KR20110089107A

KR20110089107A - 쿠메스트롤 생산 방법 및 그에 의해 생산된 쿠메스트롤

Info

Publication number: KR20110089107A
Application number: KR1020110009649A
Authority: KR
Inventors: 전희영; 서대방; 조시영; 이상준
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2011-08-04
Also published as: JP5756477B2; WO2011093686A2; WO2011093686A3; JP2013517793A; CN102803501A; KR101326979B1; CN102803501B; US20120289714A1; US8829205B2

Abstract

본 발명은 콩을 발아시키는 발아 공정; 및 콩을 발효시키는 발효 공정을 포함하는 쿠메스트롤 생산 방법과 상기 생산 방법에 의해 생산된 쿠메스트롤을 개시한다.

Description

쿠메스트롤 생산 방법 및 그에 의해 생산된 쿠메스트롤{Method for Producing Coumestrol and Coumestrol Produced by the Same Method}

본 발명은 쿠메스트롤 생산 방법 및 그에 의해 생산된 쿠메스트롤에 관한 것이다.

콩은 영양적 가치가 우수하면서도 다양한 생리 활성을 가진 기능성 물질을 다량 함유하고 있다. 특히 콩에 함유되어 있는 피토에스트로겐(phytoestrogen)은 인간을 비롯한 포유류의 에스트로겐(estrogen)과 그 구조가 유사하기 때문에 호르몬 질환을 예로 들 수 있는 만성 질환을 예방하는 효과가 있다. 일반적으로 이러한 피토에스트로겐의 종류로는 이소플라본(isoflavone), 쿠메스탄(coumestan) 또는 리그난(lignan) 등을 들 수 있다.

본 발명은 쿠메스트롤 생산 방법 및 그에 의해 생산된 쿠메스트롤을 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면은 콩을 발아시키는 발아 공정; 및 콩을 발효시키는 발효 공정을 포함하는 쿠메스트롤 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일측면은 상기 방법에 의해 생산된 쿠메스트롤을 제공한다.

본 발명에 따른 쿠메스트롤 생산 방법은 콩 내 쿠메스트롤의 함량을 높이므로 그로부터 다량의 쿠메스트롤을 높은 수율로 얻을 수 있게 한다. 상기 방법을 통해 고가의 쿠메스트롤을 다량으로 생산할 수 있다. 이렇게 생산한 쿠메스트롤은 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 활용 가능하다.

도 1은 30℃의 자동 수주 장치에서 발아시킨 콩으로부터 추출한 쿠메스트롤 함량(mg/kg 건조중량)을 나타낸 그래프이다;
도 2는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)를 접촉시키고 발아시킨 콩으로부터 추출된 쿠메스트롤 함량(mg/kg 건조중량)을 나타낸 그래프이다;
도 3은 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)를 접촉시키고 30℃ 액체 배지(potato dextrose broth)에서 발아시킨 콩으로부터 추출된 쿠메스트롤 함량(mg/kg 건조중량)을 나타낸 그래프이다;
도 4는 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae)를 접종시키고, 30℃ 액체 배지(potato dextrose broth)에서 발아시킨 콩으로부터 추출된 쿠메스트롤 함량(mg/kg 건조중량)을 나타낸 그래프이다;
도 5는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)를 접종시키고, 30℃ 액체배지(potato dextrose broth)에서 발아시킨 콩으로부터 추출된 쿠메스트롤 함량(mg/kg 건조중량)을 나타낸 그래프이다;
도 6은 콩의 종류에 따른 쿠메스트롤 함량을 나타낸 그래프이다;
도 7은 배지 첨가물에 따른 쿠메스트롤 함량을 나타낸 그래프이다;
도 8은 균주 처리 농도에 따른 쿠메스트롤 함량을 나타낸 그래프이다; 및
도 9는 최적 조건을 조합하여 공정을 진행한 후 쿠메스트롤 함량을 나타낸 그래프이다.

쿠메스트롤(CMS, 3,9-dihydroxy-6H-benzofuro(3,2-c)(1)benzopyran-6-one C₁₅H₈O₅, MW: 268.2)은 천연 에스트로겐인 에스트라디올(estradiol) 또는 스틸베스트롤(stilbestrol)과 구조적으로 유사한 쿠마린(coumarin) 유사 화합물로서, 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는다.

쿠메스트롤의 에스트로겐 활성(estrogen activity)은 기존에 에스트로겐 활성 효과가 있다고 알려진 이소플라본(isoflavone)과 비교하여 30-100 배 이상 높아, 자궁암, 골수암, 유방암 또는 뇌암, 갱년기 증상 등을 완화시키는데 있어 매우 유용하다. 이러한 에스트로겐 활성 관련 기능은 쿠메스트롤의 상기와 같은 구조 덕분으로 여겨지고 있다.

쿠메스트롤은 콩 또는 콩과 식물 원물 내에 극히 미량이거나 거의 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 활용 가치는 매우 높지만 콩에 극미량으로 포함되어 있어서 그 활용이 제한되어 있던 쿠메스트롤을 효율적으로 생산할 필요가 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 콩은 쿠메스트롤을 합성하는 콩과 식물이라면 특별한 제한없이 사용 가능하다. 예를 들어, 본 발명에서 사용될 수 있는 콩의 종류는, 장류 및 두부용, 나물용, 밥밑용 또는 풋콩용 품종일 수 있다. 장류 및 두부용 품종으로는, 대풍(大豊), 호장(湖醬), 장원(壯元), 대황(大潢), 소담, 송학(松鶴), 대원(大元), 진품(眞品), 단백(蛋白), 두유(豆油), 신팔달(新八達), 태광(太光), 만리(萬里), 장수(長壽), 무한(無限), 백운(白雲), 새알, 황금(黃金) 및 장엽(長葉) 등이 있다. 나물용 품종으로는, 신화콩, 소원콩, 안평(安平), 서남(西南), 다채(多彩), 소록(小綠), 소호(小湖), 소명(疏明), 다원(多元), 풍산(豊産)나물, 익산(益山)나물, 소백(小白)나물, 광안(光安), 단엽(短葉) 및 은하(銀河) 등이 있다. 밥밑용 품종으로는, 청자(靑磁), 흑청(黑靑), 갈미(褐味), 선흑(鮮黑), 검정콩 및 일품(一品)검정콩 등이 있다. 또한, 풋콩용 품종으로는, 다올, 신록(新綠), 새을, 검정을, 석량(夕凉)풋콩, 화엄(華嚴)풋콩 및 큰을 등이 있다.

본 발명의 다른 일측면에서, 콩은 발아가 가능하고 병충해에 강한 품종인 것이 바람직하다. 그와 같은 콩으로는, 예를 들어 신화콩, 소원콩, 안평(安平), 서남(西南), 다채(多彩), 소록(小綠), 소호(小湖), 소명(疏明), 다원(多元), 풍산(豊産)나물, 익산(益山)나물, 소백(小白)나물, 광안(光安), 단엽(短葉) 및 은하(銀河) 등이 있다.

본 발명의 일측면에 따른 쿠메스트롤 생산 방법은 콩을 발아시키는 발아 공정을 포함한다. 상기 발아 공정은 콩의 적어도 일부를 산소 또는 공기와 접촉시켜 진행될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 쿠메스트롤 생산 방법은 콩을 발효시키는 발효 공정을 포함한다. 쿠메스트롤은 콩과 식물이 곰팡이나 병원성 세균 등과 같은 미생물로부터 공격받을 때 자신을 보호하기 위해 합성하는 피토알렉신(phytoalexin)의 일종으로 알려져 있다. 즉, 콩에 진균, 효소 또는 유산균을 예로 들 수 있는 미생물을 접촉시키면 이들이 쿠메스트롤 합성 유도 인자(elicitor)로 작용하여 콩 내 쿠메스트롤 함량을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 콩의 적어도 일부를 미생물과 접촉시켜 진행되는 발효 공정을 통해 콩의 쿠메스트롤 함량을 높일 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 발효 공정은 콩에 미생물을 1 내지 10회, 구체적으로 1 내지 5회, 더 구체적으로는 1 내지 3회 접종시켜 진행될 수 있다. 이러한 과정을 통해 미생물이 콩에 보다 잘 접촉될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 쿠메스트롤 생산 방법에서, 상기 발아 공정과 발효 공정이 동시에 또는 순차적으로 진행될 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 발아 공정과 발효 공정이 동시에 진행되는 경우 콩을 미생물과 접촉시킨 상태에서 산소 또는 공기와 접촉시키는 방법으로 진행될 수 있다. 구체적으로, 상기 콩을 상기 미생물을 포함하는 배지에 침지시킨 상태에서 상기 산소 또는 공기와 접촉시켜 진행될 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 미생물은 쿠메스트롤 생산 유도 인자(elicitor)로 작용할 수 있다면, 제한 없이 적용 가능하다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 미생물은 진균, 효모 또는 유산균일 수 있으며, 구체적으로 상기 진균은 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium) 또는 모나스커스(Monascus ) 속의 미생물일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 미생물은 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 열거된 미생물들은 콩의 쿠메스트롤의 생산량을 높이는데 적합하다.

본 발명의 일측면에서, 미생물 포자의 서스펜션 용액을 콩의 떡잎 표면에 도포함으로써 콩에 미생물을 접촉시킬 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 미생물 파우더를 콩이 포함된 배지에 가함으로써 미생물을 콩에 접촉시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 배지 중량을 기준으로 0.05 내지 2 중량%, 구체적으로는 0.75 내지 2 중량%, 더 구체적으로는 1.0 내지 2.0 중량%의 미생물을 접촉시킬 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 발아 공정 및 발효 공정 중 하나 이상의 공정의 조건은 발아 및 발효가 지속적으로 이루어질 수 있는 조건이라면 특별히 제한되지 않는다. 발아 또는 발효 공정 조건의 예시는 다음과 같다.

본 발명의 일측면에서, 발아 공정 및 발효 공정 중 하나 이상의 공정은 반응기 내에서 진행될 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 공정은 반응기 부피 대비 20 내지 80 부피%, 구체적으로 40 내지 60 부피%, 더 구체적으로는 45 내지 55 부피%의 배지를 포함하는 반응기 내에서 진행될 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 배지는 발아 및 발효가 원활히 이루어질 수 있는 배지라면 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로 액체 영양 배지, 더 구체적으로 PDB 배지(potato dextrose broth)를 예로 들 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 배지는 배지 전체 중량 대비 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 5 중량%, 더 구체적으로는 0.5 내지 2 중량%의 당(糖)류를 포함할 수 있다. 이 때 당류는 일반적인 단당류, 이당류 또는 다당류를 모두 포함하며, 수크로오스(sucrose), 글루코오스(glucose) 또는 SRT를 예로 들 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 공정은 반응기 부피 대비 1 내지 50 부피%, 구체적으로 5 내지 20 부피%, 더 구체적으로 6 내지 12 부피%의 콩을 반응기에 접종하여 진행될 수 있다. 이 때 공정을 거치는 전체 콩 중 적어도 일부의 콩은 배지에 침수되도록 하고 일부는 배지에 침수되지 않도록 할 수 있다. 콩이 완전히 외부로 노출된 상태에서는 급수 과정에서 콩을 발효시키기 위해 접촉시킨 미생물이 씻겨 나갈 우려가 크고, 반대로 완전히 침수된 상태에서는 발아시킨 콩이 부패될 수 있기 때문이다.

본 발명의 일측면에서, 상기 공정은 산소 또는 공기를 최대로 공급하면서 진행될 수 있다. 예를 들어 5000ml 반응기에서 공정이 진행되는 경우 2,500vvm/m, 3L 반응기에서 공정이 진행되는 경우 15,000vvm/m으로 산소 또는 공기를 공급할 수 있다. 이와 같이 충분한 산소 또는 공기를 공급함으로써 발아가 원활하게 이루어질 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 공정은 20 내지 35℃, 구체적으로는 20 내지 30℃의 온도에서 진행될 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 공정은 차광 조건 하에서 진행될 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 공정은 2 내지 10일간 진행될 수 있다. 예를 들어, 발아 공정이 2일간 진행된 후, 발아 공정 및 발효 공정이 동시에 6 내지 8일간 진행될 수 있다.

상기와 같은 조건의 발아 공정 및 발효 공정을 통해 콩 내 쿠메스트롤 함량이 효과적으로 증진될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 쿠메스트롤 생산 방법은 발아 공정 이전에, 콩을 멸균수, 에탄올 및 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 중 하나 이상, 바람직하게는 멸균수로 세척하는 살균 공정을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 쿠메스트롤 생산 방법은 발아 공정 및 발효 공정 이후, 발아 및 발효시킨 콩에서 쿠메스트롤을 추출하는 추출 단계를 더 포함할 수 있다. 상기에서 추출은 당업계에 통상적인 방법으로 이루어질 수 있으며, 구체적으로 알코올, 더 구체적으로 에탄올 추출법으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일측면은 상기 쿠메스트롤 생산 방법에 의해 생산된 쿠메스트롤을 제공한다. 상기 쿠메스트롤은 약학, 식품 또는 화장품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다. 본 발명의 다른 일측면은 상기 쿠메스트롤을 유효 성분으로 포함하는 약학, 식품 또는 화장품 조성물을 제공한다.

이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실험예 1 내지 6] 콩의 발아 및 발효 실험

본 실험에 사용된 콩은 나물콩에 해당하는 글리신 맥스(Glycine max (L.) Merrill) 품종 두 가지(Glycine max (L.) Merrill variety 1(이하 ‘품종 1’이라 함) & variety 2(이하 ‘품종 2’라 함))였다. 상기 콩을 발아시킨 후 미생물을 접촉시키고 쿠메스트롤 생산 증대가 유도되는지를 평가하였다. 실험에 사용된 미생물 균주는 진균류에 속하는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger KCCM, 한국 미생물 보존 센터로부터 입수, 분류번호: 11240), 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae KCCM, 한국 미생물 보존 센터로부터 입수, 분류번호: 60354)(non-toxic, food grade) 및 유산균에 속하는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis KCCM, 한국 미생물 보존 센터로부터 입수, 분류번호: 11207)였다. 구체적인 실험 조건은 다음과 같다.

<발아 조건>

온도는 30℃, 습도는 55%로 고정하여 항온 항습기에서 배양하였고, 3 개군 2회 반복 실험을 실시하였으며, 광량은 암실 조건으로 설정하였다. 수주는 타이머를 통해 4시간 간격으로 3분 동안 자동으로 진행되었으며, 발아 용기는 바닥이 망으로 이루어져 물이 밑으로 빠지게 디자인된 자동 수주 장치를 이용하였다.

<미생물 균주의 준비>

1. 진균 (Aspergillus niger, Aspergillus sojae)의 준비

평판 배지(Potato dextrose agar, DifcoTM, BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 균주를 접종시킨 후 2주 동안 37℃에서 배양하여 포자를 충분히 형성하도록 하였다. 멸균된 스패튤라(spatular)를 이용하여 포자를 덜어내어 물에 고르게 분산시켰다. 그런 다음, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 농도를 확인한 후 10⁶ 개/ml 가 되도록 희석하여 포자 서스펜션(suspension)을 준비하였다.

2. 유산균 (Bifidobacterium infantis)의 준비

멸균된 액체 배지(Reinforced clostridial medium, Oxoid LTD., Hampshire, England)에 균을 접종하고 질소 충전 및 밀봉한 후, 37℃에서 1주일간 배양시켜 균주 배양액을 준비하였다.

<발아 및 미생물 처리>

각 실험예 별 발아 및 미생물의 처리 조건은 아래 표와 같다.

번호	처리 조건
실험예 1	자동 수주 장치에서 미생물 접종 없이 8일 동안 발아시켰다(도 1 참조).
실험예 2	자동수주장치에서 2일 동안 발아된 콩의 싹 부위에 포자 서스펜션을 각각 100 ㎕씩 접종하고, 4시간 후에 한번 더 접종하였다. 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 접종 후 2, 4, 6일 동안 자동수주장치에서 추가로 발아시켰다(도 2 참조).
실험예 3	1 ml의 액체 배지 (Potato dextrose broth, DifcoTM, BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)가 담긴 유리병(Ø30 mm x h75 mm)에 100 ㎕의 포자 서스펜션(10⁶ 개/ml, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger))과 표면 살균된 발아콩 4개 씩을 같이 넣고, 30℃에서 2, 4, 6일 동안 추가로 발아시켰다(도 3 참조).
실험예 4	발아시킨 콩을 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae)와 함께 배양한 것을 제외하고는 실험예 3과 실질적으로 동일한 조건으로 실험을 진행하였다(도 4 참조).
실험예 5	발아시킨 콩을 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)와 함께 배양한 것을 제외하고는, 실험예 3과 실질적으로 동일한 조건으로 실험을 진행하였다(도 5 참조).
실험예 6	5 ml의 액체 배지 (Potato dextrose broth, DifcoTM, BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)가 담긴 유리병(Ø30 mm x h75 mm)에 표면 살균된 발아콩 4개를 완전히 침지시키고 100 ㎕의 포자 서스펜션(10⁶ 개/ml)을 넣은 다음, 30℃에서 2, 4, 6일 동안 추가로 발아시켰다.

<쿠메스트롤 함량 분석>

발아된 콩과 배양액에 최종 농도가 80%가 되도록 에탄올을 첨가하여 균질화한 후 쿠메스트롤을 추출하여 분석하였다.

- 컬럼: NOVA-PAK RP18 5 ㎛ (3.9x150 mm)

- 컬럼 온도: 27℃

- 검출기: UVD (260 nm)

- 용매: 1% 아세트산 수용액(acetic acid in water, Acetonitrile gradient)

<실험 결과>

[실험예 1]

실험예 1은 발아만 진행된 경우로서, 도 1에 도시되어 있는 바와 같이 쿠메스트롤이 극히 소량으로 분석되었다.

[실험예 2]

실험예 2는 발아 및 미생물 접종이 모두 수행된 경우이며, 도 2에 도시된 바와 같이, 발아만 진행된 실험예 1에 비해 쿠메스트롤의 생산량이 상대적으로 증가되었음을 알 수 있다.

다만 균주를 싹의 표면에 접종하여, 접종된 균주가 유도 인자(elicitor)로서 효과적으로 작용하지 못하였다. 이는 4시간 간격의 수주에 의해 접종된 미생물이 제대로 생장하지 못하고 대부분 씻겨 제거되었기 때문인 것으로 판단된다. 실제로 8일 동안 자란 발아콩 주변에서 균주의 생장은 관찰되지 않았다.

이를 통해, 미생물이 콩에 효율적인 쿠메스트롤 생산 유도 인자(elicitor)로서의 역할을 수행할 수 있음을 확인하였다. 또한 콩의 생육에 필요한 수분이 적절히 공급되도록 하는 것이 중요하다는 점을 확인하였다.

[실험예 3]

2일 동안 발아시킨 콩을 아스퍼질러스 니거(A. niger)와 함께 배양하였을 때, 도 3에 도시된 바와 같이, 품종 1은 6일째 약 170 mg/kg 건조중량(dry weight)까지, 품종 2는 8일째 82.4 mg/kg 건조중량(dry weight)까지 월등히 쿠메스트롤이 증가됨을 확인하였다. 이는 미생물을 접종시키지 않고 자동수주장치에서 키웠던 실험예 1의 결과인 12.80 mg/kg 건조중량(품종 1), 5.85 mg/kg 건조중량(품종 2)과 비교할 때 약 13배 증가한 수치이다. 상기 결과를 통해 아스퍼질러스 니거(A. niger) 접종이 콩의 쿠메스트롤 생산을 유도함을 확인할 수 있었다.

[실험예 4]

2일 동안 발아시킨 콩을 아스퍼질러스 소재(A. sojae)와 함께 배양하였을 때, 도 4에 도시된 바와 같이, 품종 1은 72.04 mg/kg 건조중량, 품종 2는 81.63 mg/kg 건조중량의 쿠메스트롤을 생산하였다. 이 역시 실험예 1에 비해 월등히 쿠메스트롤 생산을 증가시켰으나, 아스퍼질러스 니거(A. niger)에 비해서는 그 효과가 다소 낮은 것으로 나타났다. 이를 통해 균주의 종류에 따라 콩의 쿠메스트롤 생산에 차이가 있음을 알 수 있었다.

[실험예 5]

유산균의 일종인 비피도박테리움 인판티스(B. infantis)와 콩을 4일 동안 함께 배양하였을 때, 도 5에 도시한 바와 같이, 품종 1의 쿠메스트롤 함량은 82.85 mg/kg 건조중량, 품종 2의 쿠메스트롤 함량은 45.1 mg/kg 건조중량인 것으로 나타났다. 이 경우에도 쿠메스트롤 생산이 증가함을 확인할 수 있었다.

[실험예 6]

본 실험 조건에서는 콩이 배지에 완전히 침지되어 원활한 발아가 일어나지 못하였다. 더욱이, 처리한 미생물에 의해 부패가 진행되었으며, 쿠메스트롤은 전혀 검출되지 않았다.

[실험예 7] 적합한 대량 생산 조건

1. 방법

대용량 바이오 반응기(bioreactor)를 이용하여 여러 조건을 달리하며 쿠메스트롤을 대량 생산하였다. 먼저 모든 기구를 미생물 접종 전에 121℃ 고압 멸균기로 멸균하여 준비하였다. 콩은 풍산 나물콩 또는 소원콩을 이용하였다. 콩의 종자를 멸균수, 에탄올 및 차아염소산 나트륨(sodium hypochlirite) 중 하나 이상으로 2회 세척 살균하였다. 각각 1% 수크로오스(sucrose), 1% 글루코오스(glucose) 및 1% SRT 중 하나 이상을 포함하는 배지를 반응기 부피 대비 20 내지 80 부피%의 양으로 준비하였다. 콩의 종자는 반응기 부피 대비 3 내지 12 부피%의 밀도로 접종하였다. 배지와 콩의 종자를 포함하는 반응기에서 온도 20 내지 30℃, 빛 또는 차광, 공기 공급 15000vvm/m 조건 아래 각각 콩의 종자를 발아시켰다.

발아 2일차에 콩에 싹이 트기 시작하면 배지 전체 중량 대비 0 내지 1.25 중량%의 균주(아스퍼질러스 오리자에, Aspergillus oryzae)(㈜ 메디오젠으로부터 입수, 1×10⁹ CFU/g 아스퍼질러스 오리자에)를 배지에 넣고 8일차까지 배양하였다.

이후 배양한 콩과 배지의 쿠메스트롤을 추출하여 함량 분석하였으며, 그 분석 방법은 상기 실험예 1 내지 6과 같다.

2. 결과

(1) 콩의 종류에 따른 결과

콩의 종류에 따른 쿠메스트롤 함량을 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 일 실시예에 적용되는 풍산 나물콩은 발아 조건 하에서 약 33.8㎍/g의 함량으로 쿠메스트롤이 관찰되었으며, 또한 소원콩은 발아 조건 하에서 약 196㎍/g의 함량으로 쿠메스트롤이 관찰되었다. 자연적으로 발생되는 콩 중 쿠메스트롤 양이 5㎍/g 이하인 것을 감안한다면, 본 발명의 일 실시예에 적용되는 콩의 경우 상대적으로 대량의 쿠메스트롤을 생산할 수 있음을 알 수 있다.

(2) 배지 첨가물에 따른 결과

각각 1% 수크로오스(sucrose), 1% 글루코오스(glucose) 및 1% SRT 중 하나 이상을 첨가한 배지에 따른 쿠메스트롤 함량을 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인할 수 있듯이, 첨가물을 첨가한 경우 모두 무처리군에 비해 많은 쿠메스트롤을 생산할 수 있었으며, 특히 1% 수크로오스를 첨가하는 경우 가장 많은 쿠메스트롤을 생산할 수 있었다. 이는 상기 첨가물들이 균 성장을 균일화하여 유도 인자로서 일정하게 작용할 수 있도록 하기 때문으로 여겨진다.

(3) 균주 처리 농도에 따른 결과

유도 인자(elicitor)로 작용하는 미생물 균주의 처리 농도에 따른 쿠메스트롤 함량을 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인할 수 있듯이, 미생물 균주의 처리 농도가 일정 이상인 경우 그 처리 농도가 높아질수록 더 많은 쿠메스트롤 생산이 가능하였다. 특히, 미생물 균주 처리 농도가 1.25 중량%인 경우 무처리군에 비해 11배 가량 높은 쿠메스트롤 생산을 나타내었다. 한편, 미생물 균주를 2 중량% 이상 처리하는 경우 발아는 진행되지 않고 발효만이 진행되어 2 중량% 이하의 농도로 미생물 균주를 처리하는 것이 적절함을 확인할 수 있었다.

(4) 최적 조건 조합 결과

상기 여러 조건들 중 최적의 조건을 조합하여 쿠메스트롤 생산 정도를 확인하였다. 그 최적 조건은 아래 표와 같다.

	최적 조건
콩의 종류	소원콩
콩 살균제	멸균수
콩 접종 밀도	반응기 부피 대비 10 부피%
배지량	반응기 부피 대비 50 부피%
배지 첨가물	1% 수크로오스
온도 조건	25℃
광도 조건	차광
공기 공급량	최대(3L 반응기의 경우 15,000 vvm/m)

최적 조건을 조합한 경우 쿠메스트롤 함량을 도 9에 나타내었다. 도 9에서 확인할 수 있듯이, 상기 최적 조건 하에서는 그렇지 않은 경우에 비해 8배 이상 많은 쿠메스트롤을 생산할 수 있다.

이상의 결과로부터, 콩을 발아 및 미생물을 이용하여 발효시킴으로써 그에 포함된 쿠메스트롤 함량을 높일 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 상업적으로 유용한 대량 생산에 적합한 발아 및 발효 공정 조건이 있음을 확인할 수 있다.

Claims

콩을 발아시키는 발아 공정; 및
콩을 발효시키는 발효 공정을 포함하는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 1 항에 있어서,
발아 공정은 콩의 적어도 일부를 산소 또는 공기와 접촉시켜 진행되고,
발효 공정은 콩의 적어도 일부를 미생물과 접촉시켜 진행되는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 1 항에 있어서,
발아 공정과 발효 공정이 동시에 또는 순차적으로 진행되는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 3 항에 있어서,
발아 공정과 발효 공정이 동시에 진행되는 방법은 콩을 미생물과 접촉시킨 상태에서 산소 또는 공기와 접촉시켜 진행되는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 콩을 상기 미생물을 포함하는 배지에 침지시킨 상태에서 상기 산소 또는 공기와 접촉시켜 진행되는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 2 항에 있어서,
미생물은 진균, 효모 또는 유산균을 포함하는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 6 항에 있어서,
진균은 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium) 또는 모나스커스(Monascus ) 속을 포함하는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 2 항에 있어서,
미생물은 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 쿠메스트롤 생산 방법.
제 1 항에 있어서,
발아 공정 및 발효 공정 중 하나 이상의 공정은 반응기 전체 부피 대비 20 내지 80 부피%의 배지를 포함하는 반응기 내에서, 반응기 전체 부피 대비 1 내지 50 부피%의 콩으로 진행되는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 9 항에 있어서,
배지는 배지 전체 중량 대비 0.001 내지 10 중량%의 당류를 포함하는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 1 항에 있어서,
발아 공정 및 발효 공정 중 하나 이상의 공정은 20 내지 35℃의 온도 및 암(巖) 조건에서 2 내지 10일간 진행되는 쿠메스트롤 생산 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 쿠메스트롤.