KR20110081846A - 미네랄로코르티코이드 수용체 활성화의 바이오마커 - Google Patents

미네랄로코르티코이드 수용체 활성화의 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자에게서 미네랄로코르티코이드 수용체(MR) 활성화의 바이오마커로서 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin: NGAL) 및/또는 SERPINA3의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 NGAL 유전자 및/또는 SERPINA3 유전자의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제에 의한 처리에 대한 환자의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

미네랄로코르티코이드 수용체 활성화의 바이오마커{BIOMARKERS OF MINERALOCORTICOID RECEPTOR ACTIVATION}
본 발명은 환자 내 미네랄로코르티코이드 수용체(Mineralocorticoid Receptor: MR) 활성화의 바이오마커에 관한 것이다.
미네랄로코르티코이드 수용체(MR)는 글루코코르티코이드 수용체(GR), 안드로겐 수용체(AR), 프로게스테론 수용체(PR), 및 에스트로겐 수용체(ER)를 비롯한 고전적인 스테로이드 호르몬 수용체의 일원이다(Funder, 1997). 이러한 수용체는 기관 발달 및 분화에서 기분 조절 및 스트레스 반응에 이르는 매우 다양한 생리학적 과정을 조절하는 호르몬-활성화 전사 인자이다(Beato et al., 1995). MR에 대한 생리학적 호르몬은 부신에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 알도스테론이다.
MR은 혈관, 뇌 및 심장 내 비-상피 부위에 위치하고 있다(Bonvalet JP. et al. 1995; Lombes M, et al. 1992; Tanaka J. et al. 1997). 지난 10 년에 걸친 수 많은 연구는 미네랄로코르티코이드의 비-상피 작용이 혈관 및 심근 섬유증 및 영양 효과를 담당한다는 것을 제시하고 있다(Brilla CG. et al. 1992, Ullian ME. et al. 1992; Young M. et al. 1994). 또한, MR은 인간 내피 세포 및 혈관 평활근 세포(VSMC)(Hatakeyama H. et al. 1994) 및 동물 연구에서 심근 세포(Silvestre JS.et al. 1988)를 포함하여 발견되었다. 여러 연구(Brilla CG et al. 1992; Young M. et al. 1994)는 심근 세포 내 콜라겐 형성의 자극을 통한 심근 섬유증과 미네랄로코르티코이드를 관련지었다.
문헌 [Farquharson CA. et al. (2000)]에서는 알도스테론이 만성 심부전에서 내피 기능이상에 역할을 할 수 있을 것으로 간접적으로 보여주었다. 따라서 MR은 고혈압 및 심부전의 치료를 특히 표적으로 하는 중요한 약물이다.
예를 들어, 알도스테론 길항제 스피로놀락톤(또한 ALDACTONE®, PFIZER로서 공지되어 있음)은 미네랄로코르티코이드 수용체에 결합하고 알도스테론의 결합을 차단한다. 상기 스테로이드성 화합물은 울혈성 심부전의 치료에 통상 사용된다. 실제로, 스피로놀락톤은 사망, 진행성 심부전으로 인한 사망, 및 심장 요인으로 인한 급사의 전반적인 위험 뿐만 아니라, 심장 요인으로 인한 입원 위험을 감소시키기 위해 약동학적으로 효과적이며 잘 용인되는 것으로 보여진다. 심각한 심부전 환자에 대한 스피로놀락톤의 투여를 랜덤화 알닥톤 평가 연구(Randomized Aldactone Evaluation Study: RALES)에서 평가하였다. RALES는 심각한 심부전 및 35% 이하의 좌심실 박출률을 갖고, 안지오텐신-전환 효소 억제제, 고리 이뇨제, 및 일부 경우에서, 디곡신을 통상적으로 포함하는 표준 요법을 받은 참가자를 등록한 랜덤화된, 이중 맹검의, 플라시보-통제된 실험이었다. 스피로놀락톤으로 치료된 RALES 대상은 플라시보-처리된 대상에 비해 사망률 및 입원 빈도가 통계적으로 유의하게 감소하였다(Pitt B. et al. 1999).
마찬가지로, 에플레레논은 미네랄로코르티코이드 수용체에서의 알도스테론 결합에 대한 또다른 차단제의 예이다. 이의 작용은 에플레레논이 재조합 인간 글루코코르티코이드, 프로게스테론 및 안드로겐 수용체에 결합하는 것보다 재조합 인간 미네랄로코르티코이드 수용체에 우선적으로 결합한다는 점에서 선택적이다. 에플레레논의 투여와 연관된 치료적 이득은 복합 임상 실험에서 증명되었다. 6,600 명이 넘는 대상이 포함된 하나의 이러한 연구에서[the Eplerenone Post-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and Survival Study (EPHESUS)], 에플레레논은 심혈관 요인에 기인하는 사망 위험 및 심혈관 사건에 대한 입원 위험을 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다(Pitt B. et al. 2003). 심장 요인으로 인한 급사율의 감소가 또한 관찰되었다.
그러나 알도스테론은 MR을 활성화시키는 것으로 알려진 유일한 내생 호르몬이 아니다. 예를 들어, 내생 글루코코르티코이드도 또한 MR을 활성화시킬 수 있다. 실제로, 글루코코르티코이드는 심장 섬유증 발달 초기 단계에서 산화 스트레스 및 혈관 염증을 생성한다는 것으로 제시되었다. 따라서 심혈관계에서 MR 활성화의 유해한 효과가 심지어 고알도스테론혈증의 부재하에서도 일어날 수 있으며(Funder JW, 2006), 알도스테론의 혈장 수준은 심혈관계에서의 MR 활성화에 대한 지표를 제공하지 않는다. 게다가, MR 발현은 심부전, 심근 경색증 또는 고혈압과 연관된 말단-기관 손상에서의 심장 또는 혈관에서 증가된다(Nagata K, et al. 2006; Takeda M. et al., 2007).
따라서, 심혈관계에서 MR 활성화를 평가하기 위한 정확하고 특이적인 방법을 개발할 필요가 당업계에 여전히 존재한다.
또한, 환자에게 MR 길항제를 투여하는 것은 고칼륨혈증과 같은 심각한 부작용을 동반할 수 있다. 실제로, RALES 연구 발행지에 따른 심각한 고칼륨혈증에 대한 여러 개의 보고가 있다. 하나의 이러한 보고에서, 응급실에서 치료되어야 할 스피로놀락톤-관련 고칼륨혈증인 25 명 이상의 환자 에피소드가 기술되어 있다(Schepkens H. et al. 2001). 25 명의 환자 중 4 명은 심혈관 소생술 측정을 필요로 했고, 25 명의 환자 중 2 명은 사망하였다. 여러 명의 저자는 상기 MR 길항제를 받은 환자 중 약 10%의 임상적으로 유의한 고칼륨혈증 발병률을 추정하였다.
따라서, 이러한 치료의 부작용을 방지 또는 제한하기 위해, MR 길항제로의 치료에 대한 심부전 환자의 반응성을 예측하기 위한 정확하고 특이적인 방법을 개발할 필요가 또한 당업계에 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin: NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 미네랄로코르티코이드 수용체(MR) 활성화의 평가 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 처리에 대한 환자의 반응성 예측 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군 환자를 치료하기 위한 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제의 용도에 관한 것이며, 상기 환자는 본 발명의 방법에 의해 반응자로서 분류된다.
발명의 상세한 설명
정의:
"MR"이라는 용어는 미네랄로코르티코이드 수용체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "MR 활성화"라는 용어는 미네랄로코르티코이드(즉, 알도스테론) 또는 글루코코르티코이드에 의한 미네랄로코르티코이드 수용체의 활성화를 의미한다.
"MR 길항제"라는 용어는 MR의 생물학적 활성화를 (부분적으로 또는 전체적으로) 억제하는 능력을 갖는 화합물(천연이든 아니든)을 의미한다. 스피로놀락톤, 에폭시멕스레논 및 에플레레논을 비롯하여 다수의 MR 길항제가 알려져 있다. 본 발명의 범주에는 지금까지 알려진 모든 이러한 MR 길항제 및 미래에 발견될 이러한 MR 길항제가 포함된다. 알도스테론 길항제는 스피로놀락톤-유형 화합물일 수 있다(스피로놀락톤, 스피로놀락톤의 활성 대사체, 예컨대 칸레논 또는 이의 염, 예컨대 칼륨 칸레노에이트). 알도스테론 길항제는 또한 에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제일 수 있다. 스테로이드성-유형 MR 길항제의 또다른 계열의 예에는 에폭시-함유 스피로놀락톤 유도체가 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,559,332호에는 MR 길항제로서 스피로놀락톤 유도체가 기재되어 있다. 추가의 MR 길항제는 스피로놀락톤에 대한 유사체인 드로스피레논(Drospirenone: DRSP)일 수 있다.
"알도스테론 신타아제 억제제"라는 용어는 코르티코스테론을 수산화시켜 18-OH-코르티코스테론을 형성하고 18-OH-코르티코스테론을 알도스테론으로 전환시킴으로써, 코르티코스테론을 알도스테론으로 전환시키는 알도스테론 신타아제 효소를 억제하는 화합물 또는 작용제가 포함되는 것으로 의도된다. 다수의 알도스테론 신타아제 억제제는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 범주에는 지금까지 알려진 모든 이러한 알도스테론 신타아제 억제제 및 미래에 발견될 이러한 알도스테론 신타아제 억제제가 포함된다. 상기 알도스테론 신타아제 억제제는 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 알도스테론 신타아제 억제제일 수 있다. 알도스테론 신타아제 억제제는 비-스테로이드성 또는 스테로이드성 아로마타아제 억제제일 수 있다. 비-스테로이드성 아로마타아제 억제제에는 아나스트로졸 및 파드로졸(이의 (+)-거울상 이성질체 포함)이 포함될 수 있다. 스테로이드성 아로마타아제 억제제의 예는 엑세메스탄이다. 또다른 비-스테로이드성 알도스테론 신타아제 억제제는 또한 문헌 [Fiebeler A. et al. (2005)]에 기재되어 있는 바와 같은 파드로졸의 히드로클로라이드의 (+)-거울상 이성질체이다(US 특허 제4617307호 및 제4889861호).
"리포칼린 2" 또는 "NGAL"이라는 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, 문헌 [Schmidt-Ott KM. et al. (2007)]에 기재된 바와 같이 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린으로 언급된다. NGAL은 임의의 기원을 가질 수 있으나, 통상적으로는 포유류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류) NGAL, 특히 인간 NGAL이다. "NGAL 유전자"라는 용어는 NGAL mRNA 및 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 게놈 DNA 서열 및 임의의 자연 발생적 NGAL 및 이의 변이체 및 개질 형태를 말한다. 또한 NGAL mRNA 및 단백질을 코딩하는 cDNA와 같은 인공 서열도 포함된다. 예시적인 인간 고유의 NGAL 뉴클레오티드 서열은 GenBank 데이터베이스에서 접근 번호 NM_005564로서 제공된다. "NGAL mRNA"라는 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, NGAL 유전자의 발현시 합성되는 메신저 RNA를 말한다. "NGAL 단백질"이라는 용어는 NGAL 유전자의 발현으로부터 수득되는 아미노산 서열, 및 임의의 자연 발생적 NGAL 및 이의 변이체 및 개질 형태를 말한다. 예시적인 인간 고유의 NGAL 아미노산 서열은 GenPept 데이터베이스에서 접근 번호 NP_005555로서 제공된다. 본원에서 사용되는 "NGAL 단백질"이라는 용어는 또한 젤라티나아제 B, 92 kDa 유형 IV 콜라게나아제, 92 kDa 젤라티나아제 및 유형 V 콜라게나아제로서 또한 알려져 있는 메탈로프로테이나아제 MMP-9와 NGAL에 의해 형성된 헤테로이량체성 착물을 포함한다(Kjeldsen et al, 1993).
"항-NGAL 항체"라는 용어는 NGAL 을 인지하는 항체 또는 그의 분절을 말한다.
"SERPINA3" 유전자라는 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, 또한 CT; AACT; GIG24; GIG25; MGC88254로서 알려져 있다. 상기 유전자의 공식적인 총 명칭은 세르핀 펩티다아제 억제제, 클레이드 A(알파-1 항-프로테이나아제, 항-트립신), 멤버 3이다. SERPINA3은 임의의 기원을 가질 수 있으나, 통상적으로는 포유류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류) SERPINA3, 특히 인간 SERPINA3이다. "SERPINA3 유전자"라는 용어는 SERPINA3 mRNA 및 단백질을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 게놈 DNA 서열 및 임의의 자연 발생적 SERPINA3 및 이의 변이체 및 개질 형태를 말한다. 또한 SERPINA3 mRNA 및 단백질을 코딩하는 cDNA와 같은 인공 서열도 포함된다. "SERPINA3 mRNA"라는 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, SERPINA3 유전자의 발현시 합성되는 메신저 RNA를 말한다. "SERPINA3 단백질"이라는 용어는 SERPINA3 유전자의 발현으로부터 수득되는 아미노산 서열, 및 임의의 자연 발생적 SERPINA3 및 이의 변이체 및 개질 형태를 말한다.
"SERPINA3 항체"라는 용어는 SERPINA3 단백질을 인지하는 항체 또는 그의 분절을 말한다.
"심혈관계"라는 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, 심장, 혈관 또는 맥관구조, 및 혈액을 이루는 세포 및 혈장으로 구성된 계를 나타낸다.
"심혈관 질환"이라는 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가지며, 심장, 심장 판막, 혈액, 및 신체의 맥관구조에 영향을 주는 수많은 상태를 분류하기 위해 사용된다. 심혈관 질환에는 내피 기능이상, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 고혈압, 뇌혈관 질환, 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심부 정맥 혈전증, 말초 동맥 질환, 심근병증, 부정맥, 대동맥 협착, 및 동맥류가 포함된다.
본원에서 사용되는 "바이오마커의 선결 값"이라는 용어는 일반적인 집단으로부터 또는 대상의 선별된 집단으로부터 수득된 생물학적 샘플 내 바이오마커의 양을 말한다. 예를 들어, 선별된 집단은 명백하게 건강한 대상, 예컨대 심혈관 질환의 존재를 나타내는 임의의 징후 또는 증후군을 이전에는 갖지 않는 개인으로 구성될 수 있다. 또다른 예에서, 선결 값은 성립된 심혈관 질환을 갖는 대상으로부터 수득된 바이오마커의 양일 수 있다. 선결 값은 역치 값, 또는 범위일 수 있다. 선결 값은 명백하게 건강한 대상과 성립된 심혈관 질환이 있는 대상 사이의 비교 측정값에 근거하여 성립될 수 있다.
본원에서 사용된 "환자"라는 용어는 포유류, 예컨대 설치류, 고양이, 개 및 영장류를 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 환자는 인간이다.
MR 길항제로의 치료 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 치료에 대한 "반응자" 또는 "반응성" 환자, 또는 환자 그룹은, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로 각각 치료되었을 때, 심혈관 질환에서 임상적으로 유의한 경감을 보이는 또는 보일 것인 환자, 또는 환자 그룹을 말한다. 본 발명의 방법에 따르면, 환자는, 환자에서 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현이 일반적 집단 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값과 유의하게 상이한 경우 치료에 대한 반응자로서 분류된다. 바람직하게는, 환자는, 환자에서 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준이 일반적 집단 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값보다 높은 경우 반응자이다.
통상적으로는, 환자에서 상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준은 환자에서 상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준 대 상기 선결 값의 비가 1.2 초과, 바람직하게는 1.5, 더욱 더 바람직하게는 2, 더욱 더 바람직하게는 5, 10 또는 20인 경우, 일반적 집단 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값보다 높은 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "건강한 대상"이라는 용어는 임의의 공지된 상태가 없는 대상, 특히, 임의의 심혈관 질환, 당뇨병, 비만, 또는 대사성 증후군을 앓고 있지 않은 대상 집단을 말한다.
"생물학적 샘플"이라는 용어는 환자로부터 유래되는 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 이러한 샘플의 예에는 유액, 조직, 세포 샘플, 기관, 생검 등이 포함된다. 바람직한 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 샘플이다. 바람직한 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변이다.
본원에서 사용되는 "바이오마커"라는 용어는, 일반적으로 분자, 즉, 유전자(또는 상기 유전자를 코딩하는 핵산), 단백질을 말하고, 환자로부터의 생물학적 샘플 내 이의 발현은 당업계의 표준 방법(및 본원에 기재된 방법)에 의해 검출될 수 있으며, 이것이 수득된 환자의 상태에 대한 예측이 되거나 이를 나타낸다.
본 발명의 예측 방법:
본 발명은 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 MR 활성화의 평가 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, 환자의 심혈관계에서의 MR 활성화의 평가 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 치료에 대한 환자의 반응성 예측 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 환자는 심혈관 질환이 있다. 특히, 상기 환자는 내피 기능이상, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 고혈압, 뇌혈관 질환, 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심부 정맥 혈전증, 말초 동맥 질환, 심근병증, 부정맥, 대동맥 협착, 또는 동맥류가 있다. 특정 구현예에서, 상기 환자는 울혈성 심부전 또는 고혈압이 있다.
특정 구현예에서, 심혈관 질환이 있는 환자는 안지오텐신-전환 효소 억제제, 이뇨제, 혈관확장제, 베타-차단제, 디지탈리스, 및 항응고제로 이루어진 군에서 선택되는 표준 치료로 이미 치료되었다.
또다른 특정 구현예에서, 환자는 비만, 당뇨병 또는 대사성 증후군이 있다. 실제로, MR 활성화가 비만 및 대사성 증후군의 병리생리학적 발달과 연관되어 있음이 제시되었다(Caprio M. et al. 2007; Lamounier-Zepter V. et al. 2005).
일구현예에서, 본 발명은 환자로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에서 1 또는 2 개의 바이오마커 mRNA의 양을 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 MR 활성화의 평가 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 환자로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에서 1 또는 2 개의 바이오마커 mRNA의 양을 측정하는 것을 포함하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 처리에 대한 환자의 반응성 예측 방법에 관한 것이다.
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 대식세포, 다핵 세포, 및 내피 세포 및 내피 촉진자 세포(EPC)가 바람직한 세포이다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 PBMC 또는 내피 세포이다. 총 RNA는 그로부터 쉽게 추출될 수 있다. 예를 들어, 핵산을 이용가능하게 하도록 세포 또는 조직 샘플을 사용 전에 처리할 수 있다. 세포 또는 단백질 용해, 핵산의 농축 또는 희석 기술은 당업자에게 알려져 있다.
유전자의 발현 수준 측정은 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 측정된 바와 같은 발현 수준은 상대적인 발현 수준이다.
더욱 바람직하게는, 측정은 샘플을 탐침, 프라이머 또는 리간드와 같은 선별 시약과 접촉시켜, 샘플 내 본래 관심의 핵산의 존재를 검출하거나, 양을 계측하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 발현 수준은 mRNA의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다.
mRNA의 양을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 먼저 샘플(예를 들어, 환자로부터 조제된 세포 또는 조직)에 함유된 핵산을 표준 방법, 예를 들어 용해 효소 또는 화학적 용액을 사용하여 추출하거나, 제조자의 지침에 따라 핵산-결합 수지에 의해 추출한다. 그 다음 추출된 mRNA를 혼성화(예를 들어, 노던 블롯 분석) 및/또는 증폭(예를 들어, RT-PCR)에 의해 검출한다. 바람직한 구현예에서, 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준은 RT-PCR, 바람직하게는 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR, 더 바람직하게는 실시간 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR 에 의해 측정된다. 바람직한 구현예에서, NGAL 유전자의 발현 수준은 정방향 5'-GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3'(SEQ ID NO:1) 및 역방향 5'-GGTGGCCACTTGCACATTGT-3'(SEQ ID NO:2) 프라이머, 또는 정방향 5'-TCACCCTGTACGGAAGAACC-3'(SEQ ID NO:3) 및 역방향 5'-GGTGGGAACAGAGAAAACGA-3'(SEQ ID NO:4) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR 에 의해 평가하였다.
다른 증폭 방법에는 리가아제 연쇄 반응(LCR), 전사-매개 증폭(TMA), 가닥 대체 증폭(SDA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)이 포함된다.
10 개 이상의 뉴클레오티드를 갖고 본원의 관심의 mRNA에 상보적인 또는 그에 상동인 서열을 나타내는 핵산은 혼성화 탐침 또는 증폭 프라이머로서 유용성을 갖는다. 이러한 핵산이 동일할 필요는 없으나, 필적하는 크기의 상동 영역과 통상적으로 약 80% 이상 일치하는, 더욱 바람직하게는 85% 일치하는, 더욱더 바람직하게는 90 ~ 95% 일치하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 혼성화를 검출하기 위해 적합한 수단, 예컨대 검출가능 표지와 조합으로 핵산을 사용하는 것이 유리할 것이다. 형광, 방사능, 효소성 또는 기타 리간드(예를 들어, 아비딘/비오틴) 를 비롯한 매우 다양한 적합한 지표가 당업계에 알려져 있다.
탐침은 통상적으로 길이 10 내지 1000 뉴클레오티드, 예를 들어, 10 내지 800, 더욱 바람직하게는 15 내지 700, 통상적으로 20 내지 500의 단일 가닥 핵산을 포함한다. 프라이머는 통상적으로 증폭될 관심의 핵산에 완벽하게 또는 거의 완벽하게 부합하도록 디자인된 길이 10 내지 25 뉴클레오티드의 보다 짧은 단일 가닥 핵산이다. 탐침 및 프라이머는 혼성화하는 핵산, 즉, 바람직하게는 높은 엄격함의 혼성화 조건(최대 용융 온도 Tm 에 상응함, 예를 들어 50 % 포름아미드, 5x 또는 6x SCC. SCC는 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-시트레이트임)에서 혼성화하는 핵산에 "특이적"이다.
상기 증폭 및 검출 방법에서 사용된 핵산 프라이머 또는 탐침은 키트로서 조립될 수 있다. 이러한 키트에는 보존 프라이머 및 분자 탐침이 포함된다. 또한 바람직한 키트에는 증폭이 발생하는 경우 측정에 필요한 성분이 포함된다. 또한 키트에는 예를 들어, PCR 완충제 및 효소; 양성 대조군 서열, 반응 대조군 프라이머; 및 특이적 서열 증폭 및 검출에 대한 지침이 포함될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 환자의 MR 활성화의 평가 방법에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질의 농도를 측정하는 것을 포함하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 치료에 대한 환자의 반응성 예측 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질의 농도는 환자로부터 수득된 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플 또는 소변 샘플에서 측정된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플을 생물학적 샘플에 존재하는 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질과 선택적으로 상호작용할 수 있는 결합 파트너와 접촉시키는 것을 포함한다. 결합 파트너는 폴리클론 또는 모노클론, 바람직하게는 모노클론일 수 있는 항체일 수 있다. 또다른 구현예에서, 결합 파트너는 앱타머일 수 있다.
본 발명의 폴리클론 항체 또는 그의 분절은 적합한 항원 또는 에피토프를 그 중에서도 예를 들어, 돼지, 소, 말, 토끼, 염소, 양 및 마우스로부터 선택된 숙주 동물에 투여함으로써 공지된 방법에 따라 발생시킬 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 항원보조제가 항체 제조를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 항체는 폴리클론일 수 있지만, 모노클론 항체가 바람직하다.
본 발명의 모노클론 항체 또는 그의 분절은 배양 중 지속 세포주에 의해 항체 분자를 제조하는 임의의 기술을 사용하여 제작 및 단리될 수 있다. 제조 및 단리를 위한 기술에는 Kohler and Milstein(1975); 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Cote et al., 1983); 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985)에 의해 본래 기재된 하이브리도마 기술이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
대안적으로는, 단쇄 항체(예를 들어, 미국 특허 제 4,946,778 호 참조)의 제조에 대해 기재된 기술은 항-NGAL 또는 항 SERPINA3, 단쇄 항체를 제조하기 위해 채택될 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 항체에는 또한 미손상 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 분절, 및, F(ab')2 분절의 디술피드 가교를 환원시켜 생성될 수 있는 Fab 분절을 포함하나 이에 제한되지 않는 항-NGAL 또는 항 SERPINA3 분절이 포함된다. 대안적으로는, Fab 및/또는 scFv 발현 라이브러리는 NGAL 또는 SERPINA3 에 대한 원하는 특이성을 갖는 분절의 빠른 식별을 가능하게 하도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 항체의 파지 디스플레이가 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 단쇄 Fv (scFv) 또는 Fab 분절이 적합한 박테리오파지, 예를 들어, M13의 표면 상에서 발현된다. 간략하게는, 단백질로 면역화된 적합한 숙주, 예를 들어, 마우스의 비장세포를 제거한다. VL 및 VH 사슬의 코딩 영역은 단백질에 대해 원하는 항체를 생성하는 세포로부터 수득된다. 그 다음 상기 코딩 영역은 파지 서열의 말단에 융합된다. 일단 파지가 적합한 담체, 예를 들어, 박테리아 내로 삽입되면, 파지는 항체 분절을 표시한다. 항체의 파지 디스플레이는 또한 당업자에게 알려진 조합 방법에 의해 제공될 수 있다. 그 다음 파지에 의해 표시되는 항체 분절은 면역어세이의 일부로서 사용될 수 있다.
NGAL에 대한 모노클론 항체가 예를 들어 문헌 [Kjeldsen et al., (1996)]에 기재되어 있다. NGAL에 대한 시판 모노클론 항체의 예에는 문헌 [Antibody Shop, Copenhagen, Denmark]에서, HYB-211-01, HYB-211-02, 및 NYB-211-05로서 수득되는 것이 포함된다. 통상적으로는, HYB-211-01 및 HYB-211-02는 환원 및 미환원 형태 모두로 NGAL과 함께 사용될 수 있다. NGAL 항체는 또한 R&D Systems에서 참조번호 AF1857로 구입할 수 있다.
SERPINA3에 대한 시판 모노클론 항체의 예에는 Abgent, Inc. San Diego 및 Sigma-Aldrich Co로부터 수득되는 것이 포함된다.
또다른 구현예에서, 결합 파트너는 앱타머일 수 있다. 앱타머는 분자 인지 면에서 항체에 대한 대안을 나타내는 분자의 계열이다. 앱타머는 고 친화성 및 특이성이 있는 표적 분자의 임의의 계열을 사실상 인지하는 능력을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩티드 서열이다. 이러한 리간드는 문헌 [Tuerk C. 1997]에 기재된 바와 같은 랜덤 서열 라이브러리의 [Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)]를 통해 단리될 수 있다. 랜덤 서열 라이브러리는 DNA의 조합적 화학 합성에 의해 수득가능하다. 본 라이브러리에서, 각각의 일원은 독특한 서열의 선형 올리고머(결국에는 화학적으로 개질됨)이다. 상기 계열의 분자의 가능한 개질, 용도 및 장점은 문헌 [Jayasena S. D., 1999]에서 리뷰되었다. 펩티드 앱타머는 2 잡종 방법에 의해 조합 라이브러리로부터 선택된 플랫폼 단백질, 예컨대 E. 콜라이(E. coli) 티오레독신(Thioredoxin) A에 의해 표시되는 형태적 배좌 항체 가변 영역으로 이루어진다(Colas et al., 1996).
본 발명의 결합 파트너, 예컨대 항체 또는 앱타머는 검출가능한 분자 또는 기질, 예컨대 형광 분자, 방사능 분자 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 표지로 표지될 수 있다. 일반적으로 (직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 표지가 당업계에 알려져 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 "표지된"이라는 용어는 검출가능한 기질, 예컨대 방사능 작용제 또는 형광단(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 파이코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5))을 항체 또는 앱타머에 커플링(즉, 물리적 연결)시킴에 의한 항체 또는 앱타머의 직접적 표지화 뿐만 아니라, 검출가능한 기질과의 반응성에 의한 탐침 또는 항체의 간접적 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체 또는 앱타머는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 방사능 분자로 표지될 수 있다. 예를 들어, 방사능 분자에는 I123, I124, In111, Re186, Re188과 같은 신티그래프 연구를 위한 방사능 원자가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 언급된 어세이에는 일반적으로 고체 지지체에 대한 결합 파트너(즉, 항체 또는 앱타머)의 결합이 포함된다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 고체 지지체에는 니트로셀룰로오스(예를 들어, 막 또는 마이크로타이터 웰 형태 내); 폴리비닐클로라이드(예를 들어, 쉬이트 또는 마이크로타이터 웰); 폴리스티렌 라텍스(예를 들어, 비이드 또는 마이크로타이터 플레이트); 폴리비닐리딘 플루오라이드; 디아조화 종이; 나일론 막; 활성화 비이드, 자기 반응성 비이드 등과 같은 기질이 포함된다.
1 또는 2 개의 바이오마커 단백질의 농도는 면역어세이, 예컨대 경쟁, 직접적 반응 또는 샌드위치 유형 어세이를 비롯한 표준 면역진단 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 어세이에는 응집반응 검사; 효소-표지 및 매개 면역어세이, 예컨대 ELISA; 비오틴/아비딘 유형 어세이; 방사능면역어세이; 면역전기영동; 면역침전이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, ELISA 방법을 사용할 수 있으며, 마이크로타이터 플레이트의 웰은 상기 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질을 인지하는 항체 세트로 코팅된다. 그 다음 상기 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질을 함유하는 또는 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 코팅된 웰에 첨가한다. 항체-항원 착물 형성이 가능하도록 충분한 인큐베이션 기간 후, 플레이트(들)를 세정하여 비-결합된 부분을 제거하고 검출가능하게 표지된 2 차 결합 분자를 첨가하였다. 2 차 결합 분자를 임의의 포획된 샘플 마커 단백질과 반응하도록 두고, 플레이트를 세정하고, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 2차 결합 분자의 존재를 검출하였다.
NGAL의 검출을 위한 적합한 ELISA 방법은 Kjeldsen et al.(1996), Mishra J. et al.(2005) 및 Wang et al.(2007)에 기재되어 있다. NGAL의 검출을 위한 샌드위치 효소 면역어세이는 Blaser J. et al.(1995)에 기재되어 있다. NGAL의 검출을 위한 방사능면역어세이는 Xu SY. et al.(1994)에 기재되어 있다.
NGAL을 검출하기 위한 ELISA 키트는 AntibodyShop(Grusbakken 8 DK-2820 Gentofte - Denmark)에서 참조명 KIT 036 또는 KIT 037로, R&D Systems Europe (Lille - France)에서 참조명 DLCN20으로, 및 MBL International, Woburn, MA 01801 , USA)에서 참조명 CY-8070 으로 시판된다. NGAL/MMP9 착물 농도를 정량하기 위한 면역어세이는 R&D Systems Europe(Lille - France)에서 참조명 DM9L20으로 시판된다.
또한, 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질(면역어세이-기반 방법과 함께 또는 없이)의 농도를 측정하는 것에는 화합물의 분리: 화합물의 분자량에 근거한 원심분리; 질량 및 전하에 근거한 전기영동; 소수성에 근거한 HPLC; 크기에 근거한 크기 배제 크로마토그래피; 및 사용되는 특정 고상에 대한 화합물의 친화성에 근거한 고상 친화성이 포함될 수 있다. 일단 분리되면, 상기 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질은 그 화합물에 대해 공지된 "분리 프로파일", 예를 들어 체류 시간에 근거하여 확인되고, 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
대안적으로는, 분리된 화합물을 예를 들어, 질량 분석기에 의해 검출 및 측정할 수 있다.
일구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질의 농도를 선결된 역치 값과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비교는 MR 길항제로의 치료에 대한 환자의 반응성 또는 환자 내 MR 활성화의 지표이다. 통상적으로는, 인간 환자는 치료 전 혈액 NGAL 단백질의 농도가 70 ㎍/ℓ 초과, 바람직하게는 80 ㎍/ℓ 초과, 더욱 더 바람직하게는 85 ㎍/ℓ, 90 ㎍/ℓ, 95 ㎍/ℓ, 100 ㎍/ℓ, 125 ㎍/ℓ, 150 ㎍/ℓ 또는 200 ㎍/ℓ 초과인 경우, 치료에 대해 반응자인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 키트
본 발명의 추가의 구현예는 환자 내 MR 활성화를 평가하기 위한 방법을 수행하는데 유용한 물질을 포함하는 키트 및 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 치료에 대한 환자의 반응성을 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 진단 실험실, 연구 실험실 또는 의사에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 이러한 상이한 세팅으로 사용될 수 있는 키트를 제공한다.
생물학적 샘플 내 NGAL 및/또는 SERPINA3의 검출을 위한 물질 및 시약은 키트 내에 함께 수합될 수 있다.
본 발명의 구현예는
a) NGAL 단백질을 검출하기 위한 수단; 및
b) SERPINA3 단백질을 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.
통상적으로 상기 키트는
a) NGAL 단백질의 결합 파트너; 및
b) SERPINA3 단백질의 결합 파트너를 포함한다.
통상적으로 상기 결합 파트너는 항체이다.
결합 파트너는 용이한 검출을 위해 태깅될 수 있다. 이것은 기질 표면(예를 들어, 비이드, 어레이 등) 상에 고정될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 통상적으로는, 기질 표면(예를 들어, 막)은 결합 파트너의 고정화를 위해(예를 들어, 겔 전기영동 및 막으로의 이동을 통해) 키트에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 일반적으로 또한 본 발명의 키트 및 바이오마커에 포함되는 결합 파트너 사이의 착물의 검출을 위한 하나 이상의 시약을 포함한다.
절차에 따라, 키트는 추출 완충액 및/또는 시약, 웨스턴 블롯팅 완충액 및/또는 시약, 및 검출 수단을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다. 절차의 다른 단계를 수행하기 위해 이러한 완충액 및 시약을 사용하기 위한 프로토콜이 키트에 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 상이한 시약은 고체(예를 들어, 동결건조됨) 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 키트는 각각의 개별적인 완충액 및/또는 시약에 대해 상이한 용기(예를 들어, 바이알, 앰플, 시험관, 플라스크 또는 병)를 임의로 포함할 수 있다. 각각의 성분은 일반적으로 각각의 용기 내에 분취되거나 농축된 형태로 제공되는 것이 적합할 것이다. 기재된 방법의 특정 단계를 수행하는데 적합한 다른 용기가 또한 제공될 수 있다. 키트의 개별적인 용기는 바람직하게는 시판용으로 밀폐된 채로 유지된다.
특정 구현예에서, 키트는 본 발명의 방법에 따라 대상 내 심부전 위험의 예측을 위한 성분을 사용하기 위한 지침을 포함한다. 본 발명의 방법에 따른 키트를 사용하기 위한 지침은 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플을 처리하기 위한 및/또는 시험을 수행하기 위한 지침, 또는 결과를 해석하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 부서에 의해 처방된 형태의 주의 지침을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료 방법:
본 발명의 방법은 심혈관 질환이 있는 환자를 분류하는데 유용할 수 있고, 그 다음 상기 환자에 대한 정확한 치료를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 따라서 반응자 또는 비-반응자로서 분류되는 환자는 적합한 양의 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제를 받을 수 있다. 따라서 이러한 방법은 의사가 치료적 처리를 선택하는 것을 도울 수 있다. 따라서 치료 비용은 환자의 위험에 대해 조정될 수 있다.
따라서 본 발명의 또다른 양상은 하기로 이루어지는 단계를 포함하는, 질환의 위험이 있는 환자를 예방하고/거나 질환이 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 상기 환자의 반응성을 예측하는 시험관 내 방법을 수행함으로써, 상기 환자가 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 치료에 대한 반응자 또는 비-반응자인지를 결정하는 단계로서, 상기 환자 내 상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준이 일반적인 집단으로부터 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값보다 높은 경우 환자를 반응자로서 분류하는 단계, 및
b) 상기 환자가 a) 단계에서 반응자로서 결정된 경우, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제를 상기 환자에 투여하는 단계.
바람직한 구현예에서, 상기 질환은 심혈관 질환이다.
또다른 구현예에서, 상기 질환은 대사성 증후군, 비만 또는 당뇨병이다.
MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제는 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 길항제 또는 억제제는 치료적 유효량으로 투여된다.
"치료적 유효량"이라는 용어는 임의의 의료적 치료에 해당되는 합리적인 유익/위험 비로 심혈관 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 충분한 양의 MR 길항제 또는 억제제를 의미한다.
본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 사용량은 정상적인 의료적 판단 범주 내에서 의사의 참석하에 결정될 것으로 이해된다. 임의의 특정 환자에 대한 특이적 치료적으로 유효한 투여량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 경중도; 사용되는 특이적 화합물의 활성; 사용되는 특이적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용되는 특이적 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 사용되는 특이적 폴리펩티드와 조합으로 또는 우연히 사용되는 약물; 및 의료 업계에 잘 알려진 유사 인자를 비롯하여 수많은 인자에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준 미만의 수준에서 화합물의 투여를 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 그러나, 제품의 일일 투여량은 0.01 내지 1,000 mg/성인/일의 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 치료되는 환자에 대해 투여량의 증상 조절을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 유효 성분을 함유한다. 의약은 통상적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 유효 성분, 바람직하게는 1 mg 내지 약 100 mg의 유효 성분을 함유한다. 유효량의 약물은 보통은 0.0002 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 체중/일, 특히 약 0.001 mg/kg 내지 7 mg/kg 체중/일의 투여량 수준으로 공급된다.
본 발명의 추가의 목적은 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군이 있는 환자의 치료용 의약의 제조를 위한 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제의 용도이며, 상기 환자는 상기 기재된 방법에 의해 반응자로서 분류된다.
본 발명의 추가의 목적은 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군이 있는 환자의 치료를 위한 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제에 관한 것이며, 상기 환자는 본 발명의 방법에 의해 반응자로서 분류된다.
따라서 본 발명의 추가의 목적은 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군이 있는 환자를 치료하기 위한 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제에 관한 것으로, 상기 환자는 일반적인 집단으로부터 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값보다 높은 상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 상기 환자는 심혈관 질환이 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 환자는 비만이 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 환자는 당뇨병이 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 환자는 대사성 증후군이 있다.
본 발명의 또다른 목적은 환자 내 MR 활성화의 바이오마커(들)로서 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 용도이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 MR 활성화를 평가하고, 임의로, 상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 MR 활성화의 선결 상태를 나타내는 선결 값과 비교하는 것을 포함하고, 선결 값에 대한 상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준이 MR 활성화의 진화, 따라서 치료의 효율 정도를 나타내는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 환자의 치료를 모니터링하는 방법이다.
본 발명은 도면 및 실시예를 참조로 하여 자세히 설명될 것이다.
도 1A: 조건적 MR 심장 과발현이 있는 모델에서의 NGAL 발현의 시간 경과. Lcn2는 리포칼린2(NGAL)를 나타낸다. HPRT는 하우스키핑 대조군 유전자를 나타낸다. Cnt는 대조군 한배 새끼 마우스를 나타낸다. DT는 조건적 hMR 과발현이 있는 이중-트랜스제닉 마우스를 나타낸다.
도 1B: MR의 심장 내 NGAL 단백질 발현. Lcn2는 리포칼린2(NGAL)를 나타낸다. GAPDH는 하우스키핑 대조군 단백질을 나타낸다. Cnt는 대조군 한배 새끼 마우스를 나타낸다. DT는 조건적 hMR 과발현이 있는 이중-트랜스제닉 마우스를 나타낸다.
도 2: MR 대 GR 과발현 마우스의 심장 내 NGAL 발현. Lcn2는 리포칼린2(NGAL)를 나타낸다. HPRT는 하우스키핑 대조군 유전자를 나타낸다. Cnt는 대조군 한배 새끼 마우스를 나타낸다. DT는 조건적 hMR 또는 hGR 과발현이 있는 이중-트랜스제닉 마우스를 나타낸다.
도 3: 다양한 모델 내 NGAL 발현. A 및 B: 정량적 PCR; C 및 D: ELISA. Cnt 는 대조군 한배 새끼 마우스를 나타낸다. DT는 조건적 hMR 과발현이 있는 이중-트랜스제닉 마우스를 나타낸다. 알도-염은 알도스테론 주입 및 음용수 중 1% NaCl 처리를 받은 신장절제술을 받은 마우스를 의미한다. 내피-특이적 MR 발현은 오직 내피 만에 표적하는 조건적 MR 발현에 의해 수득된다.
도 4: 래트 MR을 안정적으로 발현하는 래트 심근세포 ( H9C2 세포)의 세포 모델 내 NGAL의 발현. Cnt는 대조군(희석액)을 나타낸다. 알도 및 코르티코는 각각 알도스테론 및 코르티코스테론을 나타낸다. RU28318은 MR 길항제이고, RU 486은 GR 길항제이고, β액틴은 표준화에 사용되는 하우스키핑 유전자이다.
도 5A: 유형 II 당뇨병의 마우스 모델 내 NGAL 의 발현. Lcn2는 리포칼린2(NGAL)를 나타낸다. Cnt는 대조군 한배 새끼 마우스를 나타낸다. Db/db는 당뇨병 마우스를 나타낸다.
도 5B: 리포칼린2 / NGAL 혈장 수준의 진화. 대조군 및 db/db 마우스 내 혈장 Icn2, 17 주 동안 칸레노에이트로 처리하거나 처리하지 않음.
도 6: 심부전 래트의 심장 및 혈장에서의 리포칼린2 / NGAL의 MR -의존성 유도. A. 리포칼린2/NGAL의 발현은 카켁시아-유도 심부전이 있는 래트의 심장 좌심실에서 2 배 증가된다. 유도는 유효 투여량의 스피로놀락톤(50 mg/Kg/일, 심부전 증후군을 예방할 수 있음)에 의해 완전히 예방된다. B. 리포칼린2/NGAL의 혈장 수준은 또한 심부전이 있는 래트의 혈장에서 증가된다(도 6B). 증가는 동물을 스피로 50 mg/Kg/j(HF +스피로 50 mg/Kg/j 대 HF)로 처리하였을 때 예방된다.
도 7: MR의 심장 과발현의 마우스 모델에서의 현미경 분석에서 확인된 차별 유전자의 검증. 세르피나3의 발현은 MR을 과발현하는 마우스(DT-MR)의 심장에서 유의하게 증가되나, GR을 과발현하는 마우스(DT-GR)의 심장에서는 변화가 없다. mRNA 수준의 값은 각각의 샘플 내 ubc mRNA 수준에 대해 표준화하였다. 대조군 내 상기 값을 각각의 유전자에 대해 1로서 설정하였고, 배수 변화를 도에 제시한다. *, p<0.05, **, p<0.01 대 대조군, Mann-Whitney U 검정을 사용.
도 8: H9C2 / MR 세포 내 세르피나3의 발현의 MR 특이성. 세르피나3의 발현은, 특이적 MR 길항제인 RU28318을 사용하여 제시된 바와 같은 MR-의존성 메카니즘을 통해 24 시간 동안 1 nM 알도스테론(알도) 및 10 nM 코르티코스테론(코르티코)에 의해 증가된다. mRNA 수준의 값은 각각의 샘플에서 β-액틴 mRNA 수준에 대해 표준화하였다. 대조군(비처리된 세포) 내 상기 값을 각각의 유전자에 대해 1로서 설정하고, 배수 변화를 도에 제시한다. **, p<0.01 대 대조군(스테로이드는 없음), ANOVA 분석 사용.
도 9A: 10 nM 알도스테론으로 처리된 H9C2 / MR 세포에서의 세르피나3 유도의 시간-경과.
세르피나3 발현은 알도스테론에 대해 24 시간 노출 후 크게 유도된다. mRNA 수준의 값은 각각의 샘플에서 β-액틴 mRNA 수준에 대해 표준화된다. 대조군(비처리된 세포) 내 상기 값을 각각의 유전자에 대해 1로서 설정하고, 배수 변화를 도에 제시한다. *, p<0.05, **, p<0.01 대 대조군(스테로이드는 없음), ANOVA 분석 사용.
도 9B: 알도스테론으로의 세르피나3 유도의 용량-반응.
알도스테론에 의한 세르피나3 발현의 유도는 용량-의존적이다. mRNA 수준의 값을 각각의 샘플에서 β-액틴 mRNA 수준에 대해 표준화하였다. 대조군(비처리된 세포) 내 상기 값을 각각의 유전자에 대해 1로서 설정하고, 배수 변화를 도에 제시한다. *, p<0.05, **, p<0.01 대 대조군(스테로이드는 없음), ANOVA 분석 사용.
도 10 심부전이 있는 래트의 심장 내 세르피나3 의 MR -의존적 유도.
세르피나3 의 발현은 카켁시아-유도 심부전이 있는 래트의 심장 좌심실에서 크게 증가된다. 유도는 유효 투여량의 스피로놀락톤(50 mg/Kg/일, 심부전 증후군을 예방할 수 있음)에 의해 예방된다. **, p<0.01 대 sham #, p<0.05, 대 플라시보(심부전, 플라시보 투여), ANOVA 분석 사용.
실시예 1
MR 및 GR 트랜스제닉 마우스: 미네랄로코르티코이드 수용체(MR) 및 글루코코르티코이드 수용체(GR) 트랜스제닉 마우스는 인간 MR 또는 GR 각각의 조건적 발현을 가능하게 하였다. MR 및 GR 트랜스제닉 마우스를 적합한 전사촉진자(transactivator) 마우스와 교배시킨 경우, hMR 또는 hGR의 조건적, 유도성 발현을 허용하게 하는 자체 발생시킨 수용자 마우스를 사육하여 수득하였다. 상기 조건적 트랜스제닉 모델은 문헌 [Ouvrard-Pascaud et al. (2005)] 및 [Sainte-Marie et al. (2007)]에 기재되어 있다. 심장 내 MR 에 의해 선택적으로 조절되는 유전자를 확인하기 위해, MR 및 GR 수용자 마우스를 (G. Fishman, Columbia University, NY, USA)(Yu et al. 1996)에 의해 제공되는 MHC-tTA 전사촉진자 마우스와 교배시켜 hMR 및 hGR 각각의 심근세포-특이적 발현을 가능케 한다. 이것은 대조군 한배새끼와 비교하여 MR 또는 GR 조건적 마우스의 심장 내 글루코코르티코이드 결합의 3 배 증가 또는 MR의 4배 과발현을 야기하였다. 초기 배아 치사율을 피하기 위해, MR 자손에게는 임신으로부터 출생까지 Dox를 처리하여, 발현이 출생 후 제7일에만 일어나도록 한다.
샘플, RNA 단리, 표지화 및 혼성화 : 총 RNA를 TRIZOL® 시약(Life technologies)을 사용하여 5 마리의 1 개월령 MR 트랜스제닉 마우스로부터의 전체 심장으로부터 단리하였다. MR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조 샘플은 MR 트랜스제닉 마우스의 5 마리의 대조군 한배새끼(동일한 연령, 동일한 육종)로부터 추출된 전체 심장 총 RNA로 이루어졌다. GR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조 샘플은 GR 트랜스제닉 마우스의 5 마리의 대조군 한배새끼(동일한 연령, 동일한 육종)로부터 추출된 전체 심장 총 RNA로 이루어졌다. Oligotex mRNA 키트(Qiagen)를 사용하여 mRNA를 단리하였다. RNA 및 mRNA 품질을 Agilent 2100 바이오분석기를 사용하여 평가하였다. MR 트랜스제닉 마우스로부터의 mRNA를 모으고 3 개의 별도의 반응에서 Cy5로 표지하였다. MR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조로부터 mRNA를 모으고 3 개의 별도의 반응에서 Cy3으로 표지하였다. GR 트랜스제닉 마우스로부터의 mRNA를 2 개의 별도의 반응에서 Cy5로 각각 표지된 3 개의 모집물 내에 조합하였다. GR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조로부터 mRNA를 모으고 6 개의 별도의 반응물에서 Cy3으로 표지하였다. Cy3- 및 Cy5-표지된 cDNA를 CyScribe cDNA Post Labeling Kit(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 제조하였다. 표지화 반응은 각각의 마이크로어레이에 대해 별도로 수행하였다. 3 개의 마이크로어레이 혼성화를 MR 트랜스제닉 마우스에 대해, GR 트랜스제닉 마우스에 대해 6 개를 수행하였다. 혼성화 혼합물을 인간 Cot-I DNA(Gibco-BRL), 효모 tRNA 및 폴리A RNA로 미리 인큐베이션하고, 마이크로어레이에 혼성화하였다.
마이크로어레이 : 마이크로어레이를 50량체 올리고뉴클레오티드 탐침(MWG Biotech®)을 사용하여 자체 제작하였다. Lucidea Array Spotter(Amersham)를 사용하여 에폭시-실란 코팅된 유리 슬라이드 상에 탐침을 스팟팅하였다. 마이크로어레이 상에 제시된 5419 개의 유전자를 심혈관 및/또는 골격 근 정상 및 병리학적 기능 개선에 대해 선별하였다. 선별은 1) 공제 혼성화 실험(Steenman et al. 2005), 2) 게놈-범위 마이크로어레이 혼성화(Steenman et al. 2003) 및 3) 문헌 데이터에 근거하였다. 마이크로어레이는 마우스-특이적 올리고뉴클레오티드 및 인간 올리고뉴클레오티드 모두를 상응하는 마우스 서열과 80% 이상의 상동으로 함유하였다. 각각의 유전자 탐침은 삼중으로 스팟팅되었다.
원 데이터 추출 및 병합: 혼성화된 어레이를 형광 공초점 현미경(Scanarray 4000XL, GSI-Lumonics)에 의해 스캔하였다. 형광 신호 측정값을 10 ㎛/픽셀 해상도로 각각의 형광색소에 대해 개별적으로 수득하였다. 혼성화 및 배경 신호 강도, 및 품질 통제 파라미터를 GenePix Pro 5.0(Axon®)를 사용하여 측정하였다. Lowess 표준화 절차(Yang et al. 2002)를 수행하여 기술적 편차를 교정하였다. 절차는 이전에 기재된 바와 같이 채널-옆-채널을 적용하였다(Workman et al. 2002). 각각의 마이크로어레이에 대해, Cy3- 및 Cy5-신호 강도를 모든 Cy3- 또는 Cy5-신호 강도의 중앙 프로파일로서 정의된 원형에 개별적으로 표준화하였다.
마이크로어레이의 통계적 분석: 마이크로어레이의 유의성 분석(Significance Analysis of Microarrays: SAM)(Tusher et al. 2001) 및 마이크로어레이 데이터에 대한 선형 모델(Linear Models for MicroArray data: Limma)(Smyth 2004)를 사용하여 통계적으로 유의한 차별적 발현을 갖는 유전자를 확인하였다. 1-계급 분석은 트랜스제닉과 참조 마우스 사이에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인하기 위해 사용되었고, 2-계급 분석은 두 트랜스제닉 마우스 모델 사이에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인하기 위해 사용되었다. MR 트랜스제닉 마우스의 1-계급 분석은 SAM (FDR(가(flase) 발견율) = 0.05%) 및 Limma("FDR"-교정, p<0.01)에 의해 모두 확인되었던 520 개의 유전자의 확인을 산출하였다. GR 트랜스제닉 마우스의 1-계급 분석은 SAM(FDR = 0.03%) 및 Limma("FDR"-교정, p<0.01)에 의해 모두 확인되었던 1232 개의 유전자의 확인을 산출하였다. 2-계급 분석은 SAM(FDR = 0.09%) 및 Limma("FDR"-교정, p<0.01)에 의해 모두 확인되었던 529 개의 유전자의 확인을 산출하였다.
MR 활성화가 있는 다양한 트랜스제닉 또는 약리학적 마우스 모델 내 NGAL의 발현: 정량적 NGAL mRNA 발현을 1, 2 및 3 개월령 MR 트랜스제닉 마우스의 심장으로부터 추출된 2 ㎍ DNA가 없는 총 RNA를 사용하여 제조된 25 ㎕의 RT-PCR(Eurogentec로부터의 Sybr Green I에 대한 qPCR Core 키트를 사용함) 상에서 정방향 5'-GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3'(SEQ ID NO:1) 및 역방향 5'-GGTGGCCACTTGCACATTGT-3'(SEQ ID NO:2) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(Q-PCR, Light Cycler, Biorad)에 의해 분석하고, 부합하는 한배새끼 뿐만 아니라 2 개월령 GR 트랜스제닉 마우스(및 각각의 대조군 한배새끼)와 비교하였다. NGAL의 단백질 발현을 특이적 NGAL 항체(AF1857, R&D Systems)를 사용하는 2 개월령 MR 마우스로부터의 심장 단백질 추출물에서 분석하였다. 쥣과 NGAL-특이적 ELISA 어세이(A. Xu, Hong-Kong 에 의해 제공됨)를 사용하여 NGAL의 혈장 농도를 추정하였다(Wang et al., 2007).
정량적 NGAL mRNA 발현을 또한 신장절제술을 받고 3 주 동안 알도스테론 주입(60 ㎍/kg/j, 0.25 ㎕/h ALZET 미니펌프) 및 음용수 중 1% 염으로 처리된 마우스의 심장(오직 신장절제술 만을 받은 대조군 마우스와 비교하여), 및 오직 내피에서만 hMR의 조건적 발현을 허용케 하는 상기 기재된 MR 트랜스제닉 마우스와 내피-특이적 전사촉진자 마우스(L. E. Benjamine, Harvard, USA 에 의해 제공됨)(Sun et al., 2005)의 적합한 교배 후 수득된, 오직 내피에서만 인간 MR의 조건적 과발현이 있는 9 개월령 마우스로부터의 흉 대동맥에서, Q-PCR에 의해 분석하였다.
NGAL 의 혈장 농도를 또한 신장절제술을 받고 3 주 동안 알도스테론 주입 알도스테론 주입(60 ㎍/kg/j, 0.25㎕/h ALZET 미니펌프) 및 음용수 중 1% 염으로 처리된 3 개월령 마우스(오직 신장절제술만을 받은 대조군 마우스와 비교하여) 뿐만 아니라, 내피-특이적 MR 과발현이 있는 9 개월령 마우스의 혈장에서, 대조군 한배새끼와 비교하여 추정하였다.
래트 MR을 안정적으로 과발현하는 래트 심근세포 ( H9C2 세포) 의 세포 모델 내 NGAL의 발현(Fejes-toth, Endocrinology, 2007)
정량적 NGAL mRNA 발현을 다양한 농도의 알도스테론 또는 10-8 M 코르티코스테론 또는 10-6 M MR 길항제 RU 28318 또는 GR 길항제 RU 486이, 단독으로 또는 조합으로 처리된 래트 H9-C2/MR 세포로부터 추출된 2 ㎍ DNA가 없는 총 RNA 를 사용하여 제조된 25 ㎕의 RT-PCR(Eurogentec 로부터의 Sybr Green I 에 대한 qPCR Core 키트를 사용함) 상에서 정방향 5'-TCACCCTGTACGGAAGAACC-3'(SEQ ID NO:3) 및 역방향 5'-GGTGGGAACAGAGAAAACGA-3'(SEQ ID NO:4) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(Q-PCR, Light Cycler, Biorad)에 의해 분석하였다.
유형 II 당뇨병의 마우스 모델( 렙틴 수용체 유전자 내에 자연발생적 돌연변이를 갖는 db / db 마우스) 내 NGAL의 발현
NGAL의 혈장 농도를 약리학적 MR 길항제 칸레노에이트(칸레노에이트: Canrenoate, Sigma-Alderich, 음용수 중 100 mg/Kg/일, 45일)로의 처리 전 후 db/db 마우스에서 쥣과 NGAL-특이적 ELISA 어세이(A. Xu, Hong-Kong에 의해 제공됨)(Wang et al., 2007)를 사용하여 추정하였다.
결과:
리포칼린2/NGAL mRNA는 1, 1.5 또는 3 개월령 대조군 한배새끼(Cnt)와 비교하여 조건적 인간 MR 과발현(DT)을 갖는 마우스의 심장에서 강하게 발현된다(x 60-200)(도 1A). 리포칼린2/NGAL 단백질은 또한 대조군 한배새끼(Cnt)와 비교하여 조건적 인간 MR 과발현(DT)을 갖는 1.5 개월령 마우스의 심장에서 강하게 유도된다(도 1B). 이것은 대조군 한배새끼에서의 리포칼린2/NGAL 발현 유도가 절대 x 1.3 을 초과하지 않으므로 매우 민감한 것이다. 가깝게 관련된 GR 에 대한 특이성을 2 개월령의 GR 과발현 마우스의 심장에서 리포칼린/NGAL 발현을 분석하여 평가하였다(도 2). NGAL 발현은 GR-과발현 마우스에서보다 MR-과발현 마우스의 심장에서 75 배 이상 유도되었다.
리포칼린2/NGAL 발현은 3 주 약리학적 MR 자극이 있는 마우스의 심장(알도/염 모델) 뿐만 아니라, 내피를 표적으로 하는 조건적 MR 과발현이 있는 9 개월령 마우스의 대동맥(DT, 한배새끼와 비교하여, Cnt)에서 증가된다(도 3A-C). 흥미롭게도, 리포칼린2/NGAL의 혈장 수준은 또한 상기 2 개의 마우스 모델에서 증가되어, 내피 벽으로부터의 분비를 암시한다(도 3B-D).
리포칼린2/NGAL 발현은 24 시간 동안 10-8 M 알도스테론으로 처리된 H9C2/MR 세포에서 증가된다(도 4A). 이러한 리포칼린2/NGAL 발현의 증가는 MR 길항제 RU 28318 의 10-8 M 알도스테론의 첨가에 의해 예방되나, GR 길항제 RU 486 의 첨가에 의해서는 그러하지 않다(도 4A). 10-8 M 코르티코스테론(글루코코르티코이드 호르몬) 은 또한 H9C2/MR 세포에서 리포칼린2/NGAL 발현을 자극한다(도 4B). 이 증가는 또한 MR 길항제 RU 28318에 의해 예방되나, GR 길항제 RU 486 에 의해서는 예방되지 않아(도 4B), 코르티코스테론이 또한 MR을 통한 리포칼린2/NGAL 발현을 자극하였음을 나타낸다. 시간 경과 연구는 리포칼린2/NGAL 발현이 10-8 M 알도스테론의 24 시간 후에 유도되었고, 48 h 자극 후에 유지된 채로 남아있음을 나타내었다(도 4C). 리포칼린2/NGAL 발현은 알도스테론의 농도가 증가됨으로써 자극되며, 특이적 MR-매개 효과를 나타내었다(도 4D).
리포칼린2/NGAL 의 혈장 수준은 또한 유형 II 당뇨병 마우스 모델(db/db) 의 혈장에서 증가된다(도 5A 및 도 5B 대조군 대 db/db). 17 주 약리학적 MR 길항작용의 효과를 또한 상기 마우스에서 분석한다. 도 5B 는 칸레노에이트를 처리한 또는 하지 않은 대조군 및 db/db 마우스 내 리포칼린2/NGAL 혈장 수준을 나타낸다. db/db 마우스 내 리포칼린2/NGAL의 혈장 수준 증가는 db/db 마우스에게 MR 길항제 칸레노에이트를 17 주 생체 내 처리하여 예방된다(도 5B, db/db + 칸레노에이트). 칸레노에이트는 대조군 마우스 내 리포칼린2/NGAL의 혈장 수준에 대해 효과가 없다(대조군 + 칸레노에이트). 이것은 혈장 수준 리포칼린2/NGAL이 유형 II 당뇨병 내 MR 길항제의 효능을 뒤따르기 위해 사용될 수 있음을 증명한다.
카켁시아와 연관된 심부전(HF)의 래트 모델에서, 실시간 PCR 에 의해 추정되는 바와 같이 심장 리포칼린2/NGAL mRNA 발현은 2 배 까지 유도된다(sham 대 MI)(도 6A). 스피로놀락톤이 심부전 증상의 발달을 예방하기에 유효한 농도로 투여되는 경우(HF +스피로 50 mg/Kg/j 대 HF), 리포칼린2/NGAL mRNA의 유도는 완전히 예방된다(도 6A). 리포칼린2/NGAL의 혈장 수준은 또한 심부전이 있는 래트의 혈장에서 증가된다(도 6B). 동물에게 스피로 50 mg/Kg/j를 처리하는 경우 증가가 예방된다(HF +스피로 50 mg/Kg/j 대 HF).
따라서, MR 활성화는 NGAL 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 특이적이고 효율적으로 평가할 수 있다. MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로의 치료에 대한 환자의 반응성은 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내 NGAL 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 예방된다.
실시예 2
Lcn2/NGAL의 혈장 수준을 건강한 대상의 집단에서 측정하였다.
18 내지 85세 사이의 연령의 남성과 여성이 본 연구에 포함되었고, 단 이들은 지난 7 일 내에 급성 병리학을 나타내지 않았으며, 임의의 심혈관 처리 하에 있지 않았다. 건강한 대조군에 대한 추가의 배제 범주는 알려진 고혈압(65세 초과인 경우 140/90 mmHg 초과 또는 160 mm Hg 초과); 알려진 신부전, 알려진 당뇨병, 임신, 지난 5 년 내 진단된 암 또는 진화적 신생물, 만성 간 병리학, 연결도, 크론 질환, 진화적 결핵, 운동성 협심증, 급성 관상동맥 증후군, 결장병증 이력, 경동맥 동맥내막절제술 및 알려진 복부 대동맥 동맥류였다.
건강한 대상의 Lcn2/NGAL의 혈장 수준은 일반적으로 40 내지 80 ㎍/ml로 포함되었다.
심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군이 있는 환자의 Lcn2/NGAL의 혈장 수준을 또한 측정한다. 이는 건강한 대상의 수준보다 높다.
실시예 3
심근세포 내 MR 또는 GR의 만성 과발현은 변경된 신호 경로를 야기할 수 있으며, 단기간 코르티코스테로이드 처리에 의해 유도되는 것과는 상이한, 세포의 적응을 나타낸다. 심장 내 생체 내 만성 MR 활성화의 분자적 결과를 분석하기 위해, Cardiochips®, 즉, 심혈관 및/또는 골격근에서 정상 및 병리학적 기능 개선에 대해 선별된 5419 개의 유전자를 포함하는 마이크로어레이를 사용하여 MR-심장 마우스의 심장 유전자 발현을 조사하였다. 6 주 동안의 심근세포 MR 과발현은 약 24 개의 상향-조절 및 23 개의 하향-조절 유전자를 산출하였다. 흥미롭게도, 이들 대부분은 GR-심장 마우스에서 동시에 측정된 GR-조절 유전자와 대부분 상이했다(약 74 개의 GR 상향-조절 유전자 및 70 개의 GR 하향-조절 유전자). 게다가, 대부분의 MR-조절 유전자는 GR-심장 마우스 모델에서 변화가 없어, 각각의 스테로이드 수용체가 심근세포 내 유전자 발현의 구별되는 패턴을 통제하는 것을 나타낸다.
MR 및 GR 트랜스제닉 마우스: 미네랄로코르티코이드 수용체(MR) 및 글루코코르티코이드 수용체(GR) 트랜스제닉 마우스는 인간 MR 또는 GR 각각의 조건적 발현을 가능하게 하였다. MR 및 GR 트랜스제닉 마우스를 적합한 전사촉진자 마우스와 교배시킨 경우, hMR 또는 hGR의 조건적, 유도성 발현을 허용하게 하는 자체 발생시킨 수용자 마우스를 사육하여 수득하였다. 상기 조건적 트랜스제닉 모델은 문헌 [Ouvrard-Pascaud et al. (2005)] 및 [Sainte-Marie et al. (2007)]에 기재되어 있다. 심장 내 MR 에 의해 선택적으로 조절되는 유전자를 확인하기 위해, MR 및 GR 수용자 마우스를(G. Fishman, Columbia University, NY, USA)(Yu et al. 1996)에 의해 제공되는 MHC-tTA 전사촉진자 마우스와 교배시켜 hMR 및 hGR 각각의 심근세포-특이적 발현을 가능케 한다. 이것은 대조군 한배새끼와 비교하여 MR 또는 GR 조건적 마우스의 심장 내 글루코코르티코이드 결합의 3 배 증가 또는 MR의 4 배 과발현을 야기하였다. 초기 배아 치사율을 피하기 위해, MR 자손에게는 임신으로부터 출생까지 Dox를 처리하여, 발현이 출생 후 제7일에만 일어나도록 한다.
샘플, RNA 단리, 표지화 및 혼성화 : 총 RNA를 TRIZOL® 시약(Life technologies)을 사용하여 5 마리의 1 개월령 MR 트랜스제닉 마우스로부터의 전체 심장으로부터 단리하였다. MR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조 샘플은 MR 트랜스제닉 마우스의 5 마리의 대조군 한배새끼(동일한 연령, 동일한 육종)로부터 추출된 전체 심장 총 RNA로 이루어졌다. GR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조 샘플은 GR 트랜스제닉 마우스의 5 마리의 대조군 한배새끼(동일한 연령, 동일한 육종)로부터 추출된 전체 심장 총 RNA로 이루어졌다. Oligotex mRNA 키트(Qiagen)를 사용하여 mRNA를 단리하였다. RNA 및 mRNA 품질을 Agilent 2100 바이오분석기를 사용하여 평가하였다. MR 트랜스제닉 마우스로부터의 mRNA를 모으고 3 개의 별도의 반응에서 Cy5로 표지하였다. MR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조로부터 mRNA를 모으고 3 개의 별도의 반응에서 Cy3으로 표지하였다. GR 트랜스제닉 마우스로부터의 mRNA를 2 개의 별도의 반응에서 Cy5로 각각 표지된 3 개의 모집물 내에 조합하였다. GR 트랜스제닉 마우스에 대한 참조로부터 mRNA를 모으고 6 개의 별도의 반응물에서 Cy3 으로 표지하였다. Cy3- 및 Cy5-표지된 cDNA를 CyScribe cDNA Post Labeling Kit(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 제조하였다. 표지화 반응은 각각의 마이크로어레이에 대해 별도로 수행하였다. 3 개의 마이크로어레이 혼성화를 MR 트랜스제닉 마우스에 대해, GR 트랜스제닉 마우스에 대해 6 개를 수행하였다. 혼성화 혼합물을 인간 Cot-I DNA(Gibco-BRL), 효모 tRNA 및 폴리A RNA로 미리 인큐베이션하고, 마이크로어레이에 혼성화하였다.
마이크로어레이 : 마이크로어레이를 50 량체 올리고뉴클레오티드 탐침(MWG Biotech®)을 사용하여 자체 제작하였다. Lucidea Array Spotter(Amersham)를 사용하여 에폭시-실란 코팅된 유리 슬라이드 상에 탐침을 스팟팅하였다. 마이크로어레이 상에 제시된 5419 개의 유전자를 심혈관 및/또는 골격 근 정상 및 병리학적 기능 개선에 대해 선별하였다. 선별은 1) 공제 혼성화 실험(Steenman et al. 2005), 2) 게놈-범위 마이크로어레이 혼성화(Steenman et al. 2003) 및 3) 문헌 데이터에 근거하였다. 마이크로어레이는 마우스-특이적 올리고뉴클레오티드 및 인간 올리고뉴클레오티드 모두를 상응하는 마우스 서열과 80% 이상의 상동으로 함유하였다. 각각의 유전자 탐침은 삼중으로 스팟팅되었다.
원 데이터 추출 및 병합: 혼성화된 어레이를 형광 공초점 현미경(Scanarray 4000XL, GSI-Lumonics)에 의해 스캔하였다. 형광 신호 측정값을 10 ㎛/픽셀 해상도로 각각의 형광색소에 대해 개별적으로 수득하였다. 혼성화 및 배경 신호 강도, 및 품질 통제 파라미터를 GenePix Pro 5.0(Axon®)를 사용하여 측정하였다. Lowess 표준화 절차(Yang et al. 2002)를 수행하여 기술적 편차를 교정하였다. 절차는 이전에 기재된 바와 같이 채널-옆-채널을 적용하였다(Workman et al. 2002). 각각의 마이크로어레이에 대해, Cy3- 및 Cy5-신호 강도를 모든 Cy3- 또는 Cy5-신호 강도의 중앙 프로파일로서 정의된 원형에 개별적으로 표준화되었다.
마이크로어레이의 통계적 분석: 마이크로어레이의 유의성 분석(Significance Analysis of Microarrays: SAM)(Tusher et al. 2001) 및 마이크로어레이 데이터에 대한 선형 모델(Linear Models for MicroArray data: Limma)(Smyth 2004)를 사용하여 통계적으로 유의한 차별적 발현을 갖는 유전자를 확인하였다. 1-계급 분석은 트랜스제닉과 참조 마우스 사이에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인하기 위해 사용되었고, 2-계급 분석은 두 트랜스제닉 마우스 모델 사이에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인하기 위해 사용되었다. MR 트랜스제닉 마우스의 1-계급 분석은 SAM(FDR(가 발견율) = 0.05%) 및 Limma("FDR"-교정, p<0.01 )에 의해 모두 확인되었던 520 개의 유전자의 확인을 산출하였다. GR 트랜스제닉 마우스의 1-계급 분석은 SAM(FDR = 0.03%) 및 Limma("FDR"-교정, p<0.01)에 의해 모두 확인되었던 1232 개의 유전자의 확인을 산출하였다. 2-계급 분석은 SAM(FDR = 0.09%) 및 Limma("FDR"-교정, p<0.01)에 의해 모두 확인되었던 529 개의 유전자의 확인을 산출하였다.
MR 또는 GR 활성화가 있는 트랜스제닉 마우스 모델 내 serpina3의 발현: 정량적 Serpina3 mRNA 발현을 1, 2 및 3 개월령 MR 트랜스제닉 마우스의 심장으로부터 추출된 2 ㎍ DNA가 없는 총 RNA를 사용하여 제조된 25 ㎕의 RT-PCR(Eurogentec 로부터의 Sybr Green I에 대한 qPCR Core 키트를 사용함) 상에서 정방향 5'-CATCCCTGTGGGAAGTCAGT-3'(SEQ ID NO:5) 및 역방향 5'-CTTTTGGGTGGAGGCAGATA-3'(SEQ ID NO:6) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(Q-PCR, Light Cycler, Biorad)에 의해 분석하고, 부합하는 한배새끼 뿐만 아니라 2 개월령 GR 트랜스제닉 마우스(및 각각의 대조군 한배새끼)와 비교하였다.
래트 MR을 안정적으로 과발현하는 래트 심근세포 ( H9C2 세포) 의 세포 모델 내 Serpina3의 발현(Fejes-toth, Endocrinology, 2007)
정량적 Serpina3 mRNA 발현을 다양한 농도의 알도스테론 또는 10-8 M 코르티코스테론 또는 10-6 M MR 길항제 RU 28318이, 단독으로 또는 조합으로 처리된 래트 H9-C2/MR 세포로부터 추출된 2 ㎍ DNA가 없는 총 RNA 를 사용하여 제조된 25 ㎕의 RT-PCR(Eurogentec 로부터의 Sybr Green I에 대한 qPCR Core 키트를 사용함) 상에서 정방향 5'-AGACAAGGGGACACAACTGG-3'(SEQ ID NO:7) 및 역방향 5'-TGAGATGCTAAGTGGGGAGAA-3'(SEQ ID NO:8) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(Q-PCR, Light Cycler, Biorad)에 의해 분석하였다.
카켁시아에 의해 유도된 심부전의 래트 모델 내 Serpina3의 발현. 약리학적 MR 길항제와 스피로놀락톤의 효과
정량적 Serpina3 mRNA 발현을 좌심실로부터 추출된 2 ㎍ DNA가 없는 총 RNA 를 사용하여 제조된 25 ㎕의 RT-PCR(Eurogentec로부터의 Sybr Green I에 대한 qPCR Core 키트를 사용함) 상에서 정방향 5'-AGACAAGGGGACACAACTGG-3'(SEQ ID NO:7) 및 역방향 5'-TGAGATGCTAAGTGGGGAGAA-3'(SEQ ID NO:8) 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(Q-PCR, Light Cycler, Biorad) 에 의해 분석하였다.
결과:
세린-프로테아제 억제제 SERPINA3(또는 알파1 - 항키모트립신)의 mRNA 발현은, 실시간 PCR 에 의해 측정된 바와 같이 MR-심장 마우스의 심장에서 x25 상향 조절된 반면, 이들은 GR-심장 마우스에서는 매우 유의하게 상향 조절되지 않았다(도 7).
MR의 만성 효과와 초기에 발생한 효과 사이의 가능한 연결을 조사하기 위해, MR-심장 마우스에서 확인된 생체 내 MR-조절 유전자 중 일부를 H9C2/MR+ 세포주에서 시험하였다. 24 시간 동안 낮은 투여량의 알도스테론(1 nM)의 존재하에서, SERPINA3 mRNA은 약 8 배 유도되었다(도 8). 유도는 MR 길항제 RU 28318의 존재하에서 억제되었으며, 이것이 MR과의 특이적 상호작용에 관여한다는 것을 증명한다. 흥미롭게는, 10 nM 코르티코스테론은 MR 길항제로 예방되었던 알도스테론보다 유사한 영향을 갖는다(도 8). 시간 경과 실험(도 9A)은 serpina3이 10 시간 후 알도스테론 10 nM에 의해 유도되었고, 24 시간 후 강하게 유도(x 15)되었음을 나타내었다. 1 nM 알도스테론으로 시작하여 농도 의존적 유도가 관찰되었다(도 9B).
카켁시아와 연관된 심부전(HF)의 래트 모델에서, 실시간 PCR에 의해 추정되는 바와 같이 심장 Serpina3 mRNA 발현은 6 배까지 유도된다(sham 대 HF)(도 10). 스피로놀락톤이 심부전 증상의 발달을 예방하는데 유효한 농도로 투여되는 경우(HF +스피로 50 mg/Kg/j 대 HF), Serpina3 mRNA의 유도는 완전히 예방된다(도 10).
상기 데이터는 MR을 과발현하는 마우스에서 관찰되는 바와 같이, SERPINA3이 심근세포에서 알도스테론에 대한 초기 반응 뿐만 아니라, 향상된 MR 신호에 대한 만성 적응에 관여함을 보여준다. serpina3은 분비된 효소이기 때문에, 이것은 MR 활성화와 연관된 심장 손상의 마커로서 사용될 수 있다.
참조문헌:
본 출원에서, 다양한 참조문헌이 본 발명이 속하는 업계의 상황을 기술한다. 상기 참조문헌의 설명은 본원에서 참조로서 인용된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) <120> BIOMARKERS OF MINERALOCORTICOID RECEPTOR ACTIVATION <130> IP20111735/FR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ggaccagggc tgtcgctact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 ggtggccact tgcacattgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 tcaccctgta cggaagaacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 ggtgggaaca gagaaaacga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 catccctgtg ggaagtcagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 cttttgggtg gaggcagata 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 agacaagggg acacaactgg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 tgagatgcta agtggggaga a 21

Claims (15)

  1. 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin: NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 미네랄로코르티코이드 수용체(Mineralocorticoid Receptor: MR) 활성화의 평가 방법.
  2. 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정하는 것을 포함하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제에 의한 치료에 대한 환자의 반응성의 예측 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준이 1 또는 2 개의 바이오마커 mRNA의 양을 측정함으로써 결정되고, 상기 생물학적 샘플이 세포 또는 조직 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포 샘플이 말초 혈액 단핵구 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell: PBMC) 샘플 또는 내피 세포 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준이 RT-PCR에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준이 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내 1 또는 2 개의 바이오마커 단백질의 농도를 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가 심혈관 질환이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가 울혈성 심부전 또는 고혈압이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가 안지오텐신-전환 효소 억제제, 이뇨제, 혈관확장제, 베타-차단제, 디지탈리스 및 항응고제로 이루어진 군에서 선택되는 표준 치료로 이미 치료받은 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가 비만, 당뇨병 또는 대사성 증후군이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군이 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제로서,
    상기 환자가 일반적인 집단으로부터 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값(predetermined value)보다 높은, 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제.
  13. 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 또는 대사성 증후군이 있는 환자의 치료용 의약의 제조를 위한, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제의 용도로서,
    상기 환자가 일반적인 집단으로부터 또는 건강한 대상으로부터 수득된 선결 값보다 높은, 중성구 젤라티나아제-연관 리포칼린(NGAL) 유전자 및 SERPINA3 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 2 개의 바이오마커의 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는, MR 길항제 또는 알도스테론 신타아제 억제제의 용도.
  14. a) NGAL 단백질을 검출하기 위한 수단; 및
    b) SERPINA3 단백질을 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    a) NGAL 단백질의 결합 파트너; 및
    b) SERPINA3 단백질의 결합 파트너를 포함하는 키트.
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