KR20110040895A

KR20110040895A - 재조합 섬유소원

Info

Publication number: KR20110040895A
Application number: KR1020117003048A
Authority: KR
Inventors: 아브라함 보우트; 조셉 그림베르겐; 자콥 쿠프만
Original assignee: 프로피브릭스 비.브이.
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2011-04-20
Also published as: EP3078673A2; MX2011000281A; NZ590871A; IL210495A; HK1151184A1; US10562956B2; EP3078673A3; CN102089322A; JP2011527190A; US20170037108A1; US20110177524A1; WO2010004004A1; CN102089322B; AU2009268052A1; JP5819725B2; EP2310411B2; EP2310411B1; PL2310411T3; ES2585246T3; BRPI0915574A2

Abstract

본 발명은 섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관계한다. 이들 서열은 진핵 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된다. 이런 최적화된 뉴클레오티드 서열은 진핵 세포 배양 시스템에서 완전한 형태로 재조합 섬유소원과 이의 변이체의 효율적인 발현을 가능하게 한다.

Description

재조합 섬유소원{RECOMBINANT FIBRINOGEN}

기술분야

본 발명은 재조합 섬유소원, 포유동물 세포에서 높은 수준으로 이를 생산하는 방법, 그리고 이의 적용에 관계한다.

배경기술

섬유소원은 주로 간 실질 세포 (parenchymal cell)에 의해 인체에서 합성되는 가용성 혈장 당단백질이다. 이는 이황화 가교 (disulfide bridge)에 의해 연결되고 Aα, Bβ와 γ로 지정된 3개의 폴리펩티드 사슬 중에서 2개의 쌍으로 구성되는 이합체 분자 (dimeric molecule)이다. 이들 3개의 폴리펩티드 사슬은 3가지 별개의 유전자에 의해 인코딩된다. 야생형 Aα 사슬은 625개의 아미노산 전구체로서 합성되고 혈장 내에서 610개의 아미노산 단백질로서 존재하고, Bβ는 461개의 아미노산 서열을 포함하고, γ 사슬은 411개의 아미노산을 포함한다. 이들 3개의 폴리펩티드는 3가지 mRNA로부터 개별적으로 합성된다. 3가지 성분 사슬 (Aα, Bβ, 그리고 γ)의 6개-사슬 이합체 (Aα, Bβ, γ)₂로서 최종 형태로의 조립은 소포체 (endoplasmic reticulum, ER)의 내강 (lumen)내에서 일어난다.

섬유소원은 혈액 내에서 높은 농도 (1-2 g/ℓ)로 순환하고 높은 정도의 이질성 (heterogeneity)을 나타낸다. 변이 (variation)는 유전자 다형성 (genetic polymorphism), 당화 (glycosylation)와 인산화 (phosphorylation)에서 차이, Aα 사슬의 카르복시-말단 부분의 (부분적인) 단백분해 (proteolysis), 그리고 선택적 절단접합 (alternative splicing)을 통해 발생한다 (검토를 위해, De Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377; Laurens et al. (2006) J. Thromb Haemost. 4, 932; Henschen-Edman (2001) Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 936, 580을 참조한다). 각 개체에서 대략 1백만 개의 상이한 섬유소원 분자가 순환하는 것으로 추정된다. 전체 섬유소원 중에서 소수 (대부분의 경우에, 몇 % 이하)를 차지하는 이들 변이체 중에서 대부분은 기능과 구조에서 상이하다. Aα 사슬의 카르복시-말단 부분의 단백분해는 명백하게 상이한 분자량 (molecular weight)을 갖는, 섬유소원의 3가지 주요 순환 형태 (circulating form)를 산출한다. 섬유소원은 고분자량 형태 (HMW; 분자량 340 kDa; 순환계에서 Aα 사슬의 우세한 형태는 610개의 아미노산을 포함한다)로 합성된다. 이들 Aα 사슬 중에서 하나의 분해 (degradation)는 저분자량 형태 (LMW; MW = 305 kDa)를 제공한다; 이러한 LMW' 형태 (270 kDa)는 양쪽 Aα 사슬이 카르복시-말단에서 부분적으로 분해되는 변이체이다. 정상적인 혈액에서, 섬유소원 중에서 50 - 70%는 HMW이고, 20 - 50%는 1개 또는 2개의 분해된 Aα 사슬을 보유하는 섬유소원이다 (de Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377). HMW와 LMW' 변이체는 응고 시간 (clotting time) 및 섬유소 중합체 구조 (fibrin polymer structure)에서 명백한 차이를 보인다 (Hasegawa N, Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57, 183).

선택적 절단접합의 결과인 널리 공지된 변이체는 소위, γ' 변이체 및 Fib420 변이체이다.

γ' 변이체는 전체 γ-사슬 중에서 대략 8%를 차지한다. 이는 가장 풍부한 γ-사슬에 대한 411개의 아미노산이 아닌 427개의 아미노산으로 구성된다; 4개의 C-말단 아미노산 (AGDV)은 2개의 황산화 티로신 (sulphated tyrosine)을 포함하는 20개 아미노산으로 대체된다. 섬유소원 γ' 사슬은 혈소판 집합 (aggregation)을 제어하는데 결정적인 혈소판 섬유소원 수용체 IIbβ3에 결합할 수 없다.

420 kDa의 분자량을 갖는 Fib420 변이체는 전체 순환 섬유소원의 1-3%를 차지한다 (de Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377). 선택적 절단접합을 통해, 추가의 개방 해독틀 (open reading frame)이 Aα-사슬의 C-말단에 포함되고, 따라서 이를 237개의 아미노산으로 확장한다. 이들 추가의 아미노산은 결절모양 구조 (nodular structure)를 형성한다. 혈장 유래된 섬유소원은 출혈 (bleeding)을 중단시키고 혈액과 체액 손실을 감소시키기 위한 외과적 개입 (surgical intervention) 동안 임상적으로 적용되는 시판된 섬유소 실란트 (fibrin sealant)의 중요한 성분이다. 이에 더하여, 이는 섬유소의 응집 (agglutination) 특성을 이용함으로써 조직 부착을 촉진하고 상처 치유를 향상시키는데 이용된다. 섬유소원은 또한, 유전성 섬유소원혈증 (fibrinogenemia) 환자 및 후천성 섬유소원 결핍을 앓는 환자에서 섬유소원 결핍을 보충하기 위해 임상적으로 이용된다. 높은 용량의 섬유소원 (3 - 10 gram)의 정맥내 투여는 혈액의 응고를 정상화시키고 다양한 임상적 상황에서 심각한 출혈을 중지시키거나 예방하는 것으로 밝혀졌다.

야생형 (HMW) 형태에서 또는 변이체 (가령, Fib420)로서 인간 섬유소원의 재조합 생산은 혈장 유래된 물질의 이용에 비하여 많은 이점을 갖는다. 이들에는 선호되는 안정성 프로필 (safety profile), 변이체를 순수한 방식으로 만드는 가능성, 그리고 무제한적 공급이 포함된다. 하지만, 경제학적으로 실현가능한 방법으로 이를 생산하기 위해, 완전한 기능성 섬유소원의 높은 발현 수준이 요구된다. 이에 더하여, 특정한 적용 (가령, 정맥내 (IV) 지혈 겸자 (hemostat)로서 섬유소원의 이용)을 위해 적절한 번역후 변경 (post-translational modification) (가령, 당화)이 요구된다.

번역후 변경으로 인하여, 포유동물 시스템에서 발현이 바람직하다. 이런 이유로, 생물학적 활성 재조합 섬유소원은 다양한 세포, 예를 들면, 신생아 햄스터 신장 (baby hamster kidney, BHK) (가령, Farrell et al. (1991) Biochemistry 30, 9414), 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 (가령, Lord, (US6037457), Binnie et al. (1993) Biochemistry 32, 107), 또는 아프리카 사바나원숭이 (African Green Monkey) 유래된 COS 세포 (가령, Roy et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 4758)에서 발현되었다. 하지만, 이들 발현 수준은 대략 1-15 ㎍/㎖에 불과하고 임상적 실시에서 요구되는 대량의 혈장 섬유소원을 대체하기에 부적절한 것으로 간주된다. 이에 더하여, 효모 피키아 파스토리스 (P. pastoris)에서 인간 섬유소원의 발현은 8 ㎍/㎖을 산출하였는데, 이 역시 상업적 제조에 충분하지 않다 (Tojo et al. (2008) Prot. Expr. and Purif. 59, 289).

EP 1 661 989에서는 상업적으로 실현가능한 생산을 위해 적어도 100 ㎎/ℓ의 수율 (yield)이 요구된다고 보고한다. 상기 출원에서, 스피너 플라스크 (spinner flask) 내에서 CHO 세포에 의한 최대 631.5 ㎎/ℓ의 수준이 보고된다. 하지만, 이런 수준에 도달하기 위해, 세포는 배큘로바이러스 P35 항-아폽토시스 (apoptosis) 단백질을 공동-발현해야 하고, 그리고 대사길항물질 (antimetabolite)인 메토트렉세이트 (methotrexate)가 이들 벡터의 증폭에 이용되어야 한다. 세포 밀도는 당업계에서 기준에 비하여 상대적으로 낮다 (스피너 플라스크에서 15일 동안 최대 9.4 x 10⁵개 세포/㎖) (예로써, Wurm (Nature Biotechnol. (2004) 22, 1393)에서는 3-4일간의 계대배양 (subcultivation)에서 2 x 10⁶ 세포/㎖의 일과적인 세포 밀도를 보고한다).

재조합 섬유소원의 성공적인 생산을 위해 가장 중요한 문제는 완전하고 적절하게 조립되며 충분한 생물학적 활성을 갖는 산물을 높은 순도로 어떻게 만들 것인가이다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 진핵 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된 섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관계한다. 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 진핵 세포 배양 시스템에서 완전한 형태로 재조합 섬유소원의 효율적인 발현을 가능하게 한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질 서열은 상응하는 비-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질 서열과 동일하다. 본 발명의 배경에서, 용어 '섬유소원 (fibrinogen)'은 섬유소원의 임의의 형태를 지칭하고, 유전자 다형성 (genetic polymorphism), 당화 (glycosylation)와 인산화 (phosphorylation)에서 차이, Aα 사슬의 카르복시-말단 부분의 (부분적인) 단백분해 (proteolysis), 그리고 선택적 절단접합 (alternative splicing)을 통해 발생하는 변이체를 포함한다, 본 발명의 배경에서, 용어 '알파 사슬'과 'Aα 사슬'은 동의어로서 이용된다. 이들은 신호 서열을 포함하는 644개 아미노산의 섬유소원 알파 사슬 (SEQ ID No. 8), 신호 서열이 없는 625개 아미노산의 전구체 섬유소원 알파 사슬 (SEQ ID No. 8의 아미노산 20 내지 644), 순환계에서 관찰되는 610개 아미노산의 절두된 섬유소원 알파 사슬 (SEQ ID No. 8의 아미노산 20 내지 629), 그리고 신호 서열을 포함하는 866개 아미노산의 Fib420 변이체 알파 사슬 (SEQ ID No. 11) 또는 신호 서열이 없는 Fib420 변이체 알파 사슬 (SEQ ID No. 11의 아미노산 20-866)을 비롯한 알파 사슬의 야생형과 변이체 둘 모두를 지칭할 수 있다.

본 발명의 배경에서, 용어 '베타 사슬'과 'Bβ 사슬'은 동의어로서 이용된다. 이들은 신호 서열을 포함하는 491개 아미노산의 섬유소원 베타 사슬 (SEQ ID No. 9) 및 신호 서열이 없는 461개 아미노산의 섬유소원 베타 사슬 (SEQ ID No. 9의 아미노산 31 내지 491)을 비롯한 베타 사슬의 야생형과 변이체 둘 모두를 지칭할 수 있다.

본 발명의 배경에서, 용어 '감마 사슬'과 'γ 사슬'은 동의어로서 이용된다. 이들은 신호 서열을 포함하는 437개 아미노산의 섬유소원 감마 사슬 (SEQ ID No. 10), 신호 서열이 없는 411개 아미노산의 섬유소원 감마 사슬 (SEQ ID No. 10의 아미노산 27 내지 437), 신호 서열을 포함하는 감마-프라임 사슬인 453개 아미노산의 섬유소원 감마 사슬 (SEQ ID No. 13), 그리고 신호 서열이 없는 감마-프라임 사슬인 427개 아미노산의 섬유소원 감마 사슬 (SEQ ID No. 13의 아미노산 27 내지 453)을 비롯한 감마 사슬의 야생형과 변이체 둘 모두를 지칭할 수 있다.

본 발명의 배경에서, 섬유소원 또는 섬유소원 사슬은 아미노산 서열이 선택적으로, 정상적인 세포 (분비) 처리 동안 제거되는 아미노산 없이, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 모든 아미노산을 포함할 때, '완전한 (intact) 형태로' 존재한다. 이런 이유로, 644개, 625개 또는 610개 아미노산을 보유하는 알파 사슬은 완전한 형태의 알파 사슬의 실례이다.

본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 58%, 더욱 바람직하게는 적어도 60 또는 65%의 GC 함량을 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 대략 55 내지 70%의 범위에서 GC 함량을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 대략 60 내지 65%의 범위에서 GC 함량을 갖는다.

섬유소원 알파, 베타와 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명의 최적화된 뉴클레오티드 서열은 진핵 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된다. 바람직하게는, 이들은 포유동물 세포 배양 시스템, 예를 들면, COS 세포, BHK 세포, NSO 세포, Sp2/0 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, HEK293 세포 또는 곤충 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된다. 더욱 바람직하게는, 이들 뉴클레오티드 서열은 인간 세포 배양 시스템, 예를 들면, PER.C6 세포 또는 HEK293 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된다.

본 발명에 따른 최적화는 적어도 0.90, 바람직하게는 적어도 0.95, 더욱 바람직하게는 적어도 0.97의 코돈 적합화 지수 (codon adaption index)를 갖는다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 적어도 0.95의 코돈 적합화 지수로 CHO 세포에 대한 코돈 이용빈도 적합화 (codon usage adaptation)에 의해 최적화된다.

본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 임의의 유형의 섬유소원 사슬을 인코딩할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 포유동물 섬유소원 사슬을 인코딩하고, 더욱 바람직하게는 이들은 영장류 섬유소원 사슬을 인코딩하고, 가장 바람직하게는 이들은 인간 섬유소원 사슬을 인코딩한다. 또한, 조합, 예를 들면, 2개 또는 1개의 설치류 섬유소원 사슬과 결합된 1개 또는 2개의 포유동물 섬유소원 사슬이 가능하다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 이는 cDNA이다.

섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 각각의 비-최적화된 대응물에 적어도 70% 동일성을 보인다. 한 구체예에서, 섬유소원 알파, 베타와 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명의 최적화된 뉴클레오티드 서열은 각각의 비-최적화된 서열에 70-80% 동일성을 보인다. 바람직하게는, 섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명의 최적화된 뉴클레오티드 서열은 cis-작용 부위, 예를 들면, 절단접합 부위 (splice site) 및 폴리(A) 신호를 포함하지 않는다.

섬유소원 알파 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 인간 섬유소원의 알파 사슬을 인코딩하는 유전자 내에 정상적으로 존재하는 39개 염기쌍 직접 반복 서열을 포함하지 않는다. 알파 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열에서, 이러한 반복 서열은 인코딩된 단백질 서열의 변경 없이 변경된다.

바람직한 구체예에서, 알파 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 4 또는 7에 따른 서열을 포함한다.

섬유소원 알파 사슬을 인코딩하고 이들 서열 중에서 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열 역시 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 4의 뉴클레오티드 60-1932를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 4의 뉴클레오티드 60-1887을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 7의 뉴클레오티드 60-2598을 포함한다. 또한, SEQ ID No. 4 또는 7에 적어도 85%, 적어도 87% 또는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 적어도 94%, 96%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고 섬유소원 알파 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 앞서 예시된 바와 같은 SEQ ID No. 8 또는 11에 따른 서열을 포함하는 섬유소원 알파 사슬 또는 이들 서열의 일부가 본 발명에 포함된다.

바람직한 구체예에서, 베타 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 5에 따른 서열을 포함한다. 섬유소원 베타 사슬을 인코딩하고 상기 서열의 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열 역시 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 5의 뉴클레오티드 93-1473을 포함한다. SEQ ID No. 5에 적어도 85%, 적어도 87% 또는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 적어도 94%, 96%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고 섬유소원 베타 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, SEQ ID No. 9의 아미노산 31 내지 491과 같은 SEQ ID No. 9에 따른 서열을 포함하는 섬유소원 베타 사슬 또는 상기 서열의 일부 역시 본 발명에 포함된다.

바람직한 구체예에서, 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 6에 따른 서열을 포함한다. 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하고 상기 서열의 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열 역시 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 6의 뉴클레오티드 81-1311을 포함한다. SEQ ID No.6에 적어도 85%, 적어도 87% 또는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 적어도 94%, 96%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, SEQ ID No.10의 아미노산 27 내지 437과 같은 SEQ ID No.10에 따른 서열을 포함하는 섬유소원 감마 사슬 또는 상기 서열의 일부 역시 본 발명에 포함된다.

다른 바람직한 구체예에서, 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 12에 따른 서열을 포함한다. 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하고 상기 서열의 일부를 포함하는 뉴클레오티드 서열 역시 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 12의 뉴클레오티드 81-1359를 포함한다. SEQ ID No.12에 적어도 85%, 적어도 87% 또는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 적어도 94%, 96%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, SEQ ID No.13의 아미노산 27 내지 453과 같은 SEQ ID No.13에 따른 서열을 포함하는 섬유소원 감마 사슬 또는 상기 서열의 일부 역시 본 발명에 포함된다.

다른 측면에서, 본 발명은 섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 구조체에 관계한다. 상기 뉴클레오티드 구조체는 프로모터 (promoter), 종결인자 (terminator)와 인핸서 (enhancer)를 비롯하여, 섬유소원 사슬의 발현에 영향을 주는 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드 구조체는 벡터, 예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다. 뉴클레오티드 구조체는 또한, 선별 마커 (selection marker)를 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 본 발명에 따른 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 관계한다. 상기 세포에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드는 이와 같이 또는 구조체 내에, 예를 들면, 발현 벡터 또는 클로닝 벡터 내에 존재할 수 있다. 세포는 전형적으로, 섬유소원의 생산에 이용되는 숙주 세포이다. 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 바람직하게는, 포유동물 세포이다. 포유동물 세포의 적절한 실례에는 곤충 세포, COS 세포, BHK 세포, NSO 세포, Sp2/0 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 그리고 HEK293 세포가 포함된다.

본 발명에 따른 세포는 많은 양의 완전한 생물학적 활성 섬유소원을 생산한다. 세포는 전형적으로, 세포주의 일부이다. 본 발명의 배경에서, 구(句) '많은 양의 완전한 섬유소원을 생산하는 세포 또는 세포주'는 85% 이상, 바람직하게는 90%, 95% 또는 99% 이상의 완전한 산물을 생산하는 세포 또는 세포주를 지칭한다. 바람직하게는, 이는 10, 20 또는 30, 더욱 바람직하게는 40 또는 50 초과의 집단 배가 (population doubling)의 기간 동안 측정된다. 본 발명의 배경에서, '생물학적 활성' 섬유소원은 트롬빈의 존재에서 섬유소로 중합하는 섬유소원을 지칭한다. 이런 세포 또는 세포주 역시 본 발명에 포함된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 세포주는 일일 세포당 적어도 3 피코그램, 더욱 바람직하게는 일일 세포당 적어도 4 또는 5 피코그램, 이보다 더욱 바람직하게는 일일 세포당 적어도 7 또는 10 피코그램의 수준에서 완전한 재조합 섬유소원을 생산한다. 30 x 10⁶개 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는 반응기에서, 일일 세포당 3 피코그램은 일일 반응기 부피 ℓ당 90 ㎎ 섬유소원에 해당하고, 일일 세포당 5 피코그램은 일일 ℓ당 150 ㎎ 섬유소원에 해당하고, 일일 세포당 7 피코그램은 일일 ℓ당 210 ㎎ 섬유소원에 해당한다. 바람직하게는 세포 집단의 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 세포 집단의 적어도 60%, 70% 또는 80%, 가장 바람직하게는 세포 집단의 적어도 90%, 95% 또는 99%가 일일 세포당 적어도 3 피코그램, 더욱 바람직하게는 일일 세포당 적어도 5 피코그램, 이보다 더욱 바람직하게는 일일 세포당 적어도 7 피코그램을 생산한다.

많은 양의 완전한 섬유소원을 생산하는 세포 또는 세포주의 선별은 바람직하게는, 프로테아제 저해물질의 발현 없이 수행된다. 한 구체예에서, 선별은 알파 사슬의 완전한 N-말단 및 알파 사슬의 완전한 C-말단에 결합하는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체를 이용하여 수행된다. 이런 항체의 적절한 상업적으로 가용한 실례에는 Koppert et al. (1985) Blood 66, 503에서 기술된 Y18 항체, 그리고 Hoegee-de Nobel et al. (1988) Thromb. Haemost. 60(3) 415에서 기술된 G8 항체가 포함된다. 바람직하게는, 이러한 선별은 혈청-없는 환경 (serum-free environment)에서 수행된다. 완전한 섬유소원을 생산하는 세포주의 선별을 위한 이러한 방법 역시 본 발명의 일부이다. 다른 측면에서, 본 발명은 진핵 세포 배양 시스템에서 섬유소원을 생산하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 섬유소원이 생산되는 조건 하에 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 세포주를 배양하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 생산된 섬유소원은 회수된다. 최적화된 사슬 및 비-최적화된 사슬은 결합될 수 있다. 비-최적화된 사슬은 유전자 조작에 의해 또는 합성에 의해 획득될 수 있고, 그리고 이들은 최적화된 사슬이 아닌 다른 출처로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 섬유소원 분자당 1개의 사슬만 본 발명에 따른 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고, 반면 다른 2개의 사슬은 최적화되지 않은 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 섬유소원 분자당 3개의 섬유소원 사슬 중에서 2개가 본 발명에 따른 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 바람직한 구체예에서, 3개의 섬유소원 사슬 모두 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 혈장 유래된 섬유소원과 대조적으로, 이러한 방법으로 생산된 섬유소원 제조물은 특정한 섬유소원 사슬이 생산되기 때문에, 상당히 균질할 것이다. 상기 방법은 혈장 내에서 극히 소량으로 존재하는, 변이체로 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 바람직하게는 95%, 98% 또는 99% 이상 구성되는 섬유소원 제조물의 생산을 가능하게 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 여러 의학적 적용을 위한 섬유소원의 제조에서 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열의 용도에 관계한다. 한 가지 적용에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 출혈 (bleeding)을 중단시키고 혈액과 체액 손실을 감소시키기 위한 외과적 개입 (surgical intervention) 동안 임상적으로 적용되는 섬유소 실란트 (fibrin sealant)에서 이용을 위한 섬유소원을 제조하는데 이용된다. 다른 적용에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 섬유소의 응집 (agglutination) 특성을 이용함으로써 조직 부착을 촉진하고 상처 치유를 향상시키기 위한 섬유소원을 제조하는데 이용될 수 있다. 또 다른 적용에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 섬유소원의 정맥내 투여로 선천성 또는 후천성 (가령, 외상후 또는 수술 동안 출혈을 통해) 섬유소원 결핍을 앓는 환자에서 급성 출혈 에피소드 (acute bleeding episode)의 치료를 위해 임상적으로 이용되는 섬유소원을 제조하는데 이용될 수 있다. 시판되는 혈장 유래된 섬유소원 제조물은 리아스탑 (Riastap) (CSL Behring LLC; US에서 시판됨) 및 해모컴플레탄 (Haemocomplettan) (CSL Behring AG; Europe에서 시판됨)이다. 재조합 섬유소원 제조물은 선호되는 안정성 프로필 (safety profile), 무제한적 공급, 그리고 특정한 징후에 대한 바람직한 활성 프로필 (activity profile)을 갖는 섬유소원 변이체를 순수한 방식으로 제조하는 가능성을 비롯하여, 혈장 유래된 제조물에 비하여 많은 이점을 갖는다.

도면의 간단한 설명
도 1. Aα, Bβ와 γ 사슬을 인코딩하는 야생형 구조체와 코돈 최적화된 구조체로 CHO 세포의 형질감염 (transfection)후 1, 2, 3과 6일 시점에 재조합 인간 섬유소원의 발현의 수준. 실험은 이중으로 수행되었다, (opt) 최적화된 서열; (wt) 야생형 서열.
도 2. Aα, Bβ와 γ 사슬을 인코딩하는 코돈 최적화된 구조체 및 Aα-확장, Bβ와 γ 사슬 (Aα-ext.(opt) + Bβ(opt) + γ(opt)로 표시됨)을 보유하는 코돈 최적화된 구조체 (Aα(opt) + Bβ(opt) + γ(opt)로 표시됨)로 CHO 세포의 형질감염 (transfection)후 1, 2, 3과 6일 시점에 재조합 인간 섬유소원의 발현의 수준. 실험은 이중으로 수행되었다.
도 3. 재조합 인간 섬유소원을 발현하는 클론 M21, M25와 M57의 배치 런 (batch run)으로부터 배양 상층액의 웨스턴 블롯 분석. 대조 레인 (contr)은 혈장 유래된 야생형 섬유소원 (FIB3, Enzyme Research Laboratories)을 포함한다. 화살표는 Aα 사슬의 붕괴 산물을 지시한다.
도 4. 확장된 Aα 사슬을 보유하는 변이체 인간 섬유소원 (Fib420)을 발현하는 클론 P40의 배치 런으로부터 배양 상층액의 웨스턴 블롯 분석. 레인 1은 혈장 유래된 야생형 섬유소원 (FIB3, Enzyme Research Laboratories)을 포함하는 대조이다. 레인 2와 3은 각각, 배치 런의 4일과 7일 시점에 채취된, 클론 P40 Aα-확장의 배양 상층액을 포함한다.
도 5. γ' 포함 인간 섬유소원으로 일시적으로 형질감염된 PER.C6 세포의 배양 상층액의 웨스턴 블롯 분석 (상세는 실시예 9에서 기술된다). 레인 1은 재조합 γ' 섬유소원을 발현하는 PER.C6 세포의 배양 상층액을 포함한다. 레인 2는 혈장 유래된 야생형 섬유소원 (FIB3, Enzyme Research Laboratories)을 포함하는 대조이다.
도 6. PNGase F 처리에 의한 N-당화에 대한 섬유소원의 분석, 그 이후에 SDS-PAGE 분석.
레인은 아래와 같이 적하 (loading)된다:
MW: 분자량 마커 (BenchMark, Invitrogen)
ERL FIB3: PNGase F로 처리된 (+), 또는 PNGase F로 처리되지 않은 (-) 혈장 유래된 섬유소원 (ERL).
PER.C6 fbg: PNGase F로 처리된 (+), 또는 PNGase F로 처리되지 않은 (-) PER.C6 유래된 섬유소원.
2 ㎍의 섬유소원이 레인마다 적하되었다; 염색은 Coomassie Blue를 이용하여 수행되었다. 분석은 환원된 10% BisTris 겔 (NuPage, Invitrogen)을 이용하여 수행되었다.
도 7. ROTEM 분석: 응고 시간.
응고 시간은 ROTEM 분석에 의해 결정되었다. 200 ㎕의 정상 혼주 (구연산염) 혈장, 또는 해모컴플레탄 (CSL Behring GmbH, Marburg, Germany) 또는 PER.C6 섬유소원 (둘 모두, TBS에서 2 ㎎/㎖)과 1:1 혼합된 10O ㎕의 정상 혼주 (구연산염) 혈장. CaCl₂가 17 mM의 최종 농도로 첨가되었다. 응고를 일으키기 위하여, α-트롬빈이 1 IU/㎖의 최종 농도로 첨가되었다. 총 반응 부피 (total reaction volume)는 240 ㎕이었다. 상기 도면에서는 섬유소원과 1:1 혼합된 혈장에 대한 응고 시간 (second)을 나타낸다.
1. 혈장 유래된 섬유소원 (CSL Behring, Marburg, Germany)
2. PER.C6 유래된 섬유소원
모든 측정은 이중으로 수행되었다.
도 8. ROTEM 분석: 응고덩어리 단단함. 응고덩어리 단단함은 ROTEM 분석에 의해 결정되었다. 상기 도면에서는 섬유소원과 1:1 혼합된 혈장에 대한, 10분 시점에 응고덩어리의 단단함인 A10 값 (mm)을 나타낸다. 실험 상세는 도 7의 범례 (legend)에서 기술된 바와 동일하다.
1. 혈장 유래된 섬유소원 (CSL Behring, Marburg, Germany)
2. PER.C6 유래된 섬유소원
모든 측정은 이중으로 수행되었다.
도 9. ROTEM 분석: 응고덩어리 형성 시간. 건강한 개체로부터 구연산첨가 혈액은 링거 젖산 (Baxter, Utrecht, The Netherlands)으로 희석되거나, 또는 희석되지 않았다. 차후에, 링거 젖산으로 희석된 혈액은 혈장 유래된 섬유소원 또는 재조합 섬유소원으로 보충되거나, 또는 보충되지 않았다 (대조).
상기 도면에서는 아래를 도시한다:
1. 300 ㎕ 혈액
2. 150 ㎕ 혈액, 100 ㎕ 링거 젖산 (RL), 50 ㎕ TBS
3. 150 ㎕ 혈액, 100 ㎕ RL, 50 ㎕ 해모컴플레탄 6.5 ㎎/㎖ (1.1 ㎎/㎖ 최종 농도)
4. 150 ㎕ 혈액, 100 ㎕ RL, 50 ㎕ 재조합 hFbg 6.5 ㎎/㎖ (1.1 ㎎/㎖ 최종 농도).
모든 조건에서 20 ㎕ star-TEM과 20 ㎕ ex-TEM 시약 (Pentapharm GmbH, Munich, Germany)이 응고를 일으키는데 이용되었다.
정상 범위 (35 - 160 sec)는 건강한 개체에서 관찰된 값이다. 160 - 220 sec의 CFT 값은 손상되지 않은 정상적인 지혈 (haemostasis)을 갖지만 예비 (reserve)가 감소된 환자에서 관찰된다.
도 10. ROTEM 분석: 응고덩어리 단단함. 건강한 개체로부터 구연산첨가 혈액은 링거 젖산 (Baxter, Utrecht, The Netherlands)으로 희석되거나, 또는 희석되지 않았다. 차후에, 링거 젖산으로 희석된 혈액은 혈장 유래된 섬유소원 또는 재조합 섬유소원으로 보충되거나, 또는 보충되지 않았다 (대조).
측정 조건은 아래와 같았다:
1. 300 ㎕ 혈액
2. 150 ㎕ 혈액, 100 ㎕ 링거 젖산 (RL), 50 ㎕ TBS
3. 150 ㎕ 혈액, 100 ㎕ RL, 50 ㎕ 해모컴플레탄 6.5 ㎎/㎖ (1.1 ㎎/㎖ 최종 농도)
4. 150 ㎕ 혈액, 100 ㎕ RL, 50 ㎕ 재조합 hFbg 6.5 ㎎/㎖ (1.1 ㎎/㎖ 최종 농도).
모든 조건에서, 20 ㎕ star-TEM과 20 ㎕ ex-TEM 시약 (Pentapharm GmbH, Munich, Germany)이 응고를 일으키는데 이용되었다.
정상 범위 (53 - 72 mm)는 응고 질환이 없는 건강한 환자에서 관찰되는 값이다. 환자에서 관찰된 45 - 40 mm의 MCF 값은 출혈 위험 (bleeding risk)을 지시한다.

실시예

실시예 1 최적화된 cDNA 구조체의 제조.

인간 섬유소원 폴리펩티드 사슬 Aα, Bβ, γ, Aα-확장 (Fib420), 그리고 γ'를 코딩하는 cDNA는 GeneArt (Regensburg, Germany)에 의해, 야생형 형식 (본 실시예에서, 비-최적화된 형식을 지칭함) 및 코돈 최적화된 형식 둘 모두로 합성되었다: (i) cis-작용 부위 (절단접합 부위, 폴리(A) 신호)가 제거되었다; (ii) Aα 사슬의 반복 서열이 변형되었다; (iii) 연장된 mRNA 반감기 동안 GC 함량이 증가되었다; (iv) 코돈 이용빈도가 CHO에 순응되었다 (코돈 적합화 지수 - CAI- > 0.95). 이용된 야생형 기준은 알파 사슬의 경우 NM_021871, 베타 사슬의 경우에 NM_005141, 그리고 감마 사슬의 경우에 NM_000509이었다.

야생형 형식에서 Aα (SEQ ID No. 1 ), Bβ (SEQ ID No. 2)와 γ (SEQ ID No. 3) 사슬을 코딩하는 cDNA 및 최적화된 Aα (SEQ ID No. 4), Bβ (SEQ ID No. 5)와 γ (SEQ ID No. 6) 사슬을 코딩하는 cDNA는 비교되고, 그 결과는 표 1에 제시된다. 최적화된 Aα-확장 (Fib420) (SEQ ID No.7) 및 γ' 서열 (SEQ ID No.12) 역시 표 1에 제시된다.

야생형 알파 (SEQ ID No. 1), 베타 (SEQ ID No. 2)와 감마 (SEQ ID No.3) 사슬 cDNA 및 최적화된 알파 (SEQ ID No. 4), 베타 (SEQ ID No. 5)와 감마 (SEQ ID No. 6) 사슬 cDNA는 pcDNA3.1 유도체에서 서브클로닝 (subcloning)되었다. pcDNA3.1(+) neo에서 야생형- 및 최적화된- Aα-사슬, 그리고 Aα-확장 (Fib420) 둘 모두, pcDNA3.1(+)hygro에서 양쪽 Bβ 사슬, 그리고 pcDNA3.1(-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)에서 양쪽 γ 사슬. 최적화된 γ'-사슬은 pcDNA3.1(+) hygro에 서브클로닝되었다.

섬유원소 사슬	일치 (%)	코돈 적합도 지수 (CAI)		GC 함량 (%)
	Wt/opt	야생형	최적화	야생형	최적화
Aα 사슬	72	0.71	0.97	48	65
Bβ 사슬	77	0.69	0.96	45	60
γ 사슬	76	0.68	0.97	42	60
Fib420 Aα 사슬	72	0.71	0.98	48	63
γ' 사슬	75	n.d.	0.97	42	60

실시예 2 CHO 세포에서 코돈-최적화된 섬유소원 서열과 야생형 섬유소원 서열의 일시적인 발현.

최적화된 서열이 단백질 발현을 향상시키는 지를 확증하기 위하여, 일시적인 형질감염이 제조업체의 사용설명서에 따라, CHO-S 세포 (Invitrogen, Carlsbad, USA)에서 수행되었다. 간단히 말하면, CHO-S 세포는 8mM L-글루타민으로 보충된 FreeStyle 배양 배지에서 0.6 x 10⁶개 세포/㎖로, 형질감염 전일에 접종되었다. 형질감염 당일에, 세포는 125 ㎖ 진탕 플라스크 (Corning Life Sciences, Corning, USA) 내에 15 ㎖ 배지에서 1 x 10⁶개 세포/㎖의 농도로 희석되었다. 총 18.75 ㎍ 발현 플라스미드 (각각의 개별 사슬에서 6.25 ㎍)는 0.3 ㎖ OptiPro SFM과 혼합되었다. 차후에, 0.3 ㎖ FreeStyle MAX 형질감염 시약 (OptiPro SFM에서 16x 희석됨)이 첨가되고 부드럽게 혼합되었다. 실온에서 10분간 배양후, DNA-FreeStyle MAX 믹스가 CHO-S 세포에 서서히 첨가되고 진탕 플라스크를 천천히 빙빙 돌았다. 실험은 이중으로 수행되었다.

형질감염된 세포는 125 rpm으로 회전하는 오비탈 쉐이커 플랫폼 (orbital shaker platform) 상에서 37℃, 5% CO₂에서 배양되었다. 형질감염후 1, 2, 3, 그리고 6일 시점에, 재조합 섬유소원 발현을 측정하기 위해 샘플이 수집되었다.

단백질 발현은 인간 섬유소원에 특이적인 ELISA로 측정되었다. 공인된 Maxisorb Elisa 평판 (Nunc, Thermofisher Scientific, Roskilde, Denmark)은 인간 섬유소원에 대하여 발생된 100 ㎕ 10 ㎍/㎖ G8 단일클론 항체 (TNO KvL, Leiden, The Netherlands) (Hoegee-de Nobel et al. (1988) Thromb. Haemost. 60(3) 415)로 PBS (Invitrogen)에서 4℃에서 하룻밤동안 코팅되었다. 이후, 이들 평판은 PBST (PBS/0.05% Tween20 정제, Calbiochem, EMD, San Diego, USA)로 세척되고, 그리고 100 ㎕의 배양 상층액 샘플 또는 섬유소원 표준이 첨가되었다. 상기 섬유소원 표준은 아래의 농도로 PBST에서 용해되고 희석된 섬유소원(FIB3 인간 섬유소원, Enzyme Research Laboratories (ERL), Swansea, UK)을 포함하였다: 100 - 75 - 50 - 25 - 12.5 - 6.25 - 3.125 - 0 ng/㎖. 조직 배양 상층액 샘플은 PBST에서 1:10 - 1:500 희석되었다. 실온에서 1시간 배양후, 이들 평판은 웰 (well)당 200㎕ PBST로 3회 세척되고 종이 타월에서 가볍게 두드려서 건조되었다. 이후 PBST에서 1:10,000 희석된 10O ㎕의 HRP 접합된 Y18 단일클론 항체 (TNO KvL, Leiden, The Netherlands)가 첨가되었다. 이는 실온에서 1시간 동안 배양되고, 그 이후에 이들 평판은 웰당 200㎕ PBST로 4회 세척되었다; 각 세척 단계후, 이들 평판은 종이 타월에 가볍게 두드려서 건조되었다. 이후, 10O ㎕ TMB Ultra (Pierce, Thermofisher Scientific, Rockford, USA)가 각 웰에 첨가되고, 그 이후에 실온에서 4-30분 동안 배양되었다. 상기 반응은 각 웰에 100 ㎕ 2M H₂SO₄ (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)의 첨가로 중단되고, 그리고 OD450은 ELISA 평판 판독기를 이용하여 결정되었다.

획득된 결과는 도 1에 도시된다. 상기 데이터는 이들 최적화된 서열이 샘플이 분석된 모든 시점에서 섬유소원의 발현을 극적으로 향상시킨다는 것을 명백하게 증명한다. 최적화된 구조체에 대한 발현 수준에서 증가 범위는 7.9 - 10.5배이다.

실시예 3 혈청-없는 배양된 CHO 세포에서 코돈-최적화된 섬유소원 420의 일시적인 발현.

형질감염과 분석은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 본 실험에 이용된 확장된 Aα-사슬 cDNA 서열은 최적화된 확장된 Aα 서열 (SEQ ID No. 7)이고 847개 아미노산 (SEQ ID No. 11)의 분비된 폴리펩티드를 코딩한다.

획득된 결과는 도 2에 도시되고, 섬유소원 변이체, 본 실시예의 경우에 확장된 Aα 사슬을 보유하는 Fib420 변이체의 발현 수준이 최적화된 '야생형' Aα-사슬 변이체에 대한 강화된 수준과 동일한 범위 내에 있다는 것을 명백하게 증명한다.

실시예 4 혈청-없는 조건 하에 코돈-최적화된 섬유소원 cDNA로부터 인간 섬유소원을 안정적으로 발현하는 CHO 세포의 산출.

본 실시예에서 기술된 세포주 산출을 위하여, 서열-최적화된 pcDNA3.1 유래된 플라스미드가 실시예 1에 기술된 바와 같이 이용되었다. 간단히 말하면, CHO-S 세포 (Invitrogen)는 제조업체의 사용설명서에 따라, 8mM L-글루타민 (Invitrogen)으로 보충된 FreeStyle 배지 (Invitrogen)에서 계대배양되었다. 일과적으로, 세포는 10% (v/v) 배양 배지 (=12.5 ㎖)를 포함하는 125 ㎖ 진탕 플라스크 형식에서 배양되었다. 배양액은 37℃와 5% CO₂에서 가습된 배양기 내에 125 rpm으로 수평으로 진동하는 플랫폼 상에 배치되었다. CHO-S 세포 (invitrogen)의 형질감염은 제조업체의 사용설명서에 따라 수행되었다. 형질감염후, 배양액은 37℃와 5% CO₂에서 가습된 배양기 내에 125 rpm으로 수평으로 진동하는 플랫폼 상에서 하룻밤동안 배양되었다.

형질감염 익일에, 세포는 계수되고, 그리고 8 mM L 글루타민, 그리고 선별제 (selection agent) 제네티신 (Geneticin) (Invitrogen)과 히그로마이신 (Hygromycin) B (Invitrogen) (둘 모두 500 ㎍/㎖의 최종 농도로) 보충된 FreeStyle 배지 (이후, "선별 배지")에서 96-웰 평판 (접종 밀도 (seeding density) 200 세포/well) 내로 접종되었다. 각 웰에서 배양 부피 (culture volume)은 100-200 ㎕이었다. 평판은 정지 조건 하에 37℃와 5% CO₂에서 가습된 배양기 내에 배치되었다. 배지는 100 ㎕ 선별 배지로 주2회 교체되었다. 이들 평판은 세포 성장에 대하여 현미경적으로 스크리닝 (screening)되었다. 10일후, 내성 클론이 명백해졌다. 이들 클론은 500 ㎕ 선별 배지를 포함하는 48-웰 평판 내로 이전되었다.

클론이 대략 50% 합류 (confluence)에 도달할 때, 배지는 샘플링 (sampling)되고 섬유소원 발현 수준에 대한 ELISA 분석이 수행될 때까지 -20℃에서 보관되었다 (실시예 2 참조). ELISA 결과에 기초하여, 섬유소원에 대하여 양성인 클론은 6-웰 평판으로 계대-배양되었다. 다시 한 번, 각 클론의 대략 50% 합류 배지가 샘플링되고 ELISA에 의해 발현에 대하여 분석되었다. ELISA 데이터에 기초하여, 선별된 높은 발현 클론은 T25 플라스크로 이전되고, 3 - 5일후 T75 cm² 플라스크로 이전되었다. 이후, 세포는 진탕 배양액으로 이전되고, 여기서 이들은 12.5 ㎖ 선별 배지를 포함하는 125 ㎖ 진탕 플라스크에서 0.2 x 10⁶개 생존 세포/㎖의 농도로 접종되었다. 플라스크는 37℃와 5% CO₂에서 가습된 배양기 내에 125 rpm으로 ELMI 수평 진탕기 상에 배치되었다. 0.5 x 10⁶개 생존 세포/㎖ 이상의 세포 밀도에 도달한 이후, 세포는 재현가능 성장 특징이 확립될 때까지 (통상적으로, 2주 이내), 0.2 x 10⁶개 생존 세포/㎖의 접종 농도로 주3회, 새로운 배지를 포함하는 새로운 125 ㎖ 진탕 플라스크 내로 계대-배양되었다. 선별된 클론의 배양액은 선별 배지에 유지되었다.

배치 검사 (batch testing)를 위하여, 진탕 배양액은 125 ㎖ 진탕 플라스크 내에 8 mM L-글루타민으로 보충된 12.5 ㎖ FreeStyle 배지에서 선별된 클론으로 시작되었다. 이들 배양액은 0.2 x 10⁶개 생존 세포/㎖로 접종되었다. 플라스크는 37℃와 5% CO₂에서 가습된 배양기 내에 125 rpm으로 DOS-10-ELMI 수평 진탕기 상에 배치되었다. 샘플은 접종후 1, 2, 3, 4, 그리고 7일 시점에 수집되고, 그리고 전체 세포 수와 생존능 (viability) (Trypan Blue 염색에 의해)이 결정되었다. 이들 샘플은 300 x g 원심분리에 의해 세포로부터 제거되고, 그리고 상층액은 섬유소원 농도가 결정될 수 있을 때까지 -20℃에서 보관되었다.

웨스턴 블롯팅 (western blotting)을 위하여, 섬유소원을 포함하는 샘플은 5㎕ 4x 농축된 NuPAGE LDS 샘플 완충액 (Invitrogen, Paisley, UK) 및 2㎕ 10x 농축된 NuPAGE 샘플 환원제 (Invitrogen)와 혼합되었다. 최종 부피는 탈이온수 (Invitrogen/Gibco)로 20 ㎕로 조정되었다. 샘플은 70℃에서 10분 동안 가열되고, 제조업체의 사용설명서에 따라 NuPAGE Novex 겔 (10%; Bis-Tris Mini gel, Invitrogen)에 적하되었다. 상기 겔은 200 볼트에서 1시간 동안 이동되었다. 블롯팅 완충액은 44 ㎖ 25x Novex Tris-글리신 이동 완충액 (Invitrogen), 836 ㎖의 순수 (demiwater)와 220 ㎖의 메탄올 (Merck)을 혼합함으로써 제조되었다. 생성된 용액은 -20℃에서 최소 30분 동안 예냉처리되었다. 한 조각의 PVDF 막 (Pierce)은 메탄올에서 대략 15초 동안 활성화되었다. 상기 막, 6개 조각의 겔 블롯팅 페이퍼 (Gel Blotting Paper)와 2개의 블롯팅 패드는 이후, 블롯 완충액 (blot buffer)에서 수분 동안 배양되었다. 상기 막은 -20℃에서 동결된 차가운 팩 (pack)을 유지하는 블롯팅 챔버 (blotting chamber) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) 내에 놓인 블롯카세트 (blotcassette)에서 겔 상에 배치되었다. 단백질 이동은 1시간 동안 겔/막 어셈블리 (gel/membrane assembly)를 교차하여 100 볼트에서 수행되었다.

막 상에서 섬유소원 띠를 가시화시키기 위하여, 상기 블롯은 플랫폼 진탕기 상에서 50 ㎖ 차단 완충액 (PBS에서 3% 저지방 우유 분말 (Elk, Campina, Meppel, The Netherlands))에서 배양되었다. 이후, 상기 블롯은 50 ㎖ 세척 완충액 (PBS에서 0.05% Tween20)에서 10분 동안 세척되고 HRP 접합된 단일클론 항체 Y18/PO (Koppert et al. (1985) 66, 503)의 1/2000 희석액을 포함하는 10 ㎖의 차단 완충액과 함께 1시간 동안 배양되었다. 이후, 상기 블롯은 50 ㎖ 세척 완충액에서 2 x 짧은 시간 (1분 이하), 1 x 15분, 그리고 3 x 5분 세척되고, 그 이후에 50 ㎖ PBS에서 10분간 배양되었다.

이들 띠는 ECL (cat# 32209, Pierce)로 가시화되었다. 이미지는 ChemiDoc-lt Imaging System (UVP, California, US)을 이용하여 포착되었다.

안정된 클론의 복수 라운드의 산출이 수행되었다. 7일 배치 (batch) 배양액에서 3 이상의 일일 세포당 피코그램 (pcd)을 생산하는 클론만 수집되었다. 일부 클론은 7일 배치 (batch) 배양액에서 5 pcd 이상을 생산하였다.

앞서 지시된 바와 같이, 클론은 섬유소원 생산 및 생산된 섬유소원의 속성 둘 모두에 대하여 조사되었다. 일부 클론은 높은 수준의 완전한 섬유소원을 생산하고, 다른 클론은 완전한 산물을 산출하지만 분해 산물 역시 보였다. Aα-사슬은 Bβ와 γ에 비하여 단백분해에 가장 민감하고, 따라서 일차 스크리닝 도구 스크리닝 (primary screening tool screening)은 가장 먼저, 보전성 (integrity)에 대하여 Aα 사슬을 조사하는데 집중하였다. 전형적인 실례는 도 3에 도시되는데, 여기서 클론 M21은 Aα 사슬의 분해를 명백하게 보이는 반면, M25와 M57은 그렇지 않다. Bβ와 γ의 보전성에 대한 이들 샘플의 웨스턴 블롯 분석은 Aα 사슬이 단백분해 붕괴를 보이긴 하지만, 이들 사슬이 여전히 완전하다는 것을 증명하였다.

실시예 5 인간 변이체 Fib 420을 발현하는 안정된 세포주의 산출.

인간 섬유소원의 변이체를 발현하는 안정된 세포주, 다시 말하면, 확장된 Aα 사슬 (625개가 아닌 847개 아미노산)을 보유하는 Fib 420 변이체가 산출되었다. 코돈 최적화된 구조체 (SEQ ID No. 7)가 이용되고, 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 혈청-없는 조건 하에 클론이 산출되었다.

7일 배치 배양에서 3 이상의 pcd를 생산하는 2가지 양성 클론의 상층액은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 완전한 확장된 Aα 사슬 (Fib420)에 대하여 조사되었다. 명백하게, 높은 생산 클론에서도, Fib420의 Aα 사슬은 확장되고 완전하였다 (도 4).

실시예 6 혈청-없는 조건 하에 코돈-최적화된 섬유소원 cDNA로부터 인간 섬유소원을 안정적으로 발현하는 PER.C6 세포의 산출.

PER.C6 세포 (Fallaux et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9(13) 1909)는 재조합 인간 섬유소원의 발현을 위한 숙주로서 이용되었다. 간단히 말하면, PER.C6 세포는 mAb 배지 (SAFC, Hampshire, UK)에서 현탁으로 배양되고, AMAXA (Lonza, Cologne, Germany) 뉴클레오펙션 (nucleofection) 장치 (프로그램 A-27, Nucleofector kit T 이용)를 이용하여, 인간 섬유소원 단백질의 3가지 상이한 사슬 (Aα-, Bβ-, 그리고 γ 사슬)을 인코딩하고 최적화된 cDNA 사슬 (각각, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, 그리고 SEQ ID No.6)을 보유하는 3개의 벡터로 형질감염되었다.

뉴클레오펙션 이후, 세포는 T-플라스크에서 하루 동안 배양되고, 차후에 96-웰 평판 (Greiner, Alphen a/d Rijn, The Netherlands)에서 1000 - 3000개 세포/웰의 밀도로 접종되었다. 이후, 125 ㎍/㎖ 제네티신 (Invitrogen)을 포함하는 mAb 배지가 첨가되었다. 대략 3주후, 96-웰 평판의 개별 웰 중에서 대략 10 - 30%에서 클론이 나타났고, 이들은 차후에, 48-, 24-와 6-웰 평판으로 확대되고, 그 이후 T25와 T80 배양 플라스크 내로 계대배양되었다. 이러한 확대 동안, 배양액은 인간 섬유소원의 발현 수준에 대하여 스크리닝 (screening)되었다. 낮은-발현 세포 및 비-발현 세포는 폐기되었다. 차후에, 세포는 진탕 플라스크 (125 ㎖, Corning)에서 배양되었다.

전체적으로, 579개 클론이 96-웰 평판에서 확인되었다. 확대 동안 섬유소원 발현 수준에 기초하여, 43개 클론이 선별되고 진탕 플라스크로 계대배양되었다. 이들 43개의 재조합 인간 섬유소원 생산 PER.C6 세포주 중에서 10개가 성장 특징 및 생산 특징에 기초하여, 최초 배치 검사를 위해 선별되었다. VPRO 배지 (SAFC)에서 6개의 선별된 PER.C6® 세포주의 배치 검사는 최대 279 ㎎/ℓ 재조합 인간 섬유소원의 용량 생산 수준, 그리고 19.8 pcd의 비생산성 (specific productivity)을 보였다. 최종적으로, VPRO 배지에서 배치 배양은 샘플링의 시점에 배지 교체와 함께 수행되었고, 이는 최대 515 ㎎/ℓ 재조합 인간 섬유소원의 누적 용량 생산 수준을 산출하였다.

실시예 7 610개 아미노산의 Aα-사슬을 보유하는 인간 섬유소원을 발현하는 안정된 PER.C6 세포주의 산출

혈액 순환계에서 혈장 섬유소원의 우세한 형태의 Aα610을 인코딩하는 발현 플라스미드를 산출하기 위하여, Aα 사슬의 아미노산 1 - 610을 인코딩하는, 앞서 기술된 바와 같이 최적화된 cDNA 단편 (서열 ID 8)은 표준 절차에 따라, 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+) neo 내로 클로닝되었다. 재조합 인간 섬유소원을 생산하는 PER.C6 세포주의 산출은 앞서 기술된 바와 유사하다 (실시예 6 참조). Aα-, Bβ-, 그리고 γ 사슬에 이용되는 서열은 각각, SEQ ID No.8, SEQ ID No.5, 그리고 SEQ ID No.6이었다.

PER.C6 세포의 형질감염 및 96-웰 평판에서 도말 이후, 310개 클론이 48-웰 평판으로 이전되고 스크리닝되었다. 확대 경로 (expansion path)의 종결 시점에, 이들 310개의 클론 중에서 24개가 진탕 플라스크로 이전되고, 이들 중에서 최초 배치 검사 (batch test)후, 배치 배양 (batch culture)에서 안정성과 생산성 검사를 위해 8개가 선별되었다.

배치 배양에서 수율은 625개 아미노산 형식으로 Aα-사슬을 발현하는 세포주로 획득된 수율과 유사하였는데, 이는 610개 아미노 형태를 코딩하는 cDNA로부터 Aα 사슬의 발현이 발현 수준을 감손시키지 않는다는 것을 명백하게 증명하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석을 이용한 단백질 분석은 재조합 섬유소원이 완전한 형식으로 생산된다는 것을 지시하였다.

실시예 8 확장된 Aα-사슬에 기초된 재조합 인간 섬유소원 (Fib420 변이체)을 발현하는 PER.C6 세포주

재조합 인간 섬유소원을 생산하는 PER.C6 세포주의 산출은 앞서 기술된 바와 유사하다 (실시예 6과 7 참조). 요약하면, Aα-, Bβ-, 그리고 γ 사슬에 이용되는 서열은 각각, SEQ ID No. 7, SEQ ID No.5, 그리고 SEQ ID No.6이다. 형질감염 및 96-웰 평판에서 도말 이후, 325개 클론이 48-웰 평판으로 이전되고 스크리닝되었다. 확대 경로 (expansion path)의 종결 시점에, 24개의 클론이 진탕 플라스크로 이전되고, 이들 중에서 연속된 배치 배양 검사에서 안정성과 발현 분석을 위해 8개가 선별되었다.

배치 배양에서 수율은 610개 또는 625개 아미노산 형식으로 Aα-사슬을 발현하는 세포주로 획득된 수율과 유사하였는데, 이는 상기 Aα 사슬의 확대가 발현 수준을 감손시키지 않는다는 것을 지시하였다. 이는 이전에 예상되지 못하였는데, 그 이유는 혈장 유래된 섬유소원이 610/625 Aα-사슬 보유 섬유소원에 비하여 단지 1-3%의 확장된 Aα-사슬을 포함하기 때문이다. SDS-PAGE를 이용한 단백질 분석 및 웨스턴 블롯팅 분석은 재조합 섬유소원이 완전한 형식으로 생산되고, α-사슬이 예상된 크기 (도 4에 도시된 바와 같이 Fib420로부터 CHO 생산된 Aα-사슬과 유사한)를 갖는다는 것을 지시한다.

실시예 9 혈청-없는 배양된 CHO 세포에서 γ' 코돈-최적화된 섬유소원의 일시적인 발현.

일시적인 형질감염 및 분석은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행되었다. 본 실험에 이용된 확장된 γ'-사슬 cDNA 서열은 최적화된 확장된 γ' 서열 (SEQ ID No. 12)이고 453개 아미노산의 폴리펩티드를 코딩한다. 신호 펩티드의 제거후, 427개 아미노산의 분비된 폴리펩티드 (SEQ ID No. 13의 아미노산 27 내지 453)가 산출된다.

획득된 결과는 이들 γ' 사슬을 보유하는 섬유소원 변이체의 발현 수준이 최적화된 '야생형' 변이체에 대한 강화된 수준과 동일한 범위 내에 있다는 것을 증명하였다. 배양 상층액은 웨스턴 블롯팅 분석으로 분석되었다. 획득된 결과 (도 5)는 레인 1에서 γ'-사슬 재조합 섬유소원이 레인 2에서 '야생형' 섬유소원보다 느리게 이동한다는 것을 증명한다. 이는 재조합 섬유소원에서 γ'-사슬이 혈장 유래된 섬유소원에서 γ-사슬에 비하여 확장되고, 상기 γ'-사슬이 완전하고 분해되지 않는다는 것을 지시한다.

실시예 10 재조합 인간 섬유소원의 정제.

실시예 6으로부터 재조합 인간 섬유소원은 표준 방법에 따라, 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, (NH₄)₂SO₄가 40% 포화 (saturation)로 배양 상층액에 첨가되고, 그리고 침전물은 원심분리에 의해 수집되었다. 차후에, 침전물은 TBS (5OmM Tris-HCI, pH7.4, 10OmM NaCl)에서 용해되고, 적하 완충액 (loading buffer) (5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.01% Tween-20, 0.5M (NH₄)₂SO₄)에서 희석되고 (10-배), HiTrap 부틸 FF (20 ㎖) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 소수성 상호작용 칼럼 (Hydrophobic Interaction Column, HIC)에 적하되었다. 결합된 단백질은 20 칼럼 부피 (column volume)에서 0.5 - 0 M (NH₄)₂SO₄의 (NH₄)₂SO₄ 구배 (gradient)를 포함하는 적하 완충액에 의해 용리되었다. HIC 정제의 피크 분획물 (peak fraction)은 TMAE 적하 완충액 (5 mM Tris-HCI pH 8.5, 0.01% Tween-20)과 대비하여 투석에 의한 완충액 교체 대(對) 에 종속되고, 차후에 Fractogel EMD TMAE (m) 40 - 90 ㎛ (20 ㎖) (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 이온 교환 칼럼 (Ion Exchange Column)에 적하되었다. 재조합 인간 섬유소원은 차후에, 20 칼럼 부피 (column volume)에서 0 - 1 M NaCl의 연속 염 구배 (continuous salt gradient)를 이용하여 용리되었다.

피크 분획물에서 재조합 인간 섬유소원은 40% 포화로 (NH₄)₂SO₄를 첨가함으로써 다시 한 번 침전되고 원심분리에 의해 수집되었다. 최종적으로, 상기 물질은 TBS (5OmM Tris-HCI, pH7.4, 10OmM NaCl)에 용해되고, 남아있는 (NH₄)₂SO₄를 제거하기 위해 TBS에 대하여 투석되었다.

실시예 11 재조합 섬유소원의 기능성

실시예 6에서 산출된 세포주에 의해 생산된 바와 같은, 정제된 재조합 PER.C6 섬유소원은 속성과 기능성을 평가하고 이를 혈장 유래된 섬유소원과 비교하는 다수의 검사에 종속되었다. 섬유소원의 N-당화는 단백질로부터 N-연결된 탄수화물 구조를 제거하는 아미다아제 (amidase)인 PNGase F로 섬유소원의 처리에 의해 조사되었다 (Maley, F. et al. (1989) Anal. Biochem. 180, 195). PER.C6 배양액으로부터 유래된 정제된 섬유소원, 그리고 혈장 유래된 섬유소원 (FIB3 인간 섬유소원, ERL)의 샘플은 제조업체의 사용설명서에 따라, PNGase F (New England Biolabs, Ipswich, MA, US)로 처리되었다.

획득된 결과 (도 6)는 PNGase F 처리가 혈장 유래된 FIB3 (ERL) 및 PER.C6 기초된 섬유소원 둘 모두에서, SDS-PAGE에 의한 측정에서 Bβ-와 γ-사슬에 대한 감소된 분자량을 유발한다는 것을 지시한다. 이는 양쪽 사슬이 하나의 N-당화 부위를 보유한다는 사실과 일치한다 (Henschen-Edman (2001) Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 936, 580). 상기 데이터는 PNGase F 처리 이전과 이후 둘 모두에서, 별개의 단일 띠가 Bβ-와 γ-사슬 둘 모두에서 관찰된다는 것을 증명한다. 이는 혈장 유래된 섬유소원에서처럼, 재조합 섬유소원 내에 모든 사슬이 당화된다는 것을 지시한다. 인간 섬유소원의 Aα-사슬은 N-글리칸을 포함하지 않고, 따라서 분자량이 PNGase F 처리 시에 변하지 않는다. 결론적으로, 상기 데이터는 PER.C6 기초된 섬유소원의 N-당화 패턴이 혈장 유래된 대응물에서와 유사하다는 것을 지시한다.

PER.C6 유래된 섬유소원의 생물학적 활성은 Koopman et al. (1992) Blood 80(8): 1972에서 기술된 바와 같이 수행된, 중합화 분석 (polymerization assay)에서 더욱 조사되었다. 획득된 결과는 CHO-유래된 인간 섬유소원으로 획득된 결과와 유사하였다. 상기 분석은 섬유소를 형성하기 위한 트롬빈의 작용 하에 섬유소원의 중합화를 측정한다. 중합화는 시간 속에서 OD350 nm를 기록함으로써 측정된다. 혈장 내에서 재조합 PER.C6 섬유소원의 중합화는 혈장과 CHO-유래된 섬유소원에서와 동등하였다.

앞서 기술된 바와 같이 정제된 PER.C6 유래된 섬유소원의 응고력 (clottability)은 α-트롬빈 (7.5 IU/㎖) (ERL, Swansea, UK)과 CaCl₂ (2 mM 최종 농도)의 첨가, 그 이후에 37℃에서 1시간 동안 배양에 의해 조사되었다. 결과의 응고덩어리는 이후, Eppendorf 바이알 (15 min, 5000 rpm, eppendorf 원심분리)에서 원심분리에 의해 수집되었다. 상층액은 새로운 튜브로 이전되고, 그리고 응고덩어리는 알칼리 요소 (alkalic urea)에서 용해되었다. 단백질은 상기 상층액과 응고덩어리에서 A280 측정에 의해 측정되었다. 상층액의 섬유소원 함량은 ELISA (G8-Y18 항체)에 의해 측정되었다. 획득된 결과는 혈장 유래된 섬유소원 및 PER.C6 유래된 섬유소원에서 유사하였다: 각각, 97%와 94%의 단백질이 용해된 응고덩어리에서 측정되었다 (상층액에서 5%와 8%). 상층액에서, 섬유소원은 ELISA에 의해 검출되지 않았다. 이들 결과는 혈장 유래된 인간 섬유소원과 재조합 인간 섬유소원 사이에 생물학적 유사성 (biological similarity)을 더욱 뒷받침한다.

재조합 섬유소원과 혈장 유래된 섬유소원의 응고 시간 (clotting time)과 응고덩어리 단단함 (clot firmness)은 ROTEM 분석을 이용하여 측정되었다. ROTEM® (Pentapharm GmbH, Munich, Germany)은 Rotation ThromboElastoMetry를 의미한다. 상기 기술은 1회용 큐벳 내에서 (혈액) 샘플에 가라앉은 회전 축 (rotating axis)을 이용한다. 상이한 응고 조건 하에 탄성 (elasticity)에서 변화는 축의 회전에서 변화를 유발하고, 이는 혈전탄성도 (thromboelastogram)에서 가시화되고 기계적 응고덩어리 파라미터를 반영한다 (예로써, Luddington RJ. (2005) Clin Lab Haematol. 2005 27(2):81 참조). 정상 혼주 (구연산염) 혈장은 해모컴플레탄 (CSL Behring GmbH, Marburg, Germany) 또는 PER.C6 섬유소원 (둘 모두 TBS에서 2 ㎎/㎖)과 1:1 혼합되었다. CaCl₂가 17 mM의 최종 농도로 첨가되었다. 응고를 일으키기 위하여, α-트롬빈이 1 IU/㎖의 최종 농도로 첨가되었다. 응고 시간 및 응고덩어리-단단함은 ROTEM에 의해 분석되었다.

구연산첨가 혈장을 희석하면, 응고 시간과 응고덩어리 단단함 둘 모두 약화된다. 이러한 결과는 정제된 섬유소원을 첨가함으로써 희석된 혈장에서 섬유소원 수준을 복원하면, 혈장 유래된 섬유소원 및 재조합 섬유소원에 대한 응고 시간 (도 7) 및 응고덩어리 단단함 (도 8) 둘 모두 동일한 정도로 복원된다는 것을 지시한다. CHO 기초된 재조합 섬유소원으로 유사한 데이터가 획득되었다.

이들 결과는 재조합 인간 섬유소원이 유전성 섬유소원혈증 환자 및 후천성 섬유소원 결핍 환자에서 섬유소원 결핍을 보충하는 우수한 대체제가 된다는 것을 지시한다.

실시예 12 인간 혈액에서 ROTEM 분석

재조합 인간 섬유소원이 섬유소원 결핍 환자의 치료에 이용될 수 있음을 더욱 증명하기 위하여, 건강한 인간 개체로부터 혈액에서 실험이 수행되었다. 섬유소원 결핍은 혈액을 링거 젖산 (Baxter, Utrecht, The Netherlands)으로 1:1 희석함으로써 모방되었다. 이후, 실시예 11에서 기술된 바와 같은 ROTEM 분석을 이용하여, 응고덩어리 형성 시간 및 응고덩어리 단단함이 결정되었다. 링거 젖산으로 1:1 희석된 혈액에서 섬유소원 수준을 복원하기 위하여, 혈장 유래된 섬유소원 또는 재조합 섬유소원이 첨가되었다. 상기 데이터 (도 9)는 링거 젖산으로 희석된 혈액의 응고덩어리 형성 시간이 낮은 섬유소원 수준을 갖는 환자에 대한 임상적 상황 (clinical situation)에서처럼, 정상 범위를 벗어난다는 것을 지시한다. 재조합 섬유소원 또는 혈장 유래된 섬유소원의 첨가는 응고덩어리 형성 시간을 정상 범위 내에 수준으로 복원하였다. 이는 낮은 섬유소원 수준을 갖는 환자의 정맥내 치료를 위한 재조합 섬유소원의 잠재력을 지시한다.

혈액이 링거 젖산으로 희석될 때, 최대 응고덩어리 단단함 (maximum clot firmness, MCF)이 환자에서 출혈 위험 (bleeding risk)과 연관된 수준까지 감소하였다 (도 10). 섬유소원 수준이 혈장 유래된 섬유소원 또는 재조합 섬유소원으로 보충될 때 MCF는 정상 수준으로 복원되고, 따라서 낮은 섬유소원 수준을 갖는 환자의 정맥내 치료를 위한 재조합 섬유소원의 이용을 위한 잠재력을 뒷받침하였다. 놀랍게도, 미국에서 리아스탑 (Riastap)의 승인을 위한 임상적 효능 (clinical efficacy)이 혈전 탄성 묘사도 (Thromboelastography)에 의해 측정된 최대 응고덩어리 단단함인 대리 평가기준 (surrogate endpoint)에 기초되었다.

SEQUENCE LISTING <110> ProFibrix BV <120> recombinant fibrinogen <130> P613WO <150> EP08159999.5 <151> 2008-07-09 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1932 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgttttcca tgaggatcgt ctgcctggtc ctaagtgtgg tgggcacagc atggactgca 60 gatagtggtg aaggtgactt tctagctgaa ggaggaggcg tgcgtggccc aagggttgtg 120 gaaagacatc aatctgcctg caaagattca gactggccct tctgctctga tgaagactgg 180 aactacaaat gcccttctgg ctgcaggatg aaagggttga ttgatgaagt caatcaagat 240 tttacaaaca gaataaataa gctcaaaaat tcactatttg aatatcagaa gaacaataag 300 gattctcatt cgttgaccac taatataatg gaaattttga gaggcgattt ttcctcagcc 360 aataaccgtg ataataccta caaccgagtg tcagaggatc tgagaagcag aattgaagtc 420 ctgaagcgca aagtcataga aaaagtacag catatccagc ttctgcaaaa aaatgttagg 480 gcccagttgg ttgatatgaa acgactggag gtggacattg atattaagat ccgatcttgt 540 cgagggtcat gcagtagggc tttagctcgt gaagtagatc tgaaggacta tgaagatcag 600 cagaagcaac ttgaacaggt cattgccaaa gacttacttc cctctagaga taggcaacac 660 ttaccactga taaaaatgaa accagttcca gacttggttc ccggaaattt taagagccag 720 cttcagaagg tacccccaga gtggaaggca ttaacagaca tgccgcagat gagaatggag 780 ttagagagac ctggtggaaa tgagattact cgaggaggct ccacctctta tggaaccgga 840 tcagagacgg aaagccccag gaaccctagc agtgctggaa gctggaactc tgggagctct 900 ggacctggaa gtactggaaa ccgaaaccct gggagctctg ggactggagg gactgcaacc 960 tggaaacctg ggagctctgg acctggaagt actggaagct ggaactctgg gagctctgga 1020 actggaagta ctggaaacca aaaccctggg agccctagac ctggtagtac cggaacctgg 1080 aatcctggca gctctgaacg cggaagtgct gggcactgga cctctgagag ctctgtatct 1140 ggtagtactg gacaatggca ctctgaatct ggaagtttta ggccagatag cccaggctct 1200 gggaacgcga ggcctaacaa cccagactgg ggcacatttg aagaggtgtc aggaaatgta 1260 agtccaggga caaggagaga gtaccacaca gaaaaactgg tcacttctaa aggagataaa 1320 gagctcagga ctggtaaaga gaaggtcacc tctggtagca caaccaccac gcgtcgttca 1380 tgctctaaaa ccgttactaa gactgttatt ggtcctgatg gtcacaaaga agttaccaaa 1440 gaagtggtga cctccgaaga tggttctgac tgtcccgagg caatggattt aggcacattg 1500 tctggcatag gtactctgga tgggttccgc cataggcacc ctgatgaagc tgccttcttc 1560 gacactgcct caactggaaa aacattccca ggtttcttct cacctatgtt aggagagttt 1620 gtcagtgaga ctgagtctag gggctcagaa tctggcatct tcacaaatac aaaggaatcc 1680 agttctcatc accctgggat agctgaattc ccttcccgtg gtaaatcttc aagttacagc 1740 aaacaattta ctagtagcac gagttacaac agaggagact ccacatttga aagcaagagc 1800 tataaaatgg cagatgaggc cggaagtgaa gccgatcatg aaggaacaca tagcaccaag 1860 agaggccatg ctaaatctcg ccctgtcaga ggtatccaca cttctccttt ggggaagcct 1920 tccctgtccc cc 1932 <210> 2 <211> 1473 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 atgaaaagga tggtttcttg gagcttccac aaacttaaaa ccatgaaaca tctattattg 60 ctactattgt gtgtttttct agttaagtcc caaggtgtca acgacaatga ggagggtttc 120 ttcagtgccc gtggtcatcg accccttgac aagaagagag aagaggctcc cagcctgagg 180 cctgccccac cgcccatcag tggaggtggc tatcgggctc gtccagccaa agcagctgcc 240 actcaaaaga aagtagaaag aaaagcccct gatgctggag gctgtcttca cgctgaccca 300 gacctggggg tgttgtgtcc tacaggatgt cagttgcaag aggctttgct acaacaggaa 360 aggccaatca gaaatagtgt tgatgagtta 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gtgtactgcg accaggaaac cagcctgggc ggctggctgc tgatccagca gaggatggac 2040 ggcagcctga acttcaacag gacctggcag gactacaaga ggggcttcgg ctccctgaac 2100 gacgagggcg agggcgagtt ctggctgggc aacgactacc tgcacctgct gacccagagg 2160 ggatctgtcc tgagggtcga gctggaagat tgggccggca acgaggccta cgccgagtac 2220 cacttcagag tgggcagcga ggccgagggc tacgctctgc aggtgtccag ctacgagggc 2280 acagccggcg acgccctgat cgagggcagc gtggaagagg gcgccgagta caccagccac 2340 aacaacatgc agttctccac cttcgacagg gacgccgacc agtgggagga aaactgcgcc 2400 gaggtgtacg gcggagggtg gtggtacaac aactgccagg ccgccaacct gaacggcatc 2460 tactacccag gcggcagcta cgaccccagg aacaacagcc cctacgagat cgagaacggc 2520 gtggtgtggg tgtccttcag aggcgccgac tacagcctga gggccgtgag gatgaagatc 2580 aggcccctgg tgacccag 2598 <210> 8 <211> 644 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Phe Ser Met Arg Ile Val Cys Leu Val Leu Ser Val Val Gly Thr 1 5 10 15 Ala Trp Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly 20 25 30 Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys 35 40 45 Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys Cys 50 55 60 Pro Ser Gly Cys Arg Met Lys Gly Leu Ile Asp Glu Val Asn Gln Asp 65 70 75 80 Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser Leu Phe Glu Tyr Gln 85 90 95 Lys Asn Asn Lys Asp Ser His Ser Leu Thr Thr Asn Ile Met Glu Ile 100 105 110 Leu Arg Gly Asp Phe Ser Ser Ala Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr Asn 115 120 125 Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu Val Leu Lys Arg Lys 130 135 140 Val Ile Glu Lys Val Gln His Ile Gln Leu Leu Gln Lys Asn Val Arg 145 150 155 160 Ala Gln Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu Val Asp Ile Asp Ile Lys 165 170 175 Ile Arg Ser Cys Arg Gly Ser Cys Ser Arg Ala Leu Ala Arg Glu Val 180 185 190 Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys Gln Leu Glu Gln Val Ile 195 200 205 Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser Arg Asp Arg Gln His Leu Pro Leu Ile 210 215 220 Lys Met Lys Pro Val Pro Asp Leu Val Pro Gly Asn Phe Lys Ser Gln 225 230 235 240 Leu Gln Lys Val Pro Pro Glu Trp Lys Ala Leu Thr Asp Met Pro Gln 245 250 255 Met Arg Met Glu Leu Glu Arg Pro Gly Gly Asn Glu Ile Thr Arg Gly 260 265 270 Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Thr Gly Ser Glu Thr Glu Ser Pro Arg Asn 275 280 285 Pro Ser Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser 290 295 300 Thr Gly Asn Arg Asn Pro Gly Ser Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr 305 310 315 320 Trp Lys Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Trp Asn Ser 325 330 335 Gly Ser Ser Gly Thr Gly Ser Thr Gly Asn Gln Asn Pro Gly Ser Pro 340 345 350 Arg Pro Gly Ser Thr Gly Thr Trp Asn Pro Gly Ser Ser Glu Arg Gly 355 360 365 Ser Ala Gly His Trp Thr Ser Glu Ser Ser Val Ser Gly Ser Thr Gly 370 375 380 Gln Trp His Ser Glu Ser Gly Ser Phe Arg Pro Asp Ser Pro Gly Ser 385 390 395 400 Gly Asn Ala Arg Pro Asn Asn Pro Asp Trp Gly Thr Phe Glu Glu Val 405 410 415 Ser Gly Asn Val Ser Pro Gly Thr Arg Arg Glu Tyr His Thr Glu Lys 420 425 430 Leu Val Thr Ser Lys Gly Asp Lys Glu Leu Arg Thr Gly Lys Glu Lys 435 440 445 Val Thr Ser Gly Ser Thr Thr Thr Thr Arg Arg Ser Cys Ser Lys Thr 450 455 460 Val Thr Lys Thr Val Ile Gly Pro Asp Gly His Lys Glu Val Thr Lys 465 470 475 480 Glu Val Val Thr Ser Glu Asp Gly Ser Asp Cys Pro Glu Ala Met Asp 485 490 495 Leu Gly Thr Leu Ser Gly Ile Gly Thr Leu Asp Gly Phe Arg His Arg 500 505 510 His Pro Asp Glu Ala Ala Phe Phe Asp Thr Ala Ser Thr Gly Lys Thr 515 520 525 Phe Pro Gly Phe Phe Ser Pro Met Leu Gly Glu Phe Val Ser Glu Thr 530 535 540 Glu Ser Arg Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys Glu Ser 545 550 555 560 Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg Gly Lys Ser 565 570 575 Ser Ser Tyr Ser Lys Gln Phe Thr Ser Ser Thr Ser Tyr Asn Arg Gly 580 585 590 Asp Ser Thr Phe Glu Ser Lys Ser Tyr Lys Met Ala Asp Glu Ala Gly 595 600 605 Ser Glu Ala Asp His Glu Gly Thr His Ser Thr Lys Arg Gly His Ala 610 615 620 Lys Ser Arg Pro Val Arg Gly Ile His Thr Ser Pro Leu Gly Lys Pro 625 630 635 640 Ser Leu Ser Pro <210> 9 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gln Gly 20 25 30 Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro 35 40 45 Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro 50 55 60 Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gln Lys Lys Val Glu Arg Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu 85 90 95 His Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val Leu Cys Pro Thr Gly Cys Gln Leu 100 105 110 Gln Glu Ala Leu Leu Gln Gln Glu Arg Pro Ile Arg Asn Ser Val Asp 115 120 125 Glu Leu Asn Asn Asn Val Glu Ala Val Ser Gln Thr Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Phe Gln Tyr Met Tyr Leu Leu Lys Asp Leu Trp Gln Lys Arg Gln Lys 145 150 155 160 Gln Val Lys Asp Asn Glu Asn Val Val Asn Glu Tyr Ser Ser Glu Leu 165 170 175 Glu Lys His Gln Leu Tyr Ile Asp Glu Thr Val Asn Ser Asn Ile Pro 180 185 190 Thr Asn Leu Arg Val Leu Arg Ser Ile Leu Glu Asn Leu Arg Ser Lys 195 200 205 Ile Gln Lys Leu Glu Ser Asp Val Ser Ala Gln Met Glu Tyr Cys Arg 210 215 220 Thr Pro Cys Thr Val Ser Cys Asn Ile Pro Val Val Ser Gly Lys Glu 225 230 235 240 Cys Glu Glu Ile Ile Arg Lys Gly Gly Glu Thr Ser Glu Met Tyr Leu 245 250 255 Ile Gln Pro Asp Ser Ser Val Lys Pro Tyr Arg Val Tyr Cys Asp Met 260 265 270 Asn Thr Glu Asn Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Asn Arg Gln Asp Gly 275 280 285 Ser Val Asp Phe Gly Arg Lys Trp Asp Pro Tyr Lys Gln Gly Phe Gly 290 295 300 Asn Val Ala Thr Asn Thr Asp Gly Lys Asn Tyr Cys Gly Leu Pro Gly 305 310 315 320 Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Asp Lys Ile Ser Gln Leu Thr Arg Met Gly 325 330 335 Pro Thr Glu Leu Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val 340 345 350 Lys Ala His Tyr Gly Gly Phe Thr Val Gln Asn Glu Ala Asn Lys Tyr 355 360 365 Gln Ile Ser Val Asn Lys Tyr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met 370 375 380 Asp Gly Ala Ser Gln Leu Met Gly Glu Asn Arg Thr Met Thr Ile His 385 390 395 400 Asn Gly Met Phe Phe Ser Thr Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Gly Trp Leu 405 410 415 Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gln Cys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Gly Trp 420 425 430 Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala Asn Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp 435 440 445 Gly Gly Gln Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His Gly Thr Asp Asp Gly 450 455 460 Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met 465 470 475 480 Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe Pro Gln Gln 485 490 <210> 10 <211> 437 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ser Trp Ser Leu His Pro Arg Asn Leu Ile Leu Tyr Phe Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Ser Ser Thr Cys Val Ala Tyr Val Ala Thr Arg Asp 20 25 30 Asn Cys Cys Ile Leu Asp Glu Arg Phe Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr 35 40 45 Cys Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser Thr Tyr Gln Thr Lys Val Asp Lys 50 55 60 Asp Leu Gln Ser Leu Glu Asp Ile Leu His Gln Val Glu Asn Lys Thr 65 70 75 80 Ser Glu Val Lys Gln Leu Ile Lys Ala Ile Gln Leu Thr Tyr Asn Pro 85 90 95 Asp Glu Ser Ser Lys Pro Asn Met Ile Asp Ala Ala Thr Leu Lys Ser 100 105 110 Arg Lys Met Leu Glu Glu Ile Met Lys Tyr Glu Ala Ser Ile Leu Thr 115 120 125 His Asp Ser Ser Ile Arg Tyr Leu Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn 130 135 140 Gln Lys Ile Val Asn Leu Lys Glu Lys Val Ala Gln Leu Glu Ala Gln 145 150 155 160 Cys Gln Glu Pro Cys Lys Asp Thr Val Gln Ile His Asp Ile Thr Gly 165 170 175 Lys Asp Cys Gln Asp Ile Ala Asn Lys Gly Ala Lys Gln Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Phe Ile Lys Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Phe Leu Val Tyr Cys 195 200 205 Glu Ile Asp Gly Ser Gly Asn Gly Trp Thr Val Phe Gln Lys Arg Leu 210 215 220 Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys Asn Trp Ile Gln Tyr Lys Glu Gly 225 230 235 240 Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr Thr Glu Phe Trp Leu Gly Asn 245 250 255 Glu Lys Ile His Leu Ile Ser Thr Gln Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Leu 260 265 270 Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp Asn Gly Arg Thr Ser Thr Ala Asp Tyr 275 280 285 Ala Met Phe Lys Val Gly Pro Glu Ala Asp Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr 290 295 300 Ala Tyr Phe Ala Gly Gly Asp Ala Gly Asp Ala Phe Asp Gly Phe Asp 305 310 315 320 Phe Gly Asp Asp Pro Ser Asp Lys Phe Phe Thr Ser His Asn Gly Met 325 330 335 Gln Phe Ser Thr Trp Asp Asn Asp Asn Asp Lys Phe Glu Gly Asn Cys 340 345 350 Ala Glu Gln Asp Gly Ser Gly Trp Trp Met Asn Lys Cys His Ala Gly 355 360 365 His Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser 370 375 380 Thr Pro Asn Gly Tyr Asp Asn Gly Ile Ile Trp Ala Thr Trp Lys Thr 385 390 395 400 Arg Trp Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn 405 410 415 Arg Leu Thr Ile Gly Glu Gly Gln Gln His His Leu Gly Gly Ala Lys 420 425 430 Gln Ala Gly Asp Val 435 <210> 11 <211> 866 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Phe Ser Met Arg Ile Val Cys Leu Val Leu Ser Val Val Gly Thr 1 5 10 15 Ala Trp Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly 20 25 30 Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys 35 40 45 Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys Cys 50 55 60 Pro Ser Gly Cys Arg Met Lys Gly Leu Ile Asp Glu Val Asn Gln Asp 65 70 75 80 Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser Leu Phe Glu Tyr Gln 85 90 95 Lys Asn Asn Lys Asp Ser His Ser Leu Thr Thr Asn Ile Met Glu Ile 100 105 110 Leu Arg Gly Asp Phe Ser Ser Ala Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr Asn 115 120 125 Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu Val Leu Lys Arg Lys 130 135 140 Val Ile Glu Lys Val Gln His Ile Gln Leu Leu Gln Lys Asn Val Arg 145 150 155 160 Ala Gln Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu Val Asp Ile Asp Ile Lys 165 170 175 Ile Arg Ser Cys Arg Gly Ser Cys Ser Arg Ala Leu Ala Arg Glu Val 180 185 190 Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys Gln Leu Glu Gln Val Ile 195 200 205 Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser Arg Asp Arg Gln His Leu Pro Leu Ile 210 215 220 Lys Met Lys Pro Val Pro Asp Leu Val Pro Gly Asn Phe Lys Ser Gln 225 230 235 240 Leu Gln Lys Val Pro Pro Glu Trp Lys Ala Leu Thr Asp Met Pro Gln 245 250 255 Met Arg Met Glu Leu Glu Arg Pro Gly Gly Asn Glu Ile Thr Arg Gly 260 265 270 Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Thr Gly Ser Glu Thr Glu Ser Pro Arg Asn 275 280 285 Pro Ser Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser 290 295 300 Thr Gly Asn Arg Asn Pro Gly Ser Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr 305 310 315 320 Trp Lys Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser Thr Gly Ser Trp Asn Ser 325 330 335 Gly Ser Ser Gly Thr Gly Ser Thr Gly Asn Gln Asn Pro Gly Ser Pro 340 345 350 Arg Pro Gly Ser Thr Gly Thr Trp Asn Pro Gly Ser Ser Glu Arg Gly 355 360 365 Ser Ala Gly His Trp Thr Ser Glu Ser Ser Val Ser Gly Ser Thr Gly 370 375 380 Gln Trp His Ser Glu Ser Gly Ser Phe Arg Pro Asp Ser Pro Gly Ser 385 390 395 400 Gly Asn Ala Arg Pro Asn Asn Pro Asp Trp Gly Thr Phe Glu Glu Val 405 410 415 Ser Gly Asn Val Ser Pro Gly Thr Arg Arg Glu Tyr His Thr Glu Lys 420 425 430 Leu Val Thr Ser Lys Gly Asp Lys Glu Leu Arg Thr Gly Lys Glu Lys 435 440 445 Val Thr Ser Gly Ser Thr Thr Thr Thr Arg Arg Ser Cys Ser Lys Thr 450 455 460 Val Thr Lys Thr Val Ile Gly Pro Asp Gly His Lys Glu Val Thr Lys 465 470 475 480 Glu Val Val Thr Ser Glu Asp Gly Ser Asp Cys Pro Glu Ala Met Asp 485 490 495 Leu Gly Thr Leu Ser Gly Ile Gly Thr Leu Asp Gly Phe Arg His Arg 500 505 510 His Pro Asp Glu Ala Ala Phe Phe Asp Thr Ala Ser Thr Gly Lys Thr 515 520 525 Phe Pro Gly Phe Phe Ser Pro Met Leu Gly Glu Phe Val Ser Glu Thr 530 535 540 Glu Ser Arg Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys Glu Ser 545 550 555 560 Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg Gly Lys Ser 565 570 575 Ser Ser Tyr Ser Lys Gln Phe Thr Ser Ser Thr Ser Tyr Asn Arg Gly 580 585 590 Asp Ser Thr Phe Glu Ser Lys Ser Tyr Lys Met Ala Asp Glu Ala Gly 595 600 605 Ser Glu Ala Asp His Glu Gly Thr His Ser Thr Lys Arg Gly His Ala 610 615 620 Lys Ser Arg Pro Val Arg Asp Cys Asp Asp Val Leu Gln Thr His Pro 625 630 635 640 Ser Gly Thr Gln Ser Gly Ile Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Ser Ser 645 650 655 Lys Ile Phe Ser Val Tyr Cys Asp Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Trp 660 665 670 Leu Leu Ile Gln Gln Arg Met Asp Gly Ser Leu Asn Phe Asn Arg Thr 675 680 685 Trp Gln Asp Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Ser Leu Asn Asp Glu Gly Glu 690 695 700 Gly Glu Phe Trp Leu Gly Asn Asp Tyr Leu His Leu Leu Thr Gln Arg 705 710 715 720 Gly Ser Val Leu Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp Ala Gly Asn Glu Ala 725 730 735 Tyr Ala Glu Tyr His Phe Arg Val Gly Ser Glu Ala Glu Gly Tyr Ala 740 745 750 Leu Gln Val Ser Ser Tyr Glu Gly Thr Ala Gly Asp Ala Leu Ile Glu 755 760 765 Gly Ser Val Glu Glu Gly Ala Glu Tyr Thr Ser His Asn Asn Met Gln 770 775 780 Phe Ser Thr Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gln Trp Glu Glu Asn Cys Ala 785 790 795 800 Glu Val Tyr Gly Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Asn Cys Gln Ala Ala Asn 805 810 815 Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Pro Gly Gly Ser Tyr Asp Pro Arg Asn Asn 820 825 830 Ser Pro Tyr Glu Ile Glu Asn Gly Val Val Trp Val Ser Phe Arg Gly 835 840 845 Ala Asp Tyr Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys Ile Arg Pro Leu Val 850 855 860 Thr Gln 865 <210> 12 <211> 1359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgagctggt ccctgcaccc caggaacctg atcctgtact tctacgccct gctgttcctg 60 agcagcacat gcgtcgccta tgtggctacc agggacaact gctgcatcct ggacgagagg 120 ttcggcagct actgccccac cacctgcggc atcgccgact ttctgagcac ctaccagacc 180 aaggtggaca aggacctgca gagcctggag gacatcctgc accaggtgga gaacaagacc 240 agcgaggtga agcagctgat caaggccatc cagctgacct acaaccccga cgagagcagc 300 aagcccaaca tgatcgacgc cgccaccctg aagagcagga agatgctgga ggaaatcatg 360 aagtacgagg ccagcatcct gacccacgac agcagcatca gatacctgca ggaaatctac 420 aacagcaaca accagaagat cgtcaacctg aaggaaaagg tcgcccagct ggaagcccag 480 tgccaggaac cctgcaagga caccgtgcag atccacgaca tcaccggcaa ggactgccag 540 gacatcgcca acaagggcgc caagcagagc ggcctgtact tcatcaagcc cctgaaggcc 600 aaccagcagt tcctggtgta ctgcgagatc gacggcagcg gcaacggctg gaccgtgttc 660 cagaagaggc tggacggcag cgtggacttc aagaagaact ggattcagta caaggaaggc 720 ttcggccacc tgagccccac cggcaccacc gagttctggc tgggcaacga gaagatccac 780 ctgatcagca cccagagcgc catcccatac gccctgaggg tggagctgga ggactggaac 840 ggcaggacca gcaccgccga ctacgccatg ttcaaagtgg gacccgaggc cgacaagtac 900 aggctgacct acgcctactt tgccggaggg gacgctggcg acgccttcga cggcttcgac 960 ttcggcgacg accccagcga caagttcttc accagccaca acggcatgca gttcagcacc 1020 tgggacaacg acaacgacaa gttcgagggc aactgcgccg agcaggacgg ctccgggtgg 1080 tggatgaaca agtgccacgc cgggcacctg aacggcgtgt actaccaggg cggcacctac 1140 agcaaggcca gcacccccaa cggctacgac aacggcatca tctgggccac ctggaaaacc 1200 aggtggtaca gcatgaaaaa aaccaccatg aagatcatcc cattcaacag actgaccatc 1260 ggcgagggcc agcagcacca cctgggcgga gccaagcagg tgcggccaga gcaccccgcc 1320 gagacagagt acgacagcct gtaccccgag gacgacctg 1359 <210> 13 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Trp Ser Leu His Pro Arg Asn Leu Ile Leu Tyr Phe Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Ser Ser Thr Cys Val Ala Tyr Val Ala Thr Arg Asp 20 25 30 Asn Cys Cys Ile Leu Asp Glu Arg Phe Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr 35 40 45 Cys Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser Thr Tyr Gln Thr Lys Val Asp Lys 50 55 60 Asp Leu Gln Ser Leu Glu Asp Ile Leu His Gln Val Glu Asn Lys Thr 65 70 75 80 Ser Glu Val Lys Gln Leu Ile Lys Ala Ile Gln Leu Thr Tyr Asn Pro 85 90 95 Asp Glu Ser Ser Lys Pro Asn Met Ile Asp Ala Ala Thr Leu Lys Ser 100 105 110 Arg Lys Met Leu Glu Glu Ile Met Lys Tyr Glu Ala Ser Ile Leu Thr 115 120 125 His Asp Ser Ser Ile Arg Tyr Leu Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn 130 135 140 Gln Lys Ile Val Asn Leu Lys Glu Lys Val Ala Gln Leu Glu Ala Gln 145 150 155 160 Cys Gln Glu Pro Cys Lys Asp Thr Val Gln Ile His Asp Ile Thr Gly 165 170 175 Lys Asp Cys Gln Asp Ile Ala Asn Lys Gly Ala Lys Gln Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Phe Ile Lys Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Phe Leu Val Tyr Cys 195 200 205 Glu Ile Asp Gly Ser Gly Asn Gly Trp Thr Val Phe Gln Lys Arg Leu 210 215 220 Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys Asn Trp Ile Gln Tyr Lys Glu Gly 225 230 235 240 Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr Thr Glu Phe Trp Leu Gly Asn 245 250 255 Glu Lys Ile His Leu Ile Ser Thr Gln Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Leu 260 265 270 Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp Asn Gly Arg Thr Ser Thr Ala Asp Tyr 275 280 285 Ala Met Phe Lys Val Gly Pro Glu Ala Asp Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr 290 295 300 Ala Tyr Phe Ala Gly Gly Asp Ala Gly Asp Ala Phe Asp Gly Phe Asp 305 310 315 320 Phe Gly Asp Asp Pro Ser Asp Lys Phe Phe Thr Ser His Asn Gly Met 325 330 335 Gln Phe Ser Thr Trp Asp Asn Asp Asn Asp Lys Phe Glu Gly Asn Cys 340 345 350 Ala Glu Gln Asp Gly Ser Gly Trp Trp Met Asn Lys Cys His Ala Gly 355 360 365 His Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser 370 375 380 Thr Pro Asn Gly Tyr Asp Asn Gly Ile Ile Trp Ala Thr Trp Lys Thr 385 390 395 400 Arg Trp Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn 405 410 415 Arg Leu Thr Ile Gly Glu Gly Gln Gln His His Leu Gly Gly Ala Lys 420 425 430 Gln Val Arg Pro Glu His Pro Ala Glu Thr Glu Tyr Asp Ser Leu Tyr 435 440 445 Pro Glu Asp Asp Leu 450

Claims

포유동물 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된 섬유소원 알파, 베타 또는 감마 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1에 있어서, COS 세포, BHK 세포, NSO 세포, CHO 세포, Sp2/0 또는 인간 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 또는 2에 있어서, PER.C6 세포 또는 HEK293 세포 배양 시스템에서 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 적어도 0.95의 코돈 적합화 지수 (codon adaption index)로, CHO 세포에 코돈 이용빈도 적합화 (codon usage adaptation)에 의해 최적화된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 4중 어느 한 항에 있어서, 적어도 55%의 GC 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 5중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-최적화된 대응물에 적어도 70% 동일성을 나타내는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 6중 어느 한 항에 있어서, 코돈 최적화된 섬유소원 사슬은 cis-작용 부위를 보유하지 않는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No. 4 또는 7에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분, 또는 SEQ ID No. 4 또는 7에 적어도 85% 동일한 서열을 보유하는 뉴클레오티드 서열을 보유하고 섬유소원 알파 사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No. 5에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분, 또는 SEQ ID No. 5에 적어도 85% 동일한 서열을 보유하는 뉴클레오티드 서열을 보유하고 섬유소원 베타 사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No. 6 또는 12에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분, 또는 SEQ ID No. 6 또는 12에 적어도 85% 동일한 서열을 보유하는 뉴클레오티드 서열을 보유하고 섬유소원 감마 사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 구조체.
청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 청구항 11에 따른 뉴클레오티드 구조체를 포함하는 세포.
일일 세포당 적어도 3 피코그램 (picogram)의 수준에서 완전한 (intact) 재조합 섬유소원을 생산하는 세포 또는 세포주.
진핵 세포 배양 시스템에서 섬유소원을 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 섬유소원이 생산되는 조건 하에 청구항 12 또는 13에 따른 세포, 또는 청구항 13에 따른 세포주를 배양하는 단계, 그리고 선택적으로, 생산된 섬유소원을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 14의 방법에 의해 제조된 섬유소원 제조물.
알파, 베타 또는 감마 사슬 중에서 10% 이상이 변이체 유형인 것을 특징으로 하는 섬유소원 제조물.
청구항 16에 있어서, 변이체 유형이 감마 프라임 사슬 또는 알파 확장된 사슬인 것을 특징으로 하는 섬유소원 제조물.
청구항 14 내지 17중 어느 한 항에 있어서, 약제로서, 조직 실란트 (tissue sealant)로서, 또는 조직 부착을 촉진하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 섬유소원 제조물.
섬유소원 결핍의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 청구항 14 내지 18중 어느 한 항에 따른 섬유소원 제조물의 용도.
섬유소원 중에서 85% 이상이 완전한 형태로 존재하는, 재조합 기술에 의해 생산된 섬유소원 제조물.
완전한 재조합 섬유소원을 생산하는 세포 또는 세포주를 선별하는 방법에 있어서, 상기 방법은 2가지 항체를 이용하는 단계를 포함하고, 여기서 한쪽 항체는 알파 사슬의 완전한 N-말단에 선별적으로 결합하고 다른 항체는 알파 사슬의 완전한 C-말단에 선별적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.