KR20110047920A

KR20110047920A - 표면전하에 따른 세포내 흡입 및 독성 차이를 이용하여 암종 세포에 사용되는 은 또는 금 나노입자

Info

Publication number: KR20110047920A
Application number: KR1020090104725A
Authority: KR
Inventors: 주상우; 이소영; 조근창
Original assignee: 숭실대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-31
Filing date: 2009-10-31
Publication date: 2011-05-09

Abstract

본 발명은 표면전하에 따른 세포내 흡입 및 독성 차이를 이용하여 암종 세포에 사용되는 은 또는 금 나노입자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 은 및 금 나노입자의 표면전하가 나노입자의 암종세포에의 흡입차이로 인해 미치는 영향을 고찰하여, 생물학적 시스템내에서 은 및 금 나노입자의 적용에 있어 보다 효과적으로 안전하게 활용될 수 있는 방안에 관한 것이다.

이를 위한 본 발명은 암종 세포에 항암제 및/또는 약물전달체로서 사용가능한 음 또는 양으로 하전된 금 또는 은 나노입자를 제공한다. 보다 효과적인 세포흡입을 돕기 위하여 상기 나노입자는 Ag(+) 또는 Au(+) 나노입자인 것이 바람직하며 다른 세포에 대한 세포독성을 최소화하기 위해서 상기 나노입자는 Ag(-) 또는 Au(-) 나노입자인 것이 바람직하다.

나노입자, 표면전하 효과, 은, 금, 세포흡입

Description

표면전하에 따른 세포내 흡입 및 독성 차이를 이용하여 암종 세포에 사용되는 은 또는 금 나노입자{Positively or Negatively charged Silver or Gold Nanoparticles used in Carcinoma Cell considering Cellular Uptake and Cytotoxicity difference according to Surface Charges}

최근, 나노입자들(NPs)은 산업적으로 그리고 생의학적 목적으로 광범위하게 사용되어오고 있다. 특히 나노입자는 선택적 약물 운반 시스템(P.S. Ghosh, C.K Kim, G. Han, N.S. Forbes, V.M. Rotello, ACS Nano 2008, 2, 2213.)및 박테리아 감염에 대항한 잠재적인 항박테리아 약품(K.Y. Yoon, J.H. Byeon, J.H. Park, J. Hwang, Sci. Total. Environ. 2007, 373:572.)으로 제안되어 왔다. 나노입자의 광 범위한 적용에도 불구하고, 그들의 독성에 대한 연구는 초기 단계에 머물러 있다. 성공적으로 나노기술을 적용하기 위해서는, 나노입자에 대한 세포독성의 보다 깊은 이해가 필요하다. 은 및 금 나노입자의 세포독성은 사이즈, 농도 및 표면 변형으로 설명되어오고 있다(H.J. Yen, S.H. Hsu, C.L. Tsai, Small 2009, 5, 1553. / C.M. Goodman, C.D. McCusker, T. Yilmaz, V.M. Rotello, Bioconjug Chem. 2004, 15, 897. / M. Ahamed, M. Karns, M. Goodson, J. Rowe, S.M. Hussain, J.J. Schlager, Y. Hong, Toxicol. Appl. Pharmacol. 2008, 233, 404.). 종래의 보고서들은 은 나노입자가 생식계열 줄기세포를 포함한 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능을 감소시키고 세포막 누출을 증가시키는 것으로 보고하고 있다 (S.M. Hussain, K.L. Hess, J.M. Gearhart, K.T. Geiss, J.J. Schlarger, Toxicol. In Vitro 2005, 19, 975. / L. Braydich-Stolle, S. Hussain, J.J. Schlager, M.C. Hofmann, Toxicol. Sci. 2005, 88, 412. / S.H. Kim, J.E. Choi, K.H. Chung, K.S. Park, J.H. Yi, D.Y. Ryu, Toxicol. In Vitro 2009, 23, 1076.). 게다가, 은 나노입자는 활성 산소 종을 통한 세포사멸 또는 DNA 손상과 JNK(c-Jun N-terminal kinase ) 활성화를 유발한다(Y.H. Hsin, C.F. Chen, S. Huang, T.S. Shin, P.S. Lai, P.J. Chueh, Toxicol. Lett. 2008, 179, 130.). 반면에 금 나노입자의 세포독성은 논쟁이 되고 있다. 콘너 등은 금 나노입자는 K562 백혈병 세포계열에 노출되었을 때 중대한 세포독성을 일으키지 않음을 보여주었지만 (E.E. Connor, J. Mwamuka, A. Gole, C.J. Murphy, M.D. Wyatt, Small 2005, 1, 325.), 폐포 타입 II 세포계열(alveolar type II cell lines)( C. Uboldi, D. Bonacchi, G. Lorenzi, M.I. Hermanns, C. Pohl, G. Baldi, R.E. Unger, C.J. Kirkpatrick, Part Fibre Toxicol. 2009, 6, 18.) 인간 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts)( N. Pernodet, X. Fang, Y. Sun, A. Bakhtina, A. Ramakrishnan, J. Sokolov, A. Ulman, M. Rafailovich, Small 2006, 2, 766.)에서 금 나노입자의 세포독성을 지적하는 여러 보고들이 있다. 판 등은 금 나노입자의 세포독성은 섬유아세포, 상피세포, 대식세포 및 흑색종 세포내에서 사이즈 의존적이라고 보고하였다(Y. Pan, S. Neuss, A. Leifert, M. Fischler, F. Wen, U. Simon, G. Schmid, W. Brandau, W. Jahnen-Dechent, Small 2007, 3, 1941.).

현재까지 세포흡입 및 독성에 대한 금 및 은 나노입자의 표면전하 효과는 자세하게 연구되어오고 있지 않다. 현재의 연구에서, 인간 폐암종 A549 세포들이 의학적 목적으로 또는 의도하지 않게 흡입된 나노입자의 세포독성을 연구하기 위해 선택되었다. A549 세포들을 사용하여, 우리는 세포독성에 대한 금 및 은 나노입자의 표면전하의 영향을 조사하였다.

음 또는 양으로 하전된 은 또는 금 나노입자의 표면 전하가 암종 세포의 세포흡입에 미치는 영향을 고찰하여 생물학적 시스템내에서 은 및 금 나노입자의 적용에 있어 활용될 수 있는 방안을 찾고자 한다.

이를 위한 본 발명은 암종 세포에 항암제 및/또는 약물전달체로서 사용가능한 음 또는 양으로 하전된 금 또는 은 나노입자를 제공한다. 보다 효과적인 세포흡입을 돕기 위하여 상기 나노입자는 Ag(+) 또는 Au(+) 나노입자인 것이 바람직하며 다른 세포에 대한 세포독성을 최소화하기 위해서 상기 나노입자는 Ag(-) 또는 Au(-) 나노입자인 것이 바람직하며, 또한, 상기 나노입자는 유동부피 및/또는 표면영역에 기초하여 계산된 IC₅₀이하의 용량의 형태인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 암종 세포는 폐 암종 세포일 수 있으며, 특히 폐암종 A549세포일 수 있다.

한편, 음 또는 양으로 하전된 금 또는 은 나노입자는 암종 세포에 대한 흡입력이 뛰어나, 암종 세포를 탐지하는 표지물질로도 사용될 수 있을 것이다.

은 또는 금 나노입자의 표면전하가 암종 세포의 세포흡입에 대해 미치는 영향을 알게 되어, 생물학적 시스템내에서 은 또는 금 나노입자의 적용에 있어 활용 될 수 있는 방안의 기초를 마련하였다. 나아가, 표면전하를 조절하여 은 또는 금 나노입자를 비롯한 효과적인 나노구조체를 제작하여 항암제 또는 약물전달체, 나아가 암종 세포를 탐지하는 표지물질로도 사용할 수 있다.

본 발명에서, 우리는 대표적인 암종 세포인 인간 폐암종 A549 세포를 사용하여 세포흡입에 대한 은 및 금 나노입자의 표면전하의 효과를 연구하였다. 나노기술의 많은 장점에도 불구하고, 우리는 나노입자의 응용함에 있어서 안전성을 고려하여야 할 필요가 있다. 이는 생물학적 시스템에 있어 은 및 금 나노입자의 적용에 있어 중요한 문제라고 생각된다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.

우선, 본 발명에 사용하는 나노입자의 물리화학적 특성을 알아보았다. 평균 입자 지름과 그들의 상대적 표준편차들은 각 샘플에 대해 최소 100개의 입자를 일일이 세고 눈금자로 측정하여 얻었다. 통계분석과 지름에 있어 표준편차의 사이즈 분포는 표 1에 나열하였다.

도 1의 A는 다른 사이즈의 입자의 대표적 TEM 이미지를 보여준다. 입자 모양은 거의 각 입자에 대해 거의 구형이었다. 구형인 경우, 표면전하가 보다 안정적으로 존재할 수 있기 때문에 바람직한 것으로 생각되고 다른 모양의 구조체의 경우에도 표면전하가 세포흡입과정에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. Ag(-) 샘플에 대해, 큰 콜로이드내 커다란 비균일의 크기 분포는 주로 그들의 빠른 성장때문이다. 입자들의 크기분포 히스토그램은 도 1의 B에 나타내었다. 큰 콜로이드안의 넓은 크기 분포는 주로 그들의 빠른 성장때문이다. 우리의 실험환경에서 보다 좁은 크기 분포를 갖는 Ag(-) 입자의 보다 작은 크기를 준비하는 것은 쉽지 않았다. 우리는 QELS(quasi-static light scattering)크기분포는 TEM 측정의 그것들과는 다소 차이가 나는 것을 언급해야 한다. QELS 기술이 입자의 유체역학적 반지름을 측정하기 때문만이 아니라, 또한, 산란 강도가 지름의 6^th 파워(sixth power)에 비례함으로 인해 지름의 강도-평균 지름(intensity-average diameter)은 넓은 사이즈 분포를 갖는 입자들에 대한 수-평균 지름보다 상당히 클 수 있다는 것 때문이다. 강도-평균 지름은 몇몇의 큰 응집체의 존재로 인해 때로는 재생할 수 없는 비이성적으로 큰 값을 보여준다는 것을 우리는 알았고, 그래서 우리는 대신에 좀더 재현가능한 수-평균 지름을 사용하였다. 만약 우리가 수-평균 지름을 사용한다면, Ag(-) 입자들은 ~ 15 nm 입자의 모집단(population)을 보여주는데, Ag(+) 입자에 필적할 만하다.

Ag(-) 나노입자의 평균 사이즈는 Ag(+), Au(+), 및 Au(-) 입자의 그것들보다 더 큰 것으로 측정되었기 때문에, 그들의 비유사한 세포의 행동은 표면전하대신 그들의 보다 큰 사이즈에 의한 것일 수 있다. 여기서는 보여지지 않았지만, 우리의 DFS 연구로부터, ~50 nm , 약 -30 mV 의 평균사이즈와 제타 포텐셜을 갖는 Au(-) NPs 은 ~18 nm 와 약 -50 mV Au(-) 입자의 그것들과 대비할 때, 그들의 세포적 흡수에 있어 각각 주목할 많한 차이점을 보여주지 않는다. 표면전하와 사이즈 모두 세포적 흡수 메커니즘에 있어 중요한 역할을 할 것이다. 사이즈 효과가 우리의 데이터에 영향을 주었지만, 그것은 Ag(-) 와 Ag(+) 입자간의 세포적 흡수에 있어 차이점은 그들의 평균적 사이즈보다는 그들의 표면 전하들 때문일 것일 가능성이 있다.

수용액상내 Ag(-), Ag(+), Au(-), 및 Au(+) 입자들에 대한 주입 후 UV-vis 흡수 스펙트럼 변화가 측정되었고, 그들의 파장최대값은 대략적으로 각각 415, 415, 522, 및 525 nm 에서 발견되었다(도 2). 평균 입자 지름들과 그들의 상대적 표준편차들은 각 샘플에 대해 최소 100개의 입자에 대해 카운팅함에 의해 얻었다. 금 및 은 나노입자의 구조(compositions)를 결정하기 위해 사용되는 ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer)측정에 따라서, 양으로 하전된 입자들의 농도는 음으로 하전된 입자들의 그것들보다 더 높은 것으로 나타났다(표 1). 이러한 편차들은 MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 및 LDH (lactate dehydrogenase) 분석의 세포독성 분석에서 표준화되었다. Ag(-), Ag(+), Au(-), 및 Au(+) 입자들의 제타 포텐셜(zeta potentials)은 -34.8, 40.8, -37.5, 및 41.5 mV로 측정되었다.

A549세포에서의 나노입자의 내재화(Internalization)에 대하여 알아보았다. 우리는 TEM을 사용하여 나노입자들의 흡수(uptake)를 연구하였다. 세포들의 TEM 이미지들은 양으로 또는 음으로 하전된 은 및 금 나노입자들의 모두가 24시간 후 세포질내로 내재화된다는 것을 보여주었다(도 3). 내재화된 은 및 금 나노입자들의 대부분은 세포막부착 소포(membrane-bound vesicles)에서 관찰되었다(도 3). 우리는 또한, DFM(dark-field microscopy) 을 사용하여 나노입자의 내재화를 또한 관찰하였다(도 4). 세포내 삽입된 금속 나노입자는 그들의 응집된 상태로 관찰될 수 있었다. 세포내 삽입된 금속 나노입자는 DFM을 사용하여 그들의 응집된 상태를 갖는 것으로 확인될 수 있었다. 대략적으로 10⁵ 세포들이 밤새 커버글라스위에서 분주되었고 24시간동안 입자와 함께 배양되었다. 커버글라스는 마운팅 용액(DAKO fluorescent mounting medium)을 갖는 슬라이드글라스로 샌드위치 구조로 만들었다.

나노입자의 표면전하 의존 세포독성에 대하여 다양한 방법을 통해 알아보았다. 반대 전하를 갖는 금 및 은 나노입자의 세포독성은, 미토콘드리아 기능을 나타내는 MTT 어세이에서 IC₅₀값을 결정함에 의해 조사되었다. 상대적 세포독성(%)은 실험 섹션에서 기술된 것과 같이 비처리된 세포(100% 세포 생존능)의 퍼센티지로서 표현되었다.

MTT 생존능 어세이의 결과들은 24시간 및 72시간동안 Ag(-) NPs 에 노출된 A549 세포에서의 세포독성이 상당히 증가함을 보여주었다. 세포들이 24시간 또는 72시간동안 Ag(-) NPs 에 노출되었을 때, 세포 생존능은 각각 27 (n= 5) 및 19.01 (n= 5) ug/ml 에서 대략적으로 50% (IC₅₀)로 감소되었다(도 5의 A). 대조적으로, 24시간 및 72시간 동안 Ag(+) NPs 에 노출된 A549세포들의 세포 생존능은 대략적으로 5.2 (n= 3) 및 4.04 (n= 3) ug/ml 각각에서 50% 감소했다(도 5의 B).

유사하게, MTT 생존능 어세이의 결과들은 24시간 및 72시간동안 Ag(-) NPs 에 노출된 A549 세포에서의 세포독성의 상당한 증가를 보여주었다. 세포들이 24시간 또는 72시간동안 Au(-) NPs 에 노출되었을 때, 세포 생존능은 각각 48.94 (n= 5) 및 48.58 (n=5) ug/ml 에서 대략적으로 50% 로 감소되었다(도 5의 C). 대조적으로, 24시간 및 72시간 동안 Au(+) NPs 에 노출된 A549세포들의 세포 생존능은 대략적으로 23 (n= 5) 및 8.02 (n= 5) ug/ml 각각에서 50% 감소했다(도 5의 D). IC₅₀ 값들은 또한 표면 면적(mm²)에 기초하여 계산되었는데, 세포들의 표면에 접촉한 나노입자의 양이 세포독성을 결정함에 있어, 페트리 접시에서의 유동(배양매체) 부피보다 더욱 중요할 수 있기 때문이다(표 2).

우리의 데이터에 따르면, 미토콘드리아 기능 측정에 기반하여, 은 및 금 나노입자는 시간 및 농도 의존적인 세포독성 효과를 보여주고 있다. 나아가, 양으로 하전된 나노입자는 음으로 하전된 나노입자에 비하여 보다 독성이 강하다. 미토콘드리아 기능에 기초한 세포독성은 Ag(+), Au(+), Ag(-), Au(-)의 순으로 강하였다. 양으로 하전된 나노입자들이 음으로 하전된 나노입자들과 비교하여 보다 쉽게 많은 양으로 내재화되기 쉬운 것인지에 대한 메커니즘은 여전히 해결되어야 할 문제로 남아있다. 덴드리머의 경우에, 양이온적 덴드리머들은 세포막에서 특정하게 음으로 하전된 프로테오글리칸(proteoglycan)과의 상호작용을 통해 흡착 세포이물흡수(adsorptive endocytosis)에 의해 세포속으로 흡수되는 것으로 보인다(O.P. Perumal, R. Inapagolla, S. Kannan, R.M. Kannan, Biomaterials 2008, 29, 3469.).

미토콘드리아 기능외에, LDH 누출은 나노입자에 이해 유발된 세포독성의 또 다른 요인으로서 측정되었다. LDH누출은, 세포가 24시간 동안 은 또는 금 나노입자에 노출된 후, 세포막의 손상때문이다(도 6). 상대적 LDH누출(%)은 실험섹션에서 기술한 바와 같이 처리된 세포들의 퍼센티지로서 표현되었다. 도면에서 보이는 것과 같이, LDH누출은 세포가 Ag(+) NPs(나노파티클;나노입자)로 처리하였을 때에 가장 컸다.

A549 세포에 대한 나노입자의 세포사멸 효과를 알아보았다. 세포독성 연구를 확장하기 위하여, 나노입자의 처리 후에 세포 주기 분석을 시행하였다. 비가역적 손상을 입은 세포들은 세포사멸을 겪고, 서브- G₁ 페이즈(sub-G₁ phase)에서 세포들의 축적을 발생시켰다(J. Shen, H. Vakifahmetoglu, H. Stridh, B. Zhivotovsky, K.G. Wiman, Oncogene 2008, 27, 6571. / Banker DE, Groudine M, Norwood T, Appelbaum FR, Blood 1997, 89, 243. / Y. Ye, C. Wang, P. Du, M. Falzon, P.K. Seitz, C.W. Cooper, Endocrinology 2001, 142, 1906.). 세포 주기에 대한 나노입자들의 영향은 나노입자-처리한 세포들을 유세포분리기(flow cytometry)를 사용하여 분석되었다. WinMDI 2.8 소프트웨어를 사용하여 미가공 히스토그램으로부터 통계적 데이터가 추출되었고, 세포주기의 각 페이즈 내 세포의 퍼센티지는 대조군의 그것과 비교하였다(도 7). 양 또는 음 하전된 2xIC₅₀ 농도의 은 및 금 나노입자로 처리한 세포들은 서브- G₁ 페이즈(sub-G₁ phase) 내 증가를 보여주었다(도 7). 나노입자 처리를 겪지 않은 대조군 세포들에서는, 주요 세포 집단이 G₁ 페이즈에서 관찰되었고, 반면에 나노입자를 처리한 세포들에서는, 도 7에서 보는 바와 같이 G₁집단의 감소가 서브- G₁ 집단의 증가에 의해 수반되었다. 유세포분리기 분석에 더하여, 우리는 세포고사 유전자들, 백스(Bax), 및 카스파아제-3(caspase-3)의 발현 수준을 비교하였다. 도 8에서 보여주는 바와 같이, 백스 및 카스파아제-3 mRNA의 발현이 나노입자 비처리한 세포들과 비교할 때, 나노입자를 처리한 세포들에서 증가하였다.

비유사한 표면 전하를 갖는 다른 사이즈의 나노입자들이 우리 실험에서 채택되었기 때문에, 세포독성은 농도에 의존하여 빗나갈 수 있다. 내부 세포막 포텐셜 전하는 약 -70 mV로 알려진 것을 참조하면, 우리의 실험에 사용된 모든 나노입자들은 세포막 안쪽 포텐셜보다 더 양(positive)적이다. 우리의 실험 환경하에서 양적인 나노입자들이 보다 많은 독성을 보이는 우리의 결과는, 외부 세포막에서 실제 표면 전하는 나노입자들의 세포 흡수에 있어서 또한 중요하다는 것을 암시하는 것으로 보인다. 우리는 DFS와 형광 현미경을 사용하여 다양한 나노입자들의 라이브-셀 이미지들에 대해 연구하고 있다. 우리의 예비적 결과들은, 대부분의 나노입자들은 세포의 내부로 들어가기 전에 처음 세포막에 부착된다는 것을 암시한다. 여기에서, 은 또는 금 나노입자의 양전하들은 세포들의 시작 전하 인력(initial charge attraction)때문에 유리한 것으로 나타났다.

본 발명의 실험결과를 이용하여 음 또는 양으로 하전된 은 또는 금 나노입자를 생물학적 시스템내에서 다양한 방식으로 이용가능할 것이다. 본 발명의 연구에서 상기 나노입자는 암종 세포에 내재화될 수 있고, 특히 양으로 하전된 나노입자의 경우, 세포막부착 소포(membrane-bound vesicles), 또는 세포내이입 소포(endocytic vesicles)에 더 잘 내재화된다. 그리고, 우리의 실험결과에 따르면 상기 나노입자는 A549 세포들을 공격하여 세포생존력을 떨어뜨렸다. 종양이 외과적으로 제거되더라도, 제거된 부위의 잔류 암세포들로 인해 암이 재발할 가능성이 높은데, 특히 폐암의 경우에는 재발률이 높다. 따라서, 잔류 암세포들을 제거하는데 상기 나노입자들을 유용하게 사용할 수 있을 것으로 보인다. 특히, 우리의 실험에서 Ag(+) 나노입자이나, Au(+) 나노입자의 경우, A549 세포에 대한 독성이 상대적으로 강해 적절한 농도와 적절한 노출시간을 통해 자체적으로 항암제로 사용할 수도 있을 것으로 생각된다. 예컨대, 도 5의 IC₅₀을 보면, Ag(+)의 경우 상대적으로 적은 양과 짧은 시간에서도 세포독성이 상당하나, Au(-)의 경우, 그러하지 아니하며, 따라서 적절한 응용과 선택을 통해 항암제 및/또는 약물운반체로 사용할 수 있다.

항암치료에 있어 단순화학약물요법의 경우, 고농도의 인체투여로 인해 부작용이 많을 수 있다. 또한, 약물이 너무 빨리 작용하기 때문에 약물이 암세포에 취해지지 않아 그 효과가 떨어지기도 한다. 우리의 실험결과에서는 A549 세포에 대해, 음 또는 양으로 하전된 은 또는 금 나노입자는 세포막 부착되어 내재화(또는 세포내 흡입)가 잘 이루어지는 것을 확인하였다. 이는 음 또는 양으로 하전된 은 또는 금 나노입자를 약물전달물질로 활용하였을 때, A549 세포에 대해 상당한 효과를 볼 수 있다는 것을 의미하기도 한다. A549 세포에 대한 상기 나노입자들의 선택성을 보다 강화하기 위해, 선택성을 강화할 수 있는 항체, 단백질, 기타 약물을 연결하거나 포함시켜 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 한편, 우리의 연구에서 Ag(-) 나노입자나, Au(-) 나노입자의 경우, 상대적으로 낮은 세포독성을 보여주고 있는데, 약물전달물질(약물전달체)로 사용하는 경우, 다른 정상세포에 거의 영향을 주지 않고 A549세포를 제거할 수 있을 것이다. 또한 다양한 경로를 통해 투여될 수도 있는데, 이 때, 투여 방법, 투여 경로 등에 따라 사용량을 조절하여 다른 세포에 대한 세포독성을 무시할 수 있을 정도로 조절할 수도 있을 것이다. 그리고, 경우에 따라 초점이 약물 흡수가 많이 이루어져야 하는 경우라면, Ag(+) 나노입자나, Au(+) 나노입자가 선호될 수 있을 것이며, 증상의 정도에 따라 보다 부작용 없는 안전적인 방향에 초점이 맞추어진다면, Ag(-) 나노입자나, Au(-) 나노입자가 선호될 수도 있을 것이다. 이는 예시적인 것으로 본 연구 결과를 응용하여 다양한 구체적인 용법이 전개될 수 있을 것이다.

실시예

<나노입자의 제조>

음으로 하전된 은 및 금 나노입자의 콜로이드 분산물이 시트레이트 환원 방법에 의해 제조되었다. 양으로 하전된 나노입자는 다음의 방법에 의해 제조되었다(P.C. Lee, D. Meisel, J. Phys. Chem. 1982, 86, 3391. / D. Wei, W. Qian, Colloid Surf. B 2008, 62, 136.). Au(-) NP 샘플을 위해 1.4 mM HAuCl₄ 수용액 30 mL 를 끓였다. 대략적으로, 3 mL의 1% 소디움 시트레이트 용액이 격렬한 스터링하에서 HAuCl₄ 용액에 첨가되었고, 끓임은 약 1시간동안 계속되었다. Ag(-) NPs 에 대해서, 50 mL의 5.5 mM AgNO₃ 수용액을 끓였다. 대략적으로 1 mL의 1% 소디움 시트레이트 AgNO₃ 용액에 격렬한 스터링하에서 첨가되었고 끓임은 약 1시간 동안 계속되었다. Ag(+) NPs 에 대해서는 4mL 의 8.1 mM AgNO₃ 를 10mL 의 6.92 mg/mL 키토산 용액에 스터링하에 상온에서 첨가되었다. 15분 후에, 혼합물은 12.5 cm×2 cm 큐벳에 옮겨지고, 그것들을 45 ~ 95 ℃ 에서 6 ~ 12 시간동안 워터 배쓰에서 환원을 위해 대기시켰다. Au(+) NPs의 합성을 위하여, 4mL 의 1 - 8.1 mM HAuCl₄ 를 10mL 의 6.92 mg/mL 키토산 용액에 첨가하였다.

3차 증류수를 사용하였고, 모든 화학약품들은 시약등급이고 추가 정제 없이 사용하였다.

<나노입자 특성화>

UV-Vis 흡수 스펙트로스코피(Mecasys UV-3220 spectrophotometer) 가 표면 플라즈몬 밴드를 측정하기 위해 사용되었다. TEM (JEOL JEM-4010)은 금 나노입자 응집체들의 모폴로지를 관찰하기 위해 또한 사용되었다. QELS(quasi-elastic light scattering) 및 제타 포텐셜 측정법은 수력학적 반지름(hydrodynamic radius) 및 입자의 표면 포텐셜을 모니터하기 위해 사용되었으며, Malvern Nano-ZS장비를 사용하였다. 나노입자 용액내 은 및 금 퍼센티지는 Perkin-Elmer OPTIMA 4300DV ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer)를 사용하여 측정하였다.

<물질들>

A549 세포들은 10% FBS(fetal bovine serum) RPMI1640 에 유지시켰다. RPMI1640 및 FBS은 WelGene (Korea)에서 구입하였다. 항생제(antibiotic-antimycotic stabilized), MTT, 및 DMSO (dimethyl sulfoxide)는 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구입하였다. LDH 리키지 어세이를 위한 Cytotox 96 비 방사능 세포 독성 어세이(assay) Promega (USA)로부터 구입하였다. Karnovsky's fixative, 0.05 M 의 소디움 카코딜레이티드 버퍼(sodium carcodylated buffer), 1% 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide), 0.5% 우라닐아세테이트(uranyl acetate), 프로필렌 옥사이드(propylene oxide), 및 스퍼스 레진은 서울대학교 NICEM(National Instrumentation Center for Environmental Management (NICEM)로부터 얻었다. 세포 사이클 분석을 위해, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)는 Sigma로부터 구입했고, RNase A 는 AMRESCO로부터 구입하였다. 역전사를 위한 M-MLV 는 Invitrogen (USA)로부터 구입하였고, Go Taq 는 Promega (USA)로부터 구입하였다.

<세포 배양>

인간 폐암종 세포(A549, ATCC CCL-185)는 10 % FBS와 항생제로 보조한 DMEM 미디엄에서, 37 ℃ 및 5% CO₂ 환경의 인큐베이터에서 배양하였다. MTT 및 LDH 어세이를 위해, 세포들은 웰(well) 당 1x10⁴ 개가 96-well 플레이트에 분주되었다. 그것들은 어세이 전 하루동안(90% confluency) 배양되었다.

<나노입자 세포 흡수의 TEM 및 DFS 이미지>

TEM을 사용하여 나노입자의 흡수를 조사하였다. A549 세포들은 나노입자에 세포들이 노출되기 전에 성장 미디엄을 가지는 접시당 1x10⁴개 세포가 100 mm 배양접시(SPL, Korea)에 평판배양되었다. 나노입자가 첨가되었고, 세포들은 37℃ , 5% CO₂에서 배양되었다. 24시간 후에 세포들을 DPBS로 2회 세척하였고, 24시간 동안 카노프스키스 고정액(Karnovsky's fixative)으로 고정하고, 0.5 M 오스미움 테트록사이드에 포스트-고정하였다. 고정후에, 표본들(specimens)은 각각 15분동안, 30, 50, 70, 80, 90% 에탄올 등급으로 세척되고 탈수되었으며, 100%에탄올으로는 3회 실시하였다. 샘플들은 80℃에서 고분자화된 프로필렌 옥사이드에 레진 혼합물에 임베디드되었다. TEM울 위한 초슬림 박편은 다이아몬드 나이프를 이용하여 제조되었다. 샘플들은 TEM을 사용하여 분석하였다. 나노입자의 세포 흡수는 Leica DL LM 직상 현미경과 고해상도의 Cytoviva 150 어댑터로 DFM을 이용하여 또한 모니터 되었다. 세포들은 젤라틴 코팅된 슬라이드 글라스 위에 장착되고, 커버글라스로 샌드위치되었으며, 나노입자 용액에 밤새도록 배양되었다. 커버글라스를 위한 보정된 두께를 갖는 대물렌즈(x40)가 사용되어 이미지를 얻었는데 인피닛 II 칼라 CCD 카메라를 사용하였다.

<MTT 어세이>

세포 생존력은 MTT어세이로 산정하였다. 간단하게, 배양매질을 제거하고, 0.5 mg/ml의 메틸티아졸테트라졸리움 용액을 첨가하였다. 96-웰 플레이트들은 37℃ 에서 4시간동안 배양되어 MTT 포마잔 형성을 시켰다. 포마잔 크리스탈을 용해시키기 위하여 MTT 용액은 200 ul 의 DMSO로 교체되었고 마이크로플레이트 분석기(Bio-rad)를 사용하여 490 nm에서 광학 밀도를 결정하였다. 결과들은 대조군값의 퍼센티지로서 나타내었다.

<LDH( Lactate dehydrogenase) 리키지 어세이>

LDH 리키지는 매뉴얼에 따라, CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)를 사용하여 측정하였다. 간단하게, 이것은 세포 용해시 방출되는 안정한 시토솔 효소인 LDH를 정량적으로 측정하는 어세이이다. 배양 상청액의 방출된 LDH는 30분 결합 효소적 어세이로 측정되었는데, 테트라졸린 염의 레드 포마잔 프러덕트로의 변환을 초래했다. 형성된 컬러의 양은 용해된 세포의 수에 비례하였다. 분주후 24시간, 세포들은 다른 농도로 다른 나노입자로 처리하였고, 24시간 동안 배양되었다. 그리고 나서, 50 ul 의 세포 배양 매질은 각 웰로부터 수집되었고, 새로운 마이크로티터 플레이트에 플레이트하였다. 다음 50 ul의 기질 용액이 웰에 첨가되었고, 플레이트들은 상온에서 30분동안 배양되었다. 490 nm에서 흡광도는 표준 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다. 각 실험은 3회 실시되었다. 나노입자가 없는 세포 배양 매질을 함유하는 대조군 웰과 관계된 상대적 LDH리키지(%)는 테스트 대조군 x100에 의해 계산되었는데, 여기에서 [test] 는 테스트 샘플의 흡광도이고, [control] 은 대조군 샘플의 흡광도이다.

<유세포분리기(Flow cytometry)>

세포 사이클 분석은 유세포분리기의 형광 측정에 의해 프로피디움 아이오다이드(PI)로 DNA를 염색하여 실행하였다. 대략적으로 1x10⁵ A549 세포들이 6-웰 배양 플레이트(SPL, Korea)에 놓여졌다. 24시간동안 은 및 금 나토입자 처리를 하고 매질을 수확하였다. 세포들은 1x DPBS로 씻고 트립신화되고, 저장매질에 수확되었고, 원심분리되었다. 펠렛은 DPBS에 씻고, 아이스 콜드 에탄올(70%)에서 고정되고, -20℃에서 저장하였다. 유세포분리기를 이용한 분석 전에, 세포들은 DPBS로 세척하고, RNase A에 PI(40 ug/ml PI 및 50 ug/ml RNase A)로 염색하고, 40분동안 37℃에서 배양하고, 분석시까지 4℃에서 배양시켰다. 유세포분리기 분석은 FACS Calibur (Becton Dickinson, Canada)를 사용하여 실행하였다. 1x10⁴ 세포들에 대해 수집된 데이터는 WinMDI 2.8 (Scripps Research Institute, San Diego, CA, USA)을 사용하여 분석하였다.

<RT-PCR 분석>

A549 세포들로부터 총 RNA는 RNA iso plus reagent (Takara, Japan)를 사용하여 분리하였다. cRNA의 첫째 스트랜드는 M-MLV (Invitrogen, USA) and Random primer (Promega, USA)를 사용하여 총 RNA의 1 ug 으로부터 합성하였다. 사용된 프라이머 세트의 시퀀스는 다음과 같다. Bax-2 sense 5'-cccttttgcttcagggtttc-3' 및 antisense 5'-gccactcggaaaaagacctc-3', caspase 3 sense 5'-gcatactccacagcacctgg-3' 및 antisense 5'-ctgttgccacctttcggtta-3'. housekeeping gene은 β-actin: sense 5'-ctggaacggtgaaggtgaca-3' 및 antisense 5'-aagggacttcctgtaacaatgca-3'. 반응 조건은 40 초동안 95℃에서, 40초 동안 57℃에서 그리고 1분동안 72℃에서 35 사이클로 구성되어 있고 마지막으로 72℃에서 7분간의 연장을 하였다. 전기영동은 1.6% 아가로스 겔에서 수행하였다.

<통계 및 분석>

각 실험은 실험당 최소 6개의 복제본을 가지고 3회 반복되었다. 결과들은 비노출된 세포들의 퍼센티지로서 표현하였다. Student's t-test를 사용하여 데이터의 통계적 의미를 분석하였다. p<0.05 인 경우 차이점들은 유의미한 것으로 간주하였다. 나노입자 농도- 반응 (세포 생존력) 커브들은 볼쯔만 함수를 사용하여 분석하였다(Y=1/1+exp(IC₅₀-X/slope factor) (Origin 5.0, OriginLab Corporation, MA, USA).

상기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 상기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다. 즉, 본 발명의 구체적인 범위는 상기 기술한 실시예 보다는 특허청구범위에 의하여 한정지어지며, 특허청구범위의 의미와 범위 및 그 등가개념으로 도출되는 모든 변경된 형태를 본 발명의 범위로 포함하여야 한다.

도 1은 (a) Ag(-), (b) Ag(+), (c) Au(-), 및 (d) Au(+) NPs 의 TEM 이미지 (A) 와 사이즈 분포(B)이다.

도 2는 (A) Ag 및 (B) Au NPs의 UV-vis 흡수스펙트럼이다.

도 3은 나노입자에 노출된 TEM 이미지이다. A549 세포들은 24시간 동안 나노입자에 노출되었으며, TEM을 위해 고정되었다. A549내의 A. Ag(-), B. Ag(+), C. Au(-), D. Au(+) NPs 이다.

도 4는 A549 세포들 내 (A)네거티브 대조군, (B) Ag(-), (C) Ag(+), (D) Au(-), 및 (E) Au(+) NPs의 DFM(Dark field microscopy) 이미지이며, 스케일 바는 15마이크로 미터이다.

도 5는 MTT 세포 생존능 어세이다. A549 세포들은 24시간 또는 72시간 동안 다른 나노입자 농도에 노출되었다. 대조군(노출되지 않은 것) 세포들의 값은 100%로 하고, 나노입자에 노출된 세포들의 광학 밀도의 감소의 퍼센티지로서 계산하였다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±오차로 표현하였다. * 로 대조군(0 ug/ml)과 대비하여 유의미한 차이(p<0.05)를 나타냈다. 윈도우 버전 5.0 소프트웨어를 사용하여 통계분석하였다. A. Ag(-), B. Ag(+), C. Au(-), D. Au(+)이다.

도 6은 세포독성 인덱스로서 LDH 어세이이다. LDH리키지는 Ag(-) (A), Ag(+) (B), Au(-) (C) and Au(+) (D) NPs에 24시간 노출후에 측정되었다. 노출되지 않은 대조군의 값은 0%로 보고, 나노입자에 노출된 세포들의 광학 밀도의 증가 퍼센티지로서 계산하였다. 데이터는 4회의 독립적인 실험의 평균±오차로 표현하였다. * 로 대조군(0 ug/ml)과 대비하여 유의미한 차이(p<0.05)를 나타냈다.

도 7은 세포 사이클 분석이다. 세포 사이클 분석은 형광의 유세포 분리기 측정에 따라 PI(propidium iodide)로 DNA 염색하여 수행되었다. A. 나노입자의 처리없는 대조군 B. Ag(-), C. Ag(+), D. Au(-), E. Au(+)이다. 24시간 동안 Ag(-), Ag(+), Au(-) 및 Au(+) NPs에 노출시킨다. 나노입자 처리된 세포들은 sub-G₁ phase에서 증가를 보인다. F는 WinMDI 2.8 소프트웨어로 만든 플롯이다.

도 8은 A549세포에서 Ag (A) 및 Au (B) NPs 처리한 후, Bax-2 및 caspase-3의 mRNA 표현이다. 대표 겔 이미지는 나노입자 처리후의 Bax-2 및 caspase-3의 mRNA 표현의 증가를 보여준다. 마커 M, 네거티브 대조군 C 이다.

Claims

암종 세포에 항암제 및/또는 약물전달체로서 사용가능한 음 또는 양으로 하전된 금 또는 은 나노입자.
제 1항에 있어서, 효과적인 세포흡입을 돕기 위하여 상기 나노입자는 Ag(+) 또는 Au(+) 나노입자를 인 것을 특징으로 하는 나노입자.
제 1항에 있어서, 세포독성을 최소화하기 위하여 상기 나노입자는 Ag(-) 또는 Au(-) 나노입자인 것을 특징으로 하는 나노입자.
제 1항에 있어서, 상기 나노입자는 유동부피 및/또는 표면영역에 기초하여 계산된 IC₅₀이하의 용량의 형태인 것을 특징으로 하는 나노입자.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 암종 세포는 폐 암종 세포인 것을 특징으로 하는 나노입자.
암종 세포에 대한 표지물질로 사용되는 것을 특징으로 하는 음 또는 양으로 하전된 금 또는 은 나노입자.