KR20110049877A - Ｗｔ1 백신 적응 환자의 선택 방법 - Google Patents

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Abstract

WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 한, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법이나, 그 선택을 위한 임상 검사약 등을 제공한다.
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정, (b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정, 및 (c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정을 포함하는, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 등.

Description

ＷＴ1 백신 적응 환자의 선택 방법{METHOD OF SELECTING WT1 VACCINE ADAPTIVE PATIENT}
본 발명은 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 및 그것을 포함하는 암의 처치 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 한, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 등에 관한 것이다.
WT1 유전자 (Wilms' tumor gene 1) 는 소아의 신장 종양인 Wilms 종양의 원인 유전자의 하나로서 동정되었다 (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990). WT1 유전자는 전사 인자 WT1 을 코드하고 있고, WT1 은 세포의 증식·분화·아포토시스 및 장기 형성 등에 관한 중요한 기능을 한다 (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998). 당초, WT1 유전자는 암억제 유전자로 위치 부여되고 있었지만, 그 후의 연구에 의해 백혈병 및 폐암이나 유방암을 포함하는 각종 고형 암에서 발현이 인정되고, 오히려 암의 증식을 촉진하는 암유전자로서의 작용을 갖는 것으로 나타났다. 또한, WT1 유래의 펩티드로 HLA-A*0201 양성 또는 HLA-A*2402 양성의 말초혈 단핵구를 생체외(in vitro)에서 자극함으로써, 펩티드 특이적인 세포 상해성 T 세포 (CTL) 가 유도되어, 이들의 CTL 은 내인성에 WT1 을 발현하는 백혈병이나 고형 암의 암 세포를 상해하는 것으로 나타났다. 이들의 결과를 통해, WT1 은 암 면역 요법의 유망한 표적 분자인 것으로 나타났다 (Int. J. Hematol 76: 127, 2002).
항원 펩티드 특이적인 CTL 을 생체외에서 정량하는 방법으로서는 HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법 (Science 274: 94, 1996), HLA 펜타머법, ELISPOT 법 (J. Immunol. Methods 110: 29, 1988), 실시간 RT-PCR 법 (J. Immunol. Methods 210: 195, 1997), 한계 희석법 (Br. J. Cancer 77: 1907, 1998) 등이 알려져 있다. HLA-테트라머는 HLAα 사슬과 β2 마이크로글로불린을 펩티드와 회합시킨 복합체 (HLA 모노머) 를 비오틴화하여, 형광 표지한 아비딘에 결합시킴으로써 4량체화하여 제작한다. HLA 테트라머로 펩티드 특이적 CTL 을 염색하고, 플로사이토미터로 해석함으로써 CTL 의 빈도를 측정할 수 있다. HLA 모노머법, HLA 다이머법 및 HLA 펜타머법도 동일한 원리에 기초하여 CTL 의 빈도를 측정할 수 있다.
백신에 의한 자극 전의 CTL 을 CTL 전구 세포 (precursor) 라고 칭하고 있다. 특정한 암 항원에 대한 CTL 전구 세포의 존재 빈도가 높으면, 암백신으로서 그 항원을 투여한 경우에 효율적으로 특이적인 CTL 이 유도되어, 암백신 요법에 의한 주효가 얻어지기 쉽다고 생각된다. 즉, 특정한 암 항원에 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도가 높은 환자를 백신 투여 전에 선택할 수 있다면, 그 암 항원을 사용한 보다 효과적인 치료를 수행할 수 있게 된다.
그러나, 멜라노마 환자의 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 사용한 HLA 테트라머에 의한 CTL 전구 세포의 빈도 측정에 대해서는 몇가지 보고가 되어 있는데, 암 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포의 빈도는 낮은 수치인 것으로 나타나 있다 (J. Immunother. 24: 66, 2001, Hum. Gene. Ther. 13: 569, 2002). 이러한 점에서, 항원에 대한 CTL 전구 세포의 존재 빈도는 일반적으로 낮다고 생각되고 있고, CTL 전구 세포의 존재 빈도를 지표로 하여 암백신의 적응 환자를 선택하는 것은 곤란하다고 생각되고 있었다.
본 발명의 목적은 WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 한, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 등을 제공하는 데에 있다.
본 발명자는 WT1 유래의 암 항원 펩티드를 사용하여 HLA 테트라머를 제작하고, 조혈기 악성 종양 및 폐암 환자의 백신 투여 전의 CTL 전구 세포의 빈도를 측정한 바, 놀랍게도, 건강인에 비하여, 종래에 없는 높은 빈도로 CTL 전구 세포 (WT1 특이적인 CTL 전구 세포) 가 존재하고 있는 것을 발견하였다. 이 점에서 암 항원 WT1 에 관해서는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 하여, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택이나 WT1 백신의 표적 분자의 동정을 행할 수 있음이 분명해졌다. 또한 상기한 바와 같이 각종 암 환자에 있어서 WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도가 높았다는 점에서, WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 하여, 암을 진단할 수 있음도 분명해졌다.
본 발명자는 나아가, WT1 특이적 CTL 전구 세포를 기능적으로 상세 분류한 바, CTL 전구 세포 중에서도, 특히 이펙터형 CTL 전구 세포 (이하, 간단히 이펙터 세포라고도 칭한다) 가 차지하는 비율이 높은 것을 발견하였다. 따라서 WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 존재 빈도를 지표로 하여, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택이나 암의 진단을 행할 수 있음도 분명해졌다.
또한 본 발명자는 WT1 유래의 암 항원 펩티드에 의한 치료 실시중의 환자에 있어서의 WT1 특이적 CTL 의 빈도를 측정한 바, 펩티드 투여 전에 대한 펩티드 투여 후의 CTL 빈도의 증가와 치료 효과가 상관 관계에 있음을 발견하였다.
본 발명은 이상과 같은 지견에 기초하여 완성시키기에 이른 것이다.
즉 본 발명은
(1) 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법;
(2) WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법에 의해 측정하는, 상기 (1) 에 기재된 선택 방법;
(3) HLA 테트라머법에 의해 측정하는, 상기 (2) 에 기재된 선택 방법;
(4) 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머와, 상기 (a)의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는, 상기 (3) 에 기재된 선택 방법;
(5) 상기 (4) 에 기재된 공정 (c) 가, CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성의 CTL 전구 세포 중에서의 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정함으로써 행해지는, 상기 (4) 에 기재된 선택 방법;
(6) HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (4) 또는 (5) 에 기재된 선택 방법;
(7) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는 상기 (4)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 선택 방법;
(8) 플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 상기 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 선택 방법;
(9) WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양이, 건강인의 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 것을 지표로 하여 WT1 백신 응답성을 판단하는, 상기 (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 선택 방법;
(10) CTL 전구 세포가 이펙터형 CTL 전구 세포인, 상기 (1) 에 기재된 선택 방법;
(l1) WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양의 측정에, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법을 이용하는, 상기 (10) 에 기재된 선택 방법;
(12) HLA 테트라머법을 이용하는, 상기 (11) 에 기재된 선택 방법;
(13) 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 항CD45RA 항체 및 항CD27 항체와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성이고, 또한 HLA 테트라머 결합 양성의 CTL 전구 세포 중에서의, CD45RA 양성 또한 CD27 음성의 이펙트형 CTL 전구 세포의 비율을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는, 상기 (12) 에 기재된 선택 방법;
(14) HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (13)에 기재된 선택 방법;
(15) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (13) 또는 (14) 에 기재된 선택 방법;
(16) 플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 상기 (10)∼(15) 중 어느 하나에 기재된 선택 방법;
(17) 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, 암의 이환을 판단하는 공정,
을 포함하는, 암의 진단 방법;
(18) WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법에 의해 측정하는, 상기 (17) 에 기재된 진단 방법;
(19) HLA 테트라머법에 의해 측정하는, 상기 (18) 에 기재된 진단 방법;
(20) 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, 암의 이환을 판단하는 공정,
을 포함하는, 상기 (19) 에 기재된 진단 방법;
(21) 상기 (20) 에 기재된 공정 (c) 가, CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성의 CTL 전구 세포 중에서의 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정함으로써 행해지는, 상기 (20) 에 기재된 진단 방법;
(22) HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (20) 또는 (21) 에 기재된 진단 방법;
(23) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (20)∼(22) 중 어느 하나에 기재된 진단 방법;
(24) 플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 상기 (17)∼(23) 중 어느 하나에 기재된 진단 방법;
(25) WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양이, 건강인의 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 것을 지표로 하여 암의 이환을 판단하는 상기 (17)∼(24) 중 어느 하나에 기재된 진단 방법;
(26) CTL 전구 세포가 이펙터형 CTL 전구 세포인, 상기 (17) 에 기재된 진단 방법;
(27) WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양의 측정에, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법을 이용하는, 상기 (26) 에 기재된 진단 방법;
(28) HLA 테트라머법을 이용하는, 상기 (27) 에 기재된 진단 방법;
(29) 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 항CD45RA 항체 및 항CD27 항체와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성이고, 또한 HLA 테트라머 결합 양성의 CTL 전구 세포 중에서의, CD45RA 양성 또한 CD27 음성의 이펙터형 CTL 전구 세포의 비율을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, 암의 이환을 판단하는 공정,
을 포함하는, 상기 (8) 에 기재된 진단 방법;
(30) HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (29) 에 기재된 진단 방법;
(31) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (29) 또는 (30) 에 기재된 진단 방법;
(32) 플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 상기 (26)∼(31) 중 어느 하나에 기재된 진단 방법;
(33) 이하의 공정 (a)-(d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료에 복수의 WT1 백신의 표적 분자를 각각 적용하고,
(c) 상기 (b) 의 생체 시료 중 각각에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하여, 각각 비교하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과에 기초하여, 그 환자에게 유효한 WT1 백신의 표적 분자를 동정하는 공정,
을 포함하는, 환자 고유의 WT1 백신 표적 분자의 동정 방법;
(34) WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법에 의해 측정하는, 상기 (33) 에 기재된 동정 방법;
(35) HLA 테트라머법에 의해 측정하는, 상기 (34) 에 기재된 동정 방법;
(36) 이하의 공정 (a)-(d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 복수의 암 항원 펩티드를 함유하는 복수의 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 각각 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 각각 측정하여, 비교하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과에 기초하여, 그 환자에게 유효한 WT1 유래의 암 항원 펩티드를 동정하는 공정,
을 포함하는, 상기 (35) 에 기재된 동정 방법;
(37) 상기 (36) 에 기재된 공정 (c) 가, CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성의 CTL 전구 세포 중에서의 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정함으로써 행해지는, 상기 (36) 에 기재된 동정 방법;
(38) HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (36) 또는 (37) 에 기재된 동정 방법;
(39) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (36)∼(38) 중 어느 하나에 기재된 동정 방법;
(40) 플로사이토메트리에 의해 행해지는 상기 (33)∼(39) 중 어느 하나에 기재된 동정 방법;
(41) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머를 성분으로 하는, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택을 위한 임상 검사약;
(42) HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (41) 에 기재된 임상 검사약;
(43) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (41) 또는 (42) 에 기재된 임상 검사약;
(44) 상기 (41)∼(43) 중 어느 하나에 기재된 임상 검사약을 함유하는 키트;
(45) 상기 (33)∼(40) 중 어느 하나에 기재된 환자 고유의 WT1 백신 표적 분자의 동정 방법에 의해 동정된 표적 분자를 함유하는, 환자 고유의 암을 처치하기 위한 당해 환자용의 의약 조성물;
(46) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머를 성분으로 하는, 암의 진단약;
(47) HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (46) 에 기재된 진단약;
(48) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (46) 또는 (47) 에 기재된 진단약;
(49) 상기 (46)∼(48) 중 어느 하나에 기재된 진단약을 함유하는 키트;
(50) 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 을 포함하는 생체 시료를 WT1 백신 투여 후의 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 WT1 백신 투여 전의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신에 의한 치료의 적합성을 판단하는 공정,
을 포함하는, 그 환자에 있어서의 그 WT1 백신의 적합성을 판정하는 방법;
(51) WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법에 의해 측정하는, 상기 (50) 에 기재된 판정 방법;
(52) HLA 테트라머법에 의해 측정하는, 상기 (51) 에 기재된 판정 방법;
(53) 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 을 포함하는 생체 시료를 WT1 백신 투여 후의 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과와 WT1 백신 투여 전의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신에 의한 치료의 적합성을 판단하는 공정,
을 포함하는, 상기 (52) 에 기재된 판정 방법;
(54) 상기 (53) 에 기재된 공정 (c) 가, CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성의 CTL 중에서의 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정함으로써 행해지는, 상기 (53) 에 기재된 판정 방법;
(55) HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (53) 또는 (54) 에 기재된 판정 방법;
(56) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (53)∼(55) 중 어느 하나에 기재된 판정 방법;
(57) 플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 상기 (50)∼(56) 중 어느 하나에 기재된 판정 방법;
(58) WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양이, WT1 백신 투여 전의 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 것을 지표로 하여 WT1 백신에 의한 치료가 적합한지 여부를 판단하는, 상기 (50)∼(57) 중 어느 하나에 기재된 판정 방법;
(59) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머를 성분으로 하는, WT1 백신의 적합성의 판정을 위한 임상 검사약;
(60) HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 상기 (59) 에 기재된 임상 검사약;
(61) WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 상기 (59) 또는 (60) 에 기재된 임상 검사약; 그리고
(62) 상기 (59)∼(61) 중 어느 하나에 기재된 임상 검사약을 함유하는 키트, 에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(63) 상기 (1) 에 관련되어, 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정에 의해, WT1 백신 응답성이 높은 환자를 선택하고, 그 선택된 환자를 WT1 또는 WT1 유래의 암 항원 펩티드에 의해 처치하는, 그 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법, 및 상기 (2)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 선택 방법에 의해 선택된 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법;
(64) 상기 (33) 에 관련되어, 이하의 공정 (a)-(d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료에 복수의 WT1 백신의 표적 분자를 각각 적용하고,
(c) 상기 (b) 의 생체 시료 중 각각에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하여, 각각 비교하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과에 기초하여, 그 환자에게 유효한 WT1 백신의 표적 분자를 동정하는 공정,
을 포함하는, 환자 고유의 WT1 백신 표적 분자의 동정 방법에 의해 동정된 표적 분자를 투여하는, 당해 환자 고유의 암을 처치하는 방법, 및 상기 (34)∼(40) 중 어느 하나에 기재된 환자 고유의 WT1 백신 표적 분자의 동정 방법에 의해 동정된 표적 분자를 투여하는, 당해 환자 고유의 암을 처치하는 방법;
(65) 상기 (50) 에 관련되어, 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 을 포함하는 생체 시료를 WT1 백신 투여 후의 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 WT1 백신 투여 전의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신에 의한 치료의 적합성을 판단하는 공정,
을 포함하는, 그 환자에 있어서의 그 WT1 백신의 적합성을 판정하는 방법에 의해 적합성 있음으로 판정된 환자를, WT1 또는 WT1 유래의 암 항원 펩티드에 의해 처치하는, 그 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법, 및 상기 (51)∼(58) 중 어느 하나에 기재된 판정 방법에 의해, 적합성 있음으로 판정된 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법;
에 관한 것이다.
도 1 은 암 환자와 건강인에 있어서의 WT1 특이적 CTL 전구 세포의 존재 빈도를 나타내는 그래프이다. 도면 중, 세로축은 CTL 전구체 (전구 세포) 의 빈도를 나타낸다. 또한 도면 중, 혈액암은 HLA-A2402 양성의 조혈기 악성 종양 환자의 결과를, 폐암은 HLA-A2402 양성의 폐암 환자의 결과를, 건강인은 HLA-A2402 양성의 건강인의 결과를 각각 나타낸다.
본 발명은 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법, 및 그 방법에 의해 선택된 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서는 백신 투여 전의 암 환자에 있어서, 종래에 없는 높은 빈도로 WT1 특이적인 CTL 전구 세포가 존재하고 있음을 발견하였다. 따라서 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 양이나 빈도를 지표로 하여, WT1 백신 응답성이 높은 환자를 선택할 수 있다.
공정 (a) 에 있어서의 피험 환자란, 암이 의심되는 환자, 또는 암 환자를 가리킨다. 구체적으로는 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 혈액성의 암이나, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암 등의 고형 암이 의심되는 환자, 또는 이들의 암에 이환된 환자가 예시된다. 바람직하게는 백혈병, 골수 이형성 증후군 및 폐암이 의심되는 환자, 또는 이들의 암에 이환된 환자를 들 수 있다.
공정 (a) 에 있어서 피험자로부터 단리되는 생체 시료는 CTL 전구 세포를 포함하는 한 특별히 제한되지 않고, 혈액, 림프액 또는 이들의 배양물, 혈액으로부터 단리된 말초혈 단핵구 (PBMC), 또는 T 세포가 침윤된 조직 등이 예시된다. 생체 시료는 그대로 사용할 수도 있고, 희석 또는 농축시켜 사용할 수도 있다. 바람직하게는 PBMC 가 사용되고, 당해 PBMC 는 통상의 Ficoll-Hypaque 의 밀도 구배 원심법 등에 의해 단리할 수 있다.
공정 (b) 에 있어서 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 수법은 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정할 수 있는 종래 공지된 어떠한 수법을 이용해도 된다. 구체적으로는 예를 들어 HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 또는 한계 희석법 등을 이용할 수 있다.
여기서 HLA 테트라머법이란, HLA 항원 α사슬과 β2 마이크로글로불린을 목적 항원 펩티드와 회합시킨 복합체 (HLA 모노머) 를 비오틴화하고, 형광 표지된 아비딘에 결합시킴으로써 4량체화하여 제작한 HLA 테트라머를 사용하여, 항원 펩티드 특이적 CTL 을 검출하는 방법이다. 구체적으로는 당해 HLA 테트라머로 항원 펩티드 특이적인 CTL 을 염색하여, 플로사이토미터로 해석함으로써 당해 CTL 을 정량할 수 있다. 이러한 HLA 테트라머의 제조 방법 및 그것을 사용한 CTL 의 검출 방법은 공지이고, 예를 들어 문헌 (Science 274: 94, 1996) 에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
HLA 모노머법이란 상기 HLA 테트라머의 제조에 있어서 사용되는 HLA 모노머 (HLA 항원 α사슬, β2 마이크로글로불린, 항원 펩티드의 회합체를 비오틴화한 것) 를 사용하여 항원 펩티드 특이적 CTL 을 검출하는 방법이다.
HLA 다이머법이란 HLA 항원 α사슬과 Ig (이뮤노글로불린, 예를 들어 IgG1)를 융합시켜, 이것에 β2 마이크로글로불린, 항원 펩티드를 결합시킨 HLA 다이머를 사용하여, 항원 펩티드 특이적 CTL 을 검출하는 방법이다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6671-6675 (1993)). HLA 다이머에 결합한 항원 펩티드 특이적 CTL 은 예를 들어 표지 항IgG1 항체를 IgG1 에 결합시키는 것 등에 의해 검출할 수 있다.
HLA 펜타머법이란 최근 개발된 수법이고, HLA 항원과 항원 펩티드의 복합체 5분자가 Coiled-Coil 도메인을 통해 중합된 5량체에 의해, 항원 펩티드 특이적 CTL 을 검출하는 방법이다. HLA 항원-항원 펩티드의 복합체를 형광 색소 등으로 표지할 수 있기 때문에, HLA 테트라머법과 마찬가지로 플로사이토미터 등으로 해석할 수 있다 (http://www.proimmune.co.uk/ 참조).
이상 언급한 HLA 모노머, 다이머, 테트라머 및 펜타머는 모두 수탁 합성가능하고, 예를 들어 ProImmune 사 또는 BD Biosciences 사 등에 위탁함으로써 합성할 수 있다.
엘리스폿법이란, 활성화 CTL 이 생성하는 IFN-γ, GM-CSF 등의 사이토카인에 대한 항체를 플레이트 상에 고상화하고, 목적 항원 또는 목적 항원 펩티드로 자극한 생체 시료를 플레이트에 첨가하고, 상기 고상화 항체에 결합된 생체 시료 중의 활성화 CTL 이 분비한 사이토카인을 항사이토카인 항체로 스폿으로서 검출함으로써, 생체 시료 중의 CTL 을 검출하는 방법이다. 당해 엘리스폿법을 이용한 CTL 의 정량법은 공지이고, 예를 들어 문헌 (J. Immunol. Methods 110: 29, 1988) 에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
실시간 RT-PCR 법이란, 활성화 CTL 이 생성하는 IFN-γ, GM-CSF 등의 사이토카인의 유전자량을 RT-PCR 에 의해 측정함으로써, 간접적으로, 목적 항원 또는 목적 항원 펩티드 반응성의 CTL 빈도를 측정하는 방법이다. 당해 실시간 RT-PCR 법을 이용한 CTL 의 정량법은 공지이고, 예를 들어 문헌 (J. Immunol. Methods 210: 195, 1997) 에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
한계 희석법이란, CTL 을 포함하는 생체 시료를 세포 밀도를 바꿔 플레이트에 파종하고, 목적 항원 또는 목적 항원 펩티드로 자극하면서 배양하여, 활성화 CTL 이 생성하는 사이토카인량이나 세포 상해성을 측정하여, 양성 웰수로부터 CTL 빈도를 측정하는 방법이다. 당해 한계 희석법을 이용한 CTL 의 정량법은 공지이고, 예를 들어 문헌 (Br. J. Cancer 77: 1907,1998) 에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
이상과 같은 공지된 CTL 정량법을 이용함으로써, WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정할 수 있다.
공정 (c) 에 있어서의 WT1 백신 응답성의 판단은 공정 (b) 에서 얻어진 피험 환자에 있어서의 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양 (이하 피험 환자 수치라고 함) 을, 건강인의 그것 (건강인 수치) 과 비교하여, 양자의 차이를 판정함으로써 행할 수 있다. 이 경우, 건강인으로부터 단리·조제한 생체 시료 (혈액, 림프액, PBMC 등) 가 필요하지만, 이들은 암에 이환되어 있지 않은 사람의 생체 시료를 채취함으로써 취득할 수 있다. 또, 여기서 말하는 「건강인」 이란 암으로 진단되지 않은 사람을 말한다.
피험자 수치와 건강인 수치의 비교는 피험자의 생체 시료와 건강인의 생체 시료를 대상으로 한 측정을 병행하여 행함으로써 실시할 수 있다. 병행하여 실시하지 않는 경우에는 복수 (적어도 2개, 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 5 이상) 의 건강인의 생체 시료를 사용하여 균일한 측정 조건으로 측정하여 얻어진 건강인 수치의 평균치 또는 통계적 중간치를 비교에 이용할 수 있다.
피험 환자에 있어서 WT1 백신 응답성이 높은지 여부의 판단은 피험자 수치가 건강인 수치에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 많은 것을 지표로 하여 행할 수 있다. 즉, 피험자 수치가 건강인 수치에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 많으면, WT1 백신 응답성이 높은 것으로 판단한다. WT1 백신 응답성이 높은 것으로 판단된 환자는 WT1 백신이 적용가능, 즉 WT1 백신에 의한 치료를 양호하게 적용할 수 있는 것으로 판단된다.
상기 CTL 의 측정법 중, 수법의 용이함 및 정밀도의 관점에서 가장 바람직한 것은 HLA 테트라머법이다. 즉 바람직한 형태로서, 본 발명은 HLA 테트라머법을 이용하는 것을 특징으로 하는 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 및 처치 방법을 제공한다. 또 전술한 바와 같이, HLA 모노머법, HLA 다이머법 및 HLA 펜타머법도 원리적으로는 HLA 테트라머법과 동일한 수법이고, 바람직한 CTL 의 측정법이지만, 여기서는 HLA 테트라머법을 예로 들어 설명한다.
당해 HLA 테트라머를 사용한 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 및 처치 방법은 구책적으로는 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는 것이다.
여기서 공정 (a) 에 있어서의 「생체 시료」 및 「피험 환자」 는 상기한 바와 같다.
공정 (b) 에 있어서 사용되는 「HLA 테트라머」 란, HLA 항원의 α사슬과 β2 마이크로글로불린을 펩티드 (항원 펩티드) 와 회합시킨 복합체 (HLA 모노머) 를 비오틴화하여, 아비딘에 결합시킴으로써 4량체화한 것을 가리킨다 (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 (1996)). 당해 HLA 테트라머는 플로사이토메트리, 형광 현미경 등의 공지된 검출 수단에 의해 결합된 CTL 전구 세포를 용이하게 선별 또는 검출할 수 있도록, 형광 표지되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들어 피코에리트린 (PE), 플루오레세인이소시아네이트 (FITC), 페리디닌클로로필프로틴 (PerCP), 알로피코시아닌 (APC), 피코에리트린-텍사스레드 (ECD 라고도 칭한다), 피코에리트린-시아닌 5.1 (PC5 라고도 칭한다) 등에 의해 표지된 HLA 테트라머를 들 수 있다.
상기 HLA 테트라머의 성분으로서 사용되는 WT1 유래의 암 항원 펩티드는 인간 WT1 (Cell, 60: 509, 1990, NCBI 데이터 베이스 Accession No. XP_034418, 서열 번호: 1) 에 유래하여, HLA 항원과 복합체를 형성하여 HLA 구속성의 세포 상해성 T 세포 (CTL) 의 유도 활성 (면역원성) 을 갖는 것이다.
HLA 분자에는 많은 서브 타입이 존재하고, 결합할 수 있는 암 항원 펩티드의 아미노산 서열에는 각각의 타입에 관해서 규칙성 (결합 모티브) 이 존재하는 것으로 알려져 있다 (Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol., 155: p4749, 1995). 예를 들어 HLA-A24 의 경우, 8∼11 아미노산으로 이루어지는 펩티드 중의 제2위의 아미노산이 티로신 (Tyr), 페닐알라닌 (Phe), 메티오닌 (Met) 또는 트립토판 (Trp) 이고, C 말단의 아미노산이 페닐알라닌 (Phe), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile), 트립토판 (Trp) 또는 메티오닌 (Met) 이 되는 것으로 알려져 있다 (J. Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol., 155, p4307,1994).
또한 HLA-A2 의 모티브에 관해서는 이하의 표 1 에 나타낸 모티브가 알려져 있다 (Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol., 155: p4749, 1995).
HLA-A2 의 타입 N 말단으로부터 2번째의 아미노산 C 말단의 아미노산
HLA-A0201
HLA-A0204
HLA-A0205
HLA-A0206
HLA-A0207		 L, M
L
V, L, I, M
V, Q
L		 V, L
L
L
V, L
L
(펩티드의 길이는 8∼11 아미노산)
또한 최근, HLA 항원에 결합가능하다고 예상되는 펩티드 서열을, 인터넷상, NIH 의 BIMAS 의 소프트를 사용함으로써 검색할 수 있다 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). 또한 BIMAS HLA peptide binding prediction analysis (J. Immunol., 152, 163, 1994) 를 사용하여 검색할 수 있다. 이렇게 하여 검색·동정된 WT1 유래 펩티드의 구체예로서는 예를 들어 국제공개 제2000/18795호 팜플렛의 Table II∼Table XLVI 에 열거된 펩티드를 들 수 있다.
이상과 같은 WT1 유래의 펩티드는 그 아미노산 잔기의 일부에 개변 (치환, 결실, 및/또는 부가 (펩티드의 N 말단, C 말단에 대한 아미노산의 부가도 포함)) 을 갖고 있어도 되고, 바람직하게는 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있다. 당해 치환은 상기 모티브상 취할 수 있는 아미노산 잔기로의 치환이 바람직하다.
이상과 같은 WT1 유래의 펩티드 (개변체도 포함) 를, 공지된 암 항원 펩티드의 분석법 (예를 들어 WO 02/47474호, Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002) 등 참조) 에 제공함으로써, WT1 유래의 암 항원 펩티드를 선택할 수 있다.
WT1 유래의 암 항원 펩티드의 구체예로서는 예를 들어 이하의 펩티드가 예시된다:
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2)
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3)
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4)
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5)
Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 6)
Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 7)
Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 8)
Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 9)
Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 10)
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 11)
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호: 12)
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호: 13)
Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호: 14)
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호: 15)
Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 16)
Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 17)
Arg Tyr Pro Ser Abu Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 18)
(여기서 Abu 는α-아미노부티르산이다)
이 중 서열 번호: 2 및 서열 번호: 4 에 기재된 펩티드는 HLA-A24 항원 및 HLA-A2 항원에 결합성인 펩티드이고, 또한 그 이외의 펩티드 (서열 번호: 3, 5, 6∼18) 는 HLA-A24 항원에 결합성인 펩티드이다.
바람직하게는 상기 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4 및 서열 번호 25 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다.
상기 펩티드는 1개의 HLA 테트라머 중에 2종 이상 함유되어 있어도 된다.
상기 펩티드는 통상의 펩티드 화학에 있어서 사용되는 방법에 준하여 합성할 수 있다. 합성 방법으로서는 문헌 (펩티타이드·신서시스 (Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966; 더 프로틴즈 (The Proteins), Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드 합성, 마루젠 (주), 1975; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠 (주), 1985; 의약품의 개발 속 제14권·펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
상기 펩티드는 그 N 말단 아미노산의 아미노기 또는 C 말단 아미노산의 카르복실기를 수식한 펩티드이어도 된다.
여기서 N 말단 아미노산의 아미노기의 수식기로서는, 예를 들어 1∼3개의 탄소수 1 내지 6 의 알킬기, 페닐기, 시클로알킬기, 아실기를 들 수 있고, 구체적으로는 탄소수 1 내지 6 의 알카노일기, 페닐기로 치환된 탄소수 1 내지 6 의 알카노일기, 탄소수 5 내지 7 의 시클로알킬기로 치환된 카르보닐기, 탄소수 1 내지 6 의 알킬술포닐기, 페닐술포닐기, 탄소수 2 내지 6 의 알콕시카르보닐기, 페닐기로 치환된 알콕시카르보닐기, 탄소수 5 내지 7 의 시클로알콕시로 치환된 카르보닐기, 페녹시카르보닐기 등을 들 수 있다.
C 말단 아미노산의 카르복실기의 수식기로서는 예를 들어 에스테르기 및 아미드기를 들 수 있고, 에스테르기의 구체예로서는 탄소수 1 내지 6 의 알킬에스테르기, 페닐기로 치환된 탄소수 0 내지 6 의 알킬에스테르기, 탄소수 5 내지 7 의 시클로알킬에스테르기 등을 들 수 있고, 아미드기의 구체예로서는 아미드기, 탄소수 1 내지 6 의 알킬기 1개 또는 2개로 치환된 아미드기, 페닐기로 치환된 탄소수 0 내지 6 의 알킬기 1개 또는 2개로 치환된 아미드기, 아미드기의 질소원자를 포함하고 5 내지 7원환의 아자시클로알칸을 형성하는 아미드기 등을 들 수 있다.
HLA 테트라머의 성분인 HLA 항원 (HLA 항원의 α사슬) 은 어떠한 서브 타입의 HLA 항원이더라도 사용할 수 있지만, 진단 또는 선택 대상의 서브 타입과 같은 서브 타입을 사용할 필요가 있다. HLA 항원으로서는 예를 들어 HLA-A*2402 등의 HLA-A24 항원, HAL-A*0201, -A*0204, -A*0205, -A*0206 등의 HLA-A2 항원, HLA-A*2601 등의 HLA-A26 항원, 또한 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-A*1101 등을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들어 HLA-A24 항원, HLA-A2 항원 또는 HLA-A26 항원을 들 수 있다. 이들 HLA 항원의 염기 서열 및 아미노산 서열은 공지이고, 예를 들어 HLA-A24 항원에 관해서는 Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995) 및 Genbank Accession No. M64740 에 개시되어 있다. 또한 HLA-A2 항원에 관해서는 Genbank Accession No. M84379 에 개시되어 있다. 또한 HLA-A26 항원에 관해서는 Genbank Accession No. D14350 에 개시되어 있다. 따라서 이들 공지된 염기 서열의 정보에 기초하여, PCR 법 등의 통상적인 방법에 의해, 용이하게 HLA 항원의 α사슬을 클로닝할 수 있다.
당해 HLA 항원의 α사슬은 CTL 의 결합성이나 선별성을 쉽게 하기 위해서 가용성 단편인 것이 바람직하다. 또한, 비오틴-아비딘 결합에 의해 4량체화하기 위해서, 당해 HLA 항원 α사슬의 C 말단은 비오틴화가능한 구조를 갖고 있는 것, 즉 비오틴 결합 부위가 부가되어 있는 것이 바람직하다.
구체적으로는 예를 들어 HLA-A2402 (HLA-A24 의 1종) 의 경우에는 정방향 프라이머: 5'-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3' (서열 번호: 19) 및 역방향 프라이머: 5'-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3' (서열 번호: 20) 를 사용하고, HLA-A*2402 (GenBank Acc. No. M64740) 발현 플라스미드를 주형으로 하여, PCR 반응을 행함으로써, C 말단 태그 중의 특이적 리신 잔기를 BirA 효소로 비오티닐화가능하도록 설계된 재조합 가용성 HLA-A*2402α사슬의 cDNA 를 얻을 수 있다.
HLA 테트라머의 성분인 β2 마이크로글로불린은 인간 유래의 β2 마이크로글로불린이 바람직하다. 당해 인간 유래의 β2 마이크로글로불린의 cDNA 는 정방향 프라이머: 5'-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3' (서열 번호: 21) 및 역방향 프라이머: 5'-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3' (서열 번호: 22) 를 사용하고, 인간 β2 마이크로글로불린 (GenBank Acc. No. AB021288) 발현 플라스미드를 주형으로 하여, PCR 반응을 행하는 것 등에 의해 얻을 수 있다.
HLA 테트라머의 성분인 아비딘은 종래 공지된 어떠한 아비딘이더라도 사용할 수 있지만, 플로사이토메트리나 형광 현미경 등에 의한 검출을 쉽게 하기 위해서, 형광 표지되어 있는 것이 바람직하다. 형광 색소는 공지된 것을 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들어 피코에리트린 (PE), 플루오레세인이소시아네이트 (FITC), 페리디닌클로로필프로틴 (PerCP), 알로피코시아닌 (APC), 피코에리트린-텍사스레드 (ECD 라고도 칭한다), 피코에리트린-시아닌 5.1 (PC5 라고도 칭한다) 등을 들 수 있다.
이상의 HLA 테트라머의 성분을 함유하는 HLA 테트라머의 제작법에 관해서는 문헌 (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 (1996) 등) 에 의해 주지이지만, 간단히 기술하면 이하와 같이 된다.
우선 단백질을 발현가능한 대장균이나 포유 동물 세포에, HLAα사슬 발현 벡터 및 β2 마이크로글로불린 발현 벡터를 도입하여 발현시킨다. 여기서는 대장균 (예를 들어 BL21) 을 사용하는 것이 바람직하다. 얻어진 단량체 HLA 복합체와 항원 펩티드 (WT1 유래의 암항원 펩티드) 를 혼합하여, 가용성의 HLA-펩티드 복합체를 형성시킨다. 다음으로 HLA-펩티드 복합체에 있어서의 HLAα사슬의 C 말단 부위의 서열을 BirA 효소에 의해 비오틴화한다. 이 비오틴화된 HLA-펩티드 복합체와 형광 표지된 아비딘을 4:1 의 몰비로 혼합함으로써, HLA 테트라머를 조제할 수 있다. 또, 상기 각 단계에 있어서, 겔여과 등에 의한 단백 정제를 행하는 것이 바람직하다.
상기 공정 (b) 는 이상과 같이 하여 제작된 HLA 테트라머와, 생체 시료 (피험 환자로부터 단리된 CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료) 를 접촉시킴으로써 행해진다. 당해 접촉은 37℃ 에서 행하는 것이 바람직하다. 또한 접촉은 통상의 생리적 완충액, 예를 들어 혈청을 포함하는 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 중에서 행하는 것이 바람직하다.
또, HLA 테트라머 대신에 형광 표지한 스트렙토아비딘을 첨가하여 동일한 처리를 한 음성 대조도, 더불어 제작해 두는 것이 바람직하다.
공정 (b) 후, HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정한다 (공정 c). 당해 측정은 종래 공지된 어떠한 수법을 이용하여 행해도 된다. HLA 테트라머가 형광 표지되어 있는 경우, 이 HLA 테트라머에 결합한 CTL 전구 세포는 형광 표지되어 있게 되므로, 플로사이토미터, 형광 현미경 등을 사용하여 표지된 CTL 을 검출 또는 단리할 수 있다.
HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도는 예를 들어, CD8 양성 세포 (CD8 양성의 CTL 전구 세포), 또는 CD8/CD3 양성 세포 (CD8/CD3 양성의 CTL 전구 세포) 에 대한 상기 HLA 테트라머 결합 세포의 비율 (빈도) 을 측정함으로써 구할 수 있다.
여기서 CD8 양성 세포는 예를 들어 형광 표지한 마우스 항인간 CD8 모노클로날 항체를 사용하여 표지·검출할 수 있다. 또한 CD3 양성 세포는 형광 표지한 마우스 항인간 CD3 모노클로날 항체를 사용하여 표지·검출할 수 있다.
여기서 사용하는 형광 색소는 HLA 테트라머에 있어서 사용되는 형광 색소와 다른 것을 사용할 필요가 있다. 즉, PE 표지한 HLA 테트라머를 사용하는 경우에는 FITC 표지한 마우스 항인간 CD8 모노클로날 항체, 및 PerCP 표지한 마우스 항인간 CD3 모노클로날 항체를 사용한다는 바와 같이, 형광 색소를 구별할 필요가 있다.
구체적인 조작은 CD8 양성 세포에 대한 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정하는 경우에는 예를 들어 PE 표지 HLA 테트라머와 생체 시료를 접촉시킨 후, FITC 표지 마우스 항인간 CD8 모노클로날 항체를 추가로 첨가하여 반응시켜, 염색된 세포를 플로사이토미터나 형광 현미경으로 해석한다. CD8 양성 세포 (CD8+) 를 선택하여, 그 중의 테트라머 양성 세포 (CD8+ tetramer+) 의 비율로부터 음성 대조의 아비딘 양성 세포 (CD8+ avidin+) 의 비율을 뺀 수치를, WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포의 비율로 할 수 있다 (이하):
WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포(%)=[(CD8+ tetramer+ 세포수/CD8+ 세포수)-(CD8+ avidin+ 세포수/CD8+ 세포수)]×100.
또한, CD3 양성· CD8 양성 세포에 대한 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정하는 경우에는 예를 들어 PE 표지 HLA 테트라머와 생체 시료를 접촉시킨 후, FITC 표지 마우스 항인간 CD8 모노클로날 항체 및 PerCP 표지 마우스 항인간 CD3 항체를 추가로 첨가하여 반응시켜, 염색된 세포를 플로사이토미터나 형광 현미경으로 해석한다. CD3 양성 및 CD8 양성 세포 (CD3+ CD8+) 를 선택하여, 그 중의 테트라머 양성 세포 (CD3+ CD8+ tetramer+) 의 비율로부터 음성 대조의 아비딘 양성 세포 (CD3+ CD8+ avidin+) 의 비율을 뺀 수치를, WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포의 비율로 할 수 있다 (이하):
WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포(%)=[(CD3+ CD8+ tetramer+ 세포수/CD3+ CD8+ 세포수)-(CD3+ CD8+ avidin+ 세포수/CD3+ CD8+ 세포수)]×100.
이상의 측정 결과에 기초하여, WT1 백신 응답성을 판단한다. 구체적으로는 공정 (b) 에서 얻어진 피험 환자에 있어서의 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양 (이하 피험 환자 수치라고 함) 을, 건강인의 그것 (건강인 수치) 과 비교하여, 양자의 차이를 판정함으로써 행할 수 있다. 이 경우, 건강인으로부터 단리·조제한 생체 시료 (혈액, 림프액, PBMC 등) 가 필요하지만, 이들은 암에 이환되어 있지 있은 사람의 생체 시료를 채취함으로써 취득할 수 있다. 또, 여기서 말하는 「건강인」 이란 암으로 진단되지 않은 사람을 말한다.
피험자 수치와 건강인 수치의 비교는 피험자의 생체 시료와 건강인의 생체 시료를 대상으로 한 측정을 병행하여 행함으로써 실시할 수 있다. 병행하여 실시하지 않는 경우에는 복수 (적어도 2개, 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 5 이상) 의 건강인의 생체 시료를 사용하여 균일한 측정 조건으로 측정하여 얻어진 건강인 수치의 평균치 또는 통계적 중간치를 비교에 이용할 수 있다.
피험 환자에 있어서 WT1 백신 응답성이 높은지 여부의 판단은 피험자 수치가 건강인 수치에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 많은 것을 지표로 하여 행할 수 있다. 즉, 피험자 수치가 건강인 수치에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 많으면, WT1 백신 응답성이 높은 것으로 판단한다. WT1 백신 응답성이 높은 것으로 판단된 환자는 WT1 백신이 적용가능, 즉 WT1 백신에 의한 치료를 양호하게 적용할 수 있는 것으로 판단된다.
이상과 같은 본 발명의 환자의 선택 방법은 백신 투여 전의 환자의 진단 뿐만 아니라, 백신 치료 후의 진단이나 효능의 확인에도 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법, 및 그 방법에 의해 선택된 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서는 WT1 특이적 CTL 전구 세포를 기능적으로 상세 분류한 결과, 건강인에 비하여 특히 이펙터 세포가 차지하는 비율이 높은 것을 발견하였다. 따라서 WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 양이나 빈도 (비율) 를 지표로 하여, WT1 백신 응답성이 높은 환자를 선택할 수 있다. 당해 이펙터형 CTL 전구 세포를 지표로 한 선택 방법은 전술한 CTL 전구 세포 전체의 존재 빈도나 양을 지표로 한 선택 방법에 있어서 건강인과의 차이가 명확하지 않았던 경우 등에 있어서도, 더욱 상세한 해석 수법으로서 이용할 수 있다.
구체적으로는 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 항CD45RA 항체 및 항CD27 항체와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성이고, 또한 HLA 테트라머 결합 양성의 CTL 전구 세포 중에서의, CD45RA 양성 또한 CD27 음성의 이펙터형 CTL 전구 세포의 비율을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신 응답성을 판단하는 공정,
을 포함하는 선택 방법, 및 그 방법에 의해 선택된 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법이 예시된다.
여기서「이펙터 세포」 란 CD45RA 양성 또한 CD27 음성인 CTL 전구 세포를 가리킨다. 당해 이펙터 세포의 빈도는 CTL 전구 세포 중에서의 CD45RA 양성 또한 CD27 음성 세포의 비율을 측정함으로써 구할 수 있다. 구체적으로는 피험 샘플을 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 항CD45RA 항체 및 항CD27 항체와 접촉시켜, CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성이고, 또한 HLA 테트라머 양성의 CTL 전구 세포 (WT1 특이적 CTL 전구 세포) 중에서의 CD45RA 양성 또한 CD27 음성 세포의 비율을 측정함으로써 구할 수 있다.
여기서 CD45RA 양성 세포는 예를 들어 형광 표지한 마우스 항인간 CD45RA 모노클로날 항체를 사용하여 표지·검출할 수 있다. 또한 CD27 양성 세포는 예를 들어 형광 표지한 마우스 항인간 CD27 모노클로날 항체를 사용하여 표지·검출할 수 있다. 여기서 사용하는 형광 색소는 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 또는 항CD3 항체에 있어서 사용되고 있는 형광 색소와는 상이한 것을 사용할 필요가 있다. 구체적으로는 예를 들어 PE 표지한 HLA 테트라머, FITC 표지한 항CD8 모노클로날 항체, Per 표지한 항CD3 모노클로날 항체를 사용하는 경우에는, ECD 표지 마우스 항인간 CD45RA 모노클로날 항체 및 PC5 표지 마우스 항인간 CD27 모노클로날 항체를 사용한다고 하는 바와 같이, 형광 색소를 구별할 필요가 있다. 이들 표지 항체 등은 Beckman Coulter 등으로부터 구입할 수 있다.
당해 전구 세포의 구체적인 측정법 등에 관해서는 전술한 CTL 전구 세포의 존재 빈도나 양을 지표로 한 선택 방법과 동일하게 하여 행할 수 있다.
이상과 같은 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법은 또, 암의 진단에도 적용할 수 있다. 즉 본 발명에 있어서는 조혈기 악성 종양이나 폐암 환자 등의 환자에 있어서, 건강인에 비하여 WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도가 높은 것을 발견하였다. 따라서 WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도, 또는 WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 하여 암을 진단할 수 있다. 여기서 진단가능한 암으로서는 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수중, 악성 림프종 등의 혈액성의 암이나, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암 등의 고형 암을 들 수 있다. 바람직하게는 백혈병, 골수 이형성 증후군 및 폐암을 들 수 있다.
본 발명은 또, 이하의 공정 (a)- (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료에 복수의 WT1 백신의 표적 분자를 각각 적용하고,
(c) 상기 (b) 의 생체 시료 중 각각에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하여, 각각 비교하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과에 기초하여, 그 환자에게 유효한 WT1 백신의 표적 분자를 동정하는 공정,
을 포함하는, 환자 고유의 WT1 백신 표적 분자의 동정 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서는 백신 투여 전의 암 환자에 있어서, 종래에 없는 높은 빈도로 WT1 특이적인 CTL 전구 세포가 존재하고 있는 것을 발견하였다. 따라서 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 양이나 빈도를 지표로 하여, 환자 고유의 WT1 백신의 표적 분자 (치료용의 표적 분자) 의 동정을 행할 수 있다.
즉 상기 표적 분자의 동정 방법은 WT1 백신 응답성이 높은 것으로 판단된 환자에 대하여 치료상 최적의 표적 분자 (항원 펩티드) 를 동정하기 위해서, 유효하게 사용된다.
구체적으로는 상기 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법과 마찬가지로, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 또는 한계 희석법 등에 의해, WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정함으로써 행해진다. 바람직하게는 HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법이 이용된다. 이하 HLA 테트라머법을 예로 들어 구체적으로 설명한다.
HLA 테트라머법은 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 복수의 암 항원 펩티드를 함유하는 복수의 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 각각 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 각각 측정하여, 비교하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과에 기초하여, 그 환자에게 유효한 WT1 유래의 암 항원 펩티드를 동정하는 공정,
을 포함하여 행해진다.
구체적으로는 우선, 후보가 되는 WT1 유래 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머를 복수 제작한다. 그리고, 각각의 HLA 테트라머와 피험 환자로부터 단리한 생체 시료를 접촉시켜, HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정한다. 각 HLA 테트라머에 대한 측정 결과를 비교하여, 가장 높은 값을 나타낸 HLA 테트라머가 함유하는 암 항원 펩티드 (즉, 가장 CTL 에 인식되기 쉬운 암 항원 펩티드) 를, 그 환자에 대한 WT1 백신 치료를 위한 표적 분자, 즉 환자 고유의 표적 분자로서 동정한다.
여기서 사용하는 암 항원 펩티드는 WT1 에 유래하는 암 항원 펩티드이면 어떠한 것이나 되지만, 예를 들어 서열 번호: 2∼18 에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는 서열 번호: 2∼5 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다.
또, 각 공정의 구체적인 수법이나 성분의 조제법 등에 관해서는 전술한 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법의 항을 참조하기 바란다.
본 발명의 WT1 백신 표적 분자의 동정 방법에 의하면, 환자 고유의 암을 처치할 수 있는 표적 분자가 동정된다. 따라서, 본 발명은 별도의 태양으로서, 본 발명의 동정 방법에 의해 동정된 환자 고유의 WT1 백신 표적 분자를 함유하는, 환자 고유의 암을 처치하기 위한 당해 환자용의 의약 조성물, 및 그 동정 방법에 의해 동정된 표적 분자를 투여하는, 환자 고유의 암을 처치하는 방법을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물에는 암백신이 포함되고, 당업자에게 주지의 아쥬반트 등을 함유할 수 있다.
본 발명은 또, WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머를 성분으로 하는, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택을 위한 임상 검사약을 제공한다. 이하 HLA 테트라머를 예로 들어 본 발명의 임상 검사약에 관하여 설명한다.
본 발명의 임상 검사약의 성분이 되는 HLA 테트라머는 전술한 바와 같이 HLA 항원의 α사슬과 β2 마이크로글로불린을 WT1 유래의 암 항원 펩티드와 회합시킨 복합체 (HLA 모노머) 를 비오틴화하여, 아비딘에 결합시킴으로써 4량체화한 것을 가리킨다 (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 (1996)).
여기서 사용하는 암 항원 펩티드는 WT1 에 유래하는 암 항원 펩티드이면 어떠한 것을 사용해도 되지만, 예를 들어 서열 번호: 2∼18 에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는 서열 번호: 2∼5 중 어느 하나에 기재된 암 항원 펩티드를 들 수 있다.
당해 HLA 테트라머의 각 성분의 조제법이나 HLA 테트라머의 제작법에 관해서는 전술한 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법의 항에 기재한 바이다.
본 발명의 임상 검사약은 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택을 위한 키트의 1성분으로 할 수 있다. 당해 키트는 상기 본 발명의 임상 검사약만으로 이루어지는 키트이어도 되고, 또한 본 발명의 임상 검사약과 다른 성분을 함유하는 키트이어도 된다. 당해 키트 중의 다른 성분으로서는 형광 표지 스트렙토아비딘, 형광 표지 마우스 항인간 CD8 모노클로날 항체, 형광 표지 마우스 항인간 CD3 모노클로날 항체 등을 들 수 있다. 또한 이펙터 세포를 검출하는 경우에는 형광 표지 마우스 항인간 CD45RA 모노클로날 항체, 형광 표지 마우스 항인간 CD27 모노클로날 항체를 포함할 수도 있다.
여기서 형광 색소로서는 피코에리트린 (PE), 플루오레세인이소시아네이트 (FITC), 페리디닌클로로필프로틴 (PerCP), 알로피코시아닌 (APC), 피코에리트린-텍사스레드 (ECD 라고도 칭한다), 피코에리트린-시아닌 5.1 (PC5 라고도 칭한다) 등을 들 수 있다.
본 발명의 임상 검사약 및 키트는 WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택에 사용할 수 있는 것 외에, WT1 백신의 표적 분자 (치료용의 표적 분자) 의 선택에도 사용할 수 있다. 또한 동일한 성분으로 암의 진단약으로서 사용할 수도 있다.
본 발명 또한, 이하의 공정 (a)-(c):
(a) CTL 을 포함하는 생체 시료를 WT1 백신 투여 후의 환자로부터 단리하는 공정,
(b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(c) 상기 (b) 의 측정 결과를 WT1 백신 투여 전의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신에 의한 치료의 적합성을 판단하는 공정,
을 포함하는, 그 환자에 있어서의 그 WT1 백신의 적합성을 판정하는 방법, 및 그 판정 방법에 의해 적합성 있음으로 판정된 환자를, WT1 또는 WT1 유래의 암 항원 펩티드에 의해 처치하는, 그 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법을 제공한다.
후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, WT1 유래의 암 항원 펩티드 (WT1 백신) 에 의한 치료를 실시중인 환자에 있어서의 WT1 특이적 CTL 의 빈도를 측정한 바, 펩티드 투여 전에 대한 투여 후의 CTL 빈도의 증가와 치료 효과가 상관 관계에 있음을 발견하였다. 즉, WT1 펩티드 투여 후의 WT1 특이적 CTL 의 빈도가, 펩티드 투여 전의 CTL 빈도에 비하여 1.5배 이상 증가한 경우를 「면역 반응 양성」 이라고 정의하고, 이 면역 반응성과 치료 효과의 관련성에 관해서 평가하였다. 그 결과, 면역 반응성과 치료 효과 사이에는 정의 상관 관계가 관찰되었다. 이 결과로부터, 상기 면역 반응성 (CTL 의 빈도나 양의 증가) 을 지표로 하여, 대상 환자에 있어서 WT1 백신에 의한 치료가 적합한지 여부를 판단할 수 있음이 분명해졌다.
즉 본 발명의 판정 방법은, WT1 백신 투여를 실시중인 환자에 있어서, 펩티드 투여에 의한 치료를 속행할지의 여부와 같은 치료의 적합성을 판정하기 위해서, 유효하게 사용된다.
본 발명의 판정 방법에 있어서의 공정 (a) 및 (b) 의 구체적인 조작에 관해서는 상기 「WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법」 의 항에 기재된 바와 같고, 구체적으로는 HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 또는 한계 희석법 등에 의해, WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정함으로써 행해진다.
공정 (c) 에 있어서의 WT1 백신에 의한 치료가 적합한지 여부의 판단은 WT1 백신 투여 후의 환자에 있어서의 WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양 (이하, 투여 후 수치라고 함) 을, WT1 백신 투여 전의 그것 (이하, 투여 전 수치라고 함) 과 비교하여, 양자의 차이을 판정함으로써 행할 수 있다.
여기서 「백신 투여 후」 란 WT1 백신을 1회 이상 투여한 후의 어떤 타이밍이어도 되지만, 2주 간격에서의 펩티드 투여 스케줄의 경우, 1회째∼5회째의 WT1 백신 투여 후, 보다 바람직하게는 1회째∼3회째의 펩티드 투여 후의 타이밍을 들 수 있다.
WT1 백신에 의한 치료가 적합한지 여부의 판단은, WT1 백신 투여 후 수치가 투여 전 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 것을 지표로 하여 행할 수 있다. 즉, 투여 후 수치가 투여 전 수치에 비하여 1.5배 이상 높으면, WT1 백신에 의한 치료가 적합한 것으로 판단한다. 이 지견에 기초하여, 본 발명은 환자에 있어서의 그 WT1 백신의 적합성을 판정하는 본 발명 방법에 의해 적합성 있음으로 판정된 환자를, WT1 또는 WT1 유래의 암 항원 펩티드에 의해 처치하는, 그 환자에 있어서의 암을 처치하는 방법도 제공한다.
상기 CTL 의 측정법 중, 수법의 용이함 및 정밀도의 관점에서 가장 바람직한 것은 HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법이다. 이하 HLA 테트라머법을 예로 들어 설명한다.
HLA 테트라머법은 이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
(a) CTL 을 포함하는 생체 시료를 WT1 백신 투여 후의 환자로부터 단리하는 공정,
(b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
(c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
(d) 상기 (c) 의 측정 결과를 WT1 백신 투여 전의 그것과 비교하여 높은지 여부를 판정하여, WT1 백신에 의한 치료의 적합성을 판단하는 공정,
을 포함하여 행해진다.
여기서 HLA 테트라머의 성분으로 되는 HLA 항원으로서는 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원을 들 수 있다. 또한 HLA 테트라머의 성분으로 되는 암 항원 펩티드로서는, 예를 들어 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 또는 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 를 들 수 있다. 이들 서열 번호 2∼5 에 기재된 펩티드는 모두 HLA-A24 결합성의 펩티드이기 때문에, 상기 본 발명의 판정법에 있어서 사용되는 HLA 테트라머로서는 서열 번호: 2∼5 에 기재된 어느 하나의 펩티드와 HLA-A24 항원을 함유하는 HLA 테트라머를 들 수 있다. 또한 서열 번호: 2 및 4 에 기재된 펩티드는 HLA-A2 항원에 결합성인 펩티드이기도 하기 때문에, 서열 번호: 2 또는 4 에 기재된 펩티드와 HLA-A2 항원을 함유하는 HLA 테트라머도 들 수 있다.
상기 본 발명의 판정 방법 및 처치 방법에 있어서는 치료에 사용한 펩티드와 같은 펩티드, 또는 치료에 사용한 펩티드에 의해 유도되는 CTL 이 교차 반응성을 나타내는 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 환자의 치료에 있어서 서열 번호: 3 에 기재된 펩티드를 사용한 경우에는, 서열 번호: 2 또는 3 에 기재된 펩티드와 HLA-A24 항원을 함유하는 HLA 테트라머가 유효하게 사용된다.
본 발명의 HLA 테트라머를 사용한 판정 방법 및 처치 방법에 있어서의 공정 (a)∼(c) 의 구체적인 조작에 관해서는, 상기 「WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법」 의 항에 기재된 바와 같다. 또한 공정 (d) 에 관해서는 전술한 바와 같이 투여 전 수치와 투여 후 수치의 비교에 기초하여 판단된다.
이하, 본 발명의 판정 방법 및 처치 방법의 구체예를 나타낸다.
우선, WT1 유래의 암 항원 펩티드 투여 전의 암 환자로부터 혈액을 채취하여 PBMC 를 분리한다 (투여 전 시료). 다음으로, 펩티드 투여에 의한 치료를 실시한 환자의 혈액을 채취하여 PBMC 를 분리한다 (투여 후 시료). 이들 투여 전 시료, 투여 후 시료에 대하여 HLA 테트라머를 첨가하고, 상기 「WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법」의 항 및 실시예 3 에 기재된 해석 수법을 이용하여 펩티드 특이적 CTL 의 빈도를 측정·산출한다. 투여 전 시료에 있어서의 CTL 빈도에 비하여, 투여 후 시료에 있어서의 CTL 빈도가 1.5배 이상 높은 경우에, WT1 백신에 의한 치료가 적합하다 (WT1 백신에 의한 치료 효과가 높아질 것으로 기대된다) 고 판단한다.
본 발명은 또, WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 모노머, HAL 다이머, HAL 테트라머 또는 HLA 펜타머를 성분으로 하는, WT1 백신의 적합성의 판정을 위한 임상 검사약, 및 당해 임상 검사약을 함유하는 키트를 제공한다. 당해 임상 검사약 및 키트의 성분에 관해서는 상기 「WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택을 위한 임상 검사약」 의 항에 기술한 바와 같다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명이 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
말초혈 단핵구의 조제
HLA-A*2402 양성의 암 환자와 HLA-A*2402 양성의 건강인으로부터 인폼드 컨센트를 얻은 후, 채혈을 행하였다. 조혈기 악성 종양 환자는 18명이고, 그 내역은 급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 11명, 급성 림프성 백혈병 (ALL) 환자 2명, 만성 골수성 백혈병 (CML) 환자 1명, 골수 이형성 증후군 (MDS) 환자 4명이었다. 폐암 환자는 7명, HLA-A*2402 양성의 건강인은 10명이었다.
조혈기 악성 종양 환자는 진단시 또는 치료 경과에 있어서, 골수 및 말초혈 검체에 대해서 WT1 유전자의 유의한 고발현이 1회 이상 확인되었다. 또한 폐암 환자는 생체 검체 또는 적출 표본에서 WT1 유전자의 고발현이 확인되었다.
채취한 혈액으로부터 Ficoll-Hypaque 의 밀도 구배 원심법에 의해 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 분리하여, 액체 질소 속에서 동결 보존하였다.
실시예 2
HLA 테트라머의 조제
WT1 단백질의 235번째부터 243번째의 9아미노산으로 이루어지는 펩티드 (서열 번호: 2) 를 사용하고, 문헌 (Int. J. Cancer: 100, 565-570, 2002) 에 기재된 방법에 의해 형광 색소 Phycoerythrin (PE) 으로 표지한 HLA-A*2402 의 테트라머를 제작하였다.
우선, 재조합 가용성 HLA-A*2402 의 cDNA 를 증폭시키기 위해서, 하기 정방향 프라이머: 5'-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3' (서열 번호: 19) 및 역방향 프라이머: 5'-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3' (서열 번호: 20) 를 사용하고, HLA-*2402 (GenBank Acc. No. M64740) 발현 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 을 행하였다. 역방향 프라이머는 C 말단에서 프레임이 일치하 도록 BirA 인식 서열을 코드하고 있다. 증폭시킨 단편을 제한 효소 NcoI 및 BamH1 로 절단하여, pET11d 벡터 (Novagen 사) 에 클로닝하였다.
다음으로, 재조합 인간 β2 마이크로글로불린의 cDNA 를 증폭시키기 위해서, 하기 정방향 프라이머: 5'-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3' (서열 번호: 21) 및 역방향 프라이머: 5'-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3' (서열 번호: 22) 를 사용하고, 인간 β2 마이크로글로불린 (GenBank Acc. No. AB021288) 발현 플라스미드를 주형으로 하여 PCR 을 행하였다. 증폭시킨 단편을 제한 효소 NdeI 및 BamH1 로 절단하여, pET11a 벡터 (Novagen 사) 에 클로닝하였다.
상기 2종류의 벡터를 대장균 BL21 로 발현시켜, 인클루전 보디의 불용 획분으로서 회수하였다. 각각의 인클루전 보디는 8M 우레아 용액으로 용해 후, 리폴딩 버퍼로 희석하고, 추가로 펩티드 (서열 번호: 2) 를 첨가하여 가용성의 HLA-펩티드 복합체를 형성시켰다. 다음으로 HLA-펩티드 복합체의 C 말단 부위의 서열을 BirA 효소에 의해 비오틴화하여, 겔 여과법으로 비오틴화된 접시 A-펩티드 복합체를 정제하였다. 비오틴화된 HLA-펩티드 복합체와 PE 표지된 아비딘 (Molecular Probe 사) 을 4:1 의 몰비로 혼합하여 HLA 테트라머를 조제하였다.
실시예 3
WT1 특이적 CTL 전구 세포의 HLA 테트라머에 의한 해석
실시예 1 의 동결된 PBMC 를 해동시킨 직후에 0.5% 소태아 혈청 (FCS) 을 포함하는 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 에 1×106개/ml 로 재부유시키고, 실시예 2 에서 조제한 테트라머 용액 (500μg/μl) 2μl 를 첨가하여, 37℃ 에서 30분간 인큐베이트하였다. 음성 대조로서, 테트라머 대신에 PE 표지한 스트렙토아비딘 (Becton Dickinson 사) 을 첨가하여, 동일하게 처리한 검체도 준비하였다. 그 후 얼음 속에서 급냉시켜, FITC 표지 마우스 항인간 CD8 모노클로날 항체 (BD Pharmigen 사) 및 PerCP 표지 마우스 항인간 CD3 항체 (BD Pharmigen 사) 를 각 15μl 첨가하여, 4℃ 에서 30분간 인큐베이트하였다. 염색한 세포는 0.5% FCS 를 포함하는 PBS 로 2회 원심 세정한 후, 플로사이토미터 FACSort (Becton Dickinson 사) 로 해석하였다. CD3 양성 및 CD8 양성의 세포 (CD3+ CD8+) 를 선택하여, 그 선택한 세포 중의 테트라머 양성 세포 (CD3+ CD8+ tetramer+) 의 비율 (빈도) 로부터 음성 대조의 PE 표지 스트렙토아비딘 양성 세포 (CD3+ CD8+ avidin+) 의 비율을 뺀 수치를 WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포의 비율로 하였다:
WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포 (%)=[(CD3+ CD8+ tetramer+ 세포수/CD3+ CD8+ 세포수)-(CD3+ CD8+ avidin+ 세포수/CD3+ CD8+ 세포수)]×100
암 환자와 건강인 PBMC 를 해석한 결과를 표 2 에 나타낸다. 또한, 이 결과를 질환별로 플롯한 것을 도 1 에 나타낸다. 이 결과로부터, CD3/CD8 양성 세포 중의 WT1 항원 펩티드 특이적 CTL 전구 세포의 비율은, 건강인에서는 0.47∼1.30% 로 평균이 0.82% 이었지만, 조혈기 악성 종양 환자에서는 1.04∼29.45% 로 평균이 5.24%, 폐암 환자에서는 0.33∼5.97% 로 평균이 2.44% 이었고, 통계 해석에 의해 건강인에 비하여 조혈기 악성 종양 환자 및 폐암 환자에서는 유의하게 증가하고 있는 것이 분명해졌다 (p<0.05).
검체명 CTL 프리커서 빈도 (%)
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 1 8.26
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 2 8.01
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 3 5.12
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 4 3.84
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 5 4.51
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 6 3.27
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 7 2.68
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 8 2.60
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 9 1.77
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 10 1.04
급성 골수성 백혈병 (AML) 환자 11 1.49
급성 림프성 백혈병 (ALL) 환자 1 7.32
급성 림프성 백혈병 (ALL) 환자 2 1.78
만성 골수성 백혈병 (CML) 환자 2.46
골수 이형성 증후군 (MDS) 환자 1 29.45
골수 이형성 증후군 (MDS) 환자 2 2.99
골수 이형성 증후군 (MDS) 환자 3 2.81
골수 이형성 증후군 (MDS) 환자 4 2.08
폐암 환자 1 5.97
폐암 환자 2 3.83
폐암 환자 3 2.63
폐암 환자 4 1.89
폐암 환자 5 1.69
폐암 환자 6 0.72
폐암 환자 7 0.33
건강인 1 1.30
건강인 2 1.05
건강인 3 1.08
건강인 4 0.85
건강인 5 0.81
건강인 6 0.79
건강인 7 0.61
건강인 8 0.64
건강인 9 0.57
건강인 10 0.47
실시예 4
펩티드 투여에 있어서의 WT1 특이적 CTL 의 빈도 해석
이하의 시험은 오사카 대학 의학부의 윤리 위원회의 승인을 받아, 암 환자의 인폼드 컨센트를 얻은 후에 실시되었다.
WT1 의 235번째부터 243번째까지의 서열의 펩티드 (서열 번호: 2) 또는 이 펩티드의 N말단으로부터 2번째의 메티오닌을 티로신으로 치환한 개변 펩티드 (서열 번호: 3) 를 암 환자에게 1회당, 0.3mg, 1mg 또는 3mg 투여하였다. 투여하는 펩티드는 Montanide ISA51 (SEPPIC 사) 을 사용하여 에멀전화하여, 1회 또는 2주 간격으로 복수회 피내 투여하였다. 환자로서는 HLA-A*2402 양성 및 WT1 양성인 폐암, 유방암, 또는 백혈병의 환자를 대상으로 하였다.
투여 펩티드에 대한 면역 반응은 실시예 3 과 동일한 HLA 테트라머법으로 펩티드 특이적 CTL 빈도를 측정하여 평가하였다. 펩티드 투여 후의 어느 한 단계에서의 펩티드 특이적 CTL 빈도가 펩티드 투여 전의 1.5배 이상 증가한 경우를 「면역 반응 양성」 이라고 정의하였다. 또한, 펩티드 투여 후에 종양 마커 수치의 저하, 종양 세포나 종양 용적의 감소가 관찰된 경우를 「치료 효과 있음」 으로 판정하였다. 펩티드 투여에 의한 면역 반응과 치료 효과를 함께 평가할 수 있었던 19명의 암 환자에 관해서, 면역 반응과 치료 효과의 상관 관계를 카이제곱 검정에 의해 평가하였다. 그 결과, 치료 효과가 관찰된 11명의 환자 중, 8명 (73%) 에서 면역 반응 양성이었지만, 치료 효과가 관찰되지 않은 8명 중, 면역 반응 양성이었던 것은 겨우 2명 (25%) 뿐으로, 치료 효과와 면역 반응에는 유의한 정의 상관 관계 (P=0.0397) 가 관찰되었다. 이 결과를 통해, 투여 펩티드 특이적인 CTL 의 유도는 치료 효과에 있어서 중요한 팩터임을 알 수 있었다. 또한 펩티드 투여에 의한 치료가 순조롭게 진행되고 있는 것의 확인이나, 펩티드 투여에 의한 치료를 속행할지의 여부에 관한 판단에 있어서, 상기 면역 반응성이 하나의 지표가 됨을 알 수 있었다.
실시예 5
WT1 특이적 CTL 의 기능 해석
HLA 테트라머 염색 양성 및 CD8 양성의 항원 펩티드 특이적 CTL 은, 추가로 항CD45RA 항체와 항CD27 항체로 염색함으로써, 기능적으로 상세 분류할 수 있는 것으로 보고되어 있다 (J. Exp. Med., 186, p1407, 1997). CD45RA 양성 또한 CD27 양성은 나이브형, CD45RA 음성 또한 CD27 양성, 및 CD45RA 음성 또한 CD27 음성은 메모리형, 그리고 CD45RA 양성 또한 CD27 음성은 이펙터형으로 분류된다. 이펙터형이, 강한 CTL 활성을 나타내는 세포 집단이다.
실시예 4 의 임상 연구에 참가한 HLA-A*2402 양성의 암 환자 24명 (혈액암 14명, 고형 암 10명) 의 펩티드 투여 전의 PBMC 및 인폼드 컨센트를 얻어 채취한 HLA-A*2402 양성의 건강인의 PBMC 를 사용하여, HLA 테트라머 염색 양성 및 CD8 양성의 WT1 펩티드 특이적 CTL 전구 세포의 기능 분석을 행하였다. 플로사이토미터 해석용으로 실시예 3 과 동일한 방법으로 세포를 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 항CD45RA 항체, 항CD27 항체로 염색하였다. HLA 테트라머 양성 또한 CD8 양성의 세포 집단에 있어서의, CD45RA 양성/CD27 양성의 나이브형, CD45RA 음성의 메모리형, CD45RA 양성/CD27 음성의 이펙터형의 비율 (%) 을 각각 산출하였다. 나이브형, 메모리형, 이펙터형의 비율은 각각, 암 환자에서 23.7%, 45.5%, 30.8% 이었다. 한편 건강인에서는 각각, 35.9%, 53.8%, 8.9% 이었다. 암 환자와 건강인으로 비교하면, 이펙터형에 관해서는 암 환자에서 유의하게 비율이 높았지만 (p<0.05), 나이브형, 메모리형에 관해서는 유의한 차는 관찰되지 않았다. 실시예 3 에서 암 환자에서는 WT1 특이적 CTL 전구 세포가 증가하고 있음을 나타내었는데, 그들 중에서 암 환자에서는 이펙터형의 기능을 가진 CTL 의 비율이 증가하고 있음이 분명해졌다. 이 결과를 통해, 이펙터형의 CTL 전구 세포의 존재 빈도를 하나의 지표로 하여 암 환자를 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 의해, WT1 특이적 CTL 전구 세포의 빈도를 지표로 한, WT1 백신 응답성이 높은 환자의 선택 방법 및 그것을 이용하는 암의 처치 방법이나, 그 선택을 위한 임상 검사약 등이 제공된다. 본 발명의 선택 방법에 의해, 보다 WT1 백신 요법에 의한 효과가 기대되는 환자를 선택할 수 있어, 암에 대한 적절한 처치를 실시할 수 있게 된다.
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Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300 Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 435 440 445 Leu <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 2 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 3 Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 4 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 5 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 6 Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 7 Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide Xaa at 1 position stands for Abu. <400> 8 Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 9 Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 10 Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 11 Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 12 Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 13 Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 14 Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 15 Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 16 Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide <400> 17 Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic Peptide Xaa at 5 position stands for Abu. <400> 18 Arg Tyr Pro Ser Xaa Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 19 ccatgggcag ccattctatg cgctattttt ctacctccgt 40 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 20 ggatcctggc tcccatctca gggtgagggg cttgggcaga ccctc 45 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 21 catatgatcc agcgtacccc gaaaattcag 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 22 ggatccttac atgtctcgat cccacttaac 30

Claims (19)

  1. 이하의 공정 (a), (b) 및 (c):
    (a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
    (b) 상기 (a) 의 생체 시료 중에 존재하는 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
    (c) 상기 (b) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 건강인의 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 경우, WT1 백신이 적용가능하다고 판단하는 공정,
    을 포함하는, 암의 진단 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법에 의해 측정하는, 진단 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    HLA 테트라머법에 의해 측정하는, 진단 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
    (a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
    (b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
    (c) HLA 테트라머에 결합한 WT1 특이적인 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양을 측정하는 공정,
    (d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 건강인의 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 경우, WT1 백신이 적용가능하다고 판단하는 공정,
    을 포함하는, 진단 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    제 4 항에 기재된 공정 (c) 가, CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성의 CTL 전구 세포 중에서의 HLA 테트라머 결합 세포의 비율을 측정함으로써 행해지는, 진단 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 진단 방법.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 진단 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 진단 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    CTL 전구 세포가 이펙터형 CTL 전구 세포인, 진단 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    WT1 특이적인 이펙터형 CTL 전구 세포의 존재 빈도 또는 양의 측정에, HLA 모노머법, HLA 다이머법, HLA 테트라머법, HLA 펜타머법, 엘리스폿법, 실시간 RT-PCR 법 및 한계 희석법 중 어느 한 방법을 이용하는, 진단 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    HLA 테트라머법을 이용하는, 진단 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    이하의 공정 (a), (b), (c) 및 (d):
    (a) CTL 전구 세포를 포함하는 생체 시료를 피험자로부터 단리하는 공정,
    (b) WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 테트라머, 항CD8 항체, 항CD45RA 항체 및 항CD27 항체와, 상기 (a) 의 생체 시료를 접촉시키는 공정,
    (c) CD8 양성 또는 CD8/CD3 양성이고, 또한 HLA 테트라머 결합 양성의 CTL 전구 세포 중에서의, CD45RA 양성 또한 CD27 음성의 이펙터형 CTL 전구 세포의 비율을 측정하는 공정,
    (d) 상기 (c) 의 측정 결과를 건강인의 그것과 비교하여 건강인의 수치에 비하여 1.5배 이상 높은 경우, WT1 백신이 적용가능하다고 판단하는 공정,
    을 포함하는, 진단 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    HLA 테트라머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 진단 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 진단 방법.
  15. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    플로사이토메트리를 사용하여 행해지는 진단 방법.
  16. WT1 유래의 암 항원 펩티드를 함유하는 HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머를 성분으로 하는, 암의 진단약.
  17. 제 16 항에 있어서,
    HLA 모노머, HLA 다이머, HLA 테트라머 또는 HLA 펜타머의 구성 성분인 HLA 항원이 HLA-A24 항원 또는 HLA-A2 항원인, 진단약.
  18. 제 16 항에 있어서,
    WT1 유래의 암 항원 펩티드가, Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (서열 번호: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호: 4) 및 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호: 5) 에서 선택되는, 진단약.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기재된 진단약을 함유하는 키트.
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