KR20110080642A - N'-retinoylpolyethyleneglycol hydrazide derivatives and method for preparing the same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: N-retinoylpolyethyleneglycol hydrazide derivatives are provided to ensure excellent chemical stability, skin absorption, and solubility to water compared with existing retinoic acid derivatives and to secure aging prevention and skin regeneration effects. CONSTITUTION: N-retinoylpolyethyleneglycol hydrazide derivatives are represented by chemical formula 1. In chemical formula 1, R represents hydrogen or C1~6 lower alkyl, and n is an integer of 2-100. A method for preparing hydrazide derivatives of chemical formula 1 includes a step of reacting a compound in which X of chemical formula 2 is a hydroxy group with polyethylene glycol hydrazide derivatives of chemical formula 3 in the presence of a condensing agent and an organic amine catalyst.

Description

Ｎ'-레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체 및 그 제조방법 {Ｎ'-retinoylpolyethyleneglycol hydrazide derivatives and method for preparing the same}N'-retinoyl polyethyleneglycolated hydrazide derivatives and a method for preparing the same {N'-retinoylpolyethyleneglycol hydrazide derivatives and method for preparing the same}

본 발명은 하기 화학식 1의 N'-레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 하기 화학식 1과 같이, 모두-트랜스(all-trans)인 레티놀 부분을 포함하는 히드라지드 유도체는 물에 대한 용해도가 높고, 비 자극적이며, 효소 분해능이 우수하여, 피부흡수력이 탁월한 동시에 콜라겐 합성을 촉진할 수 있어, 노화방지 기능성 화장품 원료 또는, 필요에 따라, 의약품의 원료로 사용될 수 있다.The present invention relates to a N'-retinoyl polyethyleneglycolated hydrazide derivative of the formula (1) and a method for producing the same. As shown in Chemical Formula 1, the hydrazide derivative including an all-trans retinol moiety is highly soluble in water, non-irritating, and has excellent enzymatic resolution, thereby promoting collagen synthesis with excellent skin absorption. It can be used as a raw material for anti-aging functional cosmetics or, if necessary, pharmaceuticals.

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(상기 화학식 1에서, R은 수소 또는 C1~C6의 저급 알킬을 나타내고, n은 2 내지 100 의 정수이다)(In Formula 1, R represents hydrogen or lower alkyl of C1 ~ C6, n is an integer of 2 to 100)

레티노인산 및 레티닐 에스테르는 레티노이드라 총칭하는 비타민 A(레티놀)의 유도체에 속하며, 비타민 A의 유도체는 예컨대, 베타 카로틴, 레티날, 모두 트랜스(all-trans)인 레티노인산(retinoic acid), 9-시스(cis) 레티노인산 및 13-시스 레티노인산 등 다양한 형태로 존재한다. Retinoic acid and retinyl esters belong to derivatives of vitamin A (retinol), collectively known as retinoids, and derivatives of vitamin A are, for example, beta carotene, retinal, all-trans retinoic acid, 9-cis. (cis) is present in various forms, including retinoic acid and 13-cis retinoic acid.

비타민 A는 필수 영양소로 알려져 있으며, 비타민 A의 결핍은 의학적으로는 점막, 특히 호흡기에의 각질화(과각화증)를 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 기관지 감염에 의한 과민성 증상 또는 결핍증의 경우 실명에까지 이를 수 있는 인체에 필수적인 물질이다.(참조: 문헌 'Cell Pathol.', 45, 197-219, 1984, McDowell, E.M. 등) Vitamin A is known as an essential nutrient, and vitamin A deficiency is known medically to cause keratinization (hyperkeratosis) in the mucous membranes, especially the respiratory tract. In addition, hypersensitivity symptoms or deficiencies caused by bronchial infections are essential to the human body that can lead to blindness (see Cell Pathol., 45, 197-219, 1984, McDowell, E.M., et al.).

햇빛에 의한 자외선의 장기간 노출은 피부의 주름, 거칠어짐, 반점 등의 피부의 광노화 또는 암 등 피부질환의 주된 요인이다. 모두-트랜스인 레티노인산(all-trans retinoic acid)은 이러한 피부 광노화에 의한 피부의 거칠음이나 주름 등을 완화하는 효능이 있어서, 문헌 (JAMA, 259(1988), 527-532, Weiss C. N 등)에 따르면 이를 함유하는 화장품을 피부에 바를 경우 노화를 개선할 수 있다고 보고된바 있다. 한편, 비타민 A의 시스(cis) 이성체는 여드름 및 암의 치료제로 사용될 수 있다고 알려져 있다. 이와 같이 비타민 A, 특히 레티노인산은 노화 방지를 위한 화장품 원료 또는 의약의 활성성분으로 사용되어 왔다. Long-term exposure to ultraviolet rays by sunlight is a major cause of skin diseases such as skin aging, skin wrinkles, roughness, and spots. All-trans retinoic acid is effective in alleviating skin roughness and wrinkles caused by skin photoaging, such as JAMA, 259 (1988), 527-532, Weiss C. N, etc. It has been reported that applying cosmetics containing it to the skin can improve aging. On the other hand, cis isomers of vitamin A are known to be used for the treatment of acne and cancer. As such, vitamin A, particularly retinoic acid, has been used as an active ingredient in cosmetic raw materials or medicine for preventing aging.

그러나, 모두-트랜스인 레티노인산은 빛, 열, 산소, 물 등에 매우 불안정하기 때문에 실용화를 위해서는 안정화가 필요하며, 생체 내의 안정성, 지용성이라는 물성에 기인하는 낮은 흡수력의 문제가 해결되어야 하고, 한편으로는 부작용이 보고된 경우도 있다. 따라서 안정하고 비자극적이면서 광노화 억제의 효능을 유지한 레티노인산의 유도체에 대한 개발이 요구된다.However, because all-trans retinoic acid is very unstable in light, heat, oxygen, water, etc., it needs to be stabilized for practical use, and the problem of low absorption due to physical properties such as stability and fat soluble in vivo should be solved. In some cases, adverse events have been reported. Therefore, there is a need for development of derivatives of retinoic acid that are stable and non-irritating and maintain the efficacy of photoaging inhibition.

한편, 레티노인산의 에스테르 또는 아미드 유도체와 관련하여, 미국특허공보 제4,677,120호에는 2-(올-트랜스-레티노일옥시)-4-메톡시아세토페논 화합물이 비교적 저자극성이고, 피부암이나 광 노화의 억제에 효과를 나타낸다고 개시되었으며, 미국특허공보 제4,900,478호에는 테트라에틸렌글리콜과 레티노인산의 에스테르화 화합물이 피부에 대한 침투 증진 효과가 있는 것이 개시되어 있다. 또한, 아미드결합을 통한 N-(4-하이드록시페닐) 레틴아미드 및 레티노일 β-글루크로나이드도 레티노산의 노화억제의 활성을 가지면서 독성이 낮다고 보고된 문헌(FASEB J., 10, 1014-1024, 1996)도 있다. On the other hand, with respect to ester or amide derivatives of retinoic acid, U.S. Patent No. 4,677,120 discloses that 2- (all-trans-retinoyloxy) -4-methoxyacetophenone compound is relatively hypoallergenic and suppresses skin cancer and photoaging. It has been disclosed that the effect of the present invention, US Patent Publication No. 4,900,478 discloses that the esterified compound of tetraethylene glycol and retinoic acid has an effect of enhancing penetration into the skin. In addition, N- (4-hydroxyphenyl) retinamide and retinoyl β-gluronide via amide bonds have been reported to have low toxicity while having anti-aging activity of retinoic acid (FASEB J., 10, 1014). -1024, 1996).

이와 같은 에스테르화 또는 아미드화된 레티노인산은 지용성이기 때문에 물에 녹지 않고, 또한 안정성의 문제를 해결하기 못하였기 때문에, 효소 분해에 의해 쉽게 분해되어 생체 내의 광노화 억제 효과를 기대하기 어렵다. 따라서 노화억제용 레티노이드 화합물의 실용화를 위해서는 용해도 및 안정성 등의 문제의 해결이 급선무라 하겠다. Since such esterified or amidated retinoic acid is fat-soluble, it is insoluble in water and has not solved the problem of stability. Therefore, it is easily decomposed by enzymatic degradation and it is difficult to expect the effect of inhibiting photoaging in vivo. Therefore, the solution of problems such as solubility and stability for the practical use of the anti-aging retinoid compound is urgent.

최근에는 지용성인 레티노이드 계열 화합물을 폴리에틸렌글리콜로 에스테르화 및 고리화하여 물에 대한 용해도를 개선함으로써 안정화된 레티노이드 제형이 제시된 특허문헌(PCT/US2002/036421, Bentley, M.D. 등)이 있었다. 이러한 제형은 가공이나 체내 흡수가 비교적 용이하고, 특히 흡입 투여에 매우 적합하여 만성 폐쇄성 폐질환인 기종의 치료에 있어서 적은 용량으로 소기의 치료 효과를 나타낼 수 있어, 생체 이용률의 극대화하고 전신 독성을 감소시킬 수 있다고 한다.Recently, there has been a patent document (PCT / US2002 / 036421, Bentley, M.D., et al.), In which a retinoid formulation stabilized by esterifying and cyclizing a lipid-soluble retinoid family compound with polyethylene glycol to improve solubility in water. These formulations are relatively easy to process and absorb in the body, and are particularly well suited for inhalation administration, which can produce small doses of therapeutic effects in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease, maximizing bioavailability and reducing systemic toxicity. It is said to be possible.

다만, 이 제형은 혈액 내 폴리에틸렌글리콜 골격 (PEG backbone)과 레티노인산(retinoic acid)의 제어되지 않는 효소분해 속도가 문제이고, 또한, 용해도가 개선되었다 하더라도 인체의 혈액 내로 흡수된 후 실제 효능을 나타내기 위해서는 레티노인산 수용체(RAR, Retinoic Acid Receptor)에 대한 결합의 선택성이 비교적 낮다는 것이 문제된다. 어떤 관점에서, 효소분해 속도와 선택성의 문제는 대사 및 배설 효과가 불충분하다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.However, this formulation has a problem of uncontrolled rate of enzymatic degradation of the polyethylene glycol skeleton (PEG backbone) and retinoic acid in the blood, and even if the solubility is improved, it shows actual efficacy after being absorbed into the blood of the human body. The problem is that the selectivity of the binding to the Retinoic Acid Receptor (RAR) is relatively low. In some respects, the problem of enzymatic degradation rate and selectivity means that the metabolic and excretory effects are insufficient.

따라서, 인체의 혈액 pH에서 안정하고, 레티노인산의 수용체에 선택적으로 결합 후 빠르게 방출되며, 또한 비타민 A의 활성을 그대로 유지하면서도 비자극적인 새로운 수용성 레티노인산의 유도체의 개발이 절실히 요구되고 있다 (참조: 미국특허공개공보 제6,180,670).Therefore, there is an urgent need for the development of new water-soluble retinoic acid derivatives which are stable at the blood pH of the human body, are selectively released after the selective binding to the receptor of retinoic acid, and also maintain the activity of vitamin A as it is (see US Patent Published Publication No. 6,180,670).

본 발명자들은 이와 같은 선택성과 생체친화성 및 효소분해 속도의 문제점을 해결하고자 집중적인 연구를 수행하였으며, 특히, 물에 대한 용해도와 피부 흡수력을 증가시키고 잔류독성을 극소화 할 수 있는 생체 친화적 바이오폴리머인 폴리에틸렌글리콜 전구체를 도입하고, 레티노인산 수용체(RAR)에 선택적으로 결합 후 가수분해 효소에 의하여 효소분해 대사가 이루어지도록 히드라지드 부분을 도입한 레티노인산 유도체인 본 발명의 화학식 1의 N'-레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체를 개발하게 되었다. 화학식 1의 화합물은 기존의 레티노인산 유도체에 비해 화학적 안정성이 향상되었고 물에 대한 용해도가 우수하여 피부흡수력이 뛰어나며, 레티노인산 수용체와 선택적으로 결합하고 쉽게 방출되기 때문에, 노화방지 및 피부재생 효과를 가지면서도 혈액 내에서 적절하게 효소 분해되어 저자극성, 비독성이 된다.The present inventors have conducted intensive studies to solve the problems of the selectivity, biocompatibility and the rate of enzymatic degradation. In particular, the present invention is a bio-friendly biopolymer that can increase the solubility and water absorption of water and minimize residual toxicity. N'-retinoylpolyethylene glycol of Formula 1 of the present invention, which is a retinoic acid derivative in which a polyethylene glycol precursor is introduced, and a hydrazide moiety is introduced to selectively undergo binding to a retinoic acid receptor (RAR) and then undergo enzymatic metabolism by a hydrolase. A hydrazide derivative was developed. The compound of Formula 1 has improved chemical stability and superior water absorption due to improved solubility in water compared to conventional retinoic acid derivatives, and selectively binds to and is easily released with the retinoic acid receptor, thus preventing blood from aging and regenerating the skin. Properly enzymatically digested in the cells, hypoallergenic and non-toxic.

본 발명은 하기 화학식 1의 N'-레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체 및 그 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a N'-retinoyl polyethyleneglycolated hydrazide derivative of the formula (1) and a method for producing the same.

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상기 화학식 1에서, R은 수소 또는 C1~C6 저급 알킬을 나타내고, n은 2 내지 100 위의 정수이다. 바람직하게, 화학식 1의 히드라지드 유도체는 R은 수소 또는 메틸이고, n이 4 내지 40 의 정수이다.In Formula 1, R is hydrogen or C1 ~ C6 Lower alkyl and n is an integer from 2 to 100. Preferably, the hydrazide derivative of Formula 1 is R is hydrogen or methyl and n is an integer from 4 to 40.

이하, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 상세히 설명한다. Hereinafter, a method of preparing the compound of Formula 1 according to the present invention will be described in detail.

제조 방법 1로서, 화학식 2의 화합물에서 X가 히드록시인 화합물을 용매 중에서 축합제 및 유기아민 촉매의 존재 하에 화학식 3의 화합물과 반응시키거나, 제조 방법 2로서, 하기 화학식 2의 화합물 중에서 X가 할로겐인 화합물을 용매 중에서 유기아민 염기 존재 하에 하기 화학식 3의 화합물과 반응시킴으로써, 화학식 1의 히드라지드 화합물을 제조할 수 있다.As Preparation Method 1, a compound wherein X is hydroxy in a compound of Formula 2 is reacted with a compound of Formula 3 in a solvent in the presence of a condensing agent and an organic amine catalyst, or as Preparation Method 2, wherein X is A hydrazide compound of formula 1 may be prepared by reacting a compound that is a halogen with a compound of formula 3 in the presence of an organic amine base in a solvent.

Figure pat00003
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Figure pat00004
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화학식 2, 3에서 R 및 n은 상기 정의한 바와 같고, X는 히드록시 또는 할로겐을 나타낸다. 제조방법에 대해 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.In formulas (2) and (3), R and n are as defined above and X represents hydroxy or halogen. Hereinafter, the manufacturing method will be described in detail.

제조 방법 1에서는, 축합제로서 N,N,N',N'-테트라메틸틸-(벤조트리아졸-1-일)-우로니움테트라플루오로보레이트(TBTU), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카보디이미드(EDC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC) 또는 N,N-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)를 사용하고, 축합반응을 촉진시키는 유기 아민 촉매로서 디이소프로필에틸아민(DIPEA) 또는 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 사용하는 것이 바람직하다. 용매로는 무수 유기용매, 예를 들어 디클로로메탄, 벤젠, 톨루엔, 테트라히이드로퓨란 및 디에틸에테르 중에서 선택적으로 사용할 수 있다. 반응은 통상 질소 대기 하에서 빛과 수분이 차단된 상태로 진행되며 냉각 또는 가온된 상태에서 이루어진다.In the production method 1, N, N, N ', N'-tetramethyltyl- (benzotriazol-1-yl) -uronium tetrafluoroborate (TBTU), N- (3-dimethylamino as a condensing agent Propyl) -N'-ethyl-carbodiimide (EDC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) or N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) Preference is given to using diisopropylethylamine (DIPEA) or N, N-dimethylaminopyridine (DMAP) as the organic amine catalyst to be promoted. The solvent may be optionally used among anhydrous organic solvents such as dichloromethane, benzene, toluene, tetrahydrofuran and diethyl ether. The reaction is usually carried out under a nitrogen atmosphere with light and water shielded and is cooled or warmed.

제조방법 2에서는, 염기로 작용하는 유기아민으로는 바람직하게 피리딘 또는 트리에틸아민이 사용되며, 용매로는 무수 유기용매, 예를 들어 디클로로메탄, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로푸란 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상이 사용된다. 이때, 유기아민은 화학식 3의 화합물을 기준으로 하여 1.0 내지 2.0 몰배량 사용하는 것이 바람직하다. 반응은 통상 질소 대기 하에서 빛과 수분이 차단된 상태로 진행되며 냉각 또는 가온된 상태에서 이루어진다.In preparation method 2, pyridine or triethylamine is preferably used as the organic amine serving as a base, and the solvent is selected from anhydrous organic solvents such as dichloromethane, benzene, toluene, tetrahydrofuran and diethyl ether. One or more kinds are used. At this time, the organic amine is preferably used in 1.0 to 2.0 molar amount based on the compound of the formula (3). The reaction is usually carried out under a nitrogen atmosphere with light and water shielded and is cooled or warmed.

본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 염기, 축합제, 촉매 및 용매가 상기 열거되어 있으나, 이상 열거된 것만으로 한정되는 것은 아니고, 반응에 악영향을 끼치지 않는 범위 내에서 당 업계에서 통상적으로 사용되는 공지된 대체 화합물을 사용 할 수 있다.Bases, condensing agents, catalysts, and solvents that may be used in the process according to the invention are listed above, but are not limited to those listed above, and are commonly used in the art within the scope of not adversely affecting the reaction. Known alternative compounds can be used.

본 발명의 제조방법에서 출발물질의 하나로 사용되는, 화학식 2의 X가 할라이드인 화합물은 레티노산을 삼염화인, 티오닐클로라이드 등과 같은 할로겐화제와 반응시킴으로써 제조할 수 있으며, 화학식 3의 폴리에틸렌글리콜 유도체는 예를 들면, 문헌 (synthetic comm., Vol., 77 NO, 16, 1992, Timothy P. Kogan 등) 등에 기재된 공지의 방법에 따라 제조하여 사용하는 것이 가능하다. 또한 상기 설명한 방법으로 제조된 화학식 1의 화합물은 통상의 분리, 정제 방법, 예를 들어 재결정이나 칼럼 크로마토그래피법을 사용하여 정제할 수 있다.The compound in which X in Formula 2 is a halide, which is used as a starting material in the preparation method of the present invention, may be prepared by reacting retinoic acid with a halogenating agent such as phosphorus trichloride, thionyl chloride, and the like. For example, it is possible to manufacture and use according to the well-known method described in literature (synthetic comm., Vol., 77 NO, 16, 1992, Timothy P. Kogan etc.). In addition, the compound of the formula (1) prepared by the above-described method can be purified using conventional separation and purification methods such as recrystallization or column chromatography.

화학식 1의 히드라지드 유도체는 암이나 여드름, 피부주름, 주근깨 치료 등 피부질환 및 미용을 위해 사용될 수 있다. 특히, 화학식 1의 화합물은 피부 도포 시 자극이 없으며, 피부흡수력이 뛰어나 콜라겐 생합성을 촉진하고 엘라스틴의 분해를 방지하여 피부재생 효과를 지니며, 특히, 효소분해가 용이하고 레티노인산 수용체에 대해 높은 선택성을 가지는 것을 특징으로 한다Hydrazide derivatives of Formula 1 may be used for skin diseases and beauty, such as cancer or acne, skin wrinkles, freckles treatment. In particular, the compound of Formula 1 has no irritation upon skin application, has excellent skin absorption ability, promotes collagen biosynthesis and prevents degradation of elastin, and has a skin regeneration effect. In particular, the enzyme is easy to decompose and has high selectivity to the retinoic acid receptor. It is characterized by having

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 기존의 레티노인산 유도체에 비해 화학적 안정성과 피부흡수력이 뛰어나고, 물에 대한 용해도가 우수하다. 또한 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 RAR과 효과적으로 선택적 결합 및 방출을 할 수 있어, 혈액 내에서 적절하게 효소 분해되므로, 자극성 및 독성이 없고 피부재생에 있어서 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.The compound of Formula 1 according to the present invention has excellent chemical stability and skin absorption, and has excellent solubility in water, compared to conventional retinoic acid derivatives. In addition, the compound of the formula (1) according to the present invention can effectively bind and release with RAR, because it is properly enzymatically degraded in the blood, there is no irritation and toxicity and can exhibit an excellent effect on skin regeneration.

도 1은 본 발명의 화학식 1의 화합물[제조방법 1]과 비교 물질인 레티노인산, 레티놀팔미테이트 및 피이지레틴아미드 고리를 가진 화합물의 콜라겐합성 증가율을 비교한 것이다.
도 2는 본 발명의 화학식 1의 화합물[I]와 비교 물질인 레티노인산, 레티놀팔미테이트 및 피이지레틴아미드 고리를 가진 화합물의 세포독성효과를 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 화학식 1의 연결고리 형태인 히드라지드의 가수분해 속도를 피이지레틴아미드와 모노메톡시피이지레틴에스테르와 비교한 것이다.FIG. 1 compares the increase rate of collagen synthesis of a compound of Formula 1 of the present invention [Manufacturing Method 1] and a compound having a retinoic acid, a retinol palmitate, and a pyriretinamide ring.
FIG. 2 compares the cytotoxic effect of the compound [I] of the present invention and a compound having a retinoic acid, retinol palmitate and a pyrethretinamide ring.
Figure 3 compares the hydrolysis rate of the hydrazide in the linkage form of formula 1 of the present invention with the fiji retinamide and monomethoxy fiji retin ester.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 생리활성을 확인하기 위한 실험은 다음과 같이 수행되었다. Experiments for confirming the physiological activity of the compound of formula 1 according to the present invention was performed as follows.

경피흡수시험은, 7주령 암컷 쥐의 피부(등 부위)를 절취하여, 본 발명의 화합물 50 mM를 사용하여 피부 및 여과액을 경피흡수측정 기기(Franz cell) 및 HPLC를 사용하여 분석하였다. 세포 재생 효과는, 인산섬유아세포에서 피부의 신진대사를 증진을 의미하는 콜라겐합성 효과를 측정하여 확인하였다. 알러지시험은, 에탄올을 운반 매개체로 사용하여 쥐를 대상으로 시험하였다. 피부자극성시험은, 본 발명의 화합물을 0.05% 내지 1% 범위의 농도로 기니픽(Guinea Pig)에 Draize 기술로 패치 실험 및 O/W 유화 매개 실험하여 확인하였다. 세포독성시험은, 햄스터 폐섬유아세포(V79-4)를 이용하여 세포증식확인을 위해 MTT 시험을 하였다. 가수분해시험은, 쥐(rat)의 혈청에 용해하여 37℃ 항온에서 처리 후 HPLC를 통하여 확인하였다.In the transdermal absorption test, the skin (dorsal region) of 7-week-old female rats was excised, and the skin and filtrate were analyzed using a 50 mM compound of the present invention using a transdermal absorption instrument (Franz cell) and HPLC. The cell regeneration effect was confirmed by measuring the collagen synthesis effect, which means to promote skin metabolism in phosphate fibroblasts. Allergy testing was conducted in rats using ethanol as a carrier medium. Skin irritation test was confirmed by the patch test and O / W emulsification mediated experiments with the Draize technology in Guinea Pigs in a concentration range of 0.05% to 1% of the compound of the present invention. Cytotoxicity test, MTT test for cell proliferation using hamster lung fibroblasts (V79-4). The hydrolysis test was dissolved in rat serum and treated through HPLC at 37 ° C. constant temperature.

실험결과, 본 발명에 따른 히드라지도 유도체 화합물은 기존에 상업적으로 사용되어온 노화억제용 의약 및 화장품원료인 레티노산 또는 레티놀 팔미테이트 등과 비교하여 경피 흡수력에 있어서 2 내지 10배의 증가를 나타내었으며, 세포독성실험에서는 10-4w%/㎖ 이하에서 무독성인 특성을 가지며, 특히 RAR에 대한 선택적 결합 후 효소분해 및 대사과정이 최적화되어, 효능이 크게 증가됨을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 히드라지드 유도체는 무독성, 비자극성이고, 피부흡수력 및 콜라겐합성증진 기능이 우수하여 화장품 (크림, 로션, 겔 등 제형에 제한을 받지 않는다) 또는 의약의 활성 성분으로 널리 사용될 수 있다.As a result, the hydrazido derivative compounds according to the present invention showed a 2 to 10-fold increase in the transdermal absorption ability compared to the retinoic acid or retinol palmitate, which is a commercially available anti-aging drug and cosmetic ingredient. In the toxicity experiment, it was confirmed that the nontoxic property was less than 10 -4 w% / ml, and in particular, the enzymatic degradation and metabolic process after the selective binding to RAR were optimized, thereby greatly increasing the efficacy. Therefore, the hydrazide derivative according to the present invention is non-toxic, non-irritating, and has excellent skin absorption and collagen synthesis function, and thus can be widely used as an active ingredient of cosmetics (creams, lotions, gels, etc.) or pharmaceuticals. .

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것 일뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following Examples and Experimental Examples. The following Examples and Experimental Examples are only for better understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these Examples in any sense.

[실시예 1] 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 히드라지드 (R: Me, n=11)의 제조Example 1 Preparation of Monomethoxy Polyethylene Glycol Hydrazide (R: Me, n = 11)

모노메톡시폴리에틸렌글리콜 히드라지드(화학식 3)는 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜로부터 2 단계 반응을 거쳐 하기 반응 계획 1에 따라서 제조되었다.Monomethoxypolyethylene glycol hydrazide (Formula 3) was prepared according to Reaction Scheme 1 below via a two step reaction from monomethoxypolyethylene glycol.

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반응 계획 1. 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 히드라지드 합성
Reaction Scheme 1. Monomethoxypolyethyleneglycol hydrazide synthesis

ⅰ) 톨루엔 125 ㎖에 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 10 g (20 mmol)과 테트라부틸암모늄브로마이드(TBAB) 1g(3.1mol)을 넣은 다음 톨루엔 105㎖로 증류 제거한 후, 수산화 칼륨 0.8g(14.2mmol)을 첨가하여 혼합하고, 이 혼합물을 질소 대기 하에서 60 ℃로 가온하였다. 이어서 두 시간에 걸쳐 에틸아크릴레이트 16g(0.1mmol)을 첨가하고, 질소 대기 하에서 하룻밤 동안 60℃에서 교반하였다. 그 후 감압 하에 용매를 증류 제거하고, 잔류물은 디클로로메탄 용액에 용해하였다. 이 용액을 증류수로 2회 세척하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조 한 후, 컬럼 크로마토그래피로 분리하여(SiO2, 270~400 mesh, 디클로로메탄/ 메탄올= 10:1, v/v) 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피오닐에틸 에스테르 7.8g (수율: 65%)을 얻었다. NMR (d5-DMSO): 1.20 (t, CH2CH3, 3H), 2.41 (t, -CH2-COO-, 2H), 3.24 (s, O-CH3, 3H), 3.51 (PEG), 4.05 (q, CH2CH3, 2H)V) 10 g (20 mmol) of monomethoxypolyethylene glycol and 1 g (3.1 mol) of tetrabutylammonium bromide (TBAB) were added to 125 ml of toluene, followed by distillation with 105 ml of toluene, followed by 0.8 g (14.2 mmol) of potassium hydroxide. Add and mix, and warm the mixture to 60 ° C. under a nitrogen atmosphere. 16 g (0.1 mmol) of ethylacrylate were then added over two hours and stirred at 60 ° C. overnight under a nitrogen atmosphere. The solvent was then distilled off under reduced pressure and the residue dissolved in dichloromethane solution. The solution was washed twice with distilled water, dried over anhydrous magnesium sulfate and separated by column chromatography (SiO 2 , 270-400 mesh, dichloromethane / methanol = 10: 1, v / v) to monomethoxypolyethylene 7.8 g (yield: 65%) of glycol propionylethyl ester were obtained. NMR (d 5 -DMSO): 1.20 (t, CH 2 CH 3 , 3H), 2.41 (t, -CH 2 -COO-, 2H), 3.24 (s, O-CH 3 , 3H), 3.51 (PEG) , 4.05 (q, CH 2 CH 3 , 2H)

ⅱ) 단계ⅰ)에서 수득된 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 프로피오닐에틸 에스테르 5g (8.3 mmol)과 무수 히드라진 80㎖를 혼합한 용액을 100℃로 18시간 동안 가열, 교반하였다. 그 다음, 반응 용액을 뜨거운 에탄올에 천천히 가한 후 24 시간 동안 냉장 보관하여 침전물을 얻었다. 침전물을 여과하여 수거하고 에테르로 세 번 세척하여 모노메톡시에틸렌글리콜 히드라지드 4.38g (수율: 90%)을 얻었다. NMR (CDCl3): 3.38 (s, O-CH3, 3H), 3.5-3.8 (PEG), 4.08 (s, CH2CO, 2H), 8.46 (bs, NH, 1H) (참고: 문헌 'synthetic comm.' Vol. 77, No. 16, 1992)
Ii) A solution of 5 g (8.3 mmol) of monomethoxypolyethylene glycol propionylethyl ester obtained in step iv) and 80 ml of anhydrous hydrazine was heated and stirred at 100 ° C. for 18 hours. Then, the reaction solution was slowly added to hot ethanol and then refrigerated for 24 hours to obtain a precipitate. The precipitate was collected by filtration and washed three times with ether to give 4.38 g of monomethoxyethylene glycol hydrazide (yield: 90%). NMR (CDCl 3 ): 3.38 (s, O-CH 3 , 3H), 3.5-3.8 (PEG), 4.08 (s, CH 2 CO, 2H), 8.46 (bs, NH, 1H) (see literature 'synthetic comm. 'Vol. 77, No. 16, 1992)

[실시예 2] 화합물 [I] (레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체, 상기 화학식 1에서, R=Me, n=11)의 제조 Example 2 Preparation of Compound [I] (Retinoyl Polyethyleneglycolated Hydrazide Derivative, In Formula 1, R = Me, n = 11)

실시예 1에서 수득한 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 히드라지드 (상기 화학식 3에서, R은 메틸기, n=1,평균 분자량 580) 1g(1.72mmol)과 레티노인산 (화학식 2의 X= OH) 0.52g(1.72mmol)을 무수 디클로로메탄 용액 10㎖에 녹인 후, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)-우로니움테트라플루오로보레이트(TBTU) 0.06g(0.172mmol)과 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 6.7mg(0.052mmol)을 첨가한 후 질소 하에서 빛과 수분을 차단한 가운데 상온에서 12시간 교반하였다. 반응용액을 여과 한 후 용매를 감압 증류하여 제거하고 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 (SiO2, 270~400mesh, 디클로로메탄/ 메탄올= 10:1, v/v), 표제의 화합물 [1] 1.2g (수율: 65%)을 수득하였다.Monomethoxypolyethyleneglycol hydrazide obtained in Example 1 (wherein R is a methyl group, n = 1, average molecular weight 580) 1 g (1.72 mmol) and retinoic acid (X = OH in Formula 2) 0.52 g (1.72) mmol) was dissolved in 10 ml of anhydrous dichloromethane solution, and then 0.06 g of N, N, N ', N'-tetramethyl-O- (benzotriazol-1-yl) -uronium tetrafluoroborate (TBTU) (0.172 mmol) and 6.7 mg (0.052 mmol) of diisopropylethylamine (DIPEA) were added thereto, followed by stirring at room temperature for 12 hours while blocking light and water under nitrogen. After filtering the reaction solution, the solvent was distilled off under reduced pressure and the residue was separated by column chromatography (SiO 2 , 270-400mesh, dichloromethane / methanol = 10: 1, v / v) to obtain the title compound [1] 1.2g ( Yield: 65%).

[실시예 3] 화합물 [II] (레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체, 상기 화학식 1에서, R=Me, n=11)의 제조Example 3 Preparation of Compound [II] (Retinoyl Polyethyleneglycolated Hydrazide Derivative, In Formula 1, R = Me, n = 11)

레티노인산 4.0g (0.013mol)을 무수 톨루엔 20㎖에 용해시킨 후, 여기에 삼염화인 (PCl3) 1.83g (0.013mol)을 적가하고 상온에서 빛과 수분을 차단한 채 질소 하에서 15시간 동안 교반하였다. 상기 수득된 레티노산클로라이드 용액을 실시예 1에서 얻어진 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 히드라지드 7.78g(0.013mol) 및 트리에틸아민 1.57 g (0.016 mol)과 함께 얼음 냉각 하에서 20 분간 무수 디클로로메탄 40㎖에 적가해 준 후, 계속해서 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응용액을 포화 염화나트륨 수용액 50㎖ 에 가하고 유기층을 분리하여 물로 세척한 다음 무수 황산나트륨으로 건조, 여과 및 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 분리 (SiO2, 200~400 mesh, 디클로로메탄/메탄올= 10:1, v/v)하여, 표제의 화합물 [II] 6.8g (수율: 60%)을 수득하였다.
After dissolving 4.0 g (0.013 mol) of retinoic acid in 20 ml of toluene anhydride, 1.83 g (0.013 mol) of phosphorus trichloride (PCl 3 ) was added dropwise thereto, and stirred under nitrogen for 15 hours while blocking light and water at room temperature. . The obtained retinoic acid chloride solution was added dropwise with 7.78 g (0.013 mol) of monomethoxypolyethylene glycol hydrazide and 1.57 g (0.016 mol) of triethylamine to 40 ml of anhydrous dichloromethane for 20 minutes under ice cooling. After this, the mixture was stirred for 5 hours at room temperature. The reaction solution was added to 50 ml of saturated aqueous sodium chloride solution, and the organic layer was separated, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The residue was separated by column chromatography (SiO 2 , 200-400 mesh, dichloromethane / methanol = 10: 1, v / v) to give 6.8 g (yield: 60%) of the title compound [II].

[실험예 1] 경피흡수시험Experimental Example 1 Percutaneous Absorption Test

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 [I](실시예 2에서 합성한 것을 사용)의 경피흡수시험을 위해, 노화방지용 의약 및 화장품원료로 사용는 레티놀, 레티놀 팔미테이트, 레티노인산 및 피이지레인아미드를 각각 대조군으로 경피흡수시험을 하였다. 오일(카프릴릭카프릭- 트리관리세라이드)과 에탄올의 1:1 혼합용매를 매개체로 사용하였다(참고 문헌: J. Invest Dermatol., 1998, 91; 56-61). For the transdermal absorption test of the compound [I] of Formula 1 (using the one synthesized in Example 2) according to the present invention, as an anti-aging pharmaceutical and cosmetic raw material, retinol, retinol palmitate, retinoic acid and pyrazinamide, respectively Percutaneous absorption test was performed as a control. A 1: 1 mixed solvent of oil (caprylic capric-tri-administration ceres) and ethanol was used as a vehicle (J. Invest Dermatol., 1998, 91; 56-61).

먼저, 7주령의 암컷 무모 마우스의 피부를 절취하고 1.7cm2 의 피부에 50mM의 화합물 [I]의 시료용액을 150㎕씩 적용하였다. 24시간 후 2% Volpo 20™(Oleth-20)을 포함하는 50mM PBS 완충용액(pH 7.4)인 수용기 용액과 피부를 경피흡수측정기(Frnaz cell)를 이용 추출하고, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량분석하여 하기 표 1에 결과를 나타내었다(표 1에서 화학식 1의 화합물은 상기에서 제조된 화합물 [I]을 말한다).First, the skin of a 7-week-old female hairless mouse was excised and 150 μl of a 50 mM sample solution of Compound [I] was applied to 1.7 cm 2 of skin. After 24 hours, the receptor solution, 50 mM PBS buffer (pH 7.4) containing 2% Volpo 20 ™ (Oleth-20), and the skin were extracted using a percutaneous absorption analyzer (Frnaz cell), followed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 1 below by quantitative analysis (in Table 1, the compound of Formula 1 refers to compound [I] prepared above).

표 1에서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 기존에 레티놀의 3.4배, 레티놀팔미테이트의 6.1배, 레티노인산의 2.7배 경피흡수가 가능함을 확인하였으며, 특히 용해도가 개선된 것으로 알려진 피이지레틴아미드보다 상대적으로 높은 경피 흡수율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.In Table 1, it was confirmed that the compound of Formula 1 according to the present invention is capable of transdermal absorption of 3.4 times of retinol, 6.1 times of retinol palmitate, and 2.7 times of retinoic acid. It was confirmed that the relatively higher transdermal absorption.

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[실험예 2] 콜라겐 합성 효과시험Experimental Example 2 Collagen Synthesis Effect Test

본 발명의 화학식 1의 화합물 [I](화학식 1에서, R=메틸, n=11)의 피부노화방지의 효능을 확인을 위해 콜라겐합성 효과를 확인하였다. 대조물질로서 레티노인산과 레티놀팔미테이트 및 피이지레틴아미드를 각각 사용하여 비교시험을 하였다. The collagen synthesis effect of the compound [I] of Formula 1 (In Formula 1, R = methyl, n = 11) of the present invention was confirmed to confirm the efficacy of anti-aging of the skin. Comparative tests were performed using retinoic acid, retinol palmitate and fiji retinamide, respectively, as controls.

24 웰 플레이트에 동일한 수의 인간 섬유아세포(human fibroblast)를 24 시간 동안 배양한 후 시료 10-4 내지 10-7w/㎖(%)로 처리하였다. 2 시간 후 삼중수로로 치환된 프롤린(L-2, 3-3H 프롤린)으로 처리하여 24 시간 동안 배양하고, 배양 배지를 이용하여 섬유아세포가 새롭게 합성 분비한 콜라겐의 양을 트리튬이 도입된 프롤린을 분당 횟수(CPM, counting per minute) 수준으로 측정하여, 콜라겐 민감단백질(CSP, collagenous sensitive protein)의 양을 계산하였다. 또한, 계산된 CSP의 양을 근거로 콜라겐합성효과를 비교한 결과를 첨부된 도 1에 나타내었다 (참고: Analytical Biochemistry, 1979; 96, 220-224.; J. Invest Derma tol, 1991, 96, 473-477). 단, 도 1에서 대조군은 콜라겐 합성에 활성을 갖는 혈청이 첨가된 것(노화억제제 처리 안함)을 나타낸다. (도 1에서 화합물 1은 상기에서 제조된 화합물 [I]를 말한다)The same number of human fibroblasts were incubated in a 24-well plate for 24 hours and then treated with samples 10 −4 to 10 −7 w / ml (%). After 2 hours, the cells were treated with triple water-substituted proline (L-2, 3- H proline) and incubated for 24 hours, and the amount of collagen newly synthesized by fibroblasts was cultured using the culture medium. The amount of collagen sensitive protein (CSP) was calculated by measuring the number of minutes per minute (CPM). In addition, the results of comparing the collagen synthesis effect based on the calculated amount of CSP is shown in Figure 1 attached (see: Analytical Biochemistry, 1979; 96, 220-224 .; J. Invest Derma tol, 1991, 96, 473-477). However, in FIG. 1, the control group indicates that serum having an activity in collagen synthesis was added (not treated with an anti-aging agent). (Compound 1 in Figure 1 refers to compound [I] prepared above)

도 1에서 레티놀 팔미테이트는 콜라겐합성 증진 효과를 거의 나타내지 않았으며, 레티노인산 및 피이지레틴아미드는 각각 10-7 w% /㎖에서 최고 22%과 34%의 증가효과를 나타내었다. 반면에, 화학식 1의 화합물 [I]는 피이지레틴아미드의 활성보다 우수한 결과를 주었고, 레티노인산에 비해 10-7 w%/㎖에서 최고(41%)의 증진효과를 나타내었다.
In Figure 1, retinol palmitate showed little collagen synthesis enhancing effect, while retinoic acid and pyrethretinamide showed an increase of up to 22% and 34% at 10 −7 w% / ml, respectively. On the other hand, Compound [I] of Formula 1 gave better results than the activity of Fiji Retinamide, showing the highest (41%) enhancement effect at 10-7 w% / ml compared to retinoic acid.

[실험예 3] 알러지시험 (LLNA)Experimental Example 3 Allergy Test (LLNA)

본 발명의 화학식 1의 화합물 [I](화학식 1에서, R=메틸, n=11)의 알러지시험은 에탄올을 운반매개체로 사용하여 안전성 시험을 통해 확인하였다. (참고: J. Appl. Toxicol., 1990, 10(3), 173~180). 비교물질로서 레티놀팔미테이트 및 레티노인산과 화학식 1의 화합물 [I]을 각각 0.3%, 1% 농도의 아세톤/올리브오일(4/1, v/v) 용액으로 제조하였다. 쥐(Balb/c)의 양쪽 귀에 30㎕씩 3 일간 발라준 후 쥐로부터 이개임파절(Auricular lymph node)을 분리하였다. 임파절을 분쇄하여 단일세포 상태로 만든 후 방사성동위원소(3H-티미딘)를 첨가하여 24 시간 동안 배양한 다음, 세포의 증폭도(CPM)를 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. (표 2에서 화학식 1의 화합물은 상기에서 제조된 화합물 [I]을 말한다)The allergy test of the compound [I] of Formula 1 of Formula 1 (R = methyl, n = 11) of the present invention was confirmed through a safety test using ethanol as a carrier medium. (Note: J. Appl. Toxicol., 1990, 10 (3), 173-180). Retinol palmitate, retinoic acid, and the compound [I] of Formula 1 were prepared as a comparative solution of acetone / olive oil (4/1, v / v) at a concentration of 0.3% and 1%, respectively. 30 μl of both ears were applied to both ears of the mice (Balb / c) for 3 days, and auricular lymph nodes were isolated from the mice. Lymph nodes were pulverized into a single cell state and then cultured for 24 hours with the addition of radioisotope ( 3 H-thymidine), and then the results of measurement of amplification degree (CPM) of the cells are shown in Table 2 below. (Compound 1 in Table 2 refers to compound [I] prepared above)

표 2에서, 화합물 [I]은 0.3% 및 1% 용액에서 각각 1배, 2.5배로 에탄올에 비해 3배 이하의 낮은 유발성을 보였고 반면, 대조군인 레티놀 팔미테이트와 레티노인산은 동일 조건에서 7배 이상의 높은 알러지 유발성을 보였다.
In Table 2, Compound [I] showed 1-fold and 2.5-fold lower induction than 0.3-fold and 3-fold lower than ethanol, respectively, whereas the control groups Retinol Palmitate and Retinoic acid were more than 7-fold under the same conditions. It showed a high allergen.

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[실험예 4] 피부자극도시험Experimental Example 4 Skin Stimulation Test

화학식 1 화합물 [I](화학식 1에서, R=메틸, n=11)의 피부자극도를 확인하기 위하여, 기니픽(Guinea Pig)을 이용한 패치시험을 하였다.(참고 문헌: Assoc. Food and Drug officials US., 1959, 46-59; Method of testing primary irritant substances, 1973, 38(187), 1500-1541). In order to confirm the skin irritation degree of the compound [I] of Formula 1 (R = methyl, n = 11), a patch test was performed using Guinea Pig. (Reference: Assoc.Food and Drug officials US, 1959, 46-59; Method of testing primary irritant substances, 1973, 38 (187), 1500-1541).

물과 프로필렌글리콜의 O/W 유화를 운반매개로 하여 0.3% 농도의 시료용액을 제조하였다. 도포할 부위(등)의 털을 제거하고, 정확한 측정을 위해 주위환경에 24 시간 동안 적응시켰다. 도포부위(1.5 cm×1.5 cm)에 시료를 적신 가아제를 처리한 다음 고형재질의 박지로 밀봉하여 시료의 증발 및 손실을 방지하고 탄력붕대로 48 시간 동안 고정시켰다. 폐쇄 첩포를 제거한 후 2 시간, 24 시간(첩포 후 50 시간, 72 시간)째에 자극의 정도를 판정하여 표 3에 결과를 나타내었다. (표 3에서 화학식 1의 화합물은 상기에서 제조된 화합물 [I]을 말한다) 표 3에서 화학식 1의 화합물은 레티놀 팔미테이트 또는 레티노인산과 비교하여 자극 정도가 현저히 낮게 나타났다.
A sample solution of 0.3% concentration was prepared using O / W emulsification of water and propylene glycol as a carrier medium. The hair at the site of application (back) was removed and allowed to acclimate to the environment for 24 hours for accurate measurement. The treated area was treated with a gauze soaked in the application area (1.5 cm x 1.5 cm) and then sealed with a solid foil to prevent evaporation and loss of the sample and fixed with an elastic bandage for 48 hours. After removing the closed patch, the degree of stimulation was determined at 2 hours and 24 hours (50 hours and 72 hours after the patch), and the results are shown in Table 3. (The compound of formula 1 in Table 3 refers to compound [I] prepared above) In Table 3, the compound of formula 1 showed a significantly lower level of stimulation compared to retinol palmitate or retinoic acid.

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[실험예 5] 세포독성시험Experimental Example 5 Cytotoxicity Test

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 [I](화학식 1에서, R=메틸, n=11)의 의약 또는 화장품용 활성소재로서의 1차 안전성을 검증하기 위해, 차이니스햄스터 폐조직 섬유아세포의 연속 세포주(V79-4)를 배양하여 MTT 실험(참고 문헌: Journal of Immunological Methods, 1983, 65, 55~63)으로 세포독성을 확인하여, 도 2에 결과를 나타내었다. (도 2에서 화합물 1이란 상기에서 제조된 화합물 [I]을 말한다.)Continuous cell line of Chinese hamster lung tissue fibroblasts to verify the primary safety of the compound [I] of Formula 1 according to the present invention (in Formula 1, R = methyl, n = 11) as an active material for medicine or cosmetics (V79-4) was cultured to confirm cytotoxicity by MTT experiment (Ref .: Journal of Immunological Methods, 1983, 65, 55-63), and the results are shown in FIG. 2. (In Figure 2, compound 1 refers to compound [I] prepared above.)

도 2에서 화합물 [I]은 10-3 w%/㎖ 이상에서는 점차 독성을 나타내었으나, 10-4 w%/㎖ 이하에서는 미약한 독성만을 나타내었은을 알 수 있다. 이러한 결과는 독성을 나타내지 않는 한계 농도인 10-4w%/㎖ 이하에서 세포증진 효과를 보이기 시작하여 10-7w%/㎖에서 최고의 콜라겐합성 증진효과를 보이며, 상대적으로 세포독성을 발현하는 10-3w%/㎖ 이상에서는 세포증진효과를 나타내지 못하는 도 1의 실험결과와 잘 일치됨을 알 수 있다. 이로써 본 발명에 따른 화합물 [I]은 현저한 세포독성의 감소를 보임을 확인하였다.
In FIG. 2, Compound [I] gradually showed toxicity at 10 −3 w% / ml or more, but only weak toxicity at 10 −4 w% / ml or less. These results show that the cell-promoting effect is lowered at the limit of 10 -4 w% / ml, which is not toxic, and shows the highest collagen synthesis promoting effect at 10 -7 w% / ml, and shows relatively high cytotoxicity. At -3 w% / ㎖ or more it can be seen that the results are in good agreement with the experimental results of FIG. This confirmed that the compound [I] according to the present invention showed a significant decrease in cytotoxicity.

[실험예 6] Rat 혈청 중 가수분해 시험[컨쥬게이트 PHLC]Experimental Example 6 Hydrolysis in Rat Serum [Conjugate PHLC]

쥐(Rat) 혈청 중 아미드 형태의 피이지레틴아미드, 본 발명의 히드라지드 유도체인 화학식 1의 화합물 [I](화학식 1에서, R=Me, n=11 인 것), 에스테르 형태의 mPEG-ATRA의 가수분해 속도를 체내에 보다 근접하게 모델링하는 조건(37℃)하에서 가수분해 속도를 산출하였다.Fijiretinamide in amide form in rat serum, compound [I] (I in formula 1 wherein R = Me, n = 11), which is a hydrazide derivative of the present invention, mPEG-ATRA in ester form The rate of hydrolysis was calculated under conditions (37 ° C.) modeling the rate of hydrolysis closer to the body.

상기 화합물을 각각 80mg을 5 ml의 쥐 혈청 중에 용해시키고, 생성 용액을 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 시간 간격을 두고, 0.7ml 의 혈청 혼합물을 취하여, 2ml의 디클로로메탄으로 2 회 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 Na2SO4 로 건조하고, 여과하여 감압 하에 증발, 건조시켰다. 건조 잔류물에 물을 첨가하고, 여과하였다. 여과액을 역상 HPLC (Betasil C18, 100 ×2) 에 의해 PEG ATRA 및 PEG 에 대해 분석하였다. 80 mg of each of these compounds was dissolved in 5 ml of rat serum and the resulting solution was incubated at 37 ° C. At intervals of time, 0.7 ml of the serum mixture was taken and extracted twice with 2 ml of dichloromethane. The dichloromethane extracts were dried over Na 2 SO 4 , filtered, evaporated and dried under reduced pressure. Water was added to the dry residue and filtered. The filtrate was analyzed for PEG ATRA and PEG by reverse phase HPLC (Betasil C18, 100 × 2).

실험 결과를 도 3에 정리하였고, 이로부터 가수분해의 반감기(t1/2)는 에스테르 형태의 경우 2.5 시간이었고, 본 발명의 화합물 [I]의 히드라지드 유도체의 경우 16 시간이었다는 것을 확인하였다. 한편 PEG-레틴아미드의 아미드의 경우는 48 시간이 지나도 5% 미만이었다.The experimental results are summarized in FIG. 3, from which the half-life (t 1/2 ) of the hydrolysis was 2.5 hours for the ester form and 16 hours for the hydrazide derivative of the compound [I] of the present invention. On the other hand, the amide of PEG-retinamide was less than 5% even after 48 hours.

Claims (10)

하기 화학식 1의 N-레티노일폴리에틸렌글리콜화 히드라지드 유도체:
Figure pat00009

(상기 화학식 1에서, R은 수소 또는 C1~C6의 저급 알킬을 나타내고, n은 2 내지 100의 정수이다)N-retinoyl polyethyleneglycolated hydrazide derivative of Formula 1
Figure pat00009

(In Formula 1, R represents hydrogen or lower alkyl of C1 ~ C6, n is an integer of 2 to 100) 제1 항에 있어서, R은 수소 또는 메틸이고, n은 4 내지 40의 정수인 화학식 1의 히드라지드 유도체. The hydrazide derivative according to claim 1, wherein R is hydrogen or methyl and n is an integer from 4 to 40. 제1 항에 있어서, R은 메틸이고, n은 11인 화학식 1의 히드라지드 유도체.The hydrazide derivative of claim 1, wherein R is methyl and n is 11. 하기 화학식 2의 X가 히드록시기인 화합물을 용매 중에서 축합제 및 유기아민 촉매 존재 하에 하기 화학식 3의 폴리에틸렌글리콜 히드라지드 유도체와 반응시키는 것을 특징으로 하는 제 1항에 정의된 화학식 1의 히드라지드 유도체를 제조하는 방법
Figure pat00010

Figure pat00011

(상기 화학식 3에서 R 은 수소 또는 C1~C6의 저급 알킬을 나타내며, n은 2 내지 100의 정수이다)A hydrazide derivative of Formula 1 as defined in claim 1 is prepared by reacting a compound wherein X in Formula 2 is a hydroxy group with a polyethylene glycol hydrazide derivative of Formula 3 in the presence of a condensing agent and an organic amine catalyst. How to
Figure pat00010

Figure pat00011

(In Formula 3, R represents hydrogen or lower alkyl of C1 to C6, n is an integer of 2 to 100) 하기 화학식 2의 X가 할로겐인 화합물을 용매 중에서 유기아민 존재 하에 하기 화학식 3의 화합물과 반응시키는 것을 특징으로 하는 제1 항에 정의된 화학식 1의 히드라지드 유도체를 제조하는 방법:
Figure pat00012

Figure pat00013

(상기 화학식 3에서 R 은 수소 또는 C1~C6의 저급 알킬을 나타내며, n은 2 내지 100의 정수이다)A process for preparing a hydrazide derivative of formula (I) as defined in claim 1 wherein the compound of formula (II) is reacted with a compound of formula (3) in the solvent in the presence of an organic amine:
Figure pat00012

Figure pat00013

(In Formula 3, R represents hydrogen or lower alkyl of C1 to C6, n is an integer of 2 to 100) 제4 항에 있어서, 축합제는 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일) 우로니움테트라플루오로보레이트(TBTU), N-(3-디메틸아미노프로필)- N'-에틸카보디이미드(EDC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC), 및 N,N-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 히드라지드 유도체의 제조 방법.The condensation agent of claim 4, wherein the condensing agent is N, N, N ', N'-tetramethyl-O- (benzotriazol-1-yl) uroniumtetrafluoroborate (TBTU), N- (3-dimethyl Aminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide (EDC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), and N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) Method for producing a hydrazide derivative, characterized in that. 제4 항에 있어서, 유기아민 촉매는 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP) 또는 디이소프로필에틸아민(DIPEA)의 유기염인 것을 특징으로 하는 히드라지드 유도체의 제조 방법.The method of claim 4, wherein the organic amine catalyst is an organic salt of N, N-dimethylaminopyridine (DMAP) or diisopropylethylamine (DIPEA). 제5 항에 있어서, 유기아민은 피리딘 또는 트리에틸아민이며, 그 양을 화학식 3의 화합물에 대해 1.0 내지 2.0 몰배량 사용하는 것을 특징으로 하는 히드라지드 유도체의 제조 방법.The method for producing a hydrazide derivative according to claim 5, wherein the organic amine is pyridine or triethylamine, and the amount thereof is used in an amount of 1.0 to 2.0 molar amount based on the compound of the formula (3). 제4 항 내지 제8 항의 어느 한 항에 있어서, 용매는 디클로로메탄, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로푸란 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 히드라지드 유도체의 제조 방법.The method for producing a hydrazide derivative according to any one of claims 4 to 8, wherein the solvent is at least one selected from the group consisting of dichloromethane, benzene, toluene, tetrahydrofuran and diethyl ether. 제1 항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 1의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 원료 조성물. Cosmetic raw material composition comprising a compound of formula (1) as defined in any one of claims 1 to 3.
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