KR20110083919A - Multi-conjugate of sirna targeting multiple genes and preparing method thereof - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A siRNA multi-conjugate which targets multiple genes and a method for preparing the same are provided to improve gene delivery efficiency and to deliver siRNA of various sequences to cells. CONSTITUTION: A siRNA multi-conjugate which targets multiple genes has a structure formula 1(-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - ... - (Xi-A)ni-) or 2(x - A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 -...- (Xi-A)ni - x') which is connected through covalent bond of two or more kinds of double strand sense/antisense siRNA monomer with a crosslinking agent or polymers. The double strand sense/antisense siRNA monomer has 15-29 bases. The siRNA multi-conjugate targets surviving and Bcl-2. The multi-conjugate further contains a cell selective ligand at the end.

Description

복합 유전자를 표적하는 ｓｉＲＮＡ 다중 접합체 및 이의 제조방법{Multi-conjugate of siRNA targeting multiple genes and preparing method thereof} Multi-conjugate of siRNA targeting multiple genes and preparing method etc.

본 발명은 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to siRNA multiple conjugates that target complex genes and methods for their preparation.

작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)는 19 ~ 22개의 핵산으로 구성된 이중나선 구조의 짧은 RNA로서, 그의 센스 가닥과 염기 서열이 동일한 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA)와 결합되면 RNA유도침묵복합체(RNA induced silencing complex, RISC)가 결합된 mRNA를 분해시킴으로써 특정 단백질의 발현을 저해하는 것으로 알려져 있다(Elbashir, S. M. et al., 2001, Nature 411, 494-8). 적은 양으로도 효과적이고 정확하게 서열이 동일한 mRNA의 발현을 억제하는 이러한 siRNA의 성질을 이용하여 유전자 관련 질병 치료에 다양한 가능성이 연구되어 왔으며 siRNA를 이용한 치료약 개발 시장은 그 규모가 해마다 비약적으로 증가하고 있다.
Small interfering RNA (siRNA) is a double-stranded short RNA composed of 19 to 22 nucleic acids. When the sense strand and base sequence are combined with the same messenger RNA (mRNA), an RNA-induced silencing complex ( RNA induced silencing complex (RISC) is known to inhibit the expression of specific proteins by degrading the bound mRNA (Elbashir, SM et al., 2001, Nature 411 , 494-8). Various possibilities have been studied for the treatment of gene-related diseases by using the siRNA properties that effectively and precisely suppress the expression of mRNAs having the same sequence, and the market for drug development using siRNAs is increasing rapidly each year. .

최근 들어 효과적인 치료 효과를 위해 여러 종류의 mRNA를 표적으로 하는 siRNA들을 조합하여 동시에 세포 내로 전달시켜 그 효과를 확인하는 연구도 진행되고 있는데, 이는 유전자 변형 빈도가 비교적 높은 바이러스를 중심으로 이루어져 왔으나(Schuck, S. et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101(14), 4912-7) EGFR 또는 CD4/8 등에도 적용되어 향상된 치료 효과를 확인하였다(McManus, M. T. et al., 2002, J Immunol . 169(10), 5754-60).
Recently, a combination of siRNAs targeting different types of mRNAs for effective therapeutic effects and delivery into cells at the same time have been conducted to confirm the effects, but this has been centered on viruses with relatively high genetic modification frequency (Schuck). , S. et al., 2004, Proc Natl Acad Sci US A. 101 (14) , 4912-7) was also applied to EGFR or CD4 / 8 to confirm the improved therapeutic effect (McManus, MT et al., 2002, J Immunol . 169 (10) , 5754-60). .

한편, siRNA의 효소 불안정성과 열악한 세포 투과성 등은 실제 임상치료에 적용하는데 있어서 큰 장애가 되어왔으며, 이를 해결하기 위해 다양한 전달체의 개발 및 siRNA 자체에 다양한 분자의 접합 등이 연구되고 있다. 효소에 직접적으로 노출되는 것을 예방하고 세포 투과성을 증가시키기 위해 음이온성의 siRNA에 양이온성 고분자 또는 지질 분자, 및 펩타이드를 전기적 인력으로 결합시켜 전체적으로 양이온 성질을 가지는 나노 크기의 복합체를 형성하여 siRNA를 효소로부터 보호하고 동시에 음이온 성질을 가지는 세포막과의 상호작용을 향상시켜 세포 내 전달 효율을 증가시키는 연구가 대표적이라 할 수 있다. 그러나, siRNA는 분자량이 15000 이하 정도로 작으며 RNA 특유의 뻣뻣한 구조를 가지고 있어서 양이온성 고분자와 안정된 복합체를 이루는데 어려움이 있으므로, 기존에 개발된 다양한 유전자 전달체를 이용하는데 한계가 있다.
On the other hand, the enzyme instability and poor cell permeability of siRNA has been a major obstacle in the application of the actual clinical treatment, to solve this, the development of various carriers and the conjugation of various molecules to siRNA itself. In order to prevent direct exposure to enzymes and increase cell permeability, cationic polymers or lipid molecules and peptides are coupled to anionic siRNAs by electrical attraction to form nanoscale complexes with cationic properties as a whole. The study of increasing the intracellular delivery efficiency by protecting and improving the interaction with the anion cell membrane is representative. However, siRNA has a molecular weight of less than 15000 and has a stiff structure unique to RNA, making it difficult to form stable complexes with cationic polymers. Therefore, there are limitations in using various gene carriers previously developed.

이에, 본 발명자들은 안정성 및 전달효율이 증가하는 동시에, 여러 종류의 mRNA를 표적할 수 있는 siRNA를 개발하고자 연구한 결과, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 개발하였다. siRNA만을 이용하여 다중 접합체를 제조함으로써 생체 적합성이 뛰어나고, 본래의 siRNA의 유전자 저해 기능에는 영향을 미치지 않으며, 안정성 및 다양한 유전자 전달체와의 결합력이 증진되며, 두 종류 이상의 복합 유전자를 동시에 표적할 수 있는 다양한 서열의 siRNA를 세포에 동시에 전달하여 각 서열에 특이적이고 복합적으로 저해 기능을 수행함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have developed siRNA multiple conjugates that target complex genes as a result of increasing the stability and delivery efficiency while researching to develop siRNAs capable of targeting various mRNAs. The production of multiple conjugates using only siRNA is highly biocompatible, does not affect the gene inhibitory function of the original siRNA, enhances stability and binding ability with various gene carriers, and can target two or more complex genes simultaneously. The present invention was completed by confirming that siRNAs of various sequences were simultaneously delivered to cells to perform specific and complex inhibitory functions for each sequence.

본 발명의 목적은 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide siRNA multiple conjugates targeting the complex genes and methods for their preparation.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 가지는, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention is to connect two or more types of double-stranded sense / antisense small interfering RNA (siRNA) monomers directly or through covalent linkage through a crosslinking agent or a polymer Provided are siRNA multiple conjugates targeting complex genes having the following [formula 1] or [formula 2]:

[구조식 1][Formula 1]

-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni- -(X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni-

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수),
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more),

[구조식 2][Formula 2]

x-A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni - x'xA- (X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -x '

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

x와 x'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체;x and x 'are single stranded sense / antisense siRNA monomers;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수).n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more).

또한, 본 발명은 두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 가지는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention targets a complex gene having the following [formula 1] or [formula 2] prepared by the step of covalently binding two or more double-stranded sense / antisense siRNA monomers directly or via a crosslinking agent or a polymer Methods of making siRNA multiple conjugates are provided:

[구조식 1][Formula 1]

-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni- -(X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni-

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수),
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more),

[구조식 2][Formula 2]

x-A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni - x'xA- (X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -x '

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

x와 x'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체;x and x 'are single stranded sense / antisense siRNA monomers;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수).n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more).

또한, 본 발명은 상기의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체; 및 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 양이온성 유전자 전달체; 간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 이온 복합체를 제공한다.In addition, the present invention is siRNA multiple conjugate targeting the complex gene; And a cationic peptide selected from the group consisting of cationic peptides, cationic lipids and cationic polymers; It provides an ionic complex formed by the ionic interaction of the liver.

아울러, 본 발명은 상기의 이온 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering the above ionic complex to a subject.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 제조방법에 따라 두 종류 이상의 siRNA를 화학적 방법으로 결합시켜 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 효과적이고 간단하게 생산할 수 있으며, 상기의 방법으로 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 기존의 siRNA에 비해 음이온 전하밀도가 수배 증가되어 양이온성 유전자 전달체와 효과적으로 결합함으로써 유전자 전달효율을 향상시키고 다양한 서열의 siRNA를 세포에 동시에 전달하여 각 서열의 특이적/복합적 기능을 수행할 수 있으므로, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체로서 유용하게 이용될 수 있다.
According to the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, by combining two or more types of siRNA chemically, the siRNA multiple conjugate targeting the complex gene can be effectively and simply produced, and the complex gene prepared by the above method The siRNA multiple conjugate that targets is increased anion charge density by several times compared to the existing siRNA to effectively combine with the cationic gene carrier to improve gene transfer efficiency and to deliver the siRNA of various sequences to the cell at the same time specific / complex of each sequence Since it can perform a function, it can be usefully used as an siRNA multiple conjugate targeting a complex gene.

도 1은 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 제조방법의 개요를 나타낸 그림이다:
A : 이중가닥 말단에 같거나 다른 관능기로 치환된 두 종류의 siRNA 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시켜 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체; 및
B : 한쪽 말단이 같거나 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 하여 다른 서열의 단일가닥 siRNA 단량체와 공유결합시켜 2중량체를 제조한 다음, 이를 상보적으로 수소결합 시켜서 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체.
도 2는 센스 및 안티센스 모두 3' 말단이 설프하이드릴기로 치환된 이중가닥의 GFP siRNA 및 VEGF siRNA를 가교제를 이용하여 제조된 각각의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다:
A : 센스 및 안티센스 모두 3' 말단이 설프하이드릴기로 치환된 이중가닥의 GFP siRNA 및 VEGF siRNA를 가교제를 이용하여 제조한 각각의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 전기영동을 통해 확인한 결과{(a): 가교제로서 분해성의 이황화결합을 생성하는 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME)을 이용, (b): 가교제로서 비분해성의 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜(1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2)를 이용}; 및
B : 센스 3' 말단이 모두 설프하이드릴기로 치환된 GFP 단일가닥 siRNA 및 GFP 단일가닥 siRNA를 가교제를 이용하여 두 가지 서열이 접합된 siRNA 2중량체를 제조한 다음, 동일한 방법으로 제조된 안티센스 2중량체와 수소결합 시킴으로써 제조한 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 전기영동을 통해 확인한 결과. 도 1의 B에 따라 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체.
도 3은 GFP 및 VEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 하기 <실시예 1> 또는 <실시예 2>에 따라 제조한 후, GFP 단백질을 안정적으로 발현하는 암세포주인 MDA-MB-435에 농도별로 처리하여 세포의 GFP 단백질 발현량(A) 및 VEGF 단백질 발현량(B)을 측정한 그래프이다.
도 4는 하기 <실시예 1>의 방법에 따라 제조된, GFP 및 VEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 MDA-MB-435에 농도별로 처리하여 GFP 및 VEGF 단백질의 발현 정도를 형광분석기(fluorophotometer)(A) 및 ELISA(B)를 이용하여 측정한 그래프이다.
도 5는 하기 <실시예 1>의 방법에 따라 제조된, GFP 및 VEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를, GFP를 안정적으로 발현하는 A549 암세포주(A), 또는 GFP를 안정적으로 발현하는 PC-3 암세포주(B)에 농도별로 처리하여, 감소된 GFP의 발현 정도를 형광분석기(fluorophotometer)를 통해 측정한 그래프이다.
도 6은 하기 <실시예 1>의 방법에 따라 제조된, GFP 및 VEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 MDA-MB-435-GFP 세포에 처리하여, 저해된 GFP의 발현 정도를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 확인한 그림이다.
도 7은 하기 <실시예 1>의 방법에 따라 제조된, GFP 및 VEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 MDA-MB-435-GFP 세포에 처리하여, 저해된 GFP 및 VEGF mRNA의 발현량을 RT-PCR을 통해 확인한 전기영동 그림이다.
도 8은 하기 <실시예 1>의 방법에 따라 제조된, GFP 및 VEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 인터페론-알파(IFN-α) 유도 정도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이고(A), 이황화결합으로 구성된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 및 비분해성 결합으로 구성된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 MDA-MB-435-GFP 세포에 처리하여 세포의 GFP 단백질 발현량(B)을 측정한 그래프이다.
도 9는 센스 및 안티센스 모두 3' 말단이 설프하이드릴기로 치환된 이중가닥의 서비빈(survivin) siRNA 및 Bcl-2 siRNA를 가교제인 DTME를 이용하여 하기 <실시예 1>의 방법에 따라 제조한, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 전기영동을 통해 확인한 그림이고(A), 서비빈 및 Bcl-2 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 MDA-MB-435-GFP 세포에 처리하여, 저해된 서비빈 및 Bcl-2 mRNA의 발현량을 RT-PCR을 통해 확인한 전기영동 그림이다(B).
도 10은 서비빈 및 Bcl-2 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체(MGT-multi)를 암세포인 헬라(HeLa) 세포 또는 MCF7 세포에 처리하여 세포 사멸 정도를 측정한 그래프이다.
도 11은 서비빈 및 Bcl-2 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 암세포인 헬라 세포(A 및 C) 또는 MCF7 세포(B 및 D)에 처리하여 FACS 분석을 통해 세포 사멸을 측정한 그래프이다:
A 및 B: Annexin V(가로축) 또는 PI(세로축) 염색이 된 세포의 분포; 및
C 및 D: 초기와 후기 세포사멸이 진행 중인 세포 집단을 의미하는 오른쪽 상단 및 하단 패널에 분포하는 세포의 상대적인 밀도.
1 is a diagram showing an outline of a method for preparing siRNA multiple conjugates targeting complex genes:
A: siRNA multiple conjugate that targets a complex gene prepared by covalently binding two kinds of siRNA monomers substituted with the same or different functional groups at the double-stranded end directly or via a crosslinking agent or a polymer; And
B: A dimer is prepared by covalently binding a single-stranded sense / antisense siRNA monomer at one end of which is substituted with another functional group or directly with a single-stranded siRNA monomer of another sequence via a crosslinking agent or a polymer, and then complements it. SiRNA multiple conjugates targeting complex genes prepared by hydrogen bonding.
FIG. 2 shows the results of electrophoresis of siRNA multiple conjugates targeting the respective complex genes prepared by using a crosslinking agent of double stranded GFP siRNA and VEGF siRNA having a sulfhydryl group substituted at both the sense and antisense groups. The figure shown is:
A: As a result of electrophoresis, siRNA multiple conjugates targeting the respective complex genes prepared by using a crosslinking agent of double-stranded GFP siRNA and VEGF siRNA having 3 'ends substituted with sulfhydryl groups in both sense and antisense {( a): using dithio-bis-maleimidoethane (DTME) which produces a degradable disulfide bond as a crosslinking agent, (b): non-degradable 1,8-bis-maleimidodie as crosslinking agent Using ethylene glycol (1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM (PEG) 2 )}; And
B: GFP single-stranded siRNA and GFP single-stranded siRNA in which the sense 3 'end is all substituted with sulfhydryl group were prepared using a crosslinking agent, and a siRNA duplex having two sequences conjugated was prepared. Results of siRNA multiple conjugates targeting the complex gene prepared by hydrogen bonding with the weight by electrophoresis. SiRNA multiple conjugates targeting complex genes prepared according to FIG.
Figure 3 is prepared according to siRNA multiple conjugates targeting the GFP and VEGF gene according to <Example 1> or <Example 2>, and then treated by concentration to MDA-MB-435 cancer cell line stably expressing GFP protein The GFP protein expression amount (A) and VEGF protein expression amount (B) of the cells were measured.
Figure 4 is prepared according to the method of <Example 1>, the siRNA multiple conjugates targeting the GFP and VEGF genes treated by concentration in MDA-MB-435 concentration of expression of GFP and VEGF protein fluorophotometer (fluorophotometer) It is a graph measured using (A) and ELISA (B).
FIG. 5 shows siRNA multiple conjugates targeting GFP and VEGF genes prepared according to the method of Example 1 below, A549 cancer cell line (A) stably expressing GFP, or PC- stably expressing GFP. 3 Cancer cell line (B) is treated by concentration, the expression level of reduced GFP is measured by a fluorophotometer (fluorophotometer).
Figure 6 is treated according to the method of <Example 1>, siRNA multiple conjugates targeting the GFP and VEGF gene to MDA-MB-435-GFP cells, the degree of expression of inhibited GFP by confocal microscopy ( confocal microscopy).
Figure 7 is treated according to the method of <Example 1>, siRNA multiple conjugates targeting the GFP and VEGF gene to MDA-MB-435-GFP cells, the expression of the inhibited GFP and VEGF mRNA RT -The picture of electrophoresis confirmed by PCR.
FIG. 8 is a graph showing the degree of interferon-alpha (IFN-α) induction of siRNA multiple conjugates targeting GFP and VEGF genes prepared by the method of <Example 1> by ELISA (A), and disulfide bonds. A siRNA multiple conjugate targeting a complex gene consisting of a combination gene and a siRNA multiple conjugate targeting a complex gene consisting of non-degradable bonds are treated in MDA-MB-435-GFP cells to measure the amount of GFP protein expression (B) of the cells. .
9 is prepared according to the method of <Example 1> using double stranded survivin (survivin) siRNA and Bcl-2 siRNA crosslinking agent 3 'terminal is substituted with sulfhydryl group in both sense and antisense. , SiRNA multiple conjugates targeting complex genes were confirmed by electrophoresis (A), and siRNA multiple conjugates targeting survivin and Bcl-2 genes were treated on MDA-MB-435-GFP cells, thereby inhibiting Electrophoresis diagram showing the expression levels of bin and Bcl-2 mRNA by RT-PCR (B).
10 is a graph measuring the degree of cell death by treating siRNA multiple conjugates (MGT-multi) targeting the survivin and Bcl-2 genes to HeLa cells or MCF7 cells, which are cancer cells.
FIG. 11 is a graph measuring cell death via FACS analysis by treating siRNA multiple conjugates targeting the survivin and Bcl-2 genes to HeLa cells (A and C) or MCF7 cells (B and D), which are cancer cells:
A and B: distribution of cells stained with Annexin V (horizontal axis) or PI (vertical axis); And
C and D: Relative density of cells distributed in the upper right and lower panels, indicating a population of cells undergoing early and late apoptosis.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 가지는, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제공한다:The present invention provides two or more types of double-stranded sense / antisense small interfering RNA (siRNA) monomers directly or through a covalent bond via a crosslinking agent or a polymer. Provided siRNA multiple conjugates targeting complex genes having structural formula 2]:

[구조식 1][Formula 1]

-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni--(X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni-

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수, 1 이상의 정수),
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more),

[구조식 2][Formula 2]

x-A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni - x'xA- (X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -x '

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

x와 x'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체;x and x 'are single stranded sense / antisense siRNA monomers;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수, 1 이상의 정수).n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more).

상기 이중가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체는 15 내지 50의 핵산 염기수를 가지는 것이 바람직하고, 15 내지 29의 핵산 염기수를 가지는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The double-stranded sense / antisense siRNA monomer preferably has 15 to 50 nucleic acid bases, and more preferably 15 to 29 nucleic acid bases, but is not limited thereto.

상기 이중가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체의 각 단량체의 개수 ni는 1 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The number n i of each monomer of the double-stranded sense / antisense siRNA monomer is preferably 1 or more, but is not limited thereto.

상기 siRNA 다중 접합체는 서비빈(survivin) 및 Bcl-2을 동시에 표적하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The siRNA multiple conjugate preferably targets survivin and Bcl-2 simultaneously, but is not limited thereto.

상기 본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 하기와 같은 두가지 방법으로 제조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:SiRNA multiple conjugates targeting the complex gene of the present invention is preferably prepared by the following two methods, but is not limited thereto:

첫 번째 방법으로는, 말단이 서로 같거나 다른 관능기로 치환되어 있는 두 종류 이상의 이중가닥의 siRNA(상보적 수소결합)를 가교제 또는 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시켜서 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조할 수 있다(도 1의 A 참조). 더욱 상세하게는, 양쪽 말단에 설프하이드릴기가 도입된 두 종류 이상의 유전자의 각각의 단일가닥 siRNA를 상보적으로 수소결합시키고, 상기 수소결합된 것을 가교제인, 이황화결합을 생성하는 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 또는 비분해성의 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-bis-maleimidodiethylene glycol, BM(PEG)2}, 또는 고분자를 사용하여 공유결합을 통해 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조할 수 있다. In the first method, a siRNA that targets a complex gene by linking two or more double-stranded siRNAs (complementary hydrogen bonds) whose ends are substituted with the same or different functional groups through a covalent bond via a crosslinking agent or a polymer. Multiple conjugates can be prepared (see A of FIG. 1). More specifically, the dithio-bis- which produces disulfide bonds which complementarily hydrogen bond each single-stranded siRNA of two or more types of genes into which a sulfhydryl group is introduced at both ends and which is a crosslinking agent. Using dithio-bis-maleimidoethane (DTME) or non-degradable 1,8-bis-maleimidodiethylene glycol (BM (PEG) 2 ), or polymers Covalent bonds can be used to prepare siRNA multiple conjugates that target complex genes.

두 번째 방법으로는, 말단에 관능기가 도입된 두 종류 이상의 단일가닥의 센스 siRNA와 안티센스 siRNA 각각을 가교제 또는 고분자를 이용하여 반응시켜서 단일가닥의 센스와 안티센스 siRNA 2중량체를 준비한 후, 각각의 2중량체를 수용액상에서 상보적 결합(annealing)을 시킴으로써 제조할 수 있다(도 1의 B 참조). 더욱 상세하게는, 말단이 설프하이드릴기로 치환된 두 종류 이상의 유전자의 센스 가닥과 안티센스 가닥 siRNA 각각을 설프하이드릴기와 반응하는 상기 가교제를 이용하여 공유결합을 통해 2중량체를 제조한 다음, 상기 제조된 2중량체 각각을 동량으로 넣어 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 상에서 수소결합을 통한 상보적 결합을 하도록 섞어주어 복합 유전자를 표적하는 siRNA의 다중 접합체를 제조할 수 있다.In the second method, two or more single-stranded sense siRNAs and antisense siRNAs each having a functional group introduced into the terminal are reacted with a crosslinking agent or a polymer to prepare single-strand sense and antisense siRNA dimers, and then each of the two The weight can be prepared by complementary annealing in aqueous solution (see FIG. 1B). More specifically, by using a cross-linking agent that reacts each of the sense strand and antisense strand siRNA of two or more genes whose terminals are substituted with sulfhydryl groups by sulfhydryl groups, a bivalent body is prepared through covalent bonding, and then Put the same amount of each of the prepared two weights can be mixed to the complementary bonds through hydrogen bonding on phosphate buffered saline (phosphate buffered saline (PBS) to prepare multiple conjugates of siRNA targeting the complex gene.

그 밖에도, 두 종류 이상의 단일가닥의 센스 siRNA를 공유결합인 인산디에스테르결합(phosphodiester bond)에 의해 직접 연결시켜서, 상기와 같이 직접 연결시킨 이에 대한 안티센스 siRNA를 사용하여 서로 상보적 결합(annealing)을 시키거나, 안티센스 siRNA를 상기 센스 siRNA를 주형으로 하여 합성함으로써 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조할 수 있다. In addition, two or more types of single-stranded sense siRNAs are directly linked by covalent bonds of phosphodiester bonds. Or siRNA multiple conjugates targeting complex genes can be prepared by synthesizing an antisense siRNA with the sense siRNA as a template.

상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 제조 중 siRNA의 올리고 가닥은 분자량 10,000에서 50,000 사이에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용가능한 siRNA는 치료용 또는 연구용으로 사용되는 것이라면 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 c- myc , c- myb , c- fos , c- jun , 서비빈(survivin), bcl -2, 또는 VEGF, VEGF -B, VEGF -C, VEGF -D, PIGF 등 유전자 치료 또는 연구를 위해 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 siRNA도 사용될 수 있다. 특히 단계적으로 발현되는 단백질에 의해 야기되는 유전자 질병을 치료 시 각 단계에 표적이 될 수 있는 유전자를 조합하여 본 발명에 더욱 유용하게 적용 가능하다. 뿐만 아니라 유전적 돌연변이 빈도가 높은 EGFR이나 바이러스를 표적하는 시스템에서도 다양한 후보 서열을 조합하여 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 사용 가능하다. The oligo strand of siRNA during siRNA multiple conjugate preparation targeting the complex gene is preferably selected from molecular weight 10,000 to 50,000, but is not limited thereto. The siRNA usable in the present invention is not particularly limited as long as it is used for therapeutic or research purposes, for example , c - myc , c- myb , c- fos , c- jun , survivin , bcl- 2, Or any siRNA that may or may be used for gene therapy or research, such as VEGF , VEGF- B , VEGF- C , VEGF- D , PIGF, and the like. In particular, a combination of genes that can be targeted at each step in treating a genetic disease caused by a protein expressed in stages is more usefully applicable to the present invention. In addition, siRNA multiple conjugates targeting complex genes prepared by combining various candidate sequences can be used in systems targeting EGFR or viruses with high genetic mutation frequency.

상기 siRNA 말단의 하이드록시기(-OH)는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기 (-COOH) 또는 아민기(-NH2)의 관능기로 치환될 수 있다.The hydroxyl group (-OH) at the siRNA terminal may be substituted with a functional group of sulfhydryl group (-SH), carboxyl group (-COOH) or amine group (-NH 2 ).

상기 치환은 3' 말단 또는 5' 말단을 통해 이루어질 수 있으며, 센스와 안티센스 모두 3' 말단이 관능기로 치환된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The substitution may be made through a 3 'end or a 5' end, and it is preferable to use a 3 'end substituted with a functional group in both sense and antisense, but is not limited thereto.

상기 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 등의 비이온성 친수성 고분자나 PLGA, PLA 등의 소수성 고분자가 사용될 수 있다. The polymer may be a nonionic hydrophilic polymer such as polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrolidone, polyoxazolin, or hydrophobic polymer such as PLGA or PLA.

상기 가교제는 분자량이 100 ~ 10000이 되는 것으로 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2}, 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페닐아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 또는 하이드록시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide) 인 것이 바람직하고, 이황화결합을 생성하는 DTME인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The crosslinking agent has a molecular weight of 100 to 10000, dithio-bis-maleimidoethane (DTME), 1,8-bis-maleimidodiethylene glycol {1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM (PEG) 2 }, maleimide, N-hydroxysuccinimide (NHS, N-hydroxysuccinimide), vinylsulfone (vinylsulfone), iodoacetyl nitrophenyl azide, isocyanate ), Pyridyldisulfide, hydrazide or hydroxyphenyl azide, and most preferably, but not limited to DTME that produces disulfide bonds.

상기 가교제 내에 비분해성 결합인 아마이드 결합, 우레탄 등의 공유결합, 산분해성 결합인 에스터, 하이드라존, 아세탈 등의 공유결합, 환원제 분해성인 이황화결합 등 외부 자극에 의해 분해될 있는 결합을 가진 것과 외부 자극에 의해 분해되지 않는 것을 모두 사용할 수 있다. 상기 가교제에 한정되지 않고 통상적으로 약물 변형에 사용되고 있는 모든 가교제가 사용될 수 있다.Non-degradable bonds such as amide bonds, covalent bonds such as urethane, acid-decomposable esters such as esters, hydrazones, acetals, covalent bonds such as disulfide bonds such as reducing agents, and dissociable bonds with external stimuli. Anything that does not degrade by stimulation can be used. Any crosslinking agent which is not limited to the above crosslinking agent and is commonly used for drug modification can be used.

상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 바람직하게는 siRNA 접합체 말단에 도입되는 세포 선택적 리간드가 더 구비되어질 수 있다.The siRNA multiple conjugate targeting the complex gene may be further provided with a cell selective ligand introduced at the siRNA conjugate ends.

상기 구비되어지는 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 중 선택된 1종 이상이 될 수 있다. 이들 리간드는 이황화결합(disulfide bond)을 포함해 아마이드결합(amide bond)이나 에스테르 결합(ester bond) 등의 결합을 통해 상기 접합체의 말단에 도입될 수 있다.The ligands provided may be one or more selected from among cell specific antibodies, cell selective peptides, cell growth factors, folic acid, galactose, mannose, algidi, and transferrin. These ligands may be introduced at the ends of the conjugates, including disulfide bonds, through bonds such as amide bonds or ester bonds.

본 발명의 복합 유전자 siRNA 다중 접합체는 양이온성 유전자 전달체(양이온성 지질, 양이온성 고분자, 양이온성 펩타이드 등)와의 이온 상호작용에 의해 이온 복합체를 형성할 수 있다.The complex gene siRNA multiple conjugates of the present invention can form ionic complexes by ionic interactions with cationic gene carriers (cationic lipids, cationic polymers, cationic peptides, etc.).

상기 양이온성 펩타이드는 양이온 융합성 펩타이드(cationic fusogenic peptide, KALA), 폴리라이신(polylysine), 폴리글루타믹엑시드(polyglutamic acid) 또는 프로타민(protamine)일 수 있다. 상기 KALA는 WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALAACEA(서열번호: 1)의 펩타이드 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The cationic peptide may be a cationic fusogenic peptide (KALA), polylysine, polyglutamic acid, or protamine. The KALA preferably has a peptide sequence of WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALAACEA (SEQ ID NO: 1), but is not limited thereto.

상기 양이온성 지질은 다이올레일 포스페티딜에탄올아민 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린 일 수 있다.The cationic lipid may be dioleyl phosphetidylethanolamine or cholesterol dioleyl phosphetidylcholine.

상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아민 또는 폴리비닐아민일 수 있다.The cationic polymer may be polyethyleneimine, polyamine or polyvinylamine.

본 발명자들은 혈관내피세포 성장인자(human vascular endothelial growth factor, hVEGF)와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)를 표적하는 siRNA로 구성된 siRNA 다중 접합체를 두 가지 방법으로 각각 제조하였다(도 1 참조). 첫 번째 방법으로는, 이중가닥 말단에 같거나 다른 관능기로 치환된 GFP 및 hVEGF siRNA 단량체를 가교제인 DTME 또는 BM(PEG2)를 매개로 공유결합시켜 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조하였다(도 1의 A 참조). 아울러, 상기 방법에 따라, 서비빈(survivin) 및 Bcl-2를 표적하는 두 종류의 siRNA로 구성된 다중 접합체를 제조하였다(도 9의 A 참조). 두 번째 방법으로는, 말단에 관능기가 도입된 GFP 및 hVEGF를 표적하는 siRNA의 단일가닥들을 상기 가교제를 이용하여 중합시켜서 GFP 및 hVEGF의 단일가닥이 연결된 siRNA 2중량체를 준비하였다. 상기 준비된 단일가닥 siRNA 2중량체를 제작할 때 사용된 단일가닥들에 상보적인 서열을 가지는 단일가닥 siRNA들을 동일한 방법으로 연결하여 GFP 및 hVEGF의 단일가닥이 서로 연결된 siRNA 2중량체를 준비하였다. 준비된 각각의 2중량체를 수용액 상에서 상보적으로 수소결합시킴으로써(annealing) 두 종류 이상의 siRNA 서열을 포함하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조하였다(도 1의 B 참조). 상기와 같이 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는, 양이온 고분자인 선형 PEI{linear PEI(polyethylenimine)}를 사용하여, 생체 내에서 siRNA 다중 접합체의 세포 전달을 위한 이온 복합체를 제조하였다. 이때, 각 siRNA의 기능을 구분지어 확인함으로써 그 효과를 명확하게 확인하기 위해 기능의 상관성이 적은 두 가지 단백질을 표적으로 하는 siRNA를 사용하였다. 유전자 관련 질병의 치료를 위한 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 복합체를 제조하기 위해서는 상기와 같이 다양한 질병관련 siRNA의 조합이 가능하다. The inventors prepared siRNA multiple conjugates composed of siRNAs targeting human vascular endothelial growth factor (hVEGF) and green fluorescent protein (GFP) in two ways, respectively (see FIG. 1). . In the first method, siRNA multiple conjugates targeting complex genes were prepared by covalently binding GFP and hVEGF siRNA monomers substituted with the same or different functional groups at the double-stranded ends through the crosslinking agent DTME or BM (PEG 2 ) ( See A of FIG. 1). In addition, according to the above method, multiple conjugates composed of two kinds of siRNAs targeting survivin and Bcl-2 were prepared (see A of FIG. 9). In a second method, siRNA dimers in which single strands of GFP and hVEGF are linked by polymerizing single strands of siRNA targeting GFP and hVEGF having functional groups introduced into the terminal were polymerized using the crosslinking agent. In preparing the single-stranded siRNA dimer prepared above, single-stranded siRNAs having a sequence complementary to the single-strands used in the same manner were connected to prepare siRNA dimers in which single strands of GFP and hVEGF were connected to each other. SiRNA multiple conjugates targeting complex genes comprising two or more types of siRNA sequences were prepared by annealing each prepared dimer in an aqueous solution (see FIG. 1B). As the siRNA multiple conjugate targeting the complex gene prepared as described above, an ion complex for cell delivery of the siRNA multiple conjugate in vivo was prepared by using linear PEI (linear ethyl polyethylenimine)}, which is a cationic polymer. At this time, siRNA was used to target two proteins with low correlation of function in order to clearly identify the effects of each siRNA function. In order to produce siRNA multiple complexes targeting complex genes for the treatment of gene related diseases, a combination of various disease related siRNAs is possible as described above.

한편, GFP 및 hVEGF siRNA로 구성된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 대조군으로서, hVEGF siRNA 다중 접합체 및 GFP siRNA 다중 접합체 두 종류를 각각 제조한 뒤 물리적으로 이들을 혼합한 것을 사용하였다. 또한, 상기 서비빈과 Bcl-2 siRNA로 구성된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 대조군으로서, 서비빈 siRNA 다중 접합체 및 Bcl-2 siRNA 다중 접합체 두 종류를 각각 제조한 뒤 물리적으로 이들을 혼합한 것을 사용하였다. 이때, 세포질 내에서 자발적으로 분해되는 생분해성 결합인 이황화결합을 지닌, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 이용하여, 표적 단백질 저해 효과를 확인하였다.On the other hand, as a control of siRNA multiple conjugates targeting a complex gene consisting of GFP and hVEGF siRNA, two types of hVEGF siRNA multiple conjugates and GFP siRNA multiple conjugates were prepared, respectively, and physically mixed them. In addition, as a control of the siRNA multiple conjugate targeting the complex gene consisting of the survivin and Bcl-2 siRNA, two kinds of each of the survivin siRNA conjugate and Bcl-2 siRNA conjugate were prepared and then physically mixed with each other. It was. At this time, siRNA multiple conjugates targeting complex genes having disulfide bonds, which are biodegradable bonds spontaneously degraded in the cytoplasm, were used to confirm target protein inhibitory effects.

본 발명자들은, hVEGF 및 GFP siRNA로 구성된, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체/선형 PEI 이온 복합체를 GFP가 안정적으로 발현되는 유방암, 전립선암 또는 폐암 세포주인 MDA-MB-435, PC-3 또는 A549 세포에 처리하여, hVEGF 및 GFP 발현에 대한 저해 효과를 알아보았다. 그 결과, hVEGF 및 GFP siRNA로 구성된, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체/선형 PEI 이온 복합체가 각 표적 단백질인 hVEGF 및 GFP의 발현을 효과적이고 독립적으로 저해하였음을 확인하였다. 또한, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체/선형 PEI 이온 복합체는, 두 종류의 siRNA를 물리적으로 복합한 경우, 또는 두 종류의 다중 접합체를 물리적으로 복합한 siRNA/선형 PEI의 이온복합체보다 GFP 및 hVEGF의 발현을 더욱 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 3, 도 4 및 도 5 참조). 이는 물리적으로 혼합시킨 siRNA 다중 접합체의 한 분자 내에 존재하는 siRNA가 한 종류인 것에 비해, 화학적으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 한 분자 내에 두 종류의 siRNA를 포함하고 있는데, 확률적인 관점에서 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 더 유리하게 다양한 서열의 siRNA를 RNAi 매커니즘(mechanism)에 참여시킬 수 있기 때문으로 여겨진다. 또한, 위상차 현미경을 통해 GFP 단백질의 강도를 관찰한 결과, 대조군에 비해 본 발명의 siRNA 다중 접합체에서 녹색 형광이 현저히 감소된 것으로 나타났다(도 6 참조). The inventors have determined that a siRNA multiple conjugate / linear PEI ion complex targeting a complex gene, consisting of hVEGF and GFP siRNA, is a MDA-MB-435, PC-3 or A549, which is a breast, prostate or lung cancer cell line stably expressing GFP. The cells were treated to examine the inhibitory effect on hVEGF and GFP expression. As a result, it was confirmed that siRNA multiple conjugate / linear PEI ion complexes targeting complex genes composed of hVEGF and GFP siRNAs effectively and independently inhibited expression of each target protein, hVEGF and GFP. In addition, siRNA multiple conjugates / linear PEI ion complexes targeting complex genes are GFP and hVEGF than the ion complexes of siRNA / linear PEI physically complexing two types of siRNAs or physically complexing two types of multiple conjugates. It was confirmed that more effectively suppress the expression of (see Figs. 3, 4 and 5). This means that siRNA multiple conjugates targeting chemically conjugated complex genes contain two kinds of siRNAs in one molecule, compared to one type of siRNA present in one molecule of physically mixed siRNA multiple conjugates. It is believed that siRNA multiple conjugates that target complex genes in can more advantageously involve siRNAs of various sequences in the RNAi mechanism. In addition, observation of the intensity of the GFP protein through a phase contrast microscope showed that the green fluorescence was significantly reduced in the siRNA multiple conjugate of the present invention compared to the control (see FIG. 6).

본 발명자들은 GFP 및 hVEGF의 두 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체에 의해 표적 유전자인 GFP 및 hVEGF mRNA 발현량의 변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, GFP 및 hVEGF mRNA 발현은 서열 특이적으로 억제되었고, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는, 물리적으로 혼합된 siRNA 다중 접합체에 비해 각 표적 mRNA양을 더욱 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 7 참조). The inventors confirmed the change in the expression level of the target genes, GFP and hVEGF mRNA by RT-PCR, by siRNA multiple conjugates targeting two genes, GFP and hVEGF. As a result, GFP and hVEGF mRNA expression was sequence-specifically inhibited, and siRNA multiple conjugates targeting complex genes were found to reduce each target mRNA amount more effectively than physically mixed siRNA multiple conjugates (see FIG. 7). ).

본 발명자들은 GFP 및 hVEGF 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 면역반응 유도 정도를 확인하기 위해, 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 처리하여 분비된 인터페론-알파의 양을 ELISA를 통해 측정하였다. 이 때, 이황화결합{MGT-multi(cleavable)} 또는 비분해성 공유결합{MGT-multi(noncleavable)}으로 접합시켜 제조한 두 종류의 siRNA 다중 접합체를 사용하였다. 그 결과, 기존의 siRNA 또는 물리적으로 혼합한 siRNA 다중 접합체에 비하여 상기의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 인터페론-알파의 유도를 크게 일으키지 않음을 알 수 있었다. 특히, 이황화결합을 이용한 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 기존의 siRNA와 비슷한 정도의 인터페론-알파 유도를 나타냈다(도 8의 A 참조). 이는, 비분해성 결합으로 연결된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 분해성 결합으로 연결된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체와 비교하였을 때, 인터페론-알파의 분비를 더욱 활성화시킴으로써 다중 접합체에 대한 면역반응의 잠재적 위험성을 가진다고 볼 수 있다. 또한, 이황화결합으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 비분해성 공유결합으로 접합시킨 것에 비해 더욱 효과적으로 표적 단백질의 발현을 저해하는 것으로 나타났다(도 8의 B 참조). 이황화결합으로 접합시킨 siRNA 다중 접합체는 세포 내에 진입한 후 단시간 안에 21머(mer) 길이의 동일한 고유서열을 가지는 siRNA로 환원되지만 비분해성 siRNA 다중 접합체는 세포 내에 존재하는 RNase Ⅲ 인 다이서(Dicer)의 작용에 의해 다양한 길이를 가지는 siRNA로 분해된다. 복합 유전자가 무작위로 결합되어 있는 siRNA 다중 접합체가 다이서에 의해 분해되는 과정에서 siRNA의 서열 프레임이 이동될 수 있는데, 이것 때문에 VEGF 또는 GFP를 표적할 수 없는 비특이적인 서열을 가지는 siRNA 결과물이 발생할 수 있다. 이러한 이유에서 비분해성 공유결합으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 분해성 공유결합으로 접합시킨 것에 비해 감소된 효율을 보여주었다. In order to confirm the degree of immune response induction of siRNA multiple conjugates targeting the GFP and hVEGF genes, the present inventors treated the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to measure the amount of interferon-alpha secreted by ELISA. It was. At this time, two kinds of siRNA multiple conjugates prepared by conjugation with disulfide bonds (MGT-multi (cleavable)) or non-degradable covalent bonds (MGT-multi (noncleavable)) were used. As a result, it was found that siRNA multiple conjugates targeting the complex gene did not significantly induce interferon-alpha in comparison with conventional siRNA or physically mixed siRNA multiple conjugates. In particular, siRNA multiple conjugates targeting complex genes using disulfide bonds showed similar levels of interferon-alpha induction as conventional siRNAs (see FIG. 8A). This means that siRNA multiple conjugates targeting complex genes linked by non-degradable bonds are more potent in the immune response to multiple conjugates by further activating the secretion of interferon-alpha when compared to siRNA multiple conjugates targeting complex genes linked by degradable bonds. It can be regarded as a risk. In addition, siRNA multiple conjugates targeting complex genes conjugated by disulfide bonds appeared to inhibit the expression of target proteins more effectively than those conjugated by non-degradable covalent bonds (see FIG. 8B). The siRNA multiple conjugates conjugated by disulfide bonds are reduced to siRNAs having the same unique sequence of 21 mer length in a short time after entering the cell, but the non-degradable siRNA multiple conjugates are Dicer, RNase III present in the cells. It is cleaved into siRNAs having various lengths by the action of. The sequence frame of the siRNA can be shifted by the disassembly of the siRNA multiple conjugates in which the complex genes are randomly coupled, which can result in siRNA products with nonspecific sequences that cannot target VEGF or GFP. have. For this reason, siRNA multiple conjugates targeting complex genes conjugated with non-degradable covalent bonds showed reduced efficiency compared to those conjugated with degradable covalent bonds.

본 발명자들은 서비빈 및 Bcl-2의 두 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체에 의해 표적 유전자인 서비빈 및 Bcl-2 발현량의 변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 서비빈 및 Bcl-2를 표적하는 siRNA 다중 접합체도 GFP 및 hVEGF를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 경우와 동일하게, 서비빈 및 Bcl-2 두 표적 단백질의 mRNA 발현을 모두 저해하는 것을 확인하였다(도 9의 B). The present inventors confirmed the change of the expression levels of the survivin and Bcl-2, the target genes by RT-PCR, by siRNA multiple conjugates targeting two genes of survivin and Bcl-2. As a result, it was confirmed that siRNA multiple conjugates targeting Servinbin and Bcl-2 also inhibited mRNA expression of both target proteins, as in the siRNA multiple conjugates targeting GFP and hVEGF. (FIG. 9B).

본 발명자들은 서비빈 및 Bcl-2 siRNA로 구성된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체/선형 PEI 이온 복합체를 자궁암 또는 유방암 세포주인 헬라(HeLa) 또는 MCF7 세포에 처리하여, 유도되는 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 CCK-8 분석 및 Annexin V/PI 염색을 통해 확인하였다. 그 결과, 상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체/선형 PEI 이온 복합체가 두 종류의 siRNA를 물리적으로 복합한 siRNA/선형 PEI, 또는 두 종류의 다중 접합체를 물리적으로 복합한 siRNA/선형 PEI의 이온 복합체보다 암세포의 세포사멸을 더욱 효과적으로 유도하는 것을 확인함으로써(도 10 및 도 11 참조), 암세포 치료에 있어서의 이용가능성을 입증하였다. The present inventors treated siRNA multiple conjugate / linear PEI ion complexes targeting a complex gene consisting of survivin and Bcl-2 siRNA to HeLa or MCF7 cells, which are uterine cancer or breast cancer cell lines, resulting in apoptosis of cancer cells induced. ) Was confirmed by CCK-8 analysis and Annexin V / PI staining. As a result, the siRNA multiple conjugate / linear PEI ion complex targeting the complex gene was siRNA / linear PEI in which two types of siRNA were physically combined, or siRNA / linear PEI in which two types of multiple conjugates were physically combined. By confirming more effective induction of apoptosis of cancer cells (see FIGS. 10 and 11), the applicability in cancer cell therapy was demonstrated.

따라서, 상기의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 기존의 siRNA에 비해 음이온 전하밀도가 증가하여 양이온성 유전자 전달체와 효과적으로 결합함으로써 유전자 전달효율이 향상되고, 다양한 서열의 siRNA를 동시에 세포로 전달하여 각 서열의 특이적/복합적 기능을 동시에 수행할 수 있으므로, 두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체로서 유용하게 이용할 수 있다.
Therefore, siRNA multiple conjugates targeting the complex genes have increased anion charge densities compared to conventional siRNAs, which effectively bind to cationic gene carriers, thereby improving gene transfer efficiency, and simultaneously delivering siRNAs of various sequences to cells. The specific / complex functions of the sequences can be performed simultaneously, so that two or more types of double-stranded sense / antisense small interfering RNA (siRNA) monomers can be directly or covalently linked through a crosslinking agent or a polymer. It can be usefully used as a siRNA multiple conjugate that targets a complex gene linked through.

또한, 본 발명은 두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 가지는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention targets a complex gene having the following [formula 1] or [formula 2] prepared by the step of covalently binding two or more double-stranded sense / antisense siRNA monomers directly or via a crosslinking agent or a polymer Methods of making siRNA multiple conjugates are provided:

[구조식 1][Formula 1]

-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni --(X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수),
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more),

[구조식 2][Formula 2]

x-A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni - x'xA- (X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -x '

(여기서, (here,

X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;

x와 x'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체;x and x 'are single stranded sense / antisense siRNA monomers;

A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;

i는 2 이상의 정수; 및i is an integer of 2 or more; And

ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수).n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more).

상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법의 한가지 바람직한 양태로는,In one preferred embodiment of the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene,

1) 말단이 서로 같거나 다른 관능기로 치환된 두 종류 이상의 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체(x1-b + a-x1', x2-b + a-x2', …, xi-b + a-xi')를 상보적 수소결합을 통해 a-X1-b, a-X2-b, …, 및 a-Xi-b로 만드는 단계; 및1) Two or more types of single-stranded sense / antisense siRNA monomers each having the same or different terminal groups (x 1 -b + ax 1 ', x 2 -b + ax 2 ',…, x i -b + ax i ') Through complementary hydrogen bonding aX 1 -b, aX 2 -b,... , And aX i -b; And

2) 상기 a-X1-b, a-X2-b, …, 및 a-Xi-b를 가교제 또는 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함할 수 있다(여기서, X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체; x1, x2, xi와 x1', x2', xi'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체; 및 a와 b는 말단에 도입된, 같거나 다른 관능기).2) the aX 1 -b, aX 2 -b,... , And covalently bonding aX i -b via a crosslinking agent or a polymer (wherein X 1 , X 2 , X 3 ,..., X i are double-stranded siRNA monomers of different sequences; x 1 , x 2 , x i and x 1 ′, x 2 ′, x i ′ are single-stranded sense / antisense siRNA monomers; and a and b are terminal or same or different functional groups introduced.

상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법의 또 다른 바람직한 양태로는,In another preferred embodiment of the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene,

1) 말단이 서로 같거나 다른 관능기로 치환된 두 종류 이상의 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체(x1-b + a-x2와 x1'-b + a-x2') 각각을 가교제 또는 고분자를 매개로 공유결합시켜 2중량체인 x1-b-a-x2와 x1'-b-a-x2'로 만드는 단계; 및1) Sharing two or more single-stranded sense / antisense siRNA monomers (x 1 -b + ax 2 and x 1 '-b + ax 2 ') each of which has the same or different functional groups at the ends thereof through a crosslinking agent or a polymer; Combining to make a biweight x 1 -bax 2 and x 1 '-bax 2 '; And

2) 상기 2중량체인 x1-b-a-x2와 x1'-b-a-x2'를 상보적 수소결합시키는 단계를 포함할 수 있다(여기서, x1및 x2는 서로 다른 서열의 단일가닥 센스 siRNA 단량체; x1'및 x2'는 서로 다른 서열의 단일가닥 안티센스 siRNA 단량체; 및 a와 b는 말단에 도입된, 같거나 다른 관능기).2) complementarily hydrogen bonding the dimer, x 1 -bax 2 and x 1 '-bax 2 ', where x 1 and x 2 are single-stranded sense siRNA monomers of different sequences; x 1 ′ and x 2 ′ are single-stranded antisense siRNA monomers of different sequences; and a and b are the same or different functional groups introduced at the ends.

본 발명은 유전자 치료에 이용되는 다양한 siRNA를 화학적인 방법으로 서로 결합시킴으로서 단일 분자에 다양한 서열의 siRNA를 포함시켜 각각의 유전자 저해기능은 보존시키면서 한 분자당 음이온의 전하 밀도를 증가시켜 유전자 전달체와의 결합력이 향상되어 세포 내 도입 효율을 향상시킴으로써 기존의 siRNA에 비해 표적 유전자 발현의 저해 능력을 증가시키는데 그 의의가 있다. The present invention combines the various siRNAs used for gene therapy with each other by chemical methods to include siRNAs of various sequences in a single molecule to increase the charge density of anion per molecule while preserving each gene inhibitory function, It is meaningful to increase the ability to inhibit the expression of target genes compared to the existing siRNA by improving the binding efficiency to improve the introduction efficiency into cells.

상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 제조 중 siRNA의 올리고 가닥은 분자량 10,000에서 50,000 사이에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용가능한 siRNA는 치료용 또는 연구용으로 사용되는 것이라면 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 c- myc , c- myb , c- fos , c- jun , 서비빈(survivin), bcl -2, 또는 VEGF, VEGF -B, VEGF -C, VEGF -D, PIGF 등 유전자 치료 또는 연구를 위해 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 siRNA도 사용될 수 있다. 특히 단계적으로 발현되는 단백질에 의해 야기되는 유전자 질병을 치료 시 각 단계에 표적이 될 수 있는 유전자를 조합하여 본 발명에 더욱 유용하게 적용 가능하다. 뿐만 아니라 유전적 돌연변이 빈도가 높은 EGFR이나 바이러스를 표적하는 시스템에서도 다양한 후보 서열을 조합하여 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 사용 가능하다. The oligo strand of siRNA during siRNA multiple conjugate preparation targeting the complex gene is preferably selected from molecular weight 10,000 to 50,000, but is not limited thereto. The siRNA usable in the present invention is not particularly limited as long as it is used for therapeutic or research purposes, for example , c - myc , c- myb , c- fos , c- jun , survivin , bcl- 2, Or any siRNA that may or may be used for gene therapy or research, such as VEGF , VEGF- B , VEGF- C , VEGF- D , PIGF, and the like. In particular, a combination of genes that can be targeted at each step in treating a genetic disease caused by a protein expressed in stages is more usefully applicable to the present invention. In addition, siRNA multiple conjugates targeting complex genes prepared by combining various candidate sequences can be used in systems targeting EGFR or viruses with high genetic mutation frequency.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 공유결합은 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합, 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합, 환원제 분해성인 이황화결합, 생분해성 결합, 및 효소 분해성 결합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 공유결합인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, the covalent bond is a non-degradable amide bond, urethane bond, acid-decomposable ester bond, hydrazone bond, acetal bond, reducing agent degradable disulfide bond, It is preferably, but not limited to, any one covalent bond selected from the group consisting of a biodegradable bond and an enzyme degradable bond.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체의 말단인 하이드록시기(-OH) 대신에 치환된 관능기는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH) 및 아민기(-NH2)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 관능기인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, the functional group substituted in place of the hydroxyl group (-OH) which is the terminal of the single-stranded sense / antisense siRNA monomer is sulfhydryl group (-SH), It is preferably one of the functional groups selected from the group consisting of a carboxyl group (-COOH) and an amine group (-NH 2 ), but is not limited thereto.

상기 치환은 3' 말단 또는 5' 말단을 통해 이루어질 수 있으며, 센스와 안티센스 모두 3'말단이 관능기로 치환된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The substitution may be made through a 3 'end or a 5' end, and it is preferable to use a 3 'end substituted with a functional group in both sense and antisense, but is not limited thereto.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 공유 결합의 매개로 사용되는 고분자는 PEG, 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, the polymer used as a mediator of the covalent bond is PEG, Pluronic, polyvinylpyrolidone, and polyoxazolin At least one nonionic hydrophilic polymer selected from the group consisting of; Or poly-L-lactic acid, poly-glycolic acid, poly-D-lactic-co-glycolic acid, poly Poly-L-lactic-co-glycolic acid, poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, poly-L-lactic-co-glycolic acid -At least one biodegradable polyester polymer selected from the group consisting of polycaprolactone, poly-valerolactone, poly-hydroxybutyrate and poly-hydroxyvalerate Preferred but not limited to this.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 가교제는 분자량이 100 ~ 10000이 되는 것으로 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2}, 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페닐아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드록시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 이황화결합을 생성하는 DTME인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, the crosslinking agent will have a molecular weight of 100 to 10000 Dithio-bis-maleimidoethane (DTME), 1,8- Bis-maleimidodiethylene glycol {1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM (PEG) 2 }, maleimide, N-hydroxysuccinimide (NHS, N-hydroxysuccinimide), vinylsulfone (vinylsulfone), Io Any one selected from the group consisting of iodoacetyl (nitrophenyl azide), isocyanate, pyridyldisulfide, hydrazide and hydroxyphenyl azide It is preferable that it is above, and it is most preferable that it is DTME which produces a disulfide bond, but it is not limited to this.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 siRNA 다중 접합체 말단에 세포 선택적 리간드가 추가적으로 더 구비되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, it is preferable that an additional cell selective ligand is further provided at the end of the siRNA multiple conjugate, but is not limited thereto.

상기 더 구비되어지는 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 알지디(RGD) 및 트렌스페린(transferrin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The ligand further provided is a group consisting of cell specific antibodies, cell selective peptides, cell growth factors, folic acid, galactose, mannose, mannose, RGD, and transferrin. It is preferably one or more selected from but not limited thereto.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 siRNA가 갖는 관능기를 활성화하는 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.In the method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene of the present invention, the method may further include activating a functional group possessed by the siRNA, but is not limited thereto.

상기 siRNA가 갖는 관능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β말레이미도프로피오닉엑시드(N-β-Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트{N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate}로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Substances that activate the functional groups of the siRNA include 1-ethyl-3, 3-dimethylaminopropyl carbodiimide, imidazole, N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide), dichlorohexylcarbodiimide, N-β-maleimidopropionic acid, N-β-maleimidopropyl succimimide ester) and N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate). .

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조 반응은 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상적으로는 상온에서 수행이 가능하고, 대략 24 ~ 48 시간 동안 반응시켜 수득하는 것이 바람직하다. 상기 반응에 요구되는 각 반응물의 첨가비는 특별히 한정되지는 않으며, 가교제와 siRNA의 몰비(%)를 통해 siRNA의 길이를 조절할 수 있다. 반응에 첨가되는 siRNA의 종류에 따라 다중 접합체를 구성하는 siRNA들의 조합을 다양화할 수 있고 구성하는 각 siRNA의 몰비(%)를 조절함으로써 다중 접합체 한 분자를 구성하는 특정 서열의 siRNA의 비중을 달리할 수 있다.The reaction for preparing the siRNA multiple conjugates targeting the complex gene of the present invention is not particularly limited, and is usually performed at room temperature, and preferably obtained by reacting for approximately 24 to 48 hours. The addition ratio of each reactant required for the reaction is not particularly limited, and the length of the siRNA can be adjusted through the molar ratio (%) of the crosslinking agent and the siRNA. Depending on the type of siRNA added to the reaction, it is possible to vary the combination of siRNAs constituting multiple conjugates, and to control the molar ratio (%) of each siRNA constituting the multiple conjugates to change the specific gravity of siRNAs of a specific sequence constituting one molecule of multiple conjugates. Can be.

본 발명에서 상보적 결합을 시켜주는 수용액은 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS), 트리스(Tris) 완충용액 또는 히피스(HEPES) 완충용액으로, 바람직하게는 염 농도 100 mM 이상인 완충 용액이 사용될 수 있다.Complementary binding solution in the present invention is a phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer or Hips buffer (HEPES) buffer, preferably a buffer solution having a salt concentration of 100 mM or more is used Can be.

상기의 방법에 따라 제조한, 본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 기존 siRNA 비해 분자량이 크고 음이온 전하 밀도가 높으며, 안정성이 높고, 양이온성 유전자 전달체와의 이온성 결합력이 우수하여 유전자 전달 효율이 현저히 높으며, 다중 접합체를 제조한 후에도 본래의 siRNA의 유전자 저해 기능에는 영향을 미치지 않고 유전자 전달체와의 결합력을 증대시켜 세포 내로의 도입 효율이 높아질 뿐만 아니라, 두 종류 이상의 복합 유전자를 동시에 표적할 수 있는 다양한 서열의 siRNA를 세포에 동시에 전달하여 각 서열에 특이적이고 복합적으로 저해 기능을 수행할 수 있으므로, 두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) siRNA 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조에 유용하게 이용할 수 있다.
The siRNA multiple conjugates targeting the complex genes of the present invention prepared according to the above method have a higher molecular weight, higher anion charge density, higher stability, and superior ionic binding ability with cationic gene carriers compared to conventional siRNAs. The efficiency is remarkably high, and even after the multiple conjugate is prepared, the binding efficiency with the gene carrier is increased without affecting the gene inhibition function of the original siRNA, and the efficiency of introduction into the cell is increased, and the two or more complex genes can be simultaneously targeted. It is possible to deliver siRNAs of various sequences to cells at the same time to perform specific and complex inhibitory functions of each sequence. Thus, two or more double-stranded sense / antisense siRNA monomers can be directly or mediated through a crosslinking agent or a polymer. Targeting complex genes linked through covalent bonds It can be usefully used for the preparation of siRNA multiple conjugates.

또한, 본 발명은 상기의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체; 및 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 양이온성 유전자 전달체; 간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 이온 복합체를 제공한다.In addition, the present invention is siRNA multiple conjugate targeting the complex gene; And a cationic peptide selected from the group consisting of cationic peptides, cationic lipids and cationic polymers; It provides an ionic complex formed by the ionic interaction of the liver.

본 발명에 따른 상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체와 양이온성 유전자 전달체간에 이온 결합을 이용하여 이온 복합체를 형성할 수 있다. 상기 이온 복합체란, 음이온성 유전자와 이와 반대 이온을 지닌 고분자(예를 들어, 양이온성 물질)간의 상호작용에 의해 형성되는 작은 집합체로서 100 ~ 200 ㎚ 정도의 크기를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Ionic complexes may be formed using ionic bonds between siRNA multiple conjugates targeting cationic genes according to the present invention and cationic gene carriers. The ion complex is a small aggregate formed by the interaction between an anionic gene and a polymer having an opposite ion (for example, a cationic material), but preferably has a size of about 100 to 200 nm, but is not limited thereto. .

상기 양이온성 펩타이드는 양이온 융합성 펩타이드(cationic fusogenic peptide, KALA), 폴리라이신(polylysine) 및 프로타민(protamine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The cationic peptide is preferably any one selected from the group consisting of cationic fusogenic peptide (KALA), polylysine and protamine.

상기 양이온성 지질은 다이올레일 포스페티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine) 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린(cholesterol dioleoyl phosphatidyl choline)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The cationic lipid is preferably dioleoyl phosphatidylethanolamine or cholesterol dioleoyl phosphatidyl choline, but is not limited thereto.

상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리아민(polyamines) 및 폴리비닐아민(polyvinylamine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The cationic polymer is preferably one selected from the group consisting of polyethylenimine, polyamines, and polyvinylamines, but is not limited thereto.

상기 이온 복합체의 제조 과정은, 본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 중합체를 인산염완충식염수 등에 희석한 후, 여기에 상기 양이온성 물질을 첨가하여 상온에서 방치하여 수용액 상에서 이온 복합체를 형성할 수 있다. 이때, 양이온성 물질의 첨가량은 사용되는 양이온성 물질의 양전하와 siRNA의 음전하의 전하 비가 1:1 (+/- = 1/1) ~ 100:1까지 조절할 수 있다.In the process of preparing the ionic complex, the siRNA multipolymer targeting the complex gene of the present invention may be diluted with phosphate buffered saline, etc., and then the cationic material is added thereto to stand at room temperature to form an ionic complex in an aqueous solution. . At this time, the addition amount of the cationic material can be adjusted from 1: 1 (+/- = 1/1) to 100: 1 charge ratio of the positive charge of the cationic material used and the negative charge of the siRNA.

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는, 양이온 고분자인 선형 PEI{linear PEI(polyethylenimine)}를 사용하여, 생체 내에서 siRNA 다중 접합체의 세포 전달을 위한 이온 복합체를 제조하였고, 이는 기존 siRNA 비해 분자량이 크고 음이온 전하 밀도가 높으며, 안정성이 높고, 양이온성 유전자 전달체와의 이온성 결합력이 우수하여 유전자 전달 효율이 현저히 높으며, 다중 접합체를 제조한 후에도 본래의 siRNA의 유전자 저해 기능에는 영향을 미치지 않고 유전자 전달체와의 결합력을 증대시켜 세포 내로의 도입 효율이 높아질 뿐만 아니라, 두 종류 이상의 복합 유전자를 동시에 표적할 수 있는 다양한 서열의 siRNA를 세포에 동시에 전달하여 각 서열에 특이적이고 복합적으로 저해 기능을 수행할 수 있으므로, 상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체; 및 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 양이온성 유전자 전달체; 간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 이온 복합체로서 유용하게 이용될 수 있다.
SiRNA multiple conjugates targeting the complex gene of the present invention, using a linear PEI (polyethylenimine), a cationic polymer, prepared an ionic complex for cell delivery of siRNA multiple conjugates in vivo, which is compared with conventional siRNA High molecular weight, high anion charge density, high stability, excellent ionic binding ability with cationic gene carrier, gene transfer efficiency is remarkably high, and it does not affect the gene inhibition function of the original siRNA even after producing multiple conjugates Increasing the binding capacity with the gene carrier to increase the efficiency of introduction into the cell, as well as to deliver siRNAs of various sequences that can target two or more complex genes simultaneously to the cell to perform specific and complex inhibitory functions for each sequence As such, siRNA multiplexed to target the complex gene Body; And a cationic peptide selected from the group consisting of cationic peptides, cationic lipids and cationic polymers; It can be usefully used as an ionic complex formed by ionic interaction of liver.

아울러, 본 발명은 상기 이온 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering the ionic complex to a subject.

상기 이온 복합체는 서비빈(survivin) 및 Bcl-2(B-cell CLL/lymphoma 2) 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, c-myb, c- myc , c- myb , c- fos , c- jun , k- ras, p21, PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), p-p38, PKC(Protein Kinase C) 및 MMP -1(Matrix Metallo Proteinase -1) 등과 같은 암과 관련된 유전자의 조합이라면 어느 siRNA라도 사용 가능하다. 또한, 상기 이온 복합체는 VEGF, VEGF -B, VEGF -C, VEGF -D 및 PIGF 등과 같은 두 가지 이상의 혈관신생 관련 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 포함할 수 있고, 이를 사용하여 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 또는 여드름과 같은 혈관신생에 관련된 질환의 치료에 이용할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 이온 복합체는 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종인플루엔자A바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 두 가지 이상의 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 포함할 수 있고, 이를 사용하여 바이러스성 질환의 치료에도 이용할 수 있다.The ionic complex preferably includes siRNA multiple conjugates targeting survivin and Bcl-2 (B-cell CLL / lymphoma 2) genes, but is not limited thereto, c-myb,c- myc , c- myb , c- fos , c- jun , k- ras,p21,PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen),VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor),p-p38,PKC(Protein Kinase C) AndMMP -One(Matrix Metallo Proteinase -OneAny siRNA can be used as long as it is a combination of genes related to cancer. In addition, the ionic complex VEGF,VEGF -B,VEGF -C,VEGF -D AndPIGF SiRNA multiple conjugates that target two or more angiogenesis-related genes, such as hemangiomas, angiofibromas, arthritis, diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, neovascular glaucoma, corneal disease caused by neovascularization, It can be used for the treatment of diseases related to angiogenesis such as degeneration, spot degeneration, pterygium, retinal degeneration, posterior capsular fibrosis, granuloconjunctivitis, psoriasis, capillary dilatation, purulent granulomas, seborrheic dermatitis or acne. In addition, the ionic complexes include influenza virus, influenza A virus subtype H1N1, avian influenza virus, rhinovirus, adenovirus, and coronavirus. coronavirus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, herpesvirus (HSV), human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis virus SiRNA multiple conjugates that target any two or more genes and may be used to treat viral diseases.

상기 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 이온 복합체를 투여하여 암의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다. The term "individual" as used herein refers to all animals, such as humans, monkeys, dogs, goats, pigs or mice having a disease that can improve the symptoms of cancer by administering the ionic complex of the present invention.

상기 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 이온 복합체를 제공하는 것을 의미한다.The term "administration" as used above means providing an individual with any of the ionic complexes of the present invention in any suitable manner.

상기 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 이온 복합체의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "treatment" refers to any action in which the symptoms of cancer improve or benefit from administration of the ionic complex of the present invention.

상기 암은 유방암(breast cancer), 대장암(colorectal cancer), 직장암(rectal cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 비-호지킨스 림프종(non-Hodgkins lymphoma; NHL), 신세포암(renal cell cancer), 전립선암(prostate cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 연부조직육종(soft-tissue sarcoma), 카포시육종(kaposi's sarcoma), 유암종(carcinoid carcinoma), 두경부암(head and neck cancer), 흑색종 melanoma), 난소암(ovarian cancer), 중피암(mesothelioma) 및 다발성골수종(multiple myeloma)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The cancer may include breast cancer, colorectal cancer, rectal cancer, non-small cell lung cancer, non-Hodgkins lymphoma (NHL), Renal cell cancer, prostate cancer, liver cancer, pancreatic cancer, soft-tissue sarcoma, kaposi's sarcoma, carcinoid carcinoma , Head and neck cancer (melanoma melanoma), ovarian cancer (ovarian cancer), mesothelioma (mesothelioma) and multiple myeloma (multiple myeloma) is preferably any one selected from the group but is not limited thereto.

본 발명에서는 서비빈(survivin) 및 Bcl-2 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체와 대표적인 유전자 전달체인 선형 PEI(Linear PEI)를 혼합한 이온 복합체를 암세포에 처리한 결과, 상기 두 종류의 siRNA를 물리적으로 혼합한 것에 비하여 현저한 서비빈 및 Bcl-2의 억제 효능과 암세포의 세포사멸 효과를 확인함으로써 암세포 치료에 있어서 이용가능성을 입증하였다. 이에, 본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 siRNA만을 이용하여 다중 접합체를 제조함으로써 생체 적합성이 뛰어나고, 본래의 siRNA의 유전자 저해 기능에는 영향을 미치지 않으며, 안정성 및 다양한 유전자 전달체와의 결합력이 증진되며, 두 종류 이상의 복합 유전자를 동시에 표적할 수 있는 다양한 서열의 siRNA를 세포에 동시에 전달하여 각 서열에 특이적이고 복합적으로 저해 기능을 수행함을 확인하였다. In the present invention, as a result of treating cancer cells with an ionic complex of a siRNA multiple conjugate targeting a survivin and a Bcl-2 gene and a linear PEI which is a representative gene carrier, the two kinds of siRNA are physically treated. Compared with the mixture, the applicability of cancer cells was proved by confirming the inhibitory effect of the survivin and Bcl-2 and the apoptosis effect of cancer cells. Thus, siRNA multiple conjugates targeting the complex gene of the present invention is excellent in biocompatibility by preparing multiple conjugates using only siRNA, does not affect the gene inhibitory function of the original siRNA, stability and binding ability with various gene carriers It was confirmed that siRNAs of various sequences capable of simultaneously targeting two or more complex genes simultaneously were delivered to cells to perform specific and complex inhibitory functions in each sequence.

따라서, 본 발명의 이온 복합체는 다양한 유전자 전달체를 포함시킴으로써 다양한 유전자 치료에 이용할 수 있으며, 특히, 암과 관련된 유전자를 복합적으로 저해하여 암에 대한 효과적인 유전자 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
Therefore, the ion complex of the present invention can be used for various gene therapies by including various gene carriers, and in particular, it can be usefully used for effective gene therapy for cancer by complexly inhibiting genes related to cancer.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are only illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.

<< 실시예Example 1> 양 말단이  1> both ends 관능기로With functional group 치환된 두 종류의  Two types of substitution siRNAsiRNA 및  And 가교제를Crosslinker 이용한 복합 유전자를  Using complex genes 표적하는Targeted siRNAsiRNA 다중 접합체의 제조 Preparation of Multiple Conjugates

센스 및 안티센스 가닥의 3' 양 말단이 설프하이드릴기(sulfhydryl group)로 치환된 이중가닥의 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) siRNA 및 사람 혈관내피성장인자(human vascular endothelial growth factor, hVEGF) siRNA를 준비하였다. 상기 두 이중가닥의 siRNA의 양쪽 말단의 설프하이드릴기를 환원시키기 위해, 각각의 siRNA를 디에틸렌피로카보네이트(DiethylenePyrocarbonate, DEPC)를 처리한 260 ㎕의 증류수에 녹인 다음, 22 ㎕의 25X 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS), 260 ㎕의 2M 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 용액, 및 pH를 맞추기 위한 4 ㎕의 5N 수산화나트륨(NaOH) 용액을 넣어준 뒤, 12시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 투석 과정을 통해 남아 있는 DTT를 제거하였고, 용액을 농축시켜서 최종 1 nmol/㎕의 농도로 이중가닥의 GFP siRNA 및 hVEGF siRNA를 수득한 후, 상기 두 siRNA를 혼합하였고, 최종 5X PBS가 되도록 25X PBS를 넣어준 뒤, 가교제인 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME) 또는 1,8-비스-말레이미도디에틸렌 글리콜{1,8-bis-maleimidodiethylene glycol, BM(PEG)2}을 티올기의 농도의 절반이 되는 농도로 넣어 24시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후에는 투석 과정을 통해 남아있는 가교제 등의 이물질을 제거한 뒤 농축시켜 최종 1 ~ 2 ㎍/㎕의 농도가 되도록 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조하였다(도 1의 A). Double-stranded green fluorescent protein (GFP) siRNA and human vascular endothelial growth factor (hVEGF) in which the 3 'ends of the sense and antisense strands are substituted with sulfhydryl groups siRNA was prepared. In order to reduce the sulfhydryl groups at both ends of the two double-stranded siRNAs, each siRNA was dissolved in 260 μl of distilled water treated with DiethylenePyrocarbonate (DEPC), and then 22 μl of 25X phosphate buffered saline ( phosphate buffered saline (PBS), 260 μl of 2M dithiothreitol (DTT) solution, and 4 μl of 5N sodium hydroxide (NaOH) solution to adjust pH, followed by reaction for about 12 hours. After the reaction, the remaining DTT was removed through dialysis, the solution was concentrated to obtain double stranded GFP siRNA and hVEGF siRNA at the concentration of 1 nmol / μL, and then the two siRNAs were mixed and the final 5X 25X PBS was added to make PBS, followed by dithio-bis-maleimidoethane (DTME) or 1,8-bis-maleimidodiethylene glycol (1,8-bis-maleimidodiethylene glycol). , BM (PEG) 2 } was added at a concentration equal to half the concentration of thiol group and reacted at room temperature for 24 hours. After the reaction, the siRNA multiple conjugates targeting the complex gene were prepared by removing foreign substances such as a crosslinking agent remaining through dialysis and concentrating to reach a final concentration of 1 to 2 μg / μl (FIG. 1A).

상기와 같이 제조된, GFR 및 VEGF를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 전기영동을 통해 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, GFP 및 VEGF를 표적하는 siRNA 다중 접합체에 각각 50 mM의 DTT를 처리한 경우, DTME에 의한 이황화결합을 포함하는, MGT-multi siRNA(cleavable)(a)가 siRNA 단량체로 분해(c)된 것으로 나타났고, BM(PEG)2에 의한 비분해성 결합으로 구성된 MGT-multi siRNA(noncleavable)(b)는 다중 접합체의 구조가 그대로 유지(d)되는 것으로 나타났다(도 2의 A).
The siRNA multiple conjugates targeting GFR and VEGF prepared as described above were confirmed by electrophoresis, and as shown in FIG. 2, when 50 mM DTT was treated to the siRNA multiple conjugates targeting GFP and VEGF, respectively, MGT-multi siRNA (cleavable) (a), including disulfide bonds by DTME, was shown to be cleaved (c) into siRNA monomers, and MGT-multi siRNA (noncleavable) consisting of non-degradable bonds by BM (PEG) 2 (b) shows that the structure of the multiple conjugate is maintained as it is (d) (A of FIG. 2).

<< 실시예Example 2> 한쪽 말단이  2> one end 관능기로With functional group 치환된 두 종류의 센스 가닥  Two Substituted Sense Strands siRNAsiRNA 의 of 2중량체2 weight 및  And 안티센스Antisense 가닥  piece 2중량체의2 weight 수소결합을 통한 복합 유전자를  Complex genes through hydrogen bonding 표적하는Targeted siRNAsiRNA 다중 접합체의 제조  Preparation of Multiple Conjugates

3' 말단에 설프하이드릴기로 치환된 GFP 및 VEGF siRNA 센스 가닥에, 상기 <실시예 1>의 방법에 따라, DTT를 처리하여 설프하이드릴기를 환원시키고 두 종류의 센스 가닥 siRNA를 가교제인 DTME 또는 BM(PEG)2를 사용하여 5X PBS에서 반응시킨 후, 투석과 농축 과정을 통해 최종 1 ~ 2 ㎍/㎕의 농도가 되도록 복합 유전자를 표적하는 siRNA 센스 가닥 2중량체를 제조하였다. 3' 말단에 설프하이드릴기로 치환된 GFP 및 VEGF siRNA 안티센스 가닥을 상기와 동일한 방법으로 처리하여 복합 유전자를 표적하는 siRNA 안티센스가닥 2중량체를 제조하였다. 이와 같이 제조된, 상기의 센스 및 안티센스 2중량체를 PBS 상에서 서로 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 방치하여 복합 유전자를 표적하는 이중가닥의 siRNA 다중 접합체를 제조하였다(도 1의 B). GFP and VEGF siRNA sense strands substituted with a sulfhydryl group at the 3 'end were subjected to DTT treatment to reduce sulfhydryl groups according to the method of <Example 1>, and two types of sense strand siRNAs were crosslinked with DTME or After reacting in 5X PBS using BM (PEG) 2 , siRNA sense strand dimers were prepared that target the complex gene to a final concentration of 1-2 μg / μl through dialysis and concentration. GFP and VEGF siRNA antisense strands substituted with a sulfhydryl group at the 3 'end were treated in the same manner as above to prepare siRNA antisense strand dimers targeting complex genes. Thus prepared sense and antisense dimers were mixed with each other on PBS and left at 37 ° C. for 1 hour to prepare double stranded siRNA multiple conjugates targeting complex genes (FIG. 1B).

상기와 같이 제조된, siRNA 다중 접합체를 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, 전기영동을 통해 확인하였다(도 2의 B).
SiRNA multiple conjugates, prepared as described above, were confirmed by electrophoresis, as shown in FIG. 2B (B in FIG. 2).

<< 실험예Experimental Example 1> 복합 유전자를  1> complex genes 표적하는Targeted siRNAsiRNA 다중 접합체에 대한  For multiple conjugates GFPGFP 및  And VEGFVEGF 발현량의 확인 Confirmation of expression amount

<1-1> <1-1> GFPGFP 를 발현하는 Expressing MDAMDA -- MBMB -435 -435 암세포주를Cancer cell lines 이용한  Used GFPGFP 및  And VEGFVEGF 발현량의 측정 Measurement of expression level

상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에 따라 제조된 GFP 및 VEGF의 두 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 농도별로 양이온성 유전자 전달체인 선형 PEI(linear PEI)를 이용하여 NP ratio 20에서 이온 복합체를 형성한 후, GFP 단백질을 안정적으로 발현하는 암세포주인 MDA-MB-435(삼양사(주)로부터 입수)에 5시간 동안 처리하여 세포의 GFP 단백질 발현의 저해하는 정도(A) 및 VEGF 단백질 발현의 저해 정도를 측정하였다. 또한, 상기 <실시예 1>과 같이, GFP 유전자에 대한 siRNA 및 VEGF 유전자에 대한 siRNA를 이황화결합으로 접합시켜 제조한, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체(도 1의 A, MGT-multi)는 선형 PEI를 이용하여, MDA-MB-435 세포에 5시간 동안 처리하였다. 이때, GFP 유전자에 대한 siRNA 및 VEGF 유전자에 대한 siRNA를 물리적으로 혼합한 것(naked mix)과, GFP 유전자에 대한 siRNA가 이황화결합으로 접합된 다중 접합체 및 VEGF 유전자에 대한 siRNA가 이황화결합으로 접합된 다중 접합체를 물리적으로 혼합한 것(SGT-multi mix)을 각각 선형 PEI와 이온 복합체를 만들어 대조군으로서 사용하였다. siRNA 농도를 0.5 ㎍/㎖ 까지 증가시켜 세포에 처리한 후 48시간 뒤, 발현된 GFP 단백질의 발현량을 형광분석기(fluorophotometer)를 이용하여 정량하였고(도 4의 A), 동일한 세포에서 분비되는 VEGF 단백질의 발현량을 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)을 이용하여 분석하였다(도 4의 B). SiRNA multiple conjugates targeting the two genes of GFP and VEGF prepared according to <Example 1> and <Example 2> according to the concentration ion in NP ratio 20 using linear PEI (linear PEI) as a cationic gene transporter After formation of the complex, treatment with MDA-MB-435 (available from Samyang Corp.), a cancer cell line stably expressing GFP protein, was performed for 5 hours to inhibit GFP protein expression of cells (A) and VEGF protein expression. The degree of inhibition of was measured. In addition, as in <Example 1>, siRNA multiple conjugates targeting complex genes prepared by conjugating siRNA for GFP gene and siRNA for VEGF gene by disulfide bond (A, MGT-multi in FIG. 1) Using linear PEI, MDA-MB-435 cells were treated for 5 hours. In this case, the siRNA for the GFP gene and siRNA for the VEGF gene are physically mixed (naked mix), the multiple conjugates in which the siRNA for the GFP gene is disulfide bond and the siRNA for the VEGF gene are disulfide bond. Physically mixing the multiple conjugates (SGT-multi mix) was used as a control to make a linear PEI and ionic complex, respectively. 48 hours after treatment with cells by increasing the siRNA concentration to 0.5 μg / ml, the expression level of the expressed GFP protein was quantified using a fluorophotometer (FIG. 4A), and VEGF secreted from the same cell. The expression level of the protein was analyzed using an enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) (FIG. 4B).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 1> 또는 <실시예 2>에 따라 제조된 siRNA 다중 접합체는 모두 GFP 및 VEGF에 대해 유사한 저해 효과를 나타냈다(도 3). 이에, 기존의 siRNA는 선형 PEI와 안정적으로 복합체를 형성하지 못하여 표적 유전자를 저해하지 못하였으나, 화학적으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 선형 PEI와 안정적이고 균일한 이온 복합체를 형성하여 효율적으로 표적 유전자를 저해함을 확인하였다(도 3). As a result, as shown in Figure 3, the siRNA multiple conjugate prepared according to the <Example 1> or <Example 2> all showed a similar inhibitory effect on GFP and VEGF (Fig. 3). Therefore, the existing siRNA did not stably complex the linear PEI and did not inhibit the target gene, but the siRNA multiple conjugate that targets the chemically conjugated complex gene efficiently forms a stable and uniform ion complex with the linear PEI. It was confirmed that it inhibits the target gene (Fig. 3).

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 두 종류의 siRNA를 이용하였을 때, 각 siRNA가 표적 유전자인 GFP 및 VEGF mRNA에 서열 특이적으로 작용하여 그 발현을 억제함을 확인하였고, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는, 물리적으로 혼합된 siRNA 다중 접합체에 비해 각 표적 유전자들의 발현을 더욱 효과적으로 저해하는 것을 확인하였다(도 4).
In addition, as shown in Figure 4, when using two kinds of siRNA, it was confirmed that each siRNA acts specific to the target genes GFP and VEGF mRNA to inhibit its expression, siRNA that targets the complex gene Multiple conjugates were found to inhibit the expression of each target gene more effectively than physically mixed siRNA multiple conjugates (FIG. 4).

<1-2> <1-2> GFPGFP 를 발현하는 A549 및 Expressing A549 and PCPC -3 -3 암세포주를Cancer cell lines 이용한  Used GFPGFP 발현량의 측정 Measurement of expression level

상기 실험예 <1-1>과 같은 방법에 따라, 상기 <실시예 1>에 따라 이황화결합으로 접합시켜 제조한 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체(도 1의 A, MGT-multi)를 GFP를 발현하는 A549 또는 PC-3 세포주(삼양사(주)로부터 입수)에 처리하여 GFP 발현의 감소량을 형광분석기(fluorophotometer)를 이용하여 분석하였다.According to the same method as in Experimental Example <1-1>, the siRNA multiple conjugate (A, MGT-multi in FIG. 1) targeting the complex gene prepared by disulfide bond according to <Example 1> was GFP. The amount of GFP expression was analyzed by treating the expressing A549 or PC-3 cell line (obtained from Samyang Co., Ltd.) using a fluorophotometer.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-435 세포주와 유사한 GFP 발현 감소 효과를 확인하였다(도 5).
As a result, as shown in FIG. 5, the effect of reducing GFP expression similar to that of the MDA-MB-435 cell line was confirmed (FIG. 5).

<1-3> <1-3> 공초점Confocal 현미경( microscope( Confocal microscopy)을Confocal microscopy 이용한  Used GFPGFP 발현양의Expression 확인 Confirm

상기 <실시예 1>에 따라 이황화결합으로 접합시켜 제조한 GFP 및 VEGF를 표적하는 siRNA 다중 접합체 0.5 ㎍/㎖을, 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-435-GFP 세포주에 처리한 후, 공초점현미경(confocal microscopy)을 이용하여 감소된 GFP 강도를 이미지로 관찰하였다. 세포핵을 선택적으로 파랗게 염색하는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 및, 엔도좀과 라이소좀을 선택적으로 붉게 염색하는 리소트랙커(LysoTracker)를 이용하여 세포를 염색하였다. 이때, 각 이미지에서 나타나는 녹색은 세포에서 발현된 GFP를 나타냈다. 0.5 µg / ml of siRNA multiple conjugates targeting GFP and VEGF prepared by disulfide bonds according to <Example 1> was obtained using the same MDA-MB-435-GFP cell line as in Experimental Example <1-1>. After treatment, the reduced GFP intensity was imaged using confocal microscopy. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), which selectively stains the nucleus of the cell nuclei, and a lithotracker that selectively stains the endosomes and lysosomes in red. LysoTracker) was used to stain the cells. In this case, the green color in each image represents the GFP expressed in the cells.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 대조군에 비해 효과적으로 GFP를 저해하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6).
As a result, as shown in Figure 6, siRNA multiple conjugates targeting the complex gene was observed to inhibit the GFP more effectively than the control group (Fig. 6).

<1-4> <1-4> 역전사Reverse transcription 중합효소연쇄반응( Polymerase chain reaction ReverseReverse TranscriptionTranscription PCRPCR , , RTRT -- PCRPCR )을 이용한 ) GFPGFP 및  And VEGFVEGF mRNAmRNA 의 발현량 확인Expression level

상기 <실시예 1>에 따라 이황화결합으로 접합시켜 제조한 GFP 및 VEGF를 표적하는 siRNA 다중 접합체 0.5 ㎍/㎖을, 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-435-GFP 세포주에 처리한 후, 상기 세포로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR를 통해 감소된 VEGF 및 GFP의 mRNA 발현량을 확인하였다. 구체적으로, 선형 PEI를 이용하여 제작된 이온 복합체를 5시간 동안 세포에 처리한 후, 24시간 뒤에 전체 RNA를 분리하여 이를 PCR을 통해서 GFP 및 VEGF mRNA를 증폭시킨 후 전기영동을 통해 상대적인 양을 비교하였다. 0.5 µg / ml of siRNA multiple conjugates targeting GFP and VEGF prepared by disulfide bonds according to <Example 1> was obtained using the same MDA-MB-435-GFP cell line as in Experimental Example <1-1>. After the treatment, RNA was isolated from the cells to confirm mRNA expression levels of VEGF and GFP decreased through RT-PCR. Specifically, the ionic complex prepared using linear PEI was treated with the cells for 5 hours, after 24 hours, the total RNA was isolated, and the GFP and VEGF mRNAs were amplified by PCR, and the relative amounts were compared by electrophoresis. It was.

그 결과, GFP 및 VEGF를 표적하는 siRNA 다중 접합체에 의해 표적 유전자인 GFP 및 VEGF mRNA 발현이 각각 서열 특이적으로 억제되었고, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는, 물리적으로 혼합된 siRNA 다중 접합체에 비해 각 표적 mRNA양을 더욱 효과적으로 감소시킴을 확인하였다(도 7).
As a result, siRNA multiple conjugates targeting GFP and VEGF inhibited sequence expression of GFP and VEGF mRNA, which are target genes, respectively, and siRNA multiple conjugates targeting complex genes were compared to physically mixed siRNA multiple conjugates. It was confirmed that the amount of each target mRNA was reduced more effectively (FIG. 7).

<< 실험예Experimental Example 2> 복합 유전자를  2> complex genes 표적하는Targeted siRNAsiRNA 다중 접합체의 면역반응 유도 확인 Confirmation of Induction of Immune Response of Multiple Conjugates

상기 <실시예 1>에서 제조된 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 면역반응 유도 정도를 확인하기 위해, 인간 혈액으로부터 단핵구 세포인 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 Fisher lymphocyte speration medium을 이용하여 분리하였다. 물리적으로 혼합한 GFP siRNA/VEGF siRNA(naked mix), 및 물리적으로 혼합한 GFP siRNA 이황화결합 다중 접합체/VEGF siRNA 이황화결합 다중 접합체(SGT-multi mix)를 대조군으로서 사용하였고, GFP 및 VEGF siRNA를 이황화결합{MGT-multi(cleavable)} 또는 비분해성 공유결합{MGT-multi(noncleavable)}으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 실험군으로서 사용하였다. 두 종류의 양이온성 유전자 전달체인 선형 PEI 및 DOTAP를 이용하여 이온 복합체를 만들어, 360 nM의 최종농도에서 각각의 siRNA 복합체들을 PBMC 세포에 24시간 동안 처리하였다. 분비된 인터페론-알파(interferon-α, INF-α)의 양을 확인하기 위해 세포의 상층액을 이용하여 ELISA를 실시하였다(도 8의 A). 또한, 상기 이황화결합 또는 비분해성 공유결합으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 표적 단백질 저해 효과를 상기 <실험예 1>에 따라 확인하였다(도 8의 B). In order to confirm the degree of induction of the immune response of the siRNA multiple conjugate targeting the complex gene prepared in Example 1, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), which are monocyte cells from human blood, were obtained from Fisher lymphocyte speration medium. Was separated using. Physically mixed GFP siRNA / VEGF siRNA (naked mix), and physically mixed GFP siRNA disulfide multiple conjugate / VEGF siRNA disulfide multiple conjugate (SGT-multi mix) were used as controls, and GFP and VEGF siRNA were disulfide. SiRNA multiple conjugates targeting complex genes conjugated by binding {MGT-multi (cleavable)} or non-degradable covalent {MGT-multi (noncleavable)} were used as experimental groups. Ionic complexes were made using two types of cationic gene carriers, linear PEI and DOTAP, and each siRNA complexes were treated with PBMC cells for 24 hours at a final concentration of 360 nM. ELISA was performed using the supernatant of cells to confirm the amount of secreted interferon-alpha (INF-α) (FIG. 8A). In addition, the target protein inhibitory effect of siRNA multiple conjugates targeting the complex gene conjugated by the disulfide bond or non-degradable covalent bond was confirmed according to <Experimental Example 1> (Fig. 8B).

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 이황화결합으로 접합시킨 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 비분해성 공유결합으로 접합시킨 것에 비해 효율적으로 표적 단백질의 발현을 저해하였고(도 8의 B), 기존의 siRNA 또는 물리적으로 혼합한 siRNA 다중 접합체에 비하여 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 제조된, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체가 INF-α의 유도를 크게 일으키지 않음을 알 수 있었다. 특히, 이황화결합을 이용한 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 경우, 기존의 siRNA와 비슷한 정도의 인터페론-알파 유도를 나타냈다(도 8의 A).
As a result, as shown in FIG. 8, siRNA multiple conjugates targeting complex genes conjugated by disulfide bonds inhibited expression of target proteins more efficiently than non-degradable covalent bonds (FIG. 8B). It was found that siRNA multiple conjugates targeting the complex genes produced in <Example 1> and <Example 2> did not significantly induce INF-α in comparison with siRNA or physically mixed siRNA multiple conjugates. . In particular, siRNA multiple conjugates targeting complex genes using disulfide bonds showed a similar degree of interferon-alpha induction as conventional siRNAs (FIG. 8A).

<< 실험예Experimental Example 3>  3> 서비빈Survivin (( survivinsurvivin ) 및 ) And BclBcl -2를 -2 표적하는Targeted 복합 유전자를  Complex genes 표적하는Targeted siRNAsiRNA 다중 접합체의 제조 및 표적 유전자 발현 저해 확인 Preparation of Multiple Conjugates and Identification of Target Gene Expression Inhibition

상기 <실시예 1>과 같은 방법으로, 센스 및 안티센스 모두 3' 말단이 설프하이드릴기로 치환된 이중가닥의 서비빈(survivin) siRNA 및 Bcl-2 siRNA를 가교제인 DTME를 이용하여 서비빈(survivin) 및 Bcl-2를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 제조하여, 도 9의 A에 나타낸 바와 같이, 전기영동을 통하여 확인하였다(도 9의 A). 상기 제조된 서비빈(survivin) 및 Bcl-2를 표적하는 siRNA 다중 접합체 2 ㎍/㎖을 사용하여, 헬라(HeLa) 세포(한국세포주은행에서 구입)에 처리한 후 2 시간 뒤, 상기 실험예 <1-4>의 방법에 따라 서비빈 및 Bcl-2 mRNA의 양을 확인하였다. In the same manner as in <Example 1>, both survivin (survivin) siRNA and Bcl-2 siRNA having 3 'ends substituted with sulfhydryl groups in both sense and antisense were survivin (survivin) using DTME as a crosslinking agent. ) And siRNA multiple conjugates targeting Bcl-2 were confirmed by electrophoresis, as shown in FIG. 9A (FIG. 9A). 2 hr after treatment with HeLa cells (purchased from Korea Cell Line Bank) using 2 μg / ml of the siRNA multiple conjugates targeting the survivin and Bcl-2 prepared above, the experimental example < The amount of survivin and Bcl-2 mRNA was confirmed according to the method of 1-4>.

그 결과, 도 9의 B에 나타낸 바와 같이, 서비빈 및 Bcl-2를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 GFP 및 VEGF 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 경우와 동일하게, 표적 유전자인 서비빈 및 Bcl-2의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 9의 B).
As a result, as shown in FIG. 9B, siRNA multiple conjugates targeting the survivin and Bcl-2 are the same as the siRNA multiple conjugates targeting the GFP and VEGF complex genes. It was confirmed to suppress the expression of 2 (FIG. 9B).

<< 실험예Experimental Example 4>  4> 서비빈Survivin (( survivinsurvivin ) 및 ) And BclBcl -2를 -2 표적하는Targeted 복합 유전자를  Complex genes 표적하는Targeted siRNAsiRNA 다중 접합체를 이용한 암세포의 세포사멸 유도 확인 Confirmation of apoptosis of cancer cells using multiple conjugates

상기에서 확인한 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 향상된 표적 단백질 발현 억제 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 상기 <실험예 3>과 같이, 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포를 치료하는 목적으로 연구되고 있는 서비빈(survivin) siRNA 및 Bcl-2 siRNA를 사용하여 제작한 siRNA 다중 접합체(MGT-multi, 도 1의 A)를 선형 PEI를 이용하여 이온 복합체를 만들어 암세포인 헬라(HeLa) 세포 및 MCF7 세포(한국세포주은행에서 구입)에 5시간 동안 처리하였다. 한편, 서비빈 유전자에 대한 siRNA 및 Bcl-2 유전자에 대한 siRNA를 물리적으로 혼합한 것(naked mix), 서비빈 유전자에 대한 siRNA가 이황화결합으로 접합된 다중 접합체 및 Bcl-2 유전자에 대한 siRNA가 이황화결합으로 접합된 다중 접합체를 물리적으로 혼합한 것(SGT-multi mix), 또는 각각의 다중 접합체를 단독으로 사용하여(survivin multi 및 Bcl-2 multi), 그것을 선형 PEI와 이온 복합체를 제조하여 대조군으로서 사용하였다. 2 ㎍/㎖ 까지 siRNA의 농도를 증가시켜 세포에 처리한 후 4일 뒤에 CCK-8 assay kit를 사용하여 세포사멸 정도를 정량화하였다(도 10). MCF7 세포의 경우에는 2 ㎍/㎖의 농도를, 헬라(Hela) 세포의 경우에는 3 ㎍/㎖ 농도의 siRNA를 5시간 동안 처리하여 24시간 뒤에 Annexin V/PI 염색을 하여, 형광활성세포분류기(fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 통해 유도된 세포사멸을 관찰 및 비교하였고, 이를 막대그래프로 정량화하였다(도 11). In order to further confirm the enhanced target protein expression inhibitory effect of the siRNA multiple conjugates targeting the complex gene identified above, as in <Experimental Example 3>, a service that is being studied for treating cancer cells by inducing apoptosis of cancer cells SiRNA multiple conjugates (MGT-multi, A of FIG. 1) prepared using survivin siRNAs and Bcl-2 siRNAs were used to form ionic complexes using linear PEI cells such as HeLa cells and MCF7 cells (Korea Purchased from a cell line bank) for 5 hours. On the other hand, the siRNA for the survivin gene and siRNA for the Bcl-2 gene physically mixed (naked mix), the siRNA for the survivin gene is conjugated by disulfide bond multiple conjugates and siRNA for the Bcl-2 gene Physically mixing the multiple conjugates conjugated by disulfide bonds (SGT-multi mix), or using each of the multiple conjugates alone (survivin multi and Bcl-2 multi), to prepare linear PEI and ionic complexes Used as. Four days after treatment with cells by increasing the concentration of siRNA to 2 ㎍ / ㎖, the degree of cell death was quantified using a CCK-8 assay kit (Fig. 10). In the case of MCF7 cells, 2 μg / ml concentration of HeLa cells and 3 μg / ml concentration of siRNA were treated for 5 hours, followed by Annexin V / PI staining for 24 hours. Apoptosis induced by fluorescence-activated cell sorting (FACS) was observed and compared, and quantified by a bar graph (FIG. 11).

그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포사멸을 유도하는 동일한 역할을 하는 두 종류의 siRNA를 이용하여 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 사용한 경우, 한 가지 서열만을 갖는 siRNA 다중 접합체, 또는 그 다중 접합체의 물리적 혼합을 처리한 경우보다 더욱 효과적으로 암세포의 세포사멸을 유도하였음을 확인하였다(도 10 및 도 11).
As a result, as shown in Figure 10 and 11, when using a siRNA multiple conjugate that targets a complex gene using two kinds of siRNA that plays the same role in inducing apoptosis, siRNA multiple conjugate having only one sequence, Or it was confirmed that induced apoptosis of cancer cells more effectively than when the physical mixing of the multiple conjugates (Fig. 10 and 11).

본 발명의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체는 다양한 서열의 siRNA의 전달 효율을 높여, 서로 관련성 있는 유전자들을 복합적으로 저해함으로써, 유전자 치료용 약제 또는 유전자 치료 등의 의약분야에 유용하게 이용될 수 있다.
SiRNA multiple conjugates targeting the complex gene of the present invention can be usefully used in the pharmaceutical field, such as gene therapy drugs or gene therapy by increasing the efficiency of delivery of siRNA of various sequences, by complexly inhibiting related genes. .

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multi-conjugate of siRNA targeting multiple genes and preparing method thereof <130> 9p-12-51 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cationic fusogenic peptide(KALA) <400> 1 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Ala Cys Glu Ala 20 25 30 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multi-conjugate of siRNA targeting multiple genes and preparing          method <130> 9p-12-51 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cationic fusogenic peptide (KALA) <400> 1 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His   1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Ala Cys Glu Ala              20 25 30

Claims (21)

두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 가지는, 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체:

[구조식 1]
-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni-
(여기서,
X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체;
A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;
i는 2 이상의 정수; 및
ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수),

[구조식 2]
x - A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni - x'
(여기서,
X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체;
x와 x'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체;
A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;
i는 2 이상의 정수; 및
ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수).
Two or more double-stranded sense / antisense small interfering RNA (siRNA) monomers are linked directly or through a covalent bond via a crosslinking agent or a polymer [Structure 1] or [Formula 2] SiRNA multiple conjugates targeting complex genes having:

[Formula 1]
-(X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni-
(here,
X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;
A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;
i is an integer of 2 or more; And
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more),

[Formula 2]
x-A- (X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -x '
(here,
X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;
x and x 'are single stranded sense / antisense siRNA monomers;
A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;
i is an integer of 2 or more; And
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more).
제 1항에 있어서, 상기 이중가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체는 15 내지 29의 핵산 염기수를 가지는 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체.
The siRNA multiple conjugate of claim 1, wherein the double stranded sense / antisense siRNA monomer has a nucleic acid base number of 15 to 29. 3.
제 1항에 있어서, 상기 siRNA 다중 접합체는 서비빈(survivin) 및 Bcl-2를 표적하는 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체.
The siRNA multiple conjugate of claim 1, wherein the siRNA multiple conjugate targets survivin and Bcl-2.
두 종류 이상의 이중가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 가지는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법:

[구조식 1]
-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni-
(여기서,
X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체;
A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;
i는 2 이상의 정수; 및
ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수),

[구조식 2]
x-A-(X1-A)n1 - (X2-A)n2 - (X3-A)n3 - (X3-A)n3 - … - (Xi-A)ni - x'
(여기서,
X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체;
x와 x'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체;
A는 있거나 없을 수 있으며, 가교제 또는 고분자;
i는 2 이상의 정수; 및
ni는 이중가닥 siRNA 단량체의 개수로서, 1 이상의 정수).
Preparation of siRNA multiple conjugates targeting complex genes having the following [formula 1] or [formula 2] prepared by covalently binding two or more double-stranded sense / antisense siRNA monomers directly or via a crosslinking agent or a polymer Way:

[Formula 1]
-(X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni-
(here,
X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;
A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;
i is an integer of 2 or more; And
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more),

[Formula 2]
xA- (X 1 -A) n1 -(X 2 -A) n2- (X 3 -A) n3 -(X 3 -A) n3- . -(X i -A) ni -x '
(here,
X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;
x and x 'are single stranded sense / antisense siRNA monomers;
A may or may not be present and may be a crosslinking agent or a polymer;
i is an integer of 2 or more; And
n i is the number of double-stranded siRNA monomers, an integer of 1 or more).
제 4항에 있어서, 상기 제조 방법은
1) 말단이 서로 같거나 다른 관능기로 치환된 두 종류 이상의 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체(x1-b + a-x1', x2-b + a-x2', …, xi-b + a-xi')를 상보적 수소결합을 통해 a-X1-b, a-X2-b, …, 및 a-Xi-b로 만드는 단계; 및
2) 상기 a-X1-b, a-X2-b, …, 및 a-Xi-b를 가교제 또는 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법:
(여기서,
X1, X2, X3, …, Xi는 서로 다른 서열의 이중가닥 siRNA 단량체;
x1, x2, xi와 x1', x2', xi'는 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체; 및
a와 b는 말단에 도입된, 같거나 다른 관능기).
The method of claim 4, wherein the manufacturing method
1) Two or more types of single-stranded sense / antisense siRNA monomers each having the same or different terminal groups (x 1 -b + ax 1 ', x 2 -b + ax 2 ',…, x i -b + ax i ') Through complementary hydrogen bonding aX 1 -b, aX 2 -b,... , And aX i -b; And
2) the aX 1 -b, aX 2 -b,... And covalently bonding aX i -b through a crosslinking agent or a polymer, a method for preparing a siRNA multiple conjugate targeting a complex gene, the method comprising:
(here,
X 1 , X 2 , X 3 ,. , X i is a double-stranded siRNA monomer of different sequence;
x 1 , x 2 , x i and x 1 ′, x 2 ′, x i ′ are single stranded sense / antisense siRNA monomers; And
a and b are the same or different functional groups introduced at the terminal).
제 4항에 있어서, 상기 제조 방법은
1) 말단이 서로 같거나 다른 관능기로 치환된 두 종류 이상의 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체(x1-b + a-x2와 x1'-b + a-x2') 각각을 가교제 또는 고분자를 매개로 공유결합시켜 2중량체인 x1-b-a-x2와 x1'-b-a-x2'로 만드는 단계; 및
2) 상기 2중량체인 x1-b-a-x2와 x1'-b-a-x2'를 상보적 수소결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법:
(여기서,
x1및 x2는 서로 다른 서열의 단일가닥 센스 siRNA 단량체;
x1'및 x2'는 서로 다른 서열의 단일가닥 안티센스 siRNA 단량체; 및
a와 b는 말단에 도입된, 같거나 다른 관능기).
The method of claim 4, wherein the manufacturing method
1) Sharing two or more single-stranded sense / antisense siRNA monomers (x 1 -b + ax 2 and x 1 '-b + ax 2 ') each of which has the same or different functional groups at the ends thereof through a crosslinking agent or a polymer; Combining to make a biweight x 1 -bax 2 and x 1 '-bax 2 '; And
2) a method for preparing a siRNA multiple conjugate targeting a complex gene, comprising the step of complementarily hydrogen-bonding the dimer, x 1 -bax 2 and x 1 '-bax 2 ';
(here,
x 1 and x 2 are single-stranded sense siRNA monomers of different sequences;
x 1 ′ and x 2 ′ are single-stranded antisense siRNA monomers of different sequences; And
a and b are the same or different functional groups introduced at the terminal).
제 4항에 있어서, 상기 공유결합은 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
The method of claim 4, wherein the covalent bonds are non-degradable amide bonds, urethane bonds; Acid decomposable ester bonds, hydrazone bonds, acetal bonds; Disulfide bonds that are degradable reducing agents; Biodegradable bonds; And enzymatic degradable binding; siRNA multiple conjugate for targeting a complex gene, characterized in that any one selected from the group consisting of.
제 5항 또는 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH) 및 아민기(-NH2)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
The functional group according to any one of claims 5 and 6, wherein the functional group is any one selected from the group consisting of sulfhydryl group (-SH), carboxyl group (-COOH) and amine group (-NH 2 ). Method for producing a siRNA multiple conjugate targeting a complex gene.
제 4항에 있어서, 상기 단일가닥 센스/안티센스 siRNA 단량체는 3' 또는 5' 말단이 모두 관능기로 치환되어, 제조된 것임을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
5. The method of claim 4, wherein the single-stranded sense / antisense siRNA monomer is prepared by replacing all 3 ′ or 5 ′ ends with a functional group. 6.
제 4항에 있어서, 상기 공유결합의 매개로 사용되는 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산 (poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자;인 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
The method of claim 4, wherein the polymer used as a covalent bond is selected from the group consisting of polyethyleneglycol (PEG), pluronic, polyvinylpyrolidone, and polyoxazolin. Any one or more nonionic hydrophilic polymer selected; Or poly-L-lactic acid, poly-glycolic acid, poly-D-lactic-co-glycolic acid, poly Poly-L-lactic-co-glycolic acid, poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, poly-L-lactic-co-glycolic acid At least one biodegradable polyester polymer selected from the group consisting of polycaprolactone, poly-valerolactone, polyhydroxybutyrate and polyhydroxyvalerate; Method for producing a siRNA multiple conjugate targeting the complex gene, characterized in that.
제 4항에 있어서, 상기 가교제는 분자량이 100 ~ 10000이 되는 것으로 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2}, 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페닐아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드록시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
According to claim 4, wherein the crosslinking agent has a molecular weight of 100 to 10000 Dithio-bis-maleimidoethane (Dithio-bis-maleimidoethane (DTME), 1,8-bis-maleimido diethylene glycol {1,8 Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM (PEG) 2 }, maleimide, enhydroxysuccinimide (NHS, N-hydroxysuccinimide), vinylsulfone, iodoacetyl nitrophenyl azide SiRNA targeting a complex gene, characterized in that any one or more selected from the group consisting of isocyanate, pyridyldisulfide, hydrazide and hydroxyphenyl azide. Method of Making Multiple Conjugates.
제 4항에 있어서, 상기 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 말단에 세포 선택적 리간드가 더 구비되어지는 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
5. The method of claim 4, wherein a cell-selective ligand is further provided at the ends of the siRNA multiple conjugates targeting the complex genes. 6.
제 12항에 있어서, 상기 더 구비되어지는 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 알지디(RGD) 및 트렌스페린(transferrin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
The method of claim 12, wherein the ligand is further provided is a cell-specific antibody, cell selective peptide, cell growth factor, folic acid (gallicose) galactose, mannose, algidi (RGD) and transferrin Method of producing a siRNA multiple conjugate targeting a complex gene, characterized in that any one or more selected from the group consisting of (transferrin).
제 4항에 있어서, 상기 siRNA가 갖는 관능기를 활성화하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
The method of claim 4, further comprising activating a functional group possessed by the siRNA.
제 14항에 있어서, 상기 siRNA 갖는 관능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β-말레이미도프로피오닉엑시드(N-β-Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜다이싸이오) 프로피오네이트{N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate}로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체의 제조방법.
15. The method of claim 14, wherein the siRNA-activated functional group is 1-ethyl-3, 3-dimethylaminopropyl carbodiimide, imidazole, N- N-hydroxysuccinimide, dichlorohexylcarbodiimide, N-β-maleimidopropionic acid, N-β-maleimidopropyl succinimide ester (N-hydroxysuccinimide) N-β-maleimidopropyl succimimide ester) and N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate {N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate} Method for producing a siRNA multiple conjugate targeting a complex gene characterized in that.
제 1항의 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체; 및 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 양이온성 유전자 전달체; 간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 이온 복합체.
SiRNA multiple conjugates targeting the complex gene of claim 1; And a cationic peptide selected from the group consisting of cationic peptides, cationic lipids and cationic polymers; Ionic complexes formed by ionic interactions between them.
제 16항에 있어서, 상기 양이온성 펩타이드는 양이온 융합성 펩타이드(cationic fusogenic peptide, KALA), 폴리라이신(polylysine) 및 프로타민(protamine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온 복합체.
The ionic complex of claim 16, wherein the cationic peptide is any one selected from the group consisting of cationic fusogenic peptide (KALA), polylysine, and protamine.
제 16항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 다이올레일 포스페티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine) 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린(cholesterol dioleoyl phosphatidyl choline)인 것을 특징으로 하는 이온 복합체.
17. The ionic complex of claim 16, wherein the cationic lipid is dioleoyl phosphatidylethanolamine or cholesterol dioleyl phosphatidyl choline.
제 16항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리아민(polyamines) 및 폴리비닐아민(polyvinylamine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온 복합체.
The ionic complex of claim 16, wherein the cationic polymer is any one selected from the group consisting of polyethylenimine, polyamines, and polyvinylamines.
제 16항의 이온 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
A method of treating cancer, comprising administering the ionic complex of claim 16 to a subject.
제 20항에 있어서, 상기 이온 복합체는 서비빈(survivin) 및 Bcl-2 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.
The method of claim 20, wherein the ionic complex comprises an siRNA multiple conjugate that targets survivin and Bcl-2 genes.
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