KR20110034770A - Composition for preventing calves diarrhea - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 송아지 설사병 예방용 조성물에 대한 것으로, 특히 송아지의 소화기질병인 설사병에 대한 면역항체가 형성된 난황 및 초유에 천연약용식물의 추출물을 첨가하여 조성된 송아지 설사병 예방용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing calf diarrhea, and more particularly to a composition for preventing calf diarrheal disease by adding an extract of a natural medicinal plant to egg yolk and colostrum in which immune antibodies to diarrhea, a digestive disease of the calf, are formed.
일반적으로 동물들은 각종 질병으로부터 자기를 보호하기 위하여, 어떤 병원체에 감염된 후 면역기능을 발휘하여 회복된다.In general, animals are restored by exerting an immune function after being infected by a pathogen, in order to protect themselves from various diseases.
또한, 질병을 앓지 않고 면역기능을 갖도록 만들기 위해서, 특정 병원균으로 예방약을 제조하여 인위적으로 접종하므로서 면역을 얻게 할 수도 있고, 외부에서 이미 만들어진 면역물질을 체내에 주입시켜서 유사한 효력을 얻게 할 수도 있다.In addition, in order to have an immune function without suffering from diseases, the immunity may be obtained by artificially inoculating a prophylactic agent with a specific pathogen, or by injecting an immune substance already made externally into the body to obtain a similar effect.
그 중에서 송아지의 경우 어린 일령에서 다수의 병원체에 노출되어 있고, 질병에 대한 저항력도 떨어져 많은 질병이 복합적으로 감염되기 쉽다. Among them, calves are exposed to many pathogens at young age, and their resistance to disease is low, and many diseases are easily infected.
일부 어린 송아지에서는 모체이행 항체의 결여로 질병에 대한 저항력이 약해 각종 질병에 대한 방어능력이 현저히 떨어져 폐사되는 경우도 발생한다.In some young calves, the lack of maternal transfer antibodies results in weak disease resistance, resulting in markedly reduced defenses against various diseases.
송아지에 대한 주요 질병으로는 소 바이러스설사병, 로타바이러스, 코로나바이러스 및 대장균, 살모넬라, 파스튜렐라 감염증 등을 들 수 있다.Major diseases for calves include bovine virus diarrhea, rotavirus, coronavirus and E. coli, Salmonella, Pasteurella infection.
소 바이러스설사병/점막병(Bovine virus diarrhea /Mucosal disease; BVD /MD)으로 불리는 이 질병은 소의 전염병으로 소화관의 점막의 궤양과 설사, 호흡기병변 등을 유발하고 모든 연령의 소에서 감염되나 3 ~ 8개월령의 어린 동물이 감수성이 높으며, 주로 겨울에서 봄 사이에 많이 발병하는 질병으로서, 고열, 점액성이고 혈액성의 심한설사, 백혈구감소증 등 식욕절폐, 유량감소, 기침, 호흡곤란, 콧물, 탈수에 의한 폐사 등 전 연령층에 발병하는 질병이며, 임신 초기의 암소에 감염 시 태반으로 인한 유산, 흑자 및 사산도 일어나며 신생 송아지에서는 운동실조 및 허약증세도 일으킨다.Bovine virus diarrhea / Mucosal disease (BVD / MD) is an infectious disease of cattle that causes mucous membrane ulcers in the digestive tract, diarrhea and respiratory lesions. The young animals of the month of age are highly susceptible and usually develop in the winter to spring. They are caused by high fever, mucous, bloody diarrhea, leukopenia, decreased appetite, decreased flow, cough, shortness of breath, runny nose and dehydration. It is a disease that affects all age groups such as mortality. Infection of cows in early pregnancy also causes miscarriage, surplus and stillbirth due to placenta, and new calf causes ataxia and weakness.
소 로타바이러스(Bovine rotavirus; BRV) 감염증은 갓 태어난 어린 송아지에 감염 시 설사를 유발시키며 가장 피해가 심한 소화기 질병중 하나로 주로 생후 1주령 미만의 어린 송아지에 감염되면 높은 폐사율을 나타내고 회복 되더라도 비육능력이 떨어진다.Bovine rotavirus (BRV) infection causes diarrhea when infected with a newborn calf, and is one of the most damaging digestive diseases, and is mainly associated with high mortality when infected with young calf less than 1 week of age. Falls.
소 코로나바이러스(Bovine coronavirus; BCV)감염증은 심한경우 유량이 감소하며 사료효율의 저하 및 육우의 증체율 감소가 일어나며, 어린 송아지에서는 발생율이 높으며 유행성폐렴의 1차원인체이기도 하다. 특히, 소장 및 결장에 병변이 생기며 특히 융모의 심한 위축, 융합, 탈락 등이 관찰되고 흡수부전으로 인한 노란색 수양성설사와 심한 탈수 등이 일어나며, 쇠약해지다 무기력을 보이다 저 혈량증으로 폐사하기도 하는 이 질병은 신생 송아지설사병(neonatal calf diarrhea)이라 불리 울 정도로 어린 송아지에서는 중요한 질병중 하나이다.Bovine coronavirus (BCV) infection is severely reduced in flow rate, lowers feed efficiency and decreases in beef gain, and is high in young calves and is a one-dimensional human body of pandemic pneumonia. In particular, lesions occur in the small intestine and colon, especially severe atrophy, fusion, and dropping of villi are observed, yellow watery diarrhea and severe dehydration due to malabsorption, weakness, and lethargy. The disease is one of the most important in calves so young that it is called neonatal calf diarrhea.
병원성 대장균(Escherichia coli)은 장관 감염에 의해 발생되며 송아지의 경 우 설사병, 위축 및 폐사를 주증으로 하고 포유 및 이유송아지에서 많이 발생함으로 집약적인 집단관리에 의한 스트레스가 주원인이다. Escherichia coli is caused by intestinal infections and is mainly caused by diarrheal disease, atrophy and mortality in calves, and occurs mainly in mammals and weaning calves.
살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)및 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritids)균은 숙주 특이성 없이 사람의 식중독을 유발시키는 인수공통전염병의 원인균이며, 사람의 식중독 중 높은 발생빈도를 나타내고 있는 질병으로서, 동물에서는 살모넬라균의 감염에 의한 급성 또는 만성 소화기전염병으로 송아지에 주로 발병하며, 발열, 장염 및 패혈증을 주증으로 하고 뇌염, 관절염, 유산 및 유방염도 일으키고 있다. Salmonella typhimurium and Salmonella enteritids are the causative agents of common infectious diseases that cause food poisoning in humans without host specificity. Is acute or chronic gastrointestinal infectious disease caused by Salmonella infection, mainly in calves, fever, enteritis and sepsis, and encephalitis, arthritis, lactic acid and mastitis.
파스튜렐라성 폐렴은(Bovine pneumonic pasteurellosis) 장거리 수송, 이유, 제각, 기후의 급변, 사료의 교체, 사양 조건의 악화와 같은 여러 가지 스트레스 인자들과 바이러스 및 세균의 감염 등에 의해서 복합적으로 발생되는 질병으로 알려져 있으며, 그 중 파스튜렐라 헤모리티커(Pasteurella haemolytica)라는 균이 가장 중요한 원인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. Bovine pneumonic pasteurellosis is a disease caused by a combination of stress and viral and bacterial infections, such as long-haul transport, weaning, defecation , climate change, feed changes, and deterioration of specification conditions. It is known that the bacterium Pasteurella haemolytica is known to act as the most important cause.
상기와 같은 질병들에 대해 예방하는 방법으로 백신을 사용하고 있으며, 항생제, 설파제, 항균제 등을 사용하여 송아지질병을 치료하고 있다.Vaccines are used as a way to prevent such diseases, and antibiotics, sulfa drugs, antibacterial agents, etc. are used to treat calf disease.
그러나 상기 항생물질이나 항균제 등의 약제의 사용은 내성균의 출현의 문제 또는 축산물의 안전성의 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 설사에 대한 예방 또는 치료를 위하여 항생제를 투여하는 경우에 증체량이 감소되는 문제점이 발생된다.However, the use of drugs such as antibiotics and antimicrobial agents not only causes the appearance of resistant bacteria or the safety of livestock products, but also causes a problem of a decrease in weight gain when antibiotics are administered for the prevention or treatment of diarrhea. .
따라서, 안전성에 대한 문제가 발생되지 않으면서 설사병 생체내에서 상승효과를 나타내어 생체내의 면역 시스템중 보체계의 활성화 및 일상의 식품성분과의 상승작용으로 신체 항상성을 유지하도록 도와주는 역할을 하는 천연약용식물들을 이용하여 송아지 질병에 대한 예방 및 치료물질을 개발하여 항생물질의 대체 물질에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.Therefore, natural medicinal plants that play a role in maintaining body homeostasis by activating the complementary system and synergistic with the daily food components of the immune system in vivo by having a synergistic effect in diarrheal in vivo without causing a safety problem. The development of preventive and therapeutic substances for calf disease using these methods is needed to study the alternatives of antibiotics.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 면역항체가 형성된 난황 및 초유와 인체 무해한 천연약용식물들의 추출물들을 이용하여 항생 물질을 대체할 수 있는 송아지 설사병 예방용 조성물을 제공하려는 목적이 있다.In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide an anti-calf diarrheal disease prevention composition that can replace antibiotics using extracts of egg yolk and colostrum and harmless natural medicinal plants formed with immune antibodies.
본 발명은 송아지 설사병 예방용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing calf diarrhea.
본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.When described in more detail with respect to the present invention.
본 발명의 발명자들은 환경 친화적이고 강력한 항균작용과 면역력증진 효과를 갖고 있는 여러 천연약용식물들을 이용하여 항생물질 대신에 송아지 설사병에 대해 예방효과를 갖는 물질을 개발하기 위한 목적으로 수차례 연구한 결과, 여러 천연약용식물들 중 오배자, 가자, 단삼, 황금들을 선별하게 되었다.The inventors of the present invention several times for the purpose of developing a substance having a preventive effect against calf diarrhea instead of antibiotics by using a variety of natural medicinal plants that have an environmentally friendly and strong antibacterial action and immune boosting effect, Among the many natural medicinal plants, they have been selected as gallant, Gaza, sweet ginseng and gold.
본 발명의 주 재료인 오배자(Rhus chinensis)는 매미목[同翅目] 진딧물과의 오배자(五倍子)면충이 옻나무과의 붉나무(오배자나무)의 잎에 기생하여 만든 벌레 혹으로서, 한방에서는 수렴(收斂), 지혈, 해독, 항균의 효력이 있어 설사, 탈항, 위궤양, 십이지장궤양, 도한, 유정(遺精), 혈변, 혈뇨, 구내염 등에 효능이 있다고 알려졌으며, 주요 성분인 탄닌(50 ~ 60 %)의 수렴작용에 의하여 지사작용, 지혈작용, 억균작용, 선분비억제 작용을 하며, 약리작용으로 수렴효과, 항 미생물작용, 항 생육작용, 간 기능보호, 황산화작용이 보고되어 있다.The main material of the present invention, Rhus chinensis, is an insect lump formed by parasitic nematodes of the cicada aphid, parasitic on the leaves of Rhozophyllum of the lactose family, which converge in oriental medicine. , Hemostasis, detoxification, antibacterial effect is effective in diarrhea, prolapse, gastric ulcer, duodenal ulcer, Hanhan, oil well, blood stool, hematuria, stomatitis It is reported that the effect of branch office, hemostatic, fungicidal, gland secretion, pharmacological action, convergence effect, anti-microbial action, anti-growth action, liver function protection, sulfate action.
가자(訶子, Terminalia chebula retzius)는 가리득 열매로서, 약간 특이한 냄새가 나며 약성은 쓰고 조금 시며 떫은 맛을 내며, 이는 기를 내리고 오래된 담과 기침을 사키고 숨이 차는 것, 오래된 설사, 이질, 대하, 탈항에 효험이 있으며, 소화를 돕고 입맛을 돋우며 뱃속의 태아를 편하게 하는 작용도 한다. Gaza (bul 子, Terminalia chebula retzius) is a fruity fruit, with a slightly peculiar smell, weakness, bitterness and astringent taste, which can lower the swelling, soak up old cough and cough, breathe, old diarrhea, dysentery, Efficacy in larvae and disinfection, and aids digestion, promotes appetite, and eases the fetus in the stomach.
약리작용으로는 수렴, 지사, 녹농균 등에 대한 억균작용이 보고되었으며, 실험 및 연구를 통해 가자는 사람과는 달리 가축 및 가금 등에 대하여는 뚜렷한 항생효과가 있는 것을 확인한 바가 있다.As a pharmacological action, the antifungal activity of astringent, branch, Pseudomonas aeruginosa, and the like have been reported, and experiments and studies have confirmed that there is a distinct antibiotic effect on livestock and poultry, unlike the sleeper.
단삼(Salvia miltiorrhiza bunge)은 약간 특이한 향기가 있고 약성은 쓰고 떫은 맛을 내며, 혈액순환을 돕고, 어혈을 제거하며 사지관절 동통을 완화시킨다.Salvia miltiorrhiza bunge has a slightly peculiar scent, weakness and bitterness, helps blood circulation, removes blood, and alleviates limb pain.
고열로 인한 정신혼몽, 헛소리, 번조, 불면증, 피부발진, 심계항진 등을 치료한다. 약리작용은 관상동맥 확장, 콜레스테롤 강하, 혈압 강하, 간기능 활성화, 진정 항염, 항암, 항균작용이 보고된 바가 있다.Heals mental fever, bullshit, annoyance, insomnia, skin rash, palpitations due to high fever. Pharmacological action has been reported to coronary artery dilatation, cholesterol lowering, blood pressure lowering, liver function activation, soothing anti-inflammatory, anticancer, antibacterial action.
황금(Scutellariae radix)은 항균성분인 baicalein, baicalin, wogonin, β-sitosterol, scutellarein 등이 함유되어 있으며, 이들 성분은 강력한 항균효과와 체내에서 콜레스테롤을 저하시키고 불포화지방산의 함량을 높이는 작용, 이뇨작용, 염증치료 및 면역 활성 등이 있어 민간요법의 항생효과를 지닌 치료제로 널리 사용되고 있다.Gold (Scutellariae radix) contains antibacterial ingredients such as baicalein, baicalin, wogonin, β-sitosterol, scutellarein, etc. These ingredients have strong antimicrobial effect, lowering cholesterol in the body and increasing the content of unsaturated fatty acid, diuretic effect, It is widely used as a therapeutic agent with antibiotic effect of folk medicine because of inflammation treatment and immune activity.
본 발명자는 상기와 같은 효능을 갖는 천연약용식물들을 각각 추출하고, 여기에 면역항체가 형성된 난황및 초유를 혼합하여 사용할 시, 송아지 설사병에 대한 방어력을 증강시켜 주고 일시적인 치료 목적으로 사용되는 항생물질을 사용하지 않 고도 질병을 예방할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 발명하게 되었다.The present inventors extract the natural medicinal plants having the above-mentioned efficacy, and when used in combination with yolk and colostrum with an immune antibody, it enhances the defense against calves and diarrheal diseases and uses antibiotics for temporary treatment purposes. It was discovered that the disease can be prevented without using the present invention.
본 발명의 송아지 설사병 예방용 조성물은 조성물의 전체 중량을 기준으로 오배자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 가자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 단삼 추출물 5 ~ 10 중량 %, 황금 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 40 ~ 60 중량 %, 면역항체가 형성된 초유 10 ~ 20 중량 %로 이루어진 것이 특징이다.The calf diarrheal disease prevention composition of the present invention is based on the total weight of the composition 5-5% by weight of the gall bladder extract, 1-5% by weight Gaza extract, 5-10% by weight, Salvia extract, 5-10% by weight of golden extract, immune antibody It is characterized by consisting of egg yolk 40 to 60% by weight, colostrum 10 to 20% by weight of the immune antibody is formed.
이때, 상기 오배자 추출물, 가자 추출물, 단삼 추출물, 황금 추출물은 물에 물 중량대비 10 ~ 20 중량 %의 상기 추출물의 재료인 오배자, 가자, 단삼, 황금 중 어느 하나를 넣고 90 ~ 100 ℃에서 2 ~ 3 시간동안 열수추출하여 생성되는 것이 좋다.At this time, the gallja extract, Gaza extract, Dansam extract, golden extract is any of the ingredients of the extract of 10 ~ 20% by weight relative to the weight of water in water and put any one of the gallja, Gaza, sweet ginseng, gold 2 ~ 90 ~ 100 ℃ It is good to generate by hot water extraction for 3 hours.
또한, 상기 오배자 추출물, 가자 추출물, 단삼 추출물, 황금 추출물은 당도가 30 Brix인 것이 좋다.In addition, the five gall extract, let's extract, Salvia extract, golden extract is preferably 30 Brix sugar.
또한, 상기 면역항체가 형성된 난황 및 초유는 소 바이러스설사병, 로타바이러스, 코로나바이러스, 대장균, 살모넬라증, 파스튜렐라증으로 이루어진 항원들을 접종한 산란계가 낳은 계란 및 젖소에서 얻은 것이 특징이다. In addition, egg yolk and colostrum in which the immune antibody is formed are obtained from eggs and cows produced by laying hens inoculated with antigens consisting of bovine virus diarrheal disease, rotavirus, coronavirus, Escherichia coli, Salmonellosis and Pasturelasis.
즉, 상기와 같이 항원(antigen)을 생체내에 투여하면 이 항원의 자극에 의해 혈청속 내에 항체가 생성되며, 이 항체가 특정항원과 접촉했을때 이 특정항원에 대응하는 성질을 갖게 됨으로써 이를 면역항체라고 한다.In other words, when the antigen is administered in vivo as described above, an antibody is generated in the serum by stimulation of the antigen, and when the antibody comes into contact with a specific antigen, the antibody has a property corresponding to the specific antigen, thereby making it an immune antibody. It is called.
이상과 같이, 본 발명의 송아지 설사병 예방용 조성물은 송아지 설사병의 원인체인 소 로타바이러스(P44, 678 주), 소 로타바이러스(P44, 678 주), 소 코로나 바이러스(BC94 주), 대장균(E. coli, K99주), 살모넬라(Salmonella) 속, 파스튜렐라(Pasteurella) 속 중 선택된 1 종 이상에 대해 뛰어난 예방효과를 나타냄으로써, 사료첨가제 등으로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.As described above, the composition for preventing calf diarrhea of the present invention is bovine rotavirus (P44, 678 strains), bovine rotavirus (P44, 678 strains), bovine corona virus (BC94 strains), E. coli ( E. coli, K99 state), by Salmonella (Salmonella), a wave stew Pasteurella (Pasteurella) represents an excellent preventive effect on the at least one selected of the genus may also be used very useful as feed additives and the like.
또한, 약학적 조성물로도 이용할 수 있으며, 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있고, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있고, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.It can also be used as a pharmaceutical composition, can be prepared by methods known in the pharmaceutical field, and mixed with itself or with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent or the like powder, granules, tablets, capsules Or prepared in the form of injections or the like, which may be administered orally or parenterally.
본 발명에 따른 송아지 설사병 예방용 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.The effective dosage of the calf diarrheal disease preventing composition according to the present invention may be appropriately selected depending on the absorption rate, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, age, sex and condition, the severity of the disease to be treated.
본 발명에 의해, 항생물질을 대체할 수 있음과 동시에 인체무해한 천연약용식물의 추출물과 면역항체가 형성된 난황 및 초유를 이용하여 안전성 및 안정성을 확보한 상태에서 축산 농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있는 송아지 설사병 예방용 조성물이 제공된다.According to the present invention, it is possible to replace antibiotics and at the same time contribute significantly to the income increase of livestock farmers in the state of securing safety and stability using egg yolk and colostrum formed with harmless natural medicinal plants and immune antibodies. A calf diarrheal disease preventing composition is provided.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
<실시예 1> 천연약용식물들의 추출물 제조 Example 1 Preparation of Extracts of Natural Medicinal Plants
가. 천연약용식물들 선정end. Selection of natural medicinal plants
본 발명에 있어서 세균성으로 질병을 일으키는 송아지 설사병에 대한 항균성 측정시험 결과 항균성 시험결과가 우수한 오배자, 가자, 단삼, 황금을 선정하였다.In the present invention, the antimicrobial measurement test result for calf diarrheal disease causing bacterial disease was selected as a quince, Gaza, Salvia, Gold, excellent antimicrobial test results.
나. 천연약용식물들의 준비방법I. How to prepare natural medicinal plants
천연약용식물들은 깨끗한 물로 2 회이상 씻어준 다음, 건조시킨 후 사용하였다.Natural medicinal plants were washed twice with clean water and then dried.
다. 천연약용식물들의 추출All. Extraction of Natural Medicinal Plants
상기 나.에서 준비된 천연약용식물들을 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄한 다음, 추출기(동남산업 DN0017TM)에 증류수 5,000 ㎖에 생약재 500 g을 넣고 100 ℃에서 3 시간 추출하였으며, 추출한 추출물은 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과 후 Advantec 1.0㎛ Membrane filter를 이용하여 추출물을 각각 여과한 후 Brix(ATAGO, HSR500TM)를 측정하여 사용하였다.The natural medicinal plants prepared in B. were each ground using a grinder, and then 500 g of herbal medicines were added to 5,000 ml of distilled water in an extractor (Dongnam Industrial Co., Ltd. DN0017 TM ), and extracted at 100 ° C. for 3 hours. The extracted extract was a filter paper (Advantec 1 After the first filtration using the first filter paper), the extract was filtered using an Advantec 1.0 μm Membrane filter and Brix (ATAGO, HSR500 ™ ) was measured and used.
이에, 오배자추출물(30Brix), 가자추출물(30Brix), 단삼추출물(30Brix), 황금추출물(30Brix)을 제조하였다.Thus, gall bladder extract (30Brix), gaja extract (30Brix), salvia extract (30Brix), golden extract (30Brix) was prepared.
<실시예 2> 면역항체가 형성된 난황 및 초유 생산Example 2 Egg Yolk and Colostrum Production
1. 주요 질병 원인체에 대한 항원제조1. Production of antigens for major disease agents
가. 소 바이러스설사병(NADL 주)end. Bovine virus diarrheal disease (NADL state)
1) 바이러스접종 및 배양1) Vaccination and Culture
소 신장(Bovine kidney, MDBK)세포를 37 ℃에서 세포증식용 배양액(부기 1) 에 배양하여 세포의 단층이 50 %형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 세포유지용 배양액(부기 2)에 1 ㎖당 104.0TCID50의 NADL바이러스를 접종하여 37 ℃에서 3 ~ 4일간 회전 배양하였다.Bovine kidney (MDBK) cells were cultured in a cell proliferation medium (Supplementary Note 1) at 37 ° C, and when 50% of the monolayers of cells were formed, the culture medium for proliferation was removed and then per 1 ml in the cell maintenance medium (Supplementary Note 2). NADL virus of 10 4.0 TCID 50 was inoculated and cultured for 3 to 4 days at 37 ° C.
2) 바이러스수확 및 처리2) Virus Harvesting and Processing
접종바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 수확하며 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 ㎖당 106.0TCID50이상이어야 하며, 감염액은 -80 ℃에서 3 회 동결 융해한 다음 원심 침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.When the cell denaturation effect by the inoculated virus is about 80% or more, the virus content of the cultured infection solution should be 10 6.0 TCID 50 or more per ml, and the infection solution was freeze-thawed at -80 ° C three times and then centrifuged. The supernatant was then concentrated and used as antigen.
<부기 1. 세포증식용 배양액 조성성분(1,000㎖)>Bookkeeping 1. Cell Proliferation Culture Composition (1,000ml)>
α-MEM --------------------------------- 930 ㎖α-MEM --------------------------------- 930 ml
Fetal bovine serum(FBS) ---------------- 50 ㎖Fetal bovine serum (FBS) ---------------- 50 ml
7.5% NaHCO3 --------------------------------------------- 20 ㎖7.5% NaHCO 3 --------------------------------------------- 20 Ml
Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit/㎖Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit / ml
Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍/㎖Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍ / ml
Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍/㎖Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍ / ml
<부기 2. 세포유지용 배양액 조성성분(1,000㎖)><Appendix 2. Cell culture composition components (1,000 ml)>
α-MEM --------------------------------- 950 ㎖α-MEM --------------------------------- 950 ml
Fetal bovine serum(FBS) ---------------- 30 ㎖Fetal bovine serum (FBS) ---------------- 30 ml
7.5% NaHCO3 --------------------------------------------- 20 ㎖7.5% NaHCO 3 --------------------------------------------- 20 Ml
Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit/㎖Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit / ml
Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍/㎖Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍ / ml
Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍/㎖ Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍ / ml
나. 소 로타바이러스(P44, 678 주)I. Bovine Rotavirus (P44, 678 shares)
1) 바이러스접종 및 배양1) Vaccination and Culture
사바나 원숭이 신장(Green monkey kidney, MA104)세포를 37 ℃에서 세포증식용 배양액(부기 1)에 배양하여 세포의 단층이 형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 소 간결정트립신(Crystallized trypsin)이 1 ㎖당 10 ㎍ 이 첨가된 배지에 1 ㎖당 104.0TCID50의 P44, 678바이러스를 각각 희석하여 접종한 다음, 1 시간 감작시킨 후 우태혈청(FBS, Fetal bovine serum)이 함유된 α-MEM에 소 간결정트립신(Crystallized trypsin)이 1 ㎖당 0.5 ㎍을 첨가한 세포유지용 배양액(부기 2)을 가하여 37 ℃에서 24 ~ 48시간 회전 배양하였다.Green monkey kidney (MA104) cells were cultured in a cell proliferation medium (Supplementary Note 1) at 37 ° C to remove the growth medium when a monolayer of cells was formed, followed by 1 ml of bovine crystallized trypsin. Inoculated with 10 µg of medium containing 10 4.0 TCID 50 of P44 and 678 viruses per ml, and then sensitized for 1 hour, followed by bovine liver in α-MEM containing fetal bovine serum (FBS). Crystallized trypsin was added to the cell holding culture medium (additional supplement 2) to which 0.5 µg was added per 1 ml, and cultured at 37 ° C. for 24 to 48 hours.
2) 바이러스수확 및 처리2) Virus Harvesting and Processing
접종 바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 수확하며 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1 ㎖당 106.0TCID50이상이어야 하며, 감염액은 -80 ℃에서 3 회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.When the cell denaturation effect by the inoculated virus is about 80% or more, the virus content of the cultured infectious solution should be 10 6.0 TCID 50 or more per ml. After precipitation, the supernatant was concentrated and used as an antigen.
다. 소 코로나바이러스(BC94 주)All. Bovine Coronavirus BC
1) 바이러스접종 및 배양1) Vaccination and Culture
소 신장(Bovine kidney, MDBK)세포를 37℃에서 세포증식용 배양액(부기 1)에 배양하여 세포의 단층이 형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 세포유지용 배양액(부기 2)에 1 ㎖당 104.0TCID50의 BC94바이러스를 접종하여 37 ℃에서 4 ~ 5일간 회전 배양하였다.Bovine kidney (MDBK) cells were cultured in a cell proliferation medium (Supplementary Note 1) at 37 ° C, and when the monolayer of cells was formed, the culture medium for proliferation was removed and 10 4.0 per ml in the cell maintenance culture medium (Supplementary Note 2). BC94 virus of TCID 50 was inoculated and spin-cultured at 37 ° C. for 4-5 days.
2) 바이러스수확 및 처리2) Virus Harvesting and Processing
접종바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 수확하며 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1 ㎖당 105.5TCID50이상이어야 하며, 감염액은 -80 ℃에서 3 회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.When the cell denaturation effect by the inoculated virus is about 80% or more, the virus content of the cultured infection solution should be 10 5.5 TCID 50 or more per ml, and the infection solution should be freeze-thawed three times at -80 ℃ and After precipitation, the supernatant was concentrated and used as an antigen.
라. 대장균(E. coli)la. E. coli
1) 종균배양1) spawn culture
-80 ℃에 보관중인 균주(k99주)를 SBA(Sheep blood agar) 배지에 이식하여 37 ℃에서 20 시간 배양 후, 전형적인 단독집락을 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 계대 배양하여 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다.The strain (k99 strain) stored at -80 ° C was transplanted to SBA (Sheep blood agar) medium and incubated at 37 ° C for 20 hours, followed by culturing by passage in BHI (Brain heart infusion) liquid medium using a typical single colony. The culture was used as seed.
2) 본 배양2) main culture
BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 종균을 본 배양배지의 2.5 %를 접종하여 37 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 18 시간 진탕배양하였다.The seed was inoculated into BHI (Brain heart infusion) liquid medium and inoculated with 2.5% of the culture medium, followed by shaking culture for 18 hours while stirring at 150 rpm at 37 ° C.
3) 균체수집 및 처리3) Cell collection and processing
37 ℃에서 18 시간 진탕 배양한 감염배양액에 0.3 % 포르말린을 가하여 불활화 시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2 회 세척한 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 ㎚의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 항원으로 사용하였다.0.3% formalin was added to the incubated culture medium shaken at 37 ° C for 18 hours, and then concentrated. The cultured cells were collected by centrifugation at 5,000 rpm for 30 minutes, and then collected with Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS). The collected cells were washed twice and then measured as OD (Optical density) at a wavelength of 410 nm using a spectrophotometer and used as an antigen.
마. 살모넬라(Salmonella)균hemp. Salmonella (Salmonella) bacteria
1) 종균배양1) spawn culture
-80 ℃에 보관중인 살모넬라 속(S. enteritidis, S. typhimurum) 균주를 SBA(Sheep blood agar)배지에 각각 이식하여 37 ℃에서 20 시간 배양 후, 전형적인 단독집락을 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 각각 계대 배양하여 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다. S. enteritidis (S. typhimurum ) strains stored at -80 ° C were transplanted to SBA (Sheep blood agar) media, respectively, and cultured at 37 ° C for 20 hours, followed by selection of a typical single colony (Brain heart infusion). Subcultured and cultured in each liquid medium was used as the seed.
2) 본 배양2) main culture
BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 살모넬라 속(S. enteritidis, S. typhimurum) 균주를 본 배양배지의 2.5 %를 각각 접종하고 37 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 18시간 진탕배양하였다. S. enteritidis (S. typhimurum ) in BHI (Brain heart infusion) liquid medium The strain was inoculated with 2.5% of the culture medium and shaken for 18 hours with shaking at 150 rpm at 37 ℃.
3) 균체수집 및 처리3) Cell collection and processing
37 ℃에서 18 시간 각각 진탕 배양한 감염배양액에 0.3 %포르말린을 가하여 불활화시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2 회 세척한 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 ㎚의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 항원으로 사용하였다.0.3% formalin was added to the inoculated culture medium shaken at 37 ° C. for 18 hours, concentrated, and the cells were collected by centrifugation of the concentrated culture cells at 5,000 rpm for 30 minutes. Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS) was collected. After washing the cells collected twice with a spectrophotometer (Spectrophotometer) was measured at the wavelength of 410 nm OD (Optical density) was used as the antigen.
바. 파스튜렐라(Pasteurella)균 배양bar. Pasteurella Bacteria Culture
1) 종균배양1) spawn culture
- 80 ℃에 보관중인 파스튜렐라 속(P. multocida A, P. haemolytica) 균주를 SBA(Sheep blood agar)배지에 각각 이식하여 37 ℃에서 20 시간 배양 후, 전형적인 단독집락을 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 각각 계대 배양하여 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다. P. multocida A, P. haemolytica, stored at 80 ° C. Strains were transplanted into SBA (Sheep blood agar) media and incubated at 37 ° C. for 20 hours, and then, a typical single colony was selected and passaged to BHI (Brain heart infusion) liquid media, respectively.
2) 본 배양2) main culture
BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 파스튜렐라 속(P. multocida A, P. haemolytica)균을 본 배양배지의 2.5 %를 각각 접종하고, 37 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 20 시간 진탕배양하였다. P. multocida A (P. haemolytica ) bacteria were inoculated into BHI (Brain heart infusion) liquid medium, and 2.5% of the culture medium was inoculated, and the culture was shaken for 20 hours with stirring at 150 rpm at 37 ° C.
3) 균체수집 및 처리3) Cell collection and processing
37 ℃에서 20 시간 각각 진탕 배양한 감염배양액에 0.3 %포르말린을 가하여 불활화 시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2 회 세척한 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 ㎚의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 항원으로 사용하였다.0.3% formalin was added to the inoculated culture broth shaken at 37 ° C. for 20 hours, and then concentrated. The cultured cells were collected by centrifugation at 5,000 rpm for 30 minutes, and Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS) was collected. After washing the cells collected twice with a spectrophotometer (Spectrophotometer) was measured at the wavelength of 410 nm OD (Optical density) was used as the antigen.
2. 면역형성용 면역제제2. Immunogen for Immunogenesis
가. 산란계 접종용end. For laying hens
상기 1.과 같이 준비된 소 바이러스설사병, 로타바이러스, 코로나바이러스 및 대장균, 살모넬라증, 파스튜렐라증의 농축된 항원들을 각각 혼합하여 30 %의 유제액을 만든 다음, 70 %의 면역증강제(Oil adjuvant, Montnide ISA70)를 가하여 잘 혼합한 다음, 13,000 rpm에서 3 분간 균질기(Homogenizer)를 이용하여 면역제제를 생산하였다.Bovine virus diarrheal disease, rotavirus, coronavirus and E. coli, Salmonella, Pasteurella, each prepared by mixing the concentrated antigens of 30% emulsion, 70% immunoadjuvant (Oil adjuvant, Montnide ISA70) was added and mixed well, and immunogen was produced using a homogenizer for 3 minutes at 13,000 rpm.
나. 젖소 접종용I. For cows inoculation
상기 1.과 같이 준비된 소 바이러스설사병, 로타바이러스, 코로나바이러스 및 대장균, 살모넬라증, 파스튜렐라증 항원들을 각각 혼합하여 85 %의 유제액을 만든 다음, 5 %의 면역증강제(Oil adjuvant, Montnide ISA25) 와 10 %의 수산화알루미늄 겔을 가하여 1,000 rpm에서 30 분간 유제하여 면역제제를 생산하였다.Bovine virus diarrheal disease, rotavirus, coronavirus and E. coli, Salmonellosis, Pasteurellasis antigens, respectively, prepared by mixing 85% of the emulsion, and then 5% of the adjuvant (Oil adjuvant, Montnide ISA25) And 10% aluminum hydroxide gel was added to emulsify at 1,000 rpm for 30 minutes to produce an immunologic agent.
3. 면역형성용 면역제제 접종방법3. Immunization for Immunization
가. 산란계end. Laying hen
상기 2.에서 생산된 산란계 면역형성용 면역제제를 20 주령의 산란계에 마리당 0.8 ㎖씩 앞가슴 근육에 1차로 접종하고, 2차 접종은 1차 접종 3주후, 3차 접종은 2차 접종 3주후에 근육에 각각 접종하였으며, 그 이후 면역제제 접종은 3개월 단위로 추가 접종하였다.Inoculated with the immune system for laying hens immune system produced in the above 2 to 0.8 grams per horse in the 20-week-old laying hens first, the second inoculation 3 weeks after the first inoculation, the third inoculation 3 weeks after the second inoculation The muscles were inoculated respectively, followed by booster immunization every three months.
나. 젖소I. milk cow
상기 2.에서 생산된 젖소 면역형성용 면역제제를 분만 6 주전에 1 마리당 3.0 ㎖씩 근육에 1 차 접종하고, 2 차 접종은 분만 3 주전에 각각 접종하였다.Cows immunization for immune immunization produced in 2. was inoculated first in muscle by 3.0ml per horse 6 weeks before delivery, the second inoculation was inoculated 3 weeks before delivery, respectively.
4. 면역항체가 형성된 난황 및 초유 수거4. Collection of yolk and colostrum with immune antibodies
1) 난황 수거1) Egg yolk collection
상기 3.에 따라 면역제제를 3 차접종 2 주후부터 면역 항체가 형성된 난황을 위생적으로 수거한 후, 150 ppm의 차아염소산나트륨을 계란에 분사하여 깨끗하게 세척한 다음, 건조실에서 계란 표면의 수분을 완전히 건조시켰다.After 2 weeks after the 3rd immunization of the immunization agent, the yolks in which the immune antibodies were formed were collected hygienically, and 150 ppm of sodium hypochlorite was sprayed onto the eggs to clean the eggs. Dried.
상기와 같이 건조시킨 계란을 할란하여 면역항체가 형성된 난황을 채취하여 분말로 제조하는데 사용하였다. Eggs dried as described above were harvested and egg yolks with immune antibodies were collected and used to prepare powders.
2) 초유 수거2) Colostrum Collection
상기 3. 면역제제를 접종한 후 분만한 어미 젖소로부터 초유를 멸균된 용기에 담아 분말로 건조하는데 사용하였다3. After the inoculation of the immunization agent, colostrum was delivered from a mother cow delivered into a sterile container and dried to a powder.
<실시예 3> 본 발명인 송아지 설사병 예방용 조성물1<Example 3> The present invention calf diarrhea disease prevention composition 1
상기 실시예 1에서 제조된 천연약용식물들의 추출물들을 혼합하되, 전체중량을 기준으로 오배자추출물 4 %(30Brix), 가자추출물 4 %(30Brix), 단삼추출물 6 %(30Brix), 황금추출물 6 %(30Brix)의 비율로 혼합하였다.Mix the extracts of the natural medicinal plants prepared in Example 1, but based on the total weight of galleng extract 4% (30 Brix), Gaza extract 4% (30 Brix), 6% (30 Brix), Salvia extract 6% (Gold extract) 30 Brx).
여기에 상기 실시예 2에서 제조된 면역항체가 형성된 난황과 초유를 넣되, 전체중량을 기준으로 면역항체가 형성된 난황 60%, 초유 20%를 넣고 잘 혼합하며, 이를 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 디스크 및 노즐형태의 분무방법으로 수분을 건조시켜 수분 함량이 10 % 미만의 분말형태로 될때까지 건조시켜 본 발명인 송아지 설사병 예방용 조성물1을 제조하였다.Put the yolk and colostrum formed with the immune antibody prepared in Example 2, but 60%, yolk colostrum 20% with the immune antibody formed based on the total weight and mix well, using a spray dryer (Spray dryer) To dry the moisture by the spray method of the disk and nozzle form to dry until the water content is less than 10% powder form to prepare a composition for preventing calves diarrhea of the present invention.
<실시예 4> 본 발명인 송아지 설사병 예방용 조성물2<Example 4> The present inventors calf diarrhea disease prevention composition 2
상기 실시예 3에서 제조된 송아지 설사병 예방용 조성물1 의 60g에 물 100 ㎖을 넣은 후 반죽기를 이용하여 약간 걸죽하면서 매끄러운 반죽이 되도록 균질화시킨다음, 프락토 올리고당(Fructo-oligosaccharides) 20g을 첨가하여 페이스트형태로 형성된 본 발명인 송아지 설사병 예방용 조성물2를 제조하였다.60 ml of the calf diarrheal disease prevention composition 1 prepared in Example 3 was added to 100 ml of water, homogenized to a slightly thick and smooth dough using a dough machine, and then added by adding 20 g of fructo-oligosaccharides to the paste. Calf diarrhea disease prevention composition 2 of the present invention formed in the form was prepared.
<실험예 1> 천연약용식물에 대한 항균력 측정Experimental Example 1 Measurement of Antimicrobial Activity against Natural Medicinal Plants
1. 실험방법1. Experimental method
1) 항균력 실험에 사용한 병원체1) Pathogen used for antimicrobial activity test
소 질병을 일으키는 Escherichia coli(k99), Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurum, Pastuellar multocida(A), Pastuellar heamolytica(Mannheimia haemolytica)에 대한 병원체를 대상으로 천연약용식물들의 추출물들이 나타내는 항균성을 측정하였다. Antimicrobial activity of extracts of natural medicinal plants was measured for pathogens against Escherichia coli (k99), Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurum, Pastuellar multocida (A), and Pastuellar heamolytica (Mannheimia haemolytica) .
2) 실험재료2) Experimental material
천연약용식물인 오배자, 가자, 단삼, 황금을 각각 열수 추출하여 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과한 후 원심분리기(한일 Supra 22KTM)를 이용하여 5,000 rpm에서 30 분간 원심 후 상청액을 여과지(Advantec 1.00㎛ Membrane filter)를 이용하여 여과한 후, 진공농축기(EYELA SB1000TM)를 이용하여 80 ℃ 온탕수조에서 10 배로 감압 농축하여 각각의 실험재료들을 준비하였다.After extracting hot water of natural medicinal plants such as Fructus, Gaza, Sweet Ginseng, and Gold, each of them was first filtered through filter paper (Advantec No. 1 filter paper) and centrifuged at 5,000 rpm using a centrifuge (Hanil Supra 22K TM ) for 30 minutes. The supernatant was filtered using a filter paper (Advantec 1.00 μm Membrane filter), and then concentrated under reduced pressure 10 times in a hot water bath at 80 ° C. using a vacuum concentrator (EYELA SB1000 ™ ) to prepare respective test materials.
3) 항균력에 사용할 페이퍼 디스크3) Paper disk to be used for antibacterial activity
페이퍼 디스크(ADVANTEC AD49005040TM, 6㎜)에 상기 실험재료들을 각각 20 ㎕씩 흡식시킨 다음, 50 ℃ 건조기에서 충분히 건조시킨 후 항균력 실험에 사용하였다.20 μl of each of the test materials was sucked into a paper disc (ADVANTEC AD49005040 ™ , 6 mm), and then sufficiently dried in a 50 ° C. dryer, and used for antibacterial activity.
4) 항균력 실험방법4) Antibacterial test method
소 질병의 원인체에 대한 항균력 실험을 실시하기 위하여 - 80 ℃에 보관중인 균주를 Agar 평판배지에서 24 ~ 48 시간 배양하여 Colony를 선정하여 균 배양액인 BHI(Brain heart infusion) 배지에 접종하여 37 ℃에서 18 ~ 24 시간 균주를 배양하였으며, 배양액의 균 증식확인은 분광광도계(Spectrophotometer, Beckman DU650TM)를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정하여 균 증식배양액은 O.D(Optical density)값 1.2로 조정 사용하였다.In order to conduct the antimicrobial test on the causative agent of bovine disease-Incubate the strain stored at 80 ℃ in Agar plate medium for 24 to 48 hours, select Colony and inoculate it in the BHI (Brain heart infusion) medium which is the bacterial culture at 37 ℃ Strains were cultured for 18 to 24 hours, and the bacterial growth was confirmed by measuring the OD (Optical density) at a wavelength of 410 nm using a spectrophotometer (Spectrophotometer, Beckman DU650 TM ). Adjust to value 1.2 was used.
페트리디쉬(Petri dish, 87×15㎜)에 MHA(Mueller hinton agar) 또는 BHI(Brain heart infusion agar) 배지를 15 ㎖씩 가한 평판배지에 균액 100 ㎕를 골고루 도말하고, 그 위에 각각의 상기 3) 에서 준비해 둔 페이퍼 디스크들을 각각 올려놓고 37 ℃ 인큐베이터에서 24 시간 배양한 다음, 디스크 주변에 형성된 Clear zone(균 증식이 억제되어 투명하게 형성된 지역)의 직경을 측정하였다.Spread 100 μl of bacterial solution on a plate medium to which 15 ml of Mueller hinton agar (MHA) or Brain heart infusion agar (BHI) medium was added to a Petri dish (87 × 15 mm). Each of the paper disks prepared in the above was incubated for 24 hours in a 37 ℃ incubator, and then measured the diameter of the clear zone (transparent zone formed by suppressing bacterial growth) formed around the disk.
2. 실험결과2. Experimental Results
상기 실험결과, 아래의 표 1과 같이 나타났다.As a result of the experiment, shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타나 있듯이, 오배자, 가자, 단삼, 황금 추출물이 소 질병을 일으키는 대장균(Escherichia coli, k99), 살모넬라 속(Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurum), 파스튜렐라 속(Pastuellar multocida(A), Pastuellar heamolytica)에 대해 모두 항균력을 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 1, E. coli ( Esherichia coli, k99 ) , Salmonella enteritidis (Salmonella typhimurum ) , Pasteurlar multocida (A), Pastuellar, which is a blast , Gaza, Salvia, and golden extract causing bovine disease heamolytica ) all showed antimicrobial activity.
<실험예 2> 난황 내에 형성된 병원체에 대한 면역항체가와 초유에 대한 면역항체가 확인실험Experimental Example 2 Immunoantibody Value against Pathogens Formed in Egg Yolk and Immune Antibodies Against Colostrum
1. 실험방법1. Experimental method
소 바이러스설사병, 로타바이러스, 코로나바이러스 및 대장균, 살모넬라, 파스튜렐라 감염증의 항원을 산란계에 2 차접종한 후 3주째부터 면역시킨 닭의 계란을 수득하여 난황 내에 형성된 병원체에 대한 면역항체가와 초유에 대한 면역항체가 확인시험을 중화시험법(Neutralization test) 및 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)으로 실시하였다.Bovine virus diarrheal disease, rotavirus, coronavirus and E. coli, Salmonella, Pasteurella infection of the chicken eggs were immunized from the third week after laying the eggs in chicken eggs 2 weeks after the immune antibody to the pathogen formed in egg yolk Immunoantibody identification test was performed by Neutralization test and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
가. 소 바이러스성 설사병에 대한 시험end. Test for Bovine Viral Diarrhea
중화시험법(Neutralization test)을 이용하여 난황 및 초유에 대한 면역항체가를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.Using the neutralization test (Neutralization test), the antibody titers for yolk and colostrum were measured by the following method.
1) 바이러스 배양1) Virus Culture
① MDBK(Bovine kidney)세포가 80 % 단분자 막(monolayer)을 형성하였을 때 소 바이러스설사병 바이러스를 접종하였다(75㎠ flask).① MDBK (Bovine kidney) cells were inoculated with bovine virus diarrheal virus when they formed 80% monolayers (75 cm 2 flask).
② 37 ℃에서 접종된 바이러스가 잘 흡착될 수 있도록 가끔 흔들어 주면서 2시간동안 흡착시켰다.② Adsorbed for 2 hours while shaking occasionally so that the virus inoculated at 37 ℃ can be adsorbed well.
③ 접종된 바이러스를 제거하고 3 % 우태혈청(FBS, Fetal bovine serum)이 함유된 배지를 30 ㎖ 씩 넣어주었다.③ The inoculated virus was removed and 30 ml of medium containing 3% fetal bovine serum (FBS) was added.
④ 37 ℃에서 3 ~ 4일간 배양하면서 접종바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 냉동고에 3회 동결융해시켰다.④ When cultured at 37 ° C. for 3 to 4 days, the cytopathic effect caused by the inoculation virus was about 80% or higher and freeze-thawed in the freezer three times.
⑤ 동결 융해한 바이러스를 3,000 rpm에 10 분간 원심하여 상층액을 2 ㎖씩 분주하여 -80 ℃에 보관하여 항원으로 사용하였다.⑤ Centrifuged freeze-thawed virus at 3,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was dispensed 2ml each and stored at -80 ℃ to use as an antigen.
2) 바이러스 역가측정2) Virus titer measurement
① -80 ℃에 보관중인 바이러스를 10 진법으로 희석한 다음 각 희석액당 마이크로플레이트(microplate) 4 개 well에 100 ㎕씩 접종하였다.① The virus stored at -80 ° C was diluted by the decimal method, and then 100 µl was inoculated into four wells of microplates for each dilution.
② 3×104cell/100㎕로 부유된 MDBK세포를 100 ㎕씩 가하였다.② 100 μl of MDBK cells suspended in 3 × 10 4 cells / 100 μl were added.
③ 37 ℃, CO2-인큐베이터(incubator)에서 7 일간 정치배양하면서 접종바이러스에 의한 세포변성효과를 관찰하였다.③ The cell denaturation effect by inoculation virus was observed while stationary culture for 7 days at 37 ℃, CO 2 -incubator.
④ Reed와 Muench법으로 TCID50를 계산하여 바이러스의 역가를 산출하였다.④ The titer of virus was calculated by calculating TCID 50 by Reed and Muench method.
3) 면역항체가 확인 시험방법3) Immune antibody identification test method
① microplate 첫 번째 well에 100 ㎕의 난황추출물과 초유를 각각 넣고 이미 역가를 알고 있는 면역난황항체의 양성과 음성(Sigma 제조난황분말)을 두었다.① 100 μl of yolk extract and colostrum were added to the first microplate well, and the positive and negative (sigma yolk powder manufactured by Sigma) were placed.
② 모든 well에 세포배양액(혈청 비포함)을 50 ㎕씩 분주하였다. ② Dispense 50 μl of cell culture solution (no serum) into all wells.
③ 첫 well부터 50 ㎕씩 2진 희석하였다.③ 50 μL of binary dilutions from the first well.
④ 보관된 바이러스를 세포배양액으로 200 TCID50/100 ㎕되게 희석하여 검사 well에 50 ㎕씩 가하고 대조 well 및 Back titration well에는 세포배양액을 50㎕씩 가하였다.④ to dilute the virus to be stored in cell culture medium 200 TCID 50/100 ㎕ was added by 50 ㎕ the test well was added to the cell culture medium by 50㎕ In contrast well and Back titration well.
⑤ 희석된 바이러스를 3 단계 10 진희석하여 역적정법(Back titration)을 실시한 다음 37 ℃, CO2 incubator에서 1 시간 중화시켰다.⑤ Diluted virus was subjected to back titration by 3 dilution of 10 steps and neutralized for 1 hour in a CO 2 incubator at 37 ° C.
⑥ 10 % Fetal bovine serum이 첨가된 배양배지에 MDBK세포를 3×104cell/100 ㎕정도 되도록 현탁하여 microplate 모든 well에 100 ㎕씩 넣었다.⑥ Suspend MDBK cells in a culture medium containing 10% Fetal bovine serum to 3 × 10 4 cells / 100 μl and add 100 μl to all wells of the microplate.
⑦ 37 ℃, CO2 incubator에서 3 ~ 4 일간 배양하였다.⑦ Incubated for 3 to 4 days at 37 ℃, CO 2 incubator.
⑧ 바이러스를 첨가한 well에서 세포변성효과가 100 % 저해되고 해당 well에서 monolayer가 형태적으로 대조군의 well과 비교하여 거의 일치할 때 해당되는 well의 최고 희석배수의 역수를 면역항체가로 표시하였다.⑧ When the virus-denatured effect was 100% inhibited in the virus-added well and the monolayer morphologically matched well in comparison with the control well, the reciprocal of the highest dilution factor of the corresponding well was expressed as an immunoantibody titer.
나. 로타바이러스에 대한 시험I. Test for Rotavirus
중화시험법(Neutralization test)을 이용하여 난황 및 초유에 형성된 면역항체가를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.Using the neutralization test (Neutralization test), the antibody titers formed in yolk and colostrum were measured by the following method.
1) 바이러스 배양1) Virus Culture
① MA104(Green monkey kidney)세포가 100 % 단분자 막(monolayer)을 형성하였을 때 트립신(trypsin)이 1 ㎖당 10 ㎍ 이 첨가된 배지에 로타바이러스를 접종하였다(75 ㎠ flask).① When MA104 (Green monkey kidney) cells formed a 100% monolayer, a rotavirus was inoculated into a medium containing 10 μg of trypsin per ml (75 cm 2 flask).
② 37 ℃에서 접종된 바이러스가 잘 흡착될 수 있도록 가끔 흔들어 주면서 1시간동안 흡착시켰다.② Adsorbed for 1 hour while shaking occasionally so that the virus inoculated at 37 ℃ can be adsorbed well.
③ 접종된 바이러스를 제거하고 트립신(trypsin)이 1 ㎖당 0.5 ㎍을 첨가한 배양액 30 ㎖씩 넣어주었다.③ The inoculated virus was removed, and 30 ml of the culture medium in which 0.5 g of trypsin was added per ml.
④ 37 ℃에서 24 시간 배양하면서 접종바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 냉동고에 3 회 동결융해시켰다.④ When cultured at 37 ° C. for 24 hours, cytotoxicity caused by the inoculated virus was about 80% or more, and freeze-thawed in the freezer three times.
⑤ 동결 융해한 바이러스를 3,000 rpm에 10 분간 원심하여 상층액을 2 ㎖씩 분주하여 -80 ℃에 보관하여 항원으로 사용하였다.⑤ Centrifuged freeze-thawed virus at 3,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was dispensed 2ml each and stored at -80 ℃ to use as an antigen.
2) 바이러스 역가측정2) Virus titer measurement
① -80 ℃에 보관중인 바이러스를 10 진법으로 희석한 다음 각 희석액 당 microplate 4 개 well에 100 ㎕씩 접종하였다.① Diluted virus stored in -80 ℃ by decimal method and inoculated 100 μL in 4 wells of each microplate per dilution.
② 3×105cell/100 ㎕로 부유된 MA104세포에 트립신(trypsin)이 1 ㎖당 0.5 ㎍을 첨가한 세포배양액을 100 ㎕씩 가하였다.② 100 μl of the cell culture solution in which 0.5 μg of trypsin was added to 1 mL of MA104 cells suspended in 3 × 10 5 cells / 100 μl was added.
③ 37 ℃, CO2-incubator에서 7 일간 정치배양하면서 접종바이러스에 의한 세포변성효과를 관찰하였다.③ The cells were cultured at 37 ° C. in CO 2 -incubator for 7 days and observed for cytopathic effect by inoculation virus.
④ Reed와 Muench법으로 TCID50를 계산하여 바이러스의 역가를 산출하였다.④ The titer of virus was calculated by calculating TCID 50 by Reed and Muench method.
3) 면역항체가 시험방법3) Immune antibody test method
① 중화시험 2 ~ 3일전에 MA104세포를 세포배양액에 3×105cell/100 ㎕이 되게 부유시켜 96 well microplate에 0.2㎖/well 씩 분주한 다음 37 ℃, CO2-incubator에서 18 시간 배양하였다.① 2-3 days prior to the neutralization test, MA104 cells were suspended in 3 × 10 5 cells / 100 μl of the cell culture medium and dispensed into 0.2 ml / well in 96 well microplate, followed by incubation for 18 hours at 37 ℃ and CO 2 -incubator. .
② microplate 첫 번째 well에 100 ㎕의 난황추출물과 초유를 각각 넣고 이미 역가를 알고 있는 면역난황항체의 양성과 음성(Sigma 제조난황분말)을 두었다.② Put 100 μl of yolk extract and colostrum into the first well of the microplate, and put the positive and negative immune yolk antibodies (Sigma yolk powder).
③ 모든 well에 세포배양액(혈청 비포함)을 50㎕씩 분주하였다.③ Dispense 50 μl of cell culture solution (no serum) into all wells.
④ 첫 well부터 50 ㎕씩 2 진 희석하였다.④ Binary dilutions were 50 μl each from the first well.
⑤ Trypsin으로 처리한 보관된 바이러스를 세포배양액으로 200 TCID50/100 ㎕ 되게 희석하여 검사 well에 50 ㎕씩 가하고 대조 well 및 Back titration well에는 세포배양액을 50 ㎕씩 가하였다.⑤ a Trypsin the storage of the virus to the cell culture solution to be diluted to 200 TCID 50/100 ㎕ contrast added by 50 ㎕ the test well and the well Back titration well, the cell culture was treated by a 50 ㎕.
⑥ 희석된 바이러스를 3단계 10진희석하여 Back titration을 실시한 다음, 37 ℃, CO2 incubator에서 1 시간 중화시켰다.⑥ The diluted virus was subjected to back titration in 3 steps of 10 dilutions, and then neutralized for 1 hour in a CO 2 incubator at 37 ° C.
⑦ Monolayer된 microplate를 PBS(Phosphate buffered solution)로 3 회 조심스럽게 세척하였다.⑦ The monolayered microplate was carefully washed three times with PBS (Phosphate buffered solution).
⑧ 0.5 ㎍/㎖의 trypsin이 첨가된 배양배지를 microplate 모든 well에 100㎕씩 넣었다.⑧ Culture medium to which 0.5 μg / mL of trypsin was added was placed in 100 μl of all wells of the microplate.
⑨ 37 ℃, CO2 incubator에서 5 일간 배양하였다.⑨ Incubated for 5 days at 37 ℃, CO 2 incubator.
⑩ 바이러스를 첨가한 well에서 세포변성효과가 100 % 저해되고 해당 well에서 단분자 막(monolayer)이 형태적으로 대조군의 well과 비교하여 거의 일치할 때 해당되는 well의 최고 희석배수의 역수를 면역항체가로 표시하였다.세포 When the virus-denatured effect is 100% inhibited in the virus-added well and the monolayer monomorphically matches the control well, the reciprocal of the highest dilution factor of the corresponding well is obtained. Horizontally displayed.
다. 코로나바이러스에 대한 시험All. Test for Coronavirus
중화시험법(Neutralization test)을 이용하여 난황 및 초유에 대한 면역항체가를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.Using the neutralization test (Neutralization test), the antibody titers for yolk and colostrum were measured by the following method.
1) 바이러스 배양1) Virus Culture
① MDBK(Bovine kidney)세포가 80 % 단분자 막(monolayer)울 형성하였을 때 코로나바이러스를 접종하였다(75㎠ flask).① MDBK (Bovine kidney) cells were inoculated with coronavirus (75 cm 2 flask) when 80% monolayers were formed.
② 37 ℃에서 접종된 바이러스가 잘 흡착될 수 있도록 가끔 흔들어 주면서 2 시간 동안 흡착시켰다.② Adsorbed for 2 hours while shaking occasionally so that the virus inoculated at 37 ℃ can be adsorbed well.
③ 접종된 바이러스를 제거하고 3% Fetal bovine serun이 함유된 배지를 30㎖씩 넣어주었다.③ The inoculated virus was removed and 30 ml of medium containing 3% Fetal bovine serun was added.
④ 37 ℃에서 4 ~ 5일간 배양하면서 접종바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 냉동고에 3회 동결융해 시켰다.④ The cells were cultured at 37 ° C. for 4 to 5 days and were freeze-thawed three times in the freezer when the cytopathic effect caused by the inoculation virus was about 80% or more.
⑤ 동결 융해한 바이러스를 3,000 rpm에 10 분간 원심하여 상층액을 적당량으로 분주하여 -80 ℃에 보관하여 항원으로 사용하였다.⑤ Centrifuged freeze-thawed virus at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was aliquoted and stored at -80 ° C to use as antigen.
2) 바이러스 역가측정2) Virus titer measurement
① -80 ℃에 보관중인 바이러스를 10 진법으로 희석한 다음 각 희석액당 microplate 4 개 well에 100 ㎕씩 접종하였다.① Diluted virus stored in -80 ℃ by decimal method and inoculated 100 μL in 4 wells of each microplate per dilution.
② 3×104cell/100 ㎕로 부유된 MDBK세포를 100 ㎕씩 가하였다.② 100 μl of MDBK cells suspended in 3 × 10 4 cells / 100 μl were added.
③ 37 ℃, CO2-incubator에서 7 일간 정치배양하면서 접종바이러스에 의한 세포변성효과를 관찰하였다.③ The cells were cultured at 37 ° C. in CO 2 -incubator for 7 days and observed for cytopathic effect by inoculation virus.
④ Reed와 Muench법으로 TCID50를 계산하여 바이러스의 역가를 산출하였다.④ The titer of virus was calculated by calculating TCID 50 by Reed and Muench method.
3) 면역항체가 시험방법3) Immune antibody test method
① microplate 첫 번째 well에 100 ㎕의 난황추출물과 초유를 각각 넣고 이미 역가를 알고 있는 면역난황항체의 양성과 음성(Sigma 제조난황분말)을 두었다.① 100 μl of yolk extract and colostrum were added to the first microplate well, and the positive and negative (sigma yolk powder manufactured by Sigma) were placed.
② 모든 well에 세포배양액(혈청 비포함)을 50 ㎕씩 분주하였다.② Dispense 50 μl of cell culture solution (no serum) into all wells.
③ 첫 well부터 50 ㎕씩 2진 희석하였다.③ 50 μL of binary dilutions from the first well.
④ 보관된 바이러스를 세포배양액으로 200 TCID50/100㎕되게 희석하여 검사 well에 50 ㎕씩 가하고 대조 well 및 Back titration well에는 세포배양액을 50㎕씩 가하였다.④ The stored virus was diluted to 200 TCID 50/100 μl with the cell culture solution and 50 μl was added to the test well, and 50 μl was added to the control well and the back titration well.
⑤ 희석된 바이러스를 3 단계 10 진 희석하여 역적정법(Back titration)을 실시한 다음 37 ℃, CO2-incubator에서 1 시간 중화시켰다.⑤ The diluted virus was subjected to back titration by diluting 3 steps of decimal, and then neutralized for 1 hour in CO 2 -incubator at 37 ° C.
⑥ 10 % Fetal bovine serun이 첨가된 배양배지에 MDBK세포를 3×104cell/100 ㎕정도 되도록 현탁하여 microplate 모든 well에 100㎕ 씩 넣었다.⑥ Suspend MDBK cells in a culture medium containing 10% Fetal bovine serun to 3 × 10 4 cells / 100 μl and place them in 100 μl in all wells of the microplate.
⑦ 37 ℃, CO2-incubator에서 4 ~ 5 일간 배양하였다.⑦ 37 ℃, incubated in a CO 2 -incubator for 4 to 5 days.
⑧ 바이러스를 첨가한 well에서 세포변성효과가 100 % 저해되고 해당 well에서 monolayer가 형태적으로 대조군의 well과 비교하여 거의 일치할 때 해당되는 well의 최고 희석배수의 역수를 면역항체가로 표시하였다.⑧ When the virus-denatured effect was 100% inhibited in the virus-added well and the monolayer morphologically matched well in comparison with the control well, the reciprocal of the highest dilution factor of the corresponding well was expressed as an immunoantibody titer.
라. 대장균, 살모넬라, 파스튜렐라증에 대한시험la. Test for E. coli, Salmonella, Pasteurella
항원의 균체를 초음파파쇄기(sonicator)로 처리하여 추출한 균체의 외피단백질(Outer membrane protein)을 라우로살코신(N-lauroylsarcosine)으로 처리한 후 스파덱스(Sephadex G-200 gel)를 이용한 컬럼 크로마토그래피(Column chromatatography)로 추출된 항원을 이용하여 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)으로 난황 및 초유에 대한 면역항체가를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.Antigen cells were treated with sonicator to treat outer membrane protein with N-lauroylsarcosine, followed by column chromatography using Spadex G-200 gel. Using the antigen extracted by (Column chromatatography) by using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the antibody titers of yolk and colostrum were measured by the following method.
1) 검사기구1) Inspection mechanism
① ELISA용 microplate① Microplate for ELISA
② Microplate(10㎕, 200㎕용), 12-Channel Multipipette(20 ~ 200 ㎕용)② Microplate (10µl, 200µl), 12-Channel Multipipette (20 ~ 200µl)
③ Shaker(microplate용)③ Shaker (for microplate)
④ ELISA reader 및 washing④ ELISA reader and washing
2) 검사 시약2) Inspection Reagent
① 완충액 및 용액① Buffer and Solution
ⓐ Carbonate coating buffer(0.M, pH 9.6)Ⓐ Carbonate coating buffer (0.M, pH 9.6)
ㆍNaHCO3 ----- 2.93 gNaHCO 3 ----- 2.93 g
ㆍNa2CO3 ----- 1.59 gNa 2 CO 3 ----- 1.59 g
1,000㎖ DW에서 교반하면서 pH가 9.6이 되도록 조정하여 4 ℃보관하여 사용하였다.The pH was adjusted to 9.6 with stirring at 1,000 ml DW and stored at 4 ° C.
ⓑ Phosphate buffered saline(PBS), pH 7.4Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
ㆍNaCl ------- 8 gNaCl ------- 8 g
ㆍKH2PO4 ------ 0.2 gㆍ KH 2 PO 4 ------ 0.2 g
ㆍNa2HPO4 ----- 1.19 gNa 2 HPO 4 ----- 1.19 g
ㆍKCl --------- 0.2 g KCl --------- 0.2 g
DW 1,000㎖에 용해한 다음 pH가 7.4로 조정하여 사용하였다.It was dissolved in 1,000 ml of DW and used after adjusting the pH to 7.4.
ⓒ Washing buffer(PBS+Tween 20)Ⓒ Washing buffer (PBS + Tween 20)
ㆍPBS 2,000㎖에 Tween 20을 1 ㎖씩 첨가하였다.1 ml of Tween 20 was added to 2,000 ml of PBS.
ⓓ Blocking buffer : 2% BSA(Bovine serum albumin) in PBSⒹ Blocking buffer: 2% BSA (Bovine serum albumin) in PBS
ⓔ AP substrate solution(0.05M carbonate, pH 9.8)Ⓔ AP substrate solution (0.05M carbonate, pH 9.8)
ㆍA 용액 : NaHCO3 4.2g+ MgCl2·6H2O 0.203g → 1,000㎖ DWA solution: NaHCO 3 4.2g + MgCl 2 · 6H 2 O 0.203g → 1,000ml DW
ㆍB 용액 : Na2CO3 5.3g+ MgCl2·6H2O 0.203g → 1,000㎖ DWㆍ B solution: Na 2 CO 3 5.3g + MgCl 2 · 6H 2 O 0.203g → 1,000ml DW
교반하면서 pH가 9.8이 될 때까지 B용액에 A용액을 천천히 혼합하여 4 ℃보관하여 사용하였다.While stirring, solution A was slowly mixed with solution B until pH reached 9.8 and stored at 4 ° C. for use.
ⓕ HRP substrate solution(0.1M Citrate-phosphate buffer, pH 5)Ⓕ HRP substrate solution (0.1M Citrate-phosphate buffer, pH 5)
ㆍ0.1M Citrate acid : Citrate acid 19.21g을 1,000㎖ DW에 녹였다.0.1M Citrate acid: 19.21 g of citrate acid was dissolved in 1,000 ml DW.
ㆍ0.2M Na2HPO4 : Na2HPO4 28.4g을 1,000㎖ DW에 녹였다.0.2 M Na 2 HPO 4 : 28.4 g of Na 2 HPO 4 was dissolved in 1,000 ml DW.
ㆍ0.1M Citrate acid 12.5㎖ +Na2HPO4 12.85㎖ + DW 25㎖0.1M Citrate acid 12.5ml + Na 2 HPO 4 12.85ml + DW 25ml
상기 용액에 OPD(sigma P7288) 20㎎을 녹인후 마지막으로 30 % H2O2 20㎕을 넣어 바로 사용하였다.20 mg of OPD (sigma P7288) was dissolved in the solution, and finally 20 μl of 30% H 2 O 2 was used immediately.
ⓖ Stop solution : AP → 1M NaOHⒼ Stop solution: AP → 1M NaOH
HRP → 2.5M H2SO4 HRP → 2.5MH 2 SO 4
3) 면역항체가 확인 시험방법3) Immune antibody identification test method
① 항원을 Coating buffer에 적정농도로 희석(100배) 하였다.① The antigen was diluted (100 times) to the appropriate concentration in the coating buffer.
② ELISA plate 각 well에 coating buffer로 희석된 항원 100 ㎕씩 분주한 다음 4 ℃에 overnight 시켰다.② Dispense 100 μl of the antigen diluted in the coating buffer into each well of the ELISA plate and overnight at 4 ° C.
③ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.③ Dispense 200 μl of Washing Buffer into each well and wash.
이 과정을 3회 실시하였다.This process was carried out three times.
④ 각 well에 blocking buffer 200 ㎕씩 분주한 다음 37 ℃에서 1 시간 정치시켰다.④ 200 μl of blocking buffer was dispensed into each well, followed by standing at 37 ° C. for 1 hour.
⑤ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.⑤ After washing 200 ㎕ wash buffer in each well.
이 과정을 3회 실시하였다.This process was carried out three times.
⑥ 다른 U-form microplate를 이용하여 첫 well에 PBS 180 ㎕에 난황추출물과 초유를 각각 20 ㎕를 혼합하고 나머지 well에 PBS 100 ㎕씩 분주 후 첫 well의 혼합액 100 ㎕를 11번 well까지 2배수 계단 희석하여 옮긴 다음 마지막 well의 100 ㎕ 는 버렸다.⑥ Using another U-form microplate, mix 180 µl of yolk extract and colostrum in 20 µl of PBS in the first well, dispense 100 µl of PBS into the remaining wells, and add 100 µl of the mixture of the first well to the number 11 well. After dilution, 100 μl of the last well was discarded.
12번 well은 이미 역가를 알고 있는 면역난황항체 양성과 음성(Sigma 제조난황분말)을 100㎕ 씩 넣었다.Well No. 12 added 100 μl each of the positive and negative immune yolk antibodies (Sigma yolk powder).
⑦ 항원이 흡착된 ELISA plate에 2진 희석된 난황추출물과 초유와 양성, 음성을 각 well에 옮긴 후 37 ℃에서 2 시간 반응시켰다.⑦ Binary diluted yolk extract, colostrum, positive, and negative were transferred to each well on the antigen-adsorbed ELISA plate, and reacted at 37 ℃ for 2 hours.
⑧ Washing buffer를 각 well에 200 ㎕씩 분주한 다음 세척하였다.⑧ After washing 200 ㎕ wash buffer in each well.
이 과정을 3회 실시하였다.This process was carried out three times.
⑨ 콘쥬게이트(Conjugate)를 PBS에 희석하여 각 well에 100 ㎕씩 분주한 후 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다.⑨ The conjugate was diluted in PBS, and 100 μl of each conjugate was reacted at 37 ° C. for 1 hour.
⑩ Washing buffer를 각 well에 200 ㎕씩 분주한 다음 세척하였다.⑩ 200 μl of washing buffer was dispensed into each well, followed by washing.
이 과정을 4회 실시하였다.This process was carried out four times.
⑪ Substrate(OPD)를 각각 well에 100 ㎕씩 분주한 다음 실온에서 정확히 10분간 반응시켰다.⑪ 100 μl of Substrate (OPD) was dispensed into each well and then reacted for exactly 10 minutes at room temperature.
⑫ Stoping solution 50 ㎕를 가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader(492nm)로 흡광도를 측정하여 P/N(시험품/음성)값이 2이상인 희석배수를 면역항체가로 판정하였다.50 50 μl of Stoping solution was added to stop the reaction, and the absorbance was measured using an ELISA reader (492 nm) to determine the dilution factor of P / N (test product / negative value) of 2 or more.
2. 실험결과2. Experimental Results
소 바이러스설사병, 로타바이러스, 코로나바이러스 및 대장균, 살모넬라, 파스튜렐라 감염증 항원을 산란계에 3주 간격으로 2차접종한 후 3주째 면역시킨 닭의 계란으로부터 난황내에 형성된 면역항체가를 상기와 같은 방법으로 측정한 결과, 아래의 표 2와 같이 나타났다. Bovine virus diarrheal disease, rotavirus, coronavirus and E. coli, Salmonella, Pasteurella infectious agent antigens formed in egg yolk from eggs of chickens immunized 3 weeks after 2 weeks inoculation at spawning three weeks As a result, it was shown in Table 2 below.
바이러스Rota
virus
바이러스corona
virus
상기 표 2에 나타나 있듯이, 난황에 형성된 소 바이러스설사병에 대한 면역항체가는 1,280 ~ 2,560 배, 로타 바이러스는 640 ~ 2,560 배의 면역항체가를, 코로나 바이러스의 면역항체가도 640 ~ 1,280 배를 각각 나타내었으며, 대장균은 1,280 ~ 2,560 배, 살모넬라 1,280 ~ 2,560 배, 파스튜렐라는 640 ~ 2,560 배의 면역항체가를 각각 나타내었으며, 대조에서는 모두 10 배 이하의 면역항체가를 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 2, the immune antibody value for bovine virus diarrheal disease formed in egg yolk is 1,280-2,560 times, and the rotavirus shows 640-2,560 times the immuno-antibody value, and the corona virus's immune antibody value is 640-1,280 times, respectively. Escherichia coli showed 1,280-2,560 times, Salmonella 1,280-2,560 times, and Pasteurella showed 640-2,560 times of immunoantibody titer, respectively.
또한, 소 바이러스설사병, 로타 바이러스, 코로나 바이러스 및 대장균, 살모넬라, 파스튜렐라증 항원을 젖소에 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 어미 젖소가 분만 후 채취한 초유를 상기와 같은 방법으로 면역항체가를 측정한 결과, 아래의 표 3과 같이 나타났다. In addition, bovine virus diarrheal disease, rota virus, corona virus and E. coli, Salmonella, Pasteurella antigens were inoculated twice every three weeks, and then the colostrum collected after delivery by the mother cow as an immune antibody in the same manner as above. As a result of measuring the value, it appeared as Table 3 below.
(초유)material
(beestings)
바이러스Rota
virus
바이러스corona
virus
상기 표 3에 나타나 있듯이, 초유에 형성된 소 바이러스설사병에 대한 면역항체가는 2,560 ~ 10,240배, 로타 바이러스는 5,120 ~ 20,480배의 면역항체가를, 코로나 바이러스의 면역항체가도 5,120 ~ 20,480배를 각각 나타내었으며, 대장균 10,240 ~ 20,480배, 살모넬라 5,120 ~ 20,480배, 파스튜렐라는 5,120 ~ 40,960배의 면역항체가를 각각 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 3, the immune antibody value for bovine virus diarrheal disease formed in colostrum is 2,560 to 10,240 times, and the rotavirus is 5,120 to 20,480 times, and the antibody antibody to corona virus is 5,120 to 20,480 times, respectively. E. coli 10,240 ~ 20,480 fold, Salmonella 5,120 ~ 20,480 fold, Pasteurella was 5,120 ~ 40,960 fold showed that the antibody antibody titer.
<실험예 3> 본 발명인 송아지 설사병 예방용 조성물의 면역항체가 실험Experimental Example 3 Experimental Study on the Antibodies of the Present Infant Diarrhea Disease
1. 실험방법1. Experimental method
소 바이러스설사병, 로타 바이러스, 코로나 바이러스 및 대장균, 살모넬라, 파스튜렐라증에 대한 면역항체가를 측정하였다.Immune antibody titers against bovine virus diarrheal disease, rotavirus, corona virus and E. coli, Salmonella, Pasteurellasis were measured.
이때, 대조군으로 면역항체가 형성된 난황(IgY)+ 송아지를 분만 후 채취한 초유를 준비하였으며, 시험군으로는 면역항체가 형성된 난황(IgY)+ 송아지를 분만 후 채취한 초유에 실시예 1에서 제조된 오배자 추출물, 가자 추출물, 황금 추출물, 단삼추출물을 각각 넣어 준비하고, 본 발명인 실시예 3의 조성물(IgY+초유+오배자 추출물 + 가자 추출물 + 황금 추출물 + 단삼추출물)도 준비하여 면역항체가를 측정하였다.In this case, colostrum obtained after the delivery of yolk (IgY) + calf with immune antibodies was prepared as a control, and test group prepared in Example 1 with colostrum collected after the delivery of yolk (IgY) + calf with immune antibodies. Prepared by putting the five gall extract, the Gaza extract, golden extract, Salvia extract, and prepared the composition of Example 3 (IgY + colostrum + Bajaja extract + Gaza extract + golden extract + Salvia extract) to measure the antibody antibody titer .
2. 실험결과2. Experimental Results
그 결과, 아래의 표 4와 같이 나타났다.As a result, it is shown in Table 4 below.
바이러스Rota
virus
바이러스corona
virus
+오배자
추출물IgY + Colostrum
+ German
extract
+가자
추출물IgY + Colostrum
+ Let's go
extract
+황금
추출물IgY + Colostrum
+ Golden
extract
+단삼
추출물IgY + Colostrum
+ Dansam
extract
상기 표 4에 나타나 있듯이, 본 발명인 실시예 3의 조성물인 소 질병을 일으키는 대장균(Escherichia coli, k99), 살모넬라 속(Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurum), 파스튜렐라 속(Pastuellar multocida(A), Pastuellar heamolytica)에 모두에 대해 가장 높은 면역항체가를 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 4, E. coli ( Esherichia coli, k99 ) , Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurum , Pastuellar multocida (A), Pastuellar heamolytica, which causes bovine disease, the composition of Example 3 of the present invention. ), The highest immuno antibody titer was found for all.
<실험예 4> 본 발명의 송아지 설사병 예방용 조성물에 대한 효능시험Experimental Example 4 Efficacy Test on the Composition for Preventing Calf Diarrhea
가. 분말(실시예 3)에 대한 시험end. Test on Powder (Example 3)
생후 1 일령 송아지 100 두를 선정하여 시험군 50 두에는 시험품을 마리당 10g씩 10 일간 각각 급여하고, 30 일간 임상관찰을 한 결과, 아래의 표 5와 같이 나타났다.One hundred day-old calves were selected and 50 test subjects were fed 10g per 10 days for 10 days, followed by clinical observation for 30 days, and the results were shown in Table 5 below.
설사Weeping
diarrhea
곤란Breath
Difficulty
/10일간10 g
/ 10 days
상기 표 5에 나타나 있듯이, 대조군(비 급여)에서는 수양성설사 16 두, 호흡곤란 18 두 및 탈수증상 12 두등의 임상증상을 심하게 나타내었으며, 장염 및 패혈증 등의 질병 원인체들이 복합적으로 감염되어 3 두는 폐사되었으나, 본 발명인 실시예 3의 조성물을 급여한 시험군에서는 수양성설사 6 두, 호흡곤란 3두 및 탈수증상 5두 등의 임상증상을 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 5, the control group (non-feeding) showed severe clinical symptoms such as 16 diarrhea, 18 respiratory distress, and 12 dehydration symptoms, and three infectious agents such as enteritis and sepsis. Although it died, the test group fed the composition of Example 3 of the present invention was found to exhibit clinical symptoms such as 6 diarrhea, 3 respiratory distress and 5 dehydration symptoms.
이에, 본 발명인 실시예 3의 조성물을 송아지 설사병에 대해 효과적으로 예방하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.Thus, it can be seen that the composition of Example 3 of the present invention can be used to effectively prevent calf diarrhea.
나. 페이스트 제제(실시예 4)에 대한 시험I. Test for Paste Formulation (Example 4)
프락토 올리고당을 가하여 제조한 페이스트제제가 송아지의 설사병에 대한 감염예방 및 치료효과를 확인하기 위하여 신생송아지 60두를 선정하여 시험군 30두에는 초유급여 전후 1 두당 10 g씩 5 일간 급여한 후 30 일간 임상관찰을 한 결과, 아래의 표 6과 같이 나타났다.Paste prepared with fructo oligosaccharides was selected from 60 newborn calves to examine the effects of calves on diarrheal disease. As a result of daily clinical observation, it appeared as Table 6 below.
설사Weeping
diarrhea
곤란Breath
Difficulty
/5일간10 g
5 days
상기 표 6에 나타나 있듯이, 대조군(비 급여)에서는 전형적인 수양성설사 13두, 호흡곤란 8두, 탈수증상 12두 및 탈수로 인한 위축된 송아지도 확인할 수 있었으나, 본 발명인 실시예 4의 조성물을 급여한 시험군에서는 수양성설사 6두, 호흡곤란 3두 및 탈수증상 5두등의 임상증상을 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 6, the control group (non-feeding) was able to confirm a typical watery diarrhea 13, difficulty breathing 8, 12 dehydration and atrophic calves due to dehydration, but the composition of Example 4 of the present invention One study group showed 6 symptoms of diarrhea, 3 breathing difficulties, and 5 dehydration symptoms.
이에, 본 발명인 실시예 4의 조성물을 송아지 설사병에 대해 효과적으로 예방하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.Thus, it can be seen that the composition of Example 4 of the present invention can be used to effectively prevent calf diarrhea.
<실험예 5> 본 발명의 송아지 설사병 예방용 조성물에 대한 야외실증시험<Experiment 5> Field demonstration test for the composition for the prevention of calf diarrhea of the present invention
송아지 설사병이 50 % 이상 발생되는 3 개 농장을 선정하여 생후 1일령부터 본 발명의 실시예 3의 조성물을 10 g씩을 2 주간 급여한 다음 질병에 의한 설사 발생율을 확인하였다.Three farms in which calf diarrheal disease occurs more than 50% were selected and fed 10 g of the composition of Example 3 of the present invention from 1 day of age for 2 weeks, and then the incidence of diarrhea caused by the disease was confirmed.
1) 경기 용인 A농장1) Gyeonggi Yongin A Farm
두수breed
Head
두수Occur
Head
(%)Incidence
(%)
두수Our company
Head
(%)Mortality
(%)
두수breed
Head
두수Occur
Head
(%)Incidence
(%)
두수Our company
Head
(%)Mortality
(%)
불량Breeding environment
Bad
개선Breeding environment
Improving
두수breed
Head
두수Occur
Head
(%)Incidence
(%)
두수Our company
Head
(%)Mortality
(%)
상기 표 7,8,9에 나타나 있듯이, 송아지 설사병 발생율이 시험전보다 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었으며, 이에 본 발명의 송아지 설사병 예방용 조성물은 종래에 사용되어온 항생물질을 대체할 수 있는 물질임을 확인하였다.As shown in Table 7,8,9, it was confirmed that the incidence of calf diarrhea disease is significantly reduced than before the test, the composition for preventing calf diarrhea disease of the present invention is a substance that can replace the antibiotic used in the prior art .
이에, 본 발명의 송아지 설사병 예방용 조성물을 친환경적인 사육방법에 필요한 기능성제제로 제공할 수 있어, 송아지의 폐사를 줄이고 증체율을 향상시킴으로서 축산 농가의 소득 증대에 크게 이바지할 수 있을 것이라 사료된다.Thus, the calf diarrheal disease prevention composition of the present invention can be provided as a functional agent necessary for environmentally friendly breeding method, it is considered that it can contribute greatly to the income of livestock farmers by reducing the calf mortality and improving the increase rate.
본 발명에 의해, 송아지 사육에 있어 항생물질의 오·남용의 우려를 불식시켜 항생물질의 사용을 자제함과 동시에 질병으로부터의 사전에 예방해주어 피해를 줄여줌으로써 축산농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있게 된다.According to the present invention, it is possible to greatly increase the income of livestock farmers by eliminating the fear of misuse and abuse of antibiotics in calf rearing, refraining from using antibiotics, and preventing damage from diseases in advance. Will be.
도 1은 본 발명인 송아지 설사병 예방용 조성물의 제조방법도.1 is a manufacturing method of the present invention calf diarrhea disease prevention composition.
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