KR20110023399A - Intelligent fibrin bioadhesives with superior hemostasis and mechanical properties - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 피브린과 천연고분자의 가교형성에 의한 상호침투 망상구조 또는 반-상호침투 망상구조의 형성을 통해 지혈효과 및 기계적 물성이 향상된 지능형 피브린 생체접착제에 관한 것이다.The present invention relates to an intelligent fibrin bioadhesive having improved hemostatic effects and mechanical properties through the formation of an interpenetrating network or a semi-interpenetrating network by crosslinking fibrin with a natural polymer.
조직에 상처가 생기면 절단 주변의 모세혈관으로부터 혈액성분과 함께 피브리노겐이 유출하여 피브린을 형성함으로써 상처 주위를 교착시킨다. 이와 같은 피브린의 조직 교착작용을 인공적으로 이용한 것이 피브린 글루(fibrin glue)이다. When a wound occurs in the tissue, fibrinogen flows out of the capillaries around the cut with blood components to form fibrin, thereby interlocking around the wound. Fibrin glue is an artificial utilization of such fibrous tissue stabilization.
이미 유럽에서는 피브린의 조직 교착작용을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘, 및 선용 효소의 저해제를 조직 접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상적 응용이 실시되고 있다. 또한, 일본에서는 수술용 접착제로서 혈관 외과 영역을 비롯해 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착 등 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈 등에 이용되고 있다.Already in Europe, the application of inhibitors of fibrinogen, thrombin, calcium chloride, and glandular enzymes as peripheral adhesives for suturing peripheral nerves and suture of microvascular vessels using tissue interlocking action of fibrin has been applied. It is becoming. Moreover, in Japan, it is used as an adhesive for surgery, in the area of vascular surgery, cranial nerve surgery, orthopedic surgery such as bone adhesion, and hemostasis of laceration patients.
피브린 글루는 접착이 빠르고, 열이나 압력이 불필요하며 접착부위의 수분에 영향을 받지 않는 등의 물리적 장점 이외에 혈소판과 응고장해가 없고, 조직적합성이 우수하며, 적절한 흡수성을 지니는 등의 생물학적 장점을 지니는 반면, 접착력이 약하고 감염의 위험이 따르는 단점도 있다. Fibrin glue has biological advantages such as fast adhesion, no need for heat or pressure, no influence of moisture on the adhesion site, no platelet and coagulation failure, good tissue compatibility, and adequate absorption. On the other hand, there is a disadvantage that the adhesion is weak and the risk of infection.
일반적으로 피브린 글루는 피브리노겐(fibrinogen)과 트롬빈(thrombin)으로 구성되는데, 응고현상은 칼슘이온이 트롬빈을 활성화시켜 피브리노겐이 피브린으로 되면서 응고를 통한 지혈효과 및 기계적 물성을 나타낸다. 그러나 현재 시판되고 있는 피브린 글루는 응고시간이 최소 몇 분 이상으로 신속한 지혈을 달성하는데 어려움이 있다. 기계적 물성은 피브리노겐의 농도가 증가함에 따라 증가하지만, 최대의 기계적 물성을 보이기 위해서는 30 내지 90분의 상당히 긴 응고시간이 요구되는 것으로 알려져 있다(K.H. Siedentop, 등, Laryngoscope 95: 1074-1076, 1985). 또한 피브린 글루의 응고에 의한 조직접착이 성공적으로 이루어져도, 세균 감염에 따른 기계적 강도의 저하 및 조직 손상의 위험성이 수반된다. In general, fibrin glue is composed of fibrinogen and thrombin, and the coagulation phenomenon shows that the calcium ion activates thrombin and the fibrinogen becomes fibrin, which shows the hemostatic effect and mechanical properties through coagulation. However, commercially available fibrin glues have difficulty in achieving rapid hemostasis with a solidification time of at least several minutes. Mechanical properties increase with increasing concentrations of fibrinogen, but it is known that significantly longer solidification times of 30 to 90 minutes are required to achieve maximum mechanical properties (KH Siedentop, et al., Laryngoscope 95: 1074-1076, 1985). . In addition, even if the adhesion of tissues by coagulation of fibrin glue is successful, the mechanical strength and the risk of tissue damage are accompanied by bacterial infection.
따라서 응고시간을 단축하여 지혈효과를 증가시키고 형태적 안정성을 부여하여 기계적 물성을 향상시킴과 동시에 세균 감염의 위험성을 배제할 수 있는 항균성을 갖는 새로운 조직접착제의 개발이 요구되고 있다.Therefore, it is required to develop a new tissue adhesive agent having antimicrobial ability to shorten the coagulation time, increase the hemostatic effect, impart morphological stability, improve mechanical properties and eliminate the risk of bacterial infection.
본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 피브린과 천연고분자의 상호작용에 의해 지혈효과 및 기계적 물성이 향상되고 항생제의 함유로 항균성을 나타내는 지능형 피브린 생체접착제를 제공하는 것이다.The present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, an object of the present invention is to provide an intelligent fibrin bioadhesive agent that exhibits antibacterial activity by improving the hemostatic effect and mechanical properties by the interaction of fibrin and natural polymers It is.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피브린과 천연고분자의 가교형성에 의한 상호침투 망상구조 또는 반-상호침투 망상구조를 형성하여 지혈효과 및 기계적 물성이 향상된 지능형 피브린 생체접착제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an intelligent fibrin bioadhesive with improved hemostatic effect and mechanical properties by forming an interpenetrating network or a semi-interpenetrating network by crosslinking fibrin with natural polymer.
또한 본 발명은 피브린과 천연고분자의 가교형성에 의한 상호침투 망상구조 또는 반-상호침투 망상구조를 형성하고, 상기 망상구조 내에 항생제를 포함하여 향상된 지혈효과 및 기계적 물성과 함께 우수한 항균성을 나타내는 지능형 피브린 생체접착제를 제공한다.In addition, the present invention forms an interpenetrating network or a semi-interpenetrating network by crosslinking fibrin with natural polymer, and includes an antibiotic in the network to show excellent antibacterial property with improved hemostatic effect and mechanical properties. It provides a bioadhesive.
본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제는 기존의 피브린 글루에 천연고분자 및/또는 항생제를 첨가하여 제조된 새로운 형태의 상호침투 망상구조체로서, 천연고분자와의 가교형성으로 인해 응고시간이 수초 이내로 단축되어 향상된 지혈효과를 나타내고 낮은 변형률과 높은 강도에 의한 탄성력 증가로 기계적 물성이 증가 하였을 뿐만 아니라, 항생제의 함유로 인해 응고시간 및 기계적 물성에 영향을 주지 않으면서 세균 감염의 위험성을 배제할 수 있다는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제는 지혈제, 조직 접착체, 봉합사 보강제, 상처 치유제, 생체결손 부위의 봉합 및 충전제, 약물 전달체, 조직재생용 지지체 등에 유용하게 이용될 수 있다.The intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention is a new type of interpenetrating network structure prepared by adding natural polymer and / or antibiotic to the existing fibrin glue, and the coagulation time is shortened within several seconds due to crosslinking with natural polymer. It has a hemostatic effect and an increase in elasticity due to low strain and high strength, which not only increases mechanical properties but also eliminates the risk of bacterial infection without affecting the coagulation time and mechanical properties due to the inclusion of antibiotics. . Therefore, the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention can be usefully used for hemostatic agents, tissue adhesives, suture reinforcement agents, wound healing agents, sutures and fillers of biodefective sites, drug carriers, and tissue regeneration supports.
본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제는 피브린 글루와 천연고분자의 가교형성에 의한 상호침투 망상구조 또는 반-상호침투 망상구조의 형성으로 응고시간이 단축되어 지혈효과가 상승하고 기계적 물성이 향상되는 것을 특징으로 한다.Intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention is characterized in that the coagulation time is shortened by the formation of an interpenetrating network or a semi-interpenetrating network by crosslinking fibrin glue and natural polymer, thereby increasing the hemostatic effect and improving mechanical properties. It is done.
또한 본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제는 피브린 글루와 천연고분자로 형성된 상호침투 망상구조 또는 반-상호침투 망상구조 내에 항생제를 포함하여 세균 감염을 차단할 수 있는 항균성을 나타내는 것을 특징으로 한다.In addition, the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention is characterized in that it exhibits antimicrobial properties that can block bacterial infection by including antibiotics in an interpenetrating network or a semi-interpenetrating network formed of fibrin glue and natural polymer.
본 발명에 사용된 "상호침투 망상구조(interpenetrating network)" 및 "반-상호침투 망상구조(semi-interpenetrating network)"는 최근 수십 년간 고분자 재료의 기계적 물성을 증가시키는 방법으로 다양한 분야에 응용되고 있다(S. Bai, 등, Polymer 38: 4319-4323, 1997). 상호침투 망상구조는 고분자 물질을 혼합하는 고분자 블렌드의 한 형태로서 두 가지 이상의 가교 고분자의 혼합물로 정의되며, 하나의 그물 구조에 속한 고분자 사슬이 화학적 결합 없이 물리적으로 다른 그물 구조의 사슬과 영구적으로 얽혀 있어 각 그물을 형성하고 있는 화학결합을 파괴하 기 전에는 각 그물 구조의 분리가 불가능한 독특한 형태의 고분자 혼합구조이다(M.C. Doria-Serrano, 등, Biomacromolecules 2: 568-574, 2001). 상호침투 망상구조는 예컨대 2종의 고분자들이 모두 가교를 형성하면서 서로의 그물 구조가 얽혀 있는 형태를 의미하고, 반-상호침투 망상구조는 2종의 고분자들 중 하나의 고분자만이 가교를 형성하고 이렇게 형성된 그물 구조 내에 다른 하나의 고분자가 봉입되어 있는 형태를 의미한다.The "interpenetrating network" and "semi-interpenetrating network" used in the present invention have been applied to various fields in recent years as a method of increasing the mechanical properties of polymer materials. (S. Bai, et al., Polymer 38: 4319-4323, 1997). An interpenetrating network is a form of polymer blend that mixes high molecular materials and is defined as a mixture of two or more crosslinked polymers, in which polymer chains belonging to one net structure are permanently entangled with physically different chains without chemical bonding. It is a unique type of polymer mixture structure in which each net structure cannot be separated until the chemical bonds forming each net are broken (MC Doria-Serrano, et al., Biomacromolecules 2: 568-574, 2001). The interpenetrating network structure refers to a form in which two kinds of polymers form crosslinks and intertwine with each other. For the anti-interpenetrating network structure, only one of the two polymers forms a crosslinking structure. It refers to a form in which another polymer is enclosed in the formed net structure.
본 발명에서 지혈효과 및 기계적 물성의 향상을 위해 사용될 수 있는 천연고분자로는 천연물질, 동물, 인체에서 유래한 고분자로서 생체 독성반응, 염증반응, 면역반응, 발암성 등을 일으킴 없이 생체에 무독 무해하고 면역학적 거부반응을 일으키지 않으면서 생체 조직이나 생체 시스템과 좋은 친화성으로 양립할 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 천연고분자의 대표적인 예로는 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 셀룰로스(cellulose), 아가로스(agarose), 아밀로스(amylose), 덱스트란(dextran), 프로테오글리칸(proteoglycan, PG), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 헤파린(heparin), 히아루론산(hyaluronic acid), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 덱스트란황산(dextran sulfate), 폴리라이신(polylysine), 풀루란(pullulan), 카르복실화 키틴(carboxylmethyl chitin) 및 이들의 염이 포함되고, 이들은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용될 수 있다.Natural polymers that can be used for improving the hemostatic effect and mechanical properties in the present invention are harmless to the living body without causing biotoxic reactions, inflammatory reactions, immune reactions, carcinogenicity, etc. as polymers derived from natural substances, animals, and human bodies. It can be used as long as it is compatible with biological tissues or biological systems without causing immunological rejection. Representative examples of natural polymers suitable for the present invention include alginate, chitosan, chitin, cellulose, agarose, amylose, dextran, and proteoglycan. , PG), glycosaminoglycan (GAG), collagen, collagen, gelatin, heparin, hyaluronic acid, pectin, carrageenan, chondroitin sulfate sulfate, dextran sulfate, polylysine, pullulan, carboxylmethyl chitin and salts thereof, which are used alone or in mixture of two or more thereof. Can be.
본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제에서 천연고분자의 함량은 피브린 100 중량부를 기준으로 0.1 내지 50 중량부의 범위인 것이 바람직하다. 천연고분자의 함량이 0.1 중량부 미만일 경우에는 상호침투 망상구조 및 반-상호침투 망상구조를 형상하지 못하여 응고시간 단축에 의한 지혈효과 상승 및 기계적 물성이 향상을 기대하기 어렵고, 이의 함량이 50 중량부를 초과하는 경우에는 피브린 글루의 함량이 적어 조직 접착력이 급속하게 감소하는 문제점이 발생할 수 있다.In the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention, the content of natural polymer is preferably in the range of 0.1 to 50 parts by weight based on 100 parts by weight of fibrin. When the content of the natural polymer is less than 0.1 part by weight, it is difficult to form an interpenetrating network and a semi-interpenetrating network, so that it is difficult to expect an increase in hemostatic effect and mechanical properties by shortening the coagulation time, and its content is 50 parts by weight. If exceeded, the content of fibrin glue may be low, resulting in a rapid decrease in tissue adhesion.
본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제에 항균성 부여를 위해 사용가능한 항생제는 당업계에 세균의 생육과 활성을 저지 또는 억제할 수 있다고 알려진 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 본 발명에 적합한 항생제의 대표적인 예로는 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 메틸파라벤(methyl paraben), 에틸파라벤(ethyl paraben), 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 모노박탐(monobactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 마크롤라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline), 클로르암페니콜(chloramphnicol), 퀴놀론(quinolone), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 린코사미드(lincosamide), 메트로니다졸(metronidazole), 설폰아미드(sulfonamide), 트리메소프림(trimethoprim) 및 이들의 염이 포함되고, 이들은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용될 수 있다. Antibiotics that can be used to impart antimicrobial activity to the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention can be used as long as it is known in the art to inhibit or inhibit the growth and activity of bacteria. Representative examples of antibiotics suitable for the present invention are ampicillin, gentamicin, methyl paraben, methyl paraben, ethyl paraben, penicillin, cephalosporin, and monobactam. ), Carbapenem, aminoglycoside, macrolide, tetracycline, chloramphnicol, quinolone, vancomycin, teicoplanin teicoplanin, lincosamide, metronidazole, sulfonamide, trimethoprim, and salts thereof, and these may be used alone or in the form of a mixture of two or more thereof.
본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제에서 항생제의 함량은 피브린 100 중량부를 기준으로 0.01 내지 10 중량부의 범위인 것이 바람직하다. 항생제의 함량이 0.01 중량부 미만일 경우에는 목적하는 수준의 항균성이 나타나지 않을 수 있고, 이의 함량이 10 중량부를 초과하는 경우에는 과량의 항생제 투여로 의한 독성 이 유발될 수 있다는 문제점이 발생할 수 있다. 이때 항생제는 당업계에 각 항생제가 표적으로 하는 세균의 생육 및 활성을 저지하거나 억제하는데 최적이라고 알려진 농도로 사용되는 것이 바람직하다. The content of the antibiotic in the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention is preferably in the range of 0.01 to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of fibrin. If the antibiotic content is less than 0.01 parts by weight, the desired level of antimicrobial activity may not appear, and if the content is more than 10 parts by weight, there may be a problem that toxicity may be caused by the administration of an excess of antibiotics. The antibiotic is preferably used at a concentration known in the art to be optimal for inhibiting or inhibiting the growth and activity of the bacteria targeted by each antibiotic.
본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.Intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention can be prepared by a method comprising the following steps.
1) 피브리노겐과 천연고분자를 증류수에 용해시켜 피브리노겐-천연고분자 용액을 제조하는 단계;1) dissolving fibrinogen and natural polymer in distilled water to prepare a fibrinogen-natural polymer solution;
2) 트롬빈을 증류수에 용해시킨 후 CaCl2를 첨가하여 피브린 용액을 제조하는 단계; 및2) dissolving thrombin in distilled water and then adding CaCl 2 to prepare a fibrin solution; And
3) 상기 피브리노겐-천연고분자 용액과 트롬빈 용액을 혼합하여 반응시키는 단계. 3) reacting the fibrinogen-natural polymer solution by mixing the thrombin solution.
본 발명의 일 실시양태에서는, 천연고분자로 알지네이트 및 키토산을 이용하여 본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제를 제조한다. 알지네이트는 그 자체가 가교를 형성하여 그물 구조를 형성할 수 있기 때문에 피브린과 알지네이트를 혼합하게 되면 피브린의 그물 구조와 알지네이트의 그물 구조가 서로 얽히게 되는 상호침투 망상구조를 형성하게 된다(도 1 참조). 반면, 키토산은 스스로 가교를 형성하지 못하기 때문에 피브린과 키토산을 혼합하게 되면 피브린의 그물 구조 내에 키토산이 봉입되어 있는 반-상호침투 망상구조를 형성하게 된다. In one embodiment of the present invention, the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention is prepared using alginate and chitosan as natural polymers. Alginate itself can form a cross-linking structure to form a net structure, so mixing fibrin and alginate forms an interpenetrating network structure where the net structure of the fibrin and the alginate net structure are entangled with each other (see FIG. 1). . On the other hand, since chitosan does not form a crosslinking itself, when the fibrin and chitosan are mixed, the chitosan forms a semi-interpenetrating network structure in which chitosan is enclosed in the fibrin net structure.
상기와 같이 제조된 2종의 지능형 피브린 생체접착제의 응고시간과 기계적 물성을 조사한 결과, 이들 모두는 천연고분자를 포함하지 않는 피브린 글루 대조군에 비해 유의미한 수준으로 응고시간은 단축되는 반면 기계적 물성은 향상됨을 확인하였다. 특히, 피브린과 알지네이트로 구성된 상호침투 망상구조를 갖는 피브린 생체접착제가 피브린과 키토산으로 구성된 반-상호침투 망상구조를 갖는 피브린 생체접착제보다 짧은 응고시간과 우수한 기계적 물성을 나타내었다. 따라서 피브린과 천연고분자의 조합 시 피브린과 반-상호침투 망상구조보다는 상호침투 망상구조를 형성할 수 있는 천연고분자를 선택하는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 이처럼 상호침투 또는 반-상호침투 망상구조는 분자 차원에서의 그물간의 얽힘에 의해 외부적인 힘에 의한 그물의 재배치를 억제함으로써 기계적 물성을 증가시킬 수 있다.As a result of examining the coagulation time and mechanical properties of the two intelligent fibrin bioadhesives prepared as described above, all of them were significantly reduced in coagulation time while improving the mechanical properties compared to the fibrin glue control group containing no natural polymer. Confirmed. In particular, fibrin bioadhesives having an interpenetrating network composed of fibrin and alginate showed shorter coagulation time and superior mechanical properties than fibrin bioadhesives having a semi-interpenetrating network composed of fibrin and chitosan. Therefore, it may be more desirable to select a natural polymer capable of forming an interpenetrating network rather than a fibrin and a semi-interpenetrating network when combining fibrin and a natural polymer. As such, the interpenetrating or anti-interpenetrating network structure can increase the mechanical properties by suppressing the rearrangement of the net by external force by the entanglement between the net at the molecular level.
본 발명의 다른 실시양태에서는, 피브린에 천연고분자로 알지네이트와 함께 항생제로 암피실린을 첨가하여 피브린과 알지네이트의 상호침투 망상구조 내에 암피실린이 포함되어 있는 지능형 피브린 생체접착제를 제조하였다. 상기 피브린 생체접착제는 피브린과 알지네이트로만 구성된 피브린 생체접착제의 응고시간 단축 및 기계적 물성 향상과 거의 유사한 결과를 나타내었다. 또한, 상기 피브린 생체접착제는 그람 양성 세균의 생육을 효과적으로 억제하는 항균성을 나타내었다. 상기 결과는 암피실린과 같은 항생제의 첨가가 응고시간 및 기계적 물성에 거의 영향을 주지 않으면서 목적하는 항균성을 피브린 생체접착제에 부여할 수 있음을 나타내는 것이다.In another embodiment of the present invention, an intelligent fibrin bioadhesive comprising ampicillin in the interpenetrating network of fibrin and alginate was added to the fibrin by addition of ampicillin as an antibiotic with alginate as a natural polymer. The fibrin bioadhesives showed a result similar to the shortening of the solidification time and the improvement of mechanical properties of the fibrin bioadhesive composed of only fibrin and alginate. In addition, the fibrin bioadhesives exhibited antimicrobial properties that effectively inhibit the growth of Gram-positive bacteria. The results indicate that the addition of antibiotics such as ampicillin can impart the desired antimicrobial properties to the fibrin bioadhesives with little effect on the coagulation time and mechanical properties.
따라서, 본 발명에 따른 지능형 피브린 생체접착제는 지혈제, 조직 접착체, 봉합사 보강제, 상처 치유제, 생체결손 부위의 봉합 및 충전제, 약물 전달체, 조직 재생용 지지체 등에 유용하게 이용될 수 있다.Therefore, the intelligent fibrin bioadhesive according to the present invention may be usefully used for hemostatic agents, tissue adhesives, suture reinforcement agents, wound healing agents, sutures and fillers for biodefective sites, drug carriers, and supports for tissue regeneration.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention more specifically, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention.
실험예Experimental Example 1: 응고시간 측정 1: measurement of solidification time
하기 실시예에서 제조된 피브린 생체접착제의 응고시간을 측정하기 위해 컴퓨터로 제어된 응고 분석 장치(ACL Model 300R)를 이용하여 660 ㎚에서 90o로 산란된 탁도(turbidity)를 측정하였다. 이때 기준점(baseline)에서 탁도가 3% 증가된 시점을 지혈이 이루어지는 응고시간으로 설정하였다. In order to measure the coagulation time of the fibrin bioadhesive prepared in the following Examples, turbidity was measured at 90 ° at 660 nm using a computer-controlled coagulation analyzer (ACL Model 300R). At this time, the point of time when the turbidity increased by 3% at the baseline was set as the coagulation time at which hemostasis occurred.
실험예Experimental Example 2: 기계적 물성 분석 2: mechanical property analysis
하기 실시예에서 제조된 피브린 생체접착제의 기계적 물성을 ASTM 기준 시험 방법 중 ASTM-D-638M 규정에 따라 만능시험기(universal testing machine, Instron model 4465)를 사용하여 측정하였다. 측정은 최소 3개 이상의 동일 시료를 대상으로 수행되었으며, 평균치의 하중(load), 탄성 모듈러스(elastic modulus) 및 신장률(elongation)을 구하였다. Mechanical properties of the fibrin bioadhesive prepared in the following Examples were measured using a universal testing machine (Instron model 4465) according to ASTM-D-638M specification of the ASTM standard test method. Measurements were performed on at least three identical samples and average loads, elastic modulus and elongation were obtained.
실험예Experimental Example 3: 항균성 조사 3: antimicrobial activity
하기 실시예에서 제조된 피브린 생체접착제의 항균성을 디스크 확산법으로 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 배양접시에 뮐러-힌톤 배지(Mueller Hinton Agar, MHA)를 20 ㎖씩 분주한 후 서서히 식혀 굳혔다. 그람 양성 세균인 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)를 37℃ 진탕 배양기에서 배양하여 지수기 배양체를 수득한 후, 신선한 뮐러-힌톤 배지(MHB)로 균액의 최종 농도를 1×108 CFU/㎖로 맞추었다. 멸균된 면봉을 이용하여 MHA 배지 표면에 준비된 균액을 고르게 도말하였다. 도말된 MHA 배지 상에 시료를 묻힌 여과지를 올리고 이를 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 여과지 주변에 형성된 세균 억제대의 크기를 측정하였다. The antimicrobial properties of the fibrin bioadhesives prepared in the following Examples were measured and measured by the disk diffusion method. Specifically, 20 ml of Müller-Hinton medium (MHA) was added to the culture dish and slowly cooled down to harden. Gram-positive bacteria, Staphylococcus epidermidis , were cultured in a shaker at 37 ° C. to obtain an exponential culture, and the final concentration of the bacterial solution was adjusted to 1 × 10 8 CFU / Adjusted to ml. Sterilized cotton swabs were used to evenly spread the prepared bacterial solution on the surface of MHA medium. The filter paper with the sample on the smeared MHA medium was raised and incubated in a 37 ° C. incubator for 24 hours, and then the size of the bacterial inhibitor formed around the filter paper was measured.
실시예Example 1: One: 알지네이트Alginate 함유 피브린 생체접착제의 제조 Preparation of Fibrin-Containing Bioadhesives
1 ㎖ 원심분리 용기에 피브리노겐 80 ㎎과 알지네이트 0.8 ㎎을 넣고 3차 증류수 400 ㎕를 첨가한 후 37℃ 오븐에서 30분간 방치하여 용해시켜 피브리노겐-알지네이트 용액을 제조하였다. 다른 1 ㎖ 원심분리 용기에 트롬빈 5 ㎎을 넣고 3차 증류수 400 ㎕를 첨가하여 용해시킨 후 37℃ 오븐에서 30분간 방치하였다. 이와 같이 준비된 트롬빈 용액에 1 M CaCl2 수용액 0.5 ㎖를 혼합하였다. 상기 2개의 원심분리 용기에 있는 용액을 2개의 1 ㎖ 주사기로 각각 취한 후 바늘을 제거하고 피브리노겐-알지네이트 용액과 트롬빈 용액을 동시에 투여할 수 있도록 고안된 펜타 젝트(Pantaject) 장치를 이용하여 테플론 주형에 주사함으로써 상호침투 망상구조를 갖는 피브린 생체접착제를 제조하였다. Fibrinogen-alginate solution was prepared by dissolving 80 mg of fibrinogen and 0.8 mg of alginate in 1 ml centrifugation vessel, adding 400 μl of tertiary distilled water, and then leaving the mixture to stand in an oven at 37 ° C. for 30 minutes. 5 mg of thrombin was added to another 1 ml centrifuge container, and 400 µl of tertiary distilled water was added to dissolve, and the mixture was left to stand in an oven at 37 ° C. for 30 minutes. 1 M CaCl 2 in the thrombin solution thus prepared 0.5 ml of aqueous solution was mixed. The solutions in the two centrifuge vessels were each taken with two 1 ml syringes and then injected into a teflon mold using a pentaject device designed to remove needles and simultaneously administer fibrinogen-alginate and thrombin solutions. Thus, a fibrin bioadhesive having an interpenetrating network structure was prepared.
제조된 피브린 생체접착제의 응고시간 및 기계적 물성을 실험예 1 및 2에 따라 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.The solidification time and mechanical properties of the fibrin bioadhesive prepared according to Experimental Examples 1 and 2 are shown in Table 1 below.
실시예Example 2: 키토산 함유 피브린 생체접착제의 제조 2: Preparation of Chitosan-containing Fibrin Bioadhesives
천연고분자로 키토산을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반-상호침투 망상구조를 갖는 피브린 생체접착제를 제조하였다. A fibrin bioadhesive having a semi-interpenetrating network structure was prepared according to the same method as Example 1 except for using chitosan as a natural polymer.
제조된 피브린 생체접착제의 응고시간 및 기계적 물성을 실험예 1 및 2에 따라 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.The solidification time and mechanical properties of the fibrin bioadhesive prepared according to Experimental Examples 1 and 2 are shown in Table 1 below.
실시예Example 3: 3: 알지네이트와With alginate 암피실린 함유 피브린 생체접착제의 제조 Preparation of Ampicillin-containing Fibrin Bioadhesives
피브리노겐 용액의 제조 시에 나트륨 암피실린(ampicillin sodium, AMP)을 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 상호침투 망상구조를 갖는 피브린 생체접착제를 제조하였다. A fibrin bioadhesive having an interpenetrating network was prepared according to the same method as Example 1 except adding ampicillin sodium (AMP) at a concentration of 100 μg / ml when preparing the fibrinogen solution.
제조된 피브린 생체접착제의 응고시간, 기계적 물성 및 항균활성을 실험예 1 내지 3에 따라 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.The coagulation time, mechanical properties and antimicrobial activity of the prepared fibrin bioadhesives were measured according to Experimental Examples 1 to 3 and shown in Table 1 below.
비교예Comparative example 1: 피브린 1: fibrin 글루의Glue 제조 Produce
천연고분자 및 항생제를 전혀 사용하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 동 일한 방법에 따라 피브린 글루를 제조하였다.Fibrin glue was prepared according to the same method as Example 1 except that no natural polymer and no antibiotic were used.
제조된 피브린 글루의 응고시간 및 기계적 물성을 실험예 1 및 2에 따라 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.The solidification time and mechanical properties of the fibrin glue thus prepared were measured according to Experimental Examples 1 and 2 and are shown in Table 1 below.
(㎏/㎟)Elastic modulus
(Kg / mm2)
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 실시예 1 내지 3에서 제조된 피브린 생체접착제 모두는 비교예 1의 피브린 글루에 비해 유의미한 수준으로 응고시간은 단축되는 반면 기계적 물성은 향상됨을 확인하였다. 특히, 피브린과 알지네이트로 구성된 실시예 1의 피브린 생체접착제는 피브린과 키토산으로 구성된 실시예 2의 피브린 생체접착제보다 짧은 응고시간과 우수한 기계적 물성을 나타내었는데, 이로부터 피브린과 천연고분자의 조합 시 피브린과 반-상호침투 망상구조보다는 상호침투 망상구조를 형성할 수 있는 천연고분자를 선택하는 것이 더욱 효과적임을 알 수 있다.As shown in Table 1, all of the fibrin bioadhesives prepared in Examples 1 to 3 according to the present invention were found to have a shorter solidification time than the fibrin glue of Comparative Example 1 while improving mechanical properties. In particular, the fibrin bioadhesive of Example 1 composed of fibrin and alginate showed a shorter coagulation time and better mechanical properties than the fibrin bioadhesive of Example 2 composed of fibrin and chitosan, from which fibrin and natural polymer were combined. It can be seen that it is more effective to select natural polymers that can form interpenetrating networks rather than anti-interpenetrating networks.
또한, 피브린에 천연고분자로 알지네이트와 함께 항생제로 암피실린을 첨가하여 제조된 실시예 3의 피브린 생체접착제는 항생제를 첨가하지 않은 다른 피브린 생체접착제와 거의 유사한 수준의 응고시간 단축 및 기계적 물성 향상을 나타내는 반면, 그람 양성 세균의 생육을 효과적으로 억제함을 알 수 있다. 이는 암피실린과 같은 항생제의 첨가가 응고시간 및 기계적 물성에 거의 영향을 주지 않으면서 목적하는 항균성을 피브린 생체접착제에 부여할 수 있음을 나타내는 것이다.In addition, the fibrin bioadhesive of Example 3, prepared by adding ampicillin as an antibiotic with alginate as a natural polymer to fibrin, showed a similar level of shortening time and improved mechanical properties as other fibrin bioadhesives without antibiotics. It can be seen that it effectively inhibits the growth of Gram-positive bacteria. This indicates that the addition of antibiotics such as ampicillin can impart the desired antimicrobial properties to the fibrin bioadhesives with little effect on the coagulation time and mechanical properties.
이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.The specific parts of the present invention have been described in detail, and it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 피브린과 알지네이트의 가교 형성에 의해 상호침투 망상구조를 갖는 지능형 피브린 생체접착제를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.1 illustrates a process for preparing an intelligent fibrin bioadhesive having an interpenetrating network by crosslinking formation of fibrin and alginate according to Example 1 of the present invention.
Claims (6)
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2009
- 2009-08-31 KR KR1020090081256A patent/KR20110023399A/en active Search and Examination
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