 유리체 액에서 제2형 콜라겐이 발견된다.

혈액으로부터의 적합한 단백질은 예를 들어, 혈장 단백질(예를 들어, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐(예를 들어, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 햅토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-마크로글로불린), 효소 및 효소 억제제(예를 들어, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄(카파/람다))와 같은 면역계의 단백질, 수송 단백질(예를 들어, 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린), 디펜신(예를 들어, 베타-디펜신 1, 뉴로필 디펜신 1, 뉴로필 디펜신 2 및 뉴로필 디펜신 3) 등을 포함한다.

혈관-뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적합한 단백질은 예를 들어, 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코브산염 수송체 등을 포함한다.

생체내 혈청 반감기를 증가시키는 적합한 폴리펩티드는 또한 신장에 국소화된 단백질(예를 들어, 폴리시스틴, 제4형 콜라겐, 유기 음이온 수송체 K1, 헤이만스(Heymann's) 항원), 간에 국소화된 단백질(예를 들어, 알콜 탈수소효소, G250), 폐에 국소화된 단백질(예를 들어 IgA에 결합하는 분비 성분), 심장에 국소화된 단백질(예를 들어, 팽창성 심근증과 관련된 HSP27), 피부에 국소화된 단백질(예를 들어, 케라틴), 몰포제닉 프로테인(BMP)과 같은 뼈 특이적 단백질(상기 BMP는 골형성 활성을 보이는 변형성장인자 β 슈퍼패밀리 단백질의 서브셋(subset)이다(예를 들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)). 종양 특이적 단백질(예를 들어, 트로포블라스트 항원, 헤르셉틴 수용체, 오에스트로겐(oestrogen) 수용체, 카텝신(예를 들어, 간과 비장에서 발견할 수 있는 카텝신 B)를 포함한다.

적합한 질병-특이적 단백질은 예를 들어, LAG-3(림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드(OPGL; 문헌[Nature 402, 304-309 (1999)] 참조), OX40(TNF 수용체 패밀리의 구성원, 활성화된 T 세포에서 발현되고, 특이적으로 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 I(HTLV-1)-생성 세포에서 상향 조절됨; 문헌[Immunol. 165(1): 263-70 (2000)] 참조)을 포함하는 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원을 포함한다. 적합한 질병-특이적 단백질은 또한, 예를 들어, CG6512 드로소필라, 인간 파라프레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 쥐과 ftsH를 포함하는 메탈로프로테아제(관절염/암과 연관); 및 산성 섬유아세포 성장 인자(FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 전환 성장 인자-α(TFG-α), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판-유래 내피 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(P1GF), 미드킨 혈소판-유래 성장인자-BB(PDGF) 및 프랙탈킨을 포함하는 혈관신생 성장 인자를 포함한다.

또한, 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 적절한 폴리펩티드는 열충격 단백질(HSP)과 같은 스트레스 단백질을 포함한다. HSP는 세포 내에서 정상적으로 발견된다. 그들이 세포 외에서 발견되면, 세포가 죽어 그 내용물이 빠져나왔다는 것을 나타낸다. 이러한 프로그램화되지 않은 세포 죽음(괴사)은 외상, 질병 또는 손상의 결과로 세포외 HSP가 면역계로부터의 반응을 일으킬 때 발생한다. 세포외 HSP로의 결합은 본 발명의 조성물의 질병 부위로의 국소화를 야기할 수 있다.

Fc 수송에 수반되는 적합한 단백질은, 예를 들어 브람벨(Brambell) 수용체(FcRB라고도 알려짐)를 포함한다. 이러한 Fc 수용체는 2가지 기능이 있고, 이들 모두는 운반에 잠재적으로 유용하다. 이 기능은 (1) 태반을 통하여 엄마로부터 아이에게 IgG를 수송하는 것 (2) 분해로부터 IgG를 보호하여 혈청 반감기를 연장하는 것이다. 상기 수용체는 엔도솜으로부터 IgG를 재활용하는 것으로 여겨진다(문헌[Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)] 참조).

혈청 알부민에 결합하는 dAb

일 실시형태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 길항제(예를 들어, IL-13에 결합하는 항-IL-13 dAb(제1 dAb) 및 혈청 알부민(SA)에 결합하는 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드)를 제공하며, 상기 제2 dAb는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400 또는 약 500 μM(즉, x 10^-9 내지 5 x 10^-4M), 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 1 내지 약 5 μM 또는 약 3 내지 약 70 nM 또는 약 10 nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5 μM, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 30 내지 약 70 nM의 Kd로 SA에 결합한다. 일 실시형태에서, 제1 dAb(또는 dAb 단량체)는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 대략 약 1, 약 50, 약 70, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300 nM 또는 약 1, 약 2 또는 약 3 μM의 Kd로 SA(예를 들어, HSA)에 결합한다. 일 실시형태에서, 제1 항-SA dAb 및 IL-13에 대한 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드에 대하여, 제2 dAb의 그의 표적에 대한 친화성(예컨대, 표면 플라즈몬 공명으로 측정시의 Kd 및/또는 K_off, 예컨대 BiaCore 이용)은 제1 dAb의 SA에 대한 친화성의 약 1 내지 약 100000배(예를 들어, 약 100 내지 약 100000배, 또는 약 1000 내지 약 100000배, 또는 약 10000 내지 약 100000배)이다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 예를 들어, 제1 dAb는 대략 10 μM의 친화성으로 SA에 결합하나, 제2 dAb는 약 100 pM의 친화성으로 그 표적에 결합한다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일 실시형태에서, 제1 dAb는 대략적으로 약 50, 예를 들어 약 70, 약 100, 약 150 또는 약 200 nM의 Kd로 SA(예컨대, HSA)에 결합한다. 이중 특이적 리간드의 상세사항은 제WO03002609호, 제WO04003019호, 제WO2008096158호 및 제WO04058821호에서 관찰된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 리간드는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 1 nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400 또는 약 500 μM(즉, x 약 10^-9 내지 약 5 x 10^-4M), 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 1 내지 약 5 μM 또는 약 3 내지 약 70 nM 또는 약 10 nM 내지 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5 μM, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 약 30 내지 약 70 nM의 Kd로 혈청 알부민(SA)에 결합하는 dAb를 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 dAb(또는 dAb 단량체)는 표면 플라즈몬 공명으로 결정시 대략적으로 약 1, 약 50, 약 70, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300 nM 또는 약 1, 약 2 또는 약 3 μM의 Kd로, SA(예를 들어, HSA)에 결합한다. 일 실시형태에서, 제1 및 제2 dAb는 링커, 예를 들어, 1 내지 4개 아미노산 또는 1 내지 3개 아미노산, 또는 3개 초과의 아미노산, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 초과의 아미노산에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, 더 긴 링커(3개 초과의 아미노산)가 역가(길항제에서 1개 또는 2개 모두의 dAb의 Kd)을 증가시키기 위하여 사용된다.

리간드 및 길항제의 특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며, 알부민에 결합하기 위하여,

MSA-16, MSA-26(이들 서열의 공개에 대해서는 제WO04003019호를 참조하길 바라며, 이들 서열 및 이들의 핵산 대응물은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다),

DOM7m-16(서열 번호 473), DOM7m-12(서열 번호 474), D0M7m-26(서열 번호 475), DOM7r-1(서열 번호 476), DOM7r-3(서열 번호 477), DOM7r-4(서열 번호 478), DOM7r-5(서열 번호 479), DOM7r-7(서열 번호 480), DOM7r-8(서열 번호 481), DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-3(서열 번호 483), DOM7h-4(서열 번호 484), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494), DOM7h-27(서열 번호 495), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7r-13(서열 번호 497), DOM7r-14(서열 번호 498), DOM7r-15(서열 번호 499), DOM7r-16(서열 번호 500), DOM7r-17(서열 번호 501), DOM7r-18(서열 번호 502), DOM7r-19(서열 번호 503), DOM7r-20(서열 번호 504), DOM7r-21(서열 번호 505), DOM7r-22(서열 번호 506), DOM7r-23(서열 번호 507), DOM7r-24(서열 번호 508), DOM7r-25(서열 번호 509), DOM7r-26(서열 번호 510), DOM7r-27(서열 번호 511), DOM7r-28(서열 번호 512), DOM7r-29(서열 번호 513), DOM7r-30(서열 번호 514), DOM7r-31(서열 번호 515), DOM7r-32(서열 번호 516), DOM7r-33(서열 번호 517)(이들 서열의 공개에 대해서는 제WO2007080392호를 참조하길 바라며, 이들 서열 및 이들의 핵산 대응물은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다; 본 단락의 서열 번호는 제WO2007080392호에 나타난 것이다),

dAb8(dAb10), dAb10, dAb36, dAb7r20(DOM7r20), dAb7r21(DOM7r21), dAb7r22(DOM7r22), dAb7r23(DOM7r23), dAb7r24(DOM7r24), dAb7r25(DOM7r25), dAb7r26(DOM7r26), dAb7r27(DOM7r27), dAb7r28(DOM7r28), dAb7r29(DOM7r29), dAb7r29(DOM7r29), dAb7r31(DOM7r31), dAb7r32(DOM7r32), dAb7r33(DOM7r33), dAb7r33(DOM7r33), dAb7h22(DOM7h22), dAb7h23(DOM7h23), dAb7h24(DOM7h24), dAb7h25(DOM7h25), dAb7h26(DOM7h26), dAb7h27(DOM7h27), dAb7h30(DOM7h30), dAb7h31(DOM7h31), dAb2(dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb11, dAb12(dAb7m12), dAb13 (dAb15), dAb15, dAb16(dAb21, dAb7m16), dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25(dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30(dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38(dAb54), dAb41, dAb46(dAb 47, 52 및 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1(DOM7r1), dAb7r3(DOM7r3), dAb7r4(DOM7r4), dAb7r5(DOM7r5), dAb7r7(DOM7r7), dAb7r8(DOM7r8), dAb7r13(DOM7r13), dAb7r14(DOM7r14), dAb7r15(DOM7r15), dAb7r16(DOM7r16), dAb7r17(DOM7r17), dAb7r18(DOM7r18), dAb7r19(DOM7r19), dAb7h1(DOM7h1), dAb7h2(DOM7h2), dAb7h6(DOM7h6), dAb7h7(DOM7h7), dAb7h8(DOM7h8), dAb7h9(DOM7h9), dAb7h1O(DOM7H10), dAb7h11(DOM7h11), dAb7h12(DOM7h12), dAb7h13(DOM7h13), dAb7h14(DOM7h14), dAb7p1(DOM7p1) 및 dAb7p2(DOM7p2)(이들 서열의 공개에 대해서는 제WO2008096158호를 참조하길 바라며, 이들 서열 및 이들의 핵산 대응물은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb와 경쟁한다. 대안적인 명칭을 dAb 뒤에 괄호 안에 나타내었으며, 예를 들어, dAb8은 dAb10의 대안적인 명칭을 가지며, 즉 dAb8(dAb10)이다.

특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고,

MSA-16, MSA-26,

DOM7m-16(서열 번호 473), DOM7m-12(서열 번호 474), DOM7m-26(서열 번호 475), DOM7r-1(서열 번호 476), DOM7r-3(서열 번호 477), DOM7r-4(서열 번호 478), DOM7r-5(서열 번호 479), DOM7r-7(서열 번호 480), DOM7r-8(서열 번호 481), DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-3(서열 번호 483), DOM7h-4(서열 번호 484), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494), DOM7h-27(서열 번호 495), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7M-13(서열 번호 497), DOM7r-14(서열 번호 498), DOM7r-15(서열 번호 499), DOM7r-16(서열 번호 500), DOM7r-17(서열 번호 501), DOM7r-18(서열 번호 502), DOM7r-19(서열 번호 503), DOM7r-20(서열 번호 504), DOM7r-21(서열 번호 505), DOM7r-22(서열 번호 506), DOM7r-23(서열 번호 507), DOM7r-24(서열 번호 508), DOM7r-25(서열 번호 509), DOM7r-26(서열 번호 510), DOM7r-27(서열 번호 511), DOM7r-28(서열 번호 512), DOM7r-29(서열 번호 513), DOM7r-30(서열 번호 514), DOM7r-31(서열 번호 515), DOM7r-32(서열 번호 516), DOM7r-33(서열 번호 517)(본 단락에서의 서열 번호는 제WO2007080392호에 나타나 있는 것이다),

dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1 및 dAb7p2로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는

DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-3(서열 번호 483), DOM7h-4(서열 번호 484), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7r-13(서열 번호 497), DOM7r-14(서열 번호 498), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494) 또는 DOM7h-27(서열 번호 495)(이 단락의 서열 번호는 제WO2007080392호에 나타나 있는 것임), 또는

dAb8, dAb10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 또는 dAb7h14와 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며,

DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-8(서열 번호 496), DOM7h-22(서열 번호 489), DOM7h-23(서열 번호 490), DOM7h-24(서열 번호 491), DOM7h-25(서열 번호 492), DOM7h-26(서열 번호 493), DOM7h-21(서열 번호 494), DOM7h-27(서열 번호 495)(이 단락의 서열 번호는 제WO2007080392호에 나타나 있는 것임),

dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14로 이루어진 군으로부터 선택되는 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

더욱 특정한 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하며,

DOM7h-2(서열 번호 482), DOM7h-6(서열 번호 485), DOM7h-1(서열 번호 486), DOM7h-7(서열 번호 487), DOM7h-8(서열 번호 496)(이 단락의 서열 번호는 제WO2007080392호에 나타나 있는 것임),

dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, d Ab7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Vκ dAb이다.

더욱 특정한 실시형태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하는 V_H dAb이며, dAb7h30 및 dAb7h31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

더욱 특정한 실시형태에서, dAb는 dAb7h11 또는 dAb7h14이다.

다른 실시형태에서, dAb, 리간드 또는 길항제는 인간 혈청 알부민에 결합하며, 상기 아미노산 서열의 임의의 것의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개, 예를 들어 dAb7h11 또는 dAb7h14의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다.

혈청 알부민에 결합하는 적합한 카멜리드 V_HH는 서열 A(서열 번호 518), 서열 B(서열 번호 519), 서열 C(서열 번호 520), 서열 D(서열 번호 521), 서열 E(서열 번호 522), 서열 F(서열 번호 523), 서열 G(서열 번호 524), 서열 H(서열 번호 525), 서열 I(서열 번호 526), 서열 J(서열 번호 527), 서열 K(서열 번호 528), 서열 L(서열 번호 529), 서열 M(서열 번호 530), 서열 N(서열 번호 531), 서열 O(서열 번호 532), 서열 P(서열 번호 533), 서열 Q(서열 번호 534)와 같은 제WO 2004/041862호(Ablynx N. V.) 및 제WO2007080392호(V_HH 서열 및 이들의 핵산 대응물이 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다)에 개시된 것을 포함하며, 이들 서열 번호는 제WO2007080392호 또는 제WO 2004/041862호(Ablynx N. V.)에 기재된 것에 상응한다. 특정 실시형태에서, 카멜리드 V_HH는 인간 혈청 알부민에 결합하며, 제WO2007080392호에 개시된 ALB1 또는 서열 번호 518-534 중 임의의 것과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 번호는 제WO2007080392호 또는 제WO 2004/041862호에 기재된 것에 상응한다.

일부 실시형태에서, 리간드 또는 길항제는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하기 위하여 본 명세서에 개시된 임의의 항-혈청 알부민 dAb와 경쟁하는 항-혈청 알부민 dAb를 포함한다.

대안적인 실시형태에서, 길항제 또는 리간드는 IL-13(예를 들어, 인간 IL-13)에 특이적인 결합 부분을 포함하며, 여기서, 이 부분은 제WO2008096158호에 기재된 비-면역글로불린 서열을 포함하며, 이들 결합 부분의 개시물, 이들의 생성 및 선택 방법(예를 들어, 다양한 라이브러리로부터의) 및 이들의 서열은 본 명세서에 본 명세서의 본문의 일부로서 참고로 포함된다.

반감기 연장 부분(예를 들어, 알부민)으로의 컨쥬게이션

일 실시형태에서, (하나 이상의) 반감기 연장 부분(예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이의 단편 및 유사체)은 본 발명의 IL-13-결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제와 컨쥬게이트되거나 회합된다. IL-13 결합 포맷으로 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 제WO 2005077042호에 기재되어 있으며, 이 개시물은 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 명세서의 본문의 일부를 형성한다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:

· 서열 번호 1(제WO 2005077042호에 기재, 이 서열은 본 명세서에 참고로 명백히 포함된다);

· WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 이루어지는 알부민 단편 또는 변이체;

· (a) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 54 내지 61; (b) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 76 내지 89; (c) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 92 내지 100; (d) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 170 내지 176; (e) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 247 내지 252; (f) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 266 내지 277; (g) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 280 내지 288; (h) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 362 내지 368; (i) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 439 내지 447; (j) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 462 내지 475; (k) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) 제WO 2005077042호에서 서열 번호 1의 아미노산 560 내지 566으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체.

IL-13-결합 포맷으로 사용하기 위한 적합한 알부민, 단편 및 유사체의 추가의 예는 제WO 03076567호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되며, 본 명세서의 개시물의 일부를 형성한다. 특히 다음의 알부민, 단편 또는 변이체가 본 발명에서 이용될 수 있다:

· 제WO 03076567호, 예를 들어, 도 3에 기재된 인간 혈청 알부민(이 서열 정보는 참고문헌으로 본 명세서에 명백히 포함됨);

· 화학식 분자량이 66,500인 585개 아미노산의 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 사슬로 이루어진 인간 혈청 알부민(HA)(문헌[Meloun, et al., FEBS Letters 58: 136 (1975)]; 문헌[Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975)]; 문헌[Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981)]; 문헌[Minghetti, et al., J. Biol Chem. 267:6747 (1986)] 참조);

· 문헌[Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 57:219 (1973)]에 기재된 알부민의 다형성 변이체 또는 유사체 또는 단편;

· 제EP 322094호에 기재된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어, HA(1-373., HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), 및 HA(1-419) 및 1-369와 1-419 사이의 단편;

· 제EP 399666호에 기재된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어, HA(1-177) 및 HA(1-200), 및 HA(1-X)간의 단편(여기서 X는 178 내지 199의 임의의 수임).

(하나 이상의) 반감기 연장 부분(예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 또는 유사체)이 본 발명의 IL-13-결합 폴리펩티드, dAb 및 길항제를 포맷화하는 데 사용되는 경우, 이는 예를 들어, 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 뉴클레오티드 작제물을 사용하여 IL-13-결합 부분(예를 들어, 항-IL-13 dAb)으로의 직접 융합과 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 컨쥬게이트될 수 있으며, 여기서, 융합 단백질은 IL-13 결합 부분에 N- 또는 C-말단으로 위치한 반감기 연장 부분을 가지는 단일 폴리펩티드 사슬로 엔코딩된다.

대신에, 컨쥬게이션은 부분 사이에 펩티드 링커, 예를 들어, 제WO03076567호 또는 제WO2004003019호(이들 링커에 대한 기재는 본 발명에서 사용하기 위한 실시예를 제공하기 위하여 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 펩티드 링커를 사용하여 달성할 수 있다. 전형적으로, 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드는 생체내에서 자연적으로 발생하고, 개체(예를 들어, 인간)로부터 원하지 않는 물질을 제거하는 내인성 메커니즘에 의한 분해 또는 제거에 내성인 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체내 혈관 반감기를 증가시키는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 혈액 내에서 발견되는 단백질, 혈관-뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 국소화된 단백질, 스트레스 단백질, 질병-특이적 단백질, 또는 Fc 수송에 수반되는 단백질로부터 선택될 수 있다.

본 명세서를 통해 기재된 본 발명의 실시형태에서, 숙련자가 본 발명의 길항제 또는 리간드에서 항-IL-13 "dAb"의 사용 대신에, IL-13에 결합하는 본 발명의 dAb의 CDR(예를 들어, 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어 친화체, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인 상으로 이식된 CDR)의 하나 이상 또는 3개 모두를 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인을 사용할 수 있는 것이 고려된다. 따라서, 전체로서 상기의 개시는 dAb 대신에 이들 도메인을 사용한 길항제의 개시를 제공하는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 면에서, 그 개시물이 참고문헌으로 포함되는 제WO2008096158호를 참조하라.

따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 길항제는 IL-13에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체(dAb) 또는 적합한 포맷의 이러한 dAb의 상보성 결정 영역을 포함한다. 길항제는 이러한 dAb로 이루어지거나 이러한 dAb로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 길항제는 항체 포맷(예를 들어, IgG-형 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')₂)과 같은 적합한 포맷의 dAb(또는 dAb의 CDR)를 포함하는 폴리펩티드, 또는 IL-13에 결합하는 dAb 및 다른 표적 단백질, 항원 또는 에피토프(예를 들어, 혈청 알부민)에 결합하는 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드일 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드, dAb 및 길항제는 해당 분야에 공지된 다양한 적합한 항체 포맷, 예를 들어, IgG-형 포맷, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 상기의 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, a F(ab')₂ 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, V_H, V_L), dAb 및 상기의 것 중 임의의 것의 변형된 버젼(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 다른 적합한 중합체의 공유적 부착에 의한 변형)으로 포맷화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 IgG-형 포맷인 리간드(예를 들어, 항-IL-13 길항제)를 제공한다. 이러한 포맷은 IgG　분자의 통상적인 4개 사슬 구조(2개의 중쇄와 2개의 경쇄)를 가지며, 여기서, 가변 영역(V_H 및/또는 V_L)의 하나 이상이 본 발명의 dAb로 대체된다. 일 실시형태에서, 각 가변 영역(2개 V_H 영역 및 2개 V_L 영역)은 dAb 혹은 단일 가변 도메인으로 대체되며, 이 중 적어도 하나는 본 발명에 따른 항-IL-13 dAb이다. IgG-형 포맷으로 포함되는 dAb(들) 또는 단일 가변 도메인(들)은 동일하거나 상이한 특이성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, IgG-형 포맷은 4가이고, 1개(예를 들어, 오직 항-IL-13만), 2개(예를 들어, 항-IL-13 및 항-SA), 3개, 혹은 4개의 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, IgG-형 포맷은 단일특이성일 수 있고, 동일한 특이성을 가지는 4개 dAb를 포함하거나; 이중특이성이며, 동일한 특이성을 가지는 3개 dAb 및 상이한 특이성을 가지는 다른 dAb를 포함하거나; 이중특이성이며, 동일한 특이성을 가지는 2 dAb 및 이와는 상이한 공통의 특이성을 가지는 다른 2개 dAb를 포함하거나; 삼중특이성이며, 동일한 특이성을 가지는 제1 및 제2 dAb, 다른 특이성을 가지는 제3 dAb 및 제1, 제2 및 제3 dAb와 다른 특이성을 가지는 제4 dAb를 포함하거나; 또는 사중특이성이며, 각기 다른 특이성을 가지는 4개 dAb를 포함할 수 있다. IgG-형 포맷(예를 들어, Fab, F(ab')₂, Fab', Fv, scFv)의 항원 결합 단편이 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, IgG-형 포맷 또는 항원-결합 단편은 IL-13에 대하여 1가일 수 있다. 보체 활성화 및/또는 항체 의존적 세포독성(ADCC) 기능이 요구된다면, 그 리간드는 IgG1-형 포맷일 수 있다. 필요에 따라, IgG-형 포맷은 Fc 수용체로의 결합을 최소화하고/거나 보체를 고정시키기 위하여, 돌연변이된 불변 영역(변이체 IgG 중쇄 불변 영역)을 포함할 수 있다(예컨대, 문헌 [Winter et al, GB 2,209,757 B]; 문헌[Morrison et al., WO89/07142]; 문헌[Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994] 참조).

본 발명의 리간드(예를 들어, 폴리펩티드, dAb 및 길항제)는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합되는 제1의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 융합 단백질로서 포맷화될 수 있다. 필요에 따라, 이러한 포맷이 반감기를 연장하는 부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.

일반적으로 표적에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인의 배향, 그리고 상기 리간드가 링커를 포함하는지의 여부는 설계상 선택의 문제이다. 그러나 링커가 있든 없든 일부 배향은 다른 배향보다 더 우수한 결합 특성을 제공할 수 있다. 본 발명에 포함되는 모든 배향(예컨대, dAb1-링커-dAb2; dAb2-링커-dAb1)은 스크리닝에 의해 용이하게 동정될 수 있는 바람직한 결합 특성을 제공하는 배향을 포함하는 리간드이다.

dAb 단량체, 이량체 및 삼량체를 비롯한 본 발명에 따른 dAb 및 폴리펩티드는 C_H2 및 C_H3 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 힌지 영역을 임의로 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 서열로서 Fc 영역에 연결된 리간드를 엔코딩하는 벡터를 사용하여, 이러한 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 상술된 dAb 단량체의 이량체, 삼량체 및 중합체를 제공한다.

독소 부분 또는 독소를 함유하는 리간드

본 발명은 또한, 독소 부분 또는 독소를 포함하는 리간드(예를 들어, 항-IL-13 dAb, dAb 단량체)에 관한 것이다. 적합한 독소 부분은 독소(예를 들어, 표면 활성 독소, 사이토톡신)를 포함한다. 독소 부분 또는 독소는 임의의 적합한 방법을 사용하여 리간드에 컨쥬게이트되거나 또는 연결될 수 있다. 예를 들어, 독소 부분 또는 독소는 리간드에 직접 또는 적합한 링커를 통해 공유 결합될 수 있다. 적합한 링커는 절단 불가능한 링커 또는 절단 가능한 링커, 예를 들어, 세포 효소(예를 들어, 세포 에스테라아제, 카텝신 B와 같은 세포 프로테아제)에 대한 절단 부위를 포함하는 pH 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 그러한 절단가능한 링커는 리간드가 내재화된 후에 독소 부분 또는 독소를 방출할 수 있는 리간드를 제조하는데 이용될 수 있다.

리간드에 독소 부분 또는 독소를 연결 또는 컨쥬게이팅하는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 선택된 특정 방법은 독소 부분 또는 독소 및 연결되거나 컨쥬게이트되는 리간드에 좌우될 것이다. 필요에 따라, 말단 작용기를 함유하는 링커가 리간드와 독소 부분 또는 독소를 연결하는 데에 사용될 수 있다. 일반적으로 컨쥬게이션은 반응성 작용기를 함유하는 (또는 반응성 작용기를 함유하도록 변형된) 독소 부분 또는 독소를 링커 또는 리간드와 직접 반응하여 달성된다. 화학 부분 또는 작용기를 함유하는 (또는 함유하도록 변형된) 독소 부분 또는 독소와 반응하여 형성된 공유 결합은 적절한 조건하에서 두 번째 화학 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 필요에 따라, 적합한 반응성 화학 기가 임의의 적합한 방법을 사용하여 리간드 또는 링커에 추가될 수 있다(예를 들어 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)] 참조). 많은 적합한 반응성 화학물질 기의 조합이 해당 분야에 알려져 있고, 예를 들어 아민기는 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 아이오도), N-하이드록실숙신이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성 기와 반응할 수 있다. 티올은 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴로릴, 피리딜 다이설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등과 반응할 수 있다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가 인 그룹과 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포리미드 연결을 형성할 수 있다. 활성화 기를 분자내로 도입하는 적합한 방법은 해당 분야에 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)] 참조).

적합한 독소 부분 또는 독소는 예를 들어, 메이탄시노이드(예를 들어, 메이탄시놀, 예를 들어 DM1, DM4), 탁산, 칼리케아미신, 듀오카마이신 또는 이들의 유도체를 포함한다. 메이탄시노이드는 예를 들어, 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체일 수 있다. 메이탄시놀 유사체의 예는 변형된 방향족 고리를 가지는 것(예를 들어, C-19-데클로로, C-20-데메톡시, C-20-아실옥시) 및 다른 위치에 변형을 가지는 것(예를 들어, C-9-CH, C-14-알콕시메틸, C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸, C-15-하이드록시/아실옥시, C-15-메톡시, C-18-N-데메틸, 4,5-데옥시)을 포함한다. 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체는 예를 들어, 미국 특허 제5208020호 및 제6333410호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 참고문헌으로 포함된다. 메이탄시놀은 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(N-숙신이미딜 4-(2-피리딜다이티오) 펜타노에이트(또는 SPP라고도 알려짐), 4-숙신이미딜-옥시카보닐-a-(2-피리딜다이티오)-톨루엔(SMPT), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 부티레이트(SDPB), 2 이미노티올란, 또는 S-아세틸숙시닉 무수물을 이용하여 항체 및 항체 단편에 커플링될 수 있다. 탁산은 예를 들어, 탁솔, 탁소테르 또는 신규 탁산 (예를 들어, 제WO01/38318호 참조)일 수 있다. 칼리케아미신은 예를 들어, 브로모-복합체 칼리케아미신(예를 들어, 알파, 베타 또는 감마 브로모-복합체), 아이오도-복합체 칼리케아미신(예를 들어, 알파, 베타 또는 감마 아이오도-복합체) 또는 이들의 유사체 또는 모방체(mimic)일 수 있다. 브로모-복합체 칼리케아미신은 I1-BR, I2-BR, I3-BR, I4-BR, J1-BR, J2-BR 및 K1-BR일 수 있다. 아이오도-복합체 칼리케아미신은 I1-I, I2-I, I3-I, J1-I, J2-I, L1-I 및 K1-BR일 수 있다. 칼리케아미신 및 이의 돌연변이체, 유사체 및 모방체는 예를 들어, 미국 특허 제4970198호; 제5264586호; 5550246호; 제5712374호 및 제5714586호에 기재되어 있고, 상기 문헌의 각각의 내용은 참고문헌으로 본 명세서에서 포함된다. 듀오카마이신 유사체(예를 들어, KW-2189, DC88, DC89 CBI-TMI, 및 이들의 유도체)는 예를 들어, 미국 특허 제5070092호, 미국 특허 제5187186호, 미국 특허 제5641780호, 미국 특허 제5641780호, 미국 특허 제4923990호 및 미국 특허 제5101038호에 기재되어 있고, 상기 문헌의 각각의 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

다른 독소의 예는, 이에 한정되지는 않으나, 대사 길항물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, CC-1065(미국 특허 제5475092호, 제5585499호, 제5846545호 참조), 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 cis-다이클로로다이아민 플래티늄 (II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(종전 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(종전 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 미토마이신, 퓨로마이신 안트라마이신(AMC)), 듀오카마이신 및 이들의 유사체 또는 유도체, 및 항-유사 분열 제제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 탁솔, 아우리스타틴 (예를 들어 아우리스타틴 E) 및 메이탄시노이드 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함한다.

독소는 또한 자유 라디칼(free radical) 생성체(예를 들어, 셀레늄 함유 독소 부분) 또는 방사성 핵종 함유 부분인 독소와 같은 표면 활성 독소일 수 있다. 적합한 방사선 핵종 함유 잔기는 예를 들어 방사능 요오드(¹³¹I 또는 ¹²⁵I), 이트륨(⁹⁰Y), 루테튬(¹⁷⁷Lu), 액티늄(²²⁵Ac), 프라세오디뮴, 아스타틴(²¹¹At), 레늄(¹⁸⁶Re), 비스무트(²¹²Bi 또는 ²¹³Bi), 인듐(¹¹¹In), 테크네튬(⁹⁹mTc), 인(³²P), 로듐(¹⁸⁸Rh), 황(³⁵S), 탄소(¹⁴C), 삼중수소(³H), 크롬(⁵¹Cr), 염소(³⁶Cl), 코발트(⁵⁷Co 또는 ⁵⁸Co), 철(⁵⁹Fe), 셀레늄(⁷⁵Se) 또는 갈륨(⁶⁷Ga)을 포함하는 부분을 포함한다.

독소는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있으며, 박테리아 공급원으로부터의 것, 예를 들어 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소(PE) 및, 식물 단백질로부터의 것, 예를 들어, 리신의 A 사슬(RTA), 리보솜 불활성화 단백질(RIP) 겔로닌, 포키위드 항-바이러스 단백질, 사포린 및 도데칸드론이 독소로 사용되는 것으로 고려된다.

특정 표적 단백질을 생성하는 데에 관여하는 mRNA에 결합하거나, 이를 불능화하거나, 이의 분해를 촉진하거나 또는 이의 생성을 방지하도록 설계된 핵산의 안티센스 화합물도 독소로 사용될 수 있다. 안티센스 화합물은 안티센스 RNA 또는 DNA, 단일 또는 이중 가닥, 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함하며, 이들은 개개의 mRNA 종에 특이적으로 혼성화되어 mRNA 종의 전사 및/또는 RNA 프로세싱 및/또는 엔코딩된 폴리펩티드의 번역을 방지하여 각각의 엔코딩된 폴리펩티드의 양의 감소를 가져올 수 있다. 문헌[Ching, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006-10010 (1989); Broder, et al., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau, et al., FEBS Letter 274:53-56 (1990)]을 참조하길 바라며; 유용한 안티센스 치료제는 예를 들어: Veglin™(VasGene) 및 OGX-011(Oncogenix)을 포함한다.

독소는 또한, 광활성화 제제일 수 있다. 적합한 광활성화 제제는 포르피머 소듐, 그린 포르피린, 클로린 E6, 헤마토포르피린 유도체 자체, 프탈로시아닌, 에티오퍼퓨린, 텍사프린 등과 같은 포르피린-기재 물질을 포함한다.

독소는 세포내 표적(체내(intrabody))에 결합하는 dAb와 같은 세포내 표적에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 그러한 항체 또는 항체 단편 (dAb)은 한정된 세포하위 구획 또는 표적으로 지향될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편(dAb)은 erbB2, EGFR, BCR-ABL, p21Ras, 카스파제3, 카스파제7, Bcl-2, p53, t사이클린 E, ATF-1/CREB, HPV16 E7, HP1, 제4형 콜라게나아제, 카텝신 L 뿐만 아니라 문헌[Kontermann, R.E., Methods, 34:163-170 (2004), 전체 내용이 본 발명의 참고문헌으로 인용됨]에 기재된 다른 것들로부터 선택된 세포내 표적에 결합할 수 있다.

제WO2007085815호의 실시예는 본 발명의 리간드에 동등하게 적용될 수 있는 관련 검정, 포맷화 및 실험의 상세사항을 제공하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

검정

IL -13

IL-13 샌드위치 ELISA

맥시소프(MAXISORP™) 플레이트(고 단백질 결합 ELISA 플레이트, Nunc, Denmark)를 2.5 ㎍/㎖ 코팅 항체(Module Set, Bender MedSystems, Vienna, Austria)로 밤새 코팅한 다음, PBS 중의 0.05%(v/v) Tween 20으로 1회 세정하고, PBS 중의 0.5% (w/v) BSA 0.05% (v/v) Tween 20으로 블로킹하였다. 플레이트를 다시 세정하고, DOM10 dAb(즉, 항-IL-13 dAb) 또는 단독의 IL-13의 단계 희석물과 혼합된 150 pg/㎖의 IL-13(GSK)을 첨가하였다. 플레이트를 2회 세정하고, 비오틴 컨쥬게이트된 검출 항체(Module Set, Bender Medsystems)에 이어서, 과산화효소 표지된 스트렙트아비딘(Module Set, Bender MedSystems)을 사용하여 IL-13의 포획 항체에 대한 결합을 검출하였다. 마지막으로, 플레이트를 3회 세정한 다음, TMB 기질(KPL, Gaithersburg, USA)과 함께 인큐베이션하고, HCl의 첨가로 반응을 중단시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 항-IL-13 dAb 활성은 IL-13 결합의 감소를 야기함에 따라 오직 IL-13만의 대조군에 비하여 흡광도의 감소를 야기한다.

8200 세포 검출 시스템을 사용한 IL-13 수용체 결합 검정(RBA)

스페로(SPHERO™) 염소 항-인간 IgG(H&L) 폴리스티렌 입자(0.5% w/v)(염소- 항-인간 입자, Spherotech, Libertyville, USA)를 20 ㎍의 IL-13R 알파 1/Fc 키메라 또는 IL-13R 알파 2/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, USA)로 밤새 코팅하였다. 그 다음, 다음의 시약을 384-웰 블랙 웰 검정면 투명 바닥 FMAT 플레이트(Applied Biosystems, Foster City, USA)에서 합하고: PBS 중의 0.1% (w/v) BSA 또는 DOM-10 dAb의 일련의 희석물; 0.5 ㎍/㎖의 비오티닐화 항-IL-13 항체(R&D Systems); 0.25 ㎍/㎖의 스트렙트아비딘 알렉사 플루오르(STREPTAVIDIN ALEXA FLUOR^®) 647 컨쥬게이트(형광 프로브, Molecular Probe, Invitrogen Ltd, Paisley, UK); 10 ng/㎖의 재조합 인간 IL-13(R&D Systems); 및 IL-13R2/Fc 코팅된 입자의 1:10 희석물. 8200 세포 검출 시스템(Applied Biosystems)에서 판독하기 전에 플레이트를 7시간 동안 인큐베이션하였다. IL-13의 수용체 코팅된 입자로의 결합은 복합체가 형성되게 야기하며, 이는 8200에 의하여 형광 이벤트(event)로 검출된다. 항-IL-13 dAb 활성은 IL-13 결합의 감소를 야기하여, 오직 IL-13만의 대조군에 비해 형광 이벤트의 감소를 야기한다.

IL-13 세포 검정

분리된 dAb를 배양된 TF-1 세포(ATCC^® 카달로그 번호 CRL-2003)에서 IL-13 유도성 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 약술하면, 페놀 레드가 없는 RPMI 배지(Gibco, Invitrogen Ltd, Paisley, UK) 중의 40000 TF-1 세포를 조직 배양 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 두고, 5 ng/㎖의 농도의 IL-13(R&D Systems, Minneapolis, USA) 및 시험할 dAb의 희석물과 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃, 5% CO₂에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 셀타이터(CELLTITER) 96^® 시약(생존력을 결정하기 위한 비색 시약, Promega, Madison, USA)을 첨가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써 웰당 세포의 수를 정량화하였다. 항-IL-13 dAb 활성은 세포 증식의 감소를 야기하며, 이와 상응하는, 단독의 IL-13보다 더 낮은 A₄₉₀을 야기한다.

비아코어(BIACORE)^® 분리-속도(Off-rate) 스크리닝

스트렙트아비딘 코팅된 SA 칩(Biacore)을 대략 500 RU의 비오티닐화된 IL-13 (R&D Systems, Minneapolis, USA)으로 코팅하였다. 용해성 dAb를 함유하는 상층액을 런닝 완충액 중에 1:5로 희석시켰다. 50 내지 100 ㎕의 희석된 상층액을 50 ㎕/분의 유속으로 주입(kininject)한 후, 5분의 해리 단계에 적용시켰다. 모 (parent)에 비해 개선된 분리 속도를 지니는 클론을 육안으로, 또는 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어 v4.1(Biacore)을 이용한 측정에 의하여 확인하였다.

항 IL-13 dAb와의 경쟁적 비아코어^®

약 400RU의 비오티닐화된 IL-13(R&D Systems)과 커플링된 스트렙트아비딘으로 코팅된 SA 칩(Biacore)을 이용하여, 비아코어^® 3000 기기(표면 플라즈몬 공명 기기, Biacore) 상에서 이들 실험을 수행하였다. 피분석물을 블랭크 유세포에 대한 인-라인 참조와 함께, HBS-EP 런닝 완충액(Biacore) 중에서 30 ㎕/분의 유속으로 항원이 코팅된 유세포 상을 통과시켰다. 비아코어의 공동주입 기능을 이용하여, 제1 dAb를 주입한 직후 제2 dAb를 주입하였다. 이러한 경쟁 프로토콜은 일반적으로 IL-13에 결합하기 위한 시험 항체 또는 단편의 공지된 dAb(또는 기타 항체 폴리펩티드)와의 경쟁을 평가하기 위해 사용될 수 있다.

경쟁 및 에피토프 맵핑

항-IL-13 dAb의 에피토프 맵핑

항-IL-13 dAb의 에피토프 특이성을 결정하기 위해, 비아코어 경쟁 실험을 수행할 수 있다. dAb를 주입한 후, 즉시 제2 dAb를 주입하였다. 한(제2) dAb가 다른(제1) dAb가 결합한 IL-13에 결합하지 않는다면, 이는 이들 dAb가 동일한 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다. 이러한 경쟁 프로토콜은 일반적으로 IL-13에 결합하기 위한 시험 항체 또는 단편의 공지된 dAb(또는 기타 항체 폴리펩티드)와의 경쟁 (및 에피토프 맵핑)을 평가하는데 사용될 수 있다. 약간 변형된 비아코어 프로토콜이 가능하며, 여기서, 제1 dAb를 IL-13 표면에 주입한 다음, 고 친화성 결합 dAb를 IL-13 표면을 포화시키는 고농도(5 μM)로 주입하고, 최종적으로 dAb를 다시 주입한다. 고 친화성 dAb로의 포화 전 및 포화 후의 결합 간에 차이가 존재하는 경우, 에피토프는 적어도 부분적으로 중복된다.

IL-13 유도성 B 세포 증식

정상적인 혈액 공여자로부터 혈액을 채취할 수 있다. 피콜 구배를 이용하여 PBMC를 분리시켰다. 이후, 네거티브(negative) B 세포 분리 키트(이지셉 네가티브(EasySep Negative) 분리 키트, Stem Cell Technologies Inc)를 이용하여 B 세포를 분리시켰다. 유세포 분석, 및 CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 및 CD23의에 의해 순도(임의로, 98% 초과)를 결정할 수 있다. 그 다음, B 세포를 방사선 조사된 CD40L⁺L 세포로 코팅된 플레이트에서 IL-13(10 ng/㎖)의 존재하에서 웰당 1 x 10⁵개의 세포로 플레이팅시켰다. 배양물을 5일 동안 인큐베이션하였는 데, 최종 18시간 동안에는 3[H]티미딘을 첨가하였다. 항-IL-13 dAb를 배양 시작시에 10nM 또는 100nM로 첨가하였다.

B 세포 증식 검정

CD40L이 IL-13에 대해 반응성이 되도록 세포를 활성화시킬 수 있음이 상기에 제시되었다. 실제 공여자는 이들의 B 세포를 방사선 조사된 CD40L⁺L 세포 및 증가하는 농도의 IL-13과 함께 인큐베이션하는 경우 용량-의존적 증식을 나타내도록 시험할 수 있다. 음성 대조군으로, B 세포 단독 또는 CD40L 트랜스펙션된 L 세포 단독을 사용할 수 있다. 항-IL-13 dAb의 첨가는 이것이 공여자로부터 IL-13 유도성 B 세포의 억제를 야기하는지를 보기 위하여 평가할 수 있다.

설명의 목적으로, 억제성 dAb(제WO2007085815호 참조)에 대하여 평균 억제는 각각 10 nM 및 100 nM의 농도에서 80% 및 100%였다. B 세포 증식의 완전한 억제가 또한 3 ㎍/㎖의 양성 대조군 항-IL-13 dAb(R&D)에서 관찰되었다. IL-13에 결합하지 않는 대조군 dAb는 이러한 B 세포 증식을 억제하는데 실패했다.

IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합의 억제

항-IL-13 dAb를 경쟁 검정에서, IL-13Rα2에 대한 IL-13의 결합을 억제하는 이들의 능력에 대하여 시험할 수 있다.

변이체 IL-13(R130Q)에 대한 결합

IL-13의 유전 변이체는 천식(문헌[Heinzmann et al. Hum Mol Genet. (2000) 9549-59]) 및 기관지 과반응성(문헌[Howard et al., Am. J. Resp. Cell Molec. Biol. (2001) 377-384]) 위험 증가와 관련이 있다. 따라서, 항-IL-13 dAb가 변이체 IL-13(R130Q)에 결합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 변이체 IL-13 (R130Q) 및 증가하는 양의 dAb를 이용하여 TF-1 증식 분석을 수행하였다. 변이체에 결합하는 dAb는 변이체 IL-13 유도성 TF-1 증식을 예를 들어, 약 0.5 nM 내지 10 nM 값의 ND50으로 억제할 수 있을 것이다.

레수스 및 사이노몰구스 IL-13과의 교차-반응성.

dAb의 요망되는 요건은 레수스 및 사이노몰구스 IL-13과의 교차-반응성일 것이다. 이로 인해, 세포가 인간 IL-13(5 ng/㎖, Peprotech), 레수스 IL-13(5 ng/㎖, R&D systems) 또는 사이노몰구스 IL-13(인-하우스(in-house) 발현된 사이노몰구스 IL-13을 함유하는 상층액의 1:4000 희석물)으로 자극하는 TF-1 세포 증식 검정으로 dAb를 시험할 수 있다. dAb의 용량-반응은 이러한 구성으로 ND50을 결정할 것이다.

IL -4

IL-4 수용체 결합 검정(RBA)

맥시소프™ 플레이트(고 단백질 결합 ELISA 플레이트, Nunc, Denmark)를 0.5 ㎍/㎖의 재조합 인간 IL-4R/Fc(R&D Systems, Minneapolis, USA)로 밤새 코팅시켰다. 웰을 PBS 중의 0.1% (v/v) Tween 20으로 3회 세척한 후, PBS로 3회 세척하고, PBS 중의 2% (w/v) BSA로 블로킹시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 항-IL-4 dAb 또는 IL-4의 연속 희석물과 혼합된 10 ng/㎖의 비오티닐화된-IL-4(R&D Systems)를 첨가하였다. 과산화효소 표지된 항-비오틴 항체(Stratech, Soham, UK)를 이용하여 IL-4 반응을 검출한 후, TBM 기질(KPL, Gaithersburg, USA)을 이용하여 발달시켰다. HCl을 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 항-IL-4 dAb 활성은 수용체에 대한 IL-4 결합을 감소시켰고, 따라서 IL-4 단독의 대조군에 비해 흡광도를 감소시켰다.

IL-4 세포 검정

분리된 dAb를 배양된 TF-1 세포(ATCC^® 카달로그 번호 CRL-2003)에서 IL-4 유도성 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다. 약술하면, 페놀 레드가 없는 RPMI 배지(Gibco, Invitrogen Ltd, Paisley, UK) 중의 40000 TF-1 세포를 조직 배양 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 두고, 1 ng/㎖의 최종 농도의 IL-4(R&D Systems, Minneapolis, USA) 및 시험할 dAb의 희석물과 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃, 5% CO₂에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 셀타이터 96^® 시약(생존력을 결정하기 위한 비색 시약, Promega, Madison, USA)을 첨가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써 웰당 세포의 수를 정량화하였다. 항-IL-4 dAb 활성은 세포 증식의 감소를 야기하며, 이와 상응하는, 단독의 IL-4보다 더 낮은 A₄₉₀을 야기한다.

항 IL-4 dAb와의 경쟁 비아코어^®

약 400RU의 비오티닐화된 IL-4(R&D Systems)와 커플링된 스트렙트아비딘으로 코팅된 SA 칩(Biacore)을 이용하여, 비아코어^® 3000 기기(표면 플라즈몬 공명 기기, Biacore) 상에서 이들 실험을 수행하였다. 피분석물을 블랭크 유세포에 대한 인-라인 참조와 함께, HBS-EP 런닝 완충액(Biacore) 중에서 30 ㎕/분의 유속으로 항원이 코팅된 유세포 상을 통과시켰다. 비아코어의 공동주입 기능을 이용하여, 제1 dAb를 주입한 직후, 제2 dAb를 주입하였다. 이러한 경쟁 프로토콜은 일반적으로 IL-4에 결합하기 위한 시험 항체 또는 단편의 공지된 dAb(또는 기타 항체 폴리펩티드)와의 경쟁을 평가하기 위해 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1: DOM10 리드 dAb 의 선택

DOM10 -53-546

IL-4 및 IL-13에 대한 이중 표적화 분자를 분리하기 위한 시도로서, 인간 IL-13에 대하여 선택된 인-라인 융합 라이브러리로부터 항-IL-13 도메인 항체(dAb)인 DOM10-53-546을 분리하였다. ASTKGPS 링커를 사용하여, IL-4와 결합하는 dAb DOM9-112-210을 IL-13과 결합하는 dAb DOM10-53-409와 연결하여, D0M9-112-210- ASTKGPS-DOM10-53-409를 만들었다. DOM9-112-210 및 DOM10-53-409는 제WO2007085815호에 개시되어 있다. ASTKGPS 링커는 제WO2007085814호에 개시되어 있다. DOM9 dAb를 불변 유지시키고, 모든 3개의 CDR 및 CDR 주위의 프레임워크 잔기를 스패닝(spanning)하는 DOM10-53-409의 3개의 잔기를 각각 다양화시킨 12개 라이브러리의 DOM10-53-409를 만들어, 더 나은 역가 및 발현을 갖는 인-라인 융합에 대하여 선택하였다. 이들 라이브러리는 잔기를 다양화시키기 위하여 NNS 코돈을 도입하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 생성하였다. NNS 코돈은 총 32개 코돈 내의 단일의 정지 코돈 또는 20개의 아미노산 중 임의의 것으로의 치환에 의하여, 표적화된 잔기의 무작위화를 제공한다. N은 모든 4개의 뉴클레오티드 A,T,G 및 C 중 하나를 나타내며, S는 G 또는 C를 나타낸다. 그 다음, 이들 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행한 일차 PCR을 어셈블리 PCR을 사용하여 어셈블링하였다. 어셈블리 PCR('풀-쓰로우(pull-through)' 또는 SOE(중첩 신장에 의한 스플라이싱) PCR로도 공지되어 있음)은 2개의 일차 PCR 산물의 상보적인 말단을 사용하여, 2개의 일차 PCR 산물(하나는 다양화, 하나는 불변)을 분해 또는 라이게이션 없이 함께 가져오는 것을 가능하게 한다.

인-라인 융합 라이브러리를 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드(Dynal, Norway) 및 10 nM의 비오티닐화된 인간 IL-13를 사용한 2 라운드의 선택으로 처리하였다. IL-13을 5배 몰 과량의 이지-링크 설포-NHS-LC-비오틴 시약(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin reagent, Pierce, Rockford, USA)을 사용하여 비오티닐화하였다(문헌[Henderikx et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press]).

2차 라운드의 산출물을 pDOM5 벡터(도 1) 내로 클로닝하였다. pDOM5는 LacZ 프로모터의 제어 하의 pUC119-기반의 발현 벡터이다. N-종말단에서 유니버셜 GAS 리더 신호 펩티드(제WO2005093074호 참조)에 대한 융합에 의하여, 상층액 내로의 dAb의 발현이 보장된다. 또한, c-myc-태그를 dAb의 C-종말단에 추가하였다. 에스케리키아 콜라이 HB2151 세포의 형질전환 후에, 950 rpm, 30 ℃ 및 80% 습도로 프로그램화된 고속 인포스(infors) 쉐이커에서 96 딥 웰 플레이트 내에 100 ㎍/㎖의 카베니실린이 보충된 0.5㎖/웰의 오버나잇 익스프레스 오토-인덕션 배지(overnight express auto-induction medium, 고수준 단백질 발현 시스템, Novagen) 내에서 2일 동안 클론을 발현시켰다. 그 다음, 플레이트를 4000rpm에서 20분 동안 원심분리시키고, 상층액을 HBS 완충액 중에 1/5로 희석시키고, 1500 Ru 단백질 A CM5 칩에 대한 결합에 대해 비아코어™ 상에서 스크리닝하여, 개선된 발현을 갖는 클론을 선택하였다. 단백질 A를 제조처의 지시(아민 커플링 키트, 비아코어, GE healthcare)에 따라 일차 아민 커플링에 의하여 CM5 칩 상으로 커플링시켰다. 샘플을 50㎕/분의 유속으로 비아코어 상에서 구동시켰다. 0.1 M 글리신 pH 2를 사용하여 표면을 기준선으로 다시 재생시켰다. 그 다음, 개선된 발현을 갖는 임의의 클론을 50 ㎖의 오버나잇 익스프레스 오토인덕션 배지에서 30 ℃에서 48시간 동안 발현시키고, 원심분리(20분 동안 4,000 rpm)에 의한 세포 펠렛화 후에, 상층액을 스트림라인(streamline)-단백질 A 비드(Amersham Biosciences, 결합능: 비드 ㎖당 5 ㎎의 dAb)와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음, 비드를 드립(drip) 컬럼 내로 패킹하고, 10 컬럼 부피의 PBS로 세정하고, 결합 dAb를 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.0로 용출시켰다. 1 M Tris-HCl, pH 8.0을 사용한 중화 후에, 12% 아크릴아미드 트리스-글리신 겔(Invitrogen) 상에서의 SDS-PAGE 후에 육안 분석으로 단백질 순도를 추산하였다. 단백질 농도 및 수율(박테리아 배양물 L당 ㎎ 단위)을 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 측정하였다. 발현이 개선된 클론을 비아코어 상에서, 200Ru 비오티닐화된 인간 IL-13 스트렙트아비딘 칩으로의 결합에 대해 분석하여, 역가를 평가하였다. 이들 라이브러리로부터 선택된 가장 강력한 클론은 DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-53-546(프레임워크 잔기 28-30을 다양화한 라이브러리로부터의)이었으며, 이는 DOM9-112-210-ASTKGPS-DOM10-53-409와 유사한 발현 수준을 나타내었으나, IL-13에 대한 개선된 역가를 가졌다. 그 다음, DOM10 암(arm)인 DOM10-53-546을 단량체로서 pDOM5 벡터 내로 클로닝하였다. DOM10-53-546의 DNA 및 아미노산 서열을 도 2 및 3에 약술하였다.

DOM10 -53-567

사이노몰구스 IL-13에 대해 개선된 역가를 갖는 dAb를 선택하기 위한 시도로, DOM10-53-474(이 dAb는 제WO2007085815호에 개시되어 있음)의 에러 프론(error prone) 라이브러리의 비오티닐화된 사이노몰구스(cyno) IL-13 상에서 수행한 선택으로부터 DOM10-53-567을 분리하였다. 제조처의 지시에 따라 뮤타자임(Mutazyme)™ DNA 중합효소를 사용하는 스트라타진(Stratagene)으로부터의 진모프(GeneMorph) PCR 뮤타지네시스(mutagenesis) 키트(카달로그 번호 200550)를 사용하여 DOM10-53-474의 에러 프론 라이브러리를 만들었다. DOM10-53-474 에러 프론 라이브러리의 2 라운드의 선택을 각각 10 nM 및 5 nM의 사이노몰구스 IL-13을 사용하여 수행하였다. 2차 라운드의 산출물을 pDOM5 벡터 내로 클로닝하고, 상기에 설명된 바와 같이 96 웰 딥 웰 플레이트 내에서 에스케리키아 콜라이 HB2151 세포에서 발현시켰다. 플레이트를 원심분리하고, 상층액을 HBS 완충액에 1/5로 희석하고, 비아코어 상의 200Ru 사이노몰구스 IL-13 스트렙트아비딘 칩 상에서 스크리닝하여, DOM10-53-474에 비해 사이노몰구스-IL-13에 대한 개선된 결합을 갖는 클론을 찾았다. DOM10-53-567을 사이노몰구스 IL-13 및 인간 IL-13 둘 모두에 대해 개선된 결합 동역학을 갖는 클론으로서 선택하였다. DNA 및 아미노산 서열을 도 2 및 3에 약술하였다.

DOM10 -53-568

DOM10-53-567의 역가를 추가로 개선시키려는 시도로, 어셈블리 PCR을 사용하여 강력한 항-IL-13 dAb DOM10-53-386(이 dAb는 제WO2007085815호에 개시되어 있음)의 CDR2를 DOM10-53-567에 도입하여, DOM10-53-568을 생성하고, pDOM5 벡터 내로 클로닝하였다. DNA 및 아미노산 서열을 도 2 및 3에 약술하였다.

DOM10 -53-616

DOM10-53-546의 역가를 추가로 개선하기 위한 시도로, 어셈블리 PCR을 사용하여 강력한 dAb DOM10-53-386의 CDR2를 도입하여, DOM10-53-546의 CDR2를 교체하여, DOM10-53-616을 생성하고, pDOM5 벡터 내로 클로닝하였다. DNA 및 아미노산 서열을 도 2 및 3에 약술하였다.

실시예 2: 서열 분석

도 4에 나타낸 바와 같이, DOM10-53-546은 DOM10-53-474와 비교하여 5개 위치에 아미노산 변화를 갖는다: 위치 28(T에서 V) 및 30(A에서 P)에서 CDR1에 대한 N 말단에 2개의 프레임워크 돌연변이 및 위치 54(H에서 K), 56(E에서 G) 및 57(V에서 K)에서 CDR2 내의 3개의 잔기. DOM10-53-567은 위치 28(T에서 V)에서 DOM10-53-474와 오직 하나의 아미노산만이 다르다.

또한, DOM10-53-568은 이러한 돌연변이를 가지나, 그 외에 위치 56(E에서 K) 및 57(V에서 I)에서 CDR2 내의 2개의 아미노산 변화를 가졌다. DOM10-53-616은 DOM10-53-568과 같은 모든 3개의 돌연변이를 가졌으며, 그 외에 위치 30의 아미노산이 변화하였다(A에서 P). 위치 28에서 트레오닌으로부터 발린으로의 아미노산 변화가 모든 4개의 dAb에 대하여 공통적이다. DOM10-53-474를 비롯한 모든 이들 dAb는 동일한 CDR1 및 CDR3를 갖는다. 모든 넘버링은 카바트에 따른다.

실시예 3: DOM10 dAb 의 발현 및 역가

본 발명자들이 하기에 설명하는 바와 같이, 새로운 dAb가 DOM10-53-474보다 더 강력하다. 더욱이, 새로운 dAb는 인간 및 비-인간 영장류 IL-13 간의 결합에 대하여 교차-반응성인 종이다(그리고, 종 간에 강력한 IL-13 중화제). 이는 새로운 dAb를 IL-13-매개 질환 및 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물 개발의 기반 또는 약물로서 매우 유용하게 하는데, 이는 비-인간 영장류가 인간에 대한 훌륭한 모델로 여겨지고, 인간에서의 이후의 연구를 가이드하는 데이터를 제공함에 따라, 이러한 개발이 통상 인간에서의 시험 전에 비-인간 영장류 종에서 후보물질 리드의 시험을 수반하기 때문이다.

상술한 항-IL-13 DOM10 dAb의 대조 비교를 행하기 위하여, 이들을 myc 태그 없이, 상술된 바와 같이 pDOM5 벡터 내로 클로닝하고, Mach1 화학 컴피턴트(competent) 세포(Invitrogen) 내로 형질전환시키고, 오버나잇 익스프레스 오토-인덕션 배지에서 50 ㎖ 배양으로 발현시켰다. 상술된 바와 같이, 단백질을 스트림라인 단백질 A를 사용하여 정제하고, 정제된 단백질을 SDS PAGE로 평가하였다. 약술하면, SDS PAGE를 위하여, 5 ㎕의 dAb, 15 ㎕의 H₂O 및 6 ㎕의 샘플 완충액을 혼합하고, 90 ℃에서 10분 동안에 이어서 얼음 위에서 2분 동안 인큐베이션하고, 20 ㎕의 샘플을 SDS PAGE 겔 내로 로딩하였다. 결과는 모든 dAb의 순수한 제제를 보여준다.

DOM10 dAb의 발현 수준을 표 1에 약술하였다. DOM10-53-546 및 DOM10-53-616의 발현 수준은 DOM10-53-474 및 시험한 다른 새로운 dAb의 발현 수준보다 훨씬 더 나았다.

표 1. DOM10 dAb의 역가, 발현 및 열 안정성 데이터

정제된 DOM10 dAb의 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대한 결합 친화성을 비아코어 분석으로 평가하였다. 비오티닐화된 IL-13을 사용하여 분석을 수행하였다. 약 150RU의 비오티닐화된 IL-13을 스트렙트아비딘(SA) 칩(비아코어, GE healthcare)으로 코팅하였다. 표면을 0.1 M 글리신 pH 2를 사용하여 기준선으로 다시 재생시켰다. dAb를 50 ㎕/분의 유속을 사용하여 규정된 농도에서 이러한 표면 위로 통과시켰다. 데이터를 비아이밸류에이션 소프트웨어(Biacore, GE Healthcare)를 이용하여 분석하고, 1:1 결합 모델에 핏팅(fitting)시켰다. 결합 데이터는 모든 DOM10 dAb에 대한 1:1 모델에 잘 핏팅되었다. 비아코어 런(run)을 25 ℃에서 수행하였다. 인간 및 사이노몰구스 IL-13 dAb에 대한 KD 값을 표 1에 요약하였다. 새로운 dAb 모두는 인간 및 사이노몰구스 IL-13에 대하여 우수한 역가를 나타내었으며, 모두는 DOM10-53-474보다 훨씬 더 나았다. DOM10-53-567 및 DOM10-53-568은 인간 및 사이노몰구스 IL-13 둘 모두에 대하여 최적의 역가를 나타내었다.

또한, dAb를 DOM10 ELISA에서 시험하여, 인간 IL-13에 대한 역가를 평가하고, 세포 기반의 HEK Blue-STAT6(HEK STAT) 분석을 수행하여, 인간, 사이노몰구스 및 레수스 IL-13에 대한 역가를 평가하였다. DOM10 ELISA는 DOM10 dAb가 IL-13에 결합하고, IL-13 검출 항체에 대한 그의 결합을 방지하는 능력을 측정한다. 맥시소프™ 플레이트(고 단백질 결합 ELISA 플레이트, Nunc, Denmark)를 밤새 2.5 ㎍/㎖의 코팅 항체(Module Set, Bender MedSystems, Vienna, Austria)로 코팅한 다음 PBS 중의 0.05%(v/v) Tween 20으로 1회 세정하고, PBS 중의 0.5% (w/v) BSA 0.05% (v/v) Tween 20으로 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 상술된 바와 같이 플레이트를 2회 세정하고, DOM10 dAb(즉, 항-IL-13 dAb)의 단계 희석물과 혼합된 150 pg/㎖의 IL-13(GSK)을 첨가하고, 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 2회 세정하고, 비오틴 컨쥬게이트된 검출 항체(Module Set, Bender Medsystems)에 이어서, 과산화효소 표지된 스트렙트아비딘(Module Set, Bender MedSystems)을 사용하여 IL-13의 포획 항체에 대한 결합을 검출하였다. 마지막으로, 플레이트를 3회 세정하고, TMB 기질(KPL, Gaithersburg, USA)과 함께 인큐베이션하고, HCl의 첨가로 반응을 중단시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 항-IL-13 dAb 활성은 IL-13 결합의 감소를 야기함에 따라 오직 IL-13만의 대조군에 비하여 흡광도의 감소를 야기한다.

HEK Blue-STAT6 검정은 시험관 내에서 HEK Blue-STAT6 세포에서의 인간 IL-13 자극성 알칼리성 포스파타아제 생성을 억제하는 dAb의 능력을 측정하였다. 이 검정은 STAT6 유전자 및 SEAP(분비형 배아 알칼리성 포스파타아제) 리포터 유전자(Invitrogen, San Diego)를 안정하게 트랜스펙션시킨 HEK293 세포를 사용하였다. IL-13으로의 자극 시에, SEAP는 상층액 내로 분비되고, 이를 비색 방법을 사용하여 측정하였다. 용해성 dAb는 STAT6 경로를 통하여 IL-13 신호전달을 차단하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다.

약술하면, 5x10⁴ HEK-블루 STAT6 세포를 재조합 IL-13(GSK)과 함께 37 ℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션한 dAb와 함께 DMEM(Gibco, Invitrogen Ltd, Paisley, UK)에서 배양하였다. 사전-인큐베이션은 동 부피의 dAb 및 재조합 IL-13을 사용하여 수행하였다. 그 다음, 이러한 사전-인큐베이션 혼합물을 동 부피의 HEK-블루 STAT6 세포에 첨가하였다. 그러므로, 검정 내의 IL-13의 최종 농도는 3 ng/㎖이며, dAb를 200nM 내지 0.05nM 범위의 용량 반응으로 시험하였다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 배양 상층액을 퀀티블루(QuantiBlue)(Invivogen)와 혼합하고, 640nm에서 흡광도를 판독하였다. 항-IL-13 dAb 활성은 IL-13 자극에 비해 STAT6 활성화의 감소를 야기하며, 상응하는 A₆₄₀의 감소를 야기한다.

DOM10 dAb의 검정 데이터의 결과를 표 1에 요약하였다. 비아코어 데이터에 따라, DOM10-53-567은 인간, 사이노몰구스 및 레수스 IL-13에 대하여 최적의 역가를 나타내었다. DOM10-53-568이 DOM10-53-567의 KD 값과 유사한 KD 값을 나타내었지만, 이는 검정에서 덜 강력하였다.

데이터로 나타난 바와 같이, 모든 새로운 dAb는 인간 및 사이노몰구스 IL-13 간에 교차-반응성이며, 시험한 모든 형태의 IL-13의 중화를 보여주었다. 모든 새로운 dAb(DOM10-53-616 제외)는 인간, 사이노몰구스 및 레수스 IL-13에 대하여 DOM10-53-474보다 훨씬 더 큰 중화력을 보여주었다. DOM10-53-567은 사이노몰구스 및 레수스 IL-13에 대하여 DOM10-53-474보다 훨씬 더 강력한 중화제였으며, 인간 IL-13에 대해서는 대략적으로 유사하였다.

실시예 4: 새로운 dAb 의 프로테아제 안정성

동시 계류중인 특허 출원 제PCT/GB2008/050399호 및 제PCT/GB2008/050405호에 일반적으로 기재된 기법을 사용하여 새로운 dAb의 프로테아제 안정성을 평가하였으며, 이 개시물은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어, 본 발명의 dAb, 리간드 및 조성물의 프로테아제 내성의 시험 방법의 상세사항을 제공하며, 본 명세서에 이러한 본 발명의 프로테아제-내성 dAb의 이용 방법의 명시적인 개시물을 제공한다.

본 DOM10 클론의 트립신 안정성을 평가하기 위하여, 0.3 ㎎/㎖의 정제된 단백질을 PBS 완충액 중에 25:1의 dAb:트립신 비로 시퀀싱(sequencing) 등급의 트립신(Promega)을 사용하여 분해하였다. 반응을 30 ℃에서 0, 1, 4 및 24 시간 동안 수행하고, 프로테아제 억제제(Complete protease inhibitor tablets, Roche) 칵테일(cocktail)을 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 추가의 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다.

분해된 단백질을 HBS 완충액에 1/400으로 희석하고, 50 ㎕/분의 유속에서 비아코어 상의 150Ru 비오티닐화된 인간 IL-13 스트렙트아비딘 칩 위로 통과시켜, 분해되지 않은 dAB의 양을 평가하였다. 각 주입 사이클 사이에, 10 ㎕의 0.1 M 글리신 pH 2를 사용하여 칩 표면을 재생시켰다. 각 시점에서 분해되지 않은 dAb의 최대 Ru를 분해된 dAb의 최대 RU와 비교함으로써, 분해되지 않은 dAb의 백분율을 계산하였다. 결과를 도 5에 제시하였다. 시험한 dAb 중에 DOM10-53-567이 다른 dAb에 비하여 트립신 절단에 더 내성이 있었으며, DOM10-53-474의 내성과 더 유사하였다. DOM10-53-546 및 DOM10-53-616은 다른 dAb에 비하여 트립신 절단에 덜 내성이 있었다. 본 발명자들은 dAb가 프로테아제에 의해 덜 절단되는 경향이 있을 것이며, 이에 따라 반감기가 더 길기 때문에, 트립신 분해에 대한 내성이 생체 내에서의 dAb의 안정성을 나타내는 것으로 생각한다.

실시예 5: DSC (시차주사열량계)

dAb의 열 안정성을 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 결정하였다. dAb를 PBS 완충액 중에 1 ㎎/㎖로 시험하였다. 단백질을 PBS 완충액에 밤새 투석시켰다. PBS 완충액을 모든 샘플에 대한 참조로 사용하였다. 180℃/시간의 가열 속도로 모세관 셀 미세열량계 VP-DSC(Microcal, MA, USA)를 이용하여 DSC를 수행하였다. 통상적인 스캔은 보통 참조 완충액 및 단백질 샘플 둘 모두에 대해 25-90℃였다. 각각의 참조 완충액 및 샘플을 짝지은 후, 모세관 셀을 수중 1% 데콘(Decon)의 용액으로 세척한 후, PBS로 세척하였다. 생성된 데이터 결과를 오리진 7 마이크로칼(Origin 7 Microcal) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 참조 완충액으로부터 수득된 DSC 결과를 샘플 결과로부터 감산하였다. 샘플의 정확한 몰 농도를 데이터 분석 경로에 기입하여, 용융 온도(Tm), 엔탈피(ΔH) 및 반트 호프(van't Hoff) 엔탈피(ΔHv) 값을 생성시켰다. 데이터를 비-2-상(non-2-state) 모델로 핏팅시켰다. 결과를 표 1에 요약하였다. dAb의 용융 온도(Tm)는 49.9 ℃ 내지 55.5 ℃ 범위였다. DOM10-53-546 및 DOM10-53-567은 각각 55.5 ℃ 및 54.5 ℃의 가장 높은 Tm 값을 나타내었다. 시험한 dAb 중에, DOM10-53-567은 가장 높은 역가를 갖는 것으로부터 이익을 얻을 뿐 아니라, 상당히 높은 Tm을 나타내었으며, 이는 dAb의 상당히 높은 안정성을 나타내는 것으로 여겨진다. 이는 효능을 최대화하는 생체 내 온도에서 더욱 안정할 것이며, 우수한 보관 수명을 가질 것이기 때문에, 유익할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Rudolf M de Wildt Inusha De Silva Milan Ovecka <120> LIGANDS THAT BIND IL-13 <130> DB00062 WO <140> PCT/EP2008/067789 <141> 2008-12-17 <150> USSN 61/118013 <151> 2008-11-26 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence derived from Homo sapiens sequence <400> 1 Gly Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Trp Tyr 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Trp His Gly Glu Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ala Glu Asp Glu Pro Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial 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<220> <223> Artificial sequence derived from Homo sapiens sequence <400> 31 Ser Ile Asp Trp Lys Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence derived from Homo sapiens sequence <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> /replace = Lys <400> 32 Ser Ile Asp Trp His Gly Lys Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence derived from Homo sapiens sequence <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 1 5

Claims

DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖는 것을 제외하고, DOM10-53-474와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서,
카바트(Kabat) 넘버링(numbering)에 따른 위치 28에 발린을 가지며, DOM10-53-616(서열 번호 5)이 아닌, 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비해 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변화를 갖는 것을 제외하고, DOM10-53-474와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서,
서열 XGX'X"를 가지며, 여기서 G는 카바트 넘버링에 따른 위치 54에 있고,
X는 H 또는 K이며,
X'는 G 또는 K이고,
X"는 K 또는 I이며,
DOM10-53-616(서열 번호 5)이 아닌, 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
제2항에 있어서, 카바트 넘버링에 따른 위치 28에 발린을 갖는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 30, 53, 55 및 56(카바트 넘버링에 따른) 중 하나 이상에서 아미노산 변화(DOM10-53-474(서열 번호 1)에 비한)를 갖는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 30(카바트 넘버링에 따른)에 프롤린을 갖는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 53(카바트 넘버링에 따른)에 라이신을 갖는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 55(카바트 넘버링에 따른)에 글리신 또는 라이신을 갖는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 56(카바트 넘버링에 따른)에 아이소류신 또는 라이신을 갖는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 55(카바트 넘버링에 따른)에 라이신 및 위치 56(카바트 넘버링에 따른)에 아이소류신을 갖는, 단일 가변 도메인.
DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); 또는 DOM10-53-568(서열 번호 4)인, 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); 또는 DOM10-53-568(서열 번호 8)의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된, 항-인터루킨-13(IL-13) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) 및 레수스(rhesus) IL-13에 특이적으로 결합하는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 표준 HEK STAT 검정에서 0.1 내지 2.0 nM의 EC₅₀으로 인간 IL-13을 중화시키는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표준 HEK STAT 검정에서 1 내지 20 nM의 EC₅₀으로 레수스 IL-13을 중화시키는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 표준 HEK STAT 검정에서 1 내지 20 nM의 EC₅₀으로 사이노몰구스 원숭이 IL-13을 중화시키는, 단일 가변 도메인.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-13 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는, 인터루킨-13(IL-13) 길항제.
제16항에 있어서, IL-13에 결합하기 위해 DOM10-53-546(서열 번호 2); DOM10-53-567(서열 번호 3); DOM10-53-568(서열 번호 4); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)과 경쟁하는, 길항제.
폐 전달을 위한 제16항 또는 제17항의 길항제, 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하는 인터루킨-13(IL-13) 길항제.
폐 전달용 약제의 제조에서의 제16항 또는 제17항의 길항제, 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하는 인터루킨-13(IL-13) 길항제의 용도.
제16항 또는 제17항에 있어서, 인간에서의 IL-13-매개 질환의 치료법 또는 예방을 위한, 길항제.
인간에서 IL-13-매개 질환의 치료법 또는 예방용 약제의 제조에서의 제16항 또는 제17항의 길항제의 용도.
제16항 또는 제17항의 길항제 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하는 인터루킨-13(IL-13) 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서의 IL-13-매개 질환의 치료 및/또는 예방 방법.
IL-13-매개 질환이 호흡기 질환인, 제20항의 길항제, 제21항의 용도 또는 제22항의 방법.
제23항에 있어서, IL-13-매개 질환이 폐 염증, 만성 폐쇄폐병, 천식, 폐렴, 과민성 폐간질염, 호산구증가증을 갖는 폐 침윤물, 환경성 폐질병, 폐렴, 기관지 확장증, 낭성 섬유증, 간질성 폐질병, 원발성 폐고혈압, 폐혈전색전증, 늑막 장애, 종격 장애, 횡경막 장애, 호흡저하, 과다호흡, 수면 무호흡, 급성 호흡곤란 증후군, 중피종, 육종, 이식거부, 이식편대숙주병, 폐암, 알러지성 비염, 알러지, 석면증, 아스페르길루스종, 아스페르길루스증, 기관지확장증, 만성 기관지염, 폐기종, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 침습성 폐렴구균 질병, 인플루엔자, 비결핵성 미코박테리아, 흉막삼출, 진폐증, 뉴모시스티스병, 폐렴, 폐방선균증, 폐포단백증, 폐탄저병, 폐부종, 폐색전, 폐염증, 폐 조직구증 X, 폐고혈압, 폐 노카르디아증, 폐결핵, 폐정맥폐쇄병, 류머티스성 폐질병, 사르코이드증 및 베게너 육아종증으로부터 선택되는, 길항제, 용도 또는 방법.
제16항, 제17항, 제18항, 제20항, 제23항 또는 제24항의 길항제, 또는 DOM10-53-616(서열 번호 5)을 포함하는 인터루킨-13(IL-13) 길항제를 함유하는, 폐 전달 장치.
제25항에 있어서, 흡입기 또는 비강내 투여 장치인, 장치.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 가변 도메인을 포함하는, 이중 특이적 리간드.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는, 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
제28항에 있어서, DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); DOM10-53-568(서열 번호 8); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
DOM10-53-546(서열 번호 6); DOM10-53-567(서열 번호 7); DOM10-53-568(서열 번호 8); 또는 DOM10-53-616(서열 번호 9)의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, IL-13에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는, 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
제28항, 제29항 또는 제30항의 핵산을 포함하는, 벡터.
제28항, 제29항 또는 제30항의 핵산, 또는 제31항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
제32항의 숙주 세포를 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 유지시킴으로써, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 생성되는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 생성시키는 방법.
제33항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 분리시키고, 임의로 표준 HEK STAT 검정에서 상기 분리된 폴리펩티드보다 개선된 친화성 및/또는 IL-13 중화에 대한 EC₅₀을 갖는 변이체, 또는, 돌연변이된 변이체를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 제16항, 제17항, 제18항, 제20항, 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 단일 가변 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
제36항의 융합 단백질을 엔코딩하는, 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
항체 불변 도메인을 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 제16항, 제17항, 제18항, 제20항, 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 길항제 또는 제36항의 융합 단백질.
제38항에 있어서, 항체 Fc를 포함하고, 임의로 상기 Fc의 N-말단이 상기 가변 도메인의 C-말단에 연결(임의로, 직접 연결)된, 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질.
가변 도메인이 반감기 연장 부분을 추가로 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 제16항, 제17항, 제18항, 제20항, 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 길항제 또는 제36항의 융합 단백질.
제40항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 폴리에틸렌 글리콜 부분, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린-결합 부분, 또는 생체 내에서 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편인, 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질.
제41항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 혈청 알부민 또는 신생아(neonatal) Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편인, 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질.
제40항에 있어서, 상기 반감기 연장 부분이 dAb, 항체 또는 항체 단편인, 가변 도메인, 길항제 또는 융합 단백질.