KR20110033233A - Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics - Google Patents

Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics Download PDF

Info

Publication number
KR20110033233A
KR20110033233A KR1020117001522A KR20117001522A KR20110033233A KR 20110033233 A KR20110033233 A KR 20110033233A KR 1020117001522 A KR1020117001522 A KR 1020117001522A KR 20117001522 A KR20117001522 A KR 20117001522A KR 20110033233 A KR20110033233 A KR 20110033233A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
antibodies
fragment
humanized
substituted
Prior art date
Application number
KR1020117001522A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
데이비드 엠 골든버그
시엔 싱 창
한스 제이. 한센
Original Assignee
이뮤노메딕스, 인코오포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 filed Critical 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드
Publication of KR20110033233A publication Critical patent/KR20110033233A/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Abstract

본 발명은 치환된 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 치환된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 양특이성 항체 또는 융합 단백질을 제공한다. 상기 항체, 융합 단백질 또는 단편은 B-세포 종양 및 자가면역 질환과 같은 B-세포 질병뿐만 아니라 GVHD, 기관 이식 거부 및 용혈성 빈혈 및 한성글로불린혈증을 치료하는데 유용하다. 아미노산이 치환되면, 특히 CDR3 VH(CDRH3)의 카뱃 위치 101에서의 아스파르트산 잔기가 치환되면 감소된 해리 속도, 개선된 CDC 활성, 개선된 아폽토시스, 개선된 B-세포 소모 및 매우 낮은 용량에서의 개선된 치료 효능과 같은 개선된 치료 특성을 갖게 된다. 이러한 서열 변이가 포함된 인간화 항-CD20 항체인 벨투즈맙은 상이한 CDRH3 서열을 갖는 유사한 항체와 비교하여 개선된 치료 효능을 나타내며, 정맥내 또는 피하 투여될 때 200 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 100 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 80 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 50 ㎎ 이하, 가장 바람직하게는 30 ㎎ 이하의 네이키드 항체만큼 낮은 용량에서 치료학적 효과를 갖게 한다.The present invention provides substituted humanized, chimeric or human anti-CD20 antibodies or antigen binding fragments thereof and bispecific antibodies or fusion proteins comprising the substituted antibodies or antigen binding fragments thereof. The antibodies, fusion proteins or fragments are useful for treating GVHD, organ transplant rejection and hemolytic anemia and hanglobulinemia, as well as B-cell diseases such as B-cell tumors and autoimmune diseases. Substitution of amino acids, particularly aspartic acid residues at the Kabat position 101 of CDR3 V H (CDRH3), results in reduced dissociation rates, improved CDC activity, improved apoptosis, improved B-cell consumption and very low doses. Have improved therapeutic properties such as improved therapeutic efficacy. Beltuzumab, a humanized anti-CD20 antibody with such sequence variations, shows improved therapeutic efficacy compared to similar antibodies with different CDRH3 sequences, and when administered intravenously or subcutaneously, up to 200 mg, more preferably up to 100 mg More preferably at a dose as low as 80 mg, more preferably at most 50 mg, most preferably at most 30 mg, of a naked antibody.

Description

개선된 치료 특성을 갖는 항체의 구조 변이체{STRUCTURAL VARIANTS OF ANTIBODIES FOR IMPROVED THERAPEUTIC CHARACTERISTICS}STRUCTURAL VARIANTS OF ANTIBODIES FOR IMPROVED THERAPEUTIC CHARACTERISTICS

본 발명은 2008년 7월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/082,399호를 35 U.S.C. 119(e) 하에서 우선권 주장한다.
The present invention claims priority under 35 USC 119 (e) to US Provisional Patent Application No. 61 / 082,399, filed July 21, 2008.

본 발명은 바람직하게는 개선된 치료 특성을 가지며 상보성-결정 영역(complementarity-determining region, CDR)의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편의 구조 변이체에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 구조 변이는, 예를 들면, 카뱃(Kabat) 위치 101에서 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환하는 항체 중쇄의 3번째 CDR 서열(CDRH3)에 대한 변화를 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 상기 구조 변이는 카뱃 위치 94에서 카뱃 위치 101에서의 아스파르트산과 염 가교(salt bridge)를 형성할 수 있는 알기닌 잔기를 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 구조 변이는 카뱃 위치 101에서 발린 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 구조 변이체는 B-세포 백혈병, 림프종 또는 자가면역 질환뿐만 아니라 B-세포에 영향을 미치는 다른 면역 질환과 같은 B-세포의 증식과 관련되는 질환에 대해 개선된 효능을 제공할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 개선된 효능은 80 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 50 ㎎ 이하, 가장 바람직하게는 30 ㎎ 이하와 같은 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 낮은 용량(dosage)의 투여를 허용할 수 있으며, 상기 투여는 약 1주 내지 3주 간격으로 2회 이상 투여되거나, 심지어 매주 2회 이상 투여될 수 있다.The present invention preferably relates to structural variants of anti-CD20 antibodies and / or antigen binding fragments thereof having improved therapeutic properties and comprising the amino acid sequence of the complementarity-determining region (CDR). In certain embodiments, the structural variation can comprise, for example, a change to the third CDR sequence (CDRH3) of the antibody heavy chain that replaces an asparagine residue with an aspartic acid residue at Kabat position 101. In another specific embodiment, the structural variation may comprise an arginine residue capable of forming a salt bridge with aspartic acid at Kabat position 101 at Kabat position 94. In another specific embodiment, the structural variation may comprise a valine residue at Kabat position 101. Such structural variants may provide improved efficacy for diseases associated with the proliferation of B-cells, such as B-cell leukemia, lymphoma or autoimmune diseases as well as other immune diseases affecting B-cells. In a preferred embodiment, the improved efficacy allows the administration of low doses of an anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof such as 80 mg or less, more preferably 50 mg or less, most preferably 30 mg or less. The administration may be administered two or more times at intervals of about 1 to 3 weeks, or even at least twice a week.

상기 항-CD20 항체는 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체, 특히 단일클론 항체(MAb)일 수 있다. 다른 구현예는 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체의 치료 및/또는 진단 접합체(conjugate), 및 예를 들면 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체를 이용하여 B-세포 림프종 및 백혈병 및 다양한 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다. 또 다른 구현예는 적어도 하나의 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 어떤 경우에는 두 번째 상이한 항체, 특히 항-CD20 항체, 바람직하게는 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합되는 항체 융합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것일 수 있다. 상기 인간화, 키메라 또는 인간 MAb, 그의 항원 결합 단편 또는 항체 융합 단백질은 치료용 면역접합체로서 단독으로 투여되거나, 다른 네이키드(naked) 항체 또는 다른 면역접합체와 함께 하나 이상 치료제와의 조합으로 투여될 수 있다. 또 다른 구현예는 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체 및 항체 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 상기 DNA 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포 및 상기 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체의 제조 방법에 관한 것이다.The anti-CD20 antibody may be a humanized, chimeric or human anti-CD20 antibody, in particular a monoclonal antibody (MAb). Another embodiment provides treatment and / or diagnostic conjugates of humanized, chimeric or human anti-CD20 antibodies, and for example B-cell lymphoma and leukemia and various autoimmune using humanized, chimeric or human anti-CD20 antibodies. It may be directed to a method of treating a disease. Another embodiment comprises at least one anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof, in some cases combined with a second different antibody, in particular an anti-CD20 antibody, preferably an anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof It may be directed to an antibody fusion protein or antigen binding fragment thereof. The humanized, chimeric or human MAb, antigen binding fragment or antibody fusion protein thereof may be administered alone as a therapeutic immunoconjugate or in combination with one or more therapeutic agents in combination with other naked antibodies or other immunoconjugates. have. Another embodiment relates to a DNA sequence encoding a humanized, chimeric or human anti-CD20 antibody and an antibody fusion protein, a vector and host cell containing said DNA sequence and a method of making said humanized, chimeric or human anti-CD20 antibody. will be.

척추동물의 면역 시스템은 외래 항원을 정확하게 인식하는데 관여하는, 구체적으로는 이러한 외래 항원에 결합하여 제거/파괴하는 다수의 기관 및 세포 타입으로 이루어져 있다. 이들 중에서도 림프구는 면역 시스템에서 결정적이다. 림프구는 2개의 주된 아집단(sub-population), 즉 T 세포 및 B 세포로 나누어진다. 상호의존적이기는 하지만, T 세포는 주로 세포-매개성 면역을 담당하고, B-세포는 주로 항체의 생성(체액성(humoral) 면역)을 담당한다.Vertebrate immune systems consist of a number of organs and cell types that are involved in the accurate recognition of foreign antigens, specifically those that bind to and remove / destroy these foreign antigens. Among these, lymphocytes are crucial in the immune system. Lymphocytes are divided into two main sub-populations, T cells and B cells. Although interdependent, T cells are primarily responsible for cell-mediated immunity and B-cells are primarily responsible for the production of antibodies (humoral immunity).

인간에 있어서, 각각의 B-세포는 엄청난 수의 항체 분자를 생성할 수 있다. 이러한 항체의 생성은 전형적으로 외래 항원이 중성화되었을 때 중지된다(또는 실질적으로 감소된다). 그러나, 때때로 특정 B-세포의 증식이 계속해서 줄어들지 않아, B-세포 림프종 또는 백혈병으로 알려져 있는 종양이 될 수 있다. 비-호지킨 림프종의 B-세포 아형과 같은 B-세포 림프종은 암으로 인한 사망에 현저하게 기여한다. 다양한 형태의 치료에 대한 B-세포 종양의 반응은 혼합되어 있다. 예를 들면, 비-호지킨 림프종에 대한 정확한 임상적 등급화가 가능한 경우, 필드(field) 방사선 치료가 만족스러운 치료를 제공할 수 있다. 여전히 환자들 중 약 절반은 상기 질환으로 사망한다. Devesa et al., J. Nat . Cancer Inst. 79:701 (1987).In humans, each B-cell can produce a huge number of antibody molecules. The production of such antibodies is typically stopped (or substantially reduced) when the foreign antigen is neutralized. However, sometimes the proliferation of certain B-cells does not continue to diminish, resulting in a tumor known as B-cell lymphoma or leukemia. B-cell lymphomas, such as the B-cell subtypes of non-Hodgkin's lymphoma, contribute markedly to death from cancer. The response of B-cell tumors to various forms of treatment is mixed. For example, if accurate clinical grading for non-Hodgkin's lymphoma is possible, field radiation therapy may provide satisfactory treatment. About half of the patients still die from the disease. Devesa et al., J. Nat . Cancer Inst . 79: 701 (1987).

임상적인 림프구성 백혈병의 대다수는 B-세포 계열이다. Freedman, Hematol. Oncol . Clin . North Am. 4:405 (1990). 이러한 유형의 B-세포 종양은 서구 세계에서 가장 흔한 백혈병이다. Goodman et al., Leukemia and Lymphoma 22:1 (1996). 만성 림프구성 백혈병의 자연적 이력은 몇 가지 기(phase)로 나누어진다. 초기에 만성 림프구성 백혈병은 증가된 수명을 갖는 작은 성숙한 기능적으로 무능한 악성 B-세포의 축적에 의해 특정되는 가벼운(indolent) 질환이다. 결국, 악성 B-세포의 배가시간이 줄어들고, 환자들은 점점 증상을 나타내게 된다. 치료를 하면 증상의 완화를 가져올 수 있지만, 환자의 총 생존율에는 최소한으로만 영향을 미친다. 만성 림프구성 백혈병의 말기는 현저한 빈혈 및/또는 혈소판감소증으로 특정된다. 이 시점에서, 중간 생존기간(median survival)은 2년 이하이다. Foon et al., Annals Int . Medicine 113:525 (1990). 매우 낮은 세포 증식 속도로 인하여, 만성 림프구성 백혈병은 세포독성 약물의 처리에 저항성이 있다. B-세포 기원의 만성 및 급성 림프구성 백혈병 모두 본 발명에서 개시된 치료법의 적합한 표적이다.The vast majority of clinical lymphocytic leukemia is the B-cell family. Freedman, Hematol. Oncol . Clin . North Am . 4: 405 (1990). This type of B-cell tumor is the most common leukemia in the western world. Goodman et al., Leukemia and Lymphoma 22: 1 (1996). The natural history of chronic lymphocytic leukemia is divided into several phases. Initially chronic lymphocytic leukemia is an indolent disease characterized by the accumulation of small mature functionally incapable malignant B-cells with increased lifespan. Eventually, the doubling time of malignant B-cells decreases and patients become increasingly symptomatic. Treatment can relieve symptoms but only minimally affect the patient's overall survival. The late stages of chronic lymphocytic leukemia are characterized by marked anemia and / or thrombocytopenia. At this point, median survival is less than two years. Foon et al., Annals Int . Medicine 113: 525 (1990). Due to the very low cell proliferation rate, chronic lymphocytic leukemia is resistant to the treatment of cytotoxic drugs. Both chronic and acute lymphocytic leukemias of B-cell origin are suitable targets of the therapies disclosed herein.

화학치료 및 방사선치료를 포함하는 B-세포 종양의 전통적인 치료 방법은 독성 부작용으로 인해 제한적인 이용성을 갖는다. 방사성핵종, 독소 또는 다른 치료제를 인도하는 단일클론 항체를 사용하는 것은 이러한 제제가 종양 부위에 선택적으로 운반되어 정상 조직에 대한 독성을 제한할 수 있다는 가능성을 제공한다. 또한, B-세포 종양 상의 B-세포 항원들의 존재는 이들이 B-세포 상의 CD19, CD20, CD21, CD23 및 CD22 마커 등에 대한 비접합 B-세포 항체를 이용한 최적의 치료 표적이 되도록 한다. HLA-DR, CD30, CD37, CD40, CD45, CD70, CD79a 및 다른 항원들은, 비록 이들이 다른 세포 형태에서도 발현되지만, 정상 및 종양 B-세포에 대한 표적으로 사용될 수 있다. 아울러, 특정 MUC1, MUC2, MUC3 및 MUC4 항원, 바람직하게는 MUC1 뿐만 아니라 인슐린-유사 성장 인자(ILGF), 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 대식세포 이동-억제 인자(MIF)도 또한 CD20 및 다른 B-세포 마커를 발현하는 B-세포 종양을 포함하는 상이한 조혈성 종양에서 발현된다. 타나신(tanascin), 혈관 내피세포 성장 인자 수용체(VEGFR) 및 태반 성장 인자(PlGF)를 포함하는 혈관 내피세포 종양과 관련되는 것들 뿐만 아니라 암유전자 산물(cMET, Kras, bcl-2, bcl-6)과 같은 B-세포 종양과 관련되는 다른 카테고리의 항원과 같은 또 다른 항원 표적도 치료용 항체에 대한 적합한 표적이다.Traditional methods of treating B-cell tumors, including chemotherapy and radiotherapy, have limited availability due to toxic side effects. Using monoclonal antibodies to guide radionuclides, toxins or other therapeutic agents offers the possibility that such agents may be selectively transported to tumor sites to limit toxicity to normal tissues. In addition, the presence of B-cell antigens on B-cell tumors allows them to be optimal therapeutic targets with unconjugated B-cell antibodies against CD19, CD20, CD21, CD23 and CD22 markers and the like on B-cells. HLA-DR, CD30, CD37, CD40, CD45, CD70, CD79a and other antigens can be used as targets for normal and tumor B-cells, although they are also expressed in other cell types. In addition, certain MUC1, MUC2, MUC3 and MUC4 antigens, preferably MUC1, as well as insulin-like growth factor (ILGF), insulin-like growth factor receptor, macrophage migration-inhibitory factor (MIF), are also CD20 and other B- It is expressed in different hematopoietic tumors, including B-cell tumors expressing cellular markers. Oncogene products (cMET, Kras, bcl-2, bcl-6, as well as those associated with vascular endothelial tumors, including tanascin, vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) and placental growth factor (PlGF)) Another antigen target, such as other categories of antigens associated with B-cell tumors, is also a suitable target for therapeutic antibodies.

B-세포는 분화 및 동정용 마커로 이용될 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 이러한 인간 B-세포 마커 중 하나는 CD20으로 불리는 인간 B-림프구-제한성 분화 항원 Bp35이다. CD20은 초기 전구(pre)-B-세포 발생 과정에서 발현되며, 혈장 세포 분화시까지 남아있다. CD20은 정상 B 세포 및 그 비정상적인 성장이 B-세포 림프종 및 백혈병을 유도할 수 있는 종양 B 세포 모두에서 발현된다. 상기 CD20 항원에 대한 항체는 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료용으로 연구되어 왔다. 예를 들면, "IDEC-c2B8"(rituximab)로 나타낸 키메라 항-CD20 항체는 주사횟수당 500 ㎎을 상회하는 복용량(dose)으로 반복적으로 주사하여 비접합 항체로서 제공될 때 B-세포 림프종에 대한 활성을 갖는다. Maloney et al., Blood 84:2457 (1994); Longo, Curr. Opin . Oncol. 8:353 (1996). 이러한 요법으로 치료된 낮은 등급의 가벼운 형태(indolent form)를 갖는 약 50%의 비-호지킨 환자에서 반응을 보였다. 또한, 주사횟수당 600 ㎎을 상회하는 비표지 항체를 먼저 처리한 후 131I-표지된 B1(tositumomab) 항-CD20 설치류 단일클론 항체를 반복 복용량으로 제공될 때도 치료 반응이 얻어졌다. Kaminski et al., N. Engl . J. Med. 329:459 (1993); Press et al., N. Engl , J. Med. 329:1219 (1993); Press et al., Lancet 346:336 (1995). 그러나, 이러한 항체들은 비접합 형태 또는 방사성표지된 형태로 제공될 때 중간형 또는 공격형 B-세포 림프종의 보다 호발적(prevalent)이고 치사적(lethal)인 환자에서 실재적이고 영속적인 반응을 높은 비율로 보이지는 않았다. 따라서, 현저하게 영속적인 치료 반응을 달성하는 B-세포 종양에 대한 면역치료를 개발할 필요성이 존재한다.B-cells include cell surface proteins that can be used as markers for differentiation and identification. One such human B-cell marker is human B-lymphocyte-limiting differentiation antigen Bp35 called CD20. CD20 is expressed during early pre-B-cell development and remains until plasma cell differentiation. CD20 is expressed in both normal B cells and tumor B cells where their abnormal growth can induce B-cell lymphoma and leukemia. Antibodies to the CD20 antigen have been studied for the treatment of B-cell lymphoma and leukemia. For example, the chimeric anti-CD20 antibody, expressed as "IDEC-c2B8" (rituximab), is repeatedly injected at doses greater than 500 mg per injection to provide for B-cell lymphoma when given as a nonconjugated antibody. Have activity. Maloney et al., Blood 84: 2457 (1994); Longo, Curr. Opin . Oncol . 8: 353 (1996). Responses were seen in about 50% of non-Hodgkin patients with low grade indolent forms treated with this therapy. In addition, a therapeutic response was also obtained when a non-labeled antibody of greater than 600 mg per injection was first treated followed by 131 I-labeled tositumomab anti-CD20 rodent monoclonal antibody in repeated doses. Kaminski et al., N. Engl . J. Med . 329: 459 (1993); Press et al., N. Engl , J. Med . 329: 1219 (1993); Press et al., Lancet 346: 336 (1995). However, these antibodies, when provided in unconjugated or radiolabeled form, have a high rate of substantial and persistent response in more prevalent and lethal patients of intermediate or aggressive B-cell lymphoma. I didn't see it. Thus, there is a need to develop immunotherapies for B-cell tumors that achieve markedly persistent therapeutic responses.

항-CD20 설치류 단일클론 항체인 IF5를 이용하여 B-세포 림프종 환자에 대해 계속적으로 정맥내 투입으로 투여하는 CD20 표면 항원을 표적화하는 추가 연구가 수행되어 왔다. 순환하는 종양 세포를 제거하기 위하여 극히 높은 레벨(>2 g)의 1F5가 필요하다는 것이 보고되었고, 그 결과는 "일시적"인 것으로 개시되었다. Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas" Blood 69/2:584-591 (1987). 그러나, 이러한 접근법의 잠재적인 문제점은 비-인간 단일클론 항체(예컨대, 설치류 단일클론 항체)는 전형적으로 인간 작용기 기능성(effector functionality)이 없으므로, 즉 이들은 보체-의존성 용해 또는 항체-의존성 세포 독성 또는 Fc-수용체 매개성 식세포작용을 통한 표적 세포의 용해를 매개할 수 없다는 것이다. 아울러, 비-인간 단일클론 항체는 인간 숙주에 의해 외래 단백질로 인식될 수 있으며, 따라서 이러한 외래 항체를 반복적으로 주사하면 해로운 과민성 반응을 유도하는 면역 반응이 유도될 수 있다. 설치류계 단일클론 항체의 경우, 이는 종종 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응으로 나타낸다.Further studies have been carried out targeting IF20, an anti-CD20 rodent monoclonal antibody, to target CD20 surface antigens administered continuously by intravenous input to B-cell lymphoma patients. It has been reported that extremely high levels (> 2 g) of 1F5 are required to remove circulating tumor cells and the results are disclosed to be "transient". Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas" Blood 69/2: 584-591 (1987). However, a potential problem with this approach is that non-human monoclonal antibodies (eg, rodent monoclonal antibodies) typically lack human effector functionality, ie they are complement-dependent lysis or antibody-dependent cytotoxicity or Fc. -Mediating lysis of target cells through receptor mediated phagocytosis. In addition, non-human monoclonal antibodies can be recognized as foreign proteins by the human host, and repeated injections of these foreign antibodies can induce an immune response that induces a harmful hypersensitivity reaction. In the case of rodent monoclonal antibodies, this is often referred to as a human anti-mouse antibody (HAMA) response.

키메라 항체를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이들은 설치류 항체만큼 강한 HAMA 반응을 유발하지 않기 때문이다. 키메라 항체는 둘 이상의 상이한 종 유래의 부분을 포함하는 항체이다. 예를 들면, 리우 A.Y. 등(Liu, A.Y. et al., "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immunol. 139/10:3521-3526 (1987))은 상기 CD20 항원에 대한 마우스/인간 키메라 항체를 개시하고 있다. PCT 공개공보 제WO88/04936호 참조. 예시적인 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역 서열에 부착된 마우스 가변 영역 서열을 포함할 것이다.The use of chimeric antibodies is preferred because they do not elicit HAMA responses as strong as rodent antibodies. Chimeric antibodies are antibodies comprising portions from two or more different species. For example, Liu AY et al., "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immunol . 139/10: 3521-3526 (1987)) Discloses a mouse / human chimeric antibody against the CD20 antigen. See PCT Publication No. WO88 / 04936. Exemplary chimeric antibodies will include mouse variable region sequences attached to the constant region sequences of human antibodies.

HAMA 반응을 유도할 가능성을 추가로 감소시키기 위하여 인간화 항체를 사용하는 것이 보다 더 바람직하다. 후술한 바와 같이, 설치류의 골격(framework)과 불변 영역 서열을 대응하는 인간 항체의 골격과 불변 영역 서열로 교체함으로써 설치류 항체를 인간화하기 위한 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 많은 설치류 항암 항체에 대해 적용되어 왔다. 항체의 인간화는 또한 하나 이상의 인간 골격 아미노산 잔기를 양친(parent) 설치류 골격 영역 서열의 대응하는 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다.It is even more desirable to use humanized antibodies to further reduce the likelihood of inducing a HAMA response. As described below, techniques for humanizing rodent antibodies by replacing the framework and constant region sequences of rodents with the skeleton and constant region sequences of corresponding human antibodies are well known in the art and are known to many rodent anticancer antibodies. Has been applied. Humanization of an antibody may also include replacing one or more human backbone amino acid residues with a corresponding residue in the parent rodent backbone region sequence.

B-세포 질병의 치료에 효과적인 항체의 능력을 개선한 다른 접근법은 방사성 제제 또는 화학치료제와 같은 치료제를 상기 항체에 접합시켜서 상기 제제를 종양 부위에 국한시키는 것이다. 예를 들면, 전술한 1F5 항체 및 다른 B-세포 항체를 131I로 표지하여 2명의 환자에서 생체분포를 평가하였다. Eary, J.F. et al., "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc . Med. 31/8:1257-1268 (1990) 참조; 또한, Press, O.W. et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (anti-CD37) Antibody" J. Clin . Oncol. 7/8:1027-1038 (1989)(131I-표지된 IF-5로 치료된 1명의 환자가 부분 반응을 달성했음을 나타냄); Goldenberg, D.M. et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with 131I-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. clin . Oncol. 9/4:548-564 (1991)(다중 주사를 받은 8명의 환자 중 3명이 상기 CD22 설치류 항체에 대한 HAMA 반응을 나타내었음이 보고됨); Appelbaum, F.R. "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem ./ Oncol . Clinics of N. Am. 5/5:1013-1025 (1991)(리뷰 논문); Press, O.W. et al. "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Supprot" New England Journal of Medicine 3219/17:1219-1223 (1993)(131I-표지된 항-CD20 항체 IF5 및 B1-tositumomab); 및 Kaminski, M.G. et al "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [131I] Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody" NEJM 329/7:459 (1993)(131I-표지된 항-CD20 항체 B1); PCT 공개공보 제WO92/07466호(독소루비신 또는 마이토마이신과 같은 치료제에 접합된 항체) 참조. 그러나, 이전에 공격적인 세포독성 화학치료를 받았던 많은 림프종 환자들이 면역 억제되고, 따라서 많이 전처리되지 않은 림프종 환자보다 낮은 HAMA 비율을 갖는다는 사실에도 불구하고, 이들 접근법은 설치류 항체를 사용하는 것과 관련되어 있는 장애물을 제거하지는 못했다.Another approach to improving the ability of an antibody to be effective in the treatment of B-cell disease is to conjugate a therapeutic agent, such as a radioactive or chemotherapeutic agent, to the antibody to localize the agent to the tumor site. For example, the 1F5 antibody and other B-cell antibodies described above were labeled with 131 I to evaluate biodistribution in two patients. Eary, JF et al., "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc . Med . See 31/8: 1257-1268 (1990); See also, Press, OW et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (anti-CD37) Antibody" J. Clin . Oncol . 7/8: 1027-1038 (1989) (indicating that one patient treated with 131 I-labeled IF-5 achieved partial response); Goldenberg, DM et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with 131 I-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. clin . Oncol . 9/4: 548-564 (1991) (reported that 3 of 8 patients who received multiple injections exhibited HAMA response to the CD22 rodent antibody); Appelbaum, FR "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem ./ Oncol. Clinics of N. Am . 5/5: 1013-1025 (1991) (review papers); Press, OW et al. "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Supprot" New England Journal of Medicine 3219/17: 1219-1223 (1993) ( 131 I-labeled anti-CD20 antibodies IF5 and B1-tositumomab); And Kaminski, MG et al "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [ 131 I] Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody" NEJM 329/7: 459 (1993) ( 131 I-labeled anti-CD20 antibody B1); See PCT Publication No. WO92 / 07466 (antibodies conjugated to a therapeutic agent such as doxorubicin or mitomycin). However, despite the fact that many lymphoma patients who have previously undergone aggressive cytotoxic chemotherapy are immunosuppressed and therefore have a lower HAMA rate than those who are not much pretreated, these approaches are associated with the use of rodent antibodies. It did not remove the obstacle.

자가면역 질환은 B-세포 질병과 관련된 부류의 질환이다. 그 예로는 급성 특발성 혈소판감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판감소성 자반증, 피부근염, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 낭창성 신염, 류마티스성 열, 다선 증후군, 수포성 유천포창, 제1형 당뇨병, 헤노흐-쉘라인 자반증, 후-연쇄상구균성 신염, 결절성 홍반, 타카야수 동맥염, 애디슨 질환, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스테르 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 강피증, 만성 활성형 간염, 다발성근염/피부근염, 다연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병, 근위축성 측색 경화증, 척수 매독, 거대세포 동맥염/다발성근육통, 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염 및 섬유성 폐포염을 포함한다. 가장 흔한 치료는 매우 독성이 있을 수 있는 콜티코스테리이드 및 세포독성 약물이다. 상기 약물들은 또한 전체 면역 시스템을 억제하여 심각한 감염을 일으킬 수 있고, 골수, 간 및 신장에 악영향을 미친다. 자가면역 질환, 특히 클래스-Ⅲ 자가면역 질환을 치료하기 위한 보다 효과적인 방법에 대한 필요성이 있다. 암 및/또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 보다 효과적인 항체의 개발에 대한 추가적인 필요성이 존재한다.Autoimmune diseases are a class of diseases associated with B-cell disease. Examples include acute idiopathic thrombocytopenic purpura, chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, dermatomyositis, sidnam chorea, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, rheumatic fever, polycystic syndrome, bullous stool, first Type diabetes mellitus, Henoch-Shellin purpura, post-streptococcal nephritis, nodular erythema, Takayasu's arteritis, Addison's disease, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, sarcoidosis, ulcerative colitis, polymorphic erythema, IgA nephropathy, nodular polyarthritis, ankylosing Spondylitis, Goodpaster syndrome, obstructive thrombosis, Sjogren's syndrome, primary biliary cirrhosis, Hashimoto's thyroiditis, thyrotoxicosis, scleroderma, chronic active hepatitis, polymyositis / dermatitis, polychostitis, vulgaris ulcer, Wegener's granulomatosis, Membrane nephropathy, Amyotrophic lateral sclerosis, Spinal syphilis, Giant cell arteritis / Multiple muscle pain, Pernicious anemia, Rapid progressive death It comprises a body and nephritis fibrous alveolitis. The most common treatments are corticosteroids and cytotoxic drugs, which can be very toxic. The drugs also inhibit the entire immune system, causing serious infections and adversely affect bone marrow, liver and kidneys. There is a need for more effective methods for treating autoimmune diseases, particularly class-III autoimmune diseases. There is a further need for the development of more effective antibodies for treating cancer and / or autoimmune diseases.

용혈성 빈혈, 한성글로불린혈증, 간염(특히, C형 간염), 이식대숙주 질환(graft-versus-host disease, GVHD)(특히, 동종이계(allogeneic) 줄기세포 이식), 동종감작반응(allosensitization)(특히, 기관 이식과 함께)과 같은 면역학적 조절실패(dysregulation)를 갖는 또 다른 질환들은 본 발명에 개시되어 있는 신규한 조성물 및 방법에 의해 적합하게 치료된다. 이제 B-세포가 이들 병리학적 상태와 관련되어 있다는 증거가 늘어가고 있으며, 따라서 항-B-세포 치료에 의해 B-세포를 소모(depletion)시키는 것이 관심을 끌고 있다(Roccatello et al., Clin Rev Allergy Immunol 2008, 34:111-117; Cutler et al., Blood 2006, 108:756-752; Vo et al., N Engl J Med 2008, 359:242-251; Vieira et al., Transplantation 2004;77:542-548; Abdallah & Park, Clin . Transpl. 2006:427-37; Zaja et al., Bone Marrow Transplant., 2007, 40:273-77; Saadoun et al., Curr . Opin . Rheumatol. 2008, 20:23-8; Antonelli et al., Clin . Exp . Rheumatol. 2008, 26:S39-47).Hemolytic anemia, Hanglobulinemia, hepatitis (especially hepatitis C), graft-versus-host disease (GVHD) (especially allogeneic stem cell transplantation), allogeneic sensitization ( In particular, other diseases with immunological dysregulation, such as with organ transplantation, are suitably treated by the novel compositions and methods disclosed herein. There is now increasing evidence that B-cells are associated with these pathological conditions, and therefore depletion of B-cells by anti-B-cell therapy is of interest (Roccatello et al., Clin) . Rev Allergy Immunol 2008, 34: 111-117; Cutler et al., Blood 2006, 108: 756-752; Vo et al., N Engl J Med 2008, 359: 242-251; Vieira et al., Transplantation 2004; 77: 542-548; Abdallah & Park, Clin . Transpl . 2006: 427-37; Zaja et al., Bone Marrow Transplant ., 2007, 40: 273-77; Saadoun et al., Curr . Opin . Rheumatol . 2008, 20: 23-8; Antonelli et al., Clin . Exp . Rheumatol . 2008, 26: S39-47).

본 발명은 개선된 치료 특성을 갖는 항-CD20 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편의 구조 변이체를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 구조 변이는 VH의 CDR3(CDRH3)에서 아스파라긴 잔기에 대한 치환으로서 카뱃 위치 101에서의 아스파르트산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 상기 구조 변이는 카뱃 위치 101의 아스파르트산과 염 가교를 형성할 수 있는 카뱃 위치 94에서의 알기닌 잔기를 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 구조 변이는 카뱃 위치 102에서의 발린 잔기를 포함할 수 있다. 숙련된 당업자는 수행될 수 있는 가능한 아미노산 치환이 전술한 특정한 예에 한정되지 않으며, 추가적인 및/또는 상이한 카뱃 위치에서의 치환을 포함할 수 있음을 인식할 것이다.The present invention provides structural variants of anti-CD20 antibodies and / or antigen binding fragments thereof having improved therapeutic properties. In certain embodiments, the structural variation may comprise an aspartic acid residue at Kabat position 101 as a substitution for an asparagine residue in CDR3 (CDRH3) of V H. In other specific embodiments, the structural variation may comprise an arginine residue at Kabat position 94 which may form a salt bridge with aspartic acid at Kabat position 101. In another specific embodiment, the structural variation may comprise a valine residue at Kabat position 102. Those skilled in the art will recognize that the possible amino acid substitutions that may be made are not limited to the specific examples described above and may include substitutions at additional and / or different Kabat positions.

상기 개선된 치료 특성은 표적 항원으로부터의 느린 해리 속도, 보체-의존성 세포독성(CDC)의 증가 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)에서의 EC50의 감소와 같은 다양한 형태를 취할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 특성은 낮은 용량, 바람직하게는 인간 대상에 대해 80 ㎎ 이하의 용량, 더욱 바람직하게는 50 ㎎ 이하의 용량, 가장 바람직하게는 30 ㎎ 이하의 용량에서의 효능을 포함할 수 있다. 상기 용량은 2회 이상 투여될 수 있다. 바람직하게는, 다중 투여가 제공되는 곳에서, 이들은 1 내지 3주 간격으로 투여된다. 그러나, 특정 질환 세팅에서, 예를 들면 만성 림프구성 백혈병에서 4주 이상 동안 매주 2회와 같이 보다 빈번한, 분별화된(fractionated) 복용량이 바람직하다.The improved therapeutic properties can take various forms such as a slow dissociation rate from the target antigen, an increase in complement-dependent cytotoxicity (CDC) and / or a decrease in EC 50 in complement-dependent cytotoxicity (CDC). In a preferred embodiment, the property may comprise efficacy at a lower dose, preferably at a dose of up to 80 mg, more preferably at most 50 mg, most preferably at a dose of 30 mg or less for a human subject. have. The dose may be administered two or more times. Preferably, where multiple administrations are provided, they are administered at one to three week intervals. However, in certain disease settings, more frequent, fractionated doses are preferred, such as twice weekly for at least 4 weeks in chronic lymphocytic leukemia.

특정 구현예에서, 상기 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항-CD20 항체와 같은 인간 B-세포 마커에 결합하는 인간화, 키메라 또는 인간 항체일 수 있으며, B-세포 종양 및 자가면역 질환과 같은 B-세포 질환 뿐만 아니라, GVHD, 용혈성 빈혈, 한성글로불린혈증, 동종감작반응, 및 기관 이식 거부와 같은 B-세포를 포함하는 다른 질환 뿐만 아니라, C형 간염과 같은 특정 바이러스 질환과 같은 B-세포 질환의 치료 또는 진단에 사용된다. 상기 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체는 네이키드 항체 단독으로 또는 하나 이상의 치료제 또는 진단제와 접합된 표적가능한 구조체(construct)를 이용한 전-표적화 방법에서 하나 이상의 치료제와의 조합으로, 하나 이상의 치료제 및/또는 진단제로 표지된 면역접합체로서, 항체 융합 단백질로서, 또는 다른 항체, 다른 치료제 또는 면역조절제와의 다중모드 치료로서 인간 또는 가축과 같은 포유동물 대상의 치료 방법으로 사용될 수 있다. 상기 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체는 또한 진단 이미지 제제 단독으로, 다른 진단 이미지 제제와의 조합으로, 및/또는 치료용 적용분야(application)와 접목되어 사용될 수 있다.In certain embodiments, the anti-CD20 antibody or antigen-binding fragment thereof may be a humanized, chimeric or human antibody that binds to a human B-cell marker, such as an anti-CD20 antibody, and may be a B-cell tumor and an autoimmune disease. B-cell diseases as well as other viral diseases, such as hepatitis C, as well as other diseases including B-cells, such as GVHD, hemolytic anemia, Hanglobulinemia, allergic reactions, and organ transplant rejection Used to treat or diagnose a disease. The humanized, chimeric or human anti-CD20 antibody may be one or more therapeutic agents, alone or in combination with one or more therapeutic agents in a pre-targeting method using a targetable construct conjugated with one or more therapeutic or diagnostic agents. And / or as an immunoconjugate labeled with a diagnostic agent, as an antibody fusion protein, or as a multimodal treatment with other antibodies, other therapeutic agents, or immunomodulators. The humanized, chimeric or human anti-CD20 antibodies may also be used alone, in combination with other diagnostic imaging agents, and / or in combination with therapeutic applications.

숙련된 당업자는 개선된 치료 특성을 갖는 서열 변이에 대해 개시된 방법 및 조성물들은 항-CD20 항체에 제한되는 것은 아니며, 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) Ⅸ, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B 피브로넥틴, 인자 H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, 폴레이트 수용체, GROB, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자(HIF), HM1.24, 인슐린-유사 성장 인자-1(ILGF-1), ILGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, Ia, HLA-DR, 테나신, Le(y), RANTES, T101, TAC, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히 항원, 종양 괴사 항원, TNF-α, TRAIL 수용체(R1 및 R2), VEGFR, EGFR, PlGF, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 및 bcl-2, bcl-6, Kras 및 cMET을 포함하는 암유전자 산물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다른 종양-관련성 항원 또는 자가면역 및 다른 면역 질환-관련성 항원에 대한 항체에 적용될 수 있음을 인식할 것이다.The skilled artisan is not limited to anti-CD20 antibodies, and the methods and compositions disclosed for sequence variations with improved therapeutic properties, including carbonic anhydrase ase, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3 , CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52 , CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B Fibronectin, Factor H, FHL -1, Flt-1, Flt-3, folate receptor, GROB, HMGB-1, hypoxia inducible factor (HIF), HM1.24, insulin-like growth factor-1 (ILGF-1), ILGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL- 12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA- 95, NCA-90, Ia, HLA-DR, tenasin, Le (y), RANTES, T101, TAC, Tn antigen, Thomson-Freeden Antigen, tumor necrosis antigen, TNF-α, TRAIL receptors (R1 and R2), VEGFR, EGFR, PlGF, complement factors C3, C3a, C3b, C5a, C5, and bcl-2, bcl-6, Kras and cMET It will be appreciated that it may be applied to other tumor-associated antigens or antibodies to autoimmune and other immune disease-related antigens, including, but not limited to, including oncogene products.

다른 구현예는 특정 설치류 CDR 또는 하나 이상의 설치류 또는 키메라 항-CD20 MAb 유래의 설치류 CDR의 조합을 함유하는 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것일 수 있다. 이들 MAb는 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 MAb일 수 있다. 상기 CDR 서열은 경쇄 CDR 서열 CDRL1(RASSSVSYIH, 서열번호 1), CDRL2(ATSNLAS, 서열번호 2) 및 CDRL3(QQWTSNPPT, 서열번호 3) 및 중쇄 CDR 서열 CDRHl(SYNMH, 서열번호 4), CDRH2(AIYPGNGDTSYNQKFKG, 서열번호 5) 및 CDRH3 (STYYGGDWYFDV, 서열번호 6)을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.Other embodiments may relate to anti-CD20 MAbs or antigen binding fragments thereof that contain a particular rodent CDR or combination of rodent CDRs derived from one or more rodent or chimeric anti-CD20 MAbs. These MAbs can be humanized, chimeric or human anti-CD20 MAbs. The CDR sequences include the light chain CDR sequences CDRL1 (RASSSVSYIH, SEQ ID NO: 1), CDRL2 (ATSNLAS, SEQ ID NO: 2) and CDRL3 (QQWTSNPPT, SEQ ID NO: 3) and heavy chain CDR sequences CDRHl (SYNMH, SEQ ID NO: 4), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG, SEQ ID NO: 5) and CDRH3 (STYYGGDWYFDV, SEQ ID NO: 6), but are not limited thereto.

다양한 구현예는 적어도 2개의 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제1 MAb 및 제2 MAb를 포함하는 양특이성 항체 또는 항체 융합 단백질에 관한 것일 수 있다. 상기 제2 MAb는 상기에서 나열한 것과 같은 종양-관련성 항원, 또는 예를 들면 표적가능한 접합체 상의 합텐(hapten)에 결합할 수 있다.Various embodiments may relate to bispecific antibodies or antibody fusion proteins comprising a first MAb and a second MAb comprising at least two anti-CD20 MAbs or antigen binding fragments thereof or an anti-CD20 MAb or antigen binding fragments thereof. have. The second MAb may bind to tumor-associated antigens as listed above, or hapten on targetable conjugates, for example.

다른 구현예는 적어도 하나의 치료제 또는 적어도 하나의 진단제에 결합하는 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 융합 단백질의 치료용 또는 진단용 접합체에 관한 것일 수 있다. 또한, 동일한 또는 상이한 유형의 다중 치료제를 갖는 항체 및 융합 단백질이 포함된다. 다른 구현예에서, 상기 항-CD20 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은, 예를 들면, 한쪽 암(arm)은 세포, 질환, 조직 또는 병원체(예컨대, C형 간염-관련성 표적 항원)에 특이적으로 결합하고, 두 번째 암은 하나 이상의 진단제 또는 치료제가 부착된 표적가능한 접합체에 결합하는 양특이성 항체를 이용하는 치료용 또는 진단용 전-표적화 방법에서 사용될 수 있다. 양특이성 항체를 이용한 전-표적화 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제7,300,644호; 제7,138,103호; 제7,074,405호; 제7,052,872호; 제6,962,702호; 제6,458,933호 참조).Another embodiment may relate to a therapeutic or diagnostic conjugate of an anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof or antibody fusion protein that binds at least one therapeutic agent or at least one diagnostic agent. Also included are antibodies and fusion proteins with multiple therapeutic agents of the same or different types. In other embodiments, the anti-CD20 antibody, antigen binding fragment or fusion protein, for example, one arm is specific for a cell, disease, tissue or pathogen (eg, hepatitis C-related target antigen). And the second cancer can be used in therapeutic or diagnostic pro-targeting methods using bispecific antibodies that bind to one or more diagnostic agents or targetable conjugates to which the agent is attached. Pre-targeting methods using bispecific antibodies are well known in the art (e.g., U.S. Pat. Nos. 7,300,644; 7,138,103; 7,074,405; 7,052,872; 6,962,702; 6,458,933).

다른 구현예는 상기 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 융합 단백질을 단독으로, 하나 이상의 다른 치료제와의 조합으로, 예를 들면 하나 이상의 치료제를 갖는 치료용 면역접합체의 항체 성분으로, 또는 네이키드 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와의 조합으로 투여되어 치료에 이용하는 방법에 관한 것일 수 있다. 하나 이상의 진단제와의 조합으로 진단 방법에 사용하는 것 또한 고려된다. 바람직한 구현예에서, 상기 진단 또는 치료되는 질환은 B-세포 매개성 면역 질환, 자가면역 질환, B-세포 림프종 또는 백혈병이다. B-세포 매개성 면역 질환은 자가면역 질환의 서브-클래스 뿐만 아니라 상기 질환 상태가 자가활성형 T 림프구 또는 B-세포 및 T-세포 면역의 조합에 의한 것이라기 보다는 일차적으로 자가항체의 생성에 의해 매개되는 전술한 다른 면역 질환(예컨대, GVHD, 한성글로불린혈증, 용혈성 빈혈, 동종감작반응, 기관 이식 거부)을 나타낸다.Another embodiment provides an anti-CD20 MAb or antigen binding fragment or antibody fusion protein thereof alone, in combination with one or more other therapeutic agents, eg, as an antibody component of a therapeutic immunoconjugate having one or more therapeutic agents, or The kit antibodies, antigen binding fragments or fusion proteins may be administered alone or in combination with one or more therapeutic agents for use in therapy. Also contemplated for use in diagnostic methods in combination with one or more diagnostic agents. In a preferred embodiment, the disease to be diagnosed or treated is B-cell mediated immune disease, autoimmune disease, B-cell lymphoma or leukemia. B-cell mediated autoimmune diseases are primarily caused by the production of autoantibodies, rather than by sub-classes of autoimmune diseases as well as by the disease state rather than by autoactive T lymphocytes or a combination of B-cell and T-cell immunity. Mediated other immune diseases as described above (eg, GVHD, Hanglobulinemia, hemolytic anemia, allogenic sensitization, organ transplant rejection).

정의Justice

본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체는 전장(full-length)(즉, 정상 면역글로불린 유전자 단편의 재조합 공정에 의해 자연적으로 발생하거나 형성된) 면역글로불린 분자(예컨대, IgG 항체) 또는 항체 단편과 같이 면역학적으로 활성인, 면역글로불린 분자의 항원-결합 부위를 나타낸다.As used herein, an antibody is immune, such as a full-length immunoglobulin molecule (eg, an IgG antibody) or an antibody fragment (ie, naturally occurring or formed by a recombinant process of a normal immunoglobulin gene fragment). An antigen-binding site of an immunoglobulin molecule that is academically active.

항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체 부위이다. 구조와 무관하게, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합한다. 예를 들면, 항-CD20 단일클론 항체 단편은 CD20에 결합한다. 또한, "항체 단편"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어지는 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 고도가변(hypervariable) 영역을 흉내내는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위와 같은 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "항체 단편"이란 용어는 Fc 단편과 같이 항원 결합 활성이 없는 항체 부위를 포함하지는 않는다. Antibody fragments are antibody sites such as F (ab ') 2 , F (ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv and the like. Regardless of the structure, the antibody fragment binds to the same antigen as recognized by the intact antibody. For example, anti-CD20 monoclonal antibody fragments bind to CD20. The term “antibody fragment” also refers to “Fv” fragments consisting of variable regions of heavy and light chains, recombinant single chain polypeptide molecules (“scFv proteins”) in which the light and heavy chain variable regions are linked by peptide linkers, and highly variable isolated fragments consisting of variable regions, such as minimal recognition units of amino acid residues that mimic a hypervariable region. As used herein, the term "antibody fragment" does not include antibody sites that lack antigen binding activity, such as Fc fragments.

네이키드 항체는 치료제와 접합되지 않은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 나타낸다. 항체 분자의 Fc 부위는 세포의 용해를 유도할 수 있는 작용 메카니즘을 세팅하는 보체의 고정 및 ADCC(antibody dependent cell cytotoxicity)와 같은 작용기 기능을 제공할 수 있다. 그러나, Fc 부위는 다른 메카니즘과 함께 아폽토시스와 같은 치료적 기능이 작용하는데 필요하지 않는 것이 가능하다. 네이키드 항체는 폴리클론 및 단일클론 항체 뿐만 아니라 키메라, 인간화 또는 인간 항체와 같은 재조합 항체를 포함할 수 있다. Naked antibodies refer to antibodies or antigen-binding fragments thereof that are not conjugated with a therapeutic agent. The Fc region of an antibody molecule can provide functional group functions such as fixation of complement and antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC), which sets the mechanism of action that can induce cell lysis. However, it is possible that the Fc region is not necessary for a therapeutic function such as apoptosis to work with other mechanisms. Naked antibodies may include polyclonal and monoclonal antibodies as well as recombinant antibodies such as chimeric, humanized or human antibodies.

치료제는 항체 모이어티(moiety)와 함께 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여되거나, 항체 모이어티, 즉 항체 또는 항체 단편, 또는 서브단편에 접합되는 분자 또는 원자이며, 질환의 치료에 유용하다. 치료제의 비제한적인 예로는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제, 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi) 및 방사성동위원소를 포함한다. A therapeutic agent is a molecule or atom that is administered separately, simultaneously or sequentially with an antibody moiety or that is conjugated to an antibody moiety, ie an antibody or antibody fragment, or subfragment, and is useful for the treatment of a disease. Non-limiting examples of therapeutic agents include antibodies, antibody fragments, drugs, toxins, nucleases, hormones, immunomodulators, chelators, boron compounds, photoactive agents, oligonucleotides (eg antisense oligonucleotides or RNAi) and radioisotopes. Include.

진단제는 질환 또는 의료적 증상과 연관되는 세포, 조직, 병원체 또는 다른 표적에 운반하기 위한 항체, 항체 단편, 표적가능한 구조체 또는 다른 모이어티에 접합될 수 있는 검출가능한 분자 또는 원자이다. 유용한 진단제는 방사성동위원소, 초음파, 염료(바이오틴-스트렙트아비딘 복합체와 같은), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 증진제(enhancing agent)(예컨대, 자기 공명 영상용의 상자성 이온)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. A diagnostic agent is a detectable molecule or atom that can be conjugated to an antibody, antibody fragment, targetable construct or other moiety for delivery to a cell, tissue, pathogen or other target associated with a disease or medical condition. Useful diagnostic agents include, but are not limited to, radioisotopes, ultrasound, dyes (such as biotin-streptavidin complexes), contrast agents, fluorescent compounds or molecules and enhancing agents (e.g. paramagnetic ions for magnetic resonance imaging). It doesn't happen.

면역접합체는 적어도 하나의 치료제 또는 진단제를 갖는 항체 성분의 접합체이다. 항체 성분은 다중 치료제 및/또는 진단제와 접합되어 면역접합체를 형성할 수 있다. An immunoconjugate is a conjugate of antibody components having at least one therapeutic or diagnostic agent. Antibody components can be conjugated with multiple therapeutic and / or diagnostic agents to form immunoconjugates.

항체 융합 단백질이란 용어는 하나 이상의 동일한 또는 상이한 단일쇄 항체 또는 동일한 또는 상이한 특이성을 갖는 항체 단편 세그먼트(segment)가 연결되어 있는 재조합적으로 제조된 항원-결합 분자를 나타낼 수 있다. 상기 융합 단백질의 결합가(valency)는 상기 융합 단백질이 단일 항원 또는 에피토프에 대해 얼마나 많은 결합 암 또는 부위를 갖고 있는지, 즉 1가, 2가, 3가 또는 다가인지를 나타낸다. 상기 항체 융합 단백질의 다중결합가는 항원에 대한 결합시 다중 상호작용의 이점을 취할 수 있고, 따라서 항원에 대한 결합의 결합활성(avidity)을 증가시킬 수 있음을 의미한다. 특이성은 항체 융합 단백질이 얼마나 많은 항원 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있는지, 즉 단특이성, 양특이성, 삼특이성, 다중특이성인지를 나타낸다. 이러한 정의를 이용함으로써, 자연적인 항체, 예컨대 IgG는 2개의 결합 암을 갖고 있기 때문에 2가이고, 한가지 에피토프 유형에 결합하기 때문에 단특이성이다. 단특이성, 다가의 융합 단백질은 에피토프에 대한 하나 이상의 결합 부위를 갖지만, 한가지 에피토프와 결합한다. 상기 융합 단백질은 단일 항체 성분, 상이한 항체 성분들의 다가 또는 다중특이성 조합 또는 동일한 항체 성분의 다중 카피(copy)를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질용으로 적합한 치료제의 예로는 면역조절제("항체-면역조절제 융합 단백질") 및 독소("항체-독소 융합 단백질")를 포함한다. 한 바람직한 독소는 리보뉴클레아제(RNase), 바람직하게는 재조합 RNase를 포함한다. 다른 바람직한 면역조절제 융합 단백질은 본 발명에서 개시한 것과 같이 인터페론을 특정 항체 또는 다가 항체 또는 다중특이성 항체에 융합시킨 것과 같은 면역사이토카인(immunocytokine)이다. The term antibody fusion protein may refer to recombinantly produced antigen-binding molecules to which one or more identical or different single chain antibodies or antibody fragment segments having the same or different specificities are linked. The valency of the fusion protein indicates how many binding arms or sites the fusion protein has for a single antigen or epitope, ie monovalent, divalent, trivalent or multivalent. The multivalent value of the antibody fusion protein means that it can take advantage of multiple interactions upon binding to the antigen, thus increasing the binding activity of the binding to the antigen. Specificity indicates how many antigens or different epitopes the antibody fusion protein can bind to, i.e. monospecific, bispecific, trispecific, multispecific. By using this definition, natural antibodies, such as IgG, are bivalent because they have two binding arms and monospecific because they bind to one epitope type. Monospecific, multivalent fusion proteins have one or more binding sites for epitopes, but bind to one epitope. The fusion protein may comprise a single antibody component, multivalent or multispecific combinations of different antibody components or multiple copies of the same antibody component. The fusion protein may further comprise an antibody or antibody fragment and a therapeutic agent. Examples of suitable therapeutic agents for such fusion proteins include immunomodulators ("antibody-immunogen fusion proteins") and toxins ("antibody-toxin fusion proteins"). One preferred toxin includes ribonuclease (RNase), preferably recombinant RNase. Other preferred immunomodulator fusion proteins are immunocytokines, such as those in which the interferon is fused to specific antibodies or multivalent antibodies or multispecific antibodies as disclosed herein.

다중특이성 항체는 상이한 구조를 갖는 적어도 2가지 표적, 예컨대 2가지 상이한 항원, 동일한 항원 상의 2가지 상이한 에피토프, 합텐 및/또는 항원 또는 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 한 특이성은 B-세포, T-세포, 골수성세포(myeloid cell), 혈장세포(plasma cell) 또는 비만세포(mast cell) 항원 또는 에피토프에 대한 것일 수 있다. 다른 특이성은 B-세포 상의 CD20, CD19, CD21, CD23, CD37, CD45, CD70, CD79a, CD80, HLA-DR, CD74, MUC1 또는 CD22와 같은 동일한 세포 유형 상의 상이한 항원에 대한 것일 수 있다. 다중특이성, 다가 항체는 하나 이상의 결합 부위를 갖고, 상기 결합 부위가 상이한 특이성을 갖는 구조체이다. Multispecific antibodies are antibodies that can simultaneously bind to at least two targets with different structures, such as two different antigens, two different epitopes, hapten and / or antigens or epitopes on the same antigen. One specificity may be for B-cells, T-cells, myeloid cells, plasma cells or mast cell antigens or epitopes. Other specificities may be for different antigens on the same cell type, such as CD20, CD19, CD21, CD23, CD37, CD45, CD70, CD79a, CD80, HLA-DR, CD74, MUC1 or CD22 on B-cells. Multispecific, multivalent antibodies are constructs that have one or more binding sites, and wherein the binding sites have different specificities.

양특이성 항체는 상이한 구조를 갖는 2가지 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 바람직한 구현예에서, 양특이성 항체(bsAb) 및 양특이성 항체 단편(bsFab)은 예를 들면 B-세포, T-세포, 골수성세포, 혈장세포 또는 비만세포 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 암과, 치료제 또는 진단제를 갖는 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 암을 갖는다. Bispecific antibodies are antibodies that can bind to two targets with different structures simultaneously. In a preferred embodiment, the bispecific antibody (bsAb) and the bispecific antibody fragment (bsFab) are at least one that specifically binds to, for example, B-cell, T-cell, myeloid cell, plasma cell or mast cell antigen or epitope. Cancer and at least one other cancer that specifically binds to a targetable conjugate having a therapeutic or diagnostic agent.

개선된 항-Improved anti- CD20CD20 항체 Antibodies

최근 10년 동안의 의학적 치료법의 발전은 다양한 암의 치료를 위해 9가지 항체를 도입한 것으로부터 증명된다(Sharkey and Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006, 56:226-243). 이들 새로운 생물학적 치료법의 대부분은 종래 세포독성 약물과의 조합으로 사용되며, 이는 상기 항체는 그 효능(Id .)을 개선하기 위하여 추가적인 조치를 필요로 한다는 것을 나타낸다. 이는 처음에 비-호지킨 림프종(NHL)의 치료용 단일치료법으로 승인된 1세대 키메라 항-CD20 단일클론 항체(MAb)인 리툭시맙에서 가장 잘 예시된다(Castillo et al., Exp Hematol. 2008, 36:755-768). 리툭시맙은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, Biogen/IODEC 및 Genentech으로부터 상업적으로 이용할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,736,137호; 제5,776,456호; 제6,399,061호; 제6,455,043호; 제6,846,476호 참조). 이러한 성공에 기반하여, 개선된 항-CD20 항체를 도입하기 위한 노력들이 진행 중이다(Stein et al., Clin Cancer Res. 2004, 10:2868-78; Teeling et al., Blood. 2004, 104:1793-1800; Vugmeyster et al., J Immunother. 2005, 28:212- 219, Umana et al, Ann Oncol. 2008, 19(Suppl 7), abstract 98; Forero et al, Proc 99 th Ann Meeting of the Am Assoc Cancer Res, 2008, abstract LB-70; Glennie et al , Mol Immunol. 2007, 44:3823-37).Advances in medical therapies over the last decade have been demonstrated by the introduction of nine antibodies for the treatment of various cancers (Sharkey and Goldenberg, CA Cancer J Clin . 2006, 56: 226-243). Many of these new biological therapy is used in combination with conventional cytotoxic drugs, indicating that require additional steps to improve the efficacy (Id.) Is the antibody. This is best illustrated by Rituximab, a first generation chimeric anti-CD20 monoclonal antibody (MAb) initially approved as monotherapy for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (Castillo et al., Exp Hematol . 2008, 36: 755-768). Rituximab is well known in the art and commercially available from Biogen / IODEC and Genentech (see, eg, US Pat. Nos. 5,736,137; 5,776,456; 6,399,061; 6,455,043; 6,846,476). Based on this success, efforts are underway to introduce improved anti-CD20 antibodies (Stein et al., Clin Cancer Res . 2004, 10: 2868-78; Teeling et al., Blood . 2004, 104: 1793-1800; Vugmeyster et al., J Immunother . 2005, 28: 212-219, Umana et al, Ann Oncol . 2008, 19 (Suppl 7), abstract 98; Forero et al, Proc 99 th Ann Meeting of the Am Assoc Cancer Res , 2008, abstract LB-70; Glennie et al, Mol Immunol . 2007, 44: 3823-37).

이들 새로운 항-CD20 MAb의 대부분은 설치류 성분을 감소시키면서 FcγR 또는 보체(complement)-매개성 기능을 향상시키기 위한 의도이다(Glennie et al., Mol Immunol. 2007, 44:3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:226-232; Martin et al., Semin Hematol. 2008, 45:126-132). 리툭시맙을 이용하여 경험한 상기 투여와 관련된 반응을 완화시키기 위하여 개발된 첫 번째 2세대 MAb 중 하나는 현재 벨투즈맙으로 불리는 hA20 MAb이다(예컨대, Qu et al., Blood 2008, 111:2211-19; Stein et al., Clin Cancer Res. 2004, 10:2868-78; 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제7,151,164호). 벨투즈맙은 리툭시맙에 비해 더 짧은 투여 시간을 가지며, 리툭시맙에 대해 보고된 것보다 더 높은 완전 반응(complete response, CR) 속도를 나타낸다(Morschhauser et al., Proc Am Soc Clin Oncol ., J Clin Oncol. 2007, 25(18S):449s; Goldenberg et al., Proc Amer Soc Clin Oncol ., J. clin . Oncol. 2008, 26(15S):142s). 하기 실시예에서 개시된 바와 같이, 벨투즈맙은 인간화 항-CD22 MAb인 에프라투즈맙(epratuzumab) 또는 hLL2의 백본(backbone) 골격 영역을 이용하여 재조합적으로 가공되었으며(예컨대, Leung et al., Mol Immunol. 1995, 32:1413-1427; 각 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제6,306,393호; 제6,183,774호 및 제7,074,403호 참조), 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 리툭시맙과 비교하여 동일한 경쇄 CDR 및 동일한 중쇄 CDR1 및 CDR2를 갖고 있지만, 상이한 CDR3-VH(CDRH3) 불변부를 갖는다.Most of these new anti-CD20 MAbs are intended to enhance FcγR or complement-mediated function while reducing rodent components (Glennie et al., Mol Immunol . 2007, 44: 3823-37; Maloney, H ematology Am Soc Hematol Educ Program . 2007: 226-232; Martin et al., Semin Hematol . 2008, 45: 126-132). One of the first second-generation MAbs developed to mitigate the response associated with such administration experienced with rituximab is the hA20 MAb, now called veltumab (eg, Qu et al., Blood 2008, 111: 2211-). 19; Stein et al., Clin Cancer Res . 2004, 10: 2868-78; US Pat. No. 7,151,164, which is incorporated by reference in its part. Veltuzumab has a shorter dosing time than rituximab and shows a higher rate of complete response (CR) than reported for rituximab (Morschhauser et al., Proc Am Soc Clin Oncol ., J Clin Oncol . 2007, 25 (18S): 449s; Goldenberg et al., Proc Amer Soc Clin Oncol ., J. clin . Oncol . 2008, 26 (15S): 142s). As disclosed in the Examples below, beltuzumab was recombinantly processed using the backbone framework region of epratuzumab or hLL2, a humanized anti-CD22 MAb (eg, Leung et al., Mol) . Immunol . 1995, 32: 1413-1427; US Pat. No. 6,306,393, wherein each example part is incorporated herein by reference; 6,183,774 and 7,074,403), having the same light chain CDRs and the same heavy chain CDR1 and CDR2 compared to rituximab as shown in Table 1 below, but with different CDR3-V H (CDRH3) constant regions.

하기 실시예에 개시된 바와 같이, 서열에서의 차이점의 결과, 벨투즈맙은 리툭시맙과 비교하여 Daudi 세포주에서의 현저하게 개선된 보체-의존성 세포독성(CDC), 테스트된 3가지 모든 림프종 세포주에서의 더 느린 오프-속도(off-rate), 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서의 강력한 항-B-세포 활성 및 인간 림프종-설치류 모델에서의 치료 효과 뿐만 아니라 리툭시맙과 비교하여 마우스에서의 Raji 림프종 이종이식체의 현저하게 더 나은 조절성의 관점에서 독특한 특성을 가지며, 따라서 매우 낮은 복용량에서 환자에서 관찰되는 활성을 제공한다. Goldenberg et al., 2009, "Properties and structure-function relationships of veltuzumab(hA20), a humanized anti-CD20 monoclonal antibody," Blood 113:1062-70 참조. 놀랍게도, 하기 실시예에 개시된 것과 같이, 벨투즈맙과 리툭시맙 사이의 이러한 기능성의 차이는 리툭시맙의 중쇄 3번째 상보성-결정 영역(CDRH3)에서의 비보존적 단일 아미노산(카뱃 잔기 101)의 변화와 연관이 있다. 이러한 비보존적 변화는 원하는 특성으로 항체를 개선시키기 위한 타당한 기회 또는 성공에 대한 감소된 기회로 인하여 본 기술분야의 당업자에 의해 고려되어 오지 않았다.As disclosed in the examples below, as a result of the differences in the sequences, velutumab was significantly improved complement-dependent cytotoxicity (CDC) in the Daudi cell line compared to rituximab, in all three lymphoma cell lines tested. Slower off-rate, potent anti-B-cell activity in cynomolgus monkeys and therapeutic effects in human lymphoma-rodent models as well as Raji lymphoma in mice compared to rituximab It has unique properties in terms of significantly better control of xenografts and thus provides the activity observed in patients at very low doses. See Goldenberg et al., 2009, "Properties and structure-function relationships of veltuzumab (hA20), a humanized anti-CD20 monoclonal antibody," Blood 113: 1062-70. Surprisingly, as disclosed in the examples below, this difference in functionality between beltuzmab and rituximab is due to the nonconservative single amino acid (CatH residue 101) in the heavy chain third complementarity-determining region (CDRH3) of rituximab. It is related to change. Such non-conservative changes have not been considered by those skilled in the art because of reasonable opportunities for improving the antibody with the desired properties or reduced opportunities for success.

다양한 구현예에서, 본 발명은 접합체로서 단독으로 또는 다른 네이키드 항체 및 항체 치료제 접합체를 포함하는 다른 치료제와의 조합으로 투여되어 포유동물 대상, 인간 및 가축의 치료에 유용한 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체, 그의 항체 융합 단백질을 제공한다.In various embodiments, the present invention is administered as a conjugate alone or in combination with other therapeutic agents, including other naked antibodies and antibody therapeutic conjugates, for use in humanized, chimeric or human anti- CD20 antibodies, antibody fusion proteins thereof.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 VH CDR3의 카뱃 위치 101에서의 아스파르트산 잔기, 카뱃 위치 94에서의 알기닌 잔기 및 카뱃 위치 102에서의 발린 잔기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 항-CD20 항체 및 그의 항원 결합 단편은 경쇄 CDR 서열 CDRL1(RASSSVSYIH, 서열번호 1), CDRL2(ATSNLAS, 서열번호 2) 및 CDRL3(QQWTSNPPT, 서열번호 3) 및 중쇄 CDR 서열 CDRH1(SYNMH, 서열번호 4), CDRH2(AIYPGNGDTSYNQKFKG, 서열번호 5) 및 CDRH3(STYYGGDWYFDV, SEQ 서열번호 6)을 포함하는 벨투즈맙의 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 항-CD20 항체는 벨투즈맙이다.In a preferred embodiment, the anti-CD20 MAb or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises an aspartic acid residue at Kabat position 101, an arginine residue at Kabat position 94 and a valine residue at Kabat position 102 of V H CDR3. More preferably, the anti-CD20 antibody and antigen-binding fragment thereof comprise light chain CDR sequences CDRL1 (RASSSVSYIH, SEQ ID NO: 1), CDRL2 (ATSNLAS, SEQ ID NO: 2) and CDRL3 (QQWTSNPPT, SEQ ID NO: 3) and heavy chain CDR sequences CDRH1 (SYNMH, SEQ ID NO: 4), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG, SEQ ID NO: 5) and CDRH3 (STYYGGDWYFDV, SEQ SEQ ID NO: 6). In the most preferred embodiment, the anti-CD20 antibody is beltuzumab.

상기 인간화 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 양친 설치류 항-CD20 MAb의 B-세포, B-세포 림프종 및 B-세포 백혈병 표적화 특성은 유지하면서 설치류 항-CD20 MAb의 CDR(또는 설치류 항-CD20 항체의 CDR로부터 유래된 서열) 및 골격(FR) 및 하나 이상의 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 인간화 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 양친 설치류 MAb의 대응하는 FR 유래의 적어도 하나의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 인간화 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 도 2b(hA20VH1, 서열번호 14)에 나타낸 중쇄 가변 영역의 1, 5, 27, 30, 38, 48, 67, 68, 70, 95, 115 또는 116번째 아미노산에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기 및/또는 도 2a(hA20Vk, 서열번호 12)에 나타낸 경쇄 가변 영역의 4, 21, 35, 38, 45, 46, 59, 99, 104 또는 106번째 아미노산 잔기에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 상기 설치류 골격 아미노산 잔기는 올바른 결합을 유지하거나, CD20 항원에 대한 결합을 향상시키기 위하여 필요시 경쇄 및 중쇄 가변부의 FR 영역에서 치환될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 인간화 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 hA20Vk(서열번호 12) 및 hA2VH1(서열번호 14)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.The humanized anti-CD20 MAb or antigen-binding fragment thereof may contain the CDRs (or rodent anti-CD20) of rodent anti-CD20 MAb while maintaining the B-cell, B-cell lymphoma and B-cell leukemia targeting properties of the parental rodent anti-CD20 MAb. Sequences derived from the CDRs of the antibody) and backbone (FR) and constant regions of the light and heavy chain variable regions of one or more human antibodies. The humanized anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof may further comprise at least one amino acid from the corresponding FR of the parental rodent MAb. Specifically, the humanized anti-CD20 MAb or an antigen-binding fragment thereof may comprise 1, 5, 27, 30, 38, 48, 67, 68, 70, 95, of the heavy chain variable region shown in FIG. 2B (hA20VH1, SEQ ID NO: 14). At least one amino acid residue corresponding to the 115th or 116th amino acid and / or 4, 21, 35, 38, 45, 46, 59, 99, 104 or 106 of the light chain variable region shown in FIG. 2A (hA20Vk, SEQ ID NO: 12) At least one amino acid residue corresponding to the first amino acid residue. The rodent backbone amino acid residues may be substituted in the FR region of the light and heavy chain variable regions as needed to maintain correct binding or to enhance binding to the CD20 antigen. More preferably, the humanized anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof may comprise the amino acid sequences of hA20Vk (SEQ ID NO: 12) and hA2VH1 (SEQ ID NO: 14).

키메라 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 항체의 불변 영역 서열에 부착된 설치류 항-CD20 항체(또는 설치류 항-CD20 항체로부터 유래된 것)의 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 키메라 항-CD20 MAb의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 도 1a 및 도 1b에 나타낸 cA20Vk(서열번호 8) 및 cA20VH(서열번호 10)의 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 키메라 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편은 cA20Vk(서열번호 8) 및 cA20VH(서열번호 10)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.The chimeric anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof may comprise variable region sequences of rodent anti-CD20 antibodies (or those derived from rodent anti-CD20 antibodies) attached to the constant region sequences of human antibodies. In a preferred embodiment, the light and heavy chain variable regions of the chimeric anti-CD20 MAb comprise the CDR sequences of cA20Vk (SEQ ID NO: 8) and cA20VH (SEQ ID NO: 10) shown in FIGS. 1A and 1B. Most preferably, the chimeric anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof comprises the light and heavy chain variable region sequences of cA20Vk (SEQ ID NO: 8) and cA20VH (SEQ ID NO: 10).

특정 구현예는 실질적으로 설치류 항-CD20 MAb의 B-세포, B-세포 림프종 및 백혈병 세포 표적화 및 세포 결합 특성을 갖는 인간 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것일 수 있으며, 상기 CDR은 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 같이 상기 키메라 및 인간화 항-CD20 MAb에 대해 개시한 바와 같다.Certain embodiments may relate to human anti-CD20 MAbs or antigen binding fragments thereof having substantially B-cell, B-cell lymphoma and leukemia cell targeting and cell binding properties of rodent anti-CD20 MAbs, wherein the CDRs are shown in FIG. 1 and 2 as described for the chimeric and humanized anti-CD20 MAbs.

다른 구현예는 전술한 바와 같은 적어도 하나의 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 융합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 전술한 적어도 하나의 제1 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편 및 전술한 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편 이외의 적어도 하나의 제2 MAb 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 의도이다. 더욱 바람직하게는, 상기 제2 MAb는 B7, CD4, CD5, CD8 CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD70, CD74, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, ED-B 피브로넥틴, 인자 H, FHL-I, FIt-I, Flt-3, 폴레이트 수용체, GROB, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자(HIF), HM1.24, 인슐린-유사 성장 인자-1 (ILGF-1), 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(ILGF-1R), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, Ia, HM1.24, HLA-DR, 테나신, T101, TAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, VEGFR, EGFR, PlGF, 보체 인자 C5 및 암유전자 산물(예컨대, Kras, cMET, bcl-2, bcl-6) 또는 이들의 조합과 반응하는 MAb이거나, 심지어 볼 발명에서 개시된 항-CD20 MAb와 상이한 항-CD20 MAb이다.Other embodiments may comprise an antibody fusion protein or antigen binding fragment thereof comprising at least one anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof as described above. The antibody fusion protein or antigen binding fragment thereof may also comprise at least one first anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof as described above and at least one second MAb or antigen thereof other than the aforementioned anti-CD20 MAb or antigen binding fragment thereof. It is intended to include an antibody fusion protein or antigen binding fragment thereof comprising a binding fragment. More preferably, the second MAb is B7, CD4, CD5, CD8 CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45 , CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD70, CD74, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, ED-B Fibronectin, Factor H, FHL-I, FIt-I, Flt-3, Paul Late receptor, GROB, HMGB-1, hypoxia inducible factor (HIF), HM1.24, insulin-like growth factor-1 (ILGF-1), insulin-like growth factor-1 receptor (ILGF-1R), IFN- γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, Ia, HM1. 24, HLA-DR, tenasin, T101, TAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, VEGFR, EGFR, PlGF, complement factor C5 and oncogene products (eg Kras, cMET, bcl-2, bcl-6) or It is a MAb that reacts with a combination of these, or even an anti-CD20 MAb different from the anti-CD20 MAb disclosed in the present invention.

B-세포 림프종 및 백혈병 및 자가면역 질환 및 B-세포를 포함하는 다른 면역 질환(GVHD, 용혈성 빈혈, 기관 이식 거절)을 포함하는 B-세포 질병을 치료하기 위한 뛰어난 치료제를 얻기 위하여 CDR 돌연변이 및 상기 가변 영역에서 CDR 및 다른 서열을 조작한 결과로서, 상기 인간화, 키메라 또는 인간 항-CD20 항체는 상기 에피토프와 향상된 친화성 결합 뿐만 아니라 항종양 및 항-B-세포 활성을 가질 수 있다.CDR mutations and the above to obtain excellent therapeutic agents for the treatment of B-cell lymphomas and B-cell diseases including leukemia and autoimmune diseases and other immune diseases including B-cells (GVHD, hemolytic anemia, organ transplant rejection) As a result of manipulating CDRs and other sequences in variable regions, the humanized, chimeric or human anti-CD20 antibodies may have antitumor and anti-B-cell activity as well as enhanced affinity binding with the epitope.

아미노산 치환Amino acid substitutions

예컨대 항체-의존성 세포-의존성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 향상시키기 위해 작용기 기능을 개선하기 위하여 아미노산 서열을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환 또는 Fc 영역에서의 시스테인의 도입이 수행될 수 있으며, 이로부터 내재화 능력(internalization capability)을 개선시키고 및/또는 보체-의존성 세포사 및 ADCC를 증가시키게 된다. 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Caron et al., J. Exp . Med. 176:1191-1195 (1991) 및 Shopes, Br . J. Immunol. 148:2918-2022 (1922) 참조. 개선된 보체 용해와 ADCC 능력 모두를 갖는 이중 Fc 영역을 갖는 항체 융합 단백질이 제조될 수 있다.For example, it may be desirable to modify the amino acid sequence to improve functional group function to enhance antibody-dependent cell-dependent cytotoxicity (ADCC) and / or complement-dependent cytotoxicity (CDC). One or more amino acid substitutions or introduction of cysteine in the Fc region can be performed, thereby improving internalization capability and / or increasing complement-dependent cell death and ADCC. Caron et al., J. Exp . Med . 176: 1191-1195 (1991) and Shopes, Br . J. Immunol . See 148: 2918-2022 (1922). Antibody fusion proteins with double Fc regions with both improved complement lysis and ADCC ability can be prepared.

작용기 기능 또는 다른 항체 기능 특성을 향상시키기 위한 Fc 영역에 대한 변화가 보고되어 있으며(예컨대, Lazar et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 2006, 103:4005-10; Stavenhagen et al, Cancer Res. 2007, 67:8882-90; Hinton et al., J. Immunol. 2006, 176:346-56; Idusogie et al., J. Immunol. 2001, 166:2571-75 참조), 임의의 이러한 알려진 Fc 영역 아미노산 치환이 특허청구범위의 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 카뱃 위치 239에서 세린 잔기를 아스파르트산 잔기로 교체하면 ADCC 활성을 향상시킨다는 것이 보고되어 있다(Lazar et al., ibid., 2006). 페닐알라닌 243을 루이신으로, 아르기닌 292를 프롤린으로, 티로신 300을 루이신으로, 발린 305를 이소루이신으로 및 프롤린 396을 루이신으로 치환하는 것 또한 ADCC 활성을 최적화하는 것으로 나타났다(Stagenhagenet et al., 20007). 트레오닌 250을 글루타민으로 및 메티오닌 428을 루이신으로 교체하면 혈청 반감기가 눈에 띄게 증가하게 된다(Hinton et al., ibid., 2006). 리신 326을 트립토판으로 및 글루탐산 333을 세린으로 치환하면 CDC 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(Idusogie et al., ibid., 2001). 항체의 생리학적 기능을 향상시키기 위한 이들 및 다른 알려진 변형들이 본 발명에 개시된 가변 영역 서열에 대한 변화와 조합되어 개선된 치료 특성의 항-CD20 항체를 생산할 수 있다.Changes to the Fc region to enhance functional group function or other antibody functional properties have been reported (eg, Lazar et al., Proc . Natl . Acad . Sci) . USA 2006, 103: 4005-10; Stavenhagen et al, Cancer Res . 2007, 67: 8882-90; Hinton et al., J. Immunol . 2006, 176: 346-56; Idusogie et al., J. Immunol . 2001, 166: 2571-75), any such known Fc region amino acid substitutions can be used in the methods and compositions of the claims. For example, it has been reported that replacing serine residues with aspartic acid residues at Kabat position 239 improves ADCC activity (Lazar et al., Ibid ., 2006). Substitution of phenylalanine 243 with leucine, arginine 292 with proline, tyrosine 300 with leucine, valine 305 with isoleucine and proline 396 with leucine have also been shown to optimize ADCC activity (Stagenhagenet et al. , 20007). Replacing threonine 250 with glutamine and methionine 428 with leucine results in a marked increase in serum half-life (Hinton et al., Ibid ., 2006). Substitution of lysine 326 with tryptophan and glutamic acid 333 with serine has been shown to increase CDC activity (Idusogie et al., Ibid ., 2001). These and other known modifications to enhance the physiological function of the antibody can be combined with changes to the variable region sequences disclosed herein to produce anti-CD20 antibodies of improved therapeutic properties.

특정 구현예에서, 상기 개시된 방법 및 조성물은 하나 이상의 치환된 아미노산 잔기를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 및 용도를 포함할 수 있다. 아래에 논의된 바와 같이, 사실상 모든 표적 항원에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이들은 표적 항원에 대한 설치류 항체를 생성하게 된다. 본 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 설치류 단일클론 항체의 항원 결합 특이성은 대체로 고도가변 상보성 결정 영역(CDR) 서열에 의해 결정된다. 설치류 항체는 일반적으로 6개의 CDR 서열을 포함하며, 3개는 항체의 경쇄에, 3개는 중쇄에 있다. 아래에 상세히 개시한 바와 같이, 설치류 항체의 키메라, 인간화 또는 인간 버전(version)은 상기 설치류 CDR 서열이 예를 들면 인간 항체의 골격 및 불변 영역 서열 내로 삽입되거나, 전체 설치류 가변 영역 서열을 인간 항체의 불변 영역 서열에 부착하는 CDR 이식과 같은 기술에 의해 구축될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체의 가변 영역 서열은 예를 들면 화학적 합성 및 항체의 전체 경쇄 및 중쇄 가면 영역을 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 조립에 의해 구축될 수 있다.In certain embodiments, the methods and compositions disclosed above can include the manufacture and use of antibodies or antigen-binding fragments thereof having one or more substituted amino acid residues. As discussed below, methods of making monoclonal antibodies against virtually all target antigens are well known in the art. Typically, they will produce rodent antibodies against the target antigen. As is well known in the art, the antigen binding specificity of rodent monoclonal antibodies is largely determined by highly variable complementarity determining region (CDR) sequences. Rodent antibodies generally comprise six CDR sequences, three in the light chain and three in the heavy chain of the antibody. As set forth in detail below, the chimeric, humanized or human version of a rodent antibody may comprise the rodent CDR sequence inserted into, for example, the backbone and constant region sequences of a human antibody or the entire rodent variable region sequence of a human antibody. It can be constructed by techniques such as CDR grafting to constant region sequences. In other embodiments, the variable region sequences of an antibody can be constructed by, for example, chemical synthesis and assembly of oligonucleotides encoding the entire light and heavy chain mask regions of the antibody.

다양한 구현예에서, 상기 키메라, 인간화 또는 인간 항체의 구조적, 물리적 및/또는 치료적 특성은 하나 이상의 아미노산 잔기를 교체함으로서 최적화될 수 있다.In various embodiments, the structural, physical and / or therapeutic properties of the chimeric, humanized or human antibody can be optimized by replacing one or more amino acid residues.

숙련된 당업자는 일반적으로 아미노산의 치환은 전형적으로 아미노산을 상대적으로 유사한 특성의 다른 아미노산(즉, 보존적 아미노산 치환)으로 치환하는 것을 포함함을 인식할 것이다. 다양한 아미노산의 특성 및 단백질 구조 및 기능에 대한 아미노산 치환의 효과는 본 기술분야의 광범위한 연구 및 지식의 대상이 되어 왔다.Those skilled in the art will generally recognize that substitution of an amino acid typically involves substituting the amino acid for another amino acid of relatively similar nature (ie, conservative amino acid substitutions). The effect of amino acid substitution on the properties of various amino acids and protein structure and function has been the subject of extensive research and knowledge in the art.

예를 들면, 아미노산의 히드로패틱(hydropathic) 지수가 고려될 수 있다(Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol . Biol., 157:105-132). 아미노산의 상대적인 히드로패틱 특성이 결과물인 단백질의 2차 구조에 기여하게 되며, 이는 다시 상기 단백질과 다른 분자와의 상호작용을 정의한다. 각각의 아미노산은 그 소수성 및 전하 특성에 기초하여 히드로패틱 지수가 할당되어 있으며(Kyte & Doolittle, 1982), 이들은 다음과 같다: 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 보존적 치환을 함에 있어서, 그 히드로패틱 지수가 ±2 이내인 아미노산을 사용하는 것이 바람직하고, ±1 이내가 더욱 바람직하며, ±0.5 이내가 훨씬 더 바람직하다.For example, the hydropathic index of amino acids can be considered (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol . Biol ., 157: 105-132). The relative hydropathic properties of the amino acids contribute to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the interaction of the protein with other molecules. Each amino acid is assigned a hydropathic index based on its hydrophobicity and charge properties (Kyte & Doolittle, 1982), which are as follows: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cystine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamic acid (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartic acid (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5). In making conservative substitutions, it is preferred to use amino acids whose hydropathic index is within ± 2, more preferably within ± 1, even more preferably within ± 0.5.

아미노산 치환은 또한 아미노산 잔기의 친수성을 고려할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제4,554,101호). 친수성 값은 아미노산 잔기에 대해 할당되어 있다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르트산(+3.0); 글루탐산(+3.0); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 .+-.1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산을 유사한 친수성의 다른 것들로 교체하는 것이 바람직하지만, 필수적인 것은 아니다.Amino acid substitutions may also take into account the hydrophilicity of amino acid residues (eg, US Pat. No. 4,554,101). Hydrophilicity values are assigned for amino acid residues: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Aspartic acid (+3.0); Glutamic acid (+3.0); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5. +-. 1); Alanine (-0.5); Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4). It is desirable, but not required, to replace amino acids with others of similar hydrophilicity.

다른 고려사항으로는 아미노산 측쇄의 크기를 포함한다. 예를 들면, 글리신 또는 세린과 같은 조밀한 측쇄를 갖는 아미노산을 예컨대 트립토판, 티로신과 같은 커다란 측쇄를 갖는 아미노산으로 교체하는 것은 일반적으로 바람직하지 않을 것이다. 단백질 2차 구조에 대한 다양한 아미노산 잔기의 영향도 고려사항이다. 경험적인 연구를 통해, 단백질 도메인이 알파-나선, 베타-시트 또는 리버스 턴(reverse turn) 2차 구조를 채택하는 경향에 대해 상이한 아미노산 잔기가 미치는 영향이 측정되어 왔고, 본 기술분야에 알려져 있다(예컨대, Chou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245; 1978, Ann . Rev . Biochem., 47:251-276; 1979, Biophys . J., 26:367-384 참조).Other considerations include the size of the amino acid side chains. For example, it would generally be undesirable to replace amino acids with dense side chains such as glycine or serine with amino acids with large side chains such as tryptophan, tyrosine, for example. The influence of various amino acid residues on the protein secondary structure is also a consideration. Empirical studies have determined the effect of different amino acid residues on the tendency of protein domains to adopt alpha-helix, beta-sheet or reverse turn secondary structures and are known in the art ( For example, Chou & Fasman, 1974, Biochemistry , 13: see 367-384): J, 26 1979, Biophys:;; 251-276. 222-245 1978, Ann Rev Biochem, 47.....

이러한 고려사항 및 광범위한 경험적 연구에 기초하여, 보존적 아미노산 치환의 표가 만들어져 왔고, 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 아르기닌 및 리신; 글루탐산 및 아스파르트산; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 루이신 및 이소루이신이다. 다른 한편으로, Ala(A) leu, ile, val; Arg(R) gln, asn, lys; Asn(N) his, asp, lys, arg, gln; Asp(D) asn, glu; Cys(C) ala, ser; Gln(Q) glu, asn; Glu(E) gln, asp; Gly(G) ala; His(H) asn, gln, lys, arg; Ile(I) val, met, ala, phe, leu; Leu(L) val, met, ala, phe, ile; Lys(K) gln, asn, arg; Met(M) phe, ile, leu; Phe(F) leu, val, ile, ala, tyr; Pro(P) ala; Ser(S), thr; Thr(T) ser; Trp(W) phe, tyr; Tyr(Y) trp, phe, thr, ser; Val(V) ile, leu, met, phe, ala 이다.Based on these considerations and extensive empirical studies, tables of conservative amino acid substitutions have been made and are known in the art. For example arginine and lysine; Glutamic acid and aspartic acid; Serine and threonine; Glutamine and asparagine; And valine, leucine and isoleucine. On the other hand, Ala (A) leu, ile, val; Arg (R) gln, asn, lys; Asn (N) his, asp, lys, arg, gln; Asp (D) asn, glu; Cys (C) ala, ser; Gln (Q) glu, asn; Glu (E) gln, asp; Gly (G) ala; His (H) asn, gln, lys, arg; Ile (I) val, met, ala, phe, leu; Leu (L) val, met, ala, phe, ile; Lys (K) gln, asn, arg; Met (M) phe, ile, leu; Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr; Pro (P) ala; Ser (S), thr; Thr (T) ser; Trp (W) phe, tyr; Tyr (Y) trp, phe, thr, ser; Val (V) ile, leu, met, phe, ala.

아미노산 치환에 대한 다른 고려사항은 그 잔기가 단백질의 내부에 위치해 있는지, 또는 용매에 노출되어 있는지 여부를 포함한다. CDR 잔기의 경우, 자유 항체 내의 잔기는 보통 용매에 노출되어 있을 것으로 추측될 것이다. 내부의 잔기의 경우, 보존적 치환은 다음을 포함할 것이다: Asp 및 Asn; Ser 및 Thr; Ser 및 Ala; Thr 및 Ala; Ala 및 Gly; Ile 및 Val; Val 및 Leu; Leu 및 Ile; Leu 및 Met; Phe 및 Tyr; Tyr 및 Trp(예컨대, rockefeller.edu의 PROWL website 참조). 용매에 노출된 잔기의 경우, 보존적 치환은 다음을 포함할 것이다: Asp 및 Asn; Asp 및 Glu; Glu 및 Gln; Glu 및 Ala; Gly 및 Asn; Ala 및 Pro; Ala 및 Gly; Ala 및 Ser; Ala 및 Lys; Ser 및 Thr; Lys 및 Arg; Val 및 Leu; Leu 및 Ile; Ile 및 Val; Phe 및 Tyr. (Id.). PAM250 점수화 매트릭스, 데이호프(Dayhoff) 매트리스, 그랜탐(Grantham) 매트릭스, 맥라클란(McLachlan) 매트릭스, 둘리틀(Doolittle) 매트릭스, 헤니코프(Henikoff) 매트릭스, 미야타(Miyata) 매트릭스, 피치(Fitch) 매트릭스, 존스(Jones) 매트릭스, 라오(Rao) 매트릭스, 레빈(Levin) 매트릭스 및 리슬러(Risler) 매트릭스 (Idem.)와 같은 아미노산 치환의 선택을 돕기 위한 다양한 매트릭스가 구축되어 왔다.Other considerations for amino acid substitutions include whether the residue is located inside the protein or exposed to a solvent. In the case of CDR residues, it will be assumed that the residues in the free antibody are usually exposed to the solvent. For internal residues, conservative substitutions will include: Asp and Asn; Ser and Thr; Ser and Ala; Thr and Ala; Ala and Gly; Ile and Val; Val and Leu; Leu and Ile; Leu and Met; Phe and Tyr; Tyr and Trp (see, eg, the PROWL website at rockefeller.edu). For residues exposed to a solvent, conservative substitutions will include: Asp and Asn; Asp and Glu; Glu and Gln; Glu and Ala; Gly and Asn; Ala and Pro; Ala and Gly; Ala and Ser; Ala and Lys; Ser and Thr; Lys and Arg; Val and Leu; Leu and Ile; Ile and Val; Phe and Tyr. (Id.). PAM250 scoring matrix, Dayhoff mattress, Grantham matrix, McLachlan matrix, Doolittle matrix, Henikoff matrix, Miyata matrix, Fitch matrix, Various matrices have been constructed to assist in the selection of amino acid substitutions such as the Jones matrix, Rao matrix, Levin matrix and Risler matrix (Idem.).

아미노산 치환을 결정함에 있어서, 양으로 대전된 잔기(예컨대, His, Arg, Lys)와 음으로 대전된 잔기(예컨대, Asp, Glu) 사이의 이온 결합(염 가교) 또는 인접한 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합의 형성과 같은 분자간 또는 분자내 결합의 존재를 고려할 수 있다.In determining amino acid substitutions, ionic bonds (salt bridges) between positively charged residues (eg His, Arg, Lys) and negatively charged residues (eg Asp, Glu) or disulfide bonds between adjacent cysteine residues The presence of intermolecular or intramolecular bonds can be considered, such as the formation of a.

키메라chimera , 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 단일클론 항체의 제조Of monoclonal antibodies comprising human, humanized or human antibodies

사실상 모든 표적 항원에 대한 단일클론 항체의 제조 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975), 및 Coligan et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL.1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) 참조. 간략히, 단일클론 항체는 마우스에 항원을 포함하는 조성물을 주사하는 단계, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻는 단계, 상기 B-림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마(hybridoma)를 생성하는 단계, 상기 하이브리도마를 클로닝하는 단계; 상기 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론을 선별하는 단계, 상기 항원에 대한 항체를 생성하는 클론을 배양하는 단계; 및 상기 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리하는 단계에 의해 얻어질 수 있다.Techniques for producing monoclonal antibodies against virtually all target antigens are well known in the art. See, for example, Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), and Coligan et al., (Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN See IMMUNOLOGY , VOL.1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991). Briefly, a monoclonal antibody comprises injecting a composition comprising an antigen into a mouse, removing the spleen to obtain B-lymphocytes, fusing the B-lymphocytes with myeloma cells to produce hybridomas, Cloning the hybridoma; Selecting positive clones that produce antibodies to the antigen, culturing the clones that produce antibodies to the antigen; And isolating the antibody from the hybridoma culture.

MAb는 잘 확립된 다양한 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 단리 및 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술은 단백질-A 세파로즈를 갖는 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들면, Coligan, pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3 참조. 또한, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL.10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조.MAbs can be isolated and purified from hybridoma cultures by a variety of well established techniques. Such isolation techniques include affinity chromatography with Protein-A Sepharose, size-exclusion chromatography, ion-exchange chromatography. See, eg, Coligan, pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3. In addition, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS See IN MOLECULAR BIOLOGY , VOL . 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

상기 면역원에 대한 처음의 항체가 발생된 후, 상기 항체는 서열분석되고, 이어서 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 설치류 항체 및 항체 단편의 인간화 또는 키메라화는 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 인간화 단일클론 항체는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변부 유래의 마우스 상보성 결정 영역을 인간 가변 도메인으로 전달하고, 이후 상기 설치류 상대물(counterpart)의 골격 영역 내의 인간 잔기를 치환함으로써 제조된다. 인간화 단일클론 항체로부터 유래된 항체 성분을 사용하면 설치류 불변 영역의 면역원성과 관련되는 잠재적인 문제점들이 제거된다.After the first antibody against the immunogen has been generated, the antibody can be sequenced and then produced by recombinant technology. Humanization or chimerization of rodent antibodies and antibody fragments is well known to those skilled in the art. For example, humanized monoclonal antibodies are prepared by transferring mouse complementarity determining regions from the heavy and light chain variable regions of mouse immunoglobulin to human variable domains and then substituting human residues within the framework regions of the rodent counterpart. do. The use of antibody components derived from humanized monoclonal antibodies eliminates potential problems associated with immunogenicity of rodent constant regions.

키메라chimera 항체 Antibodies

키메라 항체는 인간 항체의 가변 영역이 예를 들면 마우스 항체의 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하는 마우스 항체의 가변 영역으로 교체된 재조합 단백질이다. 키메라 항체는 대상에게 투여될 때 감소된 면역원성과 증가된 안정성을 나타낸다. 설치류 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하는 일반적인 기술은 예를 들면 올랜디 등의 문헌(Orlandi et al., Proc . Nat . Acad . Sci . USA 86:3833 (1989))에 개시되어 있다. 키메라 항체를 구축하는 기술은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 한 예로서, 렁 등은 항-CD22 단일클론 항체인 설치류 LL2의 Vκ 및 VH 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 해당 인간 K 및 IgG1 불변 영역 도메인과 조합함으로서 LL2 키메라를 제조하였다(Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)).Chimeric antibodies are recombinant proteins in which the variable region of a human antibody has been replaced with the variable region of a mouse antibody, including, for example, the complementarity-determining region (CDR) of a mouse antibody. Chimeric antibodies exhibit reduced immunogenicity and increased stability when administered to a subject. General techniques for cloning rodent immunoglobulin variable domains are disclosed, for example, in Orlandi et al., Proc . Nat . Acad . Sci . USA 86: 3833 (1989). Techniques for constructing chimeric antibodies are well known to those skilled in the art. As an example, Rung et al. Prepared LL2 chimeras by combining the DNA sequences encoding the V κ and V H domains of rodent LL2, an anti-CD22 monoclonal antibody, with the corresponding human K and IgG1 constant region domains (Leung et al. , Hybridoma 13: 469 (1994)).

인간화 항체Humanized antibody

인간화 MAb의 제조 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, Jones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Carter et al., Proc . Nat . Acad . ScL USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit . Rev . Biotech. 12:437 (1992), 및 Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993) 참조). 키메라 또는 설치류 단일클론 항체는 상기 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변부의 마우스 CDR을 대응하는 인간 항체의 가변 도메인에 전달함으로써 인간화될 수 있다. 또한, 상기 키메라 단일클론 항체 내의 마우스 골격 영역(FR)은 인간 FR 서열로 교체된다. 마우스 CDR을 인간 FR 내로 단순히 전달하면 종종 항체 친화도가 감소하거나 심지어 상실되기 때문에, 설치류 항체의 본래 친화도를 회복하기 위하여 추가적인 변형이 필요할 수 있다. 이것은 그 에피토프에 대한 양호한 결합 친화도를 갖는 항체를 얻기 위하여 FR 영역 내의 하나 이상의 일부 인간 잔기를 그 설치류 상대물로 교체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991) 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988) 참조. 또한, 표적에 대한 인간화 항체의 친화도는 상기 CDR 서열을 선별적으로 변형시킴으로써 증가될 수 있다(WO00/29584A1).Techniques for making humanized MAbs are well known in the art (eg, Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al , Proc Nat Acad ScL USA 89:.... 4285 (1992), Sandhu, Crit Rev Biotech 12:.... 437 (1992), and Singer et al, J. Immun. 150: 2844 (1993). Chimeric or rodent monoclonal antibodies can be humanized by delivering the mouse CDRs of the heavy and light chain variable regions of the mouse immunoglobulin to the variable domains of the corresponding human antibodies. In addition, the mouse framework regions (FR) in the chimeric monoclonal antibodies are replaced with human FR sequences. Because simply delivering mouse CDRs into the human FR often results in decreased or even lost antibody affinity, additional modifications may be necessary to restore the original affinity of rodent antibodies. This can be accomplished by replacing one or more some human residues in the FR region with their rodent counterparts to obtain an antibody with good binding affinity for that epitope. See, eg, Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1991) and Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988). In addition, the affinity of the humanized antibody for the target can be increased by selectively modifying the CDR sequences (WO00 / 29584A1).

인간 항체Human antibody

조합 접근법 또는 인간 면역굴로불린 좌(loci)로 형질전환된 유전자변형 동물(transgenic animal)을 이용한 완전한 인간 항체의 제조 방법은 본 기술분야에 알려져 있다(예컨대, Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb . Chem . High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke and Loset, 2003, Curr . Opin . Pharmacol. 3:544-50). 또한, 완전한 인간 항체는 유전자 또는 염색체 전달감염(transfection) 방법 뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술(phage display technology)에 의해 구축될 수 있으며, 이들 모두는 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) 참조. 이러한 완전한 인간 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체보다 훨씬 적은 부작용을 나타내고, 본질적으로 내인성(endogenous) 인간 항체인 것처럼 생체내에서 기능을 할 것으로 예상된다. 어떤 구현예에서, 특허청구범위의 방법 및 절차들은 이러한 기술에 의해 제조된 인간 항체를 이용할 수 있다.Methods for the production of fully human antibodies using a combination approach or transgenic animals transformed with human immunoglobulin loci are known in the art (eg, Mancini et al., 2004, New). Microbiol . 27: 315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb . Chem . High Throughput Screen . 8: 117-26; Brekke and Loset, 2003, Curr . Opin . Pharmacol . 3: 544-50). In addition, fully human antibodies can be constructed by phage display technology as well as by gene or chromosomal transfection methods, all of which are known in the art. See, eg, McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990). Such fully human antibodies have much fewer side effects than chimeric, humanized or human antibodies and are expected to function in vivo as if they were essentially endogenous human antibodies. In certain embodiments, the methods and procedures of the claims can utilize human antibodies prepared by such techniques.

다른 한편으로, 상기 파지 디스플레이 기술은 인간 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet . Mol . Res. 4:126-40). 인간 항체는 정상 인간 또는 암과 같은 특정한 질환 상태를 나타내는 인간으로부터 생성될 수 있다(Dantas-Barbosa et al., 2005). 질환을 갖는 개인으로부터 인간 항체를 구축하는 것의 이점은 순환하는 항체 레퍼토리(repertoire)가 질환과 관련된 항원에 대한 항체 쪽으로 편향될 수 있다는 것이다.On the other hand, the phage display technique can be used to generate human antibodies (eg, Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet . Mol . Res . 4: 126-40). Human antibodies can be generated from normal humans or from humans exhibiting certain disease states such as cancer (Dantas-Barbosa et al., 2005). An advantage of building human antibodies from a diseased individual is that circulating antibody repertoire can be biased towards antibodies against antigens associated with the disease.

상기 방법론의 비제한적인 한 예로서, 단타스-바르보사 등은 골육종 환자로부터 인간 Fab 항체 단편의 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다(Dantas-Barbosa et al. (2005)). 일반적으로, 순환하는 혈액 림프구(Id.)로부터 총 RNA를 얻었다. 재조합 Fab는 μ, γ 및 κ 쇄 항체 레퍼토리로부터 클로닝되었고, 파지 디스플레이 라이브러리(Id.) 내로 삽입되었다. RNA는 cDNA로 변환되었고, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 Fab cDNA 라이브러리를 만들기 위해 사용되었다(Marks et al., 1991, J. Mol . Biol. 222:581-97). 라이브러리의 구축은 안드리스-위드호프 등에 따라 수행되었다(Andris-Widhopf et al. (2000), In: Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1st edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9.1 to 9.22). 최종 Fab 단편은 재조합 엔도뉴클레아제로 소화시키고, 박테리오파지 게놈 내로 삽입시켜 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하였다. 이러한 라이브러리는 본 기술분야에 알려진 것과 같은 표준 파지 디스플레이 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있으며, 이의 리뷰를 위해서는 예컨대 존슨 및 키스웰을 참조한다(Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)). 또한, 인간 항체는 시험관내에서 활성화된 B-세포에 의해 생성될 수 있다. 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조. 숙련된 당업자는 이러한 기술이 예시적인 것이고, 인간 항체 또는 항체 단편을 제조 및 스크리닝하기 위한 임의의 공지된 방법들이 사용될 수 있음을 인식할 것이다.As one non-limiting example of the methodology, Dantas-Barbosa et al. Constructed a phage display library of human Fab antibody fragments from osteosarcoma patients (Dantas-Barbosa et al. (2005)). In general, total RNA was obtained from circulating blood lymphocytes ( Id ). Recombinant Fabs were cloned from μ, γ and κ chain antibody repertoires and inserted into phage display libraries ( Id ). RNA was converted to cDNA and used to make Fab cDNA libraries using primers specific for heavy and light chain immunoglobulin sequences (Marks et al., 1991, J. Mol . Biol . 222: 581-97). The construction of the library was performed according to Andris-Widhopf et al. (2000), In: Phage Display Laboratory Manual , Barbas et al. (eds), 1 st edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9.1 to 9.22). Final Fab fragments were digested with recombinant endonucleases and inserted into the bacteriophage genome to prepare phage display libraries. Such libraries can be screened by standard phage display methods such as known in the art. Phage display can be performed in a variety of formats, see for example Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3: 5564-571 (1993)). Human antibodies can also be produced by activated B-cells in vitro. See US Pat. Nos. 5,567,610 and 5,229,275, each of which is incorporated by reference in its part. Those skilled in the art will recognize that such techniques are exemplary and any known method for preparing and screening human antibodies or antibody fragments may be used.

다른 한편으로, 인간 항체를 생성하기 위해 유전공학적으로 가공된 유전자변형 동물이 표준 면역화 프로토콜을 이용하여 본질적으로 임의의 면역원 표적에 대한 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 유전자변형 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은 그린 등의 문헌에 개시되어 있다(Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) 및 Taylor et al., Int . Immun. 6:579 (1994)). 이러한 시스템의 비제한적인 예는 Abgenix(Fremont, CA)의 XonoMouse®(예컨대, 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Green et al., 1999, J. Immunol . Methods 231:11-23)이다. 상기 XenoMouse® 및 유사한 동물에서, 마우스 항체 유전자는 불활성화되고 기능적인 인간 항체 유전자로 교체되었으며, 나머지 마우스 면역 시스템은 그대로 남아 있다.On the other hand, genetically engineered transgenic animals to produce human antibodies can be used to generate antibodies against essentially any immunogen target using standard immunization protocols. Methods for obtaining human antibodies from transgenic mice are disclosed in Green et al., Green et al., Nature Genet . 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994) and Taylor et al., Int . Immun . 6: 579 (1994)). A non-limiting example of such a system is XonoMouse® from Abgenix (Fremont, CA) (eg, Green et al., 1999, J. Immunol . Methods 231: 11-23, incorporated herein by reference). In the XenoMouse® and similar animals, mouse antibody genes were inactivated and replaced with functional human antibody genes and the remaining mouse immune system remained intact.

상기 XenoMouse®은 가변 영역 서열의 대부분을 포함하는 인간 IgH 및 Igkappa 좌 부분과 함께 부대 유전자(accessory gene) 및 조절 서열을 함유하는 생식계열-구성의(germline-configured) YAC(yeast artificial chromosome)으로 형질전환되었다. 상기 인간 가변 영역 레퍼토리는 공지된 기술에 의해 하이브리도마로 가공될 수 있는 항체를 생산하는 B-세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 표적 항원으로 면역화된 XonoMouse®는 보통의 면역 반응에 의해 인간 항체를 생산할 것이며, 이는 전술한 표준 기술에 의해 수확 및/또는 생산될 수 있다. 다양한 스트레인(strain)의 XenoMouse®가 이용가능하며, 이들 각각은 상이한 클래스의 항체를 생산할 수 있다. 유전자변형적으로 생산된 인간 항체는 정상 인간 항체의 약물동태학적(pharmacokinetic) 특성을 유지하면서 치료학적 잠재성을 갖는 것으로 나타나 있다(Green et al., 1999). 숙련된 당업자는 특허청구범위의 조성물 및 방법은 상기 XenoMouse® 시스템을 사용하는 것에 한정되지 않으며, 인간 항체를 생산하기 위해 유전공학적으로 가공된 임의의 유전자변형 동물을 사용할 수 있음을 인식할 것이다.The XenoMouse® is transfected with a germline-configured yeast artificial chromosome (YAC) containing an accessory gene and a regulatory sequence with human IgH and Igkappa loci comprising most of the variable region sequences. Switched The human variable region repertoire can be used to generate B-cells that produce antibodies that can be processed into hybridomas by known techniques. XonoMouse® immunized with the target antigen will produce human antibodies by a normal immune response, which can be harvested and / or produced by the standard techniques described above. A variety of strains of XenoMouse® are available, each of which can produce a different class of antibodies. Genetically produced human antibodies have been shown to have therapeutic potential while maintaining the pharmacokinetic properties of normal human antibodies (Green et al., 1999). Those skilled in the art will recognize that the compositions and methods of the claims are not limited to using the XenoMouse® system, and that any genetically engineered animal can be used to produce human antibodies.

항체 단편의 제조Preparation of Antibody Fragments

특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편은 F(ab')2, Fab', F(ab)2, Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 항원 결합 부위이다. F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 소화시킴으로써 제조될 수 있고, Fab' 단편은 상기 F(ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있다. 다른 한편으로, 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab' 단편을 빠르고 쉽게 동정할 수 있도록 하기 위하여 Fab' 발현 라이브러리가 구축될 수 있다(Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281).Antibody fragments that recognize specific epitopes can be generated by known techniques. The antibody fragment is an antigen binding site of an antibody such as F (ab ') 2 , Fab', F (ab) 2 , Fab, Fv, scFv and the like. F (ab ') 2 fragments can be prepared by digesting the antibody molecule with pepsin, and Fab' fragments can be produced by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragment. On the other hand, Fab 'expression libraries can be constructed to enable quick and easy identification of monoclonal Fab' fragments with the desired specificity (Huse et al., 1989, Science , 246: 1274-1281).

단일쇄 Fv 분자(scFv)는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. 상기 VL 및 VH 도메인은 표적 결합 부위를 형성하기 위해 결합한다. 상기 두 개의 도메인은 추가로 펩티드 링커(L)에 의해 공유결합된다. scFv 분자를 제조하고 적합한 펩티드 링크를 디자인하는 방법은 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 하기 문헌들에 개시되어 있다: 미국 특허 제4,704,692호, 미국 특허 제4,946,778호, R. Raag and M. Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB Vol 9:73-80 (1995) and R.E. Bird and B.W. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions," TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991).Single chain Fv molecules (scFv) comprise a VL domain and a VH domain. The VL and VH domains bind to form a target binding site. The two domains are further covalently linked by a peptide linker (L). Methods for preparing scFv molecules and designing suitable peptide links are disclosed in the following documents, which are incorporated herein by reference: US Pat. No. 4,704,692, US Pat. No. 4,946,778, R. Raag and M. Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB Vol 9: 73-80 (1995) and R.E. Bird and B.W. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions," TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991).

항체 단편은 전장 항체를 단백질 가수분해시키거나, 대장균 또는 다른 숙주에서 상기 단편을 코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 항체 단편은 종래의 방법에 의해 전장 항체를 펩신 또는 파파인 소화시킴으로써 얻어질 수 있다. 예를 들면, 파파인을 이용하여 효소적으로 절단시키면 2개의 1가 Fab 단편과 Fc 단편이 생성된다. 상기 방법은 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 특허인 골든베러그에 의한 미국 특허 제4,036,945호 및 제4,331,647호와 그것에 포함되어 있는 인용문헌들에 개시되어 있다. 또한, 하기 문서들 참조: Nisonoff et al., Arch Biochem . Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem . J. 73:119 (1959), Edelman et al, in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967), and Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10-2.10.4.Antibody fragments can be prepared by proteolytically full length antibodies or by expressing DNA encoding the fragments in E. coli or other hosts. Antibody fragments can be obtained by pepsin or papain digesting full length antibodies by conventional methods. For example, enzymatic cleavage with papain produces two monovalent Fab fragments and an Fc fragment. The method is disclosed in U.S. Patent Nos. 4,036,945 and 4,331,647 and Golden Patents, incorporated by reference to Golden Bearberg, which is incorporated herein by reference. See also the following documents: Nisonoff et al., Arch Biochem . Biophys . 89: 230 (1960); Porter, Biochem . J. 73: 119 (1959), Edelman et al, in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967), and Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10-2.10.4.

양특이성Bispecificity 및 다중특이성 항체 And multispecific antibodies

양특이성 항체는 다수의 생체의학적 적용분야에서 유용하다. 예를 들면, 종양 세포 표면 항원과 T-세포 표면 수용체에 대한 결합 부위를 갖는 양특이성 항체는 T 세포에 의한 특정 종양 세포의 용해를 이끌 수 있다. 신경교종 및 T 세포 상의 CD3 에피토프를 인식하는 양특이성 항체는 인간 환자에서 뇌종양을 치료하는데 성공적으로 사용되어 왔다(Nitta, et al., Lancet 1990; 355:368-371). 종양-관련성 항원(TAA) 또는 다른 질환 표적에 대한 적어도 하나의 결합 부위 뿐만 아니라 치료제 또는 진단제에 접합된 표적가능한 구축물에 대한 한 결합 부위를 포함하는 양특이성 항체를 이용한 전-표적화 방법 또한 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제7,300,644호; 제7,138,103호; 제7,074,405호; 제7,052,872호; 제6,962,702호; 제6,458,933호 참조).Bispecific antibodies are useful in many biomedical applications. For example, bispecific antibodies having binding sites for tumor cell surface antigens and T-cell surface receptors can lead to lysis of certain tumor cells by T cells. Bispecific antibodies that recognize CD3 epitopes on glioma and T cells have been used successfully to treat brain tumors in human patients (Nitta, et al., Lancet 1990; 355: 368-371). Methods of pre-targeting with bispecific antibodies comprising at least one binding site for a tumor-associated antigen (TAA) or other disease target as well as one binding site for a targetable construct conjugated to a therapeutic or diagnostic agent are also described herein. Well known in the art (e.g., U.S. Pat. .

임의의 공지된 항-TAA 항체의 항원-결합 가변 영역 서열을 포함하는 양특이성 항체는 각각의 인용된 특허 또는 출원의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 hPAM4(미국 특허 제7,282,567호), hA20(미국 특허 제7,251,164호), hA19(미국 특허 제7,109,304호), hIMMMU31(미국 특허 제7,300,655호), hLL1(미국 특허 제7,312,318호), hLL2(미국 특허 제7,074,403호), hMu-9(미국 특허 제7,387,773호), hL243(미국 특허 출원 제11/368,296호), hMN-14(미국 특허 제6,676,924호), hRS7(미국 특허 제7,238,785호), hMN-3(미국 특허 출원 제10/672,278호) 및 hR1(2009년 1월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/145,896호)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 곳에 사용될 수 있다.Bispecific antibodies comprising the antigen-binding variable region sequences of any known anti-TAA antibodies may be prepared by hPAM4 (US Pat. No. 7,282,567), which is incorporated by reference in the Examples portion of each cited patent or application. ), hA20 (US Pat. No. 7,251,164), hA19 (US Pat. No. 7,109,304), hIMMMU31 (US Pat. No. 7,300,655), hLL1 (US Pat. No. 7,312,318), hLL2 (US Pat. No. 7,074,403), hMu-9 (US Pat. No. 7,387,773), hL243 (US Patent Application No. 11 / 368,296), hMN-14 (US Patent No. 6,676,924), hRS7 (US Patent No. 7,238,785), hMN-3 (US Patent Application No. 10 / 672,278) and hR1 (US Provisional Patent Application 61 / 145,896, filed Jan. 20, 2009).

다른 용도의 항체는 매우 다양한 알려진 공급원으로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 다양한 항체를 분비하는 하이브리도마 주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 이용가능하다. 종양-관련 항원을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다양한 질환 표적에 대한 많은 수의 항체는 상기 ATCC에 기탁되어 있거나 및/또는 가변 영역 서열이 공개되어 있으며, 특허청구범위의 방법 및 조성물에서 이용할 수 있다. 예컨대, 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 하기 문헌들 참조: 미국 특허 제7,312,318호; 제7,282,567호; 제7,151,164호; 제7,074,403호; 제7,060,802호; 제7,056,509호; 제7,049,060호; 제7,045,132호; 제7,041,803호; 제7,041,802호; 제7,041,293호; 제7,038,018호; 제7,037,498호; 제7,012,133호; 제7,001,598호; 제6,998,468호; 제6,994,976호; 제6,994,852호; 제6,989,241호; 제6,974,863호; 제6,965,018호; 제6,964,854호; 제6,962,981호; 제6,962,813호; 제6,956,107호; 제6,951,924호; 제6,949,244호; 제6,946,129호; 제6,943,020호; 제6,939,547호; 제6,921,645호; 제6,921,645호; 제6,921,533호; 제6,919,433호; 제6,919,078호; 제6,916,475호; 제6,905,681호; 제6,899,879호; 제6,893,625호; 제6,887,468호; 제6,887,466호; 제6,884,594호; 제6,881,405호; 제6,878,812호; 제6,875,580호; 제6,872,568호; 제6,867,006호; 제6,864,062호; 제6,861,511호; 제6,861,227호; 제6,861,226호; 제6,838,282호; 제6,835,549호; 제6,835,370호; 제6,824,780호; 제6,824,778호; 제6,812,206호; 제6,793,924호; 제6,783,758호; 제6,770,450호; 제6,767,711호; 제6,764,688호; 제6,764,681호; 제6,764,679호; 제6,743,898호; 제6,733,981호; 제6,730,307호; 제6,720,15호; 제6,716,966호; 제6,709,653호; 제6,693,176호; 제6,692,908호; 제6,689,607호; 제6,689,362호; 제6,689,355호; 제6,682,737호; 제6,682,736호; 제6,682,734호; 제6,673,344호; 제6,653,104호; 제6,652,852호; 제6,635,482호; 제6,630,144호; 제6,610,833호; 제6,610,294호; 제6,605,441호; 제6,605,279호; 제6,596,852호; 제6,592,868호; 제6,576,745호; 제6,572;856호; 제6,566,076호; 제6,562,618호; 제6,545,130호; 제6,544,749호; 제6,534,058호; 제6,528,625호; 제6,528,269호; 제6,521,227호; 제6,518,404호; 제6,511,665호; 제6,491,915호; 제6,488,930호; 제6,482,598호; 제6,482,408호; 제6,479,247호; 제6,468,531호; 제6,468,529호; 제6,465,173호; 제6,461,823호; 제6,458,356호; 제6,455,044호; 제6,455,040호; 제6,451,310호; 제6,444,206호; 제6,441,143호; 제6,432,404호; 제6,432,402호; 제6,419,928호; 제6,413,726호; 제6,406,694호; 제6,403,770호; 제6,403,091호; 제6,395,276호; 제6,395,274호; 제6,387,350호; 제6,383,759호; 제6,383,484호; 제6,376,654호; 제6,372,215호; 제6,359,126호; 제6,355,481호; 제6,355,444호; 제6,355,245호; 제6,355,244호; 제6,346,246호; 제6,344,198호; 제6,340,571호; 제6,340,459호; 제6,331,175호; 제6,306,393호; 제6,254,868호; 제6,187,287호; 제6,183,744호; 제6,129,914호; 제6,120,767호; 제6,096,289호; 제6,077,499호; 제5,922,302호; 제5,874,540호; 제5,814,440호; 제5,798,229호; 제5,789,554호; 제5,776,456호; 제5,736,119호; 제5,716,595호; 제5,677,136호; 제5,587,459호; 제5,443,953호; 및 제5,525,338호. 이들은 단지 예시적인 것으로서, 매우 다양한 다른 항체 및 그 하이브리도마가 본 기술분야에 알려져 있다. 숙련된 당업자는 거의 모든 질환-관련 항원에 대한 항체 서열 또는 항체-분비 하이브리도마는 선택된 관심있는 질환-관련 표적에 대한 항체에 대한 ATCC, NCBI 및/또는 USPTO 데이터베이스를 간단히 검색함으로서 얻어질 수 있음을 인식할 것이다. 상기 클로닝된 항체의 항원 결합 도메인은 본 기술분야에 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 발현 벡터 내로 증폭, 절단, 라이게이션(ligation)되고, 순응된(adapted) 숙주 세포 내로 전달감염되며, 단백질 생산에 사용될 수 있다.Antibodies for other uses can be obtained commercially from a wide variety of known sources. For example, hybridoma strains that secrete various antibodies are available from the American Type Culture Collection, Manassas, VA. A large number of antibodies against various disease targets, including but not limited to tumor-associated antigens, have been deposited with the ATCC and / or have disclosed variable region sequences and can be used in the methods and compositions of the claims. . See, for example, the following documents, each of which is incorporated by reference in its part: US Pat. No. 7,312,318; No. 7,282,567; No. 7,151,164; 7,074,403; 7,074,403; 7,060,802; 7,060,802; 7,056,509; 7,056,509; 7,049,060; 7,049,060; 7,045,132; 7,045,132; 7,041,803; 7,041,803; 7,041,802; 7,041,802; 7,041,293; 7,041,293; 7,038,018; 7,038,018; 7,037,498; 7,012,133; 7,012,133; No. 7,001,598; 6,998,468; No. 6,994,976; 6,994,852; 6,994,852; No. 6,989,241; 6,974,863; 6,974,863; 6,965,018; 6,965,018; No. 6,964,854; 6,962,981; 6,962,981; No. 6,962,813; 6,956,107; 6,956,107; No. 6,951,924; No. 6,949,244; 6,946,129; 6,946,129; 6,943,020; 6,943,020; 6,939,547; 6,939,547; 6,921,645; 6,921,645; 6,921,645; 6,921,645; No. 6,921,533; No. 6,919,433; No. 6,919,078; 6,916,475; 6,916,475; 6,905,681; 6,905,681; 6,899,879; 6,899,879; 6,893,625; 6,893,625; 6,887,468; 6,887,468; 6,887,466; 6,887,466; No. 6,884,594; No. 6,881,405; 6,878,812; 6,878,812; 6,875,580; 6,875,580; 6,872,568; 6,872,568; No. 6,867,006; 6,864,062; 6,864,062; 6,861,511; 6,861,511; 6,861,227; 6,861,227; 6,861,226; 6,838,282; 6,838,282; No. 6,835,549; No. 6,835,370; No. 6,824,780; No. 6,824,778; 6,812,206; 6,812,206; No. 6,793,924; 6,783,758; 6,783,758; 6,770,450; 6,770,450; No. 6,767,711; No. 6,764,688; No. 6,764,681; No. 6,764,679; 6,743,898; 6,743,898; 6,733,981; 6,733,981; No. 6,730,307; 6,720,15; 6,720,15; 6,716,966; 6,716,966; 6,709,653; 6,709,653; No. 6,693,176; No. 6,692,908; 6,689,607; 6,689,607; No. 6,689,362; No. 6,689,355; No. 6,682,737; 6,682,736; 6,682,736; No. 6,682,734; No. 6,673,344; 6,653,104; 6,653,104; 6,652,852; 6,652,852; No. 6,635,482; No. 6,630,144; 6,610,833; 6,610,833; No. 6,610,294; 6,605,441; 6,605,441; No. 6,605,279; No. 6,596,852; 6,592,868; 6,592,868; No. 6,576,745; 6,572; 856; No. 6,566,076; 6,562,618; 6,562,618; No. 6,545,130; 6,544,749; 6,544,749; No. 6,534,058; No. 6,528,625; No. 6,528,269; 6,521,227; 6,521,227; 6,518,404; 6,518,404; 6,511,665; 6,511,665; No. 6,491,915; No. 6,488,930; 6,482,598; 6,482,598; 6,482,408; 6,482,408; No. 6,479,247; 6,468,531; 6,468,531; No. 6,468,529; No. 6,465,173; No. 6,461,823; 6,458,356; 6,458,356; No. 6,455,044; No. 6,455,040; 6,451,310; 6,451,310; 6,444,206; 6,444,206; No. 6,441,143; 6,432,404; 6,432,404; 6,432,402; 6,432,402; 6,419,928; 6,419,928; 6,413,726; 6,413,726; No. 6,406,694; 6,403,770; 6,403,770; 6,403,091; 6,403,091; 6,395,276; 6,395,276; No. 6,395,274; No. 6,387,350; No. 6,383,759; No. 6,383,484; 6,376,654; 6,376,654; 6,372,215; 6,372,215; 6,359,126; 6,359,126; 6,355,481; 6,355,481; No. 6,355,444; 6,355,245; 6,355,245; 6,355,244; 6,355,244; 6,346,246; 6,346,246; No. 6,344,198; 6,340,571; 6,340,571; 6,340,459; 6,340,459; No. 6,331,175; No. 6,306,393; 6,254,868; 6,254,868; No. 6,187,287; No. 6,183,744; 6,129,914; 6,129,914; No. 6,120,767; No. 6,096,289; 6,077,499; 6,077,499; 5,922,302; 5,922,302; 5,874,540; 5,874,540; 5,814,440; 5,814,440; No. 5,798,229; 5,789,554; 5,789,554; 5,776,456; 5,776,456; 5,736,119; 5,736,119; 5,716,595; 5,716,595; 5,677,136; 5,677,136; 5,587,459; 5,587,459; 5,443,953; 5,443,953; And 5,525,338. These are merely exemplary, and a wide variety of other antibodies and their hybridomas are known in the art. One skilled in the art can obtain antibody sequences or antibody-secreting hybridomas for almost all disease-related antigens by simply searching the ATCC, NCBI and / or USPTO databases for antibodies to selected disease-related targets of interest. Will recognize. The antigen binding domain of the cloned antibody is amplified, cleaved, ligation into the expression vector, transfected into adapted host cells using standard techniques well known in the art and used for protein production. Can be.

예를 들면, 그 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 2004년 1월 11일자로 출원된 미국 특허 출원 공개 제2005/0002945호에 개시되어 있는 것과 같은 양특이성 또는 다중특이성 항체를 제조하는 많은 방법이 알려져 있다. 양특이성 항체는 각각 상이한 항원 부위를 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 두 가지 상이한 하이브리도마의 융합을 포함하는 쿼드로마(quadroma) 방법에 의해 제조될 수 있다(Milstein and Cuello, Nature, 1983; 305:537-540).For example, the preparation of bispecific or multispecific antibodies such as those disclosed in US Patent Application Publication No. 2005/0002945, filed Jan. 11, 2004, the example portion of which is incorporated herein by reference. Many ways are known. Bispecific antibodies can be prepared by the quadroma method, which involves the fusion of two different hybridomas, each producing a monoclonal antibody that recognizes a different antigenic site (Milstein and Cuello, Nature , 1983; 305). (537-540).

또 다른 양특이성 항체의 제조 방법은 두 가지 상이한 단일클론 항체를 화학적으로 묶는 헤테로-양기능성 가교 링커를 이용한다(Staerz, et al., Nature 1985; 314:628-631; Perez, et al., Nature 1985; 316:354-356). 양특이성 항체는 또한 각각의 두 가지 양친 단일클론 항체를 해당 반쪽(half) 분자로 환원시킨 후, 혼합 및 재산화하도록 하여 하이브리드 구조를 얻음으로써 제조될 수 있다(Staerz and Bevan, Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83:1453-1457). 또 다른 방법은 적합한 링커를 이용하여 두 가지 또는 세 가지 별도로 정제된 Fab' 단편을 화학적으로 가교결합시키는 것을 포함한다(예컨대, 유럽 특허 출원 제0453082호 참조).Another method of making bispecific antibodies utilizes hetero-bifunctional bridging linkers that chemically bind two different monoclonal antibodies (Staerz, et al., Nature 1985; 314: 628-631; Perez, et al., Nature 1985; 316: 354-356. Bispecific antibodies can also be prepared by reducing each of the two parental monoclonal antibodies to their corresponding half molecules, followed by mixing and reoxidation to obtain a hybrid structure (Staerz and Bevan, Proc). Natl Acad Sci USA 1986; 83: 1453-1457). Another method involves chemically crosslinking two or three separately purified Fab ′ fragments using a suitable linker (see, eg, European Patent Application No. 0453082).

다른 방법은 레트로바이러스-유래 셔틀 벡터를 통해 독특한 선별 마커(distinct selectable marker)를 해당 양친 하이브리도마 내로 유전자 전달시키고, 이어서 이를 융합시키거나; 또는 하이브리도마 세포주를 상이한 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 함유하는 발현 플라스미드로 전달감염시킴으로서 하이브리드 하이브리도마의 생성 효율을 개선시키는 것을 포함한다.Another method is to gene transfer a unique selectable marker into the corresponding parent hybridoma via a retrovirus-derived shuttle vector and then fuse it; Or by transfecting the hybridoma cell line with expression plasmids containing the heavy and light chain genes of different antibodies to improve the efficiency of production of hybrid hybridomas.

코그니트(cognate) VH 및 VL 도메인은 적합한 조성 및 길이의 펩티드 링커(통상 12개 아미노산 잔기 이상으로 이루어짐)로 결합되어 결합 활성을 갖는 단일쇄 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv의 제조 방법은 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제4,946,778호 및 미국 특허 제5,132,405호에 개시되어 있다. 펩티드 링커의 길이를 12개 아미노산 잔기 이하로 줄이면 동일한 사슬 상에서 VH 및 VL 도메인이 짝을 이루는(pairing) 것을 방지하고, VH 및 VL 도메인이 다른 사슬 상의 상보적 도메인과 짝을 이루는 것을 강제하여 기능성 멀티머가 형성되게 된다. 3 내지 12개 사이의 아미노산 잔기 링커로 결합된 VH 및 VL 도메인의 폴리펩티드 사슬은 우세하게 다이머를 형성한다("디아바디(diabody)"라 함). 0 내지 2개 사이의 아미노산 잔기 링커로는 트리머("트리아바디(triabody)"라 함) 및 테트라머("테트라바디(tetrabody)"라 함)가 선호되지만, 올리고모화의 정확한 패턴은 상기 링커의 길이 이외에도 V-도메인의 조성 뿐만 아니라 그 방향(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH)에도 의존하는 것으로 나타난다.Cognate V H and V L domains can be combined with peptide linkers of the appropriate composition and length, usually consisting of at least 12 amino acid residues, to form single chain Fv (scFv) having binding activity. Methods of making scFv are disclosed in US Pat. No. 4,946,778 and US Pat. No. 5,132,405, each of which is incorporated herein by reference. Reducing the length of the peptide linker to 12 amino acid residues or less prevents the pairing of the V H and V L domains on the same chain and prevents the V H and V L domains from pairing with complementary domains on other chains. The functional multimer is forcibly formed. Polypeptide chains of the V H and V L domains bound with between 3 and 12 amino acid residue linkers predominantly form a dimer (called “diabody”). Trimmers (called "triabody") and tetramers (called "tetrabody") are preferred as linkers of amino acid residues between 0 and 2, but the exact pattern of oligomerization is In addition to the length, it appears to depend not only on the composition of the V-domain but also on its direction (V H -linker-V L or V L -linker-V H ).

이러한 다중특이성 또는 양특이성 항체의 제조 방법은 낮은 수율, 정제의 필요성, 낮은 안정성 또는 기술의 노동집약성의 관점에서 다양한 어려움을 보여준다. 보다 최근에는, "도크와 자물쇠(dock and lock, DNL)"로 알려진 기술이 사실상 모든 원하는 항체, 항체 단편 및 다른 작용기 분자의 조합을 생산하는데 사용되고 있다(예컨대, 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 출원 공개 제2006-0228357호(지금은 미국 특허 제7,550,143호); 제2006-0228300호(지금은 미국 특허 제7,521,056호); 제2007-0086942호(지금은 미국 특허 제7,534,866호); 제2007-0140966호(지금은 미국 특허 제7,527,787호); 제2007-0264265호 및 제2009-0060862호 및 2009년 4월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제12/418,877호 참조). 상기 기술은 서로 결합하여 다이머, 트리머, 테트라머, 퀸타머 및 헥사머 범위의 복합체 구조가 조립되도록 하는 고정(anchoring) 도메인과 다이머화 및 도킹 도메인으로 불리는 상보적 단백질 결합 도메인을 사용한다. 이들은 대규모로 정제할 필요 없이도 높은 수율로 안정한 복합체를 형성한다. 상기 DNL 기술은 네이키드 항체 모이어티로, 또는 면역조절제, 효소, 화학치료제, 케모카인, 사이토카인, 진단제, 치료제, 방사성핵종, 이미지화제, 항-혈관형성제, 성장 인자, 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 펩티드, 독소, 프로-아폽토시스제, 또는 이들의 조합과 같은 넓은 범위의 다른 작용기 분자와의 조합으로 단특이성, 양특이성 또는 다중특이성 항체가 조립되도록 한다. 양특이성 또는 다중특이성 항체의 제조용으로 본 기술분야에 알려져 있는 임의의 기술들이 본 발명의 특허청구범위의 방법을 실행하는데 사용될 수 있다.Methods of preparing such multispecific or bispecific antibodies show a variety of difficulties in view of low yield, the need for purification, low stability or labor intensiveness of the technology. More recently, a technique known as "dock and lock (DNL)" has been used to produce virtually all desired antibodies, antibody fragments, and combinations of other functional groups molecules (e.g., each example portion is incorporated by reference). US Patent Application Publication Nos. 2006-0228357 (now US Patent 7,550,143); 2006-0228300 (now US Patent 7,521,056); 2007-0086942 (now US Patent 7,534,866); 2007-0140966 (now US Patent 7,527,787); 2007-0264265 and 2009-0060862, and US Patent Application No. 12 / 418,877, filed April 8, 2009; Reference). The technique uses complementary protein binding domains, called anchoring domains and dimerization and docking domains, which bind to each other and allow complex structures in the dimer, trimer, tetramer, quintamer and hexamer ranges to be assembled. They form stable complexes with high yields without the need for large scale purification. The DNL technology is a naked antibody moiety or immunomodulator, enzyme, chemotherapeutic agent, chemokine, cytokine, diagnostic agent, therapeutic agent, radionuclide, imaging agent, anti-angiogenic agent, growth factor, oligonucleotide, hormone, Combinations with a wide range of other functional molecules such as peptides, toxins, pro-apoptosis agents, or combinations thereof allow monospecific, bispecific or multispecific antibodies to be assembled. Any technique known in the art for the preparation of bispecific or multispecific antibodies can be used to implement the methods of the claims of the present invention.

전-표적화(Pre-targeting ( prepre -- targetingtargeting ))

양특이성 또는 다중특이성 항체는 전-표적화 기술에 사용될 수 있다. 전-표적화는 본래 골수와 같은 정상 조직에 원하지 않는 독성을 부여하는 직접 표적화하는 항체의 느린 혈액내 제거(blood clearance)를 해결하기 위해 개발된 다단계 공정이다. 전-표적화함으로써, 방사성핵종 또는 다른 치료제는 수분 내에 혈액으로부터 제거되는 작은 운반 분자(표적가능한 구축물 또는 표적가능한 접합체)에 부착된다. 표적 항원 뿐만 아니라 표적가능한 구축물에 대한 결합 부위도 갖는 전-표적화 양특이성 또는 다중특이성 항체가 먼저 투여되고, 자유 항체가 순환계로부터 제거되도록 한 후, 상기 표적가능한 구축물이 투여된다.Bispecific or multispecific antibodies can be used in pre-targeting techniques. Pre-targeting is a multistep process originally developed to address the slow blood clearance of direct targeting antibodies that impart unwanted toxicity to normal tissues such as bone marrow. By pre-targeting, radionuclides or other therapeutic agents are attached to small carrier molecules (targetable constructs or targetable conjugates) that are removed from the blood in minutes. Pre-targeting bispecific or multispecific antibodies with binding sites for the target antigen as well as the targetable construct are administered first, allowing the free antibody to be removed from the circulation, and then administering the targetable construct.

전-표적화 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 하기 문서들에 개시되어 있다: Goodwin et al, 미국 특허 제4,863,713호; Goodwin et al, J. Nucl . Med. 29:226, 1988; Hnatowich et al, J. Nucl . Med. 28:1294, 1987; Oehr et al, J. Nucl . Med. 29:728, 1988; Klibanov et al, J. Nucl . Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn et al, J. Nucl . Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al, J. Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter et al, Int . J. Cancer 48:167 , 1991; Paganelli et al, Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli et al, Nucl . Med . Commun. 12:211, 1991; 미국 특허 제5,256,395호; Stickney et al, Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan et al., Cancer Res. 51:3119, 1991; 미국 특허 제6,077,499호; 미국 특허 출원 제09/597,580호; 미국 특허 출원 제10/361,026호; 미국 특허 출원 제09/337,756호; 미국 특허 출원 제09/823,746호; 미국 특허 출원 제10/116,116호; 미국 특허 출원 제09/382,186호; 미국 특허 출원 제10/150,654호; 미국 특허 제6,090,381호; 미국 특허 제6,472,511호; 미국 특허 출원 제10/114,315호; 미국 가특허 출원 제60/386,411호; 미국 가특허 출원 제60/345,641호; 미국 가특허 출원 제60/3328,835호; 미국 가특허 출원 제60/426,379호; 미국 특허 출원 제09/823,746호; 미국 특허 출원 제09/337,756호; 미국 가특허 출원 제60/342,103호; 및 미국 특허 제6,962,702호.Pre-targeting methods are well known in the art and are described, for example, in the following documents: Goodwin et al, US Pat. No. 4,863,713; Goodwin et al, J. Nucl . Med . 29: 226, 1988; Hnatowich et al, J. Nucl . Med . 28: 1294, 1987; Oehr et al, J. Nucl . Med . 29: 728, 1988; Klibanov et al, J. Nucl . Med . 29: 1951, 1988; Sinitsyn et al, J. Nucl . Med . 30:66, 1989; Kalofonos et al, J. Nucl. Med . 31: 1791, 1990; Schechter et al, Int . J. Cancer 48: 167, 1991; Paganelli et al, Cancer Res . 51: 5960, 1991; Paganelli et al, Nucl . Med . Commun . 12: 211, 1991; US Patent No. 5,256,395; Stickney et al, Cancer Res . 51: 6650, 1991; Yuan et al., Cancer Res . 51: 3119, 1991; US Patent No. 6,077,499; US Patent Application No. 09 / 597,580; US Patent Application No. 10 / 361,026; US Patent Application No. 09 / 337,756; US Patent Application No. 09 / 823,746; US Patent Application No. 10 / 116,116; US Patent Application No. 09 / 382,186; US Patent Application No. 10 / 150,654; US Patent No. 6,090,381; US Patent No. 6,472,511; US Patent Application No. 10 / 114,315; U.S. Provisional Patent Application 60 / 386,411; U.S. Provisional Patent Application 60 / 345,641; U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 3328,835; U.S. Provisional Patent Application 60 / 426,379; US Patent Application No. 09 / 823,746; US Patent Application No. 09 / 337,756; U.S. Provisional Patent Application 60 / 342,103; And US Pat. No. 6,962,702.

대상에서 질환 또는 질병을 치료 또는 진단하는 전-표적화 방법은 (1) 상기 대상에게 양특이성 항체 또는 항원 결합 항체 단편을 투여하는 단계; (2) 선택적으로 상기 대상에게 제거 조성물(clearing composition)을 투여하여 상기 조성물이 순환계로부터 항체를 제거하도록 하는 단계; 및 (3) 상기 대상에게 하나 이상의 킬레이트된 또는 화학적으로 결합된 치료제 또는 진단제를 함유하는 표적가능한 구축물을 투여하는 단계에 의해 제공될 수 있다. 또한, 상기 기술은 표적가능한 구축물에 접합된 효소를 투여한 후 상기 효소에 의해 전구약물(prodrug)이 활성형으로 전환되도록 하는 항체 의존성 효소 전구약물 치료(antibody dependent enzyme prodrug therapy, ADEPT)에도 사용될 수 있다.Pre-targeting methods for treating or diagnosing a disease or disorder in a subject include (1) administering to the subject a bispecific antibody or antigen binding antibody fragment; (2) optionally administering a clearing composition to the subject such that the composition removes the antibody from the circulation; And (3) administering to the subject a targetable construct containing one or more chelated or chemically bound therapeutic or diagnostic agents. The technique can also be used for antibody dependent enzyme prodrug therapy (ADEPT), which involves administering an enzyme conjugated to a targetable construct followed by conversion of the prodrug to the active form by the enzyme. have.

치료제 및 Remedy and 진단제Diagnostics

본 발명에서 개시된 특정 구현예에서, 상기 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 융합 단백질은 "네이키드" 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 융합 단백질로 단독으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제 이전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 융합 단백질은 적어도 하나의 치료제 및/또는 진단제에 공유적 또는 비공유적으로 부착되어 면역접합체를 형성할 수 있다.In certain embodiments disclosed herein, the antibody, antigen binding antibody fragment or fusion protein may be administered alone as a "naked" antibody, antigen binding fragment or fusion protein thereof. In other embodiments, the antibody, antigen binding fragment or fusion protein thereof may be administered before, simultaneously or after at least one other therapeutic agent. On the other hand, the antibody, antigen binding fragment or fusion protein thereof may be covalently or non-covalently attached to at least one therapeutic and / or diagnostic agent to form an immunoconjugate.

진단제는 바람직하게는 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 형광 라벨, 화학발광 라벨, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 진단제는 잘 알려져 있으며, 임의의 이러한 알려진 진단제가 사용될 수 있다. 진단제의 비제한적인 예는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94 mTc, 94Tc, 99 mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52 mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82 mRb, 83Sr, 또는 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방출제와 같은 방사성핵종을 포함할 수 있다. 사용되는 상자성 이온은 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나듐(Ⅱ), 테르븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ) 또는 에르븀(Ⅲ)을 포함할 수 있다. 금속 조영제는 란타늄(Ⅲ), 금(Ⅲ), 납(Ⅱ) 또는 미스무스(Ⅲ)를 포함할 수 있다. 초음파 조영제는 가스 충진 리포좀과 같은 리포좀을 포함할 수 있다. 방사선불투과성(radiopaque) 진단제는 바륨 화합물, 갈륨 화합물 및 탈륨 화합물로부터 선택될 수 있다. 플루오레센 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 매우 다양한 형광 라벨이 본 기술분야에 알려져 있다. 사용되는 화학발광 라벨은 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 또는 옥살레이트 에스테르를 포함할 수 있다.The diagnostic agent is preferably selected from the group consisting of radionuclides, radiocontrasts, paramagnetic ions, metals, fluorescent labels, chemiluminescent labels, ultrasound contrast agents and photoactive agents. Such diagnostic agents are well known and any such known diagnostic agent can be used. Non-limiting examples of diagnostic agents include 110 In, 111 In, 177 Lu, 18 F, 52 Fe, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 67 Ga, 68 Ga, 86 Y, 90 Y, 89 Zr, 94 m Tc , 94 Tc, 99 m Tc, 120 I, 123 I, 124 I, 125 I, 131 I, 154-158 Gd, 32 P, 11 C, 13 N, 15 O, 186 Re, 188 Re, 51 Mn, 52 radionuclides such as m Mn, 55 Co, 72 As, 75 Br, 76 Br, 82 m Rb, 83 Sr, or other gamma-, beta-, or positron-emitting agents. Paramagnetic ions used are chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II), neodymium (III), samarium (III), Ytterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III) or erbium (III). Metal contrast agents may include lanthanum (III), gold (III), lead (II) or mismuth (III). Ultrasound contrast agents may include liposomes, such as gas filled liposomes. Radiopaque diagnostic agents may be selected from barium compounds, gallium compounds and thallium compounds. A wide variety of fluorescent labels are known in the art, including but not limited to fluorescene isothiocyanate, rhodamine, phycoerytherin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde and fluorescamine. Known. Chemiluminescent labels used may include luminol, isoluminol, aromatic acridinium esters, imidazoles, acridinium salts or oxalate esters.

치료제는 바람직하게는 방사성핵종, 면역조절제, 항-혈관형성제, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 약물, 전구약물, 효소, 올리고뉴클레오티드, 간섭(interference) RNA, 프로-아폽토시스제, 광활성 치료제, 화학치료제 또는 독소일 수 있는 세포독성제, 2차 항체 또는 그의 단편 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 사용되는 약물은 항세포분열제(antimitotic), 항키나제(antikinase), 알킬화제, 항대사물질(antimetabolite), 항생제, 알칼로이드, 항-혈관형성제, 프로-아폽토시스제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 특성을 가질 수 있다.Therapeutic agents are preferably radionuclides, immunomodulators, anti-angiogenic agents, cytokines, chemokines, growth factors, hormones, drugs, prodrugs, enzymes, oligonucleotides, interference RNA, pro-apoptosis agents, photoactive therapeutic agents , Cytotoxic agents which may be chemotherapeutic agents or toxins, secondary antibodies or fragments thereof and combinations thereof. The drugs used are selected from the group consisting of antimitotic, antikinase, alkylating agents, antimetabolites, antibiotics, alkaloids, anti-angiogenic agents, pro-apoptosis agents and combinations thereof. It may have pharmaceutical properties.

사용되는 예시적인 약물은 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 아플리딘(aplidin), 아자리빈(azaribine), 아나스트로졸(anastrozole), 안트라사이클린(anthracycline), 벤다무스틴(bendamustine), 블레오마이신(bleomycin), 보르테조밉(bortezomib), 브라이오스타틴(bryostatin)-1, 부술판(busulfan), 칼리키아마이신(calicheamycin), 캄프토테신(camptothecin), 카르보플라틴(carboplatin), 10-히드록시캄프토테신(hydroxycamptothecin), 카르무스틴(carmustine), 셀레브렉스(celebrex), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin, CDDP), Cox-2 저해제, 이리노테칸(irinotecan, CPT-11), SN-38, 카르보플라틴(carboplatin), 클라드리빈(cladribine), 캄프토테칸(camptothecan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 데카바진(dacarbazine), 도세탁셀(docetaxel), 다크티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 2-피롤리노독소루비신(pyrrolinodoxorubicine, 2P-DOX), 시아노-모르폴리노 독소루비신, 독소루비신 글루쿠로나이드(glucuronide), 에피루비신 글루쿠로나이드(epirubicin glucuronide), 에스트라무스틴(estramustine), 에피도필로톡신(epidophyllotoxin), 에스트로겐 수용체 결합제, 에토포사이드(etoposide, VP16), 에토포사이드 글루쿠로나이드, 에토포사이드 포스페이트, 플록수리딘(floxuridine, FUdR), 3',5'-O-디올레오일-FudR(FUdR-dO), 플루다라빈(fludarabine), 플루타마이드(flutamide), 파네실-단백질 트랜스퍼라제 저해제, 겜시타빈(gemcitabine), 히드록시우레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드(ifosfamide), L-아스파라기나제, 레놀리다마이드(lenolidamide), 루코보린(leucovorin), 로무스틴(lomustine), 메클로레타민(mechlorethamine), 멜팔란(melphalan), 메르캅토푸린, 6-메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 마이토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 나벨빈(navelbine), 니트로스우레아, 플리코마이신(plicomycin), 프로카르바진(procarbazine), 파클리탁셀, 펜토스타틴, PSI-341, 랄록시펜(raloxifene), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신, 타목시펜, 탁솔, 테마졸로마이드(temazolomide, DTIC의 수용성 형태), 트랜스플라티눔, 탈리도마이드(thalidomide), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 우라실 머스타드, 비노렐빈(vinorelbine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 빈카 알칼로이드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.Exemplary drugs used include 5-fluorouracil, aplidin, azaribine, anastrozole, anthracycline, bendamustine, Bleomycin, bortezomib, bryostatin-1, busulfan, calicheamycin, camptothecin, carboplatin, 10- Hydroxycamptothecin, carmustine, celebrex, chlorambucil, cisplatin (CDDP), Cox-2 inhibitors, irinotecan (CPT-11), SN -38, carboplatin, cladribine, camptothecan, cyclophosphamide, cytarabine, dacarbazine, docetaxel, docetaxel, darkino Mycin (dactinomycin), daunorubicin, doxorubicin, 2- Pyrrolinodoxorubicine (2P-DOX), cyano-morpholino doxorubicin, doxorubicin glucuronide, epirubicin glucuronide, estramustine, epidoxin Epidophyllotoxin, estrogen receptor binder, etoposide (VP16), etoposide glucuronide, etoposide phosphate, floxuridine (FUdR), 3 ', 5'-O-dioleoyl- FudR (FUdR-dO), fludarabine, flutamide, panesyl-protein transferase inhibitors, gemcitabine, hydroxyurea, idarubicin, and phosphamide ifosfamide, L-asparaginase, lenolidamide, leucovorin, lomustine, mechlorethamine, melphalan, mercaptopurine, 6-mercapto Purine, methotrexate, mitoxantrone (mitoxantrone), mithramycin, mitomycin, mitomycin, mitotane, navelbine, nitrosurea, plicomycin, procarbazine, paclitaxel, pento Statins, PSI-341, raloxifene, semustine, streptozosin, tamoxifen, taxol, temazolomide (soluble form of DTIC), transplatinum, thalidomide, thioguanine , But not limited to, thiotepa, teniposide, topotecan, topotecan, uracil mustard, vinorelbine, vinblastine, vincristine and vinca alkaloids no.

사용되는 독소는 리신, 아브린, 알파 독소, 사포린, 예컨대 온코나제와 같은 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코커스 엔테로톡신-A, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 및 슈도모나스 엔도톡신을 포함할 수 있다.Toxins used are lysine, abrine, alpha toxin, saponins such as ribonucleases such as onconase (RNase), DNase I, Staphylococcus enterotoxin-A, pokeweed antiviral proteins, gels Gelonin, diphtheria toxin, Pseudomonas exotoxin and Pseudomonas endotoxin.

사용되는 면역조절제는 사이토카인, 줄기세포 성장 인자, 림포톡신, 조혈 인자, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 특히 유용한 것은 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 림포톡신, 인터루킨(IL)과 같은 조혈 인자, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자, 인터페론-α, -β 또는 -γ와 같은 인터페론, "S1 인자"로 나타낸 것과 같은 줄기세포 성장 인자이다. 상기 사이토카인에 포함되는 것은 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 파라티로이드(parathyroid) 호르몬; 티록신(thyroxine); 인슐린, 프로인슐린; 렐락신(relaxin); 프로렐락신; 소낭(follicle) 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 프로스타글란딘, 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐, OB 단백질; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 물레리안(mullerian)-저해 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피세포 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 변형 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-Ⅰ및 -Ⅱ; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-α, -β 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨(IL); IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, 키트-리간드 또는 FLT-3, Flt-1, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, 종양 괴사 인자(TNF-α와 같은 TNF) 및 LT이다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 사이토카인이라는 용어는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물 유래의 단백질과 상기 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 동등물(equivalent)을 포함한다.The immunomodulators used may be selected from cytokines, stem cell growth factors, lymphotoxins, hematopoietic factors, colony stimulating factors (CSFs), interferons (IFNs), erythropoietins, thrombopoietins, and combinations thereof. Particularly useful are lymphotoxins such as tumor necrosis factor (TNF), hematopoietic factors such as interleukin (IL), colony stimulation such as granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) or granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) Factors, interferons such as interferon-α, -β or -γ, stem cell growth factors such as the "S1 factor". Included in the cytokine are growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone and bovine growth hormone; Parathyroid hormones; Thyroxine; Insulin, proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glycoprotein hormones such as follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH) and luteinizing hormone (LH); Liver growth factor; Prostaglandins, fibroblast growth factor; Prolactin; Placental lactogen, OB protein; Tumor necrosis factor-α and -β; Mullerian-inhibiting substances; Mouse gonadotropin-associated peptide; Inhivin; Actibin; Vascular endothelial growth factor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nerve growth factors such as NGF-β; Platelet growth factor; Transforming growth factors (TGF) such as TGF-α and TGF-β; Insulin-like growth factor-I and -II; Erythropoietin (EPO); Osteoinduction factors; Interferons such as interferon-α, -β and -γ; Colony stimulating factor (CSF) such as macrophage-CSF (M-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- Interleukin (IL) such as 12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, Kit-ligand or FLT-3, Flt-1, Angiostatin, Trombos Pondine, endostatin, tumor necrosis factor (TNF such as TNF-α) and LT. As used herein, the term cytokine includes a biologically active equivalent of a protein from a natural source or recombinant cell culture with the natural sequence cytokine.

사용되는 케모카인은 RANTES, MCAF, MIP1-알파, MIP1-베타 및 IP-10을 포함한다.Chemokines used include RANTES, MCAF, MIP1-alpha, MIP1-beta and IP-10.

질환 조직을 치료하는데 유용한 방사성 동위원소는 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 1311, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au 및 211Pb를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 치료용 방사성핵종은 오거 방출기(Auger emitter)의 경우 20 내지 6,000 keV 범위, 바람직하게는 60 내지 200 keV 범위, 베타 방출기의 경우 100-2,500 keV 및 알파 방출기의 경우 4,000-6,000 keV의 붕괴 에너지를 갖는 것이 바람직하다. 유용한 베타-입자 방출 핵종의 최대 붕괴 에너지는 바람직하게는 20-5,000 keV, 더욱 바람직하게는 100-4,000 keV 및 가장 바람직하게는 500-2,500 keV이다. 또한, 실질적으로 오거 방출 입자와 함께 붕괴되는 방사성핵종이 바람직하다. 예를 들면, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m 및 Ir-192이다. 유용한 베타-입자 방출 핵종의 붕괴 에너지는 바람직하게는 <1,000 keV, 더욱 바람직하게는 <100 keV 및 가장 바람직하게는 <70 keV이다. 또한, 실질적으로 알파-입자의 생성과 함께 붕괴되는 방사성핵종이 바람직하다. 이러한 방사성핵종은 Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 및 Fm-255를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 유용한 알파-입자 방출 방사성핵종의 붕괴 에너지는 바람직하게는 2,000-10,000 keV, 더욱 바람직하게는 3,000-8,000 keV 및 가장 바람직하게는 4,000-7,000 keV 이다. 사용되는 잠재적인 추가 방사성핵종은 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113 mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122 mTe, 125 mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb 등을 포함한다. 일부 유용한 진단용 핵종은 124I, 123I, 131I, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 89Zr, 94Tc, 94 mTc, 99 mTc, 또는 111In을 포함할 수 있다.Radioisotopes useful for treating diseased tissue include 111 In, 177 Lu, 212 Bi, 213 Bi, 211 At, 62 Cu, 67 Cu, 90 Y, 125 I, 131 1, 32 P, 33 P, 47 Sc, 111 Ag, 67 Ga, 142 Pr, 153 Sm, 161 Tb, 166 Dy, 166 Ho, 186 Re, 188 Re, 189 Re, 212 Pb, 223 Ra, 225 Ac, 59 Fe, 75 Se, 77 As, 89 Sr, 99 Mo, 105 Rh, 109 Pd, 143 Pr, 149 Pm, 169 Er, 194 Ir, 198 Au, 199 Au and 211 Pb. The therapeutic radionuclide has a decay energy in the range of 20 to 6,000 keV, preferably in the range of 60 to 200 keV for the auger emitter, 100-2,500 keV for the beta emitter and 4,000-6,000 keV for the alpha emitter. It is desirable to have. The maximum decay energy of useful beta-particle releasing nuclides is preferably 20-5,000 keV, more preferably 100-4,000 keV and most preferably 500-2,500 keV. Also preferred are radionuclides that substantially collapse with the auger emitting particles. For example, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m and Ir- 192. The decay energy of useful beta-particle releasing nuclides is preferably <1,000 keV, more preferably <100 keV and most preferably <70 keV. Also preferred are radionuclides that decay substantially with the production of alpha-particles. These radionuclides are Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 and Fm- Including but not limited to 255. The decay energy of useful alpha-particle releasing radionuclides is preferably 2,000-10,000 keV, more preferably 3,000-8,000 keV and most preferably 4,000-7,000 keV. Potential additional radionuclides used are 11 C, 13 N, 15 O, 75 Br, 198 Au, 224 Ac, 126 I, 133 I, 77 Br, 113 m In, 95 Ru, 97 Ru, 103 Ru, 105 Ru , 107 Hg, 203 Hg, 121m Te, 122 m Te, 125 m Te, 165 Tm, 167 Tm, 168 Tm, 197 Pt, 109 Pd, 105 Rh, 142 Pr, 143 Pr, 161 Tb, 166 Ho, 199 Au , 57 Co, 58 Co, 51 Cr, 59 Fe, 75 Se, 201 Tl, 225 Ac, 76 Br, 169 Yb and the like. Some useful diagnostic nuclides are 124 I, 123 I, 131 I, 18 F, 52 Fe, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 67 Ga, 68 Ga, 86 Y, 89 Zr, 94 Tc, 94 m Tc, 99 m Tc, or 111 In.

치료제는 광활성제 또는 염료를 포함할 수 있다. 플루오로크롬과 같은 형광 조성물 및 다른 크로모겐(chromogen) 또는 가시광선에 민감한 폴피린(porphyrin)과 같은 염료는 상기 적합한 광을 병변에 조사함으로써 병변을 검출 및 치료하기 위해 사용되어 왔다. 치료에 있어서, 이것은 광복사(photoradiation), 광치료 또는 광역동(photodynamic) 치료로 불려 왔다. Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain (1986), 22:430 참조. 아울러, 단일클론 항체는 광치료를 달성하기 위해 광활성화된 염료와 커플링되어 왔다. Mew et al., J. Immunol. (1983), 130:1473; idem., Cancer Res. (1985), 45:4380; Oseroff et al, Proc . Natl . Acad. Sci USA (1986), 83:8744; idem., Photochem . Photobiol. (1987), 46:83; Hasan et al., Prog . Clin . Biol . Res. (1989), 288:471; Tatsuta et al., Lasers Surg . Med. (1989), 9:422; Pelegrin et al., Cancer (1991), 67:2529 참조.The therapeutic agent may include a photoactive agent or a dye. Fluorescent compositions such as fluorochromes and other dyes such as chromogen or porphyrin that are sensitive to visible light have been used to detect and treat lesions by irradiating the lesion with the appropriate light. In treatment, this has been called photoradiation, phototherapy or photodynamic therapy. Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. See Britain (1986), 22: 430. In addition, monoclonal antibodies have been coupled with photoactivated dyes to achieve phototherapy. Mew et al., J. Immunol . (1983), 130: 1473; idem ., Cancer Res . (1985), 45: 4380; Oseroff et al, Proc . Natl . Acad. Sci USA (1986), 83: 8744; idem., Photochem . Photobiol . (1987), 46: 83; Hasan et al., Prog . Clin . Biol . Res . (1989), 288: 471; Tatsuta et al., Lasers Surg . Med . (1989), 9: 422; See Pelegrin et al., Cancer (1991), 67: 2529.

콜티코스테로이드 호르몬은 다른 화학치료제의 효과를 증가시킬 수 있고, 결과적으로 이들은 조합 치료에 빈번히 사용된다. 프레드니손(prednisone) 및 덱사메타손(dexamethasone)은 콜티코스테로이드 호르몬의 예이다.Corticosteroid hormones can increase the effectiveness of other chemotherapeutic agents and consequently they are frequently used in combination therapy. Prednisone and dexamethasone are examples of corticosteroid hormones.

어떤 구현예에서, 안지오스타틴과 같은 항-혈관형성제, 바큘로스타틴, 칸스타틴, 마스핀, 항-VEGF 항체, 항-PlGF 펩티드 및 항체, 항-내피세포 성장 인자 항체, 항-Flk-1 항체, 항-Flt-1 항체 및 펩티드, 항-Kras 항체, 항-cMET 항체, 항-MIF(macrophage migration-inhibitory factor) 항체, 라미닌 펩티드, 피브로넥틴 펩티드, 플라스미노겐 활성제 저해제, 조직 메탈로프로티나제 저해제, 인터페론, 인터루킨-12, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘, 2-메톡시오에스트라디올, 프롤리페린-관련 단백질, 카르복시아미도트리아졸, CM101, 마리마스탯, 펜토산 폴리설페이트, 안지오포이에틴-2, 인터페론-알파, 헤르비마이신 A, PNU145156E, 16K 프롤락틴 단편, 리노마이드, 탈리도마이드, 펜톡시필린(pentoxifylline), 제니스테인, TNP-470, 엔도스타틴, 파클리탁셀, 아쿠틴(accutin), 안지오스타틴, 시도포비어(cidofovir), 빈크리스틴, 블레오마이신, AGTM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린이 사용될 수 있다.In certain embodiments, anti-angiogenic agents such as angiostatin, baculostatin, canstatin, maspin, anti-VEGF antibodies, anti-PlGF peptides and antibodies, anti-endothelial growth factor antibodies, anti-Flk-1 antibodies , Anti-Flt-1 antibody and peptide, anti-Kras antibody, anti-cMET antibody, anti-macrophage migration-inhibitory factor (MIF) antibody, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogen activator inhibitor, tissue metalloproteinase Inhibitors, interferon, interleukin-12, IP-10, Gro-β, thrombospondine, 2-methoxyoestradiol, proliferin-related protein, carboxamidotriazole, CM101, marimasstat, pentosan polysulfate , Angiopoietin-2, Interferon-alpha, Hermimycin A, PNU145156E, 16K Prolactin Fragment, Linomide, Thalidomide, Pentoxifylline, Genistein, TNP-470, Endostatin, Paclitaxel, Accutin , Angiostatin, cidofovir ), Vincristine, bleomycin, AGTM-1470, platelet factor 4 or minocycline can be used.

다른 유용한 치료제는 올리고뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 bcl-2와 같은 B-세포 종양의 암유전자 및 암유전자 산물에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 siRNA 또는 RNAi라 알려져 있는 것들을 포함한다.Other useful therapeutic agents include oligonucleotides, particularly antisense oligonucleotides against oncogenes and oncogene products of B-cell tumors such as bcl-2. Preferred antisense oligonucleotides include those known as siRNA or RNAi.

면역접합체Immunoconjugate

본 발명에 개시되어 있는 임의의 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 항체 융합 단백질은 하나 이상의 치료제 또는 진단제에 접합될 수 있다. 상기 치료제는 동일할 필요는 없으며, 예컨대 약물 및 방사성동위원소와 같이 상이할 수 있다. 예를 들면, 131I는 항체 또는 융합 단백질의 티로신 내에 포함될 수 있고, 약물은 리신 잔기의 엡실론(epsilon) 아미노기에 부착될 수 있다. 또한, 치료제 및 진단제는 예를 들면 환원된 SH 기 및/또는 탄수화물 측쇄에 부착될 수 있다. 항체 또는 융합 단백질과 치료제 또는 진단제의 공유 또는 비공유 접합체를 제조하는 많은 방법이 본 기술분야에 알려져 있으며, 임의의 이러한 공지된 방법이 사용될 수 있다.Any antibody, antigen binding antibody fragment or antibody fusion protein disclosed herein can be conjugated to one or more therapeutic or diagnostic agents. The therapeutic agents need not be identical and can be different, such as drugs and radioisotopes. For example, 131 I can be included in the tyrosine of an antibody or fusion protein and the drug can be attached to an epsilon amino group of a lysine residue. In addition, the therapeutic and diagnostic agents may be attached, for example, to reduced SH groups and / or carbohydrate side chains. Many methods of preparing covalent or non-covalent conjugates of antibodies or fusion proteins with therapeutic or diagnostic agents are known in the art, and any such known methods may be used.

치료제 또는 진단제는 이황화 결합 형성을 통해 환원된 항체 성분의 힌지(hinge) 영역에 부착될 수 있다. 다른 한편으로, 이러한 제제는 N-숙시닐-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 같은 헤테로-양기능성 가교 링커를 이용하여 부착될 수 있다. Yu et al., Int . J. Cancer 56:244 91994). 이러한 접합에 대한 일반적인 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS - LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al, "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES : PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995) 참조. 다른 한편으로, 치료제 또는 진단제는 항체의 Fc 영역내의 탄수화물 모이어티를 통해 접합될 수 있다. 상기 탄수화물 기는 티올기에 결합되어 있는 동일한 제제의 부하(loading)를 증가시키기 위해 사용될 수 있거나, 상기 탄수화물 모이어티는 상이한 치료제 또는 진단제를 결합시키기 위해 사용될 수 있다.The therapeutic or diagnostic agent may be attached to the hinge region of the reduced antibody component through disulfide bond formation. On the other hand, such agents can be attached using hetero-bifunctional crosslinking linkers such as N-succinyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP). Yu et al., Int . J. Cancer 56: 244 91994). General techniques for such bonding are well known in the art. For example, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS - LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al, "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND APPLICATIONS , Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES : PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION , Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995). On the other hand, the therapeutic or diagnostic agent may be conjugated via a carbohydrate moiety in the Fc region of the antibody. The carbohydrate group can be used to increase the loading of the same agent bound to the thiol group or the carbohydrate moiety can be used to combine different therapeutic or diagnostic agents.

항체 탄수화물 모이어티를 통해 항체 성분에 펩티드를 접합시키는 방법은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Shih et al., Int . J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int . J. Cancer 46: 1101 (1990); 및 Shih et al., 미국 특허 제5,057,313호 참조. 일반적인 방법은 산화된 탄화수소 부위를 갖는 항체 성분과 적어도 하나의 자유 아민 기능을 갖는 담체 폴리머를 반응시키는 것을 포함한다. 이러한 반응은 처음에 쉬프 염기(Schiff base)(imine) 결합을 가져오며, 이것은 2차 아민으로 환원됨으로써 안정화되어 최종 접합체를 형성할 수 있다.Methods of conjugating peptides to antibody components via antibody carbohydrate moieties are well known to those skilled in the art. See, eg, Shih et al., Int . , Incorporated herein by reference . J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int . J. Cancer 46: 1101 (1990); And Shih et al., US Pat. No. 5,057,313. A general method involves reacting an antibody component having an oxidized hydrocarbon moiety with a carrier polymer having at least one free amine function. This reaction initially results in a Schiff base (imine) bond, which can be stabilized by reduction with a secondary amine to form the final conjugate.

상기 면역접합체의 항체 성분으로 사용된 항체가 항원 결합 항체 단편이면 상기 Fc 영역은 없을 수도 있다. 그러나, 탄수화물 모이어티를 전장 항체 또는 항원 결합 항체 단편의 경쇄 가변 영역 내로 도입하는 것이 가능하다. 예를 들면, 각각 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., 미국 특허 제5,443,953호 (1995), Leung et al., 미국 특허 제6,254,868호 참조. 상기 가공된 탄수화물 모이어티는 상기 치료제 또는 진단제를 부착시키기 위해 사용된다.If the antibody used as the antibody component of the immunoconjugate is an antigen-binding antibody fragment, the Fc region may not exist. However, it is possible to introduce carbohydrate moieties into light chain variable regions of full length antibodies or antigen binding antibody fragments. For example, Leung et al., J. Immunol . 154: 5919 (1995); See Hansen et al., US Pat. No. 5,443,953 (1995), Leung et al., US Pat. No. 6,254,868. The processed carbohydrate moiety is used to attach the therapeutic or diagnostic agent.

어떤 구현예에서, 킬레이트제가 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 융합 단백질 또는 표적가능한 구축물에 부착될 수 있으며, 방사성핵종과 같은 치료제 또는 진단제를 킬레이트하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 킬레이터는 DTPA(예컨대, Mx-DTPA), DOTA, TETA, NETA 또는 NOTA를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 접합 방법 및 금속 또는 다른 리간드를 단백질에 부착시키기 위해 킬레이트제를 사용하는 것은 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 그 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 출원 제12/112,289호 참조).In certain embodiments, chelating agents may be attached to antibodies, antigen binding antibody fragments or fusion proteins or targetable constructs and may be used to chelate therapeutic or diagnostic agents, such as radionuclides. Exemplary chelators include, but are not limited to, DTPA (eg, Mx-DTPA), DOTA, TETA, NETA, or NOTA. Conjugation methods and the use of chelating agents to attach metals or other ligands to proteins are well known in the art (e.g., US patent application Ser. No. 12 / 112,289, the example portion of which is incorporated herein by reference. Reference).

어떤 구현예에서, 방사성(radioactive) 금속 또는 상자성 이온은 이온을 결합하기 위한 복수의 킬레이팅 기가 부착될 수 있는 긴 꼬리(long tail)를 갖는 시약과 반응시킴으로써 단백질 또는 펩티드에 부착될 수 있다. 이러한 꼬리는 폴리리신, 폴리사카라이드, 또는 예컨대 이러한 목적으로 유용하다고 알려진 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심 등의 기와 같이 킬레이팅 기가 결합될 수 있는 펜던트기(pendent group)를 갖는 다른 유도된 또는 유도가능한 사슬과 같은 폴리머일 수 있다.In certain embodiments, radioactive metal or paramagnetic ions can be attached to a protein or peptide by reacting with a reagent having a long tail to which a plurality of chelating groups for binding ions can be attached. Such tails may be polylysine, polysaccharides, or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), porphyrins, polyamines, crown ethers, bis-thiocemicarbazones, which are known to be useful for this purpose, for example, It may be a polymer such as another derived or inducible chain having a pendant group to which chelating groups can be bonded, such as groups such as polyoximes.

킬레이트는 예를 들면 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제4,824,659호에 개시되어 있는 것과 같은 항체 또는 펩티드에 직접 결합될 수 있다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 그 모노메틸 및 시클로헥실 동족물(analog)을 포함하며, 방사선 이미지를 위하여 125I, 131I, 123I, 124I, 62Cu, 64Cu, 18F, 111In, 67Ga, 68Ga, 99 mTc, 94 mTc, 11C, 13N, 15O, 76Br과 같은 60 내지 4,000 keV의 일반적인 에너지 범위의 진단용 동위원소와 함께 사용된다. 상기와 동일한 킬레이트는 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방사성 금속과 복합체를 형성할 때 MRI에도 유용하다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 매크로시클릭(macrocyclic) 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성금속, 가장 특별하게는 각각 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성핵종과 함께 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 복합체는 고리의 크기를 관심있는 금속에 맞춤으로써 매우 안정하게 만들어질 수 있다. RAIT용의 223Ra과 같은 안정하게 결합하는 핵종용으로 관심있는 매크로사이클릭 폴리에테르와 같은 다른 고리형 킬레이트도 포함된다.Chelates can be directly bound to antibodies or peptides, such as those disclosed in US Pat. No. 4,824,659, which is incorporated herein by reference, for example. Particularly useful metal-chelate combinations include 2-benzyl-DTPA and its monomethyl and cyclohexyl analogs, and for radiographic images 125 I, 131 I, 123 I, 124 I, 62 Cu, 64 Cu, Used with diagnostic isotopes in the general energy range of 60 to 4,000 keV such as 18 F, 111 In, 67 Ga, 68 Ga, 99 m Tc, 94 m Tc, 11 C, 13 N, 15 O, 76 Br. The same chelates are also useful for MRI when forming complexes with non-radioactive metals such as manganese, iron and gadolinium. Macrocyclic chelates such as NOTA, DOTA and TETA are used with radionuclides of various metals and radiometals, most particularly gallium, yttrium and copper, respectively. Such metal-chelate complexes can be made very stable by tailoring the size of the ring to the metal of interest. Other cyclic chelates such as macrocyclic polyethers of interest for stable binding nuclides such as 223 Ra for RAIT are also included.

보다 최근에는, PET 스캔 기술에서 예를 들면 F-18을 금속 또는 알루미늄과 같은 다른 원자와 반응시킴으로써 18F-표지를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 상기 18F-Al 접합체는 직접 항체에 부착되거나 전-표적화 방법에서 표적가능한 구축물을 표지하기 위해 사용되는 DOTA, NOTA 또는 NETA와 같은 킬레이트 기와 함께 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 F-18 표지 기술은 그 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 출원 제12/112,289호에 개시되어 있다.More recently, a method of using 18 F-labels has been disclosed in PET scan technology, for example by reacting F-18 with other atoms such as metal or aluminum. The 18 F-Al conjugate can form a complex with a chelating group such as DOTA, NOTA or NETA directly attached to the antibody or used to label the targetable construct in a pre-targeting method. This F-18 labeling technique is disclosed in US patent application Ser. No. 12 / 112,289, the example part of which is incorporated herein by reference.

치료적Therapeutic 처리 방법 Processing method

다양한 구현예는 인간, 가축 또는 개 및 고양이와 같은 반려 동물을 포함하는 포유동물과 같은 대상에서 B-세포 림프종 또는 백혈병 세포 질환 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 대상에게 치료학적 유효량의 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항-CD20 MAb이다. 어떤 구현예에서, 상기 치료는 치료제가 결합되어 있지 않은 "네이키드 항체"를 사용할 수 있다.Various embodiments relate to methods of treating B-cell lymphoma or leukemia cell disease or autoimmune disease in a subject, such as a mammal, including humans, domestic animals or companion animals such as dogs and cats, wherein the therapeutically effective amount is Administering the antibody, antigen-binding fragment or fusion protein thereof. In a preferred embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof is anti-CD20 MAb. In certain embodiments, the treatment can use a "naked antibody" with no therapeutic agent bound.

"네이키드" 항-CD20 항체의 투여는 표적 세포 표면 상의 다른 항원에 결합하거나, 이것과 반응성이 있는 치료학적 유효량의 다른 "네이키드 항체"를 동시에 또는 순차적으로 투여함으로써 보충될 수 있다. 바람직한 추가적인 MAb는 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, B7, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, Ia, HM1.24, HLA-DR, 테나신, Flt-1, Flt-3, VEGFR, PlGF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, 테니신, MIF, 보체 인자 C5, 암유전자, 암유전자 산물, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, 또는 그의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 인간화, 키메라 또는 인간 MAb를 포함한다.Administration of a "naked" anti-CD20 antibody may be supplemented by simultaneous or sequential administration of a therapeutically effective amount of another "naked antibody" that binds to or is reactive with other antigens on the target cell surface. Preferred additional MAbs are CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, B7, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, Ia, HM1.24, HLA-DR, Tenasin, Flt-1, Flt-3 , VEGFR, PlGF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, Tennisine, MIF, Complement Factor C5, Oncogene, Oncogene Products, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, or a combination thereof At least one humanized, chimeric or human MAb selected from.

상기 네이키드 항-CD20 치료 단독 또는 다른 네이키드 MAb와의 조합 모두 전술한 것과 같은 적어도 하나의 치료제를 동시에 또는 순차적으로 투여함으로서 추가로 보충될 수 있다. 멀티모드(multimode) 치료는 네이키드 항체, 융합 항체 또는 면역접합체 형태의 항-CD22, 항-CD19, 항-CD21, 항-CD74, 항-CD80, 항-CD23, 항-CD45, 또는 HLA-DR(변이체 사슬을 포함함) 항체의 투여로 보충된 네이키드 항-CD20 항체를 이용한 치료를 포함할 수 있다. 면역접합체는 전술한 것과 같은 하나 이상의 임의의 치료제 및/또는 진단제에 접합된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 네이키드 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 특정 B-세포 상에 발현되는 MUC1 항원에 대한 네이키드 항체로 보충될 수 있다. 항-CD19 및 항-CD22 항체와 같은 다양한 항체를 사용하는 것은 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 예를 들면, 각각의 나열된 특허 또는 특허 출원의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Ghetie et al., Cancer Res. 48:2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol . Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr . Opin . Oncol. 8:353 (1996), 미국 특허 제5,798,554호; 제6,187,287호; 제6,306,393호; 제6,676,924호; 제7,109,304호; 제7,151,164호; 제7,230,084호; 제7,230,085호; 제7,238,785호; 제7,238,786호; 제7,282,567호; 제7,300,655호; 제7,312,318호; 및 미국 특허 출원 공개 제2008-0131363호; 제2008-0089838호; 제2007-0172920호; 제2006-0193865호; 제2006-0210475호; 제2008-0138333호; 및 제2008-0146784호 참조.Both the naked anti-CD20 treatment alone or in combination with other naked MAbs may be further supplemented by simultaneously or sequentially administering at least one therapeutic agent as described above. Multimode treatments include anti-CD22, anti-CD19, anti-CD21, anti-CD74, anti-CD80, anti-CD23, anti-CD45, or HLA-DR in the form of naked antibodies, fusion antibodies or immunoconjugates. Treatment with naked anti-CD20 antibodies supplemented with administration of the antibody (including variant chains). An immunoconjugate may comprise an antibody or antigen binding fragment thereof conjugated to one or more of any of the therapeutic and / or diagnostic agents as described above. In addition, the naked anti-CD20 antibody or antigen-binding fragment thereof may be supplemented with a naked antibody against the MUC1 antigen expressed on specific B-cells. It is known to those skilled in the art to use various antibodies, such as anti-CD19 and anti-CD22 antibodies. For example, Ghetie et al., Cancer , in which the example portions of each listed patent or patent application are incorporated herein by reference. Res . 48: 2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol . Immunother . 32: 364 (1991); Longo, Curr . Opin . Oncol . 8: 353 (1996), US Pat. No. 5,798,554; No. 6,187,287; No. 6,306,393; No. 6,676,924; No. 7,109,304; No. 7,151,164; 7,230,084; 7,230,084; 7,230,085; 7,230,085; No. 7,238,785; No. 7,238,786; No. 7,282,567; 7,300,655; 7,300,655; No. 7,312,318; And US Patent Application Publication No. 2008-0131363; US2008-0089838; US2007-0172920; US2006-0193865; US2006-0210475; US2008-0138333; And 2008-0146784.

다른 형태의 멀티모드 치료에서, 대상은 표준 암 화학치료와 결합된 네이키드 항-CD20 항체 및/또는 면역접합체가 투여된다. 예를 들면, "CVB"(1.5 g/㎡ 시클로포스파미드, 200-400 ㎎/㎡ 에토포사이드 및 150-200 ㎎/㎡ 카르무스틴)는 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용되는 처방(regimen)이다. Patti et al., Eur . J. Haematol. 51:18 (1993). 다른 적합한 조합 화학치료 처방은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas," in CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3rd Edition, Holland et al. (eds.), pages 2028-2068 (Lea & Febiger 1993) 참조. 예시로서, 중간-등급의 비-호지킨 림프종(NHL)의 치료를 위한 1세대 화학치료 처방은 C-MOPP(cyclophosphamide, vincristine, procarbazine 및 prednisone) 및 CHOP(cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine 및 prednisone)을 포함한다. 유용한 2세대 화학치료 처방은 m-BACOD(methotrexate, bleomycin, doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine, dexamethasone 및 leucovorin)이고, 적합한 3세대 처방은 MACOP-B(methotrexate, doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine, prednisone, bleomycin 및 leucovorin)이다. 추가적인 유용한 약물은 페닐 부티레이트, 벤다무스틴 및 브리오스타틴-1을 포함한다. 바람직한 멀티모드 치료에서, 화학치료 약물 및 사이토카인 모두 바람직하게는 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체, 면역접합체 또는 융합 단백질과 함께 동시에 투여된다. 일반적으로, 동시 투여는 항체 및 치료제와 같은 둘 이상의 제제를 동시에 투여하는 것을 나타낼 것이다. 상기 사이토카인, 화학치료 약물 및 항체 또는 면역접합체는 임의의 순서로 또는 함께 투여될 수 있다.In other forms of multimodal treatment, the subject is administered naked anti-CD20 antibodies and / or immunoconjugates combined with standard cancer chemotherapy. For example, "CVB" (1.5 g / m 2 cyclophosphamide, 200-400 mg / m 2 etoposide and 150-200 mg / m 2 carmustine) is a prescription used to treat non-Hodgkin's lymphoma. to be. Patti et al., Eur . J. Haematol . 51:18 (1993). Other suitable combination chemotherapy regimens are well known in the art. For example, Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas," in CANCER MEDICINE , VOLUME 2, 3rd Edition, Holland et al. (eds.), pages 2028-2068 (Lea & Febiger 1993). As an example, first generation chemotherapy regimens for the treatment of mid-grade non-Hodgkin's lymphoma (NHL) include C-MOPP (cyclophosphamide, vincristine, procarbazine and prednisone) and CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone) do. Useful second-generation chemotherapy regimens are m-BACOD (methotrexate, bleomycin, doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine, dexamethasone and leucovorin), and suitable third-generation regimens are MACOP-B (methotrexate, doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine, prednisone, bleomycin and leucovorin) to be. Additional useful drugs include phenyl butyrate, bendamustine and bryostatin-1. In a preferred multimodal treatment, both the chemotherapeutic drug and the cytokine are preferably administered simultaneously with an antibody, immunoconjugate or fusion protein comprising an anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof. In general, simultaneous administration will refer to the administration of two or more agents simultaneously, such as an antibody and a therapeutic agent. The cytokines, chemotherapeutic drugs and antibodies or immunoconjugates can be administered in any order or together.

면역접합체 또는 네이키드 항체는 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위하여 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 이것에 의해 상기 면역접합체 또는 네이키드 항체는 약학적으로 적합한 부형제와의 혼합물에서 조합된다. 다른 적합한 부형제는 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) 및 그 수정판 참조.The immunoconjugate or naked antibody may be formulated according to known methods for preparing pharmaceutically useful compositions, whereby the immunoconjugate or naked antibody is combined in a mixture with a pharmaceutically suitable excipient. Other suitable excipients are well known to those skilled in the art. For example, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS , 5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL See SCIENCES , 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) and its revisions.

상기 면역접합체 또는 네이키드 항체는 예를 들면 볼루스(bolus) 주사 또는 연속적 투여를 통한 정맥 투여용으로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 약 4시간 이하의 기간에 걸쳐, 더욱 바람직하게는 약 3시간 이하의 기간에 걸쳐 투여된다. 예를 들면, 처음 25-50 ㎎은 30분 이내 , 바람직하게는 15분 내에 까지도 투여되고, 나머지는 다음 2-3시간에 걸쳐 투여될 수 있다. 주사용 제형은 예컨대 첨가된 방부제와 함께 앰풀 또는 다중-복용량 용기의 단위 용량 형태로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 오일성 또는 수성 비히클(vehicle) 내에서 서스펜션, 용액 또는 에멀전 형태를 취할 수 있으며, 서스펜션제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 다른 한편으로, 상기 활성 성분은 사용하기 전에 예컨대 멸균된 발열원-부재수(pyrogen-free water)와 같은 적합한 비히클로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.The immunoconjugate or naked antibody may be formulated for intravenous administration, for example, by bolus injection or continuous administration. Preferably, the antibody is administered over a period of about 4 hours or less, more preferably over a period of about 3 hours or less. For example, the first 25-50 mg may be administered within 30 minutes, preferably within 15 minutes, with the remainder over the next 2-3 hours. Injectable formulations may be presented in unit dose form, eg, in ampoules or in multi-dose containers, with an added preservative. The composition may take the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous vehicle and may contain formulating agents such as suspensions, stabilizers and / or dispersants. On the other hand, the active ingredient may be in powder form for constitution with a suitable vehicle, such as sterile pyrogen-free water, before use.

치료용 또는 진단용 접합체 또는 네이키드 항체의 작용 기간을 조절하기 위해 추가적인 약학적 방법이 도입될 수 있다. 조절 방출 제제는 상기 면역접합체 또는 네이키드 항체와 복합체를 형성하거나 이를 흡착하기 위한 폴리머를 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 생체적합성 폴리머는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 다이머 및 세바크산의 폴리안하이드라이드 코폴리머의 매트릭스를 포함한다. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992). 이러한 매트릭스로부터의 면역접합체 또는 항체의 방출 속도는 상기 면역접합체 또는 항체의 분자량, 면역접합체의 양, 매트릭스 내의 항체 및 분산된 입자의 크기에 의존한다. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 91989); Sherwood et al., supra. 다른 고형 용량 형태는 Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) 및 그의 수정판.Additional pharmaceutical methods can be introduced to modulate the duration of action of a therapeutic or diagnostic conjugate or naked antibody. Controlled release formulations can be prepared by using a polymer for complexing or adsorbing the immunoconjugate or naked antibody. For example, biocompatible polymers include matrices of poly (ethylene-co-vinyl acetate) and matrices of stearic acid dimers and polyanhydride copolymers of sebacic acid. Sherwood et al., Bio / Technology 10: 1446 (1992). The rate of release of an immunoconjugate or antibody from this matrix depends on the molecular weight of the immunoconjugate or antibody, the amount of immunoconjugate, the size of the antibody and dispersed particles in the matrix. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 91989); Sherwood et al., Supra . Other solid dosage forms are Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS , 5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES , 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) and its revision.

상기 면역접합체, 항체 융합 단백질, 또는 네이키드 항체는 또한 피하 또는 심지어 다른 비경구 투여에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 아울러, 상기 투여는 연속적 투여 또는 단일 또는 다중 볼루스에 의할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 약 4시간 이하의 기간에 걸쳐, 더욱 바람직하게는 약 3시간 이하의 기간에 걸쳐 투여된다. 이것은 처음에 천천히 투여함으로써 바람직하게 수행된다. 예를 들면, 25 내지 50 ㎎의 복용량이 15-30분 내에 투여되고, 나머지 복용량은 2-3시간의 기간에 걸쳐 투여된다.The immunoconjugate, antibody fusion protein, or naked antibody may also be administered to the mammal by subcutaneous or even parenteral administration. In addition, the administration may be by continuous administration or by single or multiple bolus. Preferably, the antibody is administered over a period of about 4 hours or less, more preferably over a period of about 3 hours or less. This is preferably done by slow administration at first. For example, a dose of 25-50 mg is administered within 15-30 minutes and the remaining dose is administered over a period of 2-3 hours.

일반적으로, 인간에게 투여되는 면역접합체, 융합 단백질 또는 네이키드 항체의 복용량은 환자의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 증상 및 이전의 의학적 이력과 같은 인자에 따라 다양할 것이다. 벨투즈맙보다 낮은 효능의 치료용 항체의 경우, 단일 정맥내 투여로서 약 1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏ 범위 용량의 면역접합체, 항체 융합 단백질 또는 네이키드 항체로 수용자(recipient)에게 제공되는 것이 바람직할 수 있지만, 이보다 더 낮거나 높은 용량도 환경에 따라 투여될 수 있다. 용량은 1 내지 20, 5 내지 10, 2 내지 10, 10 내지 20, 5 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 2 내지 5 ㎎/㎏ 범위, 또는 1 내지 20 ㎎/㎏ 사이의 임의의 범위일 수 있다. 상기 용량은 예를 들면 4-10주 동안 주당 1회, 8주 동안 주당 1회, 4주 동안 주당 1회, 2-8주 동안 주당 2-3회와 같이 필요시 반복될 수 있다. 또한, 유지 치료에서 요구되는 바와 같이 수개월 동안 매 2주마다, 또는 여러 달 동안 매달 또는 분기마다와 같이 덜 빈번하게 투여될 수도 있다.In general, the dosage of an immunoconjugate, fusion protein or naked antibody administered to a human will vary depending on factors such as the patient's age, weight, height, sex, general medical symptoms and previous medical history. For therapeutic antibodies of lower efficacy than beltuzumab, it is preferred to provide the recipient with an immunoconjugate, antibody fusion protein or naked antibody in a dose ranging from about 1 mg / kg to 20 mg / kg as a single intravenous administration. However, lower or higher doses may be administered depending on the environment. Doses range from 1 to 20, 5 to 10, 2 to 10, 10 to 20, 5 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 2 to 5 mg / kg, or any range between 1 to 20 mg / kg. Can be. The dose may be repeated as needed, for example once per week for 4-10 weeks, once per week for 8 weeks, once per week for 4 weeks, or 2-3 times per week for 2-8 weeks. It may also be administered less frequently, such as every two weeks for months, or monthly or quarterly for several months, as required for maintenance therapy.

다른 한편으로, 네이키드 항-CD20 MAb와 같은 항체는 매 2주 또는 3주 동안 1회 용량으로 투여되고, 적어도 총 3회 용량 동안 반복될 수 있다. 또는, 상기 항체는 4-8주 동안 주당 1회 투여될 수 있다. 상기 용량이 대략 200-300 ㎎/㎡(1.7-㎡ 환자에게 용량 당 340 ㎎, 또는 70 ㎏ 환자에게 4.9 ㎎/㎏) 이하까지 낮아진다면, 4주 내지 8주 동안 주당 1회 투여될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 용량 스케줄은 말하지만 2-3개월 동안 매 2주 또는 3주로 줄어들 수 있다. 상기 복용량 스케줄은 선택적으로 다른 간격으로 반복될 수 있고, 용량은 상기 복용량 및 스케줄을 적절히 조정하면서 다양한 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다.On the other hand, an antibody such as naked anti-CD20 MAb may be administered in one dose every two or three weeks and may be repeated for at least three total doses. Alternatively, the antibody may be administered once per week for 4-8 weeks. If the dose is lowered down to approximately 200-300 mg / m 2 (340 mg per dose in 1.7-m 2 patients, or 4.9 mg / kg in 70 kg patients), it may be administered once per week for 4 to 8 weeks. On the other hand, the dose schedule can be said to be reduced every two or three weeks for 2-3 months. The dose schedule may optionally be repeated at different intervals, and the dose may be administered via various parenteral routes with appropriate adjustments to the dose and schedule.

예시적인 구현예에서, NHL 또는 자가면역 질환은 연속 4주 동안 주당 100-400 ㎎/㎡ 복용량으로 인간화 항-CD20 항체를 4주 투여하고, 필요시 다음 달/년에 걸쳐 반복하여 처리될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 인간화 항-CD20 항체는 4 내지 8번 주사하는 동안 매 2주마다 또는 매 3주마다 1회 100-300 ㎎/㎡의 복용량으로 투여될 수 있다. 다른 한편으로, NHL은 전술한 것과 같은 4주 투여, 또는 전술한 것만큼 빈번하지 않은 주사로, 동일한 날에 상기 항-CD20 단일클론 항체 투여 이전에, 동안에 또는 이후에 1시간에 걸쳐서 360 ㎎/㎡의 복용량으로 정맥내 투여하는 에프라투즈맙(항-CD22 인간화 항체)과 조합하여 처리될 수 있다. 또는, 조합 치료에 사용되는 항체는 또한 다른 순서로 투여되어서, 상이한 주마다 교번으로 각각 4 내지 8 이상의 복용량으로 총 주사 순서 동안 격주로 제공될 수 있다. 이후, 상기 용량 스케줄은 각 치료 처방에 대한 환자의 임상적 상태 및 반응에 따라 매 3-6개월과 같은 상이한 간격으로 반복될 수 있다. 다른 한편으로, NHL은 4주 투여 또는 덜 빈번한 투여로 이트륨-90(수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 한번 이상의 주사로 5 내지 35 mCi/㎡ 사이의 총 Y-90 복용량)과 같은 치료용 동위원소로 방사성표지된 CD22 MAb의 한번 이상의 주사와 조합하여 항-CD20 항체로 처리될 수 있다. 인용에 의해 본 발명에 포함되는 미국 특허 출원 제09/590,284호는 항-CD22 항체를 이용한 자가면역 질병의 면역치료를 개시한다.In an exemplary embodiment, the NHL or autoimmune disease can be administered four weeks of humanized anti-CD20 antibody at a dose of 100-400 mg / m 2 per week for four consecutive weeks and treated repeatedly over the next month / year as needed. . On the other hand, the humanized anti-CD20 antibody may be administered at a dose of 100-300 mg / m 2 once every 2 weeks or once every 3 weeks during 4 to 8 injections. On the other hand, NHL is 360 mg / d over four hours of administration as described above, or injections as infrequent as described above, over one hour before, during or after administration of the anti-CD20 monoclonal antibody on the same day. It can be treated in combination with epratumab (anti-CD22 humanized antibody) administered intravenously at a dose of m 2. Alternatively, the antibodies used in the combination treatment may also be administered in a different order so that they are given every other week for a total injection sequence in alternate doses of 4 to 8 or more each. The dose schedule can then be repeated at different intervals, such as every 3-6 months, depending on the patient's clinical condition and response to each treatment regimen. NHL, on the other hand, is a therapeutic isotope such as yttrium-90 (total Y-90 dosage between 5 and 35 mCi / m 2 with one or more injections over a period of weeks or months), at four or less frequent administrations. It can be treated with an anti-CD20 antibody in combination with one or more injections of radiolabeled CD22 MAb. US Patent Application No. 09 / 590,284, incorporated herein by reference, discloses immunotherapy of autoimmune diseases with anti-CD22 antibodies.

바람직한 구현예에서, 벨투즈맙과 같이 특히 효과적으로 가공된 네이키드 또는 접합된 항-CD20 항체는 B-세포 림프종 또는 백혈병과 같은 B-세포 질환, 전신성 홍반성 낭창, 소낭성 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 면역 혈소판감소성 자반증, 또는 심상성 천포창과 같은 질환 뿐만 아니라 GVHD, 용혈성 빈혈, 한성글로불린혈증, 동종감작반응 및 기관 이식 거부와 같은 면역 질환을 치료하기 위해 매우 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 하기 실시예에 개시된 바와 같이, 80 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 50 ㎎ 이하, 가장 바람직하게는 30 ㎎ 이하만큼 낮은 벨투즈맙은 인간 대상에게 투여될 때 효과적이다. 이러한 용량은 바람직하게는 상기 대상에게 약 1 내지 3주 간격으로 2회 이상 투여되며, 수주에 걸쳐 지속될 수 있는 분별화된 복용량과 같이 주당 1회 이상, 예컨대 주당 2-3회 투여될 수 있다(예를 들면, 만성 림프구성 백혈병과 같은 특정 질환에는 바람직할 수 있음). 놀랍게도, 벨투즈맙과 같은 매우 효과적인 항-CD20 항체의 이러한 낮은 복용량은 순환하는 B-세포를 소모시키거나 및/또는 B-세포 관련 종양의 성장을 저해시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 낮은 용량의 항-CD20 항체를 투여하는 것은 정맥내 또는 피하 운반에 의한 것이 바람직하다.In a preferred embodiment, particularly effectively processed naked or conjugated anti-CD20 antibodies, such as veltumab, are B-cell diseases such as B-cell lymphoma or leukemia, systemic lupus erythematosus, vesicular lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma Or in very low doses to treat diseases such as immune thrombocytopenic purpura, or vulgaris, as well as immune diseases such as GVHD, hemolytic anemia, Hans globulinemia, allergic reactions and organ transplant rejection. As disclosed in the examples below, beltuzmab as low as 80 mg, more preferably 50 mg or less, most preferably 30 mg or less, is effective when administered to a human subject. Such doses are preferably administered to the subject two or more times at intervals of about one to three weeks, and may be administered one or more times per week, such as 2-3 times per week, such as fractionated dosages that may last for several weeks ( For example, for certain diseases such as chronic lymphocytic leukemia). Surprisingly, these low doses of highly effective anti-CD20 antibodies, such as veltumab, have been shown to be effective in consuming circulating B-cells and / or inhibiting the growth of B-cell related tumors. Administration of low doses of anti-CD20 antibodies is preferably by intravenous or subcutaneous delivery.

하기 실시예에 개시된 바와 같이, 벨투즈맙을 낮은 용량으로 투여하기 위한 바람직한 프로토콜은 특허청구범위의 방법을 실행함에 있어서 잘 작동하는 것으로 나타났으며, 사용될 수 있다. 예를 들면, 버킷 림프종의 마우스 모델 시스템에서, 20 gm 마우스 당 5 ㎍ 벨투즈맙 만큼 낮은 단일 복강내 또는 피하 주사하면 대조군과 비교하여 치사율의 현저한 감소를 가져왔다(실시예 13). 70 ㎏의 인간에 외삽하면, 상기 5 ㎍ 용량은 벨투즈맙 17.5 ㎎의 단일 주사와 동등할 것이다. 단일 복강내 또는 피하 주사로 투여된 20 ㎍ 벨투즈맙(70 ㎏ 개인에 대해 70 ㎎에 상당함)의 더 높은 마우스 용량은 평균 생존 시간을 4배 증가시켰다(실시예 13). 마우스에서 0.05 ㎍ 단일 복용량(70 ㎏ 개인에 대해 0.075 ㎎에 상당함)만큼 낮은 용량도 평균 생존 시간이 2배 증가하여 여전히 대조군에 대해 상대적으로 생존율에 현저한 개선을 가져왔다. 이러한 낮은 용량은 대조군에 비해 현저한 개선을 가져올 수 있지만, B-세포 관련 질환의 효과적인 치료는 더 나은 치료 효과를 위하여 다소 높은 용량을 이용할 수 있다. 비제한적인 예는 2주 간격으로 2 복용량으로 벨투즈맙을 80 ㎎ 정맥내 투여하는 것(실시예 15), 주당 1회 4 복용량으로 벨투즈맙을 138 ㎎ (80 ㎎/㎡) 정맥내 투여하는 것(실시예 15), 2주 간격으로 4 복용량으로 벨투즈맙을 80 ㎎ 피하 투여하는 것(실시예 15), 주당 4 복용량으로 벨투즈맙을 80 ㎎/㎡ 정맥내 투여하는 것(실시예 15), 2주 간격의 10 ㎎의 2 복용량으로 벨투즈맙을 피하 투여하는 것(실시예 17), 6주 동안 주당 2회 벨투즈맙을 40 ㎎ 피하 투여하는 것(실시예 18), 2주 간격의 2 복용량으로 벨투즈맙을 480 ㎎ 피하 투여하는 것(실시예 19), 주당 3 복용량으로 벨투즈맙을 120 ㎎ 피하 투여하는 것(실시예 20), 처음 15 ㎎의 벨투즈맙을 정맥내 주사한 후, 3주 동안 주당 40 ㎎ 피하 주사하는 것(실시예 21), 0. 8, 12 및 21일에 벨투즈맙 80 ㎎을 4 피하 주사하는 것(실시예 22) 및 2주 간격으로 벨투즈맙 80 ㎎을 4 피하 주사하는 것(실시예 16)을 포함한다. 후자의 경우(실시예 16)에 있어서, 80 ㎎ 벨투즈맙의 단일 피하 주사는 종양 목 매스(tumor neck mass)의 현저한 감소와 순환하는 B-세포의 신속한 소모를 가져왔다는 것은 주목할 만하다. 실시예 24는 80 ㎎/㎡만큼 낮은 벨투즈맙의 주당 1회 4 복용량은 NHL을 갖는 적어도 일부의 인간 환자에서 완전 반응을 가져왔음을 보여준다.As disclosed in the Examples below, preferred protocols for administering veltuzmab at low doses have been shown to work well in practicing the methods of the claims and can be used. For example, in a mouse model system of Burkitt's lymphoma, a single intraperitoneal or subcutaneous injection as low as 5 μg Beltuzumab per 20 gm mouse resulted in a significant reduction in mortality compared to the control (Example 13). Extrapolating to 70 kg of human, the 5 μg dose would be equivalent to a single injection of 17.5 mg of veltumab. Higher mouse doses of 20 μg Beltuzumab (equivalent to 70 mg for a 70 kg individual) administered by a single intraperitoneal or subcutaneous injection increased the mean survival time fourfold (Example 13). Doses as low as 0.05 μg single dose (corresponding to 0.075 mg for 70 kg individuals) in mice also resulted in a 2 fold increase in mean survival time, which still resulted in a significant improvement in survival relative to the control. While such low doses can result in significant improvement over the control, effective treatment of B-cell related diseases can utilize rather high doses for better therapeutic effect. Non-limiting examples include intravenously administering veltuzmab at 80 mg in two doses at two week intervals (Example 15), and intravenous 138 mg (80 mg / m 2) of veltuzmab at 4 doses once per week. (Example 15), administering 80 mg subcutaneously of Beltuzumab at 4 doses at 2 week intervals (Example 15), intravenously administering 80 mg / m 2 of Beltuzumab at 4 doses per week (Example 15), Subcutaneously administering beltuzmab at two doses of 10 mg every two weeks (Example 17), subcutaneously administering 40 mg of beltuzmab twice per week for six weeks (Example 18), two doses at two week intervals 480 mg subcutaneously administered (Example 19), 120 mg subcutaneously administered Beltuzumab at 3 doses per week (Example 20), 3 weeks after intravenous injection of the first 15 mg of Beltuzumab 40 mg subcutaneous injection per week (Example 21), 4 subcutaneous injections of 80 mg of Beltuzumab at 0.8, 12 and 21 days (Example 22) And 4 subcutaneous injections of Beltuzumab 80 mg at 2 week intervals (Example 16). In the latter case (Example 16), it is noteworthy that a single subcutaneous injection of 80 mg Beltuzumab resulted in a significant reduction in tumor neck mass and rapid consumption of circulating B-cells. Example 24 shows that 4 doses of veltuzmab as low as 80 mg / m 2 resulted in a complete response in at least some human patients with NHL.

숙련된 당업자는 개시된 용량의 벨투즈맙은 단지 예시적인 것이며, 특허청구범위의 방법의 실행시에는 정맥내 또는 더욱 바랍직하게는 피하 투여된 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ㎎ 벨투즈맙(총 복용량) 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ㎎/㎡ 벨투즈맙과 같은 다른 비제한적인 용량이 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 구현예에서, 벨투즈맙의 잠재적인 유용한 범위는 피하, 정맥내 또는 다른 비경구 주사용으로 제형화된 미리충진된 주사기 또는 자가주사용 펜의 형태로 10 내지 180 ㎎, 10 내지 100 ㎎, 20 내지 80 ㎎, 30 내지 60 ㎎, 40 내지 50 ㎎의 용량 또는 임의의 다른 범위의 용량으로 제공될 수 있다.Those skilled in the art will appreciate that the disclosed doses of veltumab are merely exemplary, and 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 administered intravenously or more preferably subcutaneously when practicing the methods of the claims. , 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 mg beltuzmab (total dose) or 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, It will be appreciated that other non-limiting doses may be used, such as 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 mg / m 2 beltuzmab. In certain embodiments, the potential useful range of veltumab is 10 to 180 mg, 10 to 100 mg, 20 in the form of a prefilled syringe or autoinjectable pen formulated for subcutaneous, intravenous or other parenteral injection. To 80 mg, 30 to 60 mg, 40 to 50 mg, or any other range of doses.

피하, 정맥내 또는 복강내 투여를 위한 낮은 용량의 벨투즈맙의 예시적인 범위는 1 ㎎ 이하, 1 내지 2 ㎎, 1 내지 5 ㎎, 1 내지 10 ㎎, 1 내지 20 ㎎, 1 내지 50 ㎎, 1 내지 75 ㎎, 1 내지 100 ㎎, 2 내지 5 ㎎, 2 내지 10 ㎎, 2 내지 20 ㎎, 2 내지 50 ㎎, 2 내지 75 ㎎, 2 내지 100 ㎎, 5 내지 10 ㎎, 5 내지 20 ㎎, 5 내지 30 ㎎, 5 내지 40 ㎎, 5 내지 50 ㎎, 5 내지 60 ㎎, 5 내지 75 ㎎, 5 내지 100 ㎎, 10 내지 20 ㎎, 10 내지 30 ㎎, 10 내지 40 ㎎, 10 내지 50 ㎎, 10 내지 60 ㎎, 10 내지 75 ㎎, 10 내지 100 ㎎, 20 내지 30 ㎎, 20 내지 40 ㎎, 20 내지 50 ㎎, 20 내지 60 ㎎, 20 내지 75 ㎎, 20 내지 100 ㎎, 25 내지 40 ㎎, 25 내지 50 ㎎, 25 내지 60 ㎎, 25 내지 75 ㎎, 25 내지 100 ㎎, 30 내지 40 ㎎, 30 내지 50 ㎎, 30 내지 60 ㎎, 30 내지 75 ㎎, 30 내지 100 ㎎, 40 내지 50 ㎎, 40 내지 60 ㎎, 40 내지 75 ㎎, 40 내지 100 ㎎, 50 내지 60 ㎎, 50 내지 75 ㎎, 50 내지 100 ㎎, 60 내지 70 ㎎, 60 내지 80 ㎎, 60 내지 90 ㎎, 60 내지 100 ㎎ 또는 75 내지 100 ㎎ 일 수 있다. 다른 한편으로, ㎎/㎡에서의 동일한 범위가 인간 대상에게 투여될 수 있다. 하기 실시예에 개시된 바와 같이, 이러한 낮은 용량의 벨투즈맙은 적어도 동물 모델 시스템과, B-세포 관련 백혈병 또는 림프종 또는 자가면역 질환 또는 다른 면역 질환을 갖는 일부 예시적인 인간 대상에서 효과적인 것으로 나타났다.Exemplary ranges of low dose Beltuzumab for subcutaneous, intravenous or intraperitoneal administration are 1 mg or less, 1 to 2 mg, 1 to 5 mg, 1 to 10 mg, 1 to 20 mg, 1 to 50 mg, 1 To 75 mg, 1 to 100 mg, 2 to 5 mg, 2 to 10 mg, 2 to 20 mg, 2 to 50 mg, 2 to 75 mg, 2 to 100 mg, 5 to 10 mg, 5 to 20 mg, 5 To 30 mg, 5 to 40 mg, 5 to 50 mg, 5 to 60 mg, 5 to 75 mg, 5 to 100 mg, 10 to 20 mg, 10 to 30 mg, 10 to 40 mg, 10 to 50 mg, 10 To 60 mg, 10 to 75 mg, 10 to 100 mg, 20 to 30 mg, 20 to 40 mg, 20 to 50 mg, 20 to 60 mg, 20 to 75 mg, 20 to 100 mg, 25 to 40 mg, 25 To 50 mg, 25 to 60 mg, 25 to 75 mg, 25 to 100 mg, 30 to 40 mg, 30 to 50 mg, 30 to 60 mg, 30 to 75 mg, 30 to 100 mg, 40 to 50 mg, 40 To 60 mg, 40 to 75 mg, 40 to 100 mg, 50 to 60 mg, 50 to 75 Mg, 50 to 100 mg, 60 to 70 mg, 60 to 80 mg, 60 to 90 mg, 60 to 100 mg or 75 to 100 mg. On the other hand, the same range at mg / m 2 may be administered to a human subject. As disclosed in the examples below, such low doses of veltumab have been shown to be effective in at least animal model systems and in some exemplary human subjects having B-cell associated leukemia or lymphoma or autoimmune diseases or other immune diseases.

본 발명에서 개시된 조성물은 다양한 자가면역 질환 뿐만 아니라 특발성(idiopathic) 형태의 B-세포 림프종, 침투성(aggressive) 형태의 B-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 뿐만 아니라 GVHD, 한성글로불린혈증, 용혈성 빈혈, 동종감작반응, 및 기관 이식 거부를 치료하는데 특히 유용하다. 예를 들면, 상기 인간화 항-CD20 항체 성분 및 면역접합체는 특발성 및 침투성 형태의 비-호지킨 림프종, 다양한 자가면역 질환(예컨대, 류마티스성 관절염, SLE, 쇼그렌 증후군, 심상성 천포창, 면역 혈소판감소성 자반증) 및 다양한 다른 면역 질환(신장 및 심장 거부와 같은 기관 이식 거부, 동종성 줄기세포 이식 후의 GVHD 및 면역 용혈성 빈혈)을 치료하는데 사용될 수 있다.The compositions disclosed herein, as well as various autoimmune diseases, as well as idiopathic form of B-cell lymphoma, invasive form of B-cell lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia and Waldenstrom's macroglobulinemia As well as being particularly useful for treating GVHD, Hanglobulinemia, hemolytic anemia, allergic reactions, and organ transplant rejection. For example, the humanized anti-CD20 antibody components and immunoconjugates may be used in idiopathic and invasive forms of non-Hodgkin's lymphoma, various autoimmune diseases (eg, rheumatoid arthritis, SLE, Sjogren's syndrome, vulgaris, immune thrombocytopenia) Purpura) and various other immune diseases (organ transplant rejection such as kidney and heart rejection, GVHD after allogeneic stem cell transplantation and immune hemolytic anemia).

전술한 바와 같이, 상기 항체는 B-세포 림프종 및 백혈병 및 다른 B-세포 질환 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 표적화될 수 있는 예시적인 유형의 암은 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종을 포함한다.As mentioned above, the antibodies can be used to treat B-cell lymphoma and leukemia and other B-cell diseases or disorders. Exemplary types of cancers that may be targeted include acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, and multiple myeloma.

항-CD20 항체는 면역-매개성 혈소판감소증(급성 특발성 혈소판감소성 자반증 및 만성 특발성 혈소판감소증 자반증)과 같은 클래스 Ⅲ 자가면역 질환, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 낭창성 신염, 류마티스성 열, 류마티스성 관절염, 다선 증후군, 수포성 유천포창, 당뇨병, 헤노흐-쉘라인 자반증, 후-연쇄상구균성 신염, 결절성 홍반, 타카야수 동맥염, 애디슨 질환, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스테르 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 강피증, 만성 활성형 간염, 다발성근염/피부근염, 다연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병, 근위축성 측색 경화증, 척수 매독, 거대세포 동맥염/다발성근육통, 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염 및 섬유성 폐포염을 포함하는 B-세포 관련 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.Anti-CD20 antibodies are class III autoimmune diseases such as immune-mediated thrombocytopenia (acute idiopathic thrombocytopenic purpura and chronic idiopathic thrombocytopenic purpura), dermatomyositis, Sjogren's syndrome, multiple sclerosis, seed men's chorea, myasthenia gravis, systemic Lupus erythematosus, Lupus nephritis, Rheumatic fever, Rheumatoid arthritis, Polygon syndrome, Bullous swelling, Diabetes, Henoch-Shellin purpura, Post-streptococcal nephritis, Nodular erythema, Takayasu's arteritis, Addison's disease, Sarcoidosis , Ulcerative colitis, polymorphic erythema, IgA nephropathy, nodular polyarteritis, ankylosing spondylitis, goodpasteur syndrome, obstructive thrombovascular disease, primary biliary cirrhosis, Hashimoto thyroiditis, thyrotoxicosis, scleroderma, chronic active hepatitis, polymyositis / skin Myositis, periarthritis, vulgaris ulcer, Wegener's granulomatosis, membranous kidney disease, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord syphilis It can be used to treat B-cell related autoimmune diseases, including giant cell arteritis / polymyalgia, pernicious anemia, rapidly progressive glomerulonephritis, and fibrotic alveolitis.

항-CD20 항체는 또한 CD20 항원을 발현하는 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있다. 예를 들면, 아폽토시스는 가교된 CD20 MAb의 IgG1-Fc와 반응하는 Fc-수용체를 갖는 림프구성 세포를 이용하여 유도될 수 있음이 알려져 있다. Shan et al., Cancer Immunol . Immunother. 48(12):673-683 (2000) 참조. 아울러, 키메라 CD20 MAb의 응집체(aggregate), 즉 호모폴리머가 아폽토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다. Ghetie et al., Blood 97(5):1392-1398 (2000) 및 Ghetie et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA 94(14):7509-7514 (1997) 참조.Anti-CD20 antibodies may also induce apoptosis in cells expressing the CD20 antigen. For example, it is known that apoptosis can be induced using lymphocytic cells with Fc-receptors that react with IgG1-Fc of crosslinked CD20 MAb. Shan et al., Cancer Immunol . Immunother . 48 (12): 673-683 (2000). In addition, it has been reported that aggregates of chimeric CD20 MAbs, ie homopolymers, induce apoptosis. Ghetie et al., Blood 97 (5): 1392-1398 (2000) and Ghetie et al., Proc. Natl . Acad . Sci See USA 94 (14): 7509-7514 (1997).

키트Kit

다양한 구현예는 환자에서 병든 조직을 치료 또는 진단하기에 적합한 성분을 함유하는 키트에 관한 것일 수 있다. 예시적인 키트는 본 발명에서 개시되어 있는 것과 같은 적어도 하나의 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질을 함유할 수 있다. 투여용 성분을 함유하는 조성물이 경구 운반에 의한 것과 같은 소화관을 통한 운반용으로 제형화되지 않는다면, 기타 다른 경로를 통해 상기 키트 성분을 운반할 수 있는 장치가 포함될 수 있다. 비경구용 운반과 같은 적용분야용의 한 유형의 장치는 상기 조성물을 대상의 체내로 주사하는데 사용되는 주사기이다. 흡입 장치 또한 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 벨투즈맙과 같은 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체의 멸균된 액상 제형 또는 동결건조된 제조물을 함유하는 미리충진된 주사기 또는 자가주사용 펜의 형태로 제공될 수 있다(예컨대, Kivitz et al., Clin . Ther. 2006, 285:1619-29).Various embodiments may relate to kits containing components suitable for treating or diagnosing diseased tissue in a patient. Exemplary kits may contain at least one antibody, antigen binding fragment or fusion protein as disclosed herein. If the composition containing the ingredient for administration is not formulated for delivery through the digestive tract, such as by oral delivery, a device capable of delivering the kit component via other routes may be included. One type of device for applications such as parenteral delivery is a syringe used to inject the composition into the body of a subject. Suction devices can also be used. In certain embodiments, an anti-CD20 antibody or antigen-binding fragment thereof, such as veltumab, may be provided in the form of a prefilled syringe or self-injecting pen containing a sterile liquid formulation or lyophilized preparation of the antibody ( See, for example, Kivitz et al., Clin . Ther . 2006, 285: 1619-29).

상기 키트 성분은 둘 이상의 용기에 함께 또는 개별적으로 포장될 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 용기는 재구성하기에 적합한 조성물의 멸균, 동결건조된 제형을 함유하는 바이알일 수 있다. 또한, 키트는 다른 시약의 재구성 및/또는 희석에 적합한 하나 이상의 완충액을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 용기는 파우치, 트레이, 상자, 튜브 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 키트 성분은 상기 용기 내에 멸균적으로 포장 및 유지될 수 있다. 포함될 수 있는 다른 성분은 키트를 사용하기 위하여 키트를 이용하는 사람에 대한 설명서이다.The kit components may be packaged together or separately in two or more containers. In certain embodiments, the container may be a vial containing a sterile, lyophilized formulation of a composition suitable for reconstitution. The kit may also contain one or more buffers suitable for reconstitution and / or dilution of other reagents. Other containers that can be used include, but are not limited to, pouches, trays, boxes, tubes, and the like. Kit components may be sterilely packaged and maintained in the container. Other ingredients that may be included are instructions for the person using the kit to use the kit.

발현 벡터Expression vector

또 다른 구현예는 항체, 그의 항원 결합 단편, 융합 단백질 또는 양특이성 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 DNA 서열에 관한 것일 수 있다. 코딩 및 발현될 수 있는 예시적인 서열은 항-CD20 MAb 또는 그의 항원 결합 단편, 적어도 하나의 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 적어도 하나의 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 적어도 하나의 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 제1 및 제2 항체는 항-CD20 항체, 종양 또는 CD4, CD5, CD8 CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, ED-B 피브로넥틴, IL-2, IL-6, IL-25, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MIF, NCA-66, Ia, HM1.24, HLA-DR, 테나신, T101, TAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, VEGFR, EGFR, PlGF, ILGF, ILGF-1R, Flt-1, Flt-3, 테나신, 보체 인자 C5, 암유전자 산물, Kras, cMET, bcl-2, bcl-6, 및/또는 표적가능한 구축물 상의 합텐과 같은 B-세포 관련 항원에 대한 항체를 포함할 수 있다.Another embodiment may relate to a DNA sequence containing a nucleic acid encoding an antibody, an antigen binding fragment thereof, a fusion protein or a bispecific antibody. Exemplary sequences that can be encoded and expressed include anti-CD20 MAbs or antigen binding fragments thereof, fusion proteins comprising at least one anti-CD20 antibody or antigen binding fragments thereof, at least one first antibody or antigen binding fragments thereof, and A fusion protein comprising at least one second antibody or antigen binding fragment thereof. The first and second antibodies are anti-CD20 antibodies, tumors or CD4, CD5, CD8 CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD95, CD126, CD133, CD138, CD154, CEACAM6, ED-B Fibronectin, IL-2, IL-6, IL-25 , MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MIF, NCA-66, Ia, HM1.24, HLA-DR, Tenasin, T101, TAC, TRAIL-R1, TRAIL-R2, VEGFR, EGFR, PlGF, ILGF, ILGF- Against B-cell related antigens such as 1R, Flt-1, Flt-3, tenasin, complement factor C5, oncogene products, Kras, cMET, bcl-2, bcl-6, and / or hapten on targetable constructs It may include an antibody.

다양한 구현예는 상기 코딩 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 키메라, 인간화 또는 인간 가변 영역 서열이 부착될 수 있는 인간 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 불변 영역 및 힌지 영역을 코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 상기 벡터는 선별된 숙주 세포에서 MAb를 발현하는 프로모터, 면역글로불린 인핸서 및 신호 또는 리더(leader) 서열을 추가로 함유할 수 있다. 특히 유용한 벡터는 pdHL2 또는 GS이다. 더욱 바람직하게는, 상기 경쇄 및 중쇄 불변 영역 및 힌지 영역은 선택적으로 알로타입(allotype) 위치 내의 적어도 하나의 아미노산이 상이한 IgG1 알로타입에서 발견되는 것으로 변화된 인간 EU 골수종 면역글로불린으로부터 유래될 수 있으며, 선택적으로는 EU 번호 시스템에 기반하여 EU의 중쇄 253번 아미노산이 알라닌으로 교체될 수 있다. Edelman et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 63:78-85 (1969) 참조.Various embodiments relate to expression vectors comprising said coding DNA sequences. The vector may contain sequences encoding light and heavy chain constant and hinge regions of human immunoglobulins to which chimeric, humanized or human variable region sequences may be attached. The vector may further contain a promoter, an immunoglobulin enhancer and a signal or leader sequence that expresses MAb in the selected host cell. Particularly useful vectors are pdHL2 or GS. More preferably, the light and heavy chain constant and hinge regions can be derived from human EU myeloma immunoglobulin, wherein at least one amino acid in the allotype position has been changed to be found in a different IgG1 allotype, and is selective Based on the EU numbering system, amino acid amino acid 253 of the heavy chain can be replaced with alanine. Edelman et al., Proc . Natl . Acad . Sci . See USA 63: 78-85 (1969).

또한, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 융합 단백질의 발현 방법이 포함된다. 숙련된 당업자는 유전공학적으로 가공된 발현 구축물 및 가공된 단백질을 발현하는 숙주 세포 내로 삽입하는 방법이 본 기술분야에 잘 알려져 있고 일상적인 실험의 문제임을 인식할 것이다. 숙주 세포 및 클로닝된 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 방법은 예를 들면 각각의 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 2005년 7월 25일에 출원된 미국 특허 출원 제11/187,863호; 2005년 10월 20일에 출원된 제11/253,666호 및 2006년 7월 14일에 출원된 제11/487,215호에 개시되어 있다.Also included are methods of expressing antibodies or antigen binding fragments or fusion proteins thereof. Those skilled in the art will recognize that genetically engineered expression constructs and methods of incorporating the processed proteins into host cells are well known in the art and are a matter of routine experimentation. Methods of expressing host cells and cloned antibodies or antigen-binding fragments are described, for example, in US Patent Application No. 11 / 187,863, filed on July 25, 2005, wherein each example portion is incorporated herein by reference. ; 11 / 253,666, filed October 20, 2005 and 11 / 487,215, filed July 14, 2006.

항-term- CD20CD20 항체의 구축을 위한 일반적인 기술 General Techniques for Constructing Antibodies

항-CD20 항체에 대한 Vκ(경쇄 가변부) 및 VH(중쇄 가변부) 서열은 RT-PCR, 5'-RACE 및 CDNA 라이브러리 스크리닝과 같은 다양한 분자 클로닝 절차에 의해 얻어질 수 있다. 구체적으로, 설치류 항-CD20 MAb를 발현하는 세포 유래의 항-CD20 MAb의 V 유전자는 PCR 증폭에 의해 클로닝 및 서열분석될 수 있다. 그 진성(authenticity)을 확인하기 위하여, 클로닝된 VL 및 VH 유전자는 올랜디 등에 의해 개시된 바와 같이 키메라 Ab로서 세포 배양물에서 발현될 수 있다(Orlandi et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 86:3833 (1989)). V 유전자 서열에 기반하여, 렁 등에 의해 개시된 바와 같이 인간화 항-CD20 MAb가 디자인되고 구축될 수 있다(Leung et al., Mol . Immunol., 32:1413 (1995)).V κ (light chain variable region) and V H (heavy chain variable region) sequences for anti-CD20 antibodies can be obtained by various molecular cloning procedures such as RT-PCR, 5'-RACE and CDNA library screening. Specifically, the V gene of anti-CD20 MAb from cells expressing rodent anti-CD20 MAb can be cloned and sequenced by PCR amplification. To confirm its authenticity, the cloned V L and V H genes can be expressed in cell culture as chimeric Abs, as disclosed by Orlando et al. (Orlandi et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 86: 3833 (1989 )). Based on the V gene sequence, humanized anti-CD20 MAbs can be designed and constructed as disclosed by Leung et al. (Leung et al., Mol . Immunol ., 32: 1413 (1995)).

cDNA는 설치류 항-CD20 MAb를 생산하는 임의의 공지된 하이브리도마 주 또는 전달감염 세포주로부터 일반적인 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning , A laboratory manual, 2nd Ed (1989)). MAb에 대한 Vκ 서열은 프라이머 VK1BACK 및 VK1FOR(Orlandi et al., 1989) 또는 렁 등에 의해 개시된 확장된 프라이머(Leung et al., BioTechniques, 15:286 (1993))를 이용하여 증폭될 수 있다. 상기 VH 서열은 상기 프라이머쌍 VH1BACK/VH1FOR(Orlandi et al., 1989) 또는 렁 등에 의해 개시된 설치류 IgG의 불변 영역에 어닐링하는 프라이머(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))를 이용하여 증폭될 수 있다.cDNA can be prepared by general molecular cloning techniques from any known hybridoma or transfected cell line producing rodent anti-CD20 MAb (Sambrook et al., Molecular Cloning , A laboratory manual , 2 nd Ed (1989). V κ sequences for MAbs can be amplified using extended primers (Leung et al., BioTechniques , 15: 286 (1993)) disclosed by primers VK1BACK and VK1FOR (Orlandi et al., 1989) or Lung et al. The V H sequence uses primers annealed to the constant region of rodent IgG disclosed by the primer pair VH1BACK / VH1FOR (Orlandi et al., 1989) or by Rung et al. (Leung et al., Hybridoma , 13: 469 (1994)). Can be amplified.

10 ㎕의 제1 사슬 cDNA 산물, 10 ㎕의 10X PCR 완충액[500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM MgCl2 및 0.01%(w/v) 젤라틴](Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 250 μM의 각각의 dNTP, 200 nM의 프라이머 및 5 유닛의 Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus)를 함유하는 PCR 반응 혼합물로 30 사이클의 PCR을 수행할 수 있다. 각각의 PCR 사이클은 바람직하게는 94℃에서 1분 동안 변성, 50℃에서 1.5분 동안 어닐링 및 72℃에서 1.5분 동안 중합으로 이루어진다. 증폭된 Vκ 및 VH 단편은 2% 아가로즈(BioRad, Richmond, CA) 상에서 정제될 수 있다. 인간화 V 유전자는 렁 등에 의해 개시된 바와 같이 긴 올리고뉴클레오티드 주형 합성과 PCR 증폭의 조합에 의해 구축될 수 있다(Leung et al., Mol . Immunol., 32:1413 (1995)).10 μl of first chain cDNA product, 10 μl of 10 × PCR buffer [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM MgCl 2 and 0.01% (w / v) gelatin] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk , CT), a PCR reaction mixture containing 250 μM of each dNTP, 200 nM of primers and 5 units of Taq DNA polymerase (Perkin Elmer Cetus) can be performed for 30 cycles of PCR. Each PCR cycle preferably consists of denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 50 ° C. for 1.5 minutes and polymerization at 72 ° C. for 1.5 minutes. Amplified V κ and V H fragments can be purified on 2% agarose (BioRad, Richmond, CA). Humanized V genes can be constructed by a combination of long oligonucleotide template synthesis and PCR amplification, as described by Leung et al. (Leung et al., Mol . Immunol ., 32: 1413 (1995)).

Vκ에 대한 PCR 산물은 Ig 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 Vκ PCR 산물의 프레임내(in-frame) 라이게이션(ligateion)을 촉진시키는 편리한 제한 부위를 함유하는 pBR327-기반의 스테이징(staging) 벡터인 VKpBR과 같은 스테이징 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. VH에 대한 PCR 산물은 pBluescript-기반의 VHpBS와 같은 유사한 스테이징 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 해당 PCR 산물을 함유하는 개별 클론은 예를 들면 생거 등의 방법에 의해 서열분석될 수 있다(Sanger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 74:5463 (1977)).Within the frame of the PCR product Ig promoter, signal peptide sequence, and V κ PCR products for the V κ (in-frame) Ligation (ligateion) pBR327- based staging of (staging) containing convenient restriction sites to facilitate vector, Can be subcloned into a staging vector such as VKpBR. PCR products for V H can be subcloned into similar staging vectors such as pBluescript-based VHpBS. Individual clones containing the corresponding PCR product can be sequenced by, for example, Sanger et al. (Sanger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 74: 5463 (1977)).

Vκ 및 VH 서열과 함께 프로모터 및 신호 펩티드 서열을 함유하는 발현 카세트는 HindⅢ-BamHI 단편으로서 이중 제한 소화에 의해 각각 VKpBR 및 VHpBS로부터 절단될 수 있다. 상기 Vκ 및 VH 발현 카세트는 각각 pKh 및 pG1g와 같은 적당한 발현 벡터 내로 라이게이션될 수 있다(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994)). 상기 발현 벡터는 예컨대 골수종 Sp2/0-Ag14(ATCC, VA)와 같은 적당한 세포 내로 동시 전달감염될 수 있고, 히그로마이신 저항성이 있는 콜로니를 선별하며, 예를 들면 ELISA 분석에 의해 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 MAb를 생산하는 상등액(supernatant fluid)을 모니터링한다. 다른 한편으로, 상기 Vκ 및 VH 발현 카세트는 변형된 스테이징 벡터인 VKpBR2 및 VHpBS2 내에서 조립될 수 있고, 각각 XbaI/BamHI 및 XhoI/BamHI 단편으로 절단되며, 길스 등(Gilles et al., J. Immunol . Methods 125:191 (1989)) 및 로스만 등(Losman et al., Cancer, 80:2660 (1997))에 의해 개시된 것과 같이 pdHL2와 같은 단일 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 유용한 다른 벡터는 바르네스 등에 의해 개시된 것과 같은 GS 벡터이다(Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123 (2000)). 다른 적당한 포유동물 발현 시스템은 베르너 등에 의해 개시되어 있다(Werner et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 48(Ⅱ), Nr. 8, 870-880 (1998)).Expression cassettes containing promoter and signal peptide sequences along with the V κ and V H sequences can be cleaved from VKpBR and VHpBS by double restriction digests as HindIII-BamHI fragments, respectively. The V κ and V H expression cassettes can be ligated into suitable expression vectors such as pKh and pG1g, respectively (Leung et al., Hybridoma , 13: 469 (1994)). The expression vector can be co-transfected into suitable cells, such as, for example, myeloma Sp2 / 0-Ag14 (ATCC, VA) and selects colonies that are resistant to hygromycin, for example chimeric, humanized or by ELISA assays. Supernatant fluids that produce human anti-CD20 MAb are monitored. On the other hand, the V κ and V H expression cassettes can be assembled in modified staging vectors VKpBR2 and VHpBS2 and cleaved into XbaI / BamHI and XhoI / BamHI fragments, respectively, Gilles et al., J . Immunol Methods 125:. 191 ( 1989)) and Rothman, etc. (Losman et al, Cancer, 80 :. 2660 (1997) is subcloned into a single expression vector, such as pdHL2, as described by). Other vectors useful are GS vectors such as those disclosed by Barnes et al. (Barnes et al., Cytotechnology 32: 109-123 (2000)). Other suitable mammalian expression systems are disclosed by Werner et al. (Werner et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res . 48 (II), Nr. 8, 870-880 (1998)).

동시 전달감염 및 ELISA에 의한 항체 분비 클론의 분석은 다음과 같이 수행될 수 있다. 코 등의 문헌에 따라 약 10 ㎍의 VKpKh(경쇄 발현 벡터) 및 20 ㎍의 VHpG1g(중쇄 발현 벡터)를 사용하여 전기천공(electroporation)(Biorad, Richmond, CA)에 의해 5×106 SP2/0 골수종 세포를 전달감염시킬 수 있다(Co et al., J. Immunol., 148:1149 (1992)). 전달감염 후, 세포는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 완전한 HSFM 배지(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)로 37℃, 5% CO2에서 키울 수 있다. 선별 공정은 2일 후 500 유닛/㎖의 하이그로마이신의 최종 농도로 하이그로마이신 선별 배지(Calbiochem, San Diego, CA)를 첨가함으로써 시작될 수 있다. 콜로니는 전형적으로 전기천공 2-3주 후에 나타난다. 이후, 상기 배양물은 추가 분석을 위해 확장될 수 있다. 키메라, 인간화 또는 인간 중쇄의 선별에 양성인 트랜스펙토마 클론은 ELISA 분석에 의해 동정될 수 있다.Analysis of antibody secretion clones by simultaneous transfection and ELISA can be performed as follows. 5 × 10 6 SP2 / 0 by electroporation (Biorad, Richmond, CA) using about 10 μg of VKpKh (light chain expression vector) and 20 μg of VHpG1g (heavy chain expression vector) according to Koh et al. Myeloma cells can be transfected (Co et al., J. Immunol ., 148: 1149 (1992)). After transfection, cells can be grown at 37 ° C., 5% CO 2 in complete HSFM medium (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) in 96-well microtiter plates. The selection process can be started by adding hygromycin selection medium (Calbiochem, San Diego, Calif.) At a final concentration of 500 units / ml of hygromycin after 2 days. Colonies typically appear 2-3 weeks after electroporation. The culture can then be expanded for further analysis. Transfectoma clones positive for the selection of chimeric, humanized or human heavy chains can be identified by ELISA analysis.

항체는 다음과 같이 세포 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 트랜스펙토마 배양물은 혈청-부재 배지에 적응된다. 키메라 항체를 생산하기 위하여, 세포를 HSFM을 이용하여 회전하는 병에서 500 ㎖ 배양물로 키운다. 배양물을 원심분리하고, 상등액은 0.2 μ 막을 통해 여과한다. 여과된 배지는 1 ㎖/분의 유속으로 단백질 A 컬럼(1×3 ㎝)으로 통과된다. 이후, 상기 수지를 약 10 컬럼 부피의 PBS로 세척하고, 10 mM EDTA를 함유하는 0.1 M 글리산 완충액(pH 3.5)을 이용하여 단백질 A-결합된 항체를 상기 컬럼으로부터 용출한다. 1.0 ㎖의 분획을 10 ㎕의 3 M Tris(pH 8.6)를 함유하는 튜브내에 수집하고, 280/260 ㎚ 흡광도로부터 단백질의 농도를 결정한다. 피크 분획을 모으고, PBS에 대해 투석하고, 예를 들면 Centricon 30(Amicon, Beverly, MA)을 이용하여 항체를 농축한다. 항체의 농도는 ELISA에 의해 측정되며, PBS를 이용하여 그 농도를 약 1 ㎎/㎖로 조정한다. 0.01%(w/v)의 나트륨 아자이드가 방부제로 상기 샘플에 편리하게 첨가될 수 있다.Antibodies can be isolated from cell culture medium as follows. Transfectoma cultures are adapted to serum-free medium. To produce chimeric antibodies, cells are grown in 500 ml culture in a rotating bottle using HSFM. The culture is centrifuged and the supernatant is filtered through 0.2 μm membrane. The filtered medium is passed through a Protein A column (1 × 3 cm) at a flow rate of 1 ml / min. The resin is then washed with about 10 column volumes of PBS and protein A-bound antibody is eluted from the column using 0.1 M glycan buffer (pH 3.5) containing 10 mM EDTA. 1.0 ml fractions are collected in a tube containing 10 μl of 3 M Tris, pH 8.6, and the concentration of the protein is determined from the 280/260 nm absorbance. Peak fractions are collected and dialyzed against PBS and the antibody is concentrated using, for example, Centricon 30 (Amicon, Beverly, Mass.). The concentration of the antibody is measured by ELISA and the concentration is adjusted to about 1 mg / ml using PBS. 0.01% (w / v) sodium azide can be conveniently added to the sample as a preservative.

도 1은 키메라 항-CD20 항체인 cA20의 경쇄 가변부(cA20Vk) 및 중쇄 가변부(cA20VH) 서열을 나타낸다. CDR 영역 서열은 굵게 밑줄로 나타나 있다. 아미노산 잔기와 뉴클레오티드 번호는 순차적으로 매겨져 있으며, 도 2에 나타나 있는 인간화 V 서열에도 동일한 번호 시스템이 사용된다. 경쇄 가변 영역은 도 1a에 나타나 있으며(서열번호 7 및 8), 중쇄 가변 영역은 도 1b에 나타나 있다(서열번호 9 및 10). 카뱃 번호 도식(scheme)은 아미노산 잔기에 대해 사용되었다. 문자로 번호를 매긴 아미노산 잔기는 카뱃에 따른 삽입 잔기를 나타내며, 이전의 잔기와 동일한 번호를 갖는다.
도 2는 hA20 경쇄 hA20Vk의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(도 2a)(서열번호 11 및 12) 및 중쇄 hA20VH1(도 2b)(서열번호 13 및 14) 뿐만 아니라, 각각 VKpBR2(도 2a) 및 VHpBS2(도 2b) 스테이징 벡터의 인접한 서열을 나타낸다. 번역되지 않는 뉴클레오티드 서열은 소문자로 나타나 있다. 서브클로닝을 위해 사용되는 제한 부위는 밑줄로 표시하여 나타내었다. 분비 신호 펩티드 서열은 이중 밑줄로 나타나 있다.
도 3은 cA20의 가변 영역 서열(서열번호 8 및 10), 리툭시맙(설치류 C2B8 유래, 서열번호 15 및 16) 및 hA20(서열번호 12 및 14)을 비교한 것이다. 점들은 cA20과 상동성임을 나타낸다. CDR 서열은 박스로 나타나 있다. 중쇄(도 3a) 및 경쇄(도 3b) 가변 영역 서열이 나타나 있다.
도 4는 스캐차드 분석(Scatchard analysis)을 나타내며, 125I-표지된 MAb를 Raji 세포에 결합시킴으로써 벨투즈맙(veltuzumab) 및 리툭시맙의 결합 특성이 측정되어 있다. 삽도는 직접 세포 표면 포화 결합 및 스캐차드 플롯 분석으로서, 닫힌 삼각형은 벨투즈맙을, 원형은 리툭시맙을 나타낸다. Bmax 및 Kd는 프리즘 소프트웨어를 이용한 한 부위(one-site) 결합 모델을 이용한 비선형 회귀 분석에 의해 결정되었다. 상기 결과는 3번의 반복 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 살아있는 세포로부터의 벨투즈맙 및 리툭시맙의 오프-속도를 비교한 것이다. Daudi(A), Ramos(B) 및 Raji(C-E) 세포는 PE-표지된 리툭시맙(닫힌 삼각형), 벨투즈맙(닫힌 사각형), cA20(닫힌 역삼각형), D101N(닫힌 원), 1F5(열린 원) 또는 B1(tositumomab)(열린 사각형)로 염색되었다. 표지된 MAb를 과량의 벨투즈맙 Fab'-NEM의 존재(A-D) 및 부재(E)시 37℃에서 배양하였고, 세포를 유세포분석기로 시간에 따라 분석하였다. 해리 속도(off-rate)는 비선형 회귀(단일 상 지수적 붕괴)에 의해 결정되었으며, P-값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용한 F-테스트에 의해 생성되었다.
도 6은 비-호지킨 림프종 세포주의 증식에 대한 벨투즈맙 및 리툭시맙의 영향을 나타낸다. 항-증식 효과는 MTT 세포독성 분석에 의해 평가되었다. 세포는 가교용 제2 항체의 존재 또는 부재시 상기 MAb와 함께 배양되었다. 흰색 막대는 제2 항체가 없음을, 회색 막대는 GAH 제2 항체가 있음을, 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 7은 건강한 혈액 공여자로부터의 B-세포의 시험관내 소모를 나타낸다. 건강한 자원자로부터 유래한 말초혈 림프구에 대한 벨투즈맙의 효과는 유세포분석기를 이용하여 시험관내에서 평가되었다. 헤파린 처리된 건강한 자원자의 전혈을 벨투즈맙과 함께 2일 동안 배양한 후의 림프구 게이트 내에 존재하는 CD19+ 세포의 백분율의 감소가 나타나 있다. 각각의 선은 상이한 혈액 공여자를 타나낸다. 오차 막대는 SD를 나타낸다.
도 8은 산재성(disseminated) 벗킷 림프종 이종이식 모델에서 벨투즈맙에 대한 생존 곡선을 나타낸 것으로서, 복강내 투여 대 피하 투여를 비교한 것이다. C.B.17 SCID 마우스는 0일에 1.5×107 Daudi 세포로 정맥내 투여되었다. 벨투즈맙을 이용한 치료는 1일에 시작되었고, 벨투즈맙은 단일 복강내 또는 단일 피하 주사로 마우스에 투여하였다. 투여된 복용량은 60, 20 또는 5 ㎍ 벨투즈맙이었다. 대조군 마우스는 생리식염수 또는 60 ㎍의 hMN-14 IgG(Labetuzumab, 항-CEACAM5 이소타입 일치된 항체)를 복강내 주사하였다.
도 9는 벨투즈맙의 최소 효과 복용량을 산재성 버킷 림프종 이종이식 모델에서 결정하였다. C.B.17 SCID 마우스는 0일에 1.5×107 Daudi 세포로 정맥내 투여되었다. 벨투즈맙을 이용한 치료는 1일에 시작되었고, 벨투즈맙은 단일 복강내 또는 단일 피하 주사로 마우스에 투여하였다. 투여된 복용량은 0.5, 0.25, 0.1 또는 0.05 ㎍ 벨투즈맙이었다. 대조군 마우스는 200 ㎕의 생리식염수를 복강내 투여하였다.
도 10은 산재성 소낭 세포(follicular cell) 림프종을 갖고, 감소하는 복용량의 벨투즈맙으로 처리된 마우스의 대표적인 생존 곡선을 나타낸다. C.B.17 SCID 마우스는 0일에 2.5×106 WSU-FSCCL 세포로 정맥내 투여되었다. 5일에 마우스는 35, 3.5, 0.35 또는 0.035 ㎍의 복용량으로 벨투즈맙을 단일 복강내 주사로 투여하였다. 대조군 마우스는 생리식염수만을 투여하였다.
도 11은 항-림프종 활성에 대한 소모성 NK 세포 및 호중구의 효과를 SCID 마우스에서 평가하였다. C.B.17 SCID 마우스는 "방법" 부분에서 개시된 바와 같이 NK 및 호중구를 소모하였고, 1×106 Raji 세포로 정맥내 투여되었다. 벨투즈맙을 이용한 치료는 3일에 시작되었고, 3, 5, 7 및 11일에 200 ㎍의 벨투즈맙을 마우스에 정맥내 투여하였다. 대조군 마우스는 200 ㎕의 생리식염수를 투여하였다.
도 12는 혈청 약물동태학을 나타낸 것으로서, 벨투즈맙(150 ㎍)을 나이브(naive) 스위스-웹스터 마우스에 복강내 또는 피하 경로를 통해 투여하였다. 14일의 기간에 걸쳐 동물을 채혈하였고, 실시예 11에 개시된 것과 같이 벨투즈맙 농도에 대해 혈청을 분석하였다(N=6).
도 13은 SCID 마우스에서 시험관내 림프종의 성장을 조절함에 있어서 벨투즈맙이 리툭시맙보다 더 효과적임을 보여준다. SCID 마우스는 꼬리 정맥 주사에 의해 Raji 세포를 접종하였다. +5, +10, +15 및 +20일에 상기 마우스는 10 ㎎/㎏/복용량으로 리툭시맙 또는 벨투즈맙(hA20)을 투여하였다. 벨투즈맙으로 처리하면 동일한 복용량의 리툭시맙으로 치료한 것과 비교하여 누적 생존 시간이 현저하게 긴 것으로 나타났다(P=0.005).
도 14는 비-호지킨 림프종에서의 벨투즈맙 효과의 인간 연구에서 24명의 소낭성 림프종 반응자에 대한 반응 기간(duration of response, DR) 및 진행 시간(time to progression, TTP)의 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 추정값을 나타낸다.
도 15는 기준선(baseline), 투여 전 2, 3 및 4주, 투여 후 4주 및 12주 후, 이후에는 마지막 투여 후 3개월의 간격으로 12개월까지 측정된 상이한 복용량 군에서의 벨투즈맙으로 처리된 NHL 환자의 B-세포 레벨을 나타낸다.Figure 1 shows the light chain variable region (cA20Vk) and heavy chain variable region (cA20VH) sequence of the chimeric anti-CD20 antibody cA20. CDR region sequences are underlined in bold. Amino acid residues and nucleotide numbers are numbered sequentially, and the same numbering system is used for the humanized V sequences shown in FIG. Light chain variable regions are shown in FIG. 1A (SEQ ID NOS: 7 and 8), and heavy chain variable regions are shown in FIG. 1B (SEQ ID NOs: 9 and 10). The Kabat number scheme was used for amino acid residues. Letter numbered amino acid residues represent insertion residues according to Kabat and have the same number as the previous residues.
FIG. 2 shows the nucleotide and amino acid sequences of hA20 light chain hA20Vk (FIG. 2A) (SEQ ID NOS: 11 and 12) and heavy chain hA20VH1 (FIG. 2B) (SEQ ID NOs: 13 and 14), as well as VKpBR2 (FIG. 2A) and VHpBS2 (FIG. 2B). ) Adjacent sequences of the staging vector. Untranslated nucleotide sequences are shown in lowercase letters. Restriction sites used for subcloning are underlined. Secretory signal peptide sequences are shown with double underlines.
Figure 3 compares the variable region sequences of cA20 (SEQ ID NOs: 8 and 10), Rituximab (derived from rodent C2B8, SEQ ID NOs: 15 and 16) and hA20 (SEQ ID NOs: 12 and 14). Dots indicate homology with cA20. CDR sequences are shown as boxes. The heavy chain (FIG. 3A) and light chain (FIG. 3B) variable region sequences are shown.
4 shows Scatchard analysis, where the binding properties of veltuzumab and rituximab are measured by binding 125 I-labeled MAbs to Raji cells. Inset is direct cell surface saturation binding and Scatchard plot analysis, with closed triangles representing beltuzumab and circles showing rituximab. B max and K d were determined by nonlinear regression analysis using a one-site binding model using Prism software. The results represent the results of three replicate experiments.
5 compares the off-rates of beltuzumab and rituximab from living cells. Daudi (A), Ramos (B) and Raji (CE) cells were PE-labeled Rituximab (closed triangle), Beltuzumab (closed square), cA20 (closed inverted triangle), D101N (closed circle), 1F5 ( Open circles) or B1 (tositumomab) (open squares). Labeled MAbs were incubated at 37 ° C. in the presence (AD) and absence (E) of excess Veltumab Fab'-NEM, and cells were analyzed over time by flow cytometry. The dissociation rate (off-rate) was determined by nonlinear regression (single phase exponential decay) and P-values were generated by F-test using GraphPad Prism software.
6 shows the effect of beltumab and rituximab on proliferation of non-Hodgkin's lymphoma cell lines. Anti-proliferative effect was assessed by MTT cytotoxicity assay. Cells were incubated with the MAb in the presence or absence of a second antibody for crosslinking. White bars indicate no second antibody, gray bars indicate GAH second antibody, and error bars indicate SD.
7 shows in vitro consumption of B-cells from healthy blood donors. The effect of beltuzmab on peripheral blood lymphocytes from healthy volunteers was assessed in vitro using flow cytometry. A decrease in the percentage of CD19 + cells present in the lymphocyte gate after incubating the whole blood of the heparinized healthy volunteers with veltuzmab for 2 days is shown. Each line represents a different blood donor. Error bars represent SD.
FIG. 8 shows survival curves for Beltuzumab in a dissipated Bkitkit lymphoma xenograft model, comparing intraperitoneal versus subcutaneous administration. CB17 SCID mice were administered intravenously on day 0 with 1.5 × 10 7 Daudi cells. Treatment with veltumab began on day 1 and veltumab was administered to mice in a single intraperitoneal or single subcutaneous injection. The dose administered was 60, 20 or 5 μg Beltuzumab. Control mice were injected intraperitoneally with saline or 60 μg of hMN-14 IgG (Labetuzumab, anti-CEACAM5 isotype matched antibody).
9 Minimal effect dose of veltumab was determined in an interspersed Burkitt's lymphoma xenograft model. CB17 SCID mice were administered intravenously on day 0 with 1.5 × 10 7 Daudi cells. Treatment with veltumab began on day 1 and veltumab was administered to mice in a single intraperitoneal or single subcutaneous injection. The dose administered was 0.5, 0.25, 0.1 or 0.05 μg Beltuzumab. Control mice were administered intraperitoneally with 200 μl of saline.
10 shows representative survival curves of mice with scattered follicular cell lymphomas and treated with decreasing doses of veltumab. CB17 SCID mice were administered intravenously with 2.5 × 10 6 WSU-FSCCL cells on day 0. On day 5 mice were administered beltuzumab in a single intraperitoneal injection at doses of 35, 3.5, 0.35 or 0.035 μg. Control mice received only saline.
FIG. 11 assessed the effect of consuming NK cells and neutrophils on anti-lymphoma activity in SCID mice. CB17 SCID mice consumed NK and neutrophils as disclosed in the “Method” section and were administered intravenously as 1 × 10 6 Raji cells. Treatment with veltumab began on day 3 and mice were administered intravenously with 200 μg of veltumab on days 3, 5, 7 and 11. Control mice received 200 μl of saline.
FIG. 12 shows serum pharmacokinetics, where Beltuzumab (150 μg) was administered to naïve Swiss-Webster mice via the intraperitoneal or subcutaneous route. Animals were bled over a 14 day period and sera were analyzed for Beltuzumab concentrations as described in Example 11. (N = 6).
13 shows that beltuzmab is more effective than rituximab in regulating the growth of lymphoma in vitro in SCID mice. SCID mice were inoculated with Raji cells by tail vein injection. At +5, +10, +15 and +20 days, the mice were administered rituximab or veltumab (hA20) at 10 mg / kg / dose. Treatment with veltumab showed a significantly longer cumulative survival time compared to treatment with the same dose of rituximab ( P = 0.005).
FIG. 14 shows Kaplan-Meier (Kaplan) of duration of response (DR) and time to progression (TTP) for 24 follicular lymphoma responders in a human study of the Beltuzumab effect in non-Hodgkin's lymphoma. -Meier) Show estimates.
FIG. 15 is treated with veltumab in different dose groups measured up to 12 months at baseline, 2, 3 and 4 weeks prior to dosing, 4 and 12 weeks after dosing, and then 3 months after the last dose. B-cell levels of NHL patients.

실시예Example 1.  One. 키메라chimera 및 인간화 항- And humanized anti- CD20CD20 항체의 구축 Construction of Antibodies

키메라(cA20) 및 인간화(hA20, 벨투즈맙) 항-CD20 항체의 구축은 그 실시예 부분이 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 미국 특허 제7,151,164호에 개시된 바와 같이 수행하였다(또한, Stein et al., Clin Cancer Res 2004; 10:2868-2878 참조). cA20 및 hA20의 가변 영역 및 DNA 및 아미노산 서열은 각각 도 1 및 도 2에 개시되어 있다.The construction of chimeric (cA20) and humanized (hA20, beltuzmab) anti-CD20 antibodies was performed as disclosed in US Pat. No. 7,151,164, the example part of which is incorporated herein by reference (also, Stein et al. , Clin Cancer Res 2004; 10: 2868-2878). The variable region and DNA and amino acid sequences of cA20 and hA20 are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.

cA20 및 hA20의 CDR 서열은 중쇄의 세 번째 CDR(CDRH3)을 제외하고는 리툭시맙(양친 설치류 MAb C2B8)의 것과 동일하다. 편리상, 중쇄 CDR 서열은 CDRH1-H3으로, 경쇄 CDR은 CDRL1-L3으로 나타낸다. 항-CD20 항체에 대해 보고된 CDRH3 서열 중에서, C2B8 및 대응하는 리툭시맙 만이 카뱃 위치 101에서 아스파라긴 잔기를 갖는다.The CDR sequences of cA20 and hA20 are identical to that of rituximab (parent rodent MAb C2B8) except for the third CDR of the heavy chain (CDRH3). For convenience, the heavy chain CDR sequences are represented by CDRH1-H3 and the light chain CDRs are represented by CDRL1-L3. Of the CDRH3 sequences reported for anti-CD20 antibodies, only C2B8 and the corresponding rituximab have asparagine residues at Kabat position 101.

벨투즈맙(hA20)의 골격 영역 서열은 인간화 항-CD22 항체인 에프라투즈맙과 같이 동일한 인간 IgG 공여자 골격 영역(FR)을 이용하여 구축하였다(Leung et al., Mol Immunol 1995; 32:1413-1427). 구체적으로, 인간 EU 항체의 FR1, FR2 및 FR3 및 인간 NEWM 항체의 FR4를 인간화 hA20 항체의 중쇄용으로 선택하였고, 인간 REI 항체의 FR을 경쇄용으로 선택하였다. 미국 특허 제7,151,164호에 개시된 바와 같이, 양친 설치류 항체의 경우와 유사한 CD20에 대한 벨투즈맙의 결합 특이성 및 친화성을 유지하도록 핵심 설치류 잔기는 FR 내에 함유되어 있다. hA20의 중쇄(hA20VH1)는 인간 EU 골격으로부터 9개의 변화를 함유하며, hA20의 경쇄(hA20Vk)는 REI 골격으로부터 7개의 아미노산 변화를 함유한다(미국 특허 제7,151,164).Skeletal region sequences of beltuzumab (hA20) were constructed using the same human IgG donor skeletal region (FR) as the humanized anti-CD22 antibody, epratumab (Leung et al., Mol Immunol 1995; 32: 1413-1427 ). Specifically, FR1, FR2 and FR3 of human EU antibody and FR4 of human NEWM antibody were selected for heavy chain of humanized hA20 antibody and FR of human REI antibody was selected for light chain. As disclosed in US Pat. No. 7,151,164, key rodent residues are contained within the FRs to maintain the binding specificity and affinity of Beltuzumab for CD20 similar to that of parental rodent antibodies. The heavy chain of hA20 (hA20VH1) contains 9 changes from the human EU backbone, and the light chain of hA20 (hA20Vk) contains 7 amino acid changes from the REI backbone (US Pat. No. 7,151,164).

cA20, hA20 및 리툭시맙(c2B8 유래)의 가변 영역 서열의 비교는 도 3에 나타나 있다. 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, cA20은 가변부 골격에서 벨투즈맙(hA20)과 다르지만, 벨투즈맙과 동일한 CDR을 갖는다. cA20의 골격 영역 서열은 경쇄의 N-말단에서의 3개 아미노산 잔기를 제외하고는 리툭시맙(c2B8)의 것과 동일하지만, 리툭시맙과 벨투즈맙의 골격 영역 서열은 경쇄에서 18개 잔기가, 중쇄에서 14개 잔기가 다르다. 리툭시맙의 CDR 서열은 VH CDR3의 카뱃 위치 101에서만 벨투즈맙(hA20) 및 cA20의 것과 다르다.A comparison of the variable region sequences of cA20, hA20 and rituximab (derived from c2B8) is shown in FIG. 3. As shown in FIGS. 3A and 3B, cA20 differs from veltumab (hA20) in the variable region backbone, but has the same CDRs as veltumab. The backbone region sequence of cA20 is identical to that of rituximab (c2B8) except for the three amino acid residues at the N-terminus of the light chain, whereas the backbone region sequence of rituximab and veltuzmab has 18 residues in the light chain, 14 residues in the heavy chain are different. The CDR sequences of Rituximab differ from those of Beltuzumab (hA20) and cA20 only at Kabat position 101 of V H CDR3.

하기 실시예에 개시된 것과 같이, 벨투즈맙과 리툭시맙은 CD20 양성 림프종 세포로부터 해리되는 속도와 생체내 및 시험관내에서의 특정한 치료 특성의 측면에서 현저하게 다르다. 이러한 특성의 변화가 골격 서열 또는 VH CDR3의 카뱃 위치 101에서 Asp 대신 Asn으로 치환시킨 차이로부터 기인하는지 여부를 결정하기 위하여, CDRH3 내의 위치 101에서 아스파르트산을 아스파라긴으로 비-보존적 단일 아미노산 변화를 갖도록 D101N으로 나타낸 벨투즈맙의 돌연변이체를 가공하였다. 따라서, D101N은 리툭시맙과 동일한 CDR을 갖지만 FR은 벨투즈맙과 동일하다. D101N 구축의 보다 상세한 사항은 아래에 개시되어 있다. 표 1은 벨투즈맙, cA20, D101N, 리툭시맙 및 1F5의 CDRH3 서열을 비교한 것으로서, 이들 모두는 동일한 CDRH1 및 CDRH2 서열을 갖는다.As disclosed in the examples below, beltuzumab and rituximab differ markedly in terms of rate of dissociation from CD20 positive lymphoma cells and specific therapeutic properties in vivo and in vitro. To determine whether this change in property is due to a difference in the backbone sequence or the substitution of Asn for Asp at Kabat position 101 of V H CDR3, a non-conservative single amino acid change in aspartic acid to asparagine at position 101 in CDRH3 The mutant of Beltuzumab, represented by D101N, was processed to have. Thus, D101N has the same CDRs as Rituximab but FR is identical to Beltuzumab. More details of the D101N implementation are disclosed below. Table 1 compares the CDRH3 sequences of Beltuzumab, cA20, D101N, Rituximab and 1F5, all of which have identical CDRH1 and CDRH2 sequences.

CDRH3의 비교1 Comparison of CDRH3 1 카뱃 번호Kabat number 9595 100100 101101 102102 벨투즈맙Beltuzmab SS TT YY YY GG GG -- DD WW YY FF DD VV D101ND101N ●● ●● ●● ●● ●● ●● -- ●● ●● ●● ●● NN ●● cA20cA20 ●● ●● ●● ●● ●● ●● -- ●● ●● ●● ●● ●● ●● 리툭시맙Rituximab ●● ●● ●● ●● ●● ●● -- ●● ●● ●● ●● NN ●● 1F51F5 ●● HH ●● GG SS NN YY VV DD ●● ●● ●● YY

1: ●로 표시된 잔기는 동일한 위치에서 벨투즈맙의 것과 동일하다.
The residue marked with 1: is identical to that of beltuzumab at the same position.

실시예 2. 벨투즈맙의 D101N 서열 변이체의 구축Example 2. Construction of D101N Sequence Variants of Veltuzumab

모든 제한 엔도뉴클레아제 및 다른 효소들은 New England Bolabs(Beverly, MA)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 Sigma Genosys(Haverhill, UK)에 의해 합성하였다. PCR 반응은 Amplitaq 중합효소(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 Perkin Elmer(Wellesley, MA) GeneAmp PCR 시스템 9600을 이용하여 수행하였다. 주형으로 hA20-pdHL2(미국 특허 제7,151,164 참조) 벡터를 이용하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍으로 5'D101N (cggtgactggtacttcaatgtctggggccaaggcaccacg 서열번호 17) 및 3'Hind3 (aaagcttgcggccgcgatcc 서열번호 18) 또는 3'D101N (cgtggtgccttggccccagacattgaagtaccagtcaccg 서열번호 19) 및 5'XhoI (cctcgagcacacaggacctc 서열번호 20)을 이용한 2번의 PCR 반응으로 각각 210 bp 또는 510 bp의 증폭물을 제조하였다. 주형으로 상기 210 bp 및 510 bp 산물의 혼합물을 이용하고 5'XhoI 및 3'Hind3 프라이머를 이용한 세 번째 PCR 반응으로 680 bp 증폭물을 제조하였으며, 이를 겔로 단리하고, pGemT PCR 클로닝 벡터(Promega, Madison, WI) 내로 클로닝하였다. 상기 증폭물의 서열은 자동화 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 상기 680 bp 단편은 XhoI 및 HindⅢ 제한 효소를 이용하여 pGemT 벡터로부터 잘라내었고, 동일한 효소로 소화시켜 준비한 hA20-pdHL2 벡터 내로 라이게이션시켰다. 최종 벡터인 D101N-hA20-pdHL2의 서열은 자동화 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
All restriction endonucleases and other enzymes were purchased from New England Bolabs (Beverly, Mass.). Oligonucleotides were synthesized by Sigma Genosys (Haverhill, UK). PCR reactions were performed using Amplitaq polymerase (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) And Perkin Elmer (Wellesley, Mass.) GeneAmp PCR system 9600. Using the hA20-pdHL2 (see US Pat. No. 7,151,164) vector as a template, 5'D101N (cggtgactggtacttcaatgtctggggccaaggcaccacg SEQ ID NO: 17) and 3'Hind3 (aaagcttgcggccgcgatcc SEQ ID NO: 18) or 3'D101gtt (cgtggcccatgacc) with oligonucleotide primer pairs ) And 2 PCR reactions using 5'XhoI (cctcgagcacacaggacctc SEQ ID NO: 20) to prepare amplification of 210 bp or 510 bp, respectively. Using a mixture of the 210 bp and 510 bp products as a template and a third PCR reaction using 5'XhoI and 3'Hind3 primers, a 680 bp amplification product was prepared, isolated by gel, and a pGemT PCR cloning vector (Promega, Madison). , WI). The sequence of the amplification was confirmed by automated DNA sequencing. The 680 bp fragment was cut out of the pGemT vector using XhoI and HindIII restriction enzymes and ligated into the hA20-pdHL2 vector prepared by digestion with the same enzyme. The sequence of the final vector, D101N-hA20-pdHL2, was confirmed by automated DNA sequencing.

실시예 3. 항-CD20 항체 결합의 스캐차드 분석Example 3. Scatchard Analysis of Anti-CD20 Antibody Binding

세포주Cell line

하기 실시예에서, 설치류 하이브리도마 1F5 및 인간 버킷 림프종 주인 Daudi, Raji 및 Ramos는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 구입하였다. 사용된 비-버킷 림프종 세포주는 알란 엡스테인 박사(Dr. Alan Epstein, University of Southern California, Los Angeles, CA)로부터 입수한 SU-DHL-6 및 미쉘 스미스 박사(Dr. Mitchell Smith, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA)로부터 입수한 WSU- FSCCL 였다. 상기 세포는 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100 유닛/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖) 및 L-글루타민(2 mM)이 보충된 DMEM(Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD)에서 부유 배양물로 키웠다.In the examples below, rodent hybridoma 1F5 and human Burkitt's lymphoma hosts Daudi, Raji and Ramos were purchased from the American Type Culture Collection, Manassas, VA. The non-bucket lymphoma cell lines used were SU-DHL-6 and Dr. Mitchell Smith, Fox Chase Cancer Center obtained from Dr. Alan Epstein, University of Southern California, Los Angeles, CA. , Philadelphia, PA). The cells were suspended in DMEM (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD) supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin (100 units / ml), streptomycin (100 μg / ml) and L-glutamine (2 mM). Raised with water.

스캐차드 분석Scatchard Analysis

Raji 세포 당 최대 결합 부위의 수 및 벨투즈맙 및 리툭시맙의 외관상(apparent) 해리 상수는 프리즘 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 방사성요오드화 샘플 및 Raji 세포를 이용하여 얻은 포화 결합 데이터의 비선형 회귀 분석에 의해 결정하였다. Raji 세포(5×105)는 225 ㎕의 분석 부피로 조직 배양 배지를 희석액으로 이용하여 37℃ 또는 실온에서 1시간 동안 방사성요오드화 MAb로 배양하였다. 이후, 세포를 1% 말 혈청을 함유하는 PBS로 2회 세척하였고, 세포 펠렛을 감마 카운터로 카운트하였다. 상기 MAb를 대략 2×106 cpm/2 ㎍ MAb/튜브를 시작으로 2:3 순차적으로 희석하여 적정하였으며, 3회 반복하였다. 비특이적 결합은 복제 비표지 MAb를 포함함으로써 측정하였다. 항-이디오타입(idiotype) 항체에 결합시킴으로써 측정된 방사성표지된 MAb의 면역활성은 90% 이상이었다.The maximum number of binding sites per Raji cell and the apparent dissociation constants of beltuzmab and rituximab are saturations obtained using radioiodized samples and Raji cells using Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, Calif.). Determined by nonlinear regression analysis of binding data. Raji cells (5 × 10 5 ) were incubated with radioiodide MAb for 1 hour at 37 ° C. or room temperature using tissue culture medium as a dilution in an assay volume of 225 μl. Cells were then washed twice with PBS containing 1% horse serum and cell pellet counted with a gamma counter. The MAb was titrated by diluting 2: 3 sequentially starting at approximately 2 × 10 6 cpm / 2 μg MAb / tube and repeated three times. Nonspecific binding was determined by including a replication unlabeled MAb. The radioactivity of radiolabeled MAbs measured by binding to anti-idiotype antibodies was greater than 90%.

도 4에 나타낸 결과는 세포당 결합 위치의 수와 평형 해리 상수(기능적 Kd) 모두 벨투즈맙 및 리툭시맙에 있어서 유사함을 보여준다. Raji 세포당 결합 위치의 수는 벨투즈맙의 경우 2.0×105-4.2×105 범위였고, 리툭시맙의 경우 1.8×105-3.6×105 범위로 계산되었다. 복제 분석에서, 외관상 해리 상수값은 벨투즈맙의 경우 6.23-12.02 nM 범위였고, 리툭시맙의 경우 6.70-8.63 nM 범위였다. 상기 값들은 본 발명자들 및 다른 사람들에 의해 이전에 보고된 값 뿐만 아니라 리툭시맙에 대한 처방 정보의 값과 유사하다(Melhus et al., Cancer Biother . Radiopharm., 22:469-479, 2007; Stein et al., Clin. Cancer Res., 10:2868-2878, 2004).
The results shown in FIG. 4 show that both the number of binding sites per cell and the equilibrium dissociation constant (functional K d ) are similar for veltumab and rituximab. The number of binding sites per Raji cell ranged from 2.0 × 10 5 -4.2 × 10 5 for veltuzmab and 1.8 × 10 5 -3.6 × 10 5 for rituximab. In replication analysis, apparent dissociation constant values ranged from 6.23-12.02 nM for veltumab and 6.70-8.63 nM for rituximab. These values are similar to the values previously reported by the inventors and others as well as the values of prescription information for rituximab (Melhus et al., Cancer Biother . Radiopharm ., 22: 469-479, 2007; Stein et al., Clin. Cancer Res ., 10: 2868-2878, 2004).

실시예 4. 경쟁적 세포 표면 결합 분석Example 4. Competitive Cell Surface Binding Assay

단백질 A 컬럼 상에서 친화 크로마토그래피에 의해 정제된 항-CD20 Ab인 cA20, hA20 및 c1F5의 Ag(항원)-결합 특이성 및 친화성 연구는 설치류 2B8 및 리툭시맙(IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, CA)을 이용한 세포 표면 경쟁적 결합 분석에 의해 평가하였다. 일정한 양(100,000 cpm, ∼10 μCi/㎍)의 125I-표지된 m2B8 또는 리툭시맙을 다양한 농도(0.2-700 nM)의 경쟁 Ab(cA20, hA20, m2B8, c1F5, 또는 리툭시맙)의 존재 하에 Raji 세포와 함께 4℃에서 1-2시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 Ab는 BPS로 세포를 세척함으로써 제거하였다. 세척 후 세포와 관련된 방사능을 측정하였다. 그 결과(나타내지 않음), cA20, hA20 및 cIF5 모두 리툭시맙(c2B8) 및 설치류 2B8과 CD20에 결합하기 위해 경쟁한다는 것을 보여주었다.
Ag (antigen) -binding specificity and affinity studies of anti-CD20 Abs, cA20, hA20, and c1F5, purified by affinity chromatography on a Protein A column, were described in rodents 2B8 and rituximab (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, CA). ) By cell surface competitive binding assay. Constant amounts (100,000 cpm, ˜10 μCi / μg) of 125 I-labeled m2B8 or rituximab at various concentrations (0.2-700 nM) of competing Abs (cA20, hA20, m2B8, c1F5, or rituximab) Incubated with Raji cells for 1-2 hours at 4 ℃ in the presence. Unbound Ab was removed by washing the cells with BPS. After washing the radioactivity associated with the cells was measured. The results (not shown) showed that cA20, hA20 and cIF5 all compete for binding to rituximab (c2B8) and rodent 2B8 and CD20.

실시예Example 5. 해리 또는  5. Harry or 오프off -속도의 비교Speed comparison

Daudi, Raji 및 Ramos 세포를 이용하여 유세포 분석기로 벨투즈맙, 리툭시맙, cA20, D101N, 1F5 및 토시투모맙(항-CD20, BEXXAR®, GlaxoSmithKline)의 해리 속도를 비교하였다(도 5). 각각의 MAb는 제조사에서 제시한 프로토콜(Invitrogen, Molecular Probes, Z-25455)을 따라 Zenon R-Phycoerythrin Human IgG 표지 키트를 이용하여 피코에리트린(PE)으로 표지하였다. 1×106 세포/㎖로 0.5 ㎖의 CM(10% FBS로 보충된 페놀 레드 부재 RPMI 1640 배지) 내의 세포(Daudi, Raji 또는 Ramos)를 실온에서 30분 동안 5 ㎍의 각각의 PE-표지된 MAb로 배양하였고, 400×g에서 펠렛화하였으며, CM으로 2회 세척하였고, 1.5 ㎖의 CM 내에 재부유하였으며, 2개의 0.75 ㎖ 당량으로 나누었다. 재결합을 방지하기 위하여, N-에틸-말레이미드(NEM)-블록된 벨투즈맙-Fab'을 각 복제물에 첨가하였고(1 ㎎/㎖ 최종 농도), 평균 형광 강도(MFI)를 즉시 측정하여 Guava PCA 및 Guava Express 소프트웨어(Guava Technologies, AInc., Hayward, CA)를 이용하여 최대 결합(T=0)을 결정하였다. 이후의 측정은 30분 간격으로 수행하였다. T=X에서의 MFI를 T=0에서의 MFI로 나눈 값인 최대 결합 백분율을 시간에 대해 플롯팅(plotting)하고, 그 결과를 Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)에 의해 분석하여 반감기(half-life) 또는 오프-속도를 산출하였다.Daudi, Raji and Ramos cells were used to compare the dissociation rates of Beltuzumab, Rituximab, cA20, D101N, 1F5 and Tositumomab (anti-CD20, BEXXAR®, GlaxoSmithKline) by flow cytometry (FIG. 5). Each MAb was labeled with phycoerythrin (PE) using the Zenon R-Phycoerythrin Human IgG labeling kit following the manufacturer's protocol (Invitrogen, Molecular Probes, Z-25455). Cells (Daudi, Raji or Ramos) in 0.5 ml CM (phenolic red absent RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS) at 1 × 10 6 cells / ml were 5 μg of each PE-labeled for 30 minutes at room temperature. Incubated with MAb, pelleted at 400 × g, washed twice with CM, resuspended in 1.5 mL of CM and divided into two 0.75 mL equivalents. To prevent recombination, N-ethyl-maleimide (NEM) -blocked Beltuzumab-Fab 'was added to each replicate (1 mg / ml final concentration), and the average fluorescence intensity (MFI) was immediately measured to determine Guava PCA. And maximum binding (T = 0) was determined using Guava Express software (Guava Technologies, AInc., Hayward, Calif.). Subsequent measurements were made at 30 minute intervals. Plot the maximum percentage of binding, the MFI at T = X divided by the MFI at T = 0, and analyze the results by Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Half-life or off-rate was calculated.

37℃에서 Daudi(도 5의 A), Romos(도 5의 B) 및 Raji(도 5의 C) 세포로부터의 벨투즈맙, 리툭시맙 및 cA20의 해리 속도를 과량의 벨투즈맙-Fab'-NEM의 존재하에 비교하였다. 유사한 조건 하에 Raji 세포(도 5의 D)로부터의 벨투즈맙, 리툭시맙 및 D101N의 해리를 비교하기 위하여 추가 측정을 수행하였다. 테스트된 각각의 세포주에 있어서, 벨투즈맙의 평균 반감기는 리툭시맙보다 2.7배(±0.3) 더 길었지만(P<0.0001), cA20과는 구별할 수 없었다(P>0.2). 반면, D101N 돌연변이체는 리툭시맙 및 벨투즈맙보다 각각 2배 및 6배 빠른 오프-속도로 Raji 세포로부터 해리한다. 상기 결과는 Asn101에서 Asp101로의 변화가 벨투즈맙의 느린 해리에 책임이 있음을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 경쟁 벨투즈맙-Fab'-NEM의 부재시 Raji 세포(도 5의 E)로부터의 벨투즈맙, 리툭시맙, D101N, 1F5 및 토시투모맙의 해리를 비교하였으며, 벨투즈맙은 가장 긴 반감기(281분)를 갖고, 이어서 1F5(195분), 리툭시맙(94분), 토시투모맙(50분) 및 D101N(42분)의 순서임을 발견하였다.
Excess Velutumab-Fab'-NEM dissociation rate of Beltuzumab, Rituximab and cA20 from Daudi (FIG. 5A), Romos (FIG. 5B) and Raji (FIG. 5C) cells at 37 ° C. Comparison was made in the presence of. Further measurements were performed to compare the dissociation of Beltuzumab, Rituximab and D101N from Raji cells (FIG. 5D) under similar conditions. For each cell line tested, the mean half-life of veltumab was 2.7 times (± 0.3) longer than rituximab ( P <0.0001), but was indistinguishable from cA20 ( P > 0.2). In contrast, the D101N mutant dissociates from Raji cells at 2 and 6 times faster off-rate than Rituximab and Beltuzumab, respectively. The results indicate that the change from Asn 101 to Asp 101 is responsible for the slow dissociation of beltuzumab. In addition, we compared the dissociation of Beltuzumab, Rituximab, D101N, 1F5 and Tocitumomab from Raji cells (E in FIG. 5) in the absence of competing Beltuzumab-Fab'-NEM, where Beltuzmab was the longest It was found to have a half-life (281 minutes) followed by 1F5 (195 minutes), rituximab (94 minutes), tocitumomab (50 minutes) and D101N (42 minutes).

실시예 6. MTT 분석에 의한 시험관내 세포 증식 억제Example 6. In Vitro Inhibition of Cell Proliferation by MTT Assay

시험관내 세포독성 분석은 모스만의 방법에 기반하고 있다(Mosmann, J Immunl Methods, 65:55-63, 1983). 간략히, 세포주를 96-웰 플레이트에서 1-2×104 세포/웰로 분주하였고, 여기에 항체를 첨가하였다(100 ㎕). 가습된 CO2(5%) 배양기에서 37℃에서 4일 동안 배양한 후, 25 ㎕의 5.0 ㎎/㎖ MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드]를 첨가하였고, 세포를 37℃에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 플레이트를 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 펠렛을 100 ㎕ DMSO/웰을 이용하여 용해시켰고, 570 ㎚에서 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 광학 밀도를 측정하였다. 표지되지 않은 리툭시맙 및 벨투즈맙은 이전에 세포독성 활성을 위해 가교결합이 필요하다는 것이 보고되어 있기 때문에(Stein Blood, 104:3705-3711, 2004), 일부 웰에 염소-항-인간 IgG(GAH)를 첨가하였다. 벨투즈맙 및 리툭시맙은 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용하였고, GAH는 20 ㎍/㎖로 사용하였다. 모든 테스트는 4회 반복 수행하였다.In vitro cytotoxicity assays are based on Mossman's method (Mosmann, J Immunl Methods , 65: 55-63, 1983). Briefly, cell lines were dispensed at 1-2 × 10 4 cells / well in 96-well plates, to which antibody was added (100 μl). After 4 days of incubation at 37 ° C. in a humidified CO 2 (5%) incubator, 25 μl of 5.0 mg / ml MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-di Phenyltetrazolium bromide] was added and the cells were further incubated at 37 ° C. for 4 hours. The plate was then centrifuged and the supernatant removed. The pellet was dissolved using 100 μl DMSO / well and the optical density was measured using a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) at 570 nm. Since unlabeled rituximab and beltuzmab have previously been reported to require crosslinking for cytotoxic activity (Stein Blood, 104: 3705-3711, 2004), in some wells goat-anti-human IgG ( GAH) was added. Veltuzumab and Rituximab were used at a final concentration of 5 μg / ml and GAH was used at 20 μg / ml. All tests were performed four times.

CD20의 발현 레벨이 다른 네 가지 림프종 세포주인 SU-DHL-6, Daudi, Raji 및 WSU-FSCCL에 대한 MTT 세포독성 분석을 이용하여 벨투즈맙 및 리툭시맙이 증식을 억제하는 능력을 조사하였다(Stein et al, Clin Cancer Res, 10:2868-2878, 2004). 양쪽 MAb에 대한 민감도는 CD20 발현과 연관성이 있었지만(SU-DHL-6>Raji>Daudi>WSU-FSCCL), 강도에서는 세포주 내에서 벨투즈맙 및 리툭시맙 사이에 현저한 차이가 관찰되지 않았다(도 6). 2차 항체(GAH, 염소 항-인간 IgG)와의 가교는 Raji 및 Daudi 세포에 대한 벨투즈맙 및 리툭시맙의 효능을 증가시켰는데, 상기 두 가지 세포는 CD20 발현과 항-CD20 MAb에 의한 죽음에 대한 민감도에 있어서 중간 레벨을 갖는다(도 6). 양 극단의 항-CD20 민감도를 갖는 세포주(예컨대, 매우 민감한 SU-DHL-6 및 매우 둔감한 WSU-FSCCL)의 증식 억제는 2차 항체의 첨가에 의해 이익을 보지 않았다.
MTT cytotoxicity assays for four lymphoma cell lines with different expression levels of CD20, SU-DHL-6, Daudi, Raji, and WSU-FSCCL, were used to investigate the ability of beltuzumab and rituximab to inhibit proliferation (Stein et al, Clin Cancer Res , 10: 2868-2878, 2004). Sensitivity to both MAbs was associated with CD20 expression (SU-DHL-6>Raji>Daudi> WSU-FSCCL), but no significant difference was observed between veltumab and rituximab in cell lines in intensity (FIG. 6). ). Cross-linking with secondary antibodies (GAH, goat anti-human IgG) increased the efficacy of beltuzmab and rituximab on Raji and Daudi cells, both of which were responsible for CD20 expression and death by anti-CD20 MAb. Have a medium level in sensitivity to (FIG. 6). Inhibition of proliferation of cell lines with both extreme anti-CD20 sensitivity (eg, highly sensitive SU-DHL-6 and very insensitive WSU-FSCCL) did not benefit from the addition of secondary antibodies.

실시예 7. 시험관내에서 B-세포 및 T-세포의 소모Example 7. Depletion of B-cells and T-cells in vitro

건강한 자원자의 인간 말초혈 림프구에 대한 벨투즈맙의 효과를 유세포 분석기를 이용하여 시험관내에서 평가하였다. 당량의 전혈을 벨투즈맙과 함께 2일 동안 배양한 후, FACS에 의해 B-세포(CD19+) 및 T-세포(CD3+)의 분석을 수행하였다. 대조군은 항체를 포함하지 않았으며, 음성 대조군은 인간화 MAb(항-CEACAM5 단일클론 항체, hMN-14)를 포함하였다. 전혈을 벨투즈맙으로 배양하면 B-세포의 수가 현저하게 감소되었지만, T-세포는 그렇지 않았다(도 7). B-세포의 감소는 5 ㎍/㎖을 이용할 때 26-80%, 1 ㎍/㎖을 이용할 때 11-61% 범위였다(처리하지 않은 세포와의 P 값<0.05, 1 ㎍/㎖[6.7 nM]의 경우 3/3 혈액 공여자 및 5 ㎍/㎖[33.3 nM]의 경우 5/5 혈액 공여자). 전혈이 배양 혼합물에 사용되었기 때문에, 세포 계수에서 관찰된 감소는 CDC 또는 ADCC 뿐만 아니라 직접 신호전달에 의한 것일 수 있다.
The effect of beltuzmab on human peripheral blood lymphocytes of healthy volunteers was assessed in vitro using a flow cytometer. Equivalent amounts of whole blood were incubated with veltumab for 2 days, followed by analysis of B-cells (CD19 +) and T-cells (CD3 +) by FACS. The control did not contain an antibody and the negative control included a humanized MAb (anti-CEACAM5 monoclonal antibody, hMN-14). Culture of whole blood with veltumab significantly reduced the number of B-cells, but not T-cells (FIG. 7). Reduction of B-cells ranged from 26-80% using 5 μg / ml and 11-61% using 1 μg / ml (P value <0.05, 1 μg / ml with untreated cells [6.7 nM]). 3/3 blood donor and 5/5 blood donor for 5 μg / ml [33.3 nM]). Since whole blood was used in the culture mixture, the observed decrease in cell count could be by direct signaling as well as CDC or ADCC.

실시예 8. 보체-의존적 세포독성(CDC) 분석Example 8. Complement-dependent Cytotoxicity (CDC) Assay

형광 방법을 사용하여 벨투즈맙 대 리투즈맙의 CDC 활성을 평가 및 비교하였다. Daudi, Raji 또는 Ramos 세포(1×106/㎖)를 검은 96-웰 플레이트(Nunc)에 접종하고(50 ㎕/웰), 37℃, 5% CO2에서 1/20 최종 농도로 인간 보체(Quidel Corp., San Diego, CA)의 존재 하에 각 테스트 MAb(0.001 내지 10 ㎍/㎖)와 함께 3시간 동안 배양하였다. 지시 염료인 AlamarBlue(BioSource, Camarillo, CA)를 첨가하고, 밤새 배양을 계속하였다. 이후, BioTek Synergy™ HT Multi-Detection Microplate Reader 및 KC4 Signature Software(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT)를 이용하여 530 nM에서의 여기(excitation) 및 590 nM에서의 방출(emission)로 형광 강도를 측정함으로써 살아있는 세포를 정량하였다.Fluorescence methods were used to evaluate and compare the CDC activity of Veltuzumab to Lituzumab. Daudi, Raji or Ramos cells (1 × 10 6 / ml) were seeded in black 96-well plates (Nunc) (50 μl / well) and human complement (1/20 final concentration at 37 ° C., 5% CO 2) . Incubated for 3 hours with each test MAb (0.001-10 μg / ml) in the presence of Quidel Corp., San Diego, Calif.). The indicator dye, AlamarBlue (BioSource, Camarillo, Calif.) Was added and the culture continued overnight. Subsequently, the fluorescence intensity was increased by excitation at 530 nM and emission at 590 nM using BioTek Synergy ™ HT Multi-Detection Microplate Reader and KC4 Signature Software (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT). Live cells were quantified by measurement.

Prism 소프트웨어를 이용하여 6회의 반복 측정의 평균으로부터 생성된 복용량-반응 커브를 분석하여 EC50 값을 얻었다. Daudi 세포의 경우, 분석에서의 날마다의 편차를 설명할 뿐만 아니라, EC50 추정값의 정확성을 증가시키기 위하여, 실험에서는 각각의 항체에 대한 분석이 매일 2회 수행되는 다원적(multi-factorial) 디자인을 사용하였고, 항체 당 3일의 다른 날에 총 9번의 분석을 반복하였다. 상기 샘플은 3가지 상이한 로트(lot)의 벨투즈맙 및 1가지 리툭시맙을 포함하였다. EC50 데이터의 통계적 분석은 일(day) 및 항체 유형을 인자로 사용하는 편차의 2-way 분석(ANOVA)에 기반하였다. 던넷(Dunnett)의 다중 비교 절차를 이용하여, 총 실험 오차율 0.05에서 모든 4가지 구축물의 3가지 비교를 수행하였다.Dose-response curves generated from the average of six replicate measurements using Prism software were analyzed to obtain EC 50 values. In the case of Daudi cells, in order to not only account for the daily deviations in the assay, but also to increase the accuracy of the EC 50 estimates, the experiment uses a multi-factorial design in which the assay for each antibody is performed twice daily. A total of 9 assays were repeated on another 3 days per antibody. The sample contained three different lots of veltumab and one rituximab. Statistical analysis of EC 50 data was based on two-way analysis of deviations using day and antibody type as factors. Using Dunnett's multiple comparison procedure, three comparisons of all four constructs were performed at a total experimental error rate of 0.05.

CDC에 대한 표적 세포로 Daudi를 이용하여, 본 발명자들은 리툭시맙과 비교할 때 벨투즈맙에 대해 낮은 값의 EC50을 일관되게 관찰하였다(표 2). 매일의 편차의 임의의 효과 뿐만 아니라 상이한 날에 항체 중의 EC50 패턴에서의 임의의 차이를 설명하는 추가적인 측정 결과는 리툭시맙과 각각의 3가지 로트의 벨투즈맙 사이에 관찰된 EC50에서의 평균 차이가 일관되게 통계적으로 유의하다는 것을 나타내었다(P<0.0001). 그러나, 다른 두 가지 세포주인 Raji 및 Ramos에서는 CDC 결과로부터 벨투즈맙 및 리툭시맙 사이에 차이점이 관찰되지 않았다.Using Daudi as the target cell for CDC, we consistently observed low values of EC 50 for beltuzumab when compared to rituximab (Table 2). Additional measurement results accounting for any effects of daily deviations as well as any differences in EC 50 patterns in antibodies on different days, the mean at EC 50 observed between rituximab and each of 3 lots of veltumab The differences were consistently statistically significant ( P <0.0001). However, in the other two cell lines Raji and Ramos, no differences were observed between beltumab and rituximab from the CDC results.

벨투즈맙과 리툭시맙의 비교: Daudi 세포주에서의 CDC 결과(EC50)의 요약Comparison of Veltuzumab and Rituximab: Summary of CDC Results (EC 50 ) in Daudi Cell Line 항체Antibodies 실험의 수(N)Number of experiments (N) EC50(g/㎖)
평균±표준편차EC 50 (g / ml)
Mean ± Standard Deviation 평균 차이
(Vmab-Rmab)Mean difference
(Vmab-Rmab) 95% 신뢰 간격
[1]95% confidence interval
[One] 리툭시맙Rituximab 99 0.1485±0.02000.1485 ± 0.0200 벨투즈맙
(로트 1)Beltuzmab
(Lot 1) 99 0.0990±0.02320.0990 ± 0.0232 -0.0495-0.0495 (-0.0611, -0.0378)(-0.0611, -0.0378) 벨투즈맙
(로트 2)Beltuzmab
(Lot 2) 99 0.0843±0.02150.0843 ± 0.0215 -0.0642-0.0642 (-0.0758, -0.0525)(-0.0758, -0.0525) 벨투즈맙
(로트 3)Beltuzmab
(Lot 3) 99 0.0904±0.02390.0904 ± 0.0239 -0.0581-0.0581 (-0.0697, -0.0464)(-0.0697, -0.0464)

[1]: 던넷의 방법을 이용한 다중 비교에 대해 조정된 2-way ANOVA 모델에 기반함.
[1]: Based on a 2-way ANOVA model adjusted for multiple comparisons using Dunnett's method.

실시예 9. 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 분석Example 9. Antibody-Dependent Cytotoxicity (ADCC) Assay

작용기로서 각각 말초혈 단핵구 세포(PBMC) 및 Daudi와 표적 세포를 이용하여 ADCC의 유도를 측정하였다. Daudi 세포는 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 5 ㎍/㎖로 각각의 테스트 항체로 3회 반복 배양하였다. 이후, 건강한 자원자로부터 얻은 새롭게 단리된 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 50:1의 소정의 최적 작용기-대-표적 비로 첨가하였다. 4시간 동안 배양한 후, CytoTox-One(Promega, Madison, WI)에 의해 세포 용해를 평가하였다. MAb + 작용기 세포, MAb + 표적 세포 및 MAb + 표적 세포 + 작용기 세포에 대해 ADCC를 측정하였다. MAb 단독으로 및 표적 세포를 단독으로 함유하는 대조군 웰 또한 처리하였다.Induction of ADCC was measured using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and Daudi and target cells, respectively as functional groups. Daudi cells were incubated three times with each test antibody at 5 μg / ml at 37 ° C., 5% CO 2 for 30 minutes. Thereafter, freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy volunteers were added at a predetermined optimal functional group-to-target ratio of 50: 1. After incubation for 4 hours, cell lysis was assessed by CytoTox-One (Promega, Madison, Wis.). ADCC was measured for MAb + effector cells, MAb + target cells and MAb + target cell + effector cells. Control wells containing MAb alone and target cells alone were also treated.

결과를 평가하기 위하여, 배지만을 갖는 웰로부터 얻은 평균 배경(background) 값을 모든 다른 웰에서 빼주었으며, 하기 식을 이용하여 % 용해를 계산하였다. 하기 식에서, MET는 MAb, 작용기 및 표적 세포를 함유하는 웰을 나타내고; ET는 작용기 및 표적 세포를 함유하는 웰을 나타내며; T는 표적 세포만을 함유하는 웰을 나타내고; 및 Max는 표적 세포 및 용해 완충액을 함유하는 웰을 나타낸다.To evaluate the results, the average background value obtained from the wells with only the medium was subtracted from all other wells and% dissolution was calculated using the following formula. In the following formulae, MET represents wells containing MAb, functional groups and target cells; ET represents wells containing functional groups and target cells; T represents a well containing only target cells; And Max represent wells containing target cells and lysis buffer.

Figure pct00001
Figure pct00001

CD20을 발현하는 Daudi 세포주의 세포용해를 측정함으로써 5가지 로트의 벨투즈맙의 ADCC 활성 레벨을 리툭시맙 및 음성 대조군 MAb(hMN-14)의 것과 비교하였다. 작용기 세포 기능은 2명의 자원하는 혈액 공여자로부터 새롭게 단리된 PBMC에 의해 제공되었다. 그 결과는 리툭시맙 및 각각의 5가지 로트의 벨투즈맙이 통계적으로 유사한(P=0.12) 레벨의 ADCC(40-45% 용해)를 생성한다는 것을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 리툭시맙 및 벨투즈맙 모두 대조군 MAb(9.9% 용해, 인간화 항-CEA 라베투즈맙)와 비교하여 현저하게 높은 레벨의 ADCC(P<0.0001)를 나타내었다.
By measuring the cytolysis of the Daudi cell line expressing CD20, the ADCC activity levels of 5 lots of beltuzmab were compared with that of rituximab and negative control MAb (hMN-14). Agonist cell function was provided by PBMC newly isolated from two volunteer blood donors. The results showed that Rituximab and each of the five lots of Veltumab produced statistically similar ( P = 0.12) levels of ADCC (40-45% lysis) (data not shown). Rituximab and Beltuzumab both exhibited significantly higher levels of ADCC ( P <0.0001) compared to control MAb (9.9% lysis, humanized anti-CEA Lavetuzumab).

실시예Example 10. 치료에 대한 자연 살해( 10. Natural killing for treatment NKNK ) 세포 및 호중구 소모의 영향) Effects of Cell and Neutrophil Depletion

NK 세포 및 호중구의 소모는 종래 개시된 바와 같이 수행하였다(Hernandez-Ilizaliturri et al., Clin Cancer Res 9:5810-12, 2003). 간략히, 각각의 마우스는 1×106 Raji 세포를 접종하기 하루 전에 100 ㎕의 항-마우스 Gr-1 복수(Dr. F.J. Hernandez-Ilizaliturri, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY) 및 100 ㎍의 항-마우스 IL-2 수용체 항체(TMβ-1, BD PharMingen, Inc., San Jose, CA)를 복강내 투여한 후, 6일 및 13일에 2회 더 항-마우스 Gr-1 복수를 복강내 주사하였다. 3일 및 13일에 1마리의 소모된 마우스 및 1마리의 소모되지 않은 마우스로부터 취한 혈액 샘플의 FACS 분석에 의해 소모를 확인하였다. 3, 5, 7 및 11일에 벨투즈맙(200 ㎍) 또는 생리식염수를 정맥내 투여하였다.Depletion of NK cells and neutrophils was performed as previously described (Hernandez-Ilizaliturri et al., Clin Cancer Res 9: 5810-12, 2003). Briefly, each mouse received 100 μl of anti-mouse Gr-1 ascites (Dr. FJ Hernandez-Ilizaliturri, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY) and 100 μg of anti--1 day prior to inoculation of 1 × 10 6 Raji cells. After intraperitoneal administration of mouse IL-2 receptor antibody (TMβ-1, BD PharMingen, Inc., San Jose, Calif.), Two more anti-mouse Gr-1 ascites were injected intraperitoneally on day 6 and day 13 . Consumption was confirmed by FACS analysis of blood samples taken from one spent mouse and one non-consumed mouse on days 3 and 13. Beltuzumab (200 μg) or saline was administered intravenously on days 3, 5, 7 and 11.

생체내에서 벨투즈맙이 Raji 종양의 성장을 저해하는데 대한 작용기 세포의 역할을 조사하였다(도 11). NK 및 호중구가 소모된 동물에서는 생리식염수 대조군 및 처리된 마우스 사이에 차이가 없었고, 모두 동일한 MST를 가졌다(16.4±1.3일). 반면, 소모되지 않은 마우스에서는 벨투즈맙 처리된 마우스가 생리식염수 대조군에 비해 현저하게 증가된 MST를 가졌다(38.6±7.3 대 18.4±0.9일; P<0.0035).
The role of effector cells in inhibiting the growth of Raji tumors by Beltuzumab in vivo was investigated (FIG. 11). In animals depleted of NK and neutrophils, there was no difference between saline controls and treated mice, all with the same MST (16.4 ± 1.3 days). In contrast, in the non-consumed mice, beltuzumab treated mice had significantly increased MST compared to the saline control group (38.6 ± 7.3 vs 18.4 ± 0.9 days; P <0.0035).

실시예Example 11.  11. 복강내Intraperitoneal 또는 피하 투여한 후 마우스에서의 혈청  Or serum in mice after subcutaneous administration 약물동태학Pharmacokinetics 분석 analysis

주사 전에 12마리의 9주령의 나이브(naive) 암컷 스위스-웹스터 마우스(Taconic Farms; Germantown, NY)의 체중을 재고, 2가지 세트의 마우스 사이에 평균 및 표준 편차가 현저하게 상이하지 않도록 6마리씩의 군으로 나누어 우리에 넣었다. 1 nmole(150 ㎍)의 벨투즈맙을 200 ㎕의 복강내 또는 피하 주사로 투여하였다. 0.5, 1, 4, 6, 24, 48, 120, 168 및 336시간에 레트로-오비탈(retro-orbital) 채혈로 혈청 샘플을 취하였고, 벨투즈맙 분석 때까지 냉동 보관하였다.Twelve nine-week old naive female Swiss-Webster mice (Taconic Farms; Germantown, NY) were weighed prior to injection, each 6 so that there was no significant difference in mean and standard deviation between the two sets of mice. Divided into groups put them in cages. 1 nmole (150 μg) of veltumab was administered by 200 μl of intraperitoneal or subcutaneous injection. Serum samples were taken by retro-orbital blood collection at 0.5, 1, 4, 6, 24, 48, 120, 168 and 336 hours and stored frozen until the Beltuzumab assay.

캡처(capture) ELISA를 사용하여 형청 샘플 내의 벨투즈맙의 양을 정량하였다. 96-웰 분석 플레이트(Nunc Maxisorp Certified Flat-Bottom Immuno Modular w/frame; NalgeNunc International Corp., Rochester, NY)를 래트(rat) 항-벨투즈맙 이디오타입 단일클론 항체인 WR2(Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ)로 코팅하였다. 벨투즈맙의 8번의 순차적인 희석액(100 내지 1.56 ng/㎖)을 만들어 표준 곡선을 구축하였다. 설치류의 혈청 샘플을 적절히 희석하였고, 상기 표준물과 함께 3중으로 웰에 피펫팅하였다. 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 폴리클론 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)를 이용하여 결합된 벨투즈맙을 검출하였고, OPD 용액(o-phenylenediamine dihydrochloride, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 상기 플레이트를 현상하였다. 상기 플레이트를 표준 곡선 웰에서 색깔이 나올 때까지 암실에서 배양하였다(∼20분). 이 시점에서, 상기 웰에 4 N 황산을 첨가하여 반응을 종료시켰고, 플레이트 판독기로 OD490 ㎚에서 상기 플레이트를 판독하였다.Capture ELISA was used to quantify the amount of veltumab in the sperm sample. A 96-well assay plate (Nunc Maxisorp Certified Flat-Bottom Immuno Modular w / frame; NalgeNunc International Corp., Rochester, NY) was used as a rat anti-beltumab idiotype monoclonal antibody, WR2 (Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ). Eight sequential dilutions of veltumab (100-1.56 ng / ml) were made to build a standard curve. Rodent serum samples were appropriately diluted and pipetted into the wells in triplicate with the standard. Bound beltzumab was detected using a peroxidase-conjugated goat anti-human polyclonal antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) and the OPD solution (o-phenylenediamine dihydrochloride, Sigma-Aldrich, St. The plates were developed using Louis, MO). The plates were incubated in the dark until color emerged from standard curve wells (-20 min). At this point, the reaction was terminated by adding 4 N sulfuric acid to the wells and the plate was read at OD 490 nm with a plate reader.

Prism 소프트웨어(GraphPad Software, Inc)를 이용하여, 상기 표준 곡선에 기반하여 마우스 혈청 샘플 내의 벨투즈맙의 농도를 계산하였다. 정확성을 보장하기 위하여, 각각의 샘플을 여러번 구동하였고, 상기 모든 구동으로부터 얻은 평균 값을 PK-분석에 사용하였다. 상기 분석으로부터 결정된 혈장 농도를 n㏖/㎖로 변환시키고, WinNonLin PK 소프트웨어 패키지(v5.1, Pharsight Corp., Mountain View, CA)를 이용하여 분석하였다. 상기 복강내 및 피하 데이터 모두에 대해 비-구획 분석을 수행하였다.Prism software (GraphPad Software, Inc) was used to calculate the concentration of Beltuzumab in mouse serum samples based on this standard curve. To ensure accuracy, each sample was run several times and the mean value from all of these runs was used for PK-analysis. Plasma concentrations determined from the assay were converted to nmol / ml and analyzed using WinNonLin PK software package (v5.1, Pharsight Corp., Mountain View, CA). Non-compartmental analyzes were performed on both the intraperitoneal and subcutaneous data.

복강내 및 피하 주사된 동물들 사이에 벨투즈맙의 혈청 농도 및 제거는 매우 유사하였지만(도 12), 몇 가지 해당 PK-파라미터는 현저하게 상이하였다(표 3 및 표 4). 최대 혈청 농도(Cmax) 및 Cmax에 대한 시간(Tmax)의 측면에서, 주사 경로 사이에 현저한 차이는 없었다. 이것은 제거(Cl) 및 곡선하 면적(AUC) 값 사이를 비교할 때도 마찬가지였다. 그러나, 최종 반감기(T1 /2) 및 평균 유지 시간(MRT)에서는 주목할 만한 차이가 관찰되었으며, 복강내 경로가 각각 현저하게 높은 값을 산출하였다(각각 P=0.0316 및 P=0.0357).Serum concentrations and clearance of Beltuzumab were very similar between intraperitoneal and subcutaneous injected animals (FIG. 12), but some of the corresponding PK-parameters were markedly different ( Table 3 and Table 4 ). In terms of maximal serum concentration (C max ) and time for C max (T max ), there was no significant difference between the injection routes. This was also the case when comparing between removal (Cl) and area under curve (AUC) values. However, the end half-life (T 1/2), and an average holding time (MRT) in a notable difference was observed, were calculated for the intraperitoneal route significantly high values, respectively (P = 0.0316, respectively, and P = 0.0357).

복강내 주사시의 hA20의 약물동태학Pharmacokinetics of hA20 at Intraperitoneal Injection 단일 복강내 주사로 투여된 hA20 IgG의 개별 마우스 혈청 PKIndividual mouse serum PK of hA20 IgG administered in a single intraperitoneal injection 동물
번호animal
number 주사된 복용량
(pmole)Injected dose
(pmole) Cmax
(pmole/㎖)C max
(pmole / ml) Tmax
(h)T max
(h) T1 /2
(h)T 1/2
(h) AUC0 →∞
(h*pmole/㎖)AUC 0 → ∞
(h * pmole / ml) Cl
(㎖/h)Cl
(Ml / h) MRT0 →∞
(h)MRT 0 → ∞
(h) 1One 1,0001,000 143.7143.7 2424 308.5308.5 86,17086,170 0.01160.0116 540.8540.8 22 1,0001,000 173.9173.9 2424 225.9225.9 54,20454,204 0.01840.0184 379.2379.2 33 1,0001,000 229.8229.8 2424 846.1846.1 214,007214,007 0.00470.0047 1,219.51,219.5 44 1,0001,000 246.5246.5 2424 562.8562.8 149,725149,725 0.00670.0067 840.1840.1 55 1,0001,000 76.576.5 2424 292.8292.8 28,62828,628 0.03490.0349 439.6439.6 66 1,0001,000 296.7296.7 2424 333.0333.0 107,101107,101 0.00930.0093 500.8500.8 평균
(편차)Average
(Deviation) 195
(79)195
(79) 428
(235)428
(235) 106,639
(67,288)106,639
(67,288) 0.0143
(0.0112)0.0143
(0.0112) 653
(320)653
(320)

본 PK 연구에서 사용된 종양이 없는 스위스-웹스터 마우스는 평균 30 g의 중량이었다. 그 중량에 기반하여 마우스의 전혈 부피를 추정하였고, 체중의 5.5 내지 7% 범위를 전혈의 ㎖로 사용하였다. 평균 6.25%를 사용하면, 상기 마우스는 대략 1.9 ㎖의 전혈을 가지며, 대략 50% 또는 0.95 ㎖의 혈청을 갖는다. 본 발명자들은 상기 마우스에 150 ㎍을 복강내 주사하였으며, 이들 모두가 혈액 내에 포함된다면, 대략 158 ㎍/㎖의 혈청 농도를 가질 것이다. 본 발명자들은 150 ㎍의 벨투즈맙을 상기 30 g의 마우스 내로 주사한 후, 최대로 예상할 수 있는 것보다 5.3배 적은 30 ㎍/㎖의 Cmax를 달성하였음을 발견하였다.The tumor-free Swiss-Webster mice used in this PK study weighed an average of 30 g. The whole blood volume of the mice was estimated based on their weight and a range of 5.5-7% of body weight was used as ml of whole blood. Using an average of 6.25%, the mice have approximately 1.9 ml of whole blood and approximately 50% or 0.95 ml of serum. We injected 150 μg intraperitoneally into the mice, and if all of them were included in the blood, we would have a serum concentration of approximately 158 μg / ml. We found that after injection of 150 μg of Beltuzumab into the 30 g of mice, a C max of 30 μg / ml was achieved, 5.3 times less than would be expected.

피하 주사시의 hA20의 약물동태학Pharmacokinetics of hA20 at Subcutaneous Injection 단일 피하 주사로 투여된 hA20 IgG의 개별 마우스 혈청 PKIndividual mouse serum PK of hA20 IgG administered in a single subcutaneous injection 동물
번호animal
number 주사된 복용량
(pmole)Injected dose
(pmole) Cmax
(pmole/㎖)C max
(pmole / ml) Tmax
(h)T max
(h) T1 /2
(h)T 1/2
(h) AUC0 →∞
(h*pmole/㎖)AUC 0 → ∞
(h * pmole / ml) Cl
(㎖/h)Cl
(Ml / h) MRT0 →∞
(h)MRT 0 → ∞
(h) 1One 1,0001,000 227.2227.2 2424 166.1166.1 45,73445,734 0.02190.0219 261.3261.3 22 1,0001,000 256.1256.1 2424 173.4173.4 55,13955,139 0.01810.0181 265.4265.4 33 1,0001,000 172.7172.7 2424 244.9244.9 66,35166,351 0.01510.0151 355.9355.9 44 1,0001,000 204.1204.1 2424 189.7189.7 58,21458,214 0.01720.0172 278.4278.4 55 1,0001,000 195.5195.5 2424 162.5162.5 41,01841,018 0.02440.0244 247.9247.9 66 1,0001,000 162.6162.6 2424 185.0185.0 43,58043,580 0.02290.0229 280.3280.3 평균
(편차)Average
(Deviation) 203
(35)203
(35) 187
(30)187
(30) 51,673
(9,844)51,673
(9,844) 0.0199
(0.0037)0.0199
(0.0037) 282
(38)282
(38)

상기 관찰 결과를 이용하여, 본 발명자들은 가장 낮은 치료 복용량으로 50 ng(0.05 ㎍)을 ∼20 g의 SCID 마우스에 주사하였다. 그 중량에 기반하여, 마우스는 대략 1.14 ㎖의 전혈 부피를 가지며, 이 중 0.57 ㎖가 혈청이다. 50 ng 모두 혈액 내에 있다면, 87.7 ng/㎖의 혈청 농도일 것이다. 정상 마우스 PK 연구에서 관찰된 것과 동일한 동역학을 이용하여, 본 발명자들은 혈청 내에서 대략 16.5 ng/㎖(87.7 ng/㎖을 5.3으로 나눈 값) 벨투즈맙의 Cmax 농도를 추정하였다. 이것은 상기 마우스에서 항원 싱크(sink)일 수 있고, 따라서 혈청의 농도를 낮출 수 있는 Daudi 세포의 존재를 설명하지 못한다.
Using this observation, we injected 50 ng (0.05 μg) into ˜20 g of SCID mice at the lowest therapeutic dose. Based on its weight, mice have a whole blood volume of approximately 1.14 ml, of which 0.57 ml is serum. If all 50 ng are in the blood, it will have a serum concentration of 87.7 ng / ml. Using the same kinetics as observed in the normal mouse PK study, we estimated the C max concentration of Beltuzumab at approximately 16.5 ng / ml (87.7 ng / ml divided by 5.3). This may be an antigen sink in the mouse and thus does not account for the presence of Daudi cells that can lower serum concentrations.

실시예Example 12.  12. 시노몰구스Cynomolgus 원숭이에서의Monkey 저항성( Resistance tolerabilitytolerability ) 및 독성약동학() And toxic pharmacokinetics toxicokineticstoxicokinetics ))

벨투즈맙의 정맥내 및 피하 주사의 탐구적인 단일 및 반복 복용량 연구를 SNBL USA, Ltd.(Everett, WA)에서 시노몰구스 원숭이로 수행하였다. 2.5 내지 6.6 ㎏(3-7 연령) 중량의 16마리의 수컷 및 16마리의 암컷 원숭이에 정맥내 또는 피하로 0, 6.7, 33.5 및 67 ㎎/㎏(인간의 경우 각각 80, 375 및 800 ㎎/㎡ 복용량에 해당함) 복용량을 1회 또는 3회(2주 간격) 투여하였다. 상기 원숭이의 혈액 샘플을 취하여 MAb 역가 및 PK, 혈액 화학, 응집 및 혈액학적 검사 뿐만 아니라 소변검사에 대해 규칙적으로 조사하였고, 이후 비장, 하악 및 장간막 림프절에서의 림프 조직 상태를 사후 평가하였다.An exploratory single and repeated dose study of intravenous and subcutaneous injections of beltumab was performed with cynomolgus monkeys at SNBL USA, Ltd. (Everett, WA). 16 male and 16 female monkeys weighing 2.5 to 6.6 kg (3-7 years) weighed 0, 6.7, 33.5 and 67 mg / kg (80, 375 and 800 mg / kg respectively in humans) intravenously or subcutaneously. Corresponds to the m 2 dose) The dose was administered once or three times (two weeks apart). Blood samples of the monkeys were taken and regularly examined for MAb titer and PK, blood chemistry, coagulation and hematology as well as urinalysis, after which the lymphoid tissue status in the spleen, mandibular and mesenteric lymph nodes was post-assessed.

단일 또는 다중 복용량으로 정맥내 또는 피하 투여된 벨투즈맙은 저항성이 좋으며(well tolerated), 순환계 및 림프 기관에서의 B-세포 소모 이외의 다른 임상적 또는 영속적 실험실 테스트 이상은 알려져 있지 않다. 모든 복용량이 투여된 동물에서의 사후 변화는 모든 복용량에서 비장, 하악 및 장간막 림프절의 소낭성 림프구 소모를 포함하였다(데이터는 나타내지 않음). 백혈구 세포, 호중구, 림프구 및 호산성구의 일시적인 감소가 알려져 있지만, 말초혈 B-세포 수의 신속하고 영구적인 감소만이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 효과는 어느 경로에 의해서든 복용 후 2일 내에 일어났으며, 6.7 ㎎/㎏ 이상의 복용량에서 나타난다. 동물들은 한번 처리 시에는 28일에, 3 복용량이 주어질 때는 56일에 회복되었다. 약물동태학적 분석(데이터는 나타내지 않음)은 반감기가 정맥내 주사 후 5 내지 8일 또는 피하 투여 후 6-13일로 추정되었고, 양쪽 경로에 대한 Tmax는 2 내지 5일 범위임을 나타내었다. 정맥내 주사 후의 Cmax는 선형이었고, 축적을 나타내지 않았으며, AUC0 -27일은 피하 경로보다 정맥내 투여시 더 컸다(데이터는 나타내지 않음). 이는 유사한 제거 속도를 갖고 피하 경로를 통해 혈류에 들어가는 MAb의 경우 더 긴 기간이 요구되는 것과 관련있는 것처럼 보인다. 복용량-정규화된(normalized) AUC 값은 모든 복용량 레벨에서 정맥내 투여 또는 피하 투여 후 벨투즈맙이 축적되는 것을 나타내었지만, 평균 분포 부피는 모든 복용량 레벨에서 정맥내 투여보다 피하 투여 후 더 컸다(데이터는 나타내지 않음). 상기 결과는 가장 낮은 단일 복용량인 6.7 ㎎/㎏(인간에서 80 ㎎/㎡와 동등함)에서, 이러한 낮은 복용량에서 정맥내 및 피하 경로 중 어느 하나로 투여된 벨투즈맙의 경우 말초 및 비장성 B-세포의 신속한 소모가 일어난다는 것을 나타낸다.
Veltumab administered intravenously or subcutaneously in single or multiple doses is well tolerated and no clinical or permanent laboratory test abnormalities other than B-cell depletion in the circulatory system and lymphoid organs are unknown. Post-mortem changes in animals administered all doses included follicular lymphocyte depletion of spleen, mandibular and mesenteric lymph nodes at all doses (data not shown). Although a temporary decrease in leukocytes, neutrophils, lymphocytes and eosinophils is known, only a rapid and permanent decrease in the number of peripheral blood B-cells was observed (data not shown). This effect occurred within 2 days after dosing by any route and appears at doses of 6.7 mg / kg or more. Animals recovered at 28 days once treatment and at 56 days given 3 doses. Pharmacokinetic analyzes (data not shown) indicated that the half-life was estimated to be 5-8 days after intravenous injection or 6-13 days after subcutaneous administration and the T max for both routes ranged from 2-5 days. Cmax was linear after the intravenous injection, did not show the accumulation, AUC 0 -27 days was greater when more than subcutaneous intravenous route (data not shown). This seems to be related to the longer duration required for MAbs with similar clearance rates and entering the bloodstream through the subcutaneous pathway. Dose-normalized AUC values indicated that beltumab accumulates after intravenous or subcutaneous administration at all dose levels, but the mean distribution volume was greater after subcutaneous administration than intravenous administration at all dose levels (data is Not shown). The results indicate that at the lowest single dose 6.7 mg / kg (equivalent to 80 mg / m 2 in humans), peripheral and splenic B-cells for beltuzmab administered either in the intravenous and subcutaneous route at this low dose. Indicates that rapid consumption of.

실시예Example 13. 마우스 모델에서  13. In the mouse model 벨투즈맙의Beltuzmab 생체내In vivo 효능 efficacy

본 연구는 대략 20 g의 C.B.17 동형접합성(homozygous) 중증 복합 면역 결핍(SCID) 마우스(Taconic, Germantown, NY에서 받았을 때 7주령)에서 수행되었다. Daudi(버킷 림프종) 모델에 있어서, 마우스는 0일에 1.5×107 세포로 정맥내 접종하고, 중량을 달고, 무작위로 6가지 처리군 및 2가지 대조군(군당 8마리)으로 할당하였다. 1일에, 처리군의 마우스는 피하 또는 정맥내로 단일 복용량의 벨투즈맙(5, 20 또는 60 ㎍)을 투여하였고, 대조군의 마우스는 생리식염수(200 ㎕) 또는 60 ㎍의 비-Daudi 표적화 이소타입-일치된 항-CEACAM5 단일클론 항체인 hMN-14 IgG(labetuzumab, Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ)를 투여하였다.This study was performed in approximately 20 g of CB17 homozygous severe combined immunodeficiency (SCID) mice (7 weeks old when received from Taconic, Germantown, NY). In the Daudi (bucket lymphoma) model, mice were inoculated intravenously with 1.5 × 10 7 cells on day 0, weighed and randomly assigned to six treatment groups and two control groups (8 per group). On day 1, mice in the treatment group received a single dose of beltuzumab (5, 20 or 60 μg) subcutaneously or intravenously, and mice in the control group had normal saline (200 μl) or 60 μg of non-Daudi targeting isotype. -The matched anti-CEACAM5 monoclonal antibody, hMN-14 IgG (labetuzumab, Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ) was administered.

상기 연구에 더하여, 동일한 Daudi 모델에서 최소 효과 복용량 시험을 수행하였다. 14마리 마우스 군은 단일 복용량의 벨투즈맙(0.5, 0.25, 0.1, 또는 0.05 ㎍)을 정맥내 투여하고, 대조군에는 생리식염수를 투여하였다. WSU-FSCCL 소낭 세포 림프종 모델에서, 15마리 군의 각각의 마우스는 2.5×106 세포를 정맥내 접종하였고, 5일 후 단일 복용량의 벨투즈맙(0.035, 0.35, 3.5 또는 35 ㎍)을 복강내 투여하였다. 매일 동물들을 모니터링하였고, 뒷다리 마비가 발생하거나, 빈사상태가 되거나, 또는 처음 체중의 20% 이상을 잃었을 때 인도적으로 희생시켰다. 카플란-메이어 플롯(로그-순위 분석)을 이용하여, Prism(v4.03) 소프트웨어 패키지(GraphPad Software, Inc.)를 이용하여 생존 곡선을 분석하였다.In addition to the above studies, a minimal effective dose test was performed in the same Daudi model. The 14 mouse groups were administered intravenously with a single dose of beltuzumab (0.5, 0.25, 0.1, or 0.05 μg) and the saline to the control group. In the WSU-FSCCL follicular cell lymphoma model, each of the 15 groups of mice received an intravenous inoculation of 2.5 × 10 6 cells and intraperitoneally administered a single dose of veltumab (0.035, 0.35, 3.5 or 35 μg) 5 days later. It was. Animals were monitored daily and humanely sacrificed when hind limb paralysis occurred, died, or lost more than 20% of the initial weight. Survival curves were analyzed using a Kaplan-Meier plot (log-rank analysis) using a Prism (v4.03) software package (GraphPad Software, Inc.).

버킷 림프종 이종이식의 Burkitt's lymphoma xenograft 정맥내Intravenous 대 피하 치료 Teen subcutaneous treatment

산재성 질환을 갖는 마우스를 벨투즈맙의 단일 정맥내 또는 피하 주사로 처리하였다. 벨투즈맙의 모든 3번의 복용량은 정맥내 또는 피하 투여되는 것과 무관하게 생리식염수 및 라베투즈맙 대조군과 비교하여 마우스의 생존을 현저하게 증가시켰다(도 8, P=0.0001). 복강내 및 피하 투여된 동일한 복용량 사이를 비교하면 어떠한 현저한 차이도 나타내지 않았다(도 8). 대조군 마우스는 28일에 질환(뒷다리 마비)에 무릎을 꿇었지만, 2가지 60 ㎍ 군의 평균 생존 시간(MST)은 복강내 및 피하의 경우에 있어서 각각 101.9±26.8 및 114.6±21.8일이었고, 4/8 및 6/8 마우스는 126일에 연구가 종료될 때까지 여전히 살아있었다. 20 ㎍ 투여된 동물의 경우에도 유사한 결과가 얻어졌으며, MST는 116.4±14.0(복강내) 및 108.4±26.2(±)일이었고, 양쪽 군에서 5/8 마우스는 연구가 종료될 때 살아있었다. 가장 낮은 복용량(5 ㎍)에서는 >50%의 사망률만이 관찰되었지만(복강내/피하 군 각각에서 연구가 종료될 때 3/8 및 1/8 마우스가 여전히 살아있었음), 이들 마우스는 대조군과 비교하여 여전히 >3.2배 증가된 MST(복강내 및 피하의 경우 각각 91.1±30.9 및 91.6±22.5일)를 가졌다.Mice with disseminated disease were treated with a single intravenous or subcutaneous injection of veltumab. All three doses of veltumab significantly increased the survival of mice compared to physiological saline and lavetuzumab controls regardless of intravenous or subcutaneous administration (FIG. 8, P = 0.0001). Comparison between the same doses administered intraperitoneally and subcutaneously showed no significant difference (FIG. 8). Control mice kneeized at disease (hind limb paralysis) at 28 days, but the mean survival time (MST) of the two 60 μg groups was 101.9 ± 26.8 and 114.6 ± 21.8 days in intraperitoneal and subcutaneous cases, respectively. / 8 and 6/8 mice were still alive until the end of the study at 126 days. Similar results were obtained for animals administered 20 μg, with MST of 116.4 ± 14.0 (intraperitoneal) and 108.4 ± 26.2 (±) days, with 5/8 mice alive at the end of the study. At the lowest dose (5 μg) only mortality of> 50% was observed (3/8 and 1/8 mice were still alive at the end of the study in each intraperitoneal / subcutaneous group), but these mice were compared to the control group. Still had a> 3.2 fold increase in MST (91.1 ± 30.9 and 91.6 ± 22.5 days for intraperitoneal and subcutaneous, respectively).

DaudiDaudi 버킷 림프종 이종이식에서의  Burkitt's Lymphoma Xenograft 벨투즈맙의Beltuzmab 최소 효과 복용량 Minimum effective dose

단일한 5 ㎍ 복용량의 벨투즈맙이 Daudi 산재성 버킷 림프종 모델에서 강력한 것으로 판명되었기 때문에, 다시 더 낮은 복용량(0.5, 0.25, 0.1 및 0.05 ㎍)을 동일한 질환 모델에서 조사하였다. 놀랍게도, 네 가지 복용량 모두 생리식염수 대조군 마우스와 비교할 때 생존을 현저하게 개선하였다(P<0.0001)(도 9). 예를 들면, 0.5 ㎍의 단일 복용량을 투여한 마우스는 대조군과 비교하여 MST에서 3배 개선되었다(69.5±23.9 대 21.4±1.1일). 테스트된 가장 낮은 복용량인 0.05 ㎍(50 ng)에서도 대조군보다 2배 이상 MST를 증가시켰다(50±8일).Lower doses (0.5, 0.25, 0.1 and 0.05 μg) were again investigated in the same disease model since a single 5 μg dose of Beltuzumab proved to be potent in the Daudi interspersed Burkitt's lymphoma model. Surprisingly, all four doses significantly improved survival compared to physiological saline control mice ( P <0.0001) (FIG. 9). For example, mice receiving a single dose of 0.5 μg improved 3 fold in MST compared to control (69.5 ± 23.9 vs 21.4 ± 1.1 days). The lowest dose tested, 0.05 μg (50 ng), also increased MST more than two times compared to the control (50 ± 8 days).

소낭follicle 세포 림프종 이종이식에서  In cell lymphoma xenografts 벨투즈맙의Beltuzmab 최소 효과 복용량 Minimum effective dose

산재성 소낭 세포 림프종 모델인 WSU-FSCCL 이종이식에서, 마우스 군은 단일 복강내 주사로 벨투즈맙을 투여하였다(도 10). 각 군은 35 ㎍의 고용량부터 0.035 ㎍의 저용량 범위(35, 3.5, 0.35 및 0.035 ㎍)의 10배 희석액을 투여하였다. WSU-FSCCL 세포의 투여 후 5일까지 치료를 시작하지 않았다. 4가지 복용량 모두 생리식염수 대조군과 비교할 때 마우스의 생존을 현저하게 증가시켰다(도 10, 대조군 MST=28일; P<0.0001). 35 ㎍ 복용량(44.3±4.9일)이 투여된 마우스의 MST는 3.5 ㎍ 군(39.5±4.6일)의 MST보다 현저하게 상이하지 않았지만, 0.35 및 0.035 ㎍(35 ng) 군의 MST(각각 40.5±1.6일 및 33.3±2.1일)보다 현저하게 더 길었다(P<0.021). 그러나, 3.5 ㎍ 군에서의 1마리를 제외하고는, 모든 마우스가 61일까지 질환의 진행에 무릎을 꿇었다.
In the WSU-FSCCL xenograft, a scattered vesicle cell lymphoma model, the mouse group was administered veltumab in a single intraperitoneal injection (FIG. 10). Each group received 10-fold dilutions ranging from high doses of 35 μg to low doses of 35 μg (35, 3.5, 0.35 and 0.035 μg). Treatment did not begin until 5 days after administration of WSU-FSCCL cells. All four doses significantly increased the survival of mice compared to the saline control group (FIG. 10, control MST = 28 days; P <0.0001). MST of mice administered 35 μg dose (44.3 ± 4.9 days) was not significantly different than MST of 3.5 μg group (39.5 ± 4.6 days), but MST of 0.35 and 0.035 μg (35 ng) groups (40.5 ± 1.6, respectively). Days and 33.3 ± 2.1 days) ( P <0.021). However, with the exception of one in the 3.5 μg group, all mice kneel to disease progression by 61 days.

실시예Example 14.  14. 벨투즈맙은Beltuzmab 마우스 모델 시스템에서  Mouse model system 리툭시맙과Rituximab and 비교하여 개선된 생체내 효능을 보여준다. Compared to improved in vivo efficacy.

SCID 마우스는 꼬리 정맥 주사에 의해 인간 버킷 림프종(Raji) 세포를 접종하였다. 접종 후 5, 10, 15 및 20일에, 상기 마우스는 10 ㎎/㎏/복용량의 리툭시맙 또는 벨투즈맙(hA20)을 투여하였다. 누적 생존 결과는 도 13에 나타나 있다.SCID mice were inoculated with human Burkitt's lymphoma (Raji) cells by tail vein injection. At 5, 10, 15, and 20 days post inoculation, the mice received 10 mg / kg / dose of rituximab or beltuzumab (hA20). Cumulative survival results are shown in FIG. 13.

도 13에 나타낸 바와 같이, Raji 림프종 세포로 주사되고 벨투즈맙(hA20)으로 처리된 SCID 마우스는 동일한 복용량의 리툭시맙으로 처리된 마우스와 비교하여 누적 생존에 있어서 현저한 개선을 보여주었다(P=0.005). 상기 연구에서, 생존에 대한 종료점 대용으로 다리 마비까지의 시간을 사용하였다. 도 13은 접종 후 90일에 걸쳐서, 벨투즈맙으로 처리된 Raji 림프종을 갖는 SCID 마우스는 약 80%의 생존율을 나타내지만, 리툭시맙으로 처리된 대응 마우스는 0에 근접한 생존율을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 13의 아래 부분은 추정된 중간 누적 생존이 대조군 마우스의 경우 22.1일, 리툭시맙으로 처리된 마우스의 경우 47.9일이고, 벨투즈맙으로 처리된 마우스의 경우 아직 도달하지 않았음을 보여준다.As shown in FIG. 13, SCID mice injected with Raji lymphoma cells and treated with Beltuzumab (hA20) showed a marked improvement in cumulative survival compared to mice treated with the same dose of Rituximab ( P = 0.005). ). In this study, time to leg paralysis was used as an endpoint for survival. 13 shows that over 90 days after inoculation, SCID mice with Raji lymphoma treated with veltumab showed about 80% survival, while corresponding mice treated with rituximab showed near zero survival. The lower portion of FIG. 13 shows that the estimated median cumulative survival was 22.1 days for control mice, 47.9 days for mice treated with rituximab and not yet reached for mice treated with veltuzmab.

상기 결과는 CDRH3 서열에서 카뱃 101 아스파라긴을 아스파르트산으로 교체하면 인간 버킷 림프종 세포를 이용하는 마우스 모델 시스템에서 생체내 효능을 현저하게 개선한다는 것을 나타낸다.
The results indicate that replacing Kabat 101 asparagine with aspartic acid in the CDRH3 sequence significantly improves in vivo efficacy in mouse model systems using human Burkitt's lymphoma cells.

실시예Example 15. 낮은 복용량의  15. Low Dose 벨투즈맙으로With Beltuzmab 처리 process

특발성 혈소판감소성 자반증Idiopathic thrombocytopenic purpura

6개월의 ITP 이력을 갖는 39세의 여성은 혈소판 레벨의 만족할만한 개선 없이 표준 치료로 스테로이드를 투여받았다. 상기 환자는 2주 간격으로 2 복용량의 80 ㎎/㎡ 벨투즈맙을 정맥내 투여받았다. 낮은 복용량에도 불구하고, 첫 번째 복용량 후 상기 환자의 B-세포 레벨이 소모되었고, 혈청 항체 레벨은 상기 첫 번째 복용량 후 10 ㎍/㎖까지 증가하였으며, 두 번째 복용량 후에는 19 ㎍/㎖에 도달한 후 천천히 제거되었지만, 8주 후 여전히 측정가능하였다(1 ㎍/㎖). 가장 중요한 것은, 상기 환자의 혈소판 레벨이 연구 시작시 24,000/㎣로부터 첫 번째 복용량 후 4일 내에 정상 한계(>150,000/㎣)까지 신속하게 증가하였다. 이러한 완전 반응은 현재도 계속 중이며, 상기 환자의 혈소판은 치료 후 18주의 마지막 평가시 여전히 >150,000/㎣ 였다. 흥미롭게도, 상기 환자는 궤양성 대장염도 앓고 있었으며, 벨투즈맙으로 시험하는 동안에는 상기 증상에 대한 치료를 하지 않았다. 벨투즈맙을 치료하는 동안, 현재의 18주 추적조사 때까지 궤양성 대장염의 모든 증상 및 증후가 완화되었는데, 이는 상기 B-세포 치료의 2차 효과인 것으로 보인다.A 39-year-old woman with a 6-month history of ITP received steroids as standard treatment without satisfactory improvement in platelet levels. The patient received intravenously two doses of 80 mg / m 2 Beltuzumab at two week intervals. Despite the low dose, the patient's B-cell level was consumed after the first dose, serum antibody levels increased to 10 μg / ml after the first dose and reached 19 μg / ml after the second dose. Then slowly removed but still measurable after 8 weeks (1 μg / ml). Most importantly, the platelet level of the patient rapidly increased from 24,000 / dl at the start of the study to the normal limit (> 150,000 / dl) within 4 days after the first dose. This complete response is still ongoing and the patient's platelets were still> 150,000 / mm <3> at the last assessment of 18 weeks after treatment. Interestingly, the patient also suffered from ulcerative colitis and did not treat the symptoms during the trial with beltumab. During the treatment of veltumab, all symptoms and symptoms of ulcerative colitis were alleviated until the current 18-week follow-up, which appears to be the secondary effect of the B-cell treatment.

변연부Margin (( marginalmarginal zonezone ) 림프종Lymphoma

변연부 림프종을 갖는 79세의 여성은 12년 전에 처음 진단되었으며, CHOP, 이후에는 CVP로 처리되었고, 리툭시맙은 처리되지 않았다. 상기 환자는 2개의 큰 장골 림프절 및 골수가 관련된 4기 질환을 나타내었다. 상기 환자는 주당 1회의 4 복용량의 138 ㎎(80 ㎎/㎡) 벨투즈맙을 정맥내 투여하였다. B-세포 레벨은 첫 번째 복용량 후 소모되었고, 혈청 항체 레벨은 이후의 복용량과 함께 증가하여, 마지막 복용량 후에는 120 ㎍/㎖에 도달한 후 천천히 제거되었지만, 마지막 평가인 12주 후에도 여전히 측정가능한 값을 가졌다(5 ㎍/㎖). 가장 중요한 것은, 상기 환자는 치료에 뛰어난 반응을 나타내었고, CT 스캔에서 장골 림프절이 정상 크기로 줄어들었으며, 골수 생검에서 음성이었다. 상기 완전 반응은 치료 후 15개월인 마지막 평가시에 현재도 계속 중이다.A 79-year-old woman with marginal lymphoma was first diagnosed 12 years ago, treated with CHOP, followed by CVP, and not with rituximab. The patient had stage 4 disease involving two large iliac lymph nodes and bone marrow. The patient was administered intravenously with 4 doses of 138 mg (80 mg / m 2) veltumab once per week. B-cell levels were consumed after the first dose, and serum antibody levels increased with subsequent doses, slowly clearing after reaching the 120 μg / ml after the last dose, but still measurable after the last assessment, 12 weeks. Had (5 μg / ml). Most importantly, the patient showed excellent response to treatment, iliac lymph nodes were reduced to normal size on CT scan and negative on bone marrow biopsy. The complete response is still ongoing at the last assessment, 15 months after treatment.

소낭성Vesicular 림프종 Lymphoma

15년의 소낭성 림프종 이력을 갖는 42세의 여성은 종래 9개월의 반응을 보였던 정맥내 벨투즈맙 투여를 포함하는 다중 치료 처방을 받았다. 상기 환자는 총 4 복용량으로 매 2주마다 80 ㎎의 벨투즈맙을 피하 주사하였다. 상기 경로에 의해 낮은 복용량을 투여함에도 불구하고, B-세포 레벨은 첫 번째 복용량 후 소모되었다. 처음 복용량 후 수일에 걸쳐 측정된 혈청 항체 레벨은 10 ㎍/㎖까지 천천히 증가하였는데, 이는 정맥내 투여로 얻어진 레벨에 상응하는 것이다. 마지막 치료 후 4주의 추적조사에서, 상기 환자를 조사한 결과 질환을 갖는 가장 큰 림프절이 줄어든 증거를 보여주었고, 4주 후 컴퓨터 단층촬영 스캔을 포함하는 반복 조사시 관련되는 림프절의 모든 치수의 합이 기준선에서의 상기 림프절의 누적 치수와 비교하여 50% 이상 감소하였으며, 이는 상기 환자가 이 시점에서 부분 반응을 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 최근 환자에 대한 추가 조사가 진행 중이지만, 양호한 생체이용성과 B-세포 소모를 갖는 활성의 증거 뿐만 아니라 질환이 >50% 감소된 것은 피하 경로가 효과적임을 입증한다.A 42-year-old woman with a 15-year history of follicular lymphoma received a multiple treatment regimen that included intravenous veltumab administration, which had previously responded to 9 months. The patient was injected subcutaneously with 80 mg of veltumab every two weeks at a total of four doses. Despite the low dose administered by this route, B-cell levels were consumed after the first dose. Serum antibody levels measured slowly over several days after the initial dose, corresponding to levels obtained by intravenous administration. At 4 weeks of follow-up after the last treatment, the patient's examination showed evidence of a reduction in the largest lymph node with disease, and after 4 weeks the sum of all dimensions of the lymph nodes involved in repeated surveys, including computed tomography scans, was baseline. Compared to the cumulative dimensions of the lymph nodes in Es, there was a reduction of at least 50%, indicating that the patient had a partial response at this point. Further investigations of these recent patients are underway, but> 50% reduction in disease as well as evidence of activity with good bioavailability and B-cell depletion demonstrates that the subcutaneous route is effective.

소낭성Vesicular 림프종 Lymphoma

4기, 등급-3의 소낭성 림프종을 갖는 41세의 남성은 8년 전에 처음 진단되었으며, 종래 CHOP 화학치료로 처리되었지만 리툭시맙은 처리되지 않았다. 상기 환자는 주당 1회 4 복용량의 80 ㎎/㎡ 벨투즈맙을 정맥내 투여받았다. B-세포 레벨은 첫 번째 복용량 후 소모되었고, 혈청 항체 레벨은 이후의 복용량과 함께 증가되어 마지막 복용량 후 86 ㎍/㎖에 도달한 후 천천히 제거되었지만, 12주 후 마지막 평가시에 여전히 측정가능한 값을 가졌다(4 ㎍/㎎). 가장 중요한 것은, 연구 시작시 존재했던 3.6 ㎝의 두피 병변을 포함하는 모든 질환이 완전히 사라졌다. 상기 완전 반응은 치료 후 9개월까지 계속되었고, 이 시점에서 새로운 병변이 FDG-PET 이미지에서 보였다. 또한, 상기 환자는 낮은 복용량의 벨투즈맙이 강력하다는 것을 보였고, 상기 환자에서 80 ㎎/㎡의 벨투즈맙만을 단일 투여한 후 순환하는 B-세포의 완화를 포함하는 완전 반응을 유도하였다.
A 41-year-old male with stage 4, grade-3 follicular lymphoma was first diagnosed 8 years ago and was treated with conventional CHOP chemotherapy but not rituximab. The patient received 4 doses of 80 mg / m 2 beltuzmab intravenously once per week. B-cell levels were consumed after the first dose, and serum antibody levels increased with subsequent doses and slowly removed after reaching 86 μg / ml after the last dose, but after 12 weeks there was still no measurable value at the last evaluation. (4 μg / mg). Most importantly, all diseases, including the 3.6 cm scalp lesions that existed at the beginning of the study, completely disappeared. The complete response continued up to 9 months after treatment, at which point new lesions were seen on the FDG-PET image. In addition, the patients showed that low doses of veltumab were potent and elicited a complete response including alleviation of circulating B-cells after a single dose of 80 mg / m 2 veltumab alone in the patient.

실시예Example 16.  16. 소낭성Vesicular 거대세포 림프종의 치료 Treatment of giant cell lymphoma

AF는 2004년 1월에 림프절 생검에 의해 CD20+로 판명된 등급 3의 소낭성 거대세포 비-호지킨 림프종을 갖는 63세의 백인 남성이다. 진단시 상기 환자의 상태는 3기였지만, 현재는 2기이다. 1992년에 상기 환자의 종래 치료는 독소루비신, 빈크리스틴, 높은 복용량의 시클로포스파미드를 포함하였으며, 24개월의 차도를 보였다. 1996년, 상기 환자는 IEC(ifosfamide, carboplatin 및 etoposide) 처방을 투여받았고, 또한 줄기세포 치료를 받았으며, 복막후 매스에 통합 방사선치료(consolidation radiation)를 받았다. 상기 환자는 88개월 동안 반응하였다. 상기 환자는 최근 B-증후군, 현저한 CBC, 혈청 화학 또는 혈청 면역글로불린 이상을 나타내지 않았고, 687 CD3-T 세포/㎕, 32 CD19-B-세포/㎕ 및 10×8 ㎝의 증가된 쇄골상 절, 2.0 및 2.8 ㎝ 직경의 왼쪽 및 오른쪽 겨드랑이 매스 및 2-3 ㎝의 측면 목 매스를 나타내었다. 상기 환자는 2주 간격으로 80 ㎎의 벨투즈맙을 4회 피하 주사하였다. 현저한 부작용이나 안전성 문제는 없었으며, 단지 주사 부위에서 미세한 일시적인 홍반성 반응과 압통(tenderness)이 있었다. 처음 주사한 후 4일에 혈액 내 CD19+ B-세포는 0으로 측정되어 완전히 완화되었다. 촉지(palpation)에 의해 측정된 상기 환자의 큰 목 매스는 처음 주사 후 4일에 50% 줄어들었고, 상기 환자는 기분이 좋아졌음을 나타내었다. CT 스캔은 다음 4주에 진행 중이다. 상기 환자는 확연히 순환하는 B-세포가 신속하게 소모되었고, 80 ㎎ 벨투즈맙의 단일 피하 주사 후 그 목 매스가 현저히 줄어들었다.AF is a 63 year old white male with grade 3 follicular giant cell non-Hodgkin's lymphoma, which was identified as CD20 + by lymph node biopsy in January 2004. The patient's condition was stage 3 at diagnosis, but is now stage 2. In 1992, the conventional treatment of this patient included doxorubicin, vincristine, high doses of cyclophosphamide, and showed a 24 month driveway. In 1996, the patient received the IEC (ifosfamide, carboplatin and etoposide) regimen, also received stem cell treatment, and received consolidation radiation on the post-peritoneal mass. The patient responded for 88 months. The patient did not show recent B-syndrome, significant CBC, serum chemistry or serum immunoglobulin abnormalities, 687 CD3-T cells / μL, 32 CD19-B-cells / μL, and an increased clavicle section of 10 × 8 cm, Left and right armpit masses of 2.0 and 2.8 cm diameter and side neck masses of 2-3 cm are shown. The patient received four subcutaneous injections of 80 mg of veltumab at two week intervals. There were no significant side effects or safety issues, only a slight temporary erythema response and tenderness at the injection site. Four days after the first injection, CD19 + B-cells in the blood were measured to zero and completely relieved. The patient's large neck mass, measured by palpation, was reduced by 50% 4 days after the first injection, indicating that the patient was feeling better. CT scans are in progress next week. The patient was rapidly consumed with apparently circulating B-cells and had significantly reduced their neck mass after a single subcutaneous injection of 80 mg Beltuzumab.

이러한 놀라운 결과는 CDRH3(카뱃 101) 치환된 항-CD20 인간화 항체인 벨투즈맙을 80 ㎎ 단일 피하 주사하면 말초 B-세포를 완화시키고 외관상 B-세포 종양 매스를 현저하게 줄일 수 있음을 보여준다. 이것은 이러한 낮은 복용량의 벨투즈맙의 피하 주사가 순환하는 및 고착 B-세포 뿐만 아니라 NHL 매스에 대해 이러한 현저한 효과를 보여준다는 첫 번째 보고이다.
These surprising results show that 80 mg single subcutaneous injection of CDRH3 (Carbat 101) substituted anti-CD20 humanized antibody, velutumab, can alleviate peripheral B-cells and significantly reduce B-cell tumor mass in appearance. This is the first report that subcutaneous injections of these low doses of Beltuzumab show this marked effect on circulating and adherent B-cells as well as NHL mass.

실시예Example 17.  17. 에반스Evans 증후군 syndrome

MT는 11개월에 다발성 혈액학적 자가항체 및 범혈구감소증 이후 추적되고 있는 3세의 아시아계 여아이다. 11개월에, 상기 환자는 설사, 왼쪽 다리의 붉은 반점, 대변의 피, 머리, 목, 몸통 및 손발 상의 확산된 일혈점 및 자반, 몇 개의 1 ㎝ 겨드랑이 절을 포함하는 자궁의 선증(cercical adeonopathy), 약간 커진 비장, 피로 증가, 식욕 감소, 힘듦, 및 말초혈 도말 상의 블라스트(blast), 증가된 세드(sed) 속도(116 ㎜/h), D-다이머의 증가, 및 과다세포성 골수(>90% 세포질)를 보여주는 골수 흡입물(aspirate), 적혈구성, 골수성 및 거핵세포성 전구체의 과다(성숙이 정지된 골수세포/후골수세포 레벨, 그러나 성숙한 호중구는 보임)를 나타내었다. 또한, 적혈구 전구체는 일부 성숙 정지를 보였지만, 세포유전학적 이상은 없었다. 실험실 연구는 또한 면역글로불린 IgA, IgG 및 IgM의 증가와 순환하는 CD19+ B-세포의 증가(48%)를 나타내었다. Ⅱb/Ⅲa 특이성을 갖는 강력한 양성 호중구 항체와 강력한 양성 혈소판 항체의 증거도 있었다. 상기 환자는 처음 스테로이드를 투여받았지만, 초기 반응이 빈약하거나 없었다. 따라서, 상기 환자는 2가지 코스의 리툭시맙을 투여받았다. 첫 번째 코스에서, 상기 환자는 매주 4 복용량을 투여받았고, 혈소판 수치는 안정화되었지만, 빈혈 및 백혈구감소증은 계속되었다. 상기 환자의 CD20 및 CD19 림프구는 감소하였지만, 5-6주 후에는 이들이 급격히 증가하였다. 리툭시맙의 두 번째 코스는 수 주에 걸쳐서 매주 3 복용량을 포함하며, 상기 환자의 혈소판 수치, 헤모글로빈 및 절대 호중구는 정상화되었고, 2-3개월 후 적혈구 및 혈소판 항체는 해소되었다. 리툭시맙에 대한 이러한 차도는 9개월 동안 지속되었지만, 일상적인 CBC 상에서 혈소판감소증이 나타났고, 적혈구, 호중구 및 혈소판 항체가 다시 검출되었다. 이후, 상기 환자는 프레드니손과 정맥내 면역글로불린을 투여받았고, 부분 반응을 보였다.MT is a 3-year-old Asian girl who has been followed up after multiple hematological autoantibodies and pancytopenia at 11 months. At 11 months, the patient had diarrhea, red spots in the left leg, blood in the stool, diffuse blood spots and purpura on the head, neck, torso and limbs, and cervical adeonopathy, including several 1 cm armpit nodes. , Slightly enlarged spleen, increased fatigue, decreased appetite, difficulty, and blast on peripheral blood smear, increased sed rate (116 mm / h), increased D-dimer, and hypercellular bone marrow (> Excess bone marrow aspirate, hematopoietic, myeloid and megakaryocyte precursors showing 90% cytoplasm) (mature / myeloid cell level at which maturation is stopped, but mature neutrophils are seen). In addition, the erythrocyte precursors showed some maturation arrest, but no cytogenetic abnormalities. Laboratory studies also showed an increase in immunoglobulin IgA, IgG and IgM and an increase in circulating CD19 + B-cells (48%). There was also evidence of potent positive neutrophil antibodies and potent positive platelet antibodies with IIb / IIIa specificity. The patient initially received steroids, but had poor or no initial response. Thus, the patient received two courses of rituximab. In the first course, the patient received 4 doses every week and platelet levels stabilized, but anemia and leukopenia continued. The CD20 and CD19 lymphocytes of these patients decreased, but after 5-6 weeks they rapidly increased. The second course of rituximab included three doses per week over several weeks, in which the platelet levels, hemoglobin and absolute neutrophils of the patient were normalized and erythrocytes and platelet antibodies were resolved after 2-3 months. This difference to rituximab lasted for 9 months, but thrombocytopenia appeared on routine CBC and red blood cells, neutrophils and platelet antibodies were detected again. The patient then received prednisone and intravenous immunoglobulin and showed partial response.

이후, 리툭시맙의 세 번째 코스에서, 매주 2 복용량이 투여되었고, 공격적인 의료적 관리가 필요한 두 번의 과민증(anaphylaxis)이 나타났다. 상기 환자는 2-3개월 일시적인 반응을 보였지만, 범혈구감소증과 혈액학적 항체가 재발하였다. 지금까지 상기 환자는 빈혈용으로 수혈을 받아 왔으며, 적혈구 항체와 빈혈이 가장 현저한 문제였고, 간헐적인 혈소판감소증이 나타났다; 상기 환자는 스테로이드 또는 정맥내 면역글로불린에 반응하지 않았다.Later, in the third course of rituximab, two doses were administered weekly, with two anaphylaxis requiring aggressive medical management. The patient showed a transient response of 2-3 months, but recurred pancytopenia and hematological antibodies. To date, the patient has been transfused for anemia, erythrocyte antibodies and anemia were the most prominent problems, with intermittent thrombocytopenia; The patient did not respond to steroids or intravenous immunoglobulins.

다음의 옵션은 비장절제술 또는 세포독성 화학치료 코스이기 때문에, 상기 환자는 10 ㎎ 피하, 2주 후 10 ㎎ 복용량의 반복된 벨투즈맙 피하 투여로 이루어지는 실험적인 처방의 벨투즈맙을 투여받는다. 두 번째 복용량 전에, 순환하는 CD19-양성 B-세포의 소모가 발견되고, 적혈구 및 혈소판 수치에서의 개선이 관찰된다. 상기 두 번째 벨투즈맙의 피하 주사 2주 후, 상기 환자의 일반적인 증상이 개선되고, 적혈구, 호중구 및 혈소판 항체는 거의 측정할 수 없으며, 모든 혈액학적 이상이 현저하게 개선되고, 혈소판, 호중구, RBC 수치는 정상 범위의 하한값이다. 치료 2개월 후, 상기 환자는 여전히 차도가 있다. 벨투즈맙 치료 동안의 임의의 시점에서 과민증에 대한 어떠한 증거도 없었는데, 이는 리툭시맙에 대한 면역 교차반응성이 없고, 매우 낮은 피하 복용량의 벨투즈맙이 에반스 증후군을 갖는 상기 환자에게 치료적이었음을 나타낸다.
Since the next option is a splenectomy or cytotoxic chemotherapy course, the patient is administered an experimental prescription veltumab consisting of 10 mg subcutaneous, repeated subcutaneous administration of 10 mg doses after 2 weeks. Prior to the second dose, depletion of circulating CD19-positive B-cells is found, and an improvement in erythrocyte and platelet levels is observed. Two weeks after the second subcutaneous injection of veltumab, the general symptoms of the patient are improved, erythrocytes, neutrophils and platelet antibodies are hardly measurable, all hematologic abnormalities are markedly improved, platelet, neutrophil, RBC levels Is the lower limit of the normal range. After 2 months of treatment, the patient is still in a driveway. There was no evidence of hypersensitivity at any point during the veltumab treatment, indicating that there was no immune cross-reactivity to rituximab, and that very low subcutaneous doses of veltumab were therapeutic for those patients with Evans syndrome.

실시예Example 18. 만성 림프구성 백혈병 18. Chronic Lymphocytic Leukemia

RT는 3년의 만성 림프구성 백혈병 이력을 갖는 47세의 여성으로서, 지금은 알렘투즈맙(CAMPATH®)의 코스 후 재발했지만, 이전의 이력은 상기 환자가 다양한 기간 동안 클로람부실 및 다른 세포독성 약물에 반응했음을 보여준다. 상기 환자는 지금 골수에서의 CLL의 증거와, 58,000/ccm의 현저한 블라스트의 증가된 말초 림프구 수치도 보인다. 상기 환자는 6주 동안 주당 2회 40 ㎎의 벨투즈맙을 피하 주사받으며, 두 번째 주사 후 말초 림프구 수치는 55% 떨어진다. 네 번째 피하 주사 2주 후, 말초혈 수치는 정상 범위를 약간 상회하지만, 보다 중요한 것은 골수 흡입물이 뚜렷이 양호한 부분 반응을 보이고, 임상적인 피로 증상, 점상출혈 및 확산된 거대 경부 및 다른 림프절이 급격하게 개선된다.
RT is a 47-year-old woman with a history of chronic lymphocytic leukemia of 3 years, now relapses after a course of Alemtuzumab (CAMPATH®), but previous history has shown that the patient has lost chlorambucil and other cytotoxicity over various periods of time. Show that you responded to the drug. The patient now also shows evidence of CLL in the bone marrow and increased peripheral lymphocyte levels of marked blasts of 58,000 / ccm. The patient received subcutaneous injections of 40 mg of Beltuzumab twice per week for six weeks, with peripheral lymphocyte levels dropping 55% after the second injection. Two weeks after the fourth subcutaneous injection, peripheral blood levels are slightly above the normal range, but more importantly, bone marrow inhalation shows a markedly good partial response, with clinical fatigue symptoms, pointed bleeding and diffuse large neck and other lymph nodes. Is improved.

실시예Example 19. 면역 혈소판감소성 자반( 19. Immune thrombocytopenic purpura ( ITPITP ))

RH는 1.5년 동안의 ITP 이력과, 4번의 종래 치료를 갖고, 비장적출술은 하지 않았으며, 기준선에서 26,000 혈소판/cmm을 나타내는 66세된 남성이다. 상기 환자는 2주 간격으로 40 ㎎ 벨투즈맙을 피하로 2 복용량 투여한다. 두 번째 주사 전에, 상기 환자의 혈액 CD19+ 림프구의 측정 결과 <90% 감소를 보여준다. 상기 두 번째 벨투즈맙 주사 2주 후, 혈소판 수치가 두배가 되는데, 치료 후 5번째 주까지 70,000까지 증가하고, 11주까지 유지되지만, 상기 혈소판 수치는 <5,000/cmm의 수치로 다시 떨어진다. 이후, 상기 환자는 다시 2주 간격으로 30 ㎎의 벨투즈맙이 2회 반복 투여된다. 상기 두 번째 주사 4일 후, 혈소판 수치는 28,000/cmm까지 증가한 후, 치료 후 3주까지 42,000/cmm까지 증가된다. 치료 6주 후, 상기 혈소판 수치는 67,000/cmm까지 현저하게 증가되고, 상기 환자는 양호한 부분 반응을 갖는 것으로 간주되며, 벨투즈맙 치료 동안에 출혈 또는 점상출혈의 증거는 없고, 풀타임(full-time) 활성 및 작용으로 되돌아간다.
RH is a 66 year old male with an ITP history of 1.5 years, 4 conventional treatments, no splenectomy, and 26,000 platelets / cmm at baseline. The patient is administered subcutaneously in two doses of 40 mg veltumab at two week intervals. Prior to the second injection, the measurement of blood CD19 + lymphocytes of the patient shows a <90% decrease. Two weeks after the second Beltuzumab injection, platelet levels were doubled, increasing to 70,000 until the fifth week after treatment and maintained until 11 weeks, but the platelet levels dropped back to <5,000 / cmm. Thereafter, the patient is administered again with 30 mg of veltumab twice at two week intervals. Four days after the second injection, platelet levels increase to 28,000 / cmm and then up to 42,000 / cmm until three weeks after treatment. After 6 weeks of treatment, the platelet levels are significantly increased up to 67,000 / cmm, the patient is considered to have a good partial response, no evidence of bleeding or bleeding during veltumab treatment, and full-time Return to activity and action.

실시예Example 20.  20. 류마티스Rheumatism 관절염 arthritis

FH는 3개월에 걸쳐서 특히 손목의 관절 통증이 점진적으로 나타난 37세의 여성으로서, 약 40분의 이른 아침의 강직(stiffness)과 통증을 갖는다. 조사 시, 상기 환자의 손목 및 양 손의 중수수지(metacarpophalangeal) 관절이 모두 부풀어 오르고 압통이 있지만, 변형되지는 않는다; 결절(nodule)이나 혈관염 병변은 없다. 상기 환자는 30 ㎎/ℓ의 증가된 C-반응성 단백질(CRP) 레벨을 갖고, 다른 실험실 발견은 정상이지만, 류마티스성 인자 및 항핵 항체는 양성이다. 상기 환자는 분명히 RA의 초기이며, 먼저 이부프로펜으로 치료된다. 그러나, 일부 초기의 증상 개선에도 불구하고, 손의 통증, 강직 및 부풀어 오름은 지속되고, 2개월 후, 상기 환자의 무릎도 유사한 영향을 받는다. 처음 제시된지 6개월 후, 상기 환자는 왼쪽 팔꿈치에 작고, 통증이 없고 움직이지 않지만 압통이 없는 3개의 피하 결절이 나타난다. 손의 X-선은 중수골 두부에서의 뼈의 부식을 보이고, 다시 CRP가 증가된다(53 ㎎/ℓ). 상기 환자는 이제 120 ㎎의 벨투즈맙을 매주 1회 3번 피하 접종한다. 상기 환자의 첫 번째 개선 증거는 아침의 관절 통증과 강직이 약 15분으로 감소된 것을 발견한 두 번째 주사 후에 일어나며, 세 번째 주사 2주 내에 상기 환자는 개선된 이동성을 경험하고, 관절의 부풀어 오름은 줄어들며, CRP 레벨은 정상 범위를 약간 상회하는 15 ㎎/ℓ까지 떨어진다. 상기 환자의 RA 증상 및 사인은 다음의 8주 동안의 추적조사에서 현저하게 개선된다. 벨투즈맙 치료 또는 그 2개월 후에는 메토트렉세이트 또는 스테로이드 치료가 필요하지 않다.
FH is a 37-year-old woman with progressive wrist pain, especially over three months, with about 40 minutes of early morning stiffness and pain. Upon irradiation, both metacarpophalangeal joints of the patient's wrist and both hands are swollen and tender, but not deformed; No nodules or vasculitis lesions. The patient has an increased C-reactive protein (CRP) level of 30 mg / L and other laboratory findings are normal, but rheumatoid factor and antinuclear antibodies are positive. The patient is clearly early in RA and is first treated with ibuprofen. However, despite some early symptom improvement, hand pain, stiffness and swelling persist, and after two months, the knee of the patient is similarly affected. Six months after the initial presentation, the patient shows three subcutaneous nodules in the left elbow that are small, painless and immobile but without tenderness. X-rays of the hands show bone erosion in the metacarpal head, again increasing CRP (53 mg / l). The patient is now subcutaneously inoculated with 120 mg of veltumab three times weekly. The patient's first improvement evidence occurs after the second injection, which found a decrease in morning joint pain and stiffness to about 15 minutes, and within two weeks of the third injection, the patient experienced improved mobility and swelling of the joints. Decreases and the CRP level drops to 15 mg / l slightly above the normal range. The symptoms and signs of RA in these patients are significantly improved at the next 8 weeks of follow-up. There is no need for methotrexate or steroid treatment after beltuzumab treatment or two months later.

실시예Example 21. 관절염을 갖는  21. Having arthritis 쇼그렌Sjogren 증후군 syndrome

K.S.는 구강건조증의 평가를 위해 구강 외과의에게 이송된 41세의 여성이다. 증가된 침전 속도(ESR, 60 ㎜/h)를 제외하고, 상기 환자는 현저한 실험적 이상은 보이지 않는다. 상기 환자는 2개월 후 약한 결막염과 안질이 발생된다. 상기 환자의 류마티스성 인자는 양성이 되고, 총 혈청 단백질은 증가하며(100 g/ℓ), 또한 IgG 레벨도 증가한다(30 g/ℓ). 셔머(Schirmer) 테스트는 매우 비정상이다(오른쪽 눈은 단지 3 ㎜의 필터 스트립만이, 그리고 왼쪽 눈은 1 ㎜의 필터 스트립만이 젖게 된다). 상기 환자는 메틸셀룰로오스 점안액으로 치료하여 망막의 궤양을 방지하고, 그 다음 해에 걸쳐서 류마티스성 인자 역가 및 항핵 항체가 꾸준히 증가하며, 손 및 손목에서 다발성관절염 변화 증거가 발생된다. 상기 환자는 약한 쇼그렌 증후군을 갖는 것으로 간주되며, 관절염용으로 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)을 투여받지만, 시카(sicca) 복합체에 대한 효과는 없다. 이후, 상기 환자는 벨투즈맙 코스를 받으며, 15 ㎎의 정맥내 투여부터 시작하여, 1주일 후 매주 40 ㎎의 벨투즈맙을 추가적으로 3회 피하 주사한다. 상기 치료 코스의 완료 2주 후, 상기 환자의 다발성관절염 증상 및 사인은 상당히 개선된 것으로 보이지만, 가장 극적인 효과는 개선된 셔머 테스트에 의해 확인된 타액분비의 개선이다. 상기 환자는 이제 단지 최소한의 구강건조증을 가지며, 결막염 또는 안질은 없고, 이러한 차도는 4개월 동안 유지된다.
KS is a 41-year-old woman who was sent to an oral surgeon for evaluation of dry mouth. Except for the increased settling rate (ESR, 60 mm / h), the patient shows no significant experimental abnormalities. The patient develops mild conjunctivitis and ocular after 2 months. The patient's rheumatic factor is positive, total serum protein is increased (100 g / l), and also IgG levels are increased (30 g / l). The Schirmer test is very abnormal (right eye only 3 mm filter strip and left eye only 1 mm filter strip). The patient is treated with methylcellulose eye drops to prevent retinal ulceration, steadily increasing rheumatoid factor titers and antinuclear antibodies over the next year, and evidence of polyarthritis changes in the hands and wrists. The patient is considered to have mild Sjogren's syndrome and is administered a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) for arthritis, but has no effect on the sicca complex. The patient then receives the Beltuzumab course, starting with an intravenous dose of 15 mg, and injecting an additional three subcutaneous injections of 40 mg of Beltuzumab each week after one week. Two weeks after the completion of the course of treatment, the symptoms and signs of polyarthritis in the patient appear to be significantly improved, but the most dramatic effect is the improvement in salivary secretion confirmed by the improved Shimmer test. The patient now has only minimal dry mouth, no conjunctivitis or eyeballs, and this drive is maintained for four months.

실시예Example 22. 신장 이식 동안의 탈감작( 22. Desensitization during kidney transplantation desensitizationdesensitization ))

SW는 이전에 5번의 정상 출산을 하고, 말기 신장 질환을 갖는 55 ㎏의 56세 여성이며, 왼쪽 신장을 교체하기 위한 이식을 기다리고 있다. 상기 환자는 HLA에 높게 감작되어 있어, 항-HLA 항체에 대한 높은 역가를 보인다. 상기 환자는 규칙적으로 혈액투석을 한다. 신장 이식을 진행하기 위하여, 상기 환자는 항-HLA 항체에 대해 탈감작할 필요가 있으며, 따라서 120 g의 1회 복용량의 인간 폴리클론 면역 글로불린(10% 제형)을 정맥내 투여받고, 4일 후 40 ㎎의 벨투즈맙을 피하 주사받는다. 벨투즈맙의 피하 주사는 8일, 12일 및 21일에 다시 반복된다. 첫 번째 주사 후, 혈액의 CD19+ B-세포는 전체적으로 사라지며, 벨투즈맙을 네 번째 피하 주사한지 8주 후에도 소모된 채로 남아 있다.SW is a 55 kg 56 year old female with 5 normal births previously and with end stage kidney disease and is waiting for a transplant to replace the left kidney. The patient is highly sensitized to HLA, showing high titers against anti-HLA antibodies. The patient regularly undergoes hemodialysis. In order to proceed with kidney transplantation, the patient needs to desensitize against the anti-HLA antibody, thus receiving 120 g of a single dose of human polyclonal immunoglobulin (10% formulation) intravenously and 40 days later. Mg of Beltuzumab is injected subcutaneously. Subcutaneous injections of veltumab are repeated again at 8, 12 and 21 days. After the first injection, the CD19 + B-cells in the blood disappear as a whole and remain consumed 8 weeks after the fourth subcutaneous injection of veltumab.

정맥내 면역 글로불린을 투여하기 전에, 상기 환자는 정맥내로 40 ㎎의 메틸프레드니솔론, 경구로 650 ㎎의 아세트아미노펜 및 50 ㎎ 디펜히드라민을 투여한다. 이후의 벨투즈맙 주사 전에 어떠한 예비투약도 없다. 이러한 코스의 이식전 치료 후, 패널-반응성 항체 레벨은 현저하게 감소되고, T-세포 유세포 분석 교차-일치는 이식 전에 50% 떨어진 것으로 나타난다. 3개월 후, 상기 환자는 사망한 공여자로부터 신장을 이식받고, 이후 전형적인 유도 치료를 받은 후(피하로 30 ㎎ 알렘투즈맙), 프레드니손, 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및 타크롤리무스(tacrolimus)로 이루어지는 면역억제 치료를 받으며, 그 후년에 걸쳐 그 양을 줄일 뿐만 아니라 예방용 항생제를 투여받는다. 상기 환자는 이식후 1년간 모니터링할 때 거부반응을 나타내지 않고, 신장 기능은 정상화된다. 신장 이식이 필요한 환자를 매우 효과적으로 탈감작시켜 성공적으로 이식시키는 성공적인 경우인 것으로 보인다.
Prior to intravenous immunoglobulin administration, the patient is administered 40 mg methylprednisolone, orally 650 mg acetaminophen and 50 mg diphenhydramine intravenously. There is no predose prior to subsequent Beltuzumab injections. After pre-transplant treatment of this course, panel-reactive antibody levels are markedly reduced and T-cell flow cytometry cross-match appears to be 50% prior to transplantation. Three months later, the patient was transplanted with kidneys from a deceased donor and then after typical induction treatment (subcutaneously 30 mg alemtuzumab), prednisone, mycophenolate mofetil and tacrolimus. Receive immunosuppressive treatment, and reduce prolonged doses over the next year, as well as prophylactic antibiotics. The patient shows no rejection when monitored for one year after transplantation, and renal function is normalized. It appears to be a successful case of highly effective desensitization and successful transplantation of patients in need of a kidney transplant.

실시예Example 23. 항- 23. Anti- CD20CD20 항체의 구조-기능 상관관계 및 치료 특성 Structure-function Correlation and Therapeutic Properties of Antibodies

리툭시맙을 개선하기 위한 접근법인 림프종 및 자가면역 질환 치료에 도입된 첫 번째 키메라 항-CD20 MAb는 CDR-이식(인간화)하고, 유전자변형 마우스로부터 완전한 인간 MAb를 만들어 설치류 성분을 감소시키고, 상이한 CD20 에피토프를 표적화하고, Fc 구조를 변경시켜 CDC 또는 ADCC 활성을 증가시키는 것을 포함한다(Forero et al, Proc 99 th Ann Meeting of the Am Assoc Cancer Res, 2008, abstract LB-70; Glennie et al., Mol Immunol. 2007, 44:3823-37). 그러나, 이러한 변형 중 어느 것이 B-세포 소모, 자가면역의 조절, 또는 환자에서의 림프종 반응으로 측정할 때, 특히 이들이 리툭시맙에 대해 굴절성 또는 저항성일 때 더욱 강력한 항-CD20 MAb를 생성하는지는 아직 알지 못한다.The first chimeric anti-CD20 MAb introduced in the treatment of lymphoma and autoimmune disease, an approach to improving rituximab, is CDR-transplanted (humanized), produces fully human MAbs from transgenic mice, reducing rodent components, Targeting CD20 epitopes and altering Fc structure to increase CDC or ADCC activity (Forero et al, Proc 99 th Ann Meeting of the Am Assoc Cancer Res , 2008, abstract LB-70; Glennie et al., Mol Immunol . 2007, 44: 3823-37). However, which of these modifications produce more potent anti-CD20 MAbs, as measured by B-cell consumption, regulation of autoimmunity, or lymphoma response in patients, particularly when they are refractive or resistant to rituximab. Do not know yet.

현재, 리툭시맙은 소낭성 림프종을 갖는 환자 약 절반에서 객관적 반응(objective response), 대부분 부분 반응을 유도하지만(Castillo et al., Exp Hematol. 2008, 36:755-768), 최적 치료 복용량 및 스케줄은 아직 명확하지 않은 채로 남아있다. 지난 10년 동안 사실상 모든 NHL 환자에 리툭시맙을 사용함에도 불구하고, 모델 시스템 또는 환자에서 CDC, ADCC 및 아폽토시스 효과를 갖는 직접 신호전달에 의해 매개되는 세포사를 보여주는 많은 연구에서 그 작용 메카니즘 뿐만 아니라 다른 항-CD20 MAb의 작용 메카니즘도 논란이 있다(Glennie et al, Mol Immunol. 2007, 44:3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:226-232; Martin et al, Semin Hematol. 2008;45:126-132).Currently, rituximab induces an objective response, mostly in partial response, in about half of patients with follicular lymphoma (Castillo et al., Exp Hematol . 2008, 36: 755-768), the optimal treatment dose and schedule remain unclear. Despite the use of rituximab in virtually all NHL patients over the past decade, many studies showing cell death mediated by direct signaling with CDC, ADCC and apoptosis effects in model systems or patients have different mechanisms of action as well as others. The mechanism of action of anti-CD20 MAb is also controversial (Glennie et al, Mol Immunol . 2007, 44: 3823-37; Maloney, Hematology Am Soc Hematol Educ Program . 2007: 226-232; Martin et al, Semin Hematol . 2008; 45: 126-132).

NHL 환자에서 에프라투즈맙과 조합된 리툭시맙이 리툭시맙만의 단독치료 결과보다 부작용이 증가하지 않는다는 개선된 반응을 보인다는 증거가 있다는 본 발명자들의 관찰로 인하여(Goldenberg, Expert Rev Anticancer Ther. 2006, 6:1341-1353; Leonard et al., J Clin Oncol. 2005, 23:5044-5051; Strauss et al, J Clin Oncol. 2006, 24:3880-3886), 본 발명자들의 본래 목적은 에프라투즈맙과 조합될 수 있지만 에프라투즈맙의 FR을 갖기 때문에 신속한 투여에 대해 보다 내성을 가지는 인간화 항-CD20 MAb를 구축하는 것이었다. 벨투즈맙의 첫 번째 특성 연구는 에피토프 결합, 친화성, ADCC, CDC 및 시험관내 세포 성장 저해의 측면에서 리툭시맙과의 유사성을 보고하였다(Stein et al., Clin Cancer Res. 2004, 10:2868-78). 가벼운 NHL을 갖는 환자를 치료한 후, 예상되는 개선된 내성과 투여 프로필은 확인되었지만, 높은 속도의 완전 반응(CR/CRu)도 발견되었다. 82명의 가벼운 NHL 환자에서의 Ⅰ/Ⅱ상 시험은 테스트된 모든 복용량에 대해 완전 반응 속도를 나타내었으며(주당 1회 × 4주의 80 내지 750 ㎎/㎡ 사이의 복용량에 대해 모든 소낭성 림프종 환자에 대해 27%)(Morschhauser et al, Proc Am Soc Clin Oncol , J Clin Oncol. 2007, 25(18S):449s, Abstract 8032; Goldenberg et al, Proc Amer Soc Clin Oncol , J. Clin . Oncol. 2008, 26(15S): 142s, Abstract. 3043; Morschhauser et al, J Clin Oncol 2009 Jul 10;27(20):3346-53. Epub 2009 May 18), 상응하는 환자에서의 종래 복용량에서 리툭시맙을 반복 사용할 때에 보고된 것을 상회한다(Davis et al, J Clin Oncol. 2000, 18:3135-3143). 이러한 발견은 본 발명자들이 리툭시맙과 비교하여 벨투즈맙의 기능적 특성을 재평가하도록 유도하였다.Due to our observation that there is evidence that Rituximab in combination with Epratuzmab in NHL patients has an improved response that results in no increase in side effects than Rituximab alone treatment (Goldenberg, Expert Rev). Anticancer Ther . 2006, 6: 1341-1353; Leonard et al., J Clin Oncol . 2005, 23: 5044-5051; Strauss et al, J Clin Oncol . 2006, 24: 3880-3886), the original purpose of the inventors was to construct a humanized anti-CD20 MAb which can be combined with epratumab but more resistant to rapid dosing because it has an FR of epratumab. The first characterization of beltuzumab reported similarities with rituximab in terms of epitope binding, affinity, ADCC, CDC, and in vitro cell growth inhibition (Stein et al., Clin Cancer Res . 2004, 10: 2868-78). After treating patients with mild NHL, expected improved resistance and dosing profiles were identified, but high rates of complete response (CR / CRu) were also found. Phase I / II trials in 82 mild NHL patients showed complete response rates for all doses tested (once per week for all follicular lymphoma patients for doses between 80 and 750 mg / m 2 × 4 weeks). 27%) (Morschhauser et al, Proc Am Soc Clin Oncol , J Clin Oncol . 2007, 25 (18S): 449s, Abstract 8032; Goldenberg et al, Proc Amer Soc Clin Oncol , J. Clin . Oncol . 2008, 26 (15S): 142s, Abstract. 3043; Morschhauser et al, J Clin Oncol 2009 Jul 10; 27 (20): 3346-53. Epub 2009 May 18), surpasses those reported when repeated use of rituximab at conventional doses in corresponding patients (Davis et al, J Clin). Oncol . 2000, 18: 3135-3143). This finding led us to reevaluate the functional properties of veltuzmab in comparison to rituximab.

시노몰구스 원숭이에서의 연구(실시예 12)는 다양한 정맥내 및 피하 복용량의 효과를 확인하였으며, 본 발명자들은 인간에서 80 ㎎/㎡에 상당하는만큼 낮은 단일 복용량이 어느 경로로 투여되든 말초혈 및 림프 기관 B-세포 소모를 유도하기에 충분히 강력하다는 것을 발견하였다. 아울러, 0.05 ㎍만큼 낮은 복용량의 단일 복강 또는 피하 접종된 CD20+ 림프종 이종이식을 갖는 마우스에서 향상된 생존, 심지어 치료를 보였다. 이들 마우스 연구에서, 복용량-반응이 관찰되었지만, 정맥내 또는 피하 경로 사이의 현저한 차이점은 나타나지 않았다.Studies in cynomolgus monkeys (Example 12) confirmed the effects of various intravenous and subcutaneous doses, and the inventors have found that peripheral blood and no matter what route is administered in a single dose as low as 80 mg / m 2 in humans. It was found to be strong enough to induce lymphoid B-cell depletion. In addition, mice with improved survival and even treatment were shown in mice with single intraperitoneal or subcutaneously inoculated CD20 + lymphoma xenografts as low as 0.05 μg. In these mouse studies, dose-response was observed, but no significant differences between the intravenous or subcutaneous routes appeared.

상이한 항-CD20 MAb는 기능적 특성과 에피토프 특이성에서 일부 다양성을 보이고, 상이한 CDC 및 세포사 효과를 매개하지만(Nishida et al., Int J Oncol. 2007, 31:29-40), 사실상 모두 큰 세포외 루프(loop)를 인식하고, 새로운 CD20 에피토프에 결합한다고 보고되어 있는 오파투무맙(ofatumumab)을 제외하고는(Teeling et al., J Immunol. 2006, 177:362-371) 서로 부분적으로 또는 완전히 교차블록한다(Polyak et al., J Immunol. 1998, 161:3242-3248; Polyak and Deans, 2002, 99:3256-3262; Perosa et al., Blood 2006, 107:1070-1077). 벨투즈맙은 리툭시맙에 의한 결합을 교차블록하는데(Stein et al., Clin Cancer Res. 2004, 10:2868-78), 이는 양쪽 MAb에 의해 동일한 에피토프가 인식되거나, 인접한 에피토프에 결합한 결과 입체 장애가 생긴다는 것을 제시한다.Different anti-CD20 MAbs show some diversity in functional properties and epitope specificities and mediate different CDC and cell death effects (Nishida et al., Int J Oncol . 2007, 31: 29-40), but virtually all large extracellular loops except for ofatumumab, which has been reported to recognize loops and bind to new CD20 epitopes (Teeling et al., J Immunol . 2006, 177: 362-371), partially or completely cross-blocking each other (Polyak et al., J Immunol . 1998, 161: 3242-3248; Polyak and Deans, 2002, 99: 3256-3262; Perosa et al., Blood 2006, 107: 1070-1077). Veltuzumab cross-blocks binding by rituximab (Stein et al., Clin Cancer Res . 2004, 10: 2868-78), suggesting that the same epitope is recognized by both MAbs, or that steric hindrance occurs as a result of binding to adjacent epitopes.

상기 실시예에서, 벨투즈맙과 리툭시맙의 결합 및 해리 파라미터를 스캐차드 분석(실시예 3) 및 오프-속도 측정(실시예 5) 모두에 의해 비교하였다. 상기 스캐차드 분석은 세포-표면 CD20 및 세포당 결합 부위의 수에 대해 벨투즈맙과 리툭시맙이 유사한 친화성을 갖는다는 것을 확인하였다(실시예 3). 놀랍게도, 벨투즈맙 또는 cA20 대 리툭시맙 또는 D101N 사이에 통계적으로 유의한 차이가 테스트된 3가지 인간 림프종 세포주 모두에서 리툭시맙 또는 D101N과 비교하여 더 느린 오프-속도(즉, 더 긴 세포 표면 유지)(실시예 5) 및 Daudi 림프종 세포에서 벨투즈맙에 의한 더 높은 CDC-매개성 세포사(실시예 8)가 발견되었다. 경쟁 결합제의 존재시 또는 부재시 측정되는 것과 무관하게, CDR3-VH에서 Asn101 대신 Asp101을 함유하는 벨투즈맙과 cA20 모두 리툭시맙 또는 D101N보다 현저하게(P<0.0001) 느린 오프-속도(∼2.5배)를 나타냈다(실시예 5).In this example, the binding and dissociation parameters of beltuzumab and rituximab were compared by both the scaffold analysis (Example 3) and off-rate measurements (Example 5). The Scatchard analysis confirmed that Beltuzumab and Rituximab had similar affinities for cell-surface CD20 and the number of binding sites per cell (Example 3). Surprisingly, a slower off-rate (ie, longer cell surface maintenance) compared to Rituximab or D101N in all three human lymphoma cell lines tested with statistically significant differences between Veltuzumab or cA20 versus Rituximab or D101N. (Example 5) and higher CDC-mediated cell death by Veltumab in Daudi lymphoma cells (Example 8). In the presence of a competing agent in the absence or the irrelevant as measured, significantly higher than all beltu containing Asp Asn 101 101 instead of in the CDR3-VH jeumap and cA20 rituximab or D101N (P <0.0001) a slow off-rate (to 2.5 Times) (Example 5).

Daudi에서 벨투즈맙에 대한 CDC 활성이 리툭시맙 또는 D101N보다 현저하게 높다는 사실은 흥미로운데, 그 이유는 벨투즈맙의 Fc 부위가 CDC 기능을 나타내는데 실패한 에프라투즈맙의 Fc 부위로부터 유래되기 때문이다(Carnahan et al., Mol Immunol. 2007, 44:1331-41). 이것은 에프라투즈맙의 신속한 내재화가 막 공격 복합체를 형성하기에 충분히 에프라투즈맙이 세포 표면 상에 오래 남아있는 것을 방지할 수 있음을 제시한다. 상기 결과는 또한 벨투즈맙과 리툭시맙 사이의 오프-속도의 차이는 처음 오파투무맙에 대해 상정된 것과 같은(Teeling et al., Blood 2004, 104:1793-1800) Daudi 세포에서 관찰되는 증가된 CDC와 관련이 없음을 제시하는데, 그 이유는 이러한 차이는 리툭시맙과 비교하여 벨투즈맙이 현저하게 느린 오프-속도를 보이는 다른 2가지 세포주에서의 CDC에 대해서는 관찰되지 않기 때문이다(실시예 5 및 실시예 8). 벨투즈맙에 대한 이러한 결과는 오파투무맙과 상이한 CD20의 표적화 에피토프를 명백하게 포함하고 있으므로, 이러한 오프-속도 변화가 틸링 등(Teeling et al., (2004))에 의해 상정된 것과 같은 에피토프의 위치 때문으로는 보이지 않는다. 그럼에도 불구하고, 오파투무맙에 대해 틸링 등(Teeling et al., (2004))이 제시하고 본 발명에서 벨투즈맙에 대해 보고한 바와 같이, 이러한 오프-속도 변화는 본 발명자들이 벨투즈맙에서 발견한 것과 같이(실시예 12 및 실시예 13), 다른 MAb(예컨대, 리툭시맙)보다 더 낮은 농도에서 주어진 CD20 항체가 기능하는가를 설명할 수 있다. CDC가 역할을 하는지는 아직 알려져 있지 않다.It is interesting to note that the CDC activity against beltuzmab in Daudi is significantly higher than rituximab or D101N, since the Fc region of veltumab is derived from the Fc region of epratumab which failed to exhibit CDC function (Carnahan et al., Mol Immunol . 2007, 44: 1331-41). This suggests that rapid internalization of epratumab can prevent epratumab from remaining on the cell surface long enough to form a membrane attack complex. The results also show that the difference in off-rate between beltuzumab and rituximab was increased in the Daudi cells as initially assumed for opatumumab (Teeling et al., Blood 2004, 104: 1793-1800). It is not related to CDC, since this difference is not observed for CDC in the other two cell lines where beltuzumab exhibits a significantly slow off-rate compared to rituximab (Example 5). And Example 8). These results for beltuzumab clearly include a targeting epitope of CD20 that is different from opatumumab, so this off-rate change is due to the position of the epitope as assumed by Tilling et al. (2004). Invisible. Nevertheless, as reported by Tilling et al. (2004) for opatumumab and reported for beltuzmab in the present invention, this off-rate change was found by the inventors in beltuzumab. As shown in Examples 12 and 13, one can explain whether a given CD20 antibody functions at a lower concentration than other MAbs (eg, rituximab). It is not yet known whether CDC plays a role.

이러한 차이가 에프라투즈맙의 FR을 갖는 벨투즈맙과 연관이 있을 것 같지는 않다. cA20의 VH 및 Vκ 사슬은 리툭시맙과는 6개 부위에서 다르지만, CDRH3의 101 잔기를 제외하고, 나머지 다섯 잔기(FR4-VH 내의 2개 및 FR1-Vκ 내의 3개)는 상이한 오프-속도에 대한 책임이 있을 것 같지 않다. 두 등(Du et al., Mol Immunol. 2008, 45:2861-2868)은 리툭시맙과 비교하여 다른 항-CD20 MAb인 c2H7의 CDR들의 상호작용이 약한 것을 보고하였는데, 이는 CDRH3 내의 상응하는 부위에서 2H7의 아미노산 잔기가 더욱 커다란 측쇄를 갖고, 그 결과 CD20 펩티드를 수용하기 위한 더 큰 주머니를 갖는다는 것을 제시한다. cA20 및 벨투즈맙이 사실상 동일한 친화성 및 오프-속도를 갖지만, cA20은 벨투즈맙보다 리툭시맙과 더욱 유사한 FR을 갖는다는 사실은 CD20과 상호작용함에 있어서 FR보다 CDR의 역할이 더욱 중요하다는 것을 강조한다. 따라서, 벨투즈맙/cA20 및 리툭시맙/D101N 사이에서 관찰되는 오프-속도의 현저한 차이는 CDRH3에서의 단일한 아미노산 차이로 인한 것임이 명백하며, 벨투즈맙과 리툭시맙 사이의 보다 광범위한 FR에서의 차이로 인한 것은 아니다. 따라서, 본 발명자들은 이것은 기능적인 효과를 초래하여 더욱 강력한 항체가 되도록 하는 것으로 보이는 CDR에서의 첫 번째 단일 아미노산 변화라고 믿고 있다.This difference is unlikely to be associated with Beltuzumab with the FR of Epratumab. The V H and V κ chains of cA20 differ in six sites from rituximab, but the remaining five residues (two in FR4-V H and three in FR1-V κ ) differ from the 101 residues of CDRH3. It's unlikely to be responsible for off-speed. Du et al., Mol Immunol . 2008, 45: 2861-2868) reported a weak interaction of CDRs of c2H7, another anti-CD20 MAb, compared to Rituximab, with the amino acid residue of 2H7 having a larger side chain at the corresponding site in CDRH3. The results suggest that they have larger pockets for accommodating CD20 peptides. Although cA20 and veltumab have virtually the same affinity and off-rate, the fact that cA20 has a FR more similar to rituximab than beltuzmab emphasizes that the role of CDR is more important than FR in interacting with CD20. do. Thus, it is evident that the significant difference in off-rate observed between beltuzumab / cA20 and rituximab / D101N is due to a single amino acid difference in CDRH3, in the broader FR between beltuzmab and rituximab. Not due to difference. Thus, the inventors believe that this is the first single amino acid change in the CDR that appears to result in a functional effect resulting in a more potent antibody.

본 발명에서 개시한 시험관내 오프-속도 및 CDC 차이는 리툭시맙과 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 보고되고(Teeling et al., J Immunol. 2006, 177:362-371) 시험관내에서 리툭시맙보다 치료학적으로 더욱 활성인 것으로 주장된(Teeling et al., Blood 2004, 104:1793-1800) 다른 항-CD20 MAb인 오파투무맙에서 발견된 것과 필적할만하다. 그러나, 이것은 임상 연구를 위해 선택된 리툭시맙과 같이 오랜 투여 시간을 요구하는(Coiffier et al., Blood 2008, 111:1094-1100; Hagenbeek et al., Blood 2008, 111:548609) 상대적으로 높은 복용량의 오파투무맙 또는 림프종 이종이식에서 성장 저해를 일으키는 것으로 나타난 가장 낮은 0.5 ㎎/㎏(10 ㎍/마우스)의 복용량(Bleeker et al., Brit. J. Haematol. 2007, 140:303-312)과 일치하지 않는다.In vitro off-rate and CDC differences disclosed herein have been reported to bind to epitopes different from rituximab (Teeling et al., J Immunol . 2006, 177: 362-371) and in vitro than rituximab Comparable to that found in another anti-CD20 MAb, opatumumab, which is claimed to be more therapeutically active (Teeling et al., Blood 2004, 104: 1793-1800). However, this requires a relatively high dose, such as Rituximab selected for clinical studies (Coiffier et al., Blood 2008, 111: 1094-1100; Hagenbeek et al., Blood 2008, 111: 548609). The lowest dose of 0.5 mg / kg (10 μg / mouse) (Bleeker et al., Brit. J. Haematol . 2007, 140: 303-312) shown to cause growth inhibition in opatumumab or lymphoma xenografts of Does not match

최근에 개발된 또 다른 인간 항-CD20 MAb인 타입-Ⅱ 항-CD20 MAb의 특성을 갖는(Umana et al., Ann Oncol. 2008, 19 (Suppl 7), abstract 98) G101은 리툭시맙보다 시험관내 및 동물 모델에서 마우스에 10-30 ㎎/㎏(Id.)의 반복 복용량이 주어질 때 더욱 강력한 것으로 나타났다. 이것은 20 g 마우스에서 각각의 반복된 적용시의 복용량이 200 내지 600 ㎍ 사이인 것으로 해석되며, 이것은 테스트된 림프종 이종이식에서 높은 성장 억제 활성을 보이는 0.05 내지 0.35 ㎍의 벨투즈맙의 단일 복용량보다 적어도 4,000 내지 12,000배 높은 것이다(실시예 11 및 실시예 13). 설치류 NK 세포와 호중구가 소모되면 벨투즈맙의 이러한 효과가 방지되는데(실시예 10), 이는 리툭시맙에 대해 이전에 나타낸 바와 같이(Hernandez-Ilizaliturri et al., Clin Cancer Res. 2003;9:5866-73) 생체내 ADCC의 역할을 강조하는 것이다.Another recently developed human anti-CD20 MAb, type-II anti-CD20 MAb (Umana et al., Ann Oncol . 2008, 19 (Suppl 7), abstract 98) G101 was tested than rituximab In vitro and animal models, mice were shown to be more potent when given repeat doses of 10-30 mg / kg ( Id ). This translates to a dose between 200 and 600 μg at each repeated application in 20 g mice, which is at least 4,000 than a single dose of 0.05 to 0.35 μg Beltuzumab showing high growth inhibitory activity in tested lymphoma xenografts. To 12,000 times higher (Example 11 and Example 13). Consumption of rodent NK cells and neutrophils prevents this effect of veltumab (Example 10), as previously shown for rituximab (Hernandez-Ilizaliturri et al., Clin Cancer Res . 2003; 9: 5866-73) to emphasize the role of ADCC in vivo.

이러한 시험관내, 마우스, 원숭이 및 다른 인간 연구는 (ⅰ) 벨투즈맙이 전임상 모델에서 종래 임상적인 복용량의 리툭시맙과 두 가지 다른 2세대 항-CD20 MAb의 최소 치료학적 복용량의 분획에서 활성이고, (ⅱ) 리툭시맙에 대해 상기 두 가지 구별되는 활성 차이는 CDC 및 오프-속도 기능을 포함하고, 및 (ⅲ) 낮은 오프-속도는 CDRH3에서 카뱃-101 잔기에서의 단일 아미노산 돌연변이와 연관이 있는 것으로 보인다는 것을 나타낸다.
These in vitro, mouse, monkey and other human studies have shown that (v) Beltuzumab is active in a fraction of the minimum therapeutic dose of conventional clinical dose of rituximab and two other second generation anti-CD20 MAbs in a preclinical model, (Ii) these two distinct activity differences for rituximab include CDC and off-rate function, and (iii) low off-rate is associated with a single amino acid mutation at the Kabat-101 residue in CDRH3. It seems to appear.

실시예Example 24.  24. 재발된Relapsed 비- ratio- 호지킨Hodgkin 림프종( Lymphoma ( NHLNHL )에서의 At) 벨투즈맙의Beltuzmab 낮은 복용량 Low dose

요약summary

총 82명의 환자(34명의 남성, 48명의 여성; 연령 33-85)가 주당 1회 4 복용량의 80-750 ㎎/㎡ 벨투즈맙을 투여받았고, 연구 평가는 12주 동안, 이후 질환 진행 때까지 계속되었다. 이들은 소낭성(FL, N=55) 또는 다른(N=27) B-세포 NHL을 가졌고, 연구 시작시 Ⅲ/Ⅳ기가 우세하였으며(79%), 1-7번의 이전의 치료 처방을 받았고(중간 1.5), 대부분(89%) 적어도 한번의 리툭시맙-함유 처방을 포함하였다.A total of 82 patients (34 males, 48 females; ages 33-85) received 4 doses of 80-750 mg / m 2 beltumab once per week, and the study evaluation continued for 12 weeks until further disease progression. It became. They had vesicular (FL, N = 55) or other (N = 27) B-cell NHL, predominantly stage III / IV at the start of the study (79%), and received 1-7 previous treatment regimens (medium 1.5), most (89%) included at least one rituximab-containing regimen.

벨투즈맙은 일반적으로 매우 저항성이 있었고, 약물과 관련된 부작용은 일시적이었으며(등급 1-2), 낮은 복용량에서 더 짧은 투여 시간을 가졌다(전형적으로 초기의 2시간 및 이후의 1시간). 소낭성 림프종에서, 24/55 환자는 객관적 반응(OR, 44%)을 가졌고, 15명(27%)은 완전 반응(CR/CRu)을 갖고, 심지어 2-5번의 이전의 리툭시맙-처방 후에도 일어났으며, 모든 복용량 레벨에서 예후가 덜 양호하였다(증가된 LDH, 종양>5 ㎝, FLIPI≥2). 다른 B-세포 NHL에서, 변연부 림프종을 갖는 5/6 환자는 OR(83%)을 갖고, 2 CR/CRu(33%)을 포함하며, 1명은 80 ㎎/㎡이고, 반면 확산된 거대 B-세포 림프종을 갖는 3/7 환자는 부분 반응(43%)을 보였고, 1명은 80 ㎎/㎡이었다. 심지어 80 ㎎/㎡에서, B-세포는 첫 번째 투여 후 소모되었고, 값(25 ㎍/㎖)을 상회하는 평균 항체 혈청 레벨이 항-CD20 치료에 중요하다고 간주되었으며(상기 복용량에서 반응하는 사람들에서 명확하게 더 높은 레벨을 가짐), 리툭시맙과 유사하거나 이보다 더 느린 후-처리 혈청 제거를 보였다.Veltuzumab was generally very resistant and the side effects associated with the drug were temporary (grade 1-2) and had shorter dose times at low doses (typically two hours initially and one hour thereafter). In vesicular lymphoma, 24/55 patients had an objective response (OR, 44%), 15 (27%) had a complete response (CR / CRu), and even 2-5 previous rituximab-prescriptions It also occurred later, with a less favorable prognosis at all dose levels (increased LDH, tumor> 5 cm, FLIPI ≧ 2). In other B-cell NHL, 5/6 patients with marginal lymphoma have OR (83%), include 2 CR / CRu (33%), one is 80 mg / m 2, while diffuse large B- 3/7 patients with cellular lymphoma showed partial response (43%) and one was 80 mg / m 2. Even at 80 mg / m 2, B-cells were consumed after the first dose, and mean antibody serum levels above the value (25 μg / ml) were considered important for anti-CD20 treatment (in those who responded at the above doses). Clearly higher levels), post-treatment serum clearance similar to or slower than rituximab.

배경background

키메라 항-CD20 단일클론 항체(MAb)인 리툭시맙(Rituxan®; Genentech, South San Fransisco, CA; Biogen Idec Pharmaceuticals, San Diego, CA)은 재발되거나 난치성의 낮은 등급 또는 소낭성 CD20 양성의 B-세포 림프종에 대한 치료용으로 10년 이상 전부터 승인되었다. 이러한 군집에서의 중심적인 시험에서, 4주 연속으로 주당 1회 투여되는 375 ㎎/㎡ 복용량은 48%의 전체 반응률(6% 완전 반응)을 나타내었다(McLaughlin et al., J Clin Oncol 16:2825-2833, 1998). 이러한 초기의 성공을 확장하여, 리툭시맙은 B-세포 종양(Traulle & Coiffier, Future Oncol 1:297-306, 2005; Marcus & Hagenbeek, Eur J Haematol Suppl 67:5-14, 2007; Cheung et al, Cancer Treat Rev 33: 161-176, 2007), 1차적으로 화학치료와의 조합(예컨대, Czuczman et al., J Clin Oncol 22:4711-4716, 2004; Coiffier et al, N Engl J Med 346:235-242, 2002) 뿐만 아니라 자가면역 질병(Chambers & Isenberg, Lupus 14:210-214, 2005; Silverman, Front Biosci 12:2194- 2206, 2007; Cohen et al., Arthritis Rheum 54:2793-2806, 2006; Hauser et al., N Engl J Med 358:676-688, 2008)의 용도로 널리 적용되어 왔다. 2세대 항-CD20 항체는 효능을 증가시키고, 독성(1차적으로 투여 반응) 또는 면역원성을 감소시키고, 보다 신속하게 투여하도록 구축되었다(Dorner & Burmester, Curr Opin Rheumatol 20:263-268, 2008; Martin et al., Semin Hematol 45:126-132, 2008; Genovese et al., Arthritis & Rheumatism 54:S66, 2006; Morschhauser et al., Blood 110:199a, 2007; Hagenbeek et al., Blood 111:5486-5495, 2008; Coiffier et al., Blood 111:1094-1100, 2008)Rituximab (Rituxan®; Genentech, South San Fransisco, Calif .; Biogen Idec Pharmaceuticals, San Diego, Calif.), A chimeric anti-CD20 monoclonal antibody (MAb), is a recurrent or refractory low grade or vesicular CD20 positive B- Approved for more than 10 years ago for the treatment of cell lymphoma. In a central trial in this cluster, the 375 mg / m2 dose administered once a week for four consecutive weeks showed an overall response rate of 48% (6% complete response) (McLaughlin et al., J Clin Oncol 16: 2825-2833, 1998). Extending this early success, rituximab is a B-cell tumor (Traulle & Coiffier, Future). Oncol 1: 297-306, 2005; Marcus & Hagenbeek, Eur J Haematol Suppl 67: 5-14, 2007; Cheung et al, Cancer Treat Rev 33: 161-176, 2007), primarily in combination with chemotherapy (eg Czuczman et al., J Clin Oncol 22: 4711-4716, 2004; Coiffier et al, N Engl J Med 346: 235-242, 2002) as well as autoimmune diseases (Chambers & Isenberg, Lupus 14: 210-214, 2005; Silverman, Front). Biosci 12: 2194- 2206, 2007; Cohen et al., Arthritis Rheum 54: 2793-2806, 2006; Hauser et al., N Engl J Med 358: 676-688, 2008). Second-generation anti-CD20 antibodies have been constructed to increase efficacy, reduce toxicity (primary dosing response) or immunogenicity, and administer more rapidly (Dorner & Burmester, Curr Opin Rheumatol 20: 263-268, 2008; Martin et al., Semin Hematol 45: 126-132, 2008; Genovese et al., Arthritis & Rheumatism 54: S66, 2006; Morschhauser et al., Blood 110: 199a, 2007; Hagenbeek et al., Blood 111: 5486-5495, 2008; Coiffier et al., Blood 111: 1094-1100, 2008)

벨투즈맙(hA20)은 리툭시맙과 동일한 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR1 및 CDR2를 갖지만 상이한 CDR3 가변 영역 중쇄 구축물을 갖고, 나머지 골격 영역은 인간화 항-CD22 MAb인 에프라투즈맙으로부터 취하여 구축된 CDR-이식된 인간화 항-CD20 IgG-kappa MAb이다(Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 22:595, 2003; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26:142s, 2008; 실시예 1). 이러한 변화는 테스트된 모든 3가지 인간 림프종 세포주에서의 현저하게 느린 해리 속도(실시예 5) 및 이들 세포주 중 하나에서 현저하게 증가된 보체-의존성 세포독성(실시예 8)과 같은 리툭시맙과 비교하여 중요한 차이를 가져왔지만, 직접적인 증식 저해, 아폽토시스, 또는 항체-매개성 세포독성에서의 현저한 차이는 시험관내에서 관찰되지 않았다(실시예 6 및 실시예 9; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 22:595, 2003; Stein et al., Clin Cancer Res 10:2868-2878, 2004; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26:142s, 2008). 아울러, 정상 시노몰구스 원숭이(실시예 12) 및 인간 림프종 이종이식을 갖는 마우스(실시예 13)에서의 연구는 매우 낮은 복용량의 벨투즈맙은 정맥내 뿐만 아니라 피하로 투여될 때에도 각각 B-세포를 소모시키고, 종양의 성장을 조절하며, 심지어 현저한 수의 마우스를 치료하는데도 매우 효과적임을 발견하였다(실시예 13 및 실시예 14; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26:142s, 2008).Veltuzumab (hA20) has the same light chain CDRs and heavy chain CDR1 and CDR2 as Rituximab but has different CDR3 variable region heavy chain constructs, and the remaining framework regions are CDR-grafted constructed from epratumab, a humanized anti-CD22 MAb Humanized anti-CD20 IgG-kappa MAb (Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 22: 595, 2003; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26: 142s, 2008; Example 1). This change is comparable to rituximab, such as significantly slower dissociation rate in all three human lymphoma cell lines tested (Example 5) and significantly increased complement-dependent cytotoxicity (Example 8) in one of these cell lines. Significant differences were observed, but no significant difference in direct proliferation inhibition, apoptosis, or antibody-mediated cytotoxicity was observed in vitro (Examples 6 and 9; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 22: 595, 2003; Stein et al., Clin Cancer Res 10: 2868-2878, 2004; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26: 142s, 2008). In addition, studies in normal cynomolgus monkeys (Example 12) and mice with human lymphoma xenografts (Example 13) have shown that very low doses of Beltuzumab can cause B-cells to be administered both intravenously and subcutaneously, respectively. It was found to be very effective in consuming, regulating tumor growth, and even treating a significant number of mice (Examples 13 and 14; Goldenberg et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26: 142s, 2008).

벨투즈맙의 처음 임상 테스트는 생명을 위협하는 혈구감소증과 함께 전신성 홍반성 낭창(SLE)을 갖는 젊은 환자로서, 표준 구조 투약에 대해 난치성이 되었고 더 이상 리툭시맙에도 반응하지 않는 환자에게 수행되었다(Tahir et al., Rheumatology 44:561-562, 2005). 벨투즈맙은 혈청내 항-리툭시맙 항체 레벨이 매우 높음에도 불구하고 말초 B-세포 레벨을 소모시킬 수 있었고, 환자는 신속하게 반응하였다.Beltuzumab's initial clinical test was performed on young patients with systemic lupus erythematosus (SLE) with life-threatening cytopenia, who were refractory to standard rescue medication and no longer responded to rituximab. Tahir et al., Rheumatology 44: 561-562, 2005). Veltuzumab was able to consume peripheral B-cell levels despite very high levels of anti-rituximab antibody in serum, and the patient responded quickly.

리툭시맙을 이용한 대부분의 경험은 비-호지킨 림프종(NHL)에 대한 것이므로, 본 발명의 실시예는 상기 군집, 특히 소낭성 또는 낮은 등급의 림프종에서 벨투즈맙의 기본적인 안정성, 저항성, 약물동태학, 약동학(pharmacodynamics), 면역원성 및 예비적인 효능을 특성화하기 위해 수행되었다(Morschhauser et al., Blood 106:683a, 2005; Morschhauser et al., Blood 108:769a, 2006; Morschhauser et al., Proc Am Soc Clin Oncol 25, 449, 2007). 적어도 6개월 이상의 치료에 들어간 마지막 환자의 추적조사와, 이제 3년 이상 차도를 계속보이는 몇몇 가장 초기의 환자를 포함하는 완전한 시험 결과는 아래에 제공되어 있다.Since most experience with rituximab is for non-Hodgkin's lymphoma (NHL), an embodiment of the present invention provides the basic stability, resistance, pharmacokinetics of Beltuzumab in the population, particularly vesicular or low grade lymphoma. , Pharmacodynamics, immunogenicity and preliminary efficacy (Morschhauser et al., Blood 106: 683a, 2005; Morschhauser et al., Blood 108: 769a, 2006; Morschhauser et al., Proc) . Am Soc Clin Oncol 25, 449, 2007). Complete test results, including follow-up of the last patient who entered treatment for at least six months and some of the earliest patients now continuing to drive for more than three years, are provided below.

방법Way

난치성 또는 재발한 NHL을 갖는 환자에 정맥내 투여하는 벨투즈맙의 오픈-라벨(open-label), 싱글-암(single-arm), 멀티센터 Ⅰ/Ⅱ상 연구를 수행하여 난치성 또는 재발한 NHL을 갖는 환자에서 벨투즈맙의 안전성 및 효과를 평가하였다. 연구의 종료점은 안전성, 효능(상대적 및 완전 반응 속도, 반응 기간, 진행 시간), 약물동태학, 약동학 및 면역원성이다.An open-label, single-arm, multi-center I / II study of beltuzmab administered intravenously to patients with refractory or recurrent NHL was performed to treat refractory or recurrent NHL. The safety and effectiveness of Beltuzumab was assessed in patients with. End points of the study were safety, efficacy (relative and complete response rate, duration of reaction, time of progression), pharmacokinetics, pharmacokinetics and immunogenicity.

모든 환자는 연속하는 4주 동안 주당 1회 복용량을 투여받았다. 연구의 처음 부분에서는 120 ㎎/㎡ 내지 750 ㎎/㎡의 증가하는 복용량 레벨, 즉 통상 리툭시맙으로 투여한 복용량의 2배까지 처리된 집단을 등록하였다. 연구의 두 번째 부분에서는 추가 환자들이 375 ㎎/㎡ 및 그 이하의 벨투즈맙을 투여받았다(Morschhauser et al., Blood 106:683a, 2005). 상대적 반응(완전 반응을 증가시킴)은 명확한 복용량 반응 없이 모든 복용량 레벨에서 일어난다는 것이 명백해졌는데(Morschhauser et al., Blood 108:769a, 2006), 이는 낮은 복용량의 상기 항체가 효과적일 수 있다는 동물 연구에서 관찰된 것과 일치한다(실시예 13). 훨씬 더 낮은 복용량의 벨투즈맙(60 ㎎/㎡을 포함함)이 중등도 SLE 활성을 갖는 몇 명의 다른 환자에서 징조를 보였기 때문에(실시예 15), 상기 프로토콜을 수정하고, 본 연구에 등록된 최종 환자들을 80 ㎎/㎡의 낮은 복용량 레벨에서 처리하였다(Morschhauser et al., Proc Am Soc Clin Oncol 25, 449, 2007).All patients received one dose per week for four consecutive weeks. At the beginning of the study, populations treated with increasing dose levels of 120 mg / m 2 to 750 mg / m 2, ie up to twice the dose normally administered with rituximab, were enrolled. In the second part of the study, additional patients received 375 mg / m 2 and below Beltuzumab (Morschhauser et al., Blood 106: 683a, 2005). Relative response (increasing complete response) has been evident at all dose levels without a clear dose response (Morschhauser et al., Blood 108: 769a, 2006), suggesting that low doses of the antibody may be effective. Consistent with what was observed in (Example 13). Since even lower doses of Beltuzumab (including 60 mg / m 2) showed signs in several other patients with moderate SLE activity (Example 15), the final patient enrolled in the study was modified Were treated at low dose levels of 80 mg / m 2 (Morschhauser et al., Proc . Am Soc Clin Oncol 25, 449, 2007).

환자 군집 - 시험대상의 적격을 갖기 위하여, WHO 기준에 의해 문서화된 CD20+ B-세포 NHL을 갖는 성인은 NHL에 대한 적어도 하나의 이전의 표준 화학치료 처방 또는 리툭시맙 처리에서 실패해야만 하고, CT에 의해 ≥1.5 ㎝의 적어도 한 병변을 갖지만 >10 ㎝ 매스는 없는 측정가능한 질환을 가져야 한다. 환자는 임의의 리툭시맙을 투여한지 적어도 12개월이 지나야 하고, 리툭시맙 처리 6개월 동안 또는 이내에 진행이 없으며, 리툭시맙에 대해 NCI CTC 등급 3 또는 4의 독성을 갖거나, 또는 알려진 HACA에 양성이어야 한다. 시험대상 조건은 또한 헤모글로빈≥10 g/㎗, ANC≥1.5×109/ℓ, 혈소판≥100×109/ℓ(모두 수혈 지원 없이), 크레아티닌 및 빌리루빈≤1.5×정상의 기관 상한값(IULN), AST 및 ALT≤2.5×IULN, 0-1 ECOG 또는 KPS≥70 수행 상태, 기대 수명≥6개월, 임의의 자가 줄기세포 이식 후 12주, 및 임의의 화학치료, 다른 실험적 처리, 또는 표시된 병변(들)에 대한 임의의 방사선 치료 후 4주를 요구하였다. 원발성 CNS 림프종, HIV 림프종, 변형 림프종, 증후성 CNS 전이 또는 악성 뇌수막염, 림프종에 대한 양성 세포진(cytology)을 갖는 흉수, 이전의 방사면역치료, 또는 다른 인간 또는 인간화 단일클론 항체를 이용한 이전의 치료(HAHA 테스트에 음성인 것 제외)는 자격이 없었다. 다른 제외 기준은 알려진 HIV, B형 또는 C형 간염에 양성, 알려진 자가면역 질환 또는 자가면역 현상의 존재, 5일 내 감염 또는 항생제 사용, 2주 내 콜티코스테로이드, 5년 내 다른 암(비-흑색종 피부암 또는 자궁경부 상피내암은 제외), 및 연구 해석 또는 절차를 방해할 수 있는 다른 증상이었다. 임신 가능성이 있는 여성은 음성 임신 테스트를 받아야 하고, 임신 가능성이 있는 환자는 처리 후 적어도 12주 동안 임신 조절을 해야 한다. Patient Population -In order to be eligible for the subject, adults with CD20 + B-cell NHL documented by the WHO criteria must fail at least one previous standard chemotherapy regimen or rituximab treatment for NHL, and Have at least one lesion of ≧ 1.5 cm but no mass> 10 cm. Patients must have at least 12 months of receiving any rituximab, have no progress during or within 6 months of rituximab treatment, have a toxicity of NCI CTC grade 3 or 4 to rituximab, or a known HACA Must be positive to Conditions under test also included hemoglobin ≥ 10 g / dL, ANC ≥ 1.5 × 10 9 / l, platelet ≥100 × 10 9 / l (all without transfusion support), creatinine and bilirubin ≤ 1.5 × normal organ upper limit (IULN), AST and ALT ≦ 2.5 × IULN, 0-1 ECOG or KPS ≧ 70 performance status, life expectancy ≧ 6 months, 12 weeks after any autologous stem cell transplantation, and any chemotherapy, other experimental treatment, or indicated lesion (s) 4 weeks after any radiation treatment for). Primary CNS lymphoma, HIV lymphoma, modified lymphoma, symptomatic CNS metastasis or malignant meningitis, pleural effusion with positive cytology for lymphoma, previous radioimmunotherapy, or previous treatment with other human or humanized monoclonal antibodies ( Aside from being negative on the HAHA test). Other exclusion criteria are positive for known HIV, hepatitis B or C, presence of known autoimmune diseases or autoimmune phenomena, infection or antibiotic use within 5 days, corticosteroids within 2 weeks, other cancers within 5 years (non- Melanoma skin cancer or cervical epithelial cancer), and other symptoms that may interfere with study interpretation or procedures. Probable women should undergo a negative pregnancy test, and probable patients should be pregnant for at least 12 weeks after treatment.

처리 - 벨투즈맙은 연속하는 4주 동안 1주 기준으로 투여하였다. 모든 환자는 매주 항-히스타민 및 해열제를 예비투약하였지만, 스테로이드는 일상적으로 투여하지 않았다. 복용량을 확대하는 동안, 3-6 환자 집단은 120, 200, 375 및 750 ㎎/㎡의 증가하는 복용량 레벨로 벨투즈맙을 투여하였고, 이후의 환자는 80, 120, 200 또는 375 ㎎/㎡의 벨투즈맙을 투여하였다. 투여 반응의 부재시 안정하게 남아 있는 환자의 경우, 벨투즈맙 투여 지침은 첫 번째 투여시 매 15-30분에 50 ㎎/시간, 이후의 투여시 100-200 ㎎/시간의 증가로 투여 속도를 증가시키도록 하였다. 그렇지 않다면, 권고된 행동은 약한 독성시 투여 속도를 늦추는 것; 중등도 독성시 적어도 15분 동안 또는 증상이 해소될 때까지 투여를 중단한 후 환자가 안정된다면 느린 투여 속도로 재개하는 것; 및 더욱 심각한 독성시 투여를 영구적으로 중지하는 것을 포함하였다. Treatment -Beltuzumab was administered on a weekly basis for four consecutive weeks. All patients were pre-administered anti-histamine and antipyretic agents weekly, but steroids were not routinely administered. During dose escalation, the 3-6 patient population received Beltuzumab at increasing dose levels of 120, 200, 375 and 750 mg / m 2, and subsequent patients received Beltuzab at 80, 120, 200 or 375 mg / m 2. Zumab was administered. For patients who remain stable in the absence of a dosing response, the Veltumab dosing instructions increase the dosing rate with an increase of 50 mg / hour every 15-30 minutes on the first dose and 100-200 mg / hour on subsequent doses. It was made. Otherwise, the recommended action is to slow down the dose at mild toxicity; With moderate toxicity, withdrawal for at least 15 minutes, or until symptoms resolve, then resume at a slow rate of administration if the patient is stable; And permanent discontinuation of administration upon more severe toxicity.

데이터 수집 - CT 스캔(목, 가슴, 복부, 골반, 알려진 질환의 다른 부위) 및 물리적 검사는 기준선 및 마지막 투여 4주 후에 얻었다. 질환 진행이 없는 환자는 질환 진행이 나타날 때까지 12주 및 이후 매 3개월에 CT 스캔 및 물리적 검사를 계속하였다. 골수 생검은 기준선 및 완전 반응을 확인할 필요가 있을 때만 골수 침윤을 갖는 환자에서 요구되었다. 투여 동안, 환자는 부작용을 모니터링하였고, 생명 징후(vital sign)는 완료시까지 매 15분에, 이후에는 30 및 60분에 얻었다. 환자들은 임의의 처리와 관련된 이상이나 추가적인 추적조사를 보증하는 다른 변화를 해결할 때까지 마지막 투여 후 4주 및 12주에, 이후에는 매 3개월에 부작용 평가를 계속 모니터링하였다. 일상적인 안전성 실험(혈청 화학, 혈액학)을 위한 혈액 샘플과 물리적 검사는 질환 진행 때까지 매 투여 이전, 마지막 투여 후 4 및 12주, 이후에는 매 3개월의 추적조사 평가시 얻었다. Data Collection —CT scans (neck, chest, abdomen, pelvis, other sites of known disease) and physical examinations were obtained at baseline and 4 weeks after the last dose. Patients without disease progression continued CT scans and physical examinations at 12 weeks and every 3 months thereafter until disease progression appeared. Bone marrow biopsies were required in patients with bone marrow infiltration only when it was necessary to confirm baseline and complete response. During dosing, the patient monitored side effects and vital signs were obtained every 15 minutes until completion and then 30 and 60 minutes. Patients continued to monitor adverse event assessments at 4 and 12 weeks after the last dose and every 3 months thereafter until they resolve any treatment-related abnormalities or other changes that warrant further follow-up. Blood samples and physical tests for routine safety experiments (serum chemistry, hematology) were obtained at follow-up evaluations before each dose, 4 and 12 weeks after the last dose, and every 3 months thereafter until disease progression.

B-세포 계수(CD19+)를 위한 혈액 샘플은 떨어진 레벨이 기준선 쪽으로 돌아갈 때까지 매 투여 이전, 마지막 투여 후 4, 8 및 12주 및 매 3개월의 추적조사 동안에 얻었다. 소변검사, T-세포 레벨(CD3+)을 위한 혈액 샘플 및 혈청 면역글로불린은 임의의 치료와 관련된 이상이 해결될 때까지 기준선, 마지막 투여 전, 마지막 투여 후 4주 및 12주, 이후에는 매 3개월의 추적조사 동안에 측정하였다. 벨투즈맙 혈청 레벨을 위한 혈액 샘플은 각 투여 전 및 투여 후 30분, 첫 번째 및 마지막 투여 후 24, 48, 72 및 96시간, 이후에는 마지막 투여 후 1, 2, 3, 4, 8 및 12주에 얻었다. 면역원(HAHA; human anti-veltuzumab antibody)을 위한 혈액 샘플은 기준선, 마지막 투여 후 4주 및 12주, 이후에는 양성인 경우 12주의 추적조사 동안에 얻었다.Blood samples for B-cell count (CD19 +) were obtained before follow-up, 4, 8 and 12 weeks after the last dose and every 3 months follow-up until the level dropped back to baseline. Urine tests, blood samples for T-cell levels (CD3 +), and serum immunoglobulins were administered at baseline, before the last dose, 4 weeks and 12 weeks after the last dose, and every 3 months thereafter until any treatment-related abnormalities were resolved. Measured during follow up. Blood samples for Beltuzumab serum levels were pre- and post-administration 30 minutes, 24, 48, 72 and 96 hours after the first and last dose, followed by 1, 2, 3, 4, 8 and 12 weeks after the last dose. Got on. Blood samples for an immunogen (HAHA; human anti-veltuzumab antibody) were obtained during baseline, 4 and 12 weeks after the last dose, and 12 weeks later if positive.

연구 평가 - 치료 반응은 국제 워크샵 기준(Cheson et al., J Clin Oncol. 1999, 17:1244-1253)을 이용하여 결정하였으며, 각 환자의 최고 반응은 완전 반응(CR), 완전 반응 미확인(CRu), 부분 반응(PR), 안정한 질환 또는 진행성 질환으로 분류하였다. 부작용(AE)은 MedDRA 시스템 기관 분류 및 바람직한 용어에 따라 분류하였다. AE 및 실험실의 독성 등급은 미국 국립 암연구소(NCI) 공통 독성 기준(CTC), 버전 3.0을 사용하였다. 복용량-제한 독성(DLT)은 임의의 치료와 관련된 등급 3 또는 4의 독성 또는 다음의 등급 2의 사건으로 정의하였다: 자가면역 반응, 증상이 없는 기관지 경련, 또는 일반화된 두드러기. 모든 실험실 값은 벨투즈맙 혈청 레벨과 HAHA 측정을 제외하고는 국소적으로 측정하였으며, ELISA 테스트를 이용한 스폰서(sponsor)에 의해 수행되었다. 마지막 투여 후의 약물동태학은 WinNonLin 2.1(Pharsight Corporation, Mountain View, CA)을 이용한 단일 구획 모델로 평가하였다. Study Assessment -Therapeutic response is based on international workshop criteria (Cheson et al., J Clin Oncol . 1999, 17: 1244-1253), and the best response of each patient was classified as complete response (CR), complete response unknown (CRu), partial response (PR), stable disease or progressive disease. Adverse events (AEs) were classified according to the MedDRA system organ classification and preferred terminology. Toxicity ratings for AEs and laboratories used the National Cancer Institute (NCI) Common Toxicity Criterion (CTC), Version 3.0. Dose-limiting toxicity (DLT) was defined as a grade 3 or 4 toxicity or any of the following Grade 2 events associated with any treatment: autoimmune response, asymptomatic bronchial spasms, or generalized urticaria. All laboratory values were measured locally except for the Beltuzumab serum levels and HAHA measurements, and were performed by a sponsor using the ELISA test. Pharmacokinetics after the last dose were evaluated in a single compartment model using WinNonLin 2.1 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA).

통계적 분석 - 기술통계학을 사용하여 정확한 95% 신뢰 구간을 나타내는 것을 포함하는 인구통계학, 안전성 및 실험실 데이터 및 처리 반응률을 요약하였다. 약물을 투여한 연구 첫날부터 질환 진행(물리적 또는 방사선(CT) 증거에 기반함), 사망 또는 마지막 접촉 중 가장 먼저 일어난 날까지의 기간으로 정의되는 진행-부재 생존(progression-free survival, PFS)은 기술통계학 뿐만 아니라 카플란-메이어 산물-제한 방법(product-limit method)에 기반한 통계를 이용하여 요약되었다. 환자는 질환 진행이나 사망을 경험하지 않으면 검열된(censored) 것으로 간주되었다. 객관적 반응(OR), 즉 CR, CRu 또는 PR의 개시 첫날부터 질환 진행, 사망 또는 마지막 접촉 중 가장 먼저 일어난 날까지의 기간으로 정의되는 반응 기간은 유사한 방법을 이용하여 요약되었다. Statistical Analysis -Descriptive statistics were used to summarize demographics, safety, and laboratory data and treatment response rates, including representing an accurate 95% confidence interval. Progression-free survival (PFS), defined as the period from the first day of the study to the disease progression (based on physical or radiographic (CT) evidence), the first day of death or last contact, Summarized using descriptive statistics as well as statistics based on the Kaplan-Meyer product-limit method. Patients were considered censored if they did not experience disease progression or death. The response period, defined as the objective response (OR), i.e. the period from the first day of initiation of CR, CRu or PR to the earliest day of disease progression, death or last contact, was summarized using similar methods.

결과result

환자 특성 - 총 82명의 환자(34명의 남성, 48명의 여성, 중간 연령 64세)를 등록하였다. 이들은 처음 진단된 후 평균 5년이고, 마지막 처리 후 1.8년이었다. 대부분의 환자는 연구 시작시 양호한 수행 상태(83% ECOG 0)였지만, 광범위한 질환(79% Ⅲ/Ⅳ 기)을 갖고, 17명의 환자(21%)는 증가된 LDH를 가졌으며, 30명(40%)은 적어도 하나의 종양 매스> 5 ㎝ 였다. 모든 환자는 적어도 하나의 이전 처리 처방(범위, 1-7)을 받았고, 대부분의 환자(89%)는 적어도 하나의 이전 리툭시맙-함유 처방을 받았다. WHO 분류(Harris & Ferry, 2001)에 기반하여, 55명의 환자는 소낭성 림프종(FCL)을 가졌지만, 27명의 환자는 비-소낭성 림프종을 가졌다: 확산된 거대 B-세포 림프종(BLBCL, N=7), 맨틀 세포 림프종(MCL, N=7), 작은 림프구성 림프종(SLL, N=5), 변연부 림프종(MZL, N=6)[점막과 관련된 림프 조직(MALT)의 절성(nodal) MZL(N=2) 및 절외성(extranodal) MZL(N=4)을 포함함] 및 림포플라즈마사이토이드(lymphoplasmacytoid) 림프종(N=2). 소낭성 및 비-소낭성 림프종을 갖는 환자에 대해 각각 좋지 못한(poor) 결과의 위험성을 위하여 공개된 기준을 사용하여 FLIPI 및 IPI 점수를 할당하였다(Solal-Celigny et al., Blood 104:1258-1265, 2004). 인구통계 및 환자 특성은 표 5에 요약되어 있다. Patient Characteristics -A total of 82 patients (34 males, 48 females, median age 64 years) were enrolled. They averaged 5 years after initial diagnosis and 1.8 years after last treatment. Most patients had good performance at the start of the study (83% ECOG 0), but had a wide range of diseases (79% III / IV), 17 patients (21%) had increased LDH, 30 (40) %) Was at least one tumor mass> 5 cm. All patients received at least one previous treatment regimen (range, 1-7) and most patients (89%) had at least one previous rituximab-containing regimen. Based on the WHO classification (Harris & Ferry, 2001), 55 patients had follicular lymphoma (FCL), but 27 patients had non-vesicular lymphoma: diffuse large B-cell lymphoma (BLBCL, N = 7), mantle cell lymphoma (MCL, N = 7), small lymphocytic lymphoma (SLL, N = 5), marginal lymphoma (MZL, N = 6) [nodal of lymphoid tissue associated with mucous membranes (MALT) MZL (N = 2) and extranodal MZL (N = 4)] and lymphoplasmacytoid lymphoma (N = 2). FLIPI and IPI scores were assigned using published criteria for the risk of poor outcomes, respectively, for patients with vesicular and non-vesicular lymphoma (Solal-Celigny et al., Blood 104: 1258-). 1265, 2004). Demographics and patient characteristics are summarized in Table 5.

인구통계 및 기준선 정보Demographic and Baseline Information 모든 환자 FCL1 기타2
(N=82) (N=55) (N=27)All patients FCL 1 Other 2
(N = 82) (N = 55) (N = 27) 성별(M/F)Gender (M / F) 34/48 21/34 13/1434/48 21/34 13/14 연령, 중간 나이(범위)Age, middle age (range) 64(33-85) 61(33-80) 66(43-85)64 (33-85) 61 (33-80) 66 (43-85) ECOG: 0,1, 2ECOG: 0,1, 2 68,18,2 45,10,0 17,8,268,18,2 45,10,0 17,8,2 연구 개시시 질환 단계
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
ⅣDisease stage at study start
I
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
9 5 4
7 6 2
26 20 6
39 24 15
9 5 4
7 6 2
26 20 6
39 24 15 진단 후 시간(년)
중간(범위)Time after diagnosis (years)
Middle (range) 5.1(1.2-31.5) 5.1(1.6-31.5) 5.1(1.2-15.3)5.1 (1.2-31.5) 5.1 (1.6-31.5) 5.1 (1.2-15.3) 이전의 처리 처방
수, 중간(범위)
리툭시맙 함유: 0, 1, ≥2Previous treatment prescription
Number, middle (range)
With rituximab: 0, 1, ≥ 2
1.5(1-7) 2(1-7) 1(1-5)
9,49,24 7,31,17 2,18,7
1.5 (1-7) 2 (1-7) 1 (1-5)
9,49,24 7,31,17 2,18,7 마지막 처리
시간(년), 중간(범위)
반응(예/아니오)
기간(월), 중간(범위)Last treatment
Time (years), medium (range)
Response (Yes / No)
Period (Month), Medium (Range)
1.8(0.1-11) 1.9(0.1-8) 1.6(0.1-11)
76/6 53/2 23/4
18.0(2-143) 18.0(2-79) 19.0(2-143)
1.8 (0.1-11) 1.9 (0.1-8) 1.6 (0.1-11)
76/6 53/2 23/4
18.0 (2-143) 18.0 (2-79) 19.0 (2-143) 증가된 LDHIncreased LDH 17 13 417 13 4 커다란 질환>5 ㎝Large disease> 5 cm 30 24 630 24 6 FLIPI
낮음(0-1)
중간(2-3)
높음(4-5)FLIPI
Low (0-1)
Medium (2-3)
High (4-5)
20
31
4
20
31
4 IPI
낮음(0-1)
낮음/중간(2)
높음/중간(3)
높음(4-5)IPI
Low (0-1)
Low / medium (2)
High / medium (3)
High (4-5)
9
12
5
1
9
12
5
One 벨투즈맙 복용량 레벨
80 ㎎/㎡
120 ㎎/㎡
200 ㎎/㎡
375 ㎎/㎡
750 ㎎/㎡Beltuzumab Dosage Levels
80 mg / ㎡
120 mg / ㎡
200 mg / ㎡
375 mg / ㎡
750 mg / ㎡
14 9 5
21 17 4
18 13 5
26 14 12
3 2 1
14 9 5
21 17 4
18 13 5
26 14 12
3 2 1 1: 소낭성 등급 1(N=31), 2(N=18) 및 3(N=4)을 포함함. 2명의 환자에 대해서는 등급이 할당되지 않음.
2: 확산된 거대 B-세포 림프종(N=7), 맨틀 세포 림프종(N=7), 변연부 림프종(N=6), 작은 림프구성 림프종(N=5) 및 림포플라즈마사이토이드 림프종(N=2)을 포함함.1: includes vesicular grades 1 (N = 31), 2 (N = 18) and 3 (N = 4). No grade is assigned to two patients.
2: diffuse large B-cell lymphoma (N = 7), mantle cell lymphoma (N = 7), marginal lymphoma (N = 6), small lymphocytic lymphoma (N = 5), and lymphoplasmacytoid lymphoma (N = Including 2).

약물 투여 - 82명의 환자 중, 78명은 4번 투여되었지만, 초기에 질환이 진행된 3명의 환자는 2-3 벨투즈맙 투여를 완료한 후 중단되었고, 이전의 리툭시맙에서 두드러기와 오한을 갖는 1명의 SLL 환자는 처음 벨투즈맙 투여시 유사한 등급 1-2 반응을 보인 후 중단되었다. 그렇지 않다면, 복용량은 알레르기 반응으로 인해 4번의 투여 중 1번 또는 2번을 감소된 복용량으로 투여한 3명의 환자와, 부주의하게 다음번에 더 높은 복용량 레벨로 한번 투여한 1명의 환자를 제외하고는 환자의 체표면적 및 복용량 레벨에 근거하여 처방된 대로 투여되었다. 모든 투여된 복용량에 대한 투여 시간은 표 6에 요약되어 있다. Drug Administration -Of 82 patients, 78 were administered four times, but initially three patients with advanced disease were discontinued after completing 2-3 beltuzumab, and one with urticaria and chills from previous rituximab. SLL patients were discontinued after showing a similar Grade 1-2 response at the first dose of beltuzmab. Otherwise, the dose is based on the exception of three patients who received a reduced dose of one or two of four doses due to allergic reactions, and one patient who inadvertently administered the next dose at a higher dose level. It was administered as prescribed based on the body surface area and the dose level. Dosing times for all administered doses are summarized in Table 6.

중간 투여 시간(시)* Medium dose time (hours) * 복용량
(㎎/㎡)dosage
(Mg / ㎡) NN 투여 1Dosing 1 투여 2Dosing 2 투여 3Dosing 3 투여 4Dosage 4 8080 1414 1.8(1.1-3.6)1.8 (1.1-3.6) 1.4(0.6-2.3)1.4 (0.6-2.3) 1.2(0.8-1.6)1.2 (0.8-1.6) 1.2(0.8-1.7)1.2 (0.8-1.7) 120120 2121 2.1(1.1-4.6)2.1 (1.1-4.6) 1.4(0.7-3.5)1.4 (0.7-3.5) 1.4(0.7-3.5)1.4 (0.7-3.5) 1.3(0.6-3.7)1.3 (0.6-3.7) 200200 1818 2.4(1.3-8.1)2.4 (1.3-8.1) 1.3(0.8-7.9)1.3 (0.8-7.9) 1.5(0.8-8.8)1.5 (0.8-8.8) 1.3(0.8-8.3)1.3 (0.8-8.3) 375375 2626 3.1(2.1-7.6)3.1 (2.1-7.6) 2.1(1.6-4.8)2.1 (1.6-4.8) 2.1(1.7-3.8)2.1 (1.7-3.8) 2.1(1.3-6.9)2.1 (1.3-6.9) 750750 33 4.7(3.8-6.2)4.7 (3.8-6.2) 2.6(2.2-3.2)2.6 (2.2-3.2) 2.4(2.0-2.8)2.4 (2.0-2.8) 2.5(2.5-2.7)2.5 (2.5-2.7)

*: 중간(범위) 시간은 투여 개시부터 투여 종료 때까지의 시간이다.*: The median (range) time is the time from the start of administration to the end of administration.

처리 반응 - 처음 투여시 중단된 1명의 환자는 효능을 평가할 수 없었다. 평가된 81명의 환자 중, 23명은 처리 4주 후의 첫 번째 계획된 평가시 또는 그 이전에 질환이 진행되었고, 추가적인 반응 평가는 하지 않았다. 그렇지 않다면, 질환 진행 전에 최고의 반응을 보인 각각의 환자는 CR 10명, CRu 7명, PR 16명 및 안정한 질환 25명을 포함하였다. Treatment Response —One patient discontinued at the first dose was unable to assess efficacy. Of the 81 patients evaluated, 23 had disease progression at or before the first planned assessment 4 weeks after treatment and no further response assessment. Otherwise, each patient who responded best before disease progression included 10 CR, 7 CRu, 16 PR and 25 stable disease.

객관적 반응(OR=CR+CRu+PR)을 계산하면, 총 OR 및 CR/CRu 비율은 각각 40.7%(33/81) 및 21.0%(17/81)였다. 소낭성 림프종에서, 덜 양호한 예후(FLIPI≥2, 향상된 LDH, 커다란 질환>5 ㎝)를 갖는 소낭성 환자와 80 ㎎/㎡를 포함하는 모든 복용량 레벨에서 상기 OR 및 CR/CRu 비율은 각각 44%(24/55) 및 27%(15/55)였고, 심지어 2-5번의 이전의 리툭시맙-처방 후에도 OR과 CR/CRu이 모두 일어났다. 다른 비-소낭성 림프종에서, 총 OR 및 CR/CRu 비율은 각각 35%(9/26) 및 27%(7/26)였다. 이것은 2명의 CR/CRu (33%)을 포함하는 OR을 갖는 5/6 MZL 환자(83%), 1명의 80 ㎎/㎡, 및 부분 반응의 3/7 DLBCL 환자(43%), 및 1/7 MCL 환자(14%)를 포함한 것이다. 표 7은 상기 결과를 요약한 것이다.Computing the objective response (OR = CR + CRu + PR), the total OR and CR / CRu ratios were 40.7% (33/81) and 21.0% (17/81), respectively. In vesicular lymphomas, the OR and CR / CRu ratios were 44% at all dose levels, including 80 mg / m 2 and vesicular patients with less favorable prognosis (FLIPI ≧ 2, improved LDH, major disease> 5 cm), respectively. (24/55) and 27% (15/55), both OR and CR / CRu occurred after 2-5 previous rituximab-prescriptions. In other non-vesicular lymphomas, the total OR and CR / CRu ratios were 35% (9/26) and 27% (7/26), respectively. This is 5/6 MZL patients (83%) with OR comprising 2 CR / CRu (33%), 1 80 mg / m 2, and 3/7 DLBCL patients (43%) of partial response, and 1 / 7 MCL patients (14%). Table 7 summarizes the results.

객관적 처리 반응* Objective processing response * OROR CRCR /Of CRuCRu 모든 평가가능한 환자(N=81)All evaluable patients (N = 81) 40.7%(33/81)40.7% (33/81) 21.0%(17/81)21.0% (17/81) 소낭성 림프종(N=55)Vesicular lymphoma (N = 55) 43.6%(24/55)43.6% (24/55) 27.3%(15/55)27.3% (15/55) 복용량(㎎/㎡): 80
120
200
375
750Dose (mg / ㎡): 80
120
200
375
750 22.2%(2/9)
41.2%(7/17)
46.2%(6/13)
50/0%(7/14)
100%(2/2)22.2% (2/9)
41.2% (7/17)
46.2% (6/13)
50/0% (7/14)
100% (2/2) 11.1%(1/9)
29.4%(5/17)
30.8%(4/13)
21.4%(3/14)
100%(2/2)11.1% (1/9)
29.4% (5/17)
30.8% (4/13)
21.4% (3/14)
100% (2/2) FLIPI: 0-1
≥2FLIPI: 0-1
≥2 55.0%(11/20)
37.1(13/35)55.0% (11/20)
37.1 (13/35) 40.0%(8/20)
20.0%(7/35)40.0% (8/20)
20.0% (7/35) 이전의 리툭시맙: 0
1
2-5Rituximab former: 0
One
2-5 57.1%(4/7)
45.2%(14/31)
35.3%(6/17)57.1% (4/7)
45.2% (14/31)
35.3% (6/17) 42.9%(3/7)
22.6%(7/31)
29.4%(5/17)42.9% (3/7)
22.6% (7/31)
29.4% (5/17) 증가된 LDH: 예
아니오Increased LDH: Yes
no 23.1%(3/13)
50.0%(21/42)23.1% (3/13)
50.0% (21/42) 15.4%(2/13)
31.0%(13/42)15.4% (2/13)
31.0% (13/42) 커다란 질환(>5 ㎝): 예
아니오Large disease (> 5 cm): yes
no 25.0%(6/24)
58.1%(18/31)25.0% (6/24)
58.1% (18/31) 8.3%(2/24)
41.9%(13/31)8.3% (2/24)
41.9% (13/31) 비-소낭성(N=26)Non-follicular (N = 26) 34.6%(9/26)34.6% (9/26) 26.9%(7/26)26.9% (7/26) 변연부 림프종1
확산된 거대 B-세포 림프종2
맨틀 세포 림프종3
작은 림프구성 림프종4
림포플라즈마사이토이드 림프종5 Marginal lymphoma 1
Diffused Giant B-Cell Lymphoma 2
Mantle cell lymphoma 3
Small lymphocytic lymphoma 4
Lymphoplasma Cytoid Lymphoma 5 83.3%(5/6)
42.9%(3/7)
14.3(1/7)
0.0%(0/4)
0.0%(0/2) 83.3% (5/6)
42.9% (3/7)
14.3 (1/7)
0.0% (0/4)
0.0% (0/2) 33.3%(2/6)
0.0%(0/7)
0.0%(0/7)
0.0%(0/4)
0.0%(0/2) 33.3% (2/6)
0.0% (0/7)
0.0% (0/7)
0.0% (0/4)
0.0% (0/2) *: Cheson 기준에 기반한 질환 진행 이전의 최고의 반응(OR=CR+CRu+PR, CR=완전 반응, CRu=미확인된 CR, PR=부분 반응, SD=안정한 질환, POD=질환의 진행)*: Best response before disease progression based on Cheson criteria (OR = CR + CRu + PR, CR = complete response, CRu = unidentified CR, PR = partial response, SD = stable disease, POD = progression of disease) 1: MZL: 1 CR(80㎎/㎡), 1 CRu(375㎎/㎡), 3 PR(80㎎/㎡, 2×200㎎/㎡), 1 SD(120㎎/㎡)
2: DLBCL: 3 PR(80㎎/㎡, 2×375㎎/㎡), 4 POD(80㎎/㎡, 2×120㎎/㎡, 200㎎/㎡)
3: MCL: 1 PR(375㎎/㎡), 3 SD(200㎎/㎡, 375㎎/㎡, 750㎎/㎡), 3 POD(120㎎/㎡,2×375㎎/㎡)
4: SLL: 2 SD(375㎎/㎡), 2POD(80㎎/㎡, 375㎎/㎡)
5: LPL: 2 SD(200㎎/㎡, 375㎎/㎡)1: MZL: 1 CR (80 mg / m 2), 1 CRu (375 mg / m 2), 3 PR (80 mg / m 2, 2 × 200 mg / m 2), 1 SD (120 mg / m 2)
2: DLBCL: 3 PR (80 mg / m 2, 2 × 375 mg / m 2), 4 POD (80 mg / m 2, 2 × 120 mg / m 2, 200 mg / m 2)
3: MCL: 1 PR (375 mg / m 2), 3 SD (200 mg / m 2, 375 mg / m 2, 750 mg / m 2), 3 POD (120 mg / m 2, 2 × 375 mg / m 2)
4: SLL: 2 SD (375 mg / m 2), 2POD (80 mg / m 2, 375 mg / m 2)
5: LPL: 2 SD (200 mg / m 2, 375 mg / m 2)

카플란-메이어 추정값에 기반하여 55명의 소낭성 환자 모두에 있어서, 중간 TTP는 6.7개월이었고(95% CI:3.7-9.3개월), 처음 투여부터 OR(TTR)의 개시까지의 중간 시간은 3.3개월이었다(95% CI: 1.7-3.7개월). OR을 갖는 24명의 환자는 10.2개월의 중간 DR을 가졌고(95% CI: 6.0-22.6개월), 중간 TTP는 15.2개월이었다(95% CI: 9.5-28.2개월). 24명의 반응자에 대한 카플란-메이어 DR 및 TTP 곡선은 도 15에 나타나 있다. 첫 번째 투여시부터 계속 15.9-37.6개월의 장기간의 반응을 보이는 5명의 환자를 포함하는 CR/CRu를 달성한 15명의 소낭성 환자에서, 카플란-메이어 추정 중간 DR 및 TTP는 각각 19.7개월(95% CI: 8.7-32.5개월) 및 24.2개월(95% CI: 13.8-34.4개월)이었다. 샘플의 크기가 작지만, 낮은 복용량에서 완전 반응의 지속성이 떨어지지는 않았으며, 80 ㎎/㎡에서 완전 반응을 갖는 1명의 소낭성 환자는 여전히 첫 번째 투여 후 15.9개월의 차도가 있다. 비-소낭성 조직 중에서, 완전 반응이 일어난 2명(80 ㎎/㎡에서 1명) 뿐만 아니라 장기간의 안정한 반응의 1명(모두 주변부 림프종이 있음)은 처리 후 여전히 15-24개월을 계속하고 있었다.For all 55 vesicular patients based on Kaplan-Meier estimates, the median TTP was 6.7 months (95% CI: 3.7-9.3 months) and the median time from initial dosing to the onset of OR (TTR) was 3.3 months. (95% CI: 1.7-3.7 months). 24 patients with OR had a median DR of 10.2 months (95% CI: 6.0-22.6 months) and median TTP was 15.2 months (95% CI: 9.5-28.2 months). Kaplan-Meier DR and TTP curves for 24 responders are shown in FIG. 15. In 15 vesicular patients who achieved CR / CRu, which included 5 patients with a long-term response of 15.9-37.6 months from the first dose, the Kaplan-Meier estimated median DR and TTP were 19.7 months (95%, respectively). CI: 8.7-32.5 months) and 24.2 months (95% CI: 13.8-34.4 months). Although the sample size is small, the sustained response of the complete response was not diminished at low doses, and one vesicular patient with a complete response at 80 mg / m 2 still had a 15.9 month drive after the first dose. Of the non-follicular tissues, not only did two complete reactions (one at 80 mg / m 2) but one long-term stable response (all with peripheral lymphoma) continued for 15-24 months after treatment. .

부작용 - 78명의 환자는 연구 과정에서 하나 이상의 부작용이 있었다. 적어도 치료와 관련될 가능성이 있는 것으로 간주된 부작용이 있는 48명의 환자 중, 1명만이 처리 후 1년 이상의 장기간의 차도 과정에서 발생한 저글로불린혈증의 등급 3의 부작용이 있었다. 그렇지 않다면, 적어도 치료와 관련될 가능성이 있는 것으로 간주된 모든 부작용은 약하거나 중등도였으며(등급 1-2), 이들 대부분은 첫 번째 투여시 우세하게 일어난 투여 반응이었고, 11명 이하의 환자는 이러한 부작용이 이후의 투여시마다 일어났다. 표 8은 가장 빈번한 부작용을 요약한 것이다. Side Effects -78 patients had one or more side effects during the study. Of the 48 patients with at least side effects that were considered likely to be related to treatment, only one had a grade 3 side effect of hypoglobulinemia that occurred in the long-term driveway over one year after treatment. Otherwise, at least all of the side effects that were considered likely to be related to treatment were mild or moderate (grade 1-2), most of which were predominantly in response to the first dose, and up to 11 patients had these side effects. This occurred at every subsequent dose. Table 8 summarizes the most frequent side effects.

5% 이상의 환자에서 일어난 부작용Adverse events in more than 5% of patients 부작용이 있는 환자
(등급≥3)Patients with Side Effects
(Grade≥3) 적어도 치료와 관련될 가능성이 있을 것으로 간주되는 부작용이 있는 환자
(등급≥3)Patients with side effects that are at least considered likely to be related to treatment
(Grade≥3) 피로fatigue 23%(0%)23% (0%) 13%(0%)13% (0%) 가려움증Itching 13%(0%)13% (0%) 7%(0%)7% (0%) 열Heat 13%(0%)13% (0%) 9%(0%)9% (0%) 두통headache 11%(0%)11% (0%) 4%(0%)4% (0%) 무기력lethargy 11%(0%)11% (0%) 9%(0%)9% (0%) 호흡장애Respiratory disorder 10%(0%)10% (0%) 4%(0%)4% (0%) 기침cough 10%(0%)10% (0%) 0%(0%)0% (0%) 복통colic 9%(0%)9% (0%) 4%(0%)4% (0%) 오한chills 9%(0%)9% (0%) 7%(0%)7% (0%) 관절통Arthralgia 9%(0%)9% (0%) 2%(0%)2% (0%) 설사diarrhea 7%(0%)7% (0%) 5%(0%)5% (0%) 오심miscarriage of justice 7%(0%)7% (0%) 5%(0%)5% (0%) 비충혈Nasal congestion 7%(0%)7% (0%) 4%(0%)4% (0%) 말초 부종Peripheral edema 6%(0%)6% (0%) 2%(0%)2% (0%) 배통(back pain)Back pain 6%(1%)6% (1%) 1%(0%)1% (0%) 근육통Muscle pain 6%(0%)6% (0%) 2%(0%)2% (0%) 어지럼증Dizziness 6%(0%)6% (0%) 4%(0%)4% (0%) 인두 통증Pharyngeal pain 6%(0%)6% (0%) 4%(0%)4% (0%) 고혈압High blood pressure 5%(0%)5% (0%) 2%(0%)2% (0%) 두드러기hives 5%(0%)5% (0%) 1%(0%)1% (0%) 변비Constipation 5%(0%)5% (0%) 1%(0%)1% (0%) 빈혈anemia 5%(2%)5% (2%) 0%(0%)0% (0%)

18명의 환자(22%)는 하나 이상의 감염이 있었다. Ⅳ 항생제가 요구되는 3명의 감염(패혈증, 봉와직염, 곰팡이 요로 감염)과 다중 경구용 항생제로 처리된 1명의 감염(달리 특정되지 않음)을 포함하는 등급 3-4의 감염을 갖는 4명은 치료와 관련된 것으로 간주하지 않았다. 그렇지 않다면, 모든 감염은 호흡기, 요로 또는 부비강을 우세하게 포함하는 경구용 처방으로 처리된 등급 1-2의 부작용이었다.Eighteen patients (22%) had one or more infections. Four patients with grade 3-4 infections, including three infections requiring sepsis (septicemia, cellulitis, fungal urinary tract infection) and one infection treated with multiple oral antibiotics (unless otherwise specified) It was not considered to be. Otherwise, all infections were side effects of grades 1-2 treated with an oral regimen that predominantly included the respiratory, urinary tract or sinus cavities.

안전성 실험 - 혈액학 및 혈청 화학을 위한 혈액 샘플은 각 투여 전, 마지막 투여 4주 및 12주 후, 이후에는 매 3개월에 추적조사 평가가 필요할 때 얻었다. 표준 안전 실험에서의 이상 패턴 변화는 일어나지 않았으며, 소수의 환자는 처리 후 독성 등급이 증가되었다(표 9). Safety Experiments —Blood samples for hematology and serum chemistry were obtained when follow-up assessments were needed before each dose, 4 and 12 weeks after the last dose, and every 3 months thereafter. No abnormal pattern change occurred in standard safety experiments, and a small number of patients had increased toxicity ratings after treatment (Table 9).

안전성 실험의 변화: 기준선으로부터의 CTC v 3.0 독성 등급을 갖는 환자(N=82)Change in safety experiment: patients with CTC v 3.0 toxicity rating from baseline (N = 82) 최대 처리 후 등급Max post-treatment rating 1One 22 33 44 혈액학hematology 헤모글로빈  hemoglobin 1010 55 1One 00 WBC  WBC 1111 55 1One 00 ANC  ANC 22 44 22 00 혈소판  Platelets 44 22 00 00 혈청 화학Serum chemistry 크레아티닌  Creatinine 1One 1One 1One 00 총 빌리루빈  Total bilirubin 55 00 00 00 알칼라인 포스페이트  Alkaline phosphate 66 00 00 00 SGPT(ALT)  SGPT (ALT) 44 00 00 00 SGOT(AST)  SGOT (AST) 44 1One 00 00

*: 등급 3의 부작용: 3명의 환자는 연구 시작시 이상 실험을 가졌고(등급 2 크레아틴, 등급 2 ANC, 등급 1 헤모글로빈), 12주에 등급 3이 되었으며, 나머지 환자는 12주까지 정상 WBC 및 ANC 레벨을 유지하였다.*: Side effects of grade 3: Three patients had an abnormal study at the start of the study (grade 2 creatine, grade 2 ANC, grade 1 hemoglobin), grade 3 at 12 weeks, and the remaining patients had normal WBC and ANC until 12 weeks The level was maintained.

약물동태학 - 모든 4번의 투여를 완료하여 모두 의도한 복용량의 벨투즈맙 복용량을 투여받았고, 첫 번째 및 마지막 투여 후 혈청 샘플을 수집하였으며, 벨투즈맙을 투여받기 전에 음성 ELISA 분석 결과를 갖는 총 72명의 환자(알수 없는 원인으로 혈청 인자가 간섭되는 것이 명백한 1명의 환자는 제외됨)가 약물동태학의 분석에 포함되었다. 표 10은 각 투여 이전 및 투여 30분 이후의 평균 혈청 레벨을 요약한 것이다. 모든 복용량에서, 첫 번째 투여시 평균 피크 레벨은 리툭시맙에서 효능을 유지하기 위해 중요하다고 간주되는 25 ㎍/㎖ 값을 상회하였다(Berinstein et al., Ann Oncol 9:995-1001, 1998; Gordon et al., J Clin Oncol 23:1096-1102, 2005; Cartron et al., Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007). 항체는 모든 복용량에서, 심지어 80 ㎎/㎡에서도 투여시 축적되었고, 평균 저점(trough) 혈청 레벨은 마지막 투여 때까지 25 ㎍/㎖ 값을 상회하였다. 처리 후 혈청 샘플은 마지막 투여 30분 후, 1, 2, 3 및 4일 후, 및 1, 2, 3, 4, 8 및 12주 후에 수집하기로 계획하였다. Pharmacokinetics -All four doses were completed, all received the intended dose of beltuzmab, serum samples were collected after the first and last dose, and a total of 72 patients with negative ELISA assay results before beltuzmab Patients were excluded from the pharmacokinetic analysis (except for one patient who apparently interfered with serum factors for unknown causes). Table 10 summarizes the mean serum levels before and 30 minutes after each administration. At all doses, the average peak level at the first dose exceeded the 25 μg / ml value deemed important to maintain efficacy in rituximab (Berinstein et al., Ann Oncol 9: 995-1001, 1998; Gordon et al., J Clin Oncol 23: 1096-1102, 2005; Cartron et al., Crit Rev in Oncol Hematol 62: 43-52, 2007). Antibodies accumulated at all doses, even at 80 mg / m 2, with mean trough serum levels above 25 μg / ml until the last dose. Post-treatment serum samples were planned to be collected 30 minutes after the last dose, after 1, 2, 3 and 4 days, and after 1, 2, 3, 4, 8 and 12 weeks.

벨투즈맙 혈청 레벨(평균±SD): 투여 전 및 투여 후 결과(㎍/㎖)Beltuzumab serum levels (mean ± SD): pre- and post-dose results (μg / ml) 80 ㎎/㎡
(N=12)80 mg / ㎡
(N = 12) 120 ㎎/㎡
(N=19)120 mg / ㎡
(N = 19) 200 ㎎/㎡
(N=14)200 mg / ㎡
(N = 14) 375 ㎎/㎡
(N=24)375 mg / ㎡
(N = 24) 750 ㎎/㎡
(N=3)750 mg / ㎡
(N = 3) 투여 1
전
후Dosing 1
I'm
after
1.3±1.5
39±9
1.3 ± 1.5
39 ± 9
0.3±0.5
59±13
0.3 ± 0.5
59 ± 13
0.3±0.6
94±22
0.3 ± 0.6
94 ± 22
0.1±0.3
194±35
0.1 ± 0.3
194 ± 35
0.7±0.5
474±33
0.7 ± 0.5
474 ± 33 투여 2
전
후Dosing 2
I'm
after
11±5
48±15
11 ± 5
48 ± 15
18±11
86±31
18 ± 11
86 ± 31
28±18
125±44
28 ± 18
125 ± 44
75±45
276±90
75 ± 45
276 ± 90
222±158
632±99
222 ± 158
632 ± 99 투여 3
전
후Dosing 3
I'm
after
20±7
55±15
20 ± 7
55 ± 15
30±19
92±44.4
30 ± 19
92 ± 44.4
57±29
140±49
57 ± 29
140 ± 49
118±51
335±91
118 ± 51
335 ± 91
385±77
801±29
385 ± 77
801 ± 29 투여 4
전
후Dosage 4
I'm
after
27±11
68±25
27 ± 11
68 ± 25
43±26
100±37
43 ± 26
100 ± 37
72±41
170±67
72 ± 41
170 ± 67
173±69
404±105
173 ± 69
404 ± 105
495±64
996±66
495 ± 64
996 ± 66

단일-구획(모노-지수) 모델은 72명의 환자 각각에서 모든 이용가능한 처리 후 혈청-레벨 데이터와 일치하였다. 표 11은 평균 Cmax 및 AUC는 복용량 레벨에 따라 증가한 반면, 제거(CL) 값은 복용량 의존성과 일치하는 패턴을 보이지 않았음을 보여주는 결과물인 일치-결정된(fit-determined) 약물동태학 파라미터를 요약한 것이다. 가장 중요한 것은, 평균 T1 /2 값은 모든 복용량, 심지어 80 ㎍/㎖에서도 필적할만한 것으로 나타났고, 항체는 평균 반감기 20일로 순환계에 남아있었다. 공식적인 비교는 수행하지 않았지만, 50명의 소낭성 환자의 경우 22명의 다른 비-소낭성 환자와 비교할 때 평균 피크 및 저점 또는 처리 후 약물동태학에서 주요한 차이는 없었다(데이터는 나타내지 않음).The single-compartment (mono-index) model was consistent with all available post-treatment serum-level data in each of 72 patients. Table 11 summarizes the fit-determined pharmacokinetic parameters, the result showing that mean Cmax and AUC increased with dose level, while clearance (CL) values did not show a pattern consistent with dose dependence. will be. Most importantly, the average T 1/2 values appeared to be comparable at all dosages, or even 80 ㎍ / ㎖, the antibody remained on the circulatory half-life of 20 days average. No formal comparisons were made, but there were no significant differences in mean peaks and lows or post-treatment pharmacokinetics for 50 vesicular patients compared to 22 other non-vesicular patients (data not shown).

벨투즈맙 혈청 레벨(평균±SD): 네 번째 투여 후 약물동태학Beltuzumab serum levels (mean ± SD): pharmacokinetics after the fourth dose 80 ㎎/㎡
(N=12)80 mg / ㎡
(N = 12) 120 ㎎/㎡
(N=19)120 mg / ㎡
(N = 19) 200 ㎎/㎡
(N=14)200 mg / ㎡
(N = 14) 375 ㎎/㎡
(N=24)375 mg / ㎡
(N = 24) 750 ㎎/㎡
(N=3)750 mg / ㎡
(N = 3) Cmax
(㎍/㎖)Cmax
(Μg / ml) 56±1956 ± 19 91±3491 ± 34 155±60155 ± 60 358±90358 ± 90 884±90884 ± 90 T1 /2
(d)T 1/2
(d) 19.7±9.419.7 ± 9.4 14.7±7.714.7 ± 7.7 18.4±9.818.4 ± 9.8 13.3±4.113.3 ± 4.1 16.1±1.416.1 ± 1.4 AUC0 →∞
(d×㎍/㎖)AUC 0 → ∞
(d × μg / ml) 1,487±6461,487 ± 646 1,952±1,2041,952 ± 1,204 4,188±2,2864,188 ± 2,286 7,191±3,2627,191 ± 3,262 20,647±3,31320,647 ± 3,313 CL
(㎖/d/㎡)CL
(Ml / d / ㎡) 67±3367 ± 33 108±103108 ± 103 230±604230 ± 604 72±5272 ± 52 37±737 ± 7

리툭시맙에 대해 보고된 것과 유사하게(Berinsteine et al., Ann Oncol 9:995-1001, 1998; Gordon et al., J Clin Oncol 23:1096-1102, 2005; Cartron et al., Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007), 각 투여시 평균 및 중간 피크 및 저점 혈청 레벨은 가장 낮은 복용량인 80 ㎎/㎡로 처리된 환자들에게 조차도 일반적으로 비반응자들보다 객관적 반응을 갖는 환자들에서 더 높았다. 이용가능한 데이터가 있는 모든 소낭성 환자에 대한 중간 투여 전 및 투여 후 결과는 표 12에 요약되어 있다.Similar to that reported for rituximab (Berinsteine et al., Ann Oncol 9: 995-1001, 1998; Gordon et al., J Clin Oncol 23: 1096-1102, 2005; Cartron et al., Crit Rev in Oncol Hematol 62: 43-52, 2007), mean and median peak and trough serum levels at each dose are generally found in patients with an objective response than non-responders, even in patients treated with the lowest dose of 80 mg / m2. Higher. Intermediate pre and post dose results for all vesicular patients with available data are summarized in Table 12.

소낭성 림프종 반응자 및 비반응자에 대한 처리 동안의 벨투즈맙 혈청 레벨Beltuzumab serum levels during treatment for vesicular lymphoma responders and non-responders 투여administration 반응자Responder 투여 전Before dosing 투여 후After administration NN 중간(㎍/㎖)Medium (μg / ml) NN 중간(㎍/㎖)Medium (μg / ml) 1One 예Yes 2020 0.00.0 1616 90.790.7 아니오no 2121 0.00.0 1515 59.059.0 22 예Yes 2020 36.536.5 1616 152.9152.9 아니오no 2020 16.116.1 1414 83.583.5 33 예Yes 2020 69.269.2 1616 201.0201.0 아니오no 2121 33.033.0 1616 75.275.2 44 예Yes 2020 93.093.0 1616 201.0201.0 아니오no 2121 43.043.0 1616 85.485.4

B-세포 및 다른 면역학적 변화 - 기준선, 각 투여 전, 마지막 투여 후 4주, 이후 기준선까지 회복할 때까지 3개월 간격으로 말초혈 B-세포 레벨(CD19+)을 측정하였다. 연구 시작시, 68명의 환자는 낮거나 낮음-정상의 말초혈 B-세포 레벨(1-256 세포/㎕, 중간 60)을 가졌고, 9명의 환자(모든 5명의 SLL 환자 포함)는 증가된 레벨을 가졌으며(572-14,712 세포/㎕, 중간 1,782), 5명의 환자는 기준선 레벨이 측정되지 않았다. B-Cells and Other Immunological Changes -Peripheral blood B-cell levels (CD19 +) were measured at 3 month intervals until baseline, before each dose, 4 weeks after the last dose and then until baseline. At the start of the study, 68 patients had low or low-normal peripheral blood B-cell levels (1-256 cells / μl, medium 60) and 9 patients (including all 5 SLL patients) had increased levels. Had (572-14,712 cells / μl, medium 1,782) and 5 patients had no baseline level measured.

도 15는 기준선에서 증가되지 않은 B-세포 레벨을 갖는 모든 환자와 처리 동안에서 얻는 적어도 하나의 샘플에 대한 B-세포 레벨 코스를 보여주는 그래프이다. B-세포 레벨이 총 림프구에 대한 백분율로 보고된 실험에서, 정량의 하한(전형적으로 1%) 아래로 떨어진 것은 측정할 수 없었으며, 분석을 위하여 결과값을 절대 세포 계수로 변환시키기 전에 하한으로 보전적으로 세팅하였다. 이와 같이, B-세포 소모의 실제 정도는 보다 완전할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 상기 결과는 가장 낮은 복용 레벨인 80 ㎎/㎡을 포함하는 모든 복용량 레벨에 대해 필적할만한 것으로 나타난다.FIG. 15 is a graph showing the B-cell level course for all patients with unincreased B-cell levels at baseline and at least one sample obtained during treatment. In experiments where B-cell levels were reported as a percentage of total lymphocytes, it was not possible to measure below the lower limit of quantitation (typically 1%) and to lower bound before converting the result to absolute cell counts for analysis. Integrity was set. As such, the actual degree of B-cell depletion may be more complete, but nevertheless the results appear comparable for all dose levels, including the lowest dose level of 80 mg / m 2.

B-세포는 일반적으로 마지막 투여 6개월 후 회복이 개시되기 전까지 소모된 채로 남아있었고, 이후 떨어진 값은 9-12개월까지 기준선 쪽으로 되돌아왔으며, 장기간의 데이터는 여전히 가장 최근의 복용량 레벨인 80 ㎎/㎡에서 처리된 환자에 대해서만 있지만, 낮은 복용량 레벨에서 B-세포 소모가 오래가지 않는다는 증거는 없다.B-cells generally remained consumed until recovery began 6 months after the last dose, and then the values dropped back to baseline by 9-12 months, with long-term data still at the most recent dose level of 80 mg / Only for patients treated at m 2, but there is no evidence that B-cell depletion does not last long at low dose levels.

연구 시작시 증가된 B-세포 레벨을 갖는 일부 환자는 명확성을 위하여 도 14에 포함시키지 않았다. 특히 SLL 환자의 경우에 매우 증가된 기준선 값에도 불구하고, 그 B-세포 레벨은 80 ㎎/㎡로 처리된 1명의 환자에서 94% 감소한 것을 포함하여 처리시(중간 96% 감소) 실질적으로 감소하였다. 그러나, 이것은 주로 단기간의 반응이었고, 대부분은 마지막 투여 12주 후까지 증가된 기준선 값 쪽으로 되돌아오기 시작하였다.Some patients with increased B-cell levels at the start of the study were not included in FIG. 14 for clarity. Despite the significantly increased baseline values, especially for SLL patients, their B-cell levels were substantially reduced upon treatment (median 96% reduction), including a 94% decrease in one patient treated with 80 mg / m 2. . However, this was mainly a short-term response, most of which began to return towards increased baseline values until 12 weeks after the last dose.

혈액 샘플로부터 정량적 혈청 면역글로불린 및 T-세포 레벨을 얻어 기준선, 마지막 투여 전, 투여 4주 및 12주 후, 이후 추적조사시 남아있는 환자에 대해 매 3개월에 평가하였다. 12주의 연구 기간 동안 또는 마지막 투여 후 1년까지 추적조사한 환자의 작은 서브셋에서 임상적으로 현저한 감소를 보이는 일치하는 패턴은 없었으며, 기준선으로부터의 중간 변화는 대부분의 시점에서 작았다(전형적으로 IgA 및 IgG에 대해서는 <5%, T 세포에 대해서는 <15%, IgM에 대해서는 <20%).Quantitative serum immunoglobulin and T-cell levels were obtained from blood samples and evaluated every 3 months for patients remaining at baseline, before the last dose, 4 and 12 weeks after dosing, and thereafter for follow-up. There was no consistent pattern of clinically significant reductions in a small subset of patients followed during the 12-week study or up to 1 year after the last dose, with moderate changes from baseline at most time points (typically IgA and <5% for IgG, <15% for T cells, <20% for IgM).

면역원성( HAHA ) - 70명의 환자는 ELISA 분석에 의해 HAHA를 분석한 마지막 투여 후 4주(N=58), 12주(N=53), 6개월(N=8) 또는 1년(N=2)에 적어도 하나의 처리후 혈청 샘플을 가졌다. 이전에 리툭시맙에 노출된 1명의 SLL 환자는 연구 시작시 음성이었지만, 임의의 외관상 임상적인 결과 없이 처리 4주 후에 증가된 역가가 나타났다(3,380 ng/㎖). 다른 모든 샘플은 음성이었다(<50 ng/㎖). Immunogenicity ( HAHA ) -70 patients were 4 weeks (N = 58), 12 weeks (N = 53), 6 months (N = 8) or 1 year (N = N) after the last dose of HAHA assayed by ELISA assay. At least one post-treatment serum sample was in 2). One SLL patient who was previously exposed to rituximab was negative at the start of the study, but increased titer after 4 weeks of treatment (3,380 ng / ml) without any apparent clinical outcome. All other samples were negative (<50 ng / ml).

논의Argument

항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 아폽토시스 효과를 갖는 직접 신호전달에 의해 매개되는 세포사의 증가에도 불구하고, B-세포 종양 또는 다양한 자가면역 질병에서 항-CD20 면역치료의 임상적인 해당 작용 메커니즘은 불확실하게 남아있다(Glennie et al., Mol Immunol 44:3823-3837, 2007). 이와 같이, 2세대 항-CD20 항체의 임상 시험이 필요하며, 이들 대부분은 전형적으로 리툭시맙에서 제공된 것과 근접하거나 더 높은 항체 복용량에 초점이 맞춰져 있다(Morschhauser et al., Blood 110:199a, 2007; Hagenbeek et al., Blood 111:5486-5495, 2008; Coiffier et al., Blood 111:1094-1100, 2008). 그러나, 동물 연구(실시예 15) 뿐만 아니라 CLL에서의 쉐이빙(shaving) 효과의 독립적인 연구(Kennedy et al., J Immunol 172:3280-3288, 2004; Williams et al., J Immunol 177:7435-7443, 2006)를 포함하는 몇 가지 일련의 연구에서 리툭시맙으로 사용된 전형적인 375 ㎎/㎡ 복용량 이하의 복용량이 이용될 수 있음을 제시하였다. 본 발명의 결과는 적어도 벨투즈맙을 이용하면 임상 반응과 말초혈 B-세포를 소모하는 능력 모두와 관련하여 375 ㎎/㎡보다 훨씬 낮은 복용량이 효능이 있음을 나타낸다.Anti-CD20 immunity in B-cell tumors or various autoimmune diseases, despite an increase in cell death mediated by direct signaling with antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement dependent cytotoxicity (CDC) and apoptosis effects The clinical mechanism of action of therapy remains uncertain (Glennie et al., Mol Immunol 44: 3823-3837, 2007). As such, clinical trials of second-generation anti-CD20 antibodies are needed, most of which are typically focused on antibody doses that are closer or higher than those provided by rituximab (Morschhauser et al., Blood 110: 199a, 2007). Hagenbeek et al., Blood 111: 5486-5495, 2008; Coiffier et al., Blood 111: 1094-1100, 2008). However, independent studies of shaving effects in CLL as well as animal studies (Example 15) (Kennedy et al., J Immunol 172: 3280-3288, 2004; Williams et al., J Immunol 177: 7435- 7443, 2006), several series of studies have suggested that doses up to the typical 375 mg / m 2 dose used with rituximab may be used. The results of the present invention indicate that at least beltuzmab is effective at doses well below 375 mg / m 2, both in terms of clinical response and the ability to consume peripheral blood B-cells.

본 연구에서의 대부분의 환자는 벨투즈맙이 리툭시맙-나이브 환자의 초기 중심적인 시험에서 리툭시맙에 대해 보고된 48% 비율(McLaughlin et al., J Clin Oncol 16:2825-2833, 1998) 또는 이전에 리툭시맙에 대해 반응한 환자에서의 40%(본 연구에서의 많은 환자들은 이전에 하나 이상의 리툭시맙-함유 처방에 노출되었기 때문임)(Davis et al., J Clin Oncol 18:3135-3143, 2000) 사이에 총 44%의 객관적 반응을 보이는 소낭성 림프종을 가졌다. 유사하게, 27% CR/CRu 또는 16% CR 단독 중 하나인 완전 반응 비율은, 이른 연구에서는 상이한 기준이 사용되었지만, 이들 군에서 보고된 6% 및 11%의 완전 반응 비율을 상회하였다.Most patients in this study reported that 48% of beltuzmab was reported for rituximab in the early central trial of rituximab-naive patients (McLaughlin et al., J Clin Oncol 16: 2825-2833, 1998) or 40% of patients who previously responded to rituximab (because many patients in this study were previously exposed to one or more rituximab-containing regimens) (Davis et al., J Clin Oncol 18: 3135-3143, 2000) with follicular lymphoma showing a total 44% objective response. Similarly, the complete response rate, either 27% CR / CRu or 16% CR alone, exceeded the complete response rates of 6% and 11% reported in these groups, although different criteria were used in earlier studies.

완전 반응을 포함하는 벨투즈맙 반응은 이전의 다중 리툭시맙-처방을 받은 환자들 뿐만 아니라 일반적으로 결과가 덜 양호할 것으로 간주되는 환자들(높은 FLIPI 점수, 증가된 LDH, 종양 매스>5 ㎝)에서 일어났다는 것이 중요하다. 가장 높은 반응 비율은 소수의 리툭시맙-나이브 환자에서 일어났으며, 57% OR 및 43% CR/CRu를 달성하였다.The Beltuzumab response, including the complete response, was not only patients who had previously received multiple rituximab-prescriptions, but also patients who were generally considered to be less likely (high FLIPI score, increased LDH, tumor mass> 5 cm). It is important that it happens in. The highest response rate occurred in a small number of rituximab-naive patients, achieving 57% OR and 43% CR / CRu.

본 연구에서 모든 FL 반응자에게 발견된 10.2개월의 중간 DR은 리툭시맙을 처음 적용한 후 재발/난치성, 특발성 NHL 환자에서 보고된 11.2개월의 DR에 필적할만하다(McLaughlin et al., J Clin Oncol 16:2825-2833, 1998). 더 긴 15.0개월의 중간 DR이 리툭시맙으로 처리된 환자에서 보고되었지만, 이들은 모두 적어도 6개월간 지속되는 이전 리툭시맙에 대한 객관적 반응을 달성하였다(Davis et al., J Clin Oncol 18:3135-3143, 2000). 반면, 본 연구에서의 환자들은 리툭시맙 6개월 내에 진행하지 않았지만, 객관적 반응은 필요하지 않았다. 이와 같이, 환자들은 다른 리툭시맙 연구들 모두에서의 1.6개월과 비교하여(McLaughlin et al., 1998; Davis et al., 2000) 본 연구에서의 3.3개월의 반응 개시에 대한 중간 시간과 일치하게, 그리고 본 연구에서 보여지는 15.2개월의 반응자에 대한 상대적으로 긴 중간 TPP와 일치하게, 더욱 난치성이고, 벨투즈맙이 효과를 얻기에는 더 많은 시간이 필요할 것이다.The median DR of 10.2 months found in all FL responders in this study is comparable to 11.2 months of DR reported in relapsed / refractory, idiopathic NHL patients after initial application of rituximab (McLaughlin et al., J Clin Oncol 16 : 2825-2833, 1998). Longer 15.0 months of intermediate DR were reported in patients treated with rituximab, but they all achieved an objective response to previous rituximab lasting at least 6 months (Davis et al., J Clin). Oncol 18: 3135-3143, 2000). In contrast, patients in this study did not progress within 6 months of rituximab, but no objective response was needed. As such, patients were consistent with the median time for onset of response of 3.3 months in this study compared to 1.6 months in all other Rituximab studies (McLaughlin et al., 1998; Davis et al., 2000). And, consistent with the relatively long median TPP for the 15.2 month responder shown in this study, it will be more refractory and more time will be required for Beltuzumab to be effective.

전술한 바와 같이, 상기 다른 연구와 비교하여 벨투즈맙에서는 많은 수의 완전 반응이 있는 것으로 보인다. 이것은 특히 중요한데, 그 이유는 본 연구에서 CR/CRu를 갖는 환자는 일반적으로 영속적인 반응을 갖기 때문이며, 중간 DR 및 PFS는 현재 각각 19.7 및 24.2개월을 가지며, 5명의 환자는 여전히 장기간의 반응을 지속하고 있으므로(15.9-37.6개월), 이들은 모두 추가로 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 연구된 낮은 복용량 레벨에도 불구하고, 벨투즈맙을 이용한 효능 결과는 4주 동안 주당 1회 투여될 때 리툭시맙과 비교하여 호의적인 것으로 보인다.As mentioned above, there appears to be a large number of complete responses in beltuzmab compared to the other studies. This is particularly important because patients with CR / CRu in this study generally have a persistent response, with median DR and PFS currently at 19.7 and 24.2 months, respectively, and 5 patients still sustaining long-term responses. (15.9-37.6 months), these can all be increased further. Thus, despite the low dosage levels studied in the present invention, efficacy results with beltuzumab appear to be favorable compared to rituximab when administered once per week for 4 weeks.

상기 비-소낭성 조직 중에서, 벨투즈맙은 27%의 CR/CRu를 가지며, 35%의 총 객관적 반응 속도를 달성하였다. 벨투즈맙은 단지 80 ㎎/㎡의 복용량 레벨에서의 1명과 3명의 장기간 반응(15-24개월)을 포함하는 절외성 MALT 또는 절성 타입의 질환을 갖는 5/6 환자(83%)에서 OR을 보여서 변연부 림프종에서 특히 양호하다. 따라서, 리툭시맙에서 이전에 보고된 양호한 반응과 일치하게(Tsimberidou et al., Cancer 107:125-135, 2006; Conconi et al., Blood 102:2741-2745, 2003), 벨투즈맙은 변연부 림프종에서 사용되기 위한 유망한 활성을 갖는다.Among the non-follicular tissues, beltuzmab had a CR / CRu of 27% and achieved a total objective response rate of 35%. Veltuzumab showed OR in 5/6 patients (83%) with an excisional MALT or ablative type of disease, including one and three long-term reactions (15-24 months) at a dose level of only 80 mg / m 2. Particularly good in marginal lymphoma. Thus, consistent with the previously reported good response in rituximab (Tsimberidou et al., Cancer 107: 125-135, 2006; Conconi et al., Blood 102: 2741-2745, 2003), Beltuzumab is a marginal lymphoma Has a promising activity for use in

DLBCL에서, 완전 반응은 일어나지 않았지만, 80 ㎎/㎡으로 처리된 1명의 환자를 포함하여 3/7 환자는 부분 반응을 달성하였다. 그 결과, 본 발명에서 주당 1회 벨투즈맙의 4 복용량을 이용하여 얻어진 43%의 OR 비율은 주당 1회 8 복용량의 리툭시맙을 이용하여 DLBCL에서 보고된 37% 속도와 필적한다(Coiffier et al., Blood 92:1927-1932, 1998). 이러한 유망한 활성의 발견은 CHOP와의 조합으로 DLBCL에서 유용하다고 판명된 리툭시맙을 이용하여 발견된 것과 유사하게 벨투즈맙이 이러한 군집에서 화학치료와의 조합으로 유용할 수 있음을 제시한다(Czuczman et al., J Clin Oncol 22:4711-4716, 2004; Coiffier et al., N Engl J Med 346:235-242, 2002; Habermann et al., J Clin Oncol 24:3121-3127, 2006).In DLBCL, no complete response occurred, but 3/7 patients achieved partial response, including one patient treated at 80 mg / m 2. As a result, the 43% OR ratio obtained using 4 doses of veltuzmab once per week in this invention is comparable to the 37% rate reported in DLBCL using 8 doses of rituximab once per week (Coiffier et al. , Blood 92: 1927-1932, 1998). The discovery of this promising activity suggests that beltuzumab may be useful in combination with chemotherapy in this population, similar to that found with rituximab, which has proven to be useful in DLBCL in combination with CHOP (Czuczman et al. ., J Clin Oncol 22: 4711-4716, 2004; Coiffier et al., N Engl J Med 346: 235-242, 2002; Habermann et al., J Clin Oncol 24: 3121-3127, 2006).

맨틀 세포 림프종을 갖는 7명의 환자 중 1명만이 120 ㎎/㎡에서 벨투즈맙으로 처리된 환자에서 단기간의 부분 반응의 객관적 반응을 가졌다. 이것은 상기 질환에서 단일-제제 리툭시맙을 이용하여 보고된 보통의 반응 속도, 우세하게는 부분 반응과 일치한다(Igarashi et al., Ann Oncol 13:928-943, 2002; Foran et al., J Clin Oncol 18:317-324, 2000). 재발된 작은 림프구성 림프종을 갖는 환자는 단일 제제인 리툭시맙에 대해 상대적으로 굴절성이 있는 것으로 알려져 있으며(McLaughlin et al., 1998; Foran et al., J Clin Oncol 18:317-324, 2000), 본 연구에서의 일부 환자들 모두 객관적 반응을 갖지 않았다.Only one of seven patients with mantle cell lymphoma had an objective response of short-term partial response in patients treated with beltumab at 120 mg / m 2. This is consistent with the normal response rate, predominantly partial response, reported using single-agent rituximab in the disease (Igarashi et al., Ann Oncol 13: 928-943, 2002; Foran et al., J Clin Oncol 18: 317-324, 2000). Patients with recurrent small lymphocytic lymphoma are known to be relatively refractive for a single agent, rituximab (McLaughlin et al., 1998; Foran et al., J Clin). Oncol 18: 317-324, 2000), not all patients in this study had an objective response.

그러나, 첫 번째 벨투즈맙 투여 후 감소되고 적어도 마지막 투여 4주 후까지 감소된 채로 남아있는 모든 환자들이 연구 시작시 증가된 B-세포 레벨을 갖고 있었고(10,000/㎣ 이상 3명), 여기에는 10,000/㎣의 초기 레벨을 갖고 80 ㎎/㎡으로 처리된 후에 94% 감소된 1명의 환자를 포함하므로, 벨투즈맙은 SSL에서의 활성의 다른 증거를 갖고 있었다. 발덴스트롬 마크로글로불린혈증과 면역사이토마(immunocytoma)를 갖는 환자에서의 리툭시맙의 2가지 연구에서는 완전 반응 없이 단지 보통의 반응 속도만을 보고하였고(Foran et al., J Clin Oncol 18:317-324, 2000; Gertz et al., Leuk Lymphoma 45:2047-2055, 2004), 따라서 본 연구에서 림포플라즈마사이토이드 림프종을 갖는 2명의 환자 모두 객관적 반응을 갖지 않는다는 것은 놀라운 일이 아니다.However, all patients who had decreased after the first veltuzmab administration and remained reduced until at least 4 weeks after the last dose had increased B-cell levels at the start of the study (30,000 +/- 3 patients), including 10,000 / Beltuzumab had other evidence of activity in SSL, as it included one patient with an initial level of shock and a 94% reduction after treatment at 80 mg / m 2. Two studies of rituximab in patients with Waldenstrom macroglobulinemia and immunocytoma reported only moderate response rates without complete response (Foran et al., J Clin Oncol 18: 317-324, 2000; Gertz et al., Leuk Lymphoma 45: 2047-2055, 2004), therefore, it is not surprising that in this study, two patients with lymphoplasmacytoid lymphoma do not have an objective response.

벨투즈맙의 약물동태학과 관련하여, 375 ㎎/㎡에서 벨투즈맙을 이용하여 달성된 평균 피크 및 저점 혈청 항체 레벨은 리툭시맙에 대해 보고된 값에 필적할 만하였다(Berinstein et al., Ann Oncol 9:995-1001, 1998). 80 ㎎/㎡에서 조차도, 첫 번째 투여 후 B-세포 소모가 일어났고, 첫 번째 투여 후 항체 혈청 레벨은 효능의 유지와 관련되는 25 ㎍/㎖ 값을 상회하였으며(Berinstein et al., 1998;; Gordon et al., 2005; Cartron et al. 2007), 각각의 연속적인 투여시 계속 증가하였고, 리툭시맙 연구에서 보고된 것과 필적하거나, 적어도 그만큼 긴 반감기로 벨투즈맙은 마지막 투여 후에도 순환계에 남아있었다(Berinstein et al., 1998; Cartron et al. 2007).Regarding the pharmacokinetics of beltumab, the mean peak and low serum antibody levels achieved with beltumab at 375 mg / m 2 were comparable to those reported for rituximab (Berinstein et al., Ann Oncol 9: 995-1001, 1998). Even at 80 mg / m 2, B-cell depletion occurred after the first dose and antibody serum levels after the first dose exceeded the 25 μg / ml value associated with maintenance of efficacy (Berinstein et al., 1998 ;; Gordon et al., 2005; Cartron et al. 2007), which continued to increase with each successive dose, with a half-life that was comparable to, or at least as long as, that reported in the rituximab study, beltuzumab remained in the circulatory system after the last dose. (Berinstein et al., 1998; Cartron et al. 2007).

본 발명자들은 리툭시맙을 이용하여 보고된 반응자에서의 더 높은 혈청 레벨과 동일한 상관관계를 발견하였으며(Berinstein et al., 1998; Cordon et al., 2005; Cartron et al., 2007), 비록 그 수는 작지만, 이러한 경향은 가장 낮은 복용량인 80 ㎎/㎡만 처리된 환자들에서도 여전히 보였다. 이러한 약물동태학 및 약동학적 발견은 더 낮은 벨투즈맙 복용량이 항원 싱크를 극복하기에 충분하다는 것을 제시하며, 따라서 80 ㎎/㎡을 포함하여 본 연구에서의 모든 복용량 레벨에서 일어난 임상 활성의 설명을 지지한다.We found the same correlation with higher serum levels in responders reported using rituximab (Berinstein et al., 1998; Cordon et al., 2005; Cartron et al., 2007), although Although small in number, this trend was still seen in patients treated with only the lowest dose of 80 mg / m 2. These pharmacokinetic and pharmacokinetic findings suggest that lower beltuzmab doses are sufficient to overcome antigen sinks, and thus support the explanation of clinical activity at all dose levels in this study, including 80 mg / m 2. do.

낮은 복용량을 이용하는 추가적인 이점은 감소된 투여 시간이다. 벨투즈맙을 이용하면, 중간 첫 번째 투여 시간은 750 ㎎/㎡에서 4.7시간이었고, 375 ㎎/㎡에서 3.1시간이었으며, 더 낮은 복용량에서는 1.8-2.4시간이었지만, 이후 투여시의 중간 시간은 375 또는 750 ㎎/㎡에서 2.1-2.6시간이었고, 더 낮은 복용량에서는 1.2-1.5시간이었다. 이러한 더 짧은 투여 시간에서는 심각한 투여 반응이나 보다 보통의 투여 반응 빈도의 증가가 없었다. 이것은 중요한데, 그 이유는 상기 프로토콜이 본 첫 번째 연구에서의 투여 속도를 제한하여서, 상기 제제를 이용하여 훨씬 더 빠른 투여가 가능할 수 있기 때문이다. 또한, 벨투즈맙은 표준 안전성 실험, T-세포 레벨 또는 혈청 면역글로불린에서 현저한 임상적 영향은 없었다. 임상적 유의성이 확실하지 않은 한가지 경우의 HAHA 반응만이 일어났다: 이를 제외하고는 벨투즈맙 면역원성의 증거는 없었다.An additional advantage of using low doses is reduced dosing time. With Veltuzumab, the median first administration time was 4.7 hours at 750 mg / m 2, 3.1 hours at 375 mg / m 2, and 1.8-2.4 hours at lower doses, but the median time for subsequent administration was 375 or 750. 2.1-2.6 hours at mg / m 2 and 1.2-1.5 hours at lower doses. At these shorter dose times there was no serious dose response or an increase in the frequency of more usual dose responses. This is important because the protocol limits the rate of administration in this first study, so that much faster administration may be possible with the formulation. In addition, Beltuzumab had no significant clinical effect on standard safety experiments, T-cell levels or serum immunoglobulins. There was only one case of HAHA response with no clinical significance: Except for this, there was no evidence of Beltuzumab immunogenicity.

리툭시맙의 첫 번째 임상 연구는 10-500 ㎎/㎡의 단일 복용량을 평가하였으며, 100 ㎎/㎡ 이상의 복용량에서 몇 가지 부분 반응을 달성하였다(Maloney et al., Blood 84:2457-2466, 1994). 다음의 리툭시맙 연구에서, 125 ㎎/㎡ 및 그 이상의 복용량만이 4주 동안 주당 1회 투여되었고, 테스트된 각각의 복용량 레벨에서 실제 반응 속도(모든 부분 반응)가 동일했기 때문에(Maloney et al., J Clin Oncol 15:3266-3274, 1997), 명백히 과학적인 고려보다는 수송(logistical)에 근거하여, 지금은 표준 375 ㎎/㎡ 복용량이 이 시점에서 추가 개발용으로 선택되었다. 약물동태학 및 환자의 반응에 영향을 미치는 인자를 보다 잘 이해하는 것이 복용량을 최적화하기 위해 분명히 필요하지만(Cartron et al., Crit Rev in Oncol Hematol 62:43-52, 2007), 리툭시맙이 처음 승인된 후, 375 ㎎/㎡과 심지어 더 높은 복용량이 더 낮은 레벨에 대한 비판적인 평가나 고려 없이 항-CD20 항체를 이용한 임상적 용도로 받아들여졌다. 그러나, 최근 만성 림프구성 백혈병에서의 "쉐이빙"의 증거는 낮은 복용량이 상기 질환에서 효과적일 수 있음을 제시하도록 하였다(Kennedy et al., J Immunol 172:3280-3288, 2004; Williams et al., J Immunol 177:7435-7443, 2006). 또한, 낮은 복용량은 악성 질환에서보다 CD20 싱크가 훨씬 적을 수 있고, 매우 공격적인 B-세포 억제가 필요하지 않거나 바람직하지 않을 수 있는, 작은 부피의 질환을 갖거나 유지 치료 중인 림프종 환자, 또는 B-세포 매개성 자가면역 질환과 같은 낮은 CD20 종양 부담(burden)에 대해 효과적임이 예측될 것이다.The first clinical study of rituximab evaluated a single dose of 10-500 mg / m 2 and achieved several partial responses at doses of 100 mg / m 2 or higher (Maloney et al., Blood 84: 2457-2466, 1994). ). In the following rituximab study, only 125 mg / m 2 and higher doses were administered once per week for 4 weeks, since the actual response rate (all partial responses) was the same at each dose level tested (Maloney et al. , J Clin Oncol 15: 3266-3274, 1997), based on logistical rather than apparent scientific considerations, now the standard 375 mg / m 2 dose has been selected for further development at this point. A better understanding of pharmacokinetics and factors affecting the patient's response is clearly needed to optimize dosage (Cartron et al., Crit Rev in Oncol Hematol 62: 43-52, 2007), after Rituximab was first approved, 375 mg / m 2 and even higher doses were accepted for clinical use with anti-CD20 antibodies without critical assessment or consideration of lower levels. lost. However, recent evidence of "shaving" in chronic lymphocytic leukemia has suggested that low doses may be effective in the disease (Kennedy et al., J Immunol 172: 3280-3288, 2004; Williams et al., J Immunol 177: 7435-7443, 2006). In addition, low doses may have much less CD20 sinks than in malignant diseases, and lymphoma patients with or undergoing maintenance of small volumes of disease, or B-cells, which may not require or undesirable highly aggressive B-cell inhibition. It will be expected to be effective against low CD20 tumor burden, such as mediated autoimmune disease.

요약하면, 본 실시예는 벨투즈맙은 저항성이 좋을 뿐만 아니라 낮은 복용량에서 활성이 있고, 80 ㎎/㎡을 포함하는 평가된 모든 복용량에서 완전 반응이 일어난다는 것을 보여주었다. 또한, 동물 모델에서 나타낸 바와 같이(실시예 15), 더욱 농축된 항체 제형을 이용하여 피하 주사함으로써 벨투즈맙을 운반하는 기회 때문에 낮은 복용량이 중요하다.
In summary, this example showed that beltuzmab was not only resistant but also active at low doses, and a complete response occurred at all doses evaluated, including 80 mg / m 2. Also, as shown in animal models (Example 15), low doses are important because of the opportunity to deliver veltumab by subcutaneous injection using a more concentrated antibody formulation.

실시예Example 25.  25. hA20hA20 변이체Mutant

명명denomination 다른 이름Another name H-CDR3H-CDR3 FcFc 비고Remarks 101101 102102 239239 332332 v-mabv-mab 벨투즈맙;
hA20Beltuzmab;
hA20 DD VV SS II 느린 해리 속도Slow dissociation rate V102YV102Y ●● YY ●● ●● 시험관내 및 생체내 특성이 유사 또는 동등한 v-mab의 CDR 변이체CDR variants of v-mabs with similar or equivalent in vitro and in vivo properties Ex. 25AEx. 25A YDEYDE ●● YY DD EE 향상된 ADCC를 갖는 V102Y의 Fc 변이체Fc variant of V102Y with enhanced ADCC Ex. 25BEx. 25B v-mab-DEv-mab-DE ●● ●● DD EE 향상된 ADCC를 갖는 v-mab의 Fc 변이체Fc variant of v-mab with enhanced ADCC Ex. 25CEx. 25C D101ND101N ●● ●● ●● 더 빠른 해리 속도를 갖는 v-mab의 CDR 변이체CDR variants of v-mab with faster dissociation rates

대응하는 부위에서 v-mab과 동일한 아미노산 잔기는 ●로 나타나 있다.Amino acid residues identical to v-mab at the corresponding sites are indicated by ●.

재료 및 방법Materials and methods

표준 PCR 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였다. DNA 서열분석은 SeqWright(Housto, TX)에 의해 수행하였다. 제한 효소는 New England Biolabs로부터 구입하였다. 프라이머는 Fsher Scientific을 통해 만들었다.PCR was performed according to standard PCR protocols. DNA sequencing was performed by SeqWright (Housto, TX). Restriction enzymes were purchased from New England Biolabs. Primers were made through Fsher Scientific.

A. A. 변이체Mutant V102YV102Y

V102Y는 VH의 CDR3 내의 102 부위(카뱃 수)에서 Val이 Tyr로 하나의 아미노산이 변화된 hA20의 변이체이다.V102Y is a variant of hA20 in which Val changes one amino acid to Tyr at 102 sites (Catbat number) in CDR3 of VH.

Figure pct00002
Figure pct00002

따라서, V102Y 내의 CDRH3은 STYYGGDWYFDY(서열번호 21)이다.Thus, CDRH3 in V102Y is STYYGGDWYFDY (SEQ ID NO: 21).

벡터의 구축 및 Vector construction and 클로닝Cloning 도식 scheme

네 가지 프라이머를 사용하였다:Four primers were used:

Figure pct00003
Figure pct00003

클로닝 도식은 다음과 같았다:The cloning scheme was as follows:

Figure pct00004
Figure pct00004

PCR 산물 #1 & #2를 겔로부터 정제하였고, 주형으로서 동일한 몰 양으로 혼합하였으며, 프라이머로서 5' Xho I & 3' Hind Ⅲ를 이용하여 PCR하여 PCR 산물 #3(680 bp)을 생성하였고, 이것을 pGEMT 내로 클로닝하였으며, XhoI 및 HindⅢ 소화 및 이후의 서열분석에 의해 확인하였다. PCR 산물 #3과 hA20-IgG-pdHL2의 Xho I/Hind Ⅲ 제한된 단편을 접합하여 V102Y-hA20-IgG-pdHL2로 나타낸 V102Y용 발현 벡터를 완성하였다.PCR products # 1 &# 2 were purified from gels, mixed in equal molar amounts as template, PCR using 5 ' Xho I &3' Hind III as primers to generate PCR product # 3 (680 bp), It was cloned into pGEMT and confirmed by XhoI and HindIII digestion and subsequent sequencing. PCR product # 3 and Xho I / Hind III restricted fragments of hA20-IgG-pdHL2 were conjugated to complete the expression vector for V102Y represented by V102Y-hA20-IgG-pdHL2.

전달감염Transmission 및 단백질 정제 And protein purification

V102Y-hA20-pdHL2(30 ㎍)을 Sal I으로 소화시켜 선형화한 후, 페놀, 클로로포름 추출하였고, 100% 에탄올 및 암모늄 아세테이트로 침전시켰다. 상기 DNA 펠렛을 전기천공 버퍼(20 mM HEPES, pH 7.0; 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4 및 6 mM 덱스트로오스) 내에 재부유시킨 후, 2.8×106 SpESF 세포와 혼합하였고, 전기천공기 GenePluser Xcell BioRad를 이용하여 커패시턴스(capacitance) 25 μF, 450 V, 저항 무한 옴(ohm), 4 ㎜ 큐벳에서 전기천공하였다. 배지를 첨가하였고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다.V102Y-hA20-pdHL2 (30 μg) was digested with Sal I and linearized, then extracted with phenol, chloroform and precipitated with 100% ethanol and ammonium acetate. The DNA pellet was resuspended in electroporation buffer (20 mM HEPES, pH 7.0; 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na 2 HPO 4 and 6 mM dextrose) and then mixed with 2.8 × 10 6 SpESF cells. Electroporation was performed using an electroporator GenePluser Xcell BioRad at a capacitance of 25 μF, 450 V, infinite ohm resistance, and 4 mm cuvettes. Medium was added and plated in 96-well plates.

48시간 후, 0.2 μM MTX를 함유하는 동일한 부피의 선별 배지를 첨가하였다. 약 10일 후, 상기 플레이트 위에 코팅된 마우스 항-hA20 항체와 항-인간 Fc-HRP 접합체를 이용한 ELISA에 의해 클론을 스크리닝하였다. OPD 및 H2O2를 이용하여 색깔을 나타내었다.After 48 hours, the same volume of selection medium containing 0.2 μM MTX was added. After about 10 days, the clones were screened by ELISA using mouse anti-hA20 antibody and anti-human Fc-HRP conjugate coated on the plate. Colors were shown using OPD and H 2 O 2 .

가장 높은 생산성(42 ㎎/ℓ)을 갖는 클론을 선별하였고, 3D10으로 나타내었다. 회전하는 병에서 V102Y를 만들었고, 단백질 A로 정제하였으며, 그 순도는 SDS-PAGE 및 크기-배제 HPLC에 의해 나타내었다. 다른 특성으로는 해리 속도 결정 및 ADCC 분석을 포함하였다.
The clone with the highest productivity (42 mg / L) was selected and represented as 3D10. V102Y was made in a rotating bottle and purified with Protein A, the purity of which was indicated by SDS-PAGE and size-exclusion HPLC. Other features included dissociation rate determination and ADCC analysis.

B. B. 변이체Mutant YDEYDE

YDE는 Fc의 CH2 도메인 상에 2개의 아미노산 돌연변이, 즉 S 239 D(TCA→GAT) & I 332 E(ATC→GAA)를 갖는 V102Y의 돌연변이체이다.YDE is a mutant of V102Y with two amino acid mutations on the CH2 domain of Fc, namely S 239 D (TCA → GAT) & I 332 E (ATC → GAA).

V102Y와 마찬가지로, YDE 내의 CDRH3은 STYYGGDWYFDY(서열번호 21)이다.Like V102Y, CDRH3 in YDE is STYYGGDWYFDY (SEQ ID NO: 21).

벡터의 구축 및 Vector construction and 클로닝Cloning 도식 scheme

두 개의 아미노산의 돌연변이를 위하여 6개의 프라이머를 디자인하였다:Six primers were designed for mutation of two amino acids:

Figure pct00005
Figure pct00005

클로닝 도식은 다음과 같았다:The cloning scheme was as follows:

Figure pct00006
Figure pct00006

각각의 PCR 산물을 겔-정제하였고, 동일한 몰 농도로 혼합하였으며, 5' PstI - Fc 및 3' PstI - Fc를 프라이머로 사용하여 PCR#4(941 bp)를 얻었다. PCR#4를 pGEMT 내에 클로닝하였고, 서열분석에 의해 확인하였다. 이후, 그 단편을 PstI을 이용하여 pGEMT로부터 소화시켰고, 역시 PstI으로 소화시킨 중간 벡터인 1826-SV3 내로 클로닝하였다. EagI을 이용한 상기 스테이징 벡터로부터의 PCR#4 절단물과 EagI-제한된 V102Y-hA20-IgG-pdHL2를 접합시켜 최종 YDE-hA20-pdHL2의 구축을 완료하였다.Each PCR product was gel-purified and mixed at the same molar concentration, PCR # 4 (941 bp) was obtained using 5 ' PstI - Fc and 3' PstI - Fc as primers. PCR # 4 was cloned into pGEMT and confirmed by sequencing. The fragment was then digested from pGEMT with PstI and cloned into 1826-SV3, an intermediate vector that was also digested with PstI. PCR # 4 cleavage from the staging vector using EagI and EagI-limited V102Y-hA20-IgG-pdHL2 were conjugated to complete the construction of the final YDE-hA20-pdHL2.

전달감염Transmission 및 단백질 정제 And protein purification

V102Y에 대해 상기에 개시한 것과 동일한 절차를 사용하여 YDE에 대한 생산 클론을 얻었고, 이를 단백질 A에 의해 세포로부터 정제하였으며, SDS-PAGE 및 SE-HPLC에 의해 그 순도를 나타내었다. YDE는 m-mab 또는 V102Y와 비교하여 증가된 ADCC를 가진 것으로 나타났다.
Production clones for YDE were obtained using the same procedure as described above for V102Y, which was purified from cells by Protein A, and showed its purity by SDS-PAGE and SE-HPLC. YDE was shown to have increased ADCC compared to m-mab or V102Y.

C. C. 변이체Mutant v- v- mabmab -- DEDE

v-mab-DE는 v-mab의 Fc 변이체로서, Fc의 CH2 도메인 상에 YDE와 동일한 아미노산 돌연변이를 갖는다. 실시예 2에서 YDE에 대해 개시된 것과 동일한 프라이머 및 클로닝 도식을 사용하여 발현 벡터 v-mab-DE-hA20-pdHL2를 구축하였으며, 이를 전달감염시키지는 않았다.
v-mab-DE is an Fc variant of v-mab that has the same amino acid mutation as YDE on the CH2 domain of Fc. The same primers and cloning scheme as described for YDE in Example 2 were used to construct the expression vector v-mab-DE-hA20-pdHL2, but not to transfect.

hA20hA20 변이체의Mutant ADCCADCC 분석 analysis

ADCC 분석은 하기와 같이 수행하였다. 간략하게, Daudi 세포를 50 ㎕ 분석 배지(페놀 레드가 없는 RPMI 1640, 1% Glutamax, 1% PenStrep) 내에서 104 세포/웰로 플레이팅하였다. 한 세트의 웰은 배경 대조군용으로 배지만을 받았고, 다른 세트의 웰은 세포만을 받아 최대 세포 용해에 대한 대조군으로 사용하였다.ADCC analysis was performed as follows. Briefly, Daudi cells were plated at 10 4 cells / well in 50 μl assay medium (RPMI 1640 without phenol red, 1% Glutamax, 1% PenStrep). One set of wells received medium only for the background control and the other set of wells received only cells and used as a control for maximal cell lysis.

각각의 분석에서, 한 공여자로부터 수집된 PBMC를 사용하였다. 혈액을 헤파린화된 튜브 내로 당겼고(대략 50 ㎖의 혈액/공여자), 이 때 림프구의 밀도 구배 분리를 위하여 UNI-SEP 맥시 튜브(NOVAmed, LTD)를 사용하였다. 1.6×107 세포/㎖에서 대략 3 ㎖의 PBMC를 각 공여자로부터 얻었다.In each analysis, PBMCs collected from one donor were used. Blood was pulled into heparinized tubes (approximately 50 ml of blood / donor) at which time UNI-SEP maxi tubes (NOVAmed, LTD) were used for density gradient separation of lymphocytes. Approximately 3 ml of PBMC were obtained from each donor at 1.6 × 10 7 cells / ml.

각각의 분석에서 작용기 대 표적의 비 40 대 1, 5 ㎍/㎖의 항체를 사용하였다. 37℃, 5% CO2의 습한 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 상기 플레이트를 배양기로부터 꺼내어 실온에 도달하도록 하였고, CytoTox-One Homogenous Membrane Integrity Assay Kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 6개의 복제물에서 각 샘플에 대한 용해 백분율은 하기 식을 이용하여 결정하였다:In each assay a ratio of functional group to target 40 to 1, 5 μg / ml antibody was used. After 4 hours of incubation in a humid incubator at 37 ° C., 5% CO 2 , the plates were removed from the incubator to reach room temperature and analyzed according to the manufacturer's protocol using a CytoTox-One Homogenous Membrane Integrity Assay Kit. The percent dissolution for each sample in six replicates was determined using the following formula:

Figure pct00007
Figure pct00007

하기 표는 3명의 공여자로부터 표적 세포로 Daudi를 이용하여 얻어진 ADCC 결과(% 용해)를 요약한 것이다. 각 공여자에 있어서, YDE 및 v-mab 또는 V102Y 중 어느 하나 사이의 차이는 통계학적으로 유의하였다(공여자 009의 경우 p<0.0001; 공여자 006의 경우 p<0.0002; 공여자 001의 경우 p<0.02). v-mab 및 V102Y 사이의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다. 이소타입 대조군(h734 IgG)은 최소 ADCC를 보였다.The table below summarizes the ADCC results (% lysis) obtained using Daudi as target cells from three donors. For each donor, the difference between YDE and either v-mab or V102Y was statistically significant (p <0.0001 for donor 009; p <0.0002 for donor 006; p <0.02 for donor 001). The difference between v-mab and V102Y was not statistically significant. Isotype control (h734 IgG) showed minimal ADCC.

공여자 009Donor 009 공여자 006Donor 006 공여자 001Donor 001 v-mabv-mab 36.7±3.736.7 ± 3.7 21.1±4.221.1 ± 4.2 52.5±4.352.5 ± 4.3 V102YV102Y 33.4±7.733.4 ± 7.7 24.2±2.724.2 ± 2.7 47.5±0.547.5 ± 0.5 YDEYDE 54.5±2.754.5 ± 2.7 31.5±3.631.5 ± 3.6 58.3±3.358.3 ± 3.3 h734IgGh734IgG 4.2±2.64.2 ± 2.6 0.06±3.50.06 ± 3.5 4.2±2.84.2 ± 2.8

본 발명에서 개시 및 청구된 조성물 및 방법 모두는 본 발명의 견지에서 과도한 실험없이 제조 및 사용될 수 있다. 상기 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 측면에서 개시되어 있지만, 변형들이 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 상기 방법 및 조성물 및 본 발명에 개시된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 적용될 수 있음은 본 기술분야의 당업자에게 자명하다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적 모두에서 연관된 특정 제제는 본 발명에 개시된 제제 대신에 치환될 수 있으며, 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있을 것이다. 본 기술분야의 당업자에게 자명한 이러한 유사한 치환 및 변형은 모두 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 것과 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내인 것으로 간주된다.All of the compositions and methods disclosed and claimed herein can be made and used without undue experimentation in light of the present invention. Although the compositions and methods are disclosed in terms of preferred embodiments, it is understood that modifications may be applied to the methods and compositions and steps or order of steps of the methods disclosed herein without departing from the concept, spirit and scope of the invention. It is apparent to those skilled in the art. More specifically, the specific agents involved in both chemical and physiological may be substituted for the formulations disclosed herein and the same or similar results may be obtained. All such similar substitutions and variations apparent to those skilled in the art are considered to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.

본 발명은 2008년 7월 21일자로 출원된 미국 가특허 제61/082,399에 기반하며, 이를 우선권 주장한다. 상기 우선권 출원에 개시된 것들은 도면, 특허청구범위 및 이의 명세서를 포함하는 그 전체가 인용에 의해 본 발명에 포함된다. 아울러, 본 발명에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 포함된다.The present invention is based on US Provisional Patent No. 61 / 082,399, filed July 21, 2008, which claims priority. What is disclosed in the above priority application is incorporated by reference in its entirety, including the drawings, claims, and specification thereof. In addition, the contents of all documents, patents, and patent applications cited in the present invention are incorporated in its entirety.

<110> IMMUNOMEDICS, INC. <120> STRUCTURAL VARIANTS OF ANTIBODIES FOR IMPROVED THERAPEUTIC CHARACTERISTICS <130> 2010-fpa-4380 <150> US 61/082,399 <151> 2008-07-21 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 7 gac atc cag ctg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atc 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gtt cgc ttc agt ggc agt 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg act tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg act agt aac cca ccc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 9 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg gaa tgg att 144 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (21)..(65) <220> <221> sig_peptide <222> (21)..(65) <220> <221> CDS <222> (148)..(477) <220> <221> sig_peptide <222> (148)..(159) <220> <221> mat_peptide <222> (160)..(477) <400> 11 tctagacaca ggacctcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val 1 5 10 gca aca gct aca ggtaa ggggctcaca gtagcaggct tgaggtctgg acatatatat 110 Ala Thr Ala Thr 15 gggtgacaat gacatccact ttgcctttct ctccaca ggt gtc cac tcc gac 162 Gly Val His Ser Asp 1 5 atc cag ctg acc cag tct cca tca tct ctg agc gca tct gtt gga gat 210 Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 10 15 20 agg gtc act atg act tgt agg gcc agc tca agt gta agt tac atc cac 258 Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 25 30 35 tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa gca cct aaa ccc tgg att tat gcc 306 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala 40 45 50 act tcg aac ctg gct tct ggt gtc cct gtc cga ttc tct ggc agc gga 354 Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly 55 60 65 tct ggg aca gat tac act ttc acc atc agc tct ctt caa cca gaa gac 402 Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 70 75 80 85 att gca aca tat tat tgt cag cag tgg act agt aac cca ccc acg ttc 450 Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe 90 95 100 ggt gga ggg acc aag ctg gag atc aaa cgt gagtagaatt taaactttgc 500 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110 ttcctcagtt ggatcc 516 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val 35 40 45 Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 50 55 60 Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu 85 90 95 Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn 100 105 110 Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (23)..(67) <220> <221> sig_peptide <222> (23)..(67) <220> <221> CDS <222> (150)..(524) <220> <221> sig_peptide <222> (150)..(161) <220> <221> mat_peptide <222> (162)..(524) <400> 13 ctcgagcaca caggacctca cc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc 46 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu 1 5 ttc ttg gta gca aca gct aca ggt aaggggctca cagtagcagg cttgaggtct 100 Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 10 15 ggacatatat atgggtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccaca ggt gtc cac 158 Gly Val His 1 tcc cag gtc caa ctg cag caa tca ggg gct gaa gtc aag aaa cct ggg 206 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 5 10 15 tca tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt act agt 254 Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30 35 tac aat atg cac tgg gtc aag cag gca cct gga cag ggt ctg gaa tgg 302 Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 40 45 50 att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag 350 Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys 55 60 65 ttc aag ggt aaa gcc aca ctg act gcc gac gaa tcc acc aat aca gcc 398 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala 70 75 80 tac atg gag ctg agc agc ctg agg tct gag gac acg gca ttt tat tac 446 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr 85 90 95 tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc gat gtc tgg 494 Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 115 ggc caa ggc acc acg gtc acc gtc tcc tca ggtgag tccttacaac 540 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 120 125 ctctctcttc tattcagctt aaatagattt tactgcattt gttggggggg aaatgtgtgt 600 atctgaattt caggtcatga aggactaggg acaccttggg agtcagaaag ggtcattggg 660 agcccgggct gatgcagaca gacatcctca gctcccagac ttcatggcca gagatttata 720 ggatcc 726 <210> 14 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 102 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 cggtgactgg tacttcaatg tctggggcca aggcaccacg 40 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 aaagcttgcg gccgcgatcc 20 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 cgtggtgcct tggccccaga cattgaagta ccagtcaccg 40 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 cctcgagcac acaggacctc 20 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 cggtgactgg tacttcgatt actggggcca aggcaccacg 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 cgtggtgcct tggccccagt aatcgaagta ccagtcaccg 40 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 cctcgagcac acaggacctc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 aaagcttgcg gccgcgatcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 ctctgcagag cccaaatctt 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 agaggaagac atccggtccc ccc 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ggggggaccg gatgtcttcc tct 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 atggttttct cttcgggggc tgg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 ccagcccccg aagagaaaac cat 23 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 acctgcaggc ggccgtcgca 20 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <110> IMMUNOMEDICS, INC. <120> STRUCTURAL VARIANTS OF ANTIBODIES FOR IMPROVED THERAPEUTIC          CHARACTERISTICS <130> 2010-fpa-4380 <150> US 61 / 082,399 <151> 2008-07-21 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His   1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser   1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr   1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Tyr Asn Met His   1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys   1 5 10 15 Gly     <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val   1 5 10 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS (222) (1) .. (318) <400> 7 gac atc cag ctg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly   1 5 10 15 gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atc 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile              20 25 30 cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr          35 40 45 gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gtt cgc ttc agt ggc agt 192 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser      50 55 60 ggg tct ggg act tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu  65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg act agt aac cca ccc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr                  85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gag atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             100 105 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly   1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile              20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr          35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser      50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu  65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr                  85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             100 105 <210> 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS (222) (1) .. (363) <400> 9 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala   1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr              20 25 30 aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg gaa tgg att 144 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile          35 40 45 gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe      50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr  65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly             100 105 110 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser         115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala   1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr              20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile          35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe      50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr  65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly             100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser         115 120 <210> 11 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS (222) (21) .. (65) <220> <221> sig_peptide (222) (21) .. (65) <220> <221> CDS <148> (148) .. (477) <220> <221> sig_peptide (148) (148) <220> <221> mat_peptide <222> (160) .. (477) <400> 11 tctagacaca ggacctcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta 53                       Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val                         1 5 10 gca aca gct aca ggtaa ggggctcaca gtagcaggct tgaggtctgg acatatatat 110 Ala Thr Ala Thr              15 gggtgacaat gacatccact ttgcctttct ctccaca ggt gtc cac tcc gac 162                                             Gly Val His Ser Asp                                               1 5 atc cag ctg acc cag tct cca tca tct ctg agc gca tct gtt gga gat 210 Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp                  10 15 20 agg gtc act atg act tgt agg gcc agc tca agt gta agt tac atc cac 258 Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His              25 30 35 tgg ttc cag cag aaa cca ggg aaa gca cct aaa ccc tgg att tat gcc 306 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala          40 45 50 act tcg aac ctg gct tct ggt gtc cct gtc cga ttc tct ggc agc gga 354 Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly      55 60 65 tct ggg aca gat tac act ttc acc atc agc tct ctt caa cca gaa gac 402 Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp  70 75 80 85 att gca aca tat tat tgt cag cag tgg act agt aac cca ccc acg ttc 450 Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe                  90 95 100 ggt gga ggg acc aag ctg gag atc aaa cgt gagtagaatt taaactttgc 500 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys             105 110 ttcctcagtt ggatcc 516 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly   1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala              20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val          35 40 45 Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro      50 55 60 Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe  65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu                  85 90 95 Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn             100 105 110 Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys         115 120 125 <210> 13 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS (222) (23) .. (67) <220> <221> sig_peptide (222) (23) .. (67) <220> <221> CDS (222) (150) .. (524) <220> <221> sig_peptide <222> (150) .. (161) <220> <221> mat_peptide 162 (162) .. (524) <400> 13 ctcgagcaca caggacctca cc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc 46                                  Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu                                    1 5 ttc ttg gta gca aca gct aca ggt aaggggctca cagtagcagg cttgaggtct 100 Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr      10 15 ggacatatat atgggtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccaca ggt gtc cac 158                                                        Gly val his                                                          One tcc cag gtc caa ctg cag caa tca ggg gct gaa gtc aag aaa cct ggg 206 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly       5 10 15 tca tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt act agt 254 Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser  20 25 30 35 tac aat atg cac tgg gtc aag cag gca cct gga cag ggt ctg gaa tgg 302 Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp                  40 45 50 att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag 350 Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys              55 60 65 ttc aag ggt aaa gcc aca ctg act gcc gac gaa tcc acc aat aca gcc 398 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala          70 75 80 tac atg gag ctg agc agc ctg agg tct gag gac acg gca ttt tat tac 446 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr      85 90 95 tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc gat gtc tgg 494 Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 115 ggc caa ggc acc acg gtc acc gtc tcc tca ggtgag tccttacaac 540 Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ser                 120 125 ctctctcttc tattcagctt aaatagattt tactgcattt gttggggggg aaatgtgtgt 600 atctgaattt caggtcatga aggactaggg acaccttggg agtcagaaag ggtcattggg 660 agcccgggct gatgcagaca gacatcctca gctcccagac ttcatggcca gagatttata 720 ggatcc 726 <210> 14 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly   1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys              20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe          35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu      50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn  65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn                  85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe             100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp         115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser     130 135 140 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala   1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr              20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile          35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe      50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr  65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys                  85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly             100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser         115 120 <210> 16 <211> 102 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly   1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile              20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr          35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser      50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu  65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr                  85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys             100 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 cggtgactgg tacttcaatg tctggggcca aggcaccacg 40 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 aaagcttgcg gccgcgatcc 20 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 cgtggtgcct tggccccaga cattgaagta ccagtcaccg 40 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 cctcgagcac acaggacctc 20 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr   1 5 10 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 cggtgactgg tacttcgatt actggggcca aggcaccacg 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 cgtggtgcct tggccccagt aatcgaagta ccagtcaccg 40 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 cctcgagcac acaggacctc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 aaagcttgcg gccgcgatcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 ctctgcagag cccaaatctt 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 agaggaagac atccggtccc ccc 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ggggggaccg gatgtcttcc tct 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 atggttttct cttcgggggc tgg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 ccagcccccg aagagaaaac cat 23 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 acctgcaggc ggccgtcgca 20 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val   1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr   1 5 10

Claims (59)

키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄의 세 번째 상보성 결정 영역(CDR) 서열에서 적어도 하나의 아미노산을 치환시켜 치환된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 만드는 방법을 포함하며, 상기 치환된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 더 느린 오프-속도(off-rate), 더 느린 항원 해리 속도, 더 높은 CDC 활성, 더 높은 ADCC 활성, 더 높은 아폽토시스 활성, 가교 부재시 시험관내에서의 세포사를 유도하는 더 큰 활성 및 CD20-양성 세포를 갖는 대상에게 투여될 때 생체내에서 CD20-양성 세포를 죽이거나 그의 성장을 저해하는 더 큰 능력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 개선된 특성을 갖는 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 개선 방법.A method of making a substituted antibody or antigen binding fragment thereof by replacing at least one amino acid in a third complementarity determining region (CDR) sequence of the heavy chain of a chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof; The substituted antibody or antigen-binding fragment thereof induces slower off-rate, slower antigen dissociation rate, higher CDC activity, higher ADCC activity, higher apoptosis activity, cell death in vitro in the absence of crosslinking. A chimera with at least one improved property selected from the group consisting of greater activity and greater ability to kill or inhibit growth of CD20-positive cells in vivo when administered to a subject having CD20-positive cells, Methods of improving humanized or human anti-CD20 antibodies or antigen-binding fragments thereof. 청구항 1에 있어서,
상기 CD20-양성 세포는 B-세포인 방법.The method according to claim 1,
The CD20-positive cell is a B-cell. 청구항 1에 있어서,
상기 치환은 상기 항체의 중쇄 CDR3(CDRH3)의 카뱃 위치 101에서의 치환인 방법.The method according to claim 1,
Wherein said substitution is a substitution at Kabat position 101 of heavy chain CDR3 (CDRH3) of said antibody. 청구항 3에 있어서,
상기 치환은 카뱃 위치 101에서의 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로 교체하는 것을 포함하는 방법.The method according to claim 3,
Said substitution comprising replacing an asparagine residue at Kabat position 101 with an aspartic acid residue. 청구항 4에 있어서,
상기 치환된 항체는 카뱃 위치 94에서의 아르기닌 잔기와 상기 카뱃 위치 94에서의 아르기닌 잔기와 이온 결합을 형성하는 카뱃 위치 101에서의 아스파르트산 잔기를 포함하는 방법.The method according to claim 4,
The substituted antibody comprises an arginine residue at Kabat position 94 and an aspartic acid residue at Kabat position 101 to form an ionic bond with the arginine residue at Kabat position 94. 청구항 1에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편은 CD20에 대한 리툭시맙의 결합을 저해하는 방법.The method according to claim 1,
Said substituted antibody or fragment thereof inhibits the binding of rituximab to CD20. 청구항 1에 있어서,
상기 치환된 항체는 벨투즈맙인 방법.The method according to claim 1,
Wherein said substituted antibody is veltuzumab. 청구항 4에 있어서,
카뱃 위치 101에서 아스파라긴 대신 아스파르트산이 치환되면 CD20으로부터의 항-CD20 항체의 해리 속도가 적어도 2배 더 느려지게 되는 방법.The method according to claim 4,
Substitution of aspartic acid instead of asparagine at Kabat position 101 results in at least two-fold slower dissociation rate of anti-CD20 antibodies from CD20. 청구항 1에 있어서,
상기 치환되지 않은 항체의 CDR 서열은 설치류 항-CD20 항체의 CDR 서열과 동일한 방법.The method according to claim 1,
The CDR sequence of said unsubstituted antibody is the same as the CDR sequence of a rodent anti-CD20 antibody. 청구항 9에 있어서,
상기 설치류 항-CD20 항체는 경쇄 CDR 서열 CDRL1(RASSSVSYIH), CDRL2(ATSNLAS) 및 CDRL3(QQWTSNPPT) 및 중쇄 CDR 서열 CDRH1(SYNMH), CDRH2(AIYPGNGDTSYNQKFKG) 및 CDRH3(STYYGGDWYFNV)을 포함하는 방법.The method according to claim 9,
The rodent anti-CD20 antibodies comprise light chain CDR sequences CDRL1 (RASSSVSYIH), CDRL2 (ATSNLAS) and CDRL3 (QQWTSNPPT) and heavy chain CDR sequences CDRH1 (SYNMH), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG) and CDRH3 (STYYGGDWYFNV). 청구항 4에 있어서,
상기 치환된 항-CD20 항체 또는 그의 단편은 경쇄 CDR 서열 CDRL1(RASSSVSYIH), CDRL2(ATSNLAS) 및 CDRL3(QQWTSNPPT) 및 중쇄 CDR 서열 CDRH1(SYNMH), CDRH2(AIYPGNGDTSYNQKFKG) 및 CDRH3(STYYGGDWYFDV)을 포함하는 방법.The method according to claim 4,
The substituted anti-CD20 antibody or fragment thereof comprises light chain CDR sequences CDRL1 (RASSSVSYIH), CDRL2 (ATSNLAS) and CDRL3 (QQWTSNPPT) and heavy chain CDR sequences CDRH1 (SYNMH), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG) and CDRH3 (STYYGGDWYFDV). . 청구항 1에 있어서,
상기 인간화 항-CD20 항체는 인간화 항-CD22 항체인 에프라투즈맙의 골격 영역 서열 또는 인간화 항-CD20 항체인 벨투즈맙의 골격 영역 서열을 포함하는 방법.The method according to claim 1,
Wherein said humanized anti-CD20 antibody comprises a framework region sequence of epratumab, a humanized anti-CD22 antibody, or a framework region sequence of veltumab, a humanized anti-CD20 antibody. 청구항 4에 있어서,
카뱃 위치 101에서 아스파라긴 잔기 대신 아스파르트산이 치환되면 상기 항체에 노출된 Daudi 세포의 보체-의존적 세포독성이 증가하게 되는 방법.The method according to claim 4,
Substitution of aspartic acid instead of asparagine residue at Kabat position 101 results in increased complement-dependent cytotoxicity of Daudi cells exposed to the antibody. 청구항 4에 있어서,
카뱃 위치 101에서 아스프라긴 잔기 대신 아스파르트산이 치환되면 상기 항체에 노출된 Daudi 세포의 보체-의존적 세포독성에서의 EC50이 30 내지 40% 감소하게 되는 방법.The method according to claim 4,
Substitution of aspartic acid instead of aspragine residue at Kabat position 101 results in a 30-40% reduction in EC 50 in complement-dependent cytotoxicity of Daudi cells exposed to the antibody. a) 청구항 2의 방법에 의해 만들어진 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 얻는 단계;
b) 상기 치환된 항-CD20 항체 또는 그의 단편을 대상에게 투여하는 단계; 및
c) 대상에서 질환을 치료하는 단계를 포함하는 대상에서 질환을 치료하는 방법으로서,
상기 질환은 B-세포 매개성 면역 질환, 자가면역 질환, B-세포 림프종 및 백혈병, 이식대숙주 질환, 기관 이식 거부, 면역 용혈성 빈혈, 동종감작반응 및 한성글로불린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.a) obtaining a substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof made by the method of claim 2;
b) administering said substituted anti-CD20 antibody or fragment thereof to a subject; And
c) treating a disease in a subject comprising treating the disease in the subject,
The disease is selected from the group consisting of B-cell mediated immune disease, autoimmune disease, B-cell lymphoma and leukemia, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, immune hemolytic anemia, allogeneic sensitization and Hans globulinemia. 청구항 15에 있어서,
상기 질환은 면역 혈소판감소성 자반증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 에반스 증후군, 관절염, 동맥염, 심상성 천포창, 신장 이식 거부, 심장 이식 거부, 류마티스성 관절염, 버킷 림프종, 비-호지킨 림프종, 소낭성 림프종, 작은 림프구성 림프종, 확산된 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 다발성 골수종인 방법.The method according to claim 15,
The disease includes immune thrombocytopenic purpura, systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, Evans syndrome, arthritis, arteritis, vulgaris ulcer, kidney transplant rejection, heart transplant rejection, rheumatoid arthritis, Burkitt lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, bovine Cystic lymphoma, small lymphocytic lymphoma, diffuse B-cell lymphoma, marginal lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia and multiple myeloma. 청구항 15에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편은 네이키드 항체 또는 그의 단편인 방법.The method according to claim 15,
The substituted antibody or fragment thereof is a naked antibody or fragment thereof. 청구항 15에 있어서,
대상에게 상기 치환된 항체 또는 그의 단편의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 적어도 하나의 치료제를 추가로 투여하는 것을 포함하는 방법.The method according to claim 15,
And additionally administering at least one therapeutic agent prior to, simultaneously with, or after administration of the substituted antibody or fragment thereof to the subject. 청구항 15에 있어서,
상기 항체 또는 그의 단편은 적어도 하나의 치료제에 접합되는 방법.The method according to claim 15,
The antibody or fragment thereof is conjugated to at least one therapeutic agent. 청구항 15에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편은 200 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 100 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 80 ㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 50 ㎎ 이하, 가장 바람직하게는 30 ㎎ 이하의 용량으로 대상에게 비경구적으로 투여되고, 상기 투여는 B-세포 매개성 면역 질환, 자가면역 질환, 다른 B-세포 관련 면역 질환, B-세포 림프종 또는 백혈병의 치료에 효과적인 방법.The method according to claim 15,
The substituted antibody or fragment thereof is parenterally to the subject at a dose of 200 mg or less, more preferably 100 mg or less, more preferably 80 mg or less, more preferably 50 mg or less and most preferably 30 mg or less. And the administration is effective for the treatment of B-cell mediated immune disease, autoimmune disease, other B-cell related immune disease, B-cell lymphoma or leukemia. 청구항 20에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편은 1주 내지 3주의 간격으로 2회 이상 대상에게 투여되는 방법.The method of claim 20,
Wherein said substituted antibody or fragment thereof is administered to a subject two or more times at intervals of one to three weeks. 청구항 20에 있어서,
상기 투여는 정맥내 또는 피하 투여인 방법.The method of claim 20,
Wherein said administration is intravenous or subcutaneous administration. 청구항 20에 있어서,
상기 투여는 피하 투여이고, CD20-양성 세포를 갖는 대상에게 투여될 때 생체내에서 CD20-양성 세포를 죽이거나 성장을 저해하는데 정맥내 투여보다 더욱 효과적인 방법.The method of claim 20,
Wherein said administration is subcutaneous administration and is more effective than intravenous administration in killing or inhibiting growth of CD20-positive cells in vivo when administered to a subject having CD20-positive cells. 청구항 20에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편의 투여는 대상에서 말초 B-세포 레벨을 소모시키는데 효과적인 방법.The method of claim 20,
Administration of said substituted antibody or fragment thereof is effective for consuming peripheral B-cell levels in a subject. 청구항 24에 있어서,
상기 투여는 정맥내 80 ㎎/㎡ 또는 피하 80 ㎎의 단일 복용량으로 대상에서 말초 B-세포를 소모시키는데 효과적인 방법.The method of claim 24,
Wherein said administration is effective for consuming peripheral B-cells in a subject at a single dose of intravenous 80 mg / m 2 or subcutaneous 80 mg. 청구항 24에 있어서,
상기 투여는 대상에게 적어도 1번 투여될 때, 바람직하게는 2 내지 4번 투여될 때, 정맥내 80 ㎎/㎡ 이하 또는 피하 80 ㎎ 이하의 용량으로 대상에서 말초 B-세포를 소모시키는데 효과적인 방법.The method of claim 24,
Wherein said administration is effective for consuming peripheral B-cells in a subject at a dose of no more than 80 mg / m 2 or no more than 80 mg intravenously, when administered at least once, preferably 2-4 times. 청구항 26에 있어서,
대상의 재발을 방지 또는 치료하기에 필요한 만큼 반복적으로 추가로 투여하는 것을 포함하는 방법.27. The method of claim 26,
And further administering repeatedly as needed to prevent or treat recurrence of the subject. 청구항 17에 있어서,
상기 치환된 항체는 벨투즈맙이고, 리툭시맙에 난치인 대상에게 벨투즈맙을 투여하는 것이 상기 질환을 치료하는데 효과적인 방법.18. The method of claim 17,
And wherein said substituted antibody is veltumab and administering veltumab to a subject refractory to rituximab is effective for treating said disease. 청구항 18에 있어서,
상기 치료제는 방사성핵종, 붕소, 면역조절제, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 저해제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 독소, 혈관형성 저해제, 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA, 2차 항체 또는 그의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method according to claim 18,
The therapeutic agent may be a radionuclide, boron, immunomodulator, cytokine, hormone, hormonal antagonist, enzyme, enzyme inhibitor, photoactive therapeutic agent, cytotoxic drug, toxin, angiogenesis inhibitor, oligonucleotide, interfering RNA, secondary antibody or fragment thereof and And a combination thereof. 청구항 19에 있어서,
상기 치료제는 방사성핵종, 붕소, 면역조절제, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 저해제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 독소, 혈관형성 저해제, 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA, 2차 항체 또는 그의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method of claim 19,
The therapeutic agent may be a radionuclide, boron, immunomodulator, cytokine, hormone, hormonal antagonist, enzyme, enzyme inhibitor, photoactive therapeutic agent, cytotoxic drug, toxin, angiogenesis inhibitor, oligonucleotide, interfering RNA, secondary antibody or fragment thereof and And a combination thereof. 청구항 19에 있어서,
상기 치료제는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL- 13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, TNF-알파 및 "S1 인자"로 나타낸 줄기세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method of claim 19,
The therapeutic agent is IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 , IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, interferon-alpha, interferon-beta, interferon-gamma, TNF-alpha and " Stem cell growth factor represented by "S1 factor". 청구항 1의 방법에 의해 제조된 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편.A substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof produced by the method of claim 1. 청구항 32에 있어서,
상기 치환되지 않은 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열은 리툭시맙 유래이고, 상기 치환은 VH의 CDR3의 카뱃 위치 101에서 아스라라긴 잔기를 아스파르트산 잔기로 교체하는 것을 포함하는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method according to claim 32,
The light and heavy chain CDR sequences of the unsubstituted antibody are derived from rituximab, and the substitutions include substituted chimera, humanization or replacement of an asparagine residue with an aspartic acid residue at Kabat position 101 of CDR3 of V H. Human anti-CD20 antibody or fragment thereof. 청구항 33에 있어서,
카뱃 위치 101에서 아스파라긴 잔기 대신 아스파르트산 잔기가 치환되면 CD20으로부터의 항체의 해리 속도가 적어도 2배 더 느려지게 되는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method according to claim 33,
A substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or fragment thereof, wherein the substitution of aspartic acid residues in place of asparagine residues at Kabat position 101 results in at least a two-fold slower dissociation rate of the antibody from CD20. 청구항 33에 있어서,
카뱃 위치 101에서 아스파라긴 잔기 대신 아스파르트산 잔기가 치환되면 상기 치환된 키멜, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체에 노출된 Daudi 세포에서 보체-의존적 세포독성이 증가하게 되는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체.The method according to claim 33,
Substitution of aspartic acid residues in place of asparagine residues at the Kabat position 101 results in increased complement-dependent cytotoxicity in Daudi cells exposed to the substituted chimerized, humanized or human anti-CD20 antibodies, resulting in substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 Antibodies. 청구항 33에 있어서,
카뱃 위치 101에서 아스파라긴 잔기 대신 아스파르트산 잔기가 치환되면 Daudi 세포에서의 보체-의존적 세포독성에서의 EC50이 30 내지 40% 감소하게 되는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체.The method according to claim 33,
Substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibodies wherein the substitution of aspartic acid residues instead of asparagine residues at Kabat position 101 results in a 30-40% reduction in EC 50 in complement-dependent cytotoxicity in Daudi cells. 청구항 33에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편은 VH의 CDR3의 카뱃 위치 101에서의 아스파르트산 잔기와 이온 결합을 형성하는 카뱃 위치 94에서의 아르기닌 잔기를 추가로 포함하는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method according to claim 33,
The substituted antibody or fragment thereof substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody further comprising an arginine residue at Kabat position 94 which forms an ionic bond with an aspartic acid residue at Kabat position 101 of CDR3 of V H. Or a fragment thereof. 청구항 37에 있어서,
상기 항체 또는 그의 단편은 VH의 CDR3의 카뱃 위치 102에서의 발린 잔기를 추가로 포함하는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method of claim 37,
Said antibody or fragment thereof comprises a substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or fragment thereof further comprising a valine residue at Kabat position 102 of CDR3 of V H. 청구항 38에 있어서,
상기 치환되지 않은 항체는 상기 치환된 항체의 카뱃 위치 102에서의 티로신 잔기 및 카뱃 위치 102에서의 발린 잔기를 티로신 잔기로 교체하는 것을 포함하는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method of claim 38,
Wherein said unsubstituted antibody comprises replacing a tyrosine residue at Kabat position 102 and a valine residue at Kabat position 102 with a tyrosine residue of said substituted antibody or a fragment thereof. 청구항 33에 있어서,
상기 치환딘 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편은 경쇄 CDR 서열 CDR1(RASSSVSYIH), CDRL2(ATSNLAS) 및 CDRL3(QQWTSNPPT) 및 중쇄 CDR 서열 CDRH1(SYNMH), CDRH2(AIYPGNGDTSYNQKFKG) 및 CDRH3(STYYGGDWYFDV)을 포함하는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method according to claim 33,
The substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibodies or fragments thereof include the light chain CDR sequences CDR1 (RASSSVSYIH), CDRL2 (ATSNLAS) and CDRL3 (QQWTSNPPT) and heavy chain CDR sequences CDRH1 (SYNMH), CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG) and CDRH3 (STYYVDWYF) Substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or fragment thereof. 청구항 40에 있어서,
상기 항체는 벨투즈맙인 치환된 인간화 항-CD20 항체 또는 그의 단편.The method of claim 40,
Said antibody is veltumab; or a substituted humanized anti-CD20 antibody or fragment thereof. 청구항 32의 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질 또는 양특이성 단백질 또는 그의 항원 결합 단편.A fusion protein or bispecific protein or antigen binding fragment thereof comprising the substituted chimeric, humanized or human antibody of claim 32 or a fragment thereof. 청구항 42에 있어서,
2차 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함하는 융합 단백질 또는 양특이성 항체.The method of claim 42,
A fusion protein or bispecific antibody further comprising a secondary antibody or antigen binding fragment thereof. 청구항 43에 있어서,
상기 2차 항체 또는 그의 단편은 종양 관련성 항원 또는 표적가능한 구축물 상의 합텐에 결합하는 융합 단백질 또는 양특이성 항체.The method of claim 43,
Said secondary antibody or fragment thereof is a fusion protein or bispecific antibody that binds to a hapten on a tumor associated antigen or targetable construct. 청구항 44에 있어서,
상기 종양 관련성 항원은 탄산무수화효소 Ⅸ, B7, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B 피브로넥틴, 인자 H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, 폴레이트 수용체, GROB, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자(HIF), HM1.24, Ia, 인슐린-유사 성장 인자-1(ILGF-1), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, Ia, HLA-DR, 테나신, Le(y), RANTES, T101, TAC, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히 항원, 종양 괴사 항원, TNF-α, TRAIL 수용체(R1 및 R2), VEGFR, EGFR, PlGF, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 및 bcl-2, bcl-6, Kras 및 cMET를 포함하는 암유전자 산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질 또는 양특이성 항체.The method of claim 44,
The tumor associated antigens are carbonic anhydrase VII, B7, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 , CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95 , CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B fibronectin, factor H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, folate receptor, GROB, HMGB-1, hypoxia inducible factor ( HIF), HM1.24, Ia, insulin-like growth factor-1 (ILGF-1), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP- 1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, Ia, HLA-DR, Tenasin, Le (y), RANTES, T101, TAC, Tn Antigen , Thomson-Friedenrich antigen, tumor necrosis antigen, TNF-α, TRAIL receptors (R1 and R2), VEGFR, EGFR, PlGF, complement factor C3, C3a, C3b, C5a, C5, and bcl-2, bcl-6, Kras Fusion protein or bispecific antibody is selected from the group consisting of cancer gene product comprising a cMET. a) 진단제에 표지되어 있는 청구항 2의 방법에 의해 만들어진 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 얻는 단계;
b) 상기 치환된 항-CD20 항체 또는 그의 단편을 대상에게 투여하는 단계; 및
c) 대상에서 질환을 치료하는 단계를 포함하는 대상에서 질환을 진단 또는 검출하는 방법으로서,
상기 질환은 B-세포 매개성 면역 질환, 자가면역 질환, B-세포 림프종 및 백혈병, 이식대숙주 질환, 기관 이식 거부, 면역 용혈성 빈혈, 동종감작반응 및 한성글로불린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.a) obtaining a substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof made by the method of claim 2 labeled on a diagnostic agent;
b) administering said substituted anti-CD20 antibody or fragment thereof to a subject; And
c) a method of diagnosing or detecting a disease in a subject, comprising treating the disease in the subject,
The disease is selected from the group consisting of B-cell mediated immune disease, autoimmune disease, B-cell lymphoma and leukemia, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, immune hemolytic anemia, allogeneic sensitization and Hans globulinemia. 청구항 46에 있어서,
상기 진단제는 방사성핵종, 방사성 조영제, 상자성 이온, 금속, 형광 라벨, 화학발광 라벨, 초음파 조영제 및 광활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method of claim 46,
Wherein said diagnostic agent is selected from the group consisting of radionuclides, radiocontrasts, paramagnetic ions, metals, fluorescent labels, chemiluminescent labels, ultrasound contrast agents and photoactive agents. 청구항 18에 있어서,
상기 치료제는 2차 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 방법.The method according to claim 18,
Said therapeutic agent comprises a secondary antibody or antigen binding fragment thereof. 청구항 48에 있어서,
상기 2차 항체 또는 그의 단편은 탄산무수화효소 Ⅸ, B7, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B 피브로넥틴, 인자 H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, 폴레이트 수용체, GROB, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자(HIF), HM1.24, Ia, 인슐린-유사 성장 인자-1(ILGF-1), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, Ia, HLA-DR, 테나신, Le(y), RANTES, T101, TAC, Tn 항원, 톰슨-프리덴라이히 항원, 종양 괴사 항원, TNF-α, TRAIL 수용체(R1 및 R2), VEGFR, EGFR, PlGF, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 및 bcl-2, bcl-6, Kras 및 cMET를 포함하는 암유전자 산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method of claim 48,
The secondary antibody or fragment thereof may comprise carbonic anhydrase VII, B7, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-d, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM6, B7, ED-B fibronectin, factor H, FHL-1, Flt-1, Flt-3, folate receptors, GROB, HMGB-1, hypoxia induction Sex factor (HIF), HM1.24, Ia, insulin-like growth factor-1 (ILGF-1), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL -13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1 , MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, NCA-66, NCA-95, NCA-90, Ia, HLA-DR, Tenasin, Le (y), RANTES, T101, TAC , Tn antigen, Thompson- Friedenrich antigen, tumor necrosis antigen, TNF-α, TRAIL receptors (R1 and R2), VEGFR, EGFR, PlGF, complement factor C3, C3a, C3b, C5a, C5, and bcl-2, bcl - 6, Kras and cMET. The method selected from the group consisting of products. 청구항 48에 있어서,
상기 2차 항체 또는 그의 단편은 LL1, LL2, RFB4, hA20, 1F5, L243, MN-3, MN-15, L19, G250 및 L243으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method of claim 48,
Said secondary antibody or fragment thereof is selected from the group consisting of LL1, LL2, RFB4, hA20, 1F5, L243, MN-3, MN-15, L19, G250 and L243. a) 청구항 32에 따른 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및
b) 상기 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편을 함유하는 주사기 또는 자가주사용 펜을 포함하는 키트.a) a substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof according to claim 32; And
b) A kit comprising a syringe or self-injecting pen containing said substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or fragment thereof. 청구항 51에 있어서,
상기 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편은 10 내지 180 ㎎ 사이, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 ㎎ 사이, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 ㎎ 사이, 더욱 바람직하게는 30 내지 80 ㎎ 사이, 더욱 바람직하게는 30 내지 60 ㎎ 사이, 가장 바람직하게는 40 내지 50 ㎎ 사이의 용량인 키트.The method of claim 51,
Said chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or fragment thereof is between 10 and 180 mg, more preferably between 10 and 100 mg, more preferably between 20 and 80 mg, more preferably between 30 and 80 mg, More preferably between 30 and 60 mg, most preferably between 40 and 50 mg. 청구항 51에 있어서,
상기 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 단편은 피하 또는 정맥내 주사용으로 제형화된 동결건조 또는 멸균 용액 내에 있는 키트.The method of claim 51,
Wherein said chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or fragment thereof is in a lyophilized or sterile solution formulated for subcutaneous or intravenous injection. 청구항 51에 있어서,
키트용 설명서를 추가로 포함하는 키트.The method of claim 51,
Kits further comprising instructions for the kits. 청구항 1에 있어서,
상기 치환된 항체의 6가지 CDR 세트는 벨투즈맙, cA20, 1F5, B9E9, 2H7, 2F2, 7D8, 11B8, 1H4 또는 GA101 중 임의의 하나의 6가지 CDR 세트와 동일하지 않는 방법.The method according to claim 1,
And the six CDR sets of said substituted antibodies are not identical to the six CDR sets of any one of beltuzumab, cA20, 1F5, B9E9, 2H7, 2F2, 7D8, 11B8, 1H4 or GA101. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 치환된 항체의 6가지 CDR 세트는 벨투즈맙, cA20, 1F5, B9E9, 2H7, 2F2, 7D8, 11B8, 1H4 또는 GA101 중 임의의 하나의 6가지 CDR 세트와 동일하지 않는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편.A substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen-binding fragment thereof prepared by the method of claim 1, wherein the six CDR sets of the substituted antibody are Beltuzumab, cA20, 1F5, B9E9, 2H7, 2F2, 7D8 , A substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen binding fragment thereof that is not identical to the six CDR sets of any one of 11B8, 1H4 or GA101. 청구항 55에 있어서,
상기 인간화 항-CD20 항체는 인간화 항-CD22 항체인 에프라투즈맙의 골격 영역 서열 또는 인간화 항-CD20 항체인 벨투즈맙의 골격 영역 서열을 포함하는 방법.The method of claim 55,
Wherein said humanized anti-CD20 antibody comprises a framework region sequence of epratumab, a humanized anti-CD22 antibody, or a framework region sequence of veltumab, a humanized anti-CD20 antibody. 청구항 56에 있어서,
상기 인간화 항-CD20 항체는 인간화 항-CD22 항체인 에프라투즈맙의 골격 영역 서열 또는 인간화 항-CD20 항체인 벨투즈맙의 골격 영역 서열을 포함하는 치환된 키메라, 인간화 또는 인간 항-CD20 항체 또는 그의 항원 결합 단편.The method of claim 56, wherein
The humanized anti-CD20 antibody is a substituted chimeric, humanized or human anti-CD20 antibody or antigen thereof comprising a backbone region sequence of epratumab, a humanized anti-CD22 antibody, or a backbone region sequence of veltumab, a humanized anti-CD20 antibody Binding fragments. 청구항 20에 있어서,
상기 치환된 항체 또는 그의 단편은 적어도 주당 2회 대상에게 투여되는 방법.The method of claim 20,
Wherein said substituted antibody or fragment thereof is administered to the subject at least twice per week.
KR1020117001522A 2008-07-21 2009-07-21 Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics KR20110033233A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8239908P 2008-07-21 2008-07-21
US61/082,399 2008-07-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110033233A true KR20110033233A (en) 2011-03-30

Family

ID=41570576

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117001522A KR20110033233A (en) 2008-07-21 2009-07-21 Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics

Country Status (16)

Country Link
US (2) US7919273B2 (en)
EP (1) EP2318048B1 (en)
JP (1) JP6049163B2 (en)
KR (1) KR20110033233A (en)
CN (1) CN102159243B (en)
AU (1) AU2009274129B2 (en)
BR (1) BRPI0917204A2 (en)
CA (1) CA2731255C (en)
EA (1) EA201100228A1 (en)
HK (1) HK1155388A1 (en)
IL (1) IL210307B (en)
MX (1) MX2011000891A (en)
NZ (1) NZ590330A (en)
UA (1) UA108735C2 (en)
WO (1) WO2010011697A1 (en)
ZA (1) ZA201100013B (en)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150126605A (en) * 2013-03-12 2015-11-12 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. Cd20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same
KR20160010391A (en) * 2012-11-19 2016-01-27 발리오팜 아게 Recombinant bispecific antibody binding to cd20 and cd95
US10392425B2 (en) 2015-02-05 2019-08-27 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecules comprising Shiga toxin A subunit effector regions and enriched compositions thereof
US10815469B2 (en) 2014-06-11 2020-10-27 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising protease-cleavage resistant, Shiga toxin A subunit effector polypeptides and carboxy-terminal moieties
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
US11225509B2 (en) 2018-04-17 2022-01-18 Molecular Templates, Inc. HER2-targeting molecules comprising de-immunized, Shiga toxin A subunit scaffolds
US11312751B2 (en) 2014-01-27 2022-04-26 Molecular Templates, Inc. MHC class I epitope delivering polypeptides
US11365223B2 (en) 2015-05-30 2022-06-21 Molecular Templates, Inc. De-immunized, Shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
US11389542B1 (en) 2016-12-07 2022-07-19 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, Shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
US11406692B2 (en) 2017-01-25 2022-08-09 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, Shiga toxin a subunit effectors and CD8+ t-cell epitopes

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160279239A1 (en) 2011-05-02 2016-09-29 Immunomedics, Inc. Subcutaneous administration of anti-cd74 antibody for systemic lupus erythematosus and autoimmune disease
US8034352B2 (en) * 2005-04-06 2011-10-11 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Tetrameric cytokines with improved biological activity
US20160355591A1 (en) 2011-05-02 2016-12-08 Immunomedics, Inc. Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
PE20140196A1 (en) 2007-08-09 2014-03-19 Boehringer Ingelheim Int ANTI-CD37 ANTIBODIES
NZ597259A (en) * 2009-06-23 2014-04-30 Alexion Pharma Inc Bispecific antibodies that bind to complement proteins
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
EP2409989A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-25 International-Drug-Development-Biotech Method to improve glycosylation profile for antibody
MX340555B (en) 2010-08-25 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Antibodies against il-18r1 and uses thereof.
JP2014506258A (en) * 2011-01-10 2014-03-13 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド New use
ES2865068T3 (en) 2011-01-14 2021-10-14 Univ California Therapeutic antibodies to ROR-1 protein and methods of using them
CA2831572C (en) 2011-05-02 2019-11-26 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
US9013184B2 (en) 2011-07-18 2015-04-21 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. MR imaging system for automatically providing incidental findings
CA2853138A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Immunomedics, Inc. Therapeutic use of anti-cd22 antibodies for inducing trogocytosis
AU2012366290A1 (en) * 2012-01-19 2014-08-07 Therapeutic Proteins International, LLC Stabilization of the anti-CD20 antibody Rituximab
WO2013109904A1 (en) * 2012-01-19 2013-07-25 University Of Miami Compositions, methods and kits for treatment of cancer and autoimmune diseases
EP2849784A1 (en) * 2012-05-16 2015-03-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Combination of cd37 antibodies with ice (ifosfamide, carboplatin, etoposide)
WO2014052713A2 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Her2-and vegf-a-binding proteins with enhanced stability
SI2839860T1 (en) 2012-10-12 2019-07-31 MedImmune Limited, Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2727602A1 (en) * 2012-10-31 2014-05-07 Takeda GmbH Method for preparation of a high concentration liquid formulation of an antibody
AU2014230735B2 (en) 2013-03-13 2018-03-15 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014140361A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Takeda Gmbh Formulation of an antibody and use thereof
US20160200789A1 (en) * 2013-04-26 2016-07-14 Philogen S.P.A. Il4 conjugated to antibodies against extracellular matrix components
CN106029098A (en) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 Humanized RFB4 anti-CD22 antibody
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP2018520153A (en) * 2015-06-29 2018-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド Type II anti-CD20 antibody for use in organ transplantation
EP3337491A4 (en) * 2015-08-19 2019-04-10 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
CN109154600A (en) * 2016-06-16 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 For determining the measuring method and method of CDC induction of antibodies
CN109862919A (en) 2016-10-11 2019-06-07 免疫医疗有限公司 The therapeutic agent that antibody-drug conjugates combined immunization mediates
JP7256741B2 (en) * 2016-10-12 2023-04-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Efficacy of anti-C5 antibodies in preventing antibody-mediated rejection in renal transplantation of sensitized recipients.
WO2018187074A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Immunomedics, Inc. Subcutaneous administration of antibody-drug conjugates for cancer therapy
CN107384963A (en) * 2017-07-31 2017-11-24 山东兴瑞生物科技有限公司 A kind of preparation method and applications of controllable type CD20 Chimeric antigen receptors modification T cell
CN107693804A (en) * 2017-10-10 2018-02-16 天津市肿瘤医院 A kind of ultrasonic microbubble preparation method of the weary oxygen microenvironment of target tumor
KR20210016562A (en) 2018-05-23 2021-02-16 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 Molecular adjuvant
WO2021041678A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Anti-cd20 antibodies, anti-cd37 antibodies, and mixtures thereof
WO2022042494A1 (en) * 2020-08-27 2022-03-03 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 Cd22 antibody and application thereof
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
AU2022305071A1 (en) * 2021-07-01 2024-01-18 Rallybio Ipa, Llc Administration of anti-hpa-1a antibodies
WO2023046322A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceutica Nv Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1541435A (en) * 1975-02-04 1979-02-28 Searle & Co Immunological materials
US4036945A (en) * 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) * 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4824659A (en) * 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US5776093A (en) * 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5057313A (en) * 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US4699784A (en) * 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) * 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5567610A (en) * 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5734033A (en) * 1988-12-22 1998-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antisense oligonucleotides inhibiting human bcl-2 gene expression
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5229275A (en) * 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9019812D0 (en) * 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
WO1992007466A1 (en) 1990-11-05 1992-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Synergistic therapy with combinations of anti-tumor antibodies and biologically active agents
US5667988A (en) * 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5443953A (en) * 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
ES2251723T3 (en) * 1994-08-12 2006-05-01 Immunomedics, Inc. SPECIFIC HUMANIZED ANTIBODIES AND ANTIBODIES FOR B-cell LYMPHOMA AND LEUKEMIA CELLS.
US5798554A (en) * 1995-02-24 1998-08-25 Consorzio Per La Ricerca Sulla Microelettronica Nel Mezzogiorno MOS-technology power device integrated structure and manufacturing process thereof
EP0888125B1 (en) * 1996-03-20 2004-05-26 Immunomedics, Inc. GLYCOSYLATED IgG ANTIBODIES
JP2000510119A (en) * 1996-05-03 2000-08-08 イムノメディクス，インコーポレイテッド Targeted combination immunotherapy for cancer
US6183744B1 (en) * 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
ATE384792T1 (en) 1998-11-18 2008-02-15 Genentech Inc ANTIBODY VARIANTS WITH HIGHER BINDING AFFINITIES COMPARED TO PARENTAL ANTIBODIES
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
CN100457914C (en) 1999-04-15 2009-02-04 荷兰克鲁塞尔公司 Recombinant protein production in human cell using sequences encoding adenovirus E1 protein
EP1194167B1 (en) * 1999-06-09 2009-08-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
CA2404390A1 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibody to cd20 and interleukin-2
HUP0300369A2 (en) * 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
BR0110364A (en) 2000-04-25 2003-12-30 Idec Pharma Corp Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphoma
IL156955A0 (en) 2001-01-17 2004-02-08 Genecraft Inc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7321026B2 (en) * 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
JP2005289809A (en) * 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) Mutant heavy-chain antibody
AU2003208415B2 (en) * 2002-02-14 2009-05-28 Immunomedics, Inc. Anti-CD20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
JP4745242B2 (en) * 2003-05-20 2011-08-10 アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド CD20 binding molecule
AR044388A1 (en) * 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution CD20 UNION MOLECULES
EA012464B1 (en) * 2004-08-04 2009-10-30 Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк. Antibody against cd20 and use thereof
TW200630106A (en) * 2004-10-08 2006-09-01 Wyeth Corp Immunotherapy of autoimmune disorders
JP2008538767A (en) * 2005-04-22 2008-11-06 ジェネンテック・インコーポレーテッド Method for treating dementia or Alzheimer's disease with CD20 antibody
AU2006338198B2 (en) * 2005-12-02 2012-04-26 Genentech, Inc. Binding polypeptides and uses thereof
US9382327B2 (en) * 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160010391A (en) * 2012-11-19 2016-01-27 발리오팜 아게 Recombinant bispecific antibody binding to cd20 and cd95
KR20190071000A (en) * 2013-03-12 2019-06-21 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. Cd20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same
US10450354B2 (en) 2013-03-12 2019-10-22 Molecular Templates, Inc. CD20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same
KR20150126605A (en) * 2013-03-12 2015-11-12 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. Cd20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same
US11312751B2 (en) 2014-01-27 2022-04-26 Molecular Templates, Inc. MHC class I epitope delivering polypeptides
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
US10815469B2 (en) 2014-06-11 2020-10-27 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising protease-cleavage resistant, Shiga toxin A subunit effector polypeptides and carboxy-terminal moieties
US11104707B2 (en) 2015-02-05 2021-08-31 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof
US11248061B2 (en) 2015-02-05 2022-02-15 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecule comprising Shiga toxin A subunit effector polypeptides and enriched compositions thereof
US10392425B2 (en) 2015-02-05 2019-08-27 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecules comprising Shiga toxin A subunit effector regions and enriched compositions thereof
US11365223B2 (en) 2015-05-30 2022-06-21 Molecular Templates, Inc. De-immunized, Shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
US11389542B1 (en) 2016-12-07 2022-07-19 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, Shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
US11857628B2 (en) 2016-12-07 2024-01-02 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin A subunit effector polypeptides, Shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
US11406692B2 (en) 2017-01-25 2022-08-09 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, Shiga toxin a subunit effectors and CD8+ t-cell epitopes
US11225509B2 (en) 2018-04-17 2022-01-18 Molecular Templates, Inc. HER2-targeting molecules comprising de-immunized, Shiga toxin A subunit scaffolds

Also Published As

Publication number Publication date
EP2318048A4 (en) 2013-05-01
US20110236304A1 (en) 2011-09-29
UA108735C2 (en) 2015-06-10
CN102159243B (en) 2015-08-19
ZA201100013B (en) 2011-09-28
IL210307A0 (en) 2011-03-31
CA2731255C (en) 2018-06-05
AU2009274129A1 (en) 2010-01-28
EA201100228A1 (en) 2011-08-30
MX2011000891A (en) 2011-06-01
HK1155388A1 (en) 2012-05-18
AU2009274129B2 (en) 2016-02-25
CN102159243A (en) 2011-08-17
CA2731255A1 (en) 2010-01-28
JP2011528720A (en) 2011-11-24
US20100034738A1 (en) 2010-02-11
US7919273B2 (en) 2011-04-05
WO2010011697A1 (en) 2010-01-28
EP2318048A1 (en) 2011-05-11
IL210307B (en) 2020-11-30
EP2318048B1 (en) 2019-05-29
JP6049163B2 (en) 2016-12-21
NZ590330A (en) 2012-08-31
BRPI0917204A2 (en) 2015-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7919273B2 (en) Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics
US11180559B2 (en) Subcutaneous anti-HLA-DR monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies
US9605071B2 (en) Anti-CD19 antibodies
US8287864B2 (en) Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics
US20190071503A1 (en) Humanized Anti-HLA-DR Antibodies
AU2009202613B2 (en) Anti-CD20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
EP2216342B1 (en) Anti-CD19 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment