KR20110016867A - Cell-permeable p27 recombinant protein, a polynucleotide that codes the same and an anti-cancer composition containing the same as an active ingredient - Google Patents

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KR20110016867A
KR20110016867A KR1020107022958A KR20107022958A KR20110016867A KR 20110016867 A KR20110016867 A KR 20110016867A KR 1020107022958 A KR1020107022958 A KR 1020107022958A KR 20107022958 A KR20107022958 A KR 20107022958A KR 20110016867 A KR20110016867 A KR 20110016867A
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Abstract

PURPOSE: A pharmaceutical composition for anticancer containing cell permeable p27 recombinant protein is provided to suppress formation of cyclin-dependent kinase and cyclin and to reactivate signal transduction mechanism. CONSTITUTION: A cell permeable p27 recombinant protein has macromolecule transduction domain(MTD) which is fused at one end or both ends of p27 protein having an amino acid sequence of sequence number 2. The MTD is JO-58 MTD having an amino acid sequence of sequence number 60 or JO-68 MTD having an amino acid sequence of sequence number 70. A polynucleotide encoding the p27 recombinant protein has a base sequence of sequence number 197, 199, 201, 203, 205, or 207. A pharmaceutical composition for treating p27 deletion contains p27 recombinant protein and pharmaceutically acceptable carrier.

Description

세포투과성 p27 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물{CELL-PERMEABLE P27 RECOMBINANT PROTEIN, A POLYNUCLEOTIDE THAT CODES THE SAME AND AN ANTI-CANCER COMPOSITION CONTAINING THE SAME AS AN ACTIVE INGREDIENT}CELL-PERMEABLE P27 RECOMBINANT PROTEIN, A POLYNUCLEOTIDE THAT CODES THE SAME AND AN ANTI-CANCER COMPOSITION CONTAINING THE SAME AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 종양 억제인자 (tumor suppressor) p27 에 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 p27 재조합 단백질, 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질의 발현벡터 및 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 p27 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention provides a p27 recombinant protein having a cell permeability by fusion of a macromolecule transduction domain (MTD) to a tumor suppressor p27, a polynucleotide encoding the cell permeable p27 recombinant protein, the cell permeable p27 An expression vector of a recombinant protein and a pharmaceutical composition for anticancer drugs for treating p27 defect or loss of function containing the cell-permeable p27 recombinant protein as an active ingredient.

암은 정상세포로부터 유전적 (genetic)이고 후성적 (epigenetic)인 변화를 통해 발생한다. 이러한 암세포는, IGF (insulin-like growth factor)와 같은 생존인자가 존재하여 세포사멸 (apoptosis)을 유발하지 않아 세포성장과 분열이 비정상적으로 이루어지고; VEGF (vascular endothelial growth factor) 유도물질 (inducer)의 활성화로 인해 혈관생성 (angiogenesis)이 촉진되며; 세포와 세포간 접합에 관여하는 E-캐드헤린 (E-cadherin)의 감소로 인해 세포전이가 유발된다는 특징을 가지고 있다. 또한, 암세포는 이들의 세포분열 과정 중 세포주기 (cell cycle) 조절 유전자의 변이나 조절 단백질의 오작동으로 인해 과도한 세포증식과 성장이 유도되어 종양형성 (tumorigenesis)이 촉진되기도 한다.Cancer occurs through genetic and epigenetic changes from normal cells. These cancer cells have a survival factor such as IGF (insulin-like growth factor) and do not cause apoptosis, resulting in abnormal cell growth and division; Activation of vascular endothelial growth factor (VEGF) inducers promotes angiogenesis; Cell metastasis is induced by the reduction of E-cadherin, which is involved in cell-to-cell junctions. In addition, cancer cells may induce excessive cell proliferation and growth due to mutations in cell cycle regulatory genes or malfunction of regulatory proteins during their cell division, thereby promoting tumorigenesis.

세포주기는 하나의 세포가 분열하여 두 개의 세포로 나누어지는 일련의 과정이 순차적으로 일어나는 것으로, 세포주기 조절에는 많은 인자들이 관여한다. 그 중 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 사이클린-의존성 키나아제 (cyclin-dependent kinase, CDK)이다. 사이클린-의존성 키나아제는 종류에 따라 각 세포주기의 사이클린 (cyclin)과 결합하여 기능적 단위체를 형성하고 이를 인산화 (phosphorylation)시킴으로써 세포주기의 각 단계를 조절한다. 이러한 과정에 의해 세포주기의 각 단계마다 활성화되는 사이클린-CDK 복합체가 형성된다. 사이클린-CDK 복합체의 형성은 다양한 기작에 의해 조절되는데, 특히 CDK의 활성화를 억제하는 CDK 저해제가 중요하게 작용한다 (Balomenos, D 및 Martinez, AC, Immunol. Today 21: 551-5, 2000)The cell cycle is a series of processes in which one cell divides and is divided into two cells in sequence. Many factors are involved in cell cycle regulation. An important role is the cyclin-dependent kinase (CDK). Cyclin-dependent kinases regulate each stage of the cell cycle by binding to cyclins of each cell cycle to form functional units and phosphorylating them, depending on the type. This process results in the formation of a cyclin-CDK complex that is activated at each stage of the cell cycle. The formation of the cyclin-CDK complex is regulated by a variety of mechanisms, especially CDK inhibitors that inhibit CDK activation (Balomenos, D and Martinez, AC, Immunol. Today 21: 551-5, 2000)

CDK 저해제는 CDK의 활성을 통해서 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제하며, 이는 CDK4 및 6과 사이클린 D의 복합체만을 인식할 수 있는 특이적인 저해제인 INK4 (inhibitors of CDK4) 패밀리와, 사이클린 E-CDK2, 사이클린 A/B-CDK2의 활성을 저해하는 CIP/KIP 패밀리의 두 그룹으로 나뉜다. INK4 패밀리에는 p16, p15, p18, p19 등이 포함되며, CIP/KIP 패밀리에는 p21,p27,p57 등이 포함된다.CDK inhibitors inhibit unwanted cell proliferation in vivo through the activity of CDK, which is a family of INK4 (inhibitors of CDK4), cyclin E-CDK2 and cyclin, which are specific inhibitors capable of recognizing only complexes of CDK4 and 6 and cyclin D. It is divided into two groups of CIP / KIP families that inhibit the activity of A / B-CDK2. The INK4 family includes p16, p15, p18, p19 and the like, and the CIP / KIP family includes p21, p27, p57 and the like.

이중 사이클린-의존성 키나아제 저해제 1B 또는 CDKN1B라고 알려져 있는 p27은 CDK와 사이클린 각각에 결합하는 세포주기 저해 단백질로서, G1에서 세포분열 진행을 조절한다. p27Kip1 유전자는 p21Cip1/Waf1와 p57Kip2 유전자들과 같은 CIP/KIP 패밀리의 다른 멤버들과 DNA 서열이 유사하여 단백질 수준에서 이들과 구조적 유사성을 갖는데, 이러한 구조적 유사성은 여러 다른 분류의 사이클린과 CDK 분자들에 결합하는 작용적 특성을 갖게 한다.P27, known as the dual cyclin-dependent kinase inhibitor 1B or CDKN1B, is a cell cycle inhibitory protein that binds to CDK and cyclin, respectively, and regulates cell division progression at G1. The p27 Kip1 gene has a similar DNA sequence to other members of the CIP / KIP family, such as the p21 Cip1 / Waf1 and p57 Kip2 genes, which have structural similarities with them at the protein level. Have functional properties that bind to molecules.

p27은 사이클린 E/CDK2 및 사이클린 A/CDK2와 같은 복합체 형성을 억제하여 세포주기를 불활성화시키는 것으로 보고되었다 (Drexler HC, Cell Cycle 2(5): 438-41, 2004). 또한, p27은 세포주기의 초기 G1기에서는 사이클린 D-CDK4/6에 결합하여 핵으로의 유입을 촉진하여 사이클린 D의 안정성을 증가시키는 반면, 세포주기가 정지된 G1 (G1-arrested) 세포에서는 사이클린 E-CDK2 복합체에 강하게 결합하여 이들의 ATP 결합을 저해함으로써 촉매 (catalytic) 활성을 억제한다. 결국 이러한 음성적 (negative) 조절은 G1기에서 S기로의 진행을 차단함으로써 세포증식을 억제하여 종양형성을 저해하게 된다.p27 has been reported to inactivate the cell cycle by inhibiting complex formation such as cyclin E / CDK2 and cyclin A / CDK2 (Drexler HC, Cell Cycle 2 (5): 438-41, 2004). In addition, p27 binds to cyclin D-CDK4 / 6 in the early G1 phase of the cell cycle and promotes its entry into the nucleus to increase the stability of cyclin D, while cyclin in G1 (G1-arrested) cells in which the cell cycle is stopped It strongly binds to the E-CDK2 complex and inhibits their catalytic activity by inhibiting their ATP binding. Eventually, such negative regulation inhibits cell proliferation by inhibiting the progression from the G1 phase to the S phase, thereby inhibiting tumor formation.

전술한 바와 같은 기작에 의해 p27은 종양 억제인자 (tumor suppressor)로서의 기능을 발휘한다. 이는 p27 유전자가 제거된 마우스에서 세포증식이 증가되고 뇌하수체 종양이 형성된다는 연구 결과로부터 확인된다. 또한, 유방암 (breast carcinoma), 위암 (gastric cancer), 결장암 (colon cancer), 전립선암 (prostate adenocarcinoma), 비소세포폐암 (non-small cell lung carcinoma), 자궁선암 (cervical adenocarcinoma), 교모세포종 (glioblastoma) 등의 다양한 인간 암 (human cancer)에서 p27의 발현이 감소되어 있음이 보고되었다 (Kau 등, Nat. Rev. Cancer 4: 106-117, 2004; Belletti B 등, Curr. Med. Chem. 12(14): 1589-605, 2005).By the mechanism described above, p27 functions as a tumor suppressor. This is confirmed by studies showing increased cell proliferation and pituitary tumor formation in mice with the p27 gene removed. In addition, breast carcinoma, gastric cancer, colon cancer, prostate adenocarcinoma, non-small cell lung carcinoma, cervical adenocarcinoma, glioblastoma It has been reported that p27 expression is reduced in various human cancers (Kau et al . , Nat. Rev. Cancer 4: 106-117, 2004; Belletti B et al. , Curr. Med. Chem. 12 ( 14): 1589-605, 2005).

이에 본 발명자들은 체내에서 p27의 과발현을 유도하거나 p27 단백질을 직접 체내에 고효율로 전달할 수 있다면 종양형성을 효과적으로 억제할 수 있음을 확신하고, 이를 이용하여 신규 항암제의 개발을 위해 예의 연구 노력하였다.Therefore, the present inventors are convinced that if they can induce the overexpression of p27 in the body or deliver the p27 protein directly to the body with high efficiency, tumor formation can be effectively suppressed, and the use of this has been a thorough research effort for the development of a new anticancer agent.

한편, 합성화합물 또는 천연물의 작은 분자들 (small molecules)은 세포 안으로 전달될 수 있으나, 단백질, 펩티드, 핵산 같은 거대분자들 (macromolecules)은 세포 안으로 전달될 수 없다. 이들은 분자량 500 이상의 거대분자로 살아있는 세포의 원형질막 (plasma membrane), 즉 이중 지질막 구조 (lipid bilayer structure)를 통과할 수 없음이 널리 알려져 있다. 이를 극복하기 위한 방법으로 "거대분자 세포 내 전달기술 (macromolecule intracellular transduction technology: MITT)"이 개발되었는데 (Jo 등, Nat. Biotech. 19: 929-33, 2001), 이는 질병 치료성 거대분자의 생체 내 전달을 가능케 함으로써 기존의 의약품 개발 기술로는 불가능했던 펩티드, 단백질, 유전자 자체 등으로 바이오 신약물의 개발을 가능하게 한다. 이 기술에 따르면, 거대분자들은 "소수성 거대분자 전달 도메인 (hydrophobic macromolecule transduction domain, MTD)"과 다른 여러 가지 세포 내 운반체들과 융합되어 재조합 단백질 형태로 합성 또는 발현, 정제되고 세포 내로 전달된 후, 특정 위치로 정확하고 빠르게 운반되어 필요한 여러 가지 역할을 효과적으로 발휘할 수 있다. 이처럼 거대분자 전달 도메인 (MTD)은 펩티드, 단백질, DNA, RNA, 합성화합물 등과 융합되어 세포 내로 들어갈 수 없는 많은 불투과성 물질들의 전달을 가능케 한다.On the other hand, small molecules of synthetic compounds or natural products can be delivered into cells, but macromolecules such as proteins, peptides, and nucleic acids cannot be delivered into cells. It is well known that they cannot cross the plasma membrane of living cells, i.e., the lipid bilayer structure, with macromolecules of molecular weight 500 or more. In order to overcome this, "macromolecule intracellular transduction technology" (MITT) has been developed (Jo et al . , Nat. Biotech . 19: 929-33, 2001). By enabling internal delivery, it is possible to develop bionew drugs using peptides, proteins, genes, etc., which were not possible with conventional drug development technologies. According to this technique, macromolecules are fused with "hydrophobic macromolecule transduction domain" (MTD) and many other intracellular carriers, synthesized, expressed, purified in recombinant protein form, and then transferred into cells. It can be delivered accurately and quickly to a specific location, effectively fulfilling the different roles required. As such, the macromolecular delivery domain (MTD) is fused to peptides, proteins, DNA, RNA, synthetic compounds and the like to enable the delivery of many impermeable substances that cannot enter the cell.

이에 본 발명자들은 종양 억제인자 p27에 거대분자 전달 도메인을 융합시켜 세포투과성을 부여한 p27 재조합 단백질을 제조하고 이 재조합 단백질이 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 환경 하에서도 세포 외부로부터 대량의 종양 억제인자 p27을 세포의 핵 내로 효과적으로 전달하여 인간의 다양한 암에서 발생되는 p27 결손 또는 기능 상실을 치료할 수 있는 항암제로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors prepared a p27 recombinant protein which gives cell permeability by fusing the macromolecular delivery domain to the tumor suppressor p27, and the recombinant protein p27 cells from the outside of the cell even in vitro as well as in vivo . The present invention was completed by confirming that the present invention can be effectively used as an anticancer agent to treat p27 deficiency or malfunction caused by various cancers in humans.

따라서 본 발명의 목적은 종양 억제인자 p27 에 세포투과성을 부여하여 이를 세포 내로 고효율로 도입함으로써 인간의 다양한 암에서 발생되는 p27 결손 또는 기능 상실을 치료할 수 있는 항암제로서 세포투과성 p27 재조합 단백질을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a cell-permeable p27 recombinant protein as an anticancer agent capable of treating p27 deficiency or loss of function caused by various cancers of humans by imparting cell permeability to tumor suppressor p27 and introducing it into cells with high efficiency. .

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양 억제인자 p27 과 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 p27 을 세포 내로 고효율로 도입하는 세포투과성 p27 재조합 단백질을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cell-permeable p27 recombinant protein which is imparted cell permeability by fusion of tumor suppressor p27 and macromolecular transduction domain (MTD) to introduce p27 into the cell with high efficiency. .

또한 본 발명은 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.The present invention also provides a polynucleotide encoding the cell permeable p27 recombinant protein.

아울러 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.In addition, the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide and the transformed bacteria transformed with the expression vector.

또한 본 발명은 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 p27 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a cell permeable p27 recombinant protein comprising culturing the transforming bacteria.

마지막으로 본 발명은 상기 p27 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 세포투과성 p27 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물을 제공한다.Finally, the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer drugs for treating cell permeable p27 defect or loss of function containing the p27 recombinant protein as an active ingredient.

본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 p27 재조합 단백질은 종양 억제인자 p27 을 세포의 핵 내로 고효율로 도입하여 사이클린-의존성 키나아제와 사이클린의 복합체 형성을 방해하여 암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제하고, 이로 인해 암세포의 사멸을 유도하여 인간의 다양한 암에 대한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.The p27 recombinant protein having cell permeability according to the present invention introduces a tumor suppressor p27 into the nucleus of the cell with high efficiency, thereby preventing the formation of a complex of cyclin-dependent kinase and cyclin and inhibiting the cell cycle of cancer cells, thereby preventing unnecessary cell proliferation in vivo. It can be usefully used as an anticancer agent against various cancers in humans by inducing death of cancer cells.

도 1a 및 1b 는 각각 본 발명에서 거대분자 전달 도메인 (MTD)로 사용된 JO-58 및 JO-68 MTDs 의 정량적 세포투과성과 가시적 세포투과성을 유세포분석기와 동초점 레이저 주사현미경을 이용하여 확인한 결과이고,
도 1c 는 본 발명에서 거대분자 전달 도메인 (MTD)로 사용된 JO-58 및 JO-68 MTDs 의 세포투과성을 다양한 마우스 조직에서 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과이고,
도 2 는 본 발명에 따라 전장 형태의 p27 에 JO-58 및 JO-68 MTDs 가 각각 융합된 p27 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고,
도 3 은 본 발명에 따라 전장 형태의 전장 형태의 p27 에 JO-58 및 JO-68 MTDs 가 각각 융합된 p27 재조합 단백질을 PCR 로 증폭한 결과이고,
도 4a 는 pGEM-T Easy 벡터에 도 3 의 PCR 증폭산물을 서브클로닝 (subcloning)하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4b 는 도 3 의 PCR 증폭산물이 pGEM-T Easy 벡터에 서브클로닝 되었음을 나타낸 것이고,
도 5a 는 본 발명의 p27 재조합 단편을 pET-28a(+) 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 5b 는 본 발명의 재조합 발현벡터에 각각의 p27 재조합 단편이 클로닝 되었음을 나타낸 것이고,
도 6 은 본 발명의 p27 재조합 단백질의 발현을 단백질 발현 유도제인 IPTG 의 존재(+) 또는 부재 (-) 하에서 조사한 결과이고,
도 7a 및 7b 는 각각 본 발명의 재조합 발현벡터가 형질전환된 세균으로부터 발현된 전장 형태의 p27 에 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 융합된 p27 재조합 단백질을 정제한 결과이고,
도 8a 및 도 8b 는 각각 본 발명에 따른 전장 형태의 p27 에 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 융합된 p27 재조합 단백질의 세포투과성을 유세포분석기로 분석한 결과이고,
도 9a 및 도 9b 는 각각 본 발명에 따른 전장 형태의 p27 에 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 융합된 p27 재조합 단백질의 세포투과성을 마우스 섬유아세포에서 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과이고,
도 10a 는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포 내 기능을 인간 결장암 세포주인 HCT-116 세포주에서 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이고,
도 10b 는 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포 내 기능을 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주에서 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이고,
도 11a 및 11b 는 각각 본 발명에 따른 전장 형태의 p27 에 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질을 인간 결장암 세포주 HCT-116 에 처리한 후 세포증식 억제효과를 관찰한 결과이고,
도 12a 는 본 발명에 따른 전장 형태의 p27 에 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질을 인간 유방암 세포주 MCF7 에 3 일간 처리한 후 암세포의 생존능을 관찰한 결과이고,
도 12b 는 본 발명에 따른 전장 형태의 p27 에 JO-58 MTD 가 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질을 인간 유방암 세포주 MCF7 에 1 일간 처리하고 2 일간 배양한 후 암세포의 생존능을 관찰한 결과이고,
도 13 은 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 의 아폽시스 유도효과를 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이고,
도 14 는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 의 아폽시스 유도효과를 세포 내 아넥신-V 염색을 통해 조사한 결과이고,
도 15a 는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 을 종양이 형성된 마우스에 피하 주사로 9 일간 처리한 후 매일 종양 크기의 변화를 측정한 결과이고,
도 15b 는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 을 피하 주사로 9 일간 투여하고 14 일 경과 후 마우스로부터 적출된 종양 크기를 비교한 사진이고,
도 16a 는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 을 종양이 형성된 마우스에 정맥 주사로 14 일간 처리한 후 매일 종양 크기의 변화를 측정한 결과이고,
도 16b 는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 을 정맥 주사로 14 일간 투여하고 7 일 경과 후 마우스로부터 적출된 종양 크기를 비교한 사진이고,
도 17 은 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 이 피하 주사로 투여된 마우스의 종양 조직에서 세포사멸 유도효과를 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석으로 관찰한 결과이다. Figures 1a and 1b is the result of check using the macromolecule transduction domain (MTD) of JO-58 and a quantitative cell-permeable and visible the cell-permeable flow cytometry and the auto-focus laser scanning microscope of JO-68 MTDs used as in the present invention, respectively ,
Figure 1c is the result of observing the cell permeability of JO-58 and JO-68 MTDs used as a macromolecular delivery domain (MTD) in various mouse tissues by confocal laser scanning microscope,
2 shows the structure of p27 recombinant protein in which JO-58 and JO-68 MTDs are fused to full-length p27, respectively, according to the present invention.
3 is a result of amplifying by PCR a p27 recombinant protein in which JO-58 and JO-68 MTDs are fused to full-length full-length p27 according to the present invention,
Figure 4a is a schematic diagram showing the process of subcloning the PCR amplification product of Figure 3 in the pGEM-T Easy vector,
Figure 4b shows that the PCR amplification product of Figure 3 was subcloned into the pGEM-T Easy vector,
Figure 5a is a schematic diagram showing a process for producing a recombinant expression vector by cloning the p27 recombinant fragment of the present invention in a pET-28a (+) vector,
5b shows that each p27 recombinant fragment was cloned into the recombinant expression vector of the present invention,
6 shows the results of investigating the expression of the p27 recombinant protein of the present invention in the presence (+) or absence (-) of IPTG, a protein expression inducing agent,
7A and 7B show the results of purifying p27 recombinant protein in which JO-58 MTD and JO-68 MTD are fused to full-length p27 expressed from a bacterium transformed with the recombinant expression vector of the present invention.
8A and 8B show the results of analyzing the cell permeability of p27 recombinant protein fused with JO-58 MTD and JO-68 MTD to full-length p27 according to the present invention.
9A and 9B show the cell permeability of p27 recombinant protein fused with JO-58 MTD and JO-68 MTD to full-length p27 according to the present invention, respectively, using confocal laser scanning microscope in mouse fibroblasts,
Figure 10a is the result of analyzing the intracellular function of the cell permeable p27 recombinant protein according to the present invention by Western blotting in HCT-116 cell line, a human colon cancer cell line,
Figure 10b is the result of analyzing the intracellular function of the cell permeable p27 recombinant protein of the present invention by Western blotting in MDA-MB-231 cell line, a human breast cancer cell line,
11A and 11B show the effect of inhibiting cell proliferation after treatment of human colon cancer cell line HCT-116 with a cell-permeable p27 recombinant protein fused with JO-58 MTD and JO-68 MTD to full-length p27 according to the present invention, respectively. Result,
Figure 12a is a result of observing the viability of cancer cells after treatment of the cell-permeable p27 recombinant protein fused JO-58 MTD and JO-68 MTD to full-length p27 in human breast cancer cell line MCF7 for 3 days,
Figure 12b is a result of observing the viability of cancer cells after treatment for one day and cell cultured p27 recombinant protein fused with JO-58 MTD to full-length p27 in human breast cancer cell line MCF7 for 1 day,
13 is a result of Western blot analysis of the apoptosis induction effect of the cell permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 according to the present invention,
14 shows the results of apoptosis induction of the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 according to the present invention through intracellular Annexin-V staining.
Figure 15a is a result of measuring the change in tumor size daily after treatment of the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 according to the present invention subcutaneous injection for 9 days,
Figure 15b is a photograph comparing the tumor size extracted from the mouse 14 days after the administration of the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 according to the present invention by subcutaneous injection for 9 days,
Figure 16a is a result of measuring the change in tumor size daily after treatment with the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 according to the present invention by intravenous injection for 14 days,
Figure 16b is a photograph comparing the tumor size extracted from the mouse 7 days after the administration of the cell permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 by intravenous injection for 14 days,
FIG. 17 shows TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) analysis of apoptosis-inducing effects in tumor tissues of mice to which the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 were administered subcutaneously. The result is observed.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]Best Mode for Carrying Out the Invention [

본 발명은 종양 억제인자 p27 과 거대분자 전달 도메인 (MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 p27 을 세포 내로 고효율로 도입할 수 있는 세포투과성 p27 재조합 단백질 (CP-p27) 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.The present invention provides a cell-permeable p27 recombinant protein (CP-p27) and a polynucleotide encoding the same, which are endowed with cell permeability through the fusion of a tumor suppressor p27 with a macromolecular delivery domain (MTD) to efficiently introduce p27 into cells. to provide.

본 발명의 특징은 거대분자 세포 내 전달기술 (MITT)을 이용하여 세포 내로의 도입이 용이하지 않은 거대분자인 종양 억제인자 p27 에 특정한 거대분자 전달 도메인 (이하, "MTD" 로 약칭함)을 융합시켜 세포투과성을 부여함으로써 p27 을 세포 내로 고효율로 전달하는 것이다. 이때 거대분자 전달 도메인은 p27 의 한쪽 말단에만 융합되거나, 또는 그의 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있다. 분비 단백질 (secreted protein) 유래 소수성 펩티드인 MTD 를 이용한 세포 내 전달기술은 생체 내 p27 농도의 실시간 정량적 조절 (real-time quantitative regulation)을 가능케 하여 p27 의 암조직으로의 전달을 매개하고 개개의 암세포 내로 분포될 수 있게 만든다. 이러한 효과는 p27 이 암조직 내에서 사이클린-의존성 키나아제와 사이클린의 복합체 형성을 방해하여 암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제하고, 이로 인해 암세포의 사멸을 유도할 수 있는 환경을 제공할 수 있다.A feature of the present invention is the use of a macromolecular intracellular delivery technology (MITT) to fuse a macromolecular delivery domain (hereinafter abbreviated as "MTD") specific to the tumor suppressor p27, a macromolecule that is not readily introduced into cells. In this way, p27 can be efficiently transferred into cells by imparting cell permeability. The macromolecular delivery domain can then be fused only to one end of p27, or to both ends thereof. Intracellular delivery technology using MTD, a hydrophobic peptide derived from secreted protein, enables real-time quantitative regulation of p27 concentration in vivo, mediating delivery of p27 to cancer tissue and into individual cancer cells Make it distributed. These effects inhibit the formation of complexes of cyclin-dependent kinases and cyclins in cancer tissues, thereby inhibiting the cell cycle of cancer cells, thereby suppressing unnecessary cell proliferation in vivo, thereby providing an environment for inducing cancer cell death. can do.

본 발명에서는 종양 억제인자 p27 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인 (MTD)으로서 세포 내로 거대분자의 전달을 가능케 하는 펩티드 도메인에 상기 p27 을 융합하여 세포투과성을 갖는 p27 재조합 단백질을 개발하였다.In the present invention, a p27 recombinant protein having cell permeability was developed by fusing the p27 into a peptide domain that enables the delivery of macromolecules into cells as a macromolecular delivery domain (MTD) that can be fused to a tumor suppressor p27.

본 발명에서 "세포투과성 p27 재조합 단백질" 이란 거대분자 전달 도메인과 종양 억제인자 p27 을 포함하며, 이들의 유전적 융합이나 화학적 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 여기서 "유전적 융합" 이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형의 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.In the present invention, "cell permeable p27 recombinant protein" refers to a covalent complex comprising a macromolecular delivery domain and a tumor suppressor p27, formed by genetic fusion or chemical bonding thereof. By "genetic fusion" is meant a linear covalent linkage formed through the genetic expression of a DNA sequence encoding a protein.

암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제하는 p27 은 서열번호: 1 의 염기서열 및 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 종양 억제인자로서, G1 기에서 세포분열 진행을 조절하는 세포주기 저해 단백질로 작용한다. 종양 억제인자 p27 은 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 번부터 198 번까지의 아미노산을 포함하는 도메인으로 구성된다 (도 2 참조).P27, which inhibits unnecessary cell proliferation in vivo by inhibiting the cell cycle of cancer cells, is a tumor suppressor having a nucleotide sequence of SEQ ID NO : 1 and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 , a cell cycle that regulates cell division progression in G1 phase It acts as an inhibitory protein. Tumor suppressor p27 consists of a domain comprising amino acids 1 to 198 in the amino acid sequence of SEQ ID 2 (see FIG. 2 ).

종양 억제인자 p27 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인으로는 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성을 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 상기 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열중의 어느 하나를 포함하는 거대분자 전달 도메인은 세포막을 관통하여 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 포함하는 생물학적 활성분자의 세포 내로의 유입을 매개할 수 있는 세포투과성 폴리펩티드다. 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인은 N-말단 영역, 소수성 영역 및 C-말단의 분비 단백질 전달 부위 (secreted protein cleavage site)의 3 부분으로 이루어진 시그널 펩티드 (signal peptides)에서 헬릭스 (helix)를 형성해 세포막 표적 (targeting) 활성을 부여하는 소수성 영역을 갖도록 고안된 것이다. 이러한 거대분자 전달 도메인은 세포에 손상을 주지 않으면서 직접 세포막을 관통함으로써 표적 단백질을 세포 내로 이동시켜 목적하는 기능을 발휘하게 할 수 있다.As the macromolecular delivery domain that can be fused to the tumor suppressor p27, a polypeptide having cell permeability including an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 3 to 196 may be used. Macromolecular delivery domains comprising any of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3-196 can mediate the influx of biologically active molecules comprising polypeptides, protein domains, or full-length proteins into cells through cell membranes. Cell permeable polypeptide. The macromolecular delivery domain according to the present invention forms a helix in signal peptides consisting of three parts of an N-terminal region, a hydrophobic region and a C-terminal secreted protein cleavage site, forming a helix in the cell membrane. It is designed to have a hydrophobic region that confers targeting activity. These macromolecular delivery domains can directly penetrate the cell membrane without damaging the cells, thereby moving the target protein into the cells and exerting the desired function.

본 발명에 따라 종양 억제인자 p27 에 융합될 수 있는 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 거대분자 전달 도메인을 하기 표 1a 내지 1i 에 나타내었다.Macromolecular delivery domains having amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3 to 196 that can be fused to tumor suppressor p27 according to the present invention are shown in Tables 1A- 1I below.

[표 1a]TABLE 1a

Figure pct00001
Figure pct00001

[표 1b]TABLE 1b

Figure pct00002
Figure pct00002

[표 1c][Table 1c]

Figure pct00003
Figure pct00003

[표 1d]TABLE 1d

Figure pct00004
Figure pct00004

[표 1e]TABLE 1e

Figure pct00005
Figure pct00005

[표 1f]TABLE 1f

Figure pct00006
Figure pct00006

[표 1g]Table 1g

Figure pct00007
Figure pct00007

[표 1h]Table 1h

Figure pct00008
Figure pct00008

[표 1i]TABLE 1i

Figure pct00009
Figure pct00009

본 발명의 세포투과성을 갖는 p27 재조합 단백질은 거대분자 전달 도메인으로 상기 194 종의 MTDs 중의 어느 하나가 종양 억제인자 p27 의 한쪽 또는 양쪽 말단에 융합되고, 이 융합 컨스트럭트의 한쪽 말단에 SV40 거대 T 항원 (SV40 large T antigen) 유래 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS)과 용이한 정제를 위해 히스티딘-표지 (histidine-tag, His-Tag) 친화성 도메인이 융합되어 있는 구조를 가질 수 있다.The p27 recombinant protein having cell permeability of the present invention is a macromolecular delivery domain, in which any one of the above 194 MTDs is fused to one or both ends of the tumor suppressor p27, and at one end of the fusion construct, the SV40 giant T It may have a structure in which a histidine-tag (His-Tag) affinity domain is fused for easy purification with a nuclear localization sequence (NLS) derived from an antigen (SV40 large T antigen).

본 발명의 일 실시양태에서는, 종양 억제인자 p27 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인으로 아밀로이드 베타 A4 단백질 전구체 (Amyloid beta A4 protein precursor, ABPP) 로부터 유래된 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 갖는 JO-58 MTD (이하, "MTD1"로 약칭함), 및 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor)로부터 유래된 분비 단백질 (secreted protein)인 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 갖는 JO-68 MTD (이하, "MTD2"로 약칭함)를 사용한다.In one embodiment of the invention, JO- with an amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 derived from amyloid beta A4 protein precursor (ABPP) as a macromolecular delivery domain capable of fusion to tumor suppressor p27 58 MTD (hereinafter abbreviated as “MTD 1 ”), and JO-68 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 which is a secreted protein derived from Streptomyces coelicolor , Abbreviated as "MTD 2 ").

본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 거대분자 전달 도메인으로 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 를 이용한 세포투과성 p27 재조합 단백질로서 이들 각각에 대해 3 개의 전장 형태 (full-length forms)를 고안한다.In a preferred embodiment of the invention, three full-length forms are devised for each of them as cell-permeable p27 recombinant proteins using JO-58 MTD and JO-68 MTD as macromolecular delivery domains.

본 발명에서 용어 "전장 형태"는 종양 억제인자 p27 의 서열번호: 2 로 기재되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환을 포함하지 않는 온전한 형태의 아미노산 서열을 포함하는 형태를 의미한다. 그러나 전장 형태의 p27 뿐만 아니라, p27 의 항암활성을 손상시키지 않은 범위 내에서 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환에 의한 다양한 변형을 포함하는 p27 유도체도 본 발명에 사용될 수 있다.As used herein, the term “full length form” refers to a form comprising an intact amino acid sequence that does not include the deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of tumor suppressor p27. it means. However, not only full-length p27 but also p27 derivatives containing various modifications by deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acid residues in its amino acid sequence within the range not impairing the anticancer activity of p27 can be used in the present invention. have.

도 2 를 참고로 하면, 본 발명에 따른 전장 형태의 p27 재조합 단백질은To Figure 2 for reference, the full-length form according to the present invention the recombinant protein p27

1) 전장의 p27 N-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 His-MTD1-p27 (HM1p27),1) His-MTD 1 -p27 (HM 1 p27) fused JO-58 MTD to the full length p27 N-terminus,

2) 그의 C-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 His-p27-MTD1 (Hp27M1),2) His-p27-MTD 1 (Hp27M 1 ) fused JO-58 MTD at its C-terminus,

3) 그의 양 말단에 JO-58 MTD 가 융합된 His-MTD1-p27-MTD1 (HM1p27M1),3) His-MTD 1 -p27-MTD 1 (HM 1 p27M 1 ) with JO-58 MTD fused at both ends thereof,

4) 그의 N-말단에 JO-68 MTD 가 융합된 His-MTD2-p27 (HM2p27),4) His-MTD 2 -p27 (HM 2 p27) fused JO-68 MTD at its N-terminus,

5) 그의 C-말단에 JO-68 MTD 가 융합된 His-p27-MTD2 (Hp27M2),5) His-p27-MTD 2 (Hp27M 2 ) fused JO-68 MTD at its C-terminus,

6) 그의 양 말단에 JO-68 MTD 가 융합된 His-MTD2-p27-MTD2 (HM2p27M2),6) His-MTD 2 -p27-MTD 2 (HM 2 p27M 2 ) with JO-68 MTD fused at both ends thereof,

상기에서 JO-58 MTD (MTD1)를 이용하여 제조된 전장 형태의 p27 재조합 단백질로서,As a full-length p27 recombinant protein prepared using the JO-58 MTD (MTD 1 ),

His-MTD1-p27 (HM1p27)은 서열번호: 198 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 197 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;His-MTD 1 -p27 (HM 1 p27) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 198 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 197 ;

His-p27-MTD1 (Hp27M1)은 서열번호: 200 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 199 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;His-p27-MTD 1 (Hp27M 1 ) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 200 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 199 ;

His-MTD1-p27-MTD1 (HM1p27M1)은 서열번호: 202 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 201 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.His-MTD 1 -p27-MTD 1 (HM 1 p27M 1 ) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 202 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 201 .

상기에서 JO-68 MTD (MTD2)를 이용하여 제조된 전장 형태의 p27 재조합 단백질로서,As a full-length p27 recombinant protein prepared using JO-68 MTD (MTD 2 ),

His-MTD2-p27 (HM2p27)은 서열번호: 204 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 203 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;His-MTD 2 -p27 (HM 2 p27) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 204 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 203 ;

His-p27-MTD2 (Hp27M2)은 서열번호: 206 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 205 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;His-p27-MTD 2 (Hp27M 2 ) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 , which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 205 ;

His-MTD2-p27-MTD2 (HM2p27M2)은 서열번호: 208 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 207 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.His-MTD 2 -p27-MTD 2 (HM 2 p27M 2 ) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 207 .

본 발명에서는 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지와 NLS 만이 융합된 p27 재조합 단백질 His-p27 (Hp27)을 제조한다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 210 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 209 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.In the present invention, as a control of the cell-permeable p27 recombinant protein, p27 recombinant protein His-p27 (Hp27), in which only histithin label and NLS are fused without MTD, is prepared. This control protein has an amino acid sequence of SEQ ID 210 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 209 .

또한 본 발명은 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the cell permeable p27 recombinant protein and a transformed bacterium transformed with the recombinant expression vector.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA 를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.As used herein, a "recombinant expression vector" refers to a gene construct that is capable of expressing a protein of interest or RNA of interest in a suitable host cell and comprises an essential regulatory element operably linked to express a gene insert.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest to perform a general function. For example, a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the encoding nucleic acid sequence. Operative linkage with recombinant expression vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art.

본 발명에 사용가능한 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 (cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터 (promoter), 오퍼레이터 (operator), 개시코돈 (initiation codon), 종결코돈 (termination codon), 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal), 인핸서 (enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 (signal sequence) 또는 리더서열 (leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 (constitutive) 또는 유도성 (inducible)일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현벡터인 경우 복제기원을 포함한다.Expression vectors usable in the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, and the like. Suitable expression vectors include membrane targeting or in addition to expression control sequences such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, and enhancers. It may be prepared in various ways according to the purpose, including a signal sequence or leader sequence for secretion. The promoter of the expression vector may be constitutive or inducible. In addition, the expression vector includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, it includes a replication source.

이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현벡터는 예를 들면, pET28a(+)-HM1p27 일 수 있다. 상기 재조합 발현벡터 pET28a(+)-HM1p27 은 pET-28a(+) 벡터 (Novagen, Germany)의 다중 클로닝 부위 (multi cloning site, MCS) 중 NdeI 제한효소 부위에 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질로서 전장의 p27 N-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 재조합 단백질 HM1p27 을 코딩하는 뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 의미한다.The recombinant expression vector of the present invention prepared as described above may be, for example, pET28a (+)-HM 1 p27. The recombinant expression vector pET28a (+)-HM 1 p27 is a cell permeable p27 recombination according to the present invention at the NdeI restriction enzyme site in the multi cloning site (MCS) of the pET-28a (+) vector (Novagen, Germany). As a protein, it means a vector in which the nucleotide encoding the recombinant protein HM 1 p27 is fused to the full-length p27 N-terminus of JO-58 MTD.

본 발명의 일 실시예에서는, 단백질의 정제를 용이하게 할 목적으로 세포투과성 p27 재조합 단백질의 N-말단 부위에 인위적으로 6 개의 히스티딘-표지 (histidine-tag)를 포함시켜 발현시키기 위하여, His-Tag 서열을 가지고 있는 pET-28a(+) 벡터 (Novagen, USA)에 본 발명의 뉴클레오티드를 클로닝한다.In one embodiment of the present invention, His-Tag is expressed by artificially including six histidine-tags in the N-terminal region of the cell-permeable p27 recombinant protein for the purpose of facilitating purification of the protein. The nucleotide of the present invention is cloned into the pET-28a (+) vector (Novagen, USA) having the sequence.

상기 재조합 발현벡터로부터 발현되는 세포투과성 p27 재조합 단백질은 전장 형태의 p27 의 한쪽 또는 양쪽 말단에 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 중의 하나가 융합되고, 그의 N-말단 부위에 히스티딘-표지와 NLS 가 연결되어 있다.The cell-permeable p27 recombinant protein expressed from the recombinant expression vector is fused with one of JO-58 MTD and JO-68 MTD at one or both ends of the full-length p27, and histidine-labeled and NLS at its N-terminus. It is connected.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다. 본 발명의 형질전환 세균은 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 대장균을 본 발명의 재조합 발현벡터, 예를 들면 본 발명에 따른 전장의 p27 N-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 세포투과성 재조합 단백질 HM1p27 을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 pET28a(+)-HM1p27 을 이용함으로써 많은 양의 세포투과성 p27 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법 (microprojectile bombardment), 전기충격 유전자 전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection) 및 리포좀 매개법 (liposome-mediated method) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.The present invention also provides a transformed bacterium transformed with the recombinant expression vector. The transforming bacterium of the present invention may preferably be Escherichia coli, and E. coli is a cell permeable recombinant protein HM fused with a recombinant expression vector of the present invention, for example, JO-58 MTD fused to the p27 N-terminus of the full length of the present invention. 1 recombinant expression vector comprising a nucleotide encoding the p27 pET28a (+) - it is possible to express a large amount of cell-permeable p27 recombinant protein by using a HM 1 p27. Transformation includes any method of introducing a nucleic acid into a host cell and can be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. Preferably, microprojectile bombardment, electroporation, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, PEG-mediated fusion, microinjection ( microinjection) and liposome-mediated methods.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기의 방법으로 제조된 전장의 p27 N-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 HM1p27 과 전장의 p27 양말단에 JO-58 MTD 가 융합된 HM1p27M1 각각을 포함하는 재조합 발현벡터를 대장균 DH5α 에 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균을 2009 년 5 월 6 일자로 한국생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내 생물자원센터 (Biological Resource Center)에 기탁번호 KCTC-11507BP 및 KCTC-11508BP 로 기탁하였다.In a preferred embodiment of the present invention, HM 1 p27 fused JO-58 MTD to the full-length p27 N-terminal prepared by the above method and HM 1 p27M 1 fused JO-58 MTD to the full-length p27 sock end, respectively Transgenic bacteria obtained by transforming the recombinant expression vector comprising E. coli into DH5α were deposited at the Biological Resource Center in the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on May 6, 2009. It was deposited with the numbers KCTC-11507BP and KCTC-11508BP.

본 발명은 또한, 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 p27 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a cell permeable p27 recombinant protein comprising culturing the transgenic bacteria.

상기 제조방법은 본 발명의 형질전환 세균에 도입된 재조합 발현벡터에서 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 형질전환 세균을 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것에 의해 수행된다. 상기 형질전환 세균을 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 형질전환 세균이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 후, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건, 예컨대 유전자 발현 유도제인 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)의 존재 하에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양이 완료되면, 상기 배양물로부터 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수할 수 있다. 본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한"은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 숙주세포로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.The preparation method is performed by culturing the transformed bacteria under appropriate media and conditions such that the polynucleotide encoding the cell permeable p27 recombinant protein of the present invention is expressed in the recombinant expression vector introduced into the transformed bacterium of the present invention. Methods of culturing the transformed bacteria to express the recombinant protein are known in the art, and for example, seeded in a suitable medium in which the transformed bacteria can grow and cultured, and then inoculated in the medium for culture and suitable Expression of the protein can be induced by culturing in the presence of conditions such as isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), which is a gene expression inducer. Upon completion of the culture, substantially pure recombinant protein can be recovered from the culture. The term "substantially pure" in the present invention means that the sequence of the recombinant protein of the present invention and the polynucleotide encoding it is substantially free of other proteins derived from host cells.

상기 형질전환 세균에서 발현된 재조합 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각 (cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 병용하여 이용할 수 있다 (Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990).Recovery of the recombinant protein expressed in the transgenic bacteria can be carried out through various separation and purification methods known in the art, and typically centrifuged cell lysate to remove cell debris, culture impurities, etc. After separation, precipitation, for example, salting out (ammonium sulfate precipitation and sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (protein fraction precipitation using acetone, ethanol, etc.), etc., can be carried out, dialysis, electrophoresis and various column chromatography. And the like. As the chromatography, ion exchange chromatography, gel-penetration chromatography, HPLC, reverse phase-HPLC, affinity column chromatography, and ultrafiltration may be used alone or in combination (Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory). Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990).

한편, 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균에서 발현된 재조합 단백질은 단백질 분리 시 단백질의 특성에 따라 용해성 분획 (soluble fraction)과 불용해성 분획 (insoluble fraction)으로 구분될 수 있다. 발현된 단백질의 대부분이 용해성 분획에 있을 경우에는 상기에 기술된 방법에 따라 별다른 어려움 없이 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 그러나 발현된 단백질의 대부분이 불용해성 분획, 즉, 봉입체 (inclusion body) 형태로 존재하는 경우에는, 우레아, 계면활성제 등의 단백질 변성제가 포함된 용액으로 최대한 단백질을 용해시킨 후 원심분리하여 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행함으로써 정제할 수 있다. 이때, 단백질 변성제가 포함된 용액에 의해 단백질의 구조가 변형되어 그 활성을 잃을 수 있으므로 불용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에는 탈염 및 원상화 (refolding) 단계가 필요하다. 즉, 상기 탈염 및 원상화 단계는 단백질 변성제가 포함되지 않은 용액을 이용하여 투석 및 희석을 수행하거나 또는 필터를 이용하여 원심분리를 할 수 있다. 또한, 상기 용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에도 정제 시 사용하는 용액 내의 염 농도가 높을 경우에는 이러한 탈염 및 원상화 단계를 수행할 수 있다.Meanwhile, the recombinant protein expressed in bacteria transformed with the recombinant expression vector may be classified into a soluble fraction and an insoluble fraction depending on the characteristics of the protein when the protein is separated. If most of the expressed protein is in the soluble fraction, the protein can be isolated and purified without any difficulty according to the method described above. However, when most of the expressed protein is present in the form of insoluble fraction, that is, inclusion body, the protein is dissolved in the solution containing protein denaturant such as urea and surfactant as much as possible, followed by centrifugation and dialysis and electrolysis. It can be purified by carrying out the electrophoresis and various column chromatography. At this time, since the structure of the protein may be modified by the solution containing the protein denaturant and its activity may be lost, desalting and refolding steps are required during the purification of the protein from the insoluble fraction. That is, the desalting and reconstituting may be performed by dialysis and dilution using a solution containing no protein denaturant, or centrifugation using a filter. In addition, even during the purification of the protein from the soluble fraction, if the salt concentration in the solution used for purification is high, such a desalting and reconstitution step can be performed.

본 발명의 일 실시양태에서는, 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질이 봉입체 형태로서 불용해성 분획에 존재함을 확인하고, 불용해성 분획으로부터 이를 정제하기 위하여 불용해성 분획을 트리톤 X-100 과 같은 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액에 용해시킨 다음 초음파로 처리하고 원심분리하여 침전물을 수득한다. 상기 수득한 침전물을 변성제인 우레아가 포함되어 있는 용액에 용해시킨 후 원심분리하여 상층액을 수득한다. 우레아를 이용하여 불용해성 분획으로부터 최대한 용해된 본 발명의 재조합 단백질은 히스티딘-결합 정제 키트를 사용하여 정제하고, 이후 정제된 단백질은 투석막 등을 이용한 투석에 의해 염분의 제거 및 단백질 구조의 원상화 과정을 수행함으로써 본 발명의 재조합 단백질을 수득할 수 있다.In one embodiment of the present invention, in order to confirm that the cell-permeable p27 recombinant protein according to the present invention is present in the form of inclusion bodies in the insoluble fraction, and to purify it from the insoluble fraction, the insoluble fraction is added to a non-insoluble fraction such as Triton X-100. It is dissolved in a buffer containing a mild surfactant and then sonicated and centrifuged to obtain a precipitate. The obtained precipitate is dissolved in a solution containing a denaturant urea and centrifuged to obtain a supernatant. Recombinant protein of the present invention maximally dissolved from an insoluble fraction using urea is purified using a histidine-binding purification kit, and then the purified protein is purified by dialysis using a dialysis membrane or the like to remove salts and restore the protein structure. By carrying out the recombinant protein of the present invention can be obtained.

아울러 본 발명은 상기 세포투과성 p27 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 p27 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer drugs for treating p27 defect or loss of function containing the cell-permeable p27 recombinant protein as an active ingredient.

종양 억제인자인 p27 이 결손되거나 기능이 상실된 경우에 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 p27 재조합 단백질은 세포의 핵 내로 종양 억제인자인 p27 을 고효율로 도입하여 사이클린-의존성 키나아제와 사이클린의 복합체 형성을 방해하고 암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 p27 재조합 단백질은 세포주기 저해와 세포사멸 유도에 관연하는 신호전달 기작의 재활성화를 통해 암세포의 사멸을 유도하여 인간의 다양한 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.In the case where the tumor suppressor p27 is deleted or the function is lost, the cell-permeable p27 recombinant protein according to the present invention efficiently introduces the tumor suppressor p27 into the nucleus of the cell, thereby preventing the formation of the complex of cyclin-dependent kinase and cyclin. By inhibiting the cell cycle of cancer cells, unnecessary cell proliferation in vivo can be suppressed. Accordingly, p27 recombinant protein having cell permeability according to the present invention induces apoptosis of cancer cells through reactivation of signaling mechanisms related to cell cycle inhibition and induction of apoptosis, thereby preventing and / or treating various cancers in humans. It can be usefully used as an anticancer agent.

본 발명에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함한다. 경구 투여용의 경우, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함하며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 사용할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).The composition containing the recombinant protein according to the present invention as an active ingredient may further include a pharmaceutically acceptable carrier, such as a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration. Carriers for oral administration include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like. For oral administration, the recombinant protein according to the invention can be mixed with excipients and used in the form of intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups and wafers. In addition, carriers for parenteral administration include water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers may be used by reference to those described in the following references ( Remington's Pharmaceutical Sciences , 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 조성물은 다양한 비경구 또는 경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예:락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신)와 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.The compositions according to the invention can be formulated in a variety of parenteral or oral dosage forms. Representative of parenteral formulations are injectable formulations, preferably aqueous isotonic solutions or suspensions. Injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer. In addition, oral dosage forms include, for example, tablets, capsules, and the like, which include diluents (e.g., lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine) and glidants (in addition to the active ingredients). Such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols). The tablets may comprise binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, optionally starch, agar, alginic acid or Disintegrants such as sodium salts, absorbents, colorants, flavors and / or sweeteners may be further included. The formulations may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.

본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.Compositions of the present invention may further comprise auxiliaries such as preservatives, hydrating agents, emulsifiers, salts for regulating osmotic pressure and / or buffers and other therapeutically useful substances, and may be formulated according to conventional methods.

또한, 본 발명에 따른 조성물의 투여 경로로는 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사, 종양 직접 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.In addition, the route of administration of the composition according to the present invention may be administered to humans and animals orally or parenterally, such as intravenous, subcutaneous, intranasal or intraperitoneal. Oral administration also includes sublingual application. Parenteral administration includes injections and drip methods such as subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, direct tumor injection.

본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 재조합 단백질의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1 회 투여 시 5 내지 20 mg의 유효 투여량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 단백질의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 재조합 단백질의 항암제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.In the composition of the present invention, the total effective amount of the recombinant protein of the present invention may be administered to a patient in a single dose, and the fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long time. It may also be administered by. The composition of the present invention can vary the content of the active ingredient according to the extent of the disease, but can be repeatedly administered several times a day at an effective dose of 5 to 20 mg when administered once per adult. However, the effective dose of the recombinant protein may be determined in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route and frequency of treatment of the drug. . In view of this, one of ordinary skill in the art will be able to determine the appropriate effective dosage for the particular use of the recombinant protein as an anticancer agent. The composition according to the present invention is not particularly limited to the formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention more specifically, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention.

실시예 1: 선택된 MTD 의 세포투과성 실험Example 1: Cell Permeation Experiment of Selected MTD

＜1-1＞ 유세포 분석 (flow cytometry)<1-1> flow cytometry

본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)으로서 이후의 실시예에 사용되는 JO-58 MTD (MTD1) 및 JO-68 MTD (MTD2)의 세포투과성을 정량적으로 검증하기 위해, 문헌 (Yang Y. 등, FEBS Lett. 532(1-2): 36-44, 2002; Motejadded H, 등, Biotechnol Lett. 31(4): 543-9, 2009)에 기재된 방법에 따라 EGFP (enhanced green fluorescent protein)에 상기 각각의 MTD 가 융합된 재조합 단백질을 제조하여 이들의 세포내 유입을 FACS (fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다.In order to quantitatively verify the cell permeability of the JO-58 MTD (MTD 1 ) and JO-68 MTD (MTD 2 ) used in the following examples as a macromolecular transduction domain (MTD) according to the present invention, EGFP (enhanced) according to the method described in Yang Y. et al., FEBS Lett . 532 (1-2): 36-44, 2002; Motejadded H, et al., Biotechnol Lett . 31 (4): 543-9, 2009). Recombinant proteins in which each MTD was fused to a green fluorescent protein were prepared, and their intracellular influx was analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS).

가용성 형태로 분리, 정제된 EGFP-MTD1 및 EGFP-MTD2 의 재조합 단백질을 FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe)를 이용하여 형광 표지하였다. 2 내지 20 mg의 재조합 단백질에 333 mg/㎖ 농도의 FITC 1 ㎕를 혼합한 후 빛을 피해 상온에서 2 시간 동안 진탕하면서 결합시켰다. 형광으로 표지된 EGFP-MTD1 및 EGFP-MTD2 의 재조합 단백질을 4℃에서 1 일간 DMEM 배지에 대해 투석하여 표지되지 않은 FITC 를 제거하였고, 이로부터 회수된 재조합 단백질은 브래드포드 (Bradford) 단백질 정량법으로 그 농도를 분석하였다. 그 결과 각각의 재조합 단백질의 농도는 약 1 ㎍/㎕로 측정되었다.Recombinant proteins of EGFP-MTD 1 and EGFP-MTD 2 isolated and purified in soluble form were fluorescently labeled using FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe). 1 μl of FITC at a concentration of 333 mg / ml was mixed with 2 to 20 mg of the recombinant protein, followed by binding for 2 hours at room temperature, avoiding light. Fluorescently labeled recombinant proteins of EGFP-MTD 1 and EGFP-MTD 2 were dialyzed against DMEM medium at 4 ° C. for 1 day to remove unlabeled FITC, from which the recovered recombinant protein was analyzed by Bradford protein assay. The concentration was analyzed by. As a result, the concentration of each recombinant protein was measured at about 1 μg / μl.

한편, 마우스의 대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)를 10％ 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin, WelGENE) 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지 (WelGENE)에 접종하고 37℃, 5％ CO2 의 습윤 조건 하에서 배양하였다.Meanwhile, RAW 264.7 cells derived from macrophages of mice (Korea Cell Line Bank, Seoul, South Korea) were injected with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin (WelGENE) 500 mg. / MEM was inoculated in DMEM medium (WelGENE) and incubated under wet conditions of 37 ° C, 5% CO 2 .

배양 후, 상기에서 준비된 FITC-표지 EGFP-MTD1 및 EGFP-MTD2 재조합 단백질 각각을 10 μM 농도로 RAW 264.7 세포에 처리한 후 37℃에서 1 시간 더 배양하였다. 이어서, 상기 재조합 단백질이 처리된 RAW 264.7 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 FITC 를 제거하기 위해 트립신/EDTA (T/E, Invitrogen)를 처리하고, 저온의 PBS (phosphate buffered saline)로 3 회 세척하였다. 준비된 세포에 대해 셀퀘스트 프로 세포측정 분석 소프트웨어 (CellQuest Pro cytometric analysis software)를 이용한 FACScan 유세포 분석기 (flow cytometry, Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 이때 각 시료의 세포 농도는 1×104 세포/㎕이었고, 분석 실험은 2 회 이상 수행하였다. 본 발명에 따른 EGFP-MTD1 및 EGFP-MTD2 재조합 단백질의 세포투과성은 세포투과성이 없을거라 기대되는 음성 대조군 (scrambled MTD), 세포투과성이 이미 확인된 양성 대조군 (kFGF4-유래 MTD), FITC-형광 단일처리군 및 단백질을 처리하지 않은 세포군을 비교군으로 하여 세포투과성을 결정하였다.After incubation, each of the FITC-labeled EGFP-MTD 1 and EGFP-MTD 2 recombinant proteins prepared above was treated with RAW 264.7 cells at a concentration of 10 μM and further incubated for 1 hour at 37 ° C. Subsequently, trypsin / EDTA (T / E, Invitrogen) was treated to remove free FITC exposed to the cell membranes of RAW 264.7 cells treated with the recombinant protein, and washed three times with cold PBS (phosphate buffered saline). . Prepared cells were analyzed by FACScan flow cytometry (Becton Dickinson, Calif.) Using CellQuest Pro cytometric analysis software. At this time, the cell concentration of each sample was 1 × 10 4 cells / μl, and the assay was performed two or more times. The cell permeability of the EGFP-MTD 1 and EGFP-MTD 2 recombinant proteins according to the present invention is expected to be cell-permeable negative control (scrambled MTD), cell permeability positive control (kFGF4-derived MTD), FITC- Cell permeability was determined using the fluorescence single treatment group and the protein group not treated with the comparison group.

그 결과, 도 1a 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인으로서 JO-58 MTD 와 JO-68 MTD 가 융합된 재조합 단백질이 대조군에 비하여 높은 수준의 원형질막 투과 능력을 나타냄을 확인하였다. 도 1a 에서 회색의 곡면은 세포 단독, 검은색 곡선은 FITC 단독, 파랑색 곡선은 세포투과성이 없는 음성 대조군 (scrambled MTD), 적색 곡선은 세포투과성 있는 양성 대조군 (kFGF4-유래 MTD), 녹색 곡선은 JO-58 MTD 와 JO-68 MTD 각각의 재조합 단백질을 나타낸다.As a result, as shown in Figure 1a , it was confirmed that the recombinant protein fused JO-58 MTD and JO-68 MTD as a macromolecular delivery domain according to the present invention showed a higher level of plasma membrane permeability than the control. In FIG. 1A , gray curves are cells alone, black curves are FITC alone, blue curves are not cell permeable negative control (scrambled MTD), red curves are cell permeable positive control (kFGF4-derived MTD), and green curves are Recombinant proteins of JO-58 MTD and JO-68 MTD are shown respectively.

＜1-2＞ 동초점 레이저 주사 현미경 관찰 I<1-2> Confocal laser scanning microscope observation I

상기 실시예 ＜1-1＞에서 유세포 분석으로 1 차적으로 세포투과성이 확인된 JO-58 MTD 와 JO-68 MTD 의 세포 내 전달부위를 시각적으로 확인하기 위하여, 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)에 FITC-표지된 EGFP-MTD1 및 EGFP-MTD2 재조합 단백질을 10 μM 의 농도로 처리하고 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다. 사용된 NIH3T3 세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (8-well chamber slide, LabTek, Nalgen Nunc)에서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, NIH3T3 세포는 10％ FBS 및 5％ 페니실린/스트렙토마이신 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 무혈청 DMEM, FITC 함유 무혈청 DMEM, 또는 FITC-표지된 재조합 단백질 각각을 10 μM 로 함유하는 무혈청 DMEM 으로 37℃, 5％ CO2 하에서 1 시간 동안 처리하였다. 1 시간 경과 후, 세포를 4％ 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 실온에서 20 분간 처리하여 고정시켰다.NIH3T3 cells derived from mouse fibroblasts to visually identify intracellular delivery sites of JO-58 MTD and JO-68 MTD whose cell permeability was primarily confirmed by flow cytometry in Example <1-1>. FITC-labeled EGFP-MTD 1 and EGFP-MTD 2 recombinant proteins were treated at 10 μM and cultured at 37 ° C. for 1 hour at the Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea. scanning microscopy). The NIH3T3 cells used were incubated for 24 hours in 8-well chamber slides (LabTek, Nalgen Nunc). At this time, NIH3T3 cells were cultured in DMEM medium containing 500 mg / ml of 10% FBS and 5% penicillin / streptomycin. It washed three times and the cultured cells with PBS then serum-free DMEM, FITC-containing serum-free DMEM, or FITC- 1 hour labeled recombinant proteins, respectively under the serum-free DMEM 37 ℃, 5% CO 2 containing by 10 μM Treated during. After 1 hour, cells were fixed by treating with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature.

상기에서 고정된 세포는 MTD 의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 형광 염색하는 PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) 대조염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 1 ㎍/㎖ 농도로 5 분간 PI 로 염색한 후, 세포를 PBS 로 3 회 세척하였다. 세포 내 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 10 ㎕의 DABCO (Fluca) 함유 폴리비닐 알코올 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후에 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 이때 동초점 레이저 주사 현미경은 노르마스키 필터 (normaski filter)를 이용하여 세포의 원형, FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였고, FITC 는 488 nm에서 여기되고 530 nm대역통과 필터 (bandpass filter)로 검출되었다.The fixed cells were confirmed to be delivered to the nucleus and permeable to the nucleus through PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) counterstaining to fluoresce the nucleus so as to easily distinguish the MTD intracellular delivery site. After staining with PI for 5 min at a concentration of 1 μg / ml, the cells were washed three times with PBS. To preserve the fluorescent label of the intracellular recombinant protein, 10 μl of DABCO (Fluca) containing polyvinyl alcohol mounting medium was added onto the slide and observed 15 minutes later with confocal laser scanning microscope. At this time, the confocal laser scanning microscope observed the prototype, FITC fluorescence and PI fluorescence of the cells using a Normaski filter, and FITC was excited at 488 nm and detected with a 530 nm bandpass filter.

그 결과, 도 1b 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인으로서 JO-58 MTD 와 JO-68 MTD 가 융합된 재조합 단백질은 세포 단독, FITC 단독, 음성 대조군 (scrambled MTD) 및 양성 대조군 (kFGF4-유래 MTD) 대조군에 비하여 핵 내에 광범위하게 분포하고 있음을 확인하였다. JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 재조합 단백질의 세포내 핵 국소화는 상기 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과에 비례하는 것이다.As a result, as shown in Figure 1b , the recombinant protein fused JO-58 MTD and JO-68 MTD as a macromolecular delivery domain according to the present invention is a cell alone, FITC alone, negative control (scrambled MTD) and positive control ( kFGF4-derived MTD) was found to be widely distributed in the nucleus compared to the control. Intracellular nuclear localization of the JO-58 MTD and JO-68 MTD recombinant proteins is proportional to the relative cell permeability results of the flow cytometry.

＜1-3＞ 동초점 레이저 주사 현미경 관찰-II<1-3> Confocal laser scanning microscope observation -II

상기 실시예 ＜1-2＞에서 배양된 세포를 대상으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 조직 상태에서도 세포투과성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.The following experiments were performed to confirm whether the JO-58 MTD and the JO-68 MTD of the present invention, which confirmed the cell permeability, of the cells cultured in Example <1-2> showed cell permeability even in the tissue state. It was.

이를 위해 FITC-표지된 EGFP-MTD1 및 EGFP-MTD2 재조합 단백질을 3 가지 대조군 (FITC 단독, 음성 대조군 (scrambled MTD) 및 양성 대조군 (kFGF5-유래 MTD))과 함께 7 주령의 누드마우스 (Balb/c nu/nu mice, 중앙실험동물, 서울)에 300 ㎍씩 복강 주사 (intraperitoneal injection)하였다. 1.5 시간 후 각 그룹 마우스를 희생시키고 이로부터 간, 신장, 비장, 폐, 심장 및 뇌 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 OCT 화합물로 봉입하고 냉동시킨 후 마이크로톰 (microtome)을 이용하여 두께 14 ㎛로 박절하였다. 조직 절편을 슬라이드 위에 놓고 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 이때, 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위하여 10 ㎕의 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후에 관찰하였다.To this end, FITC-labeled EGFP-MTD 1 and EGFP-MTD 2 recombinant proteins were combined with three controls (FITC alone, negative control (scrambled MTD) and positive control (kFGF5-derived MTD) to 7 week old nude mice (Balb). / c nu / nu mice, central laboratory animals, Seoul) was intraperitoneal injection by 300 ㎍. After 1.5 hours, each group of mice was sacrificed and liver, kidney, spleen, lung, heart and brain tissues were extracted therefrom. The extracted tissue was encapsulated with OCT compound, frozen and cut into 14 μm thickness using a microtome. Tissue sections were placed on slides and observed under confocal laser scanning microscope. At this time, in order to preserve the fluorescent label of the recombinant protein 10 μl of the mounting medium (mounting medium) was added to the slide and observed after 15 minutes.

그 결과, 도 1c 에 나타난 바와 같이, 유세포의 상대적 세포투과성 결과에 비례하여 뚜렷한 FITC 형광 (연두색)으로 염색된 각 조직 내로의 단백질 전달이 관찰되었다. 상기 결과로부터 본 발명에서 거대분자 전달 도메인으로 사용되는 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 세포투과성이 우수하여 목적하는 단백질을 효과적으로 조직 내에 전달할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG . 1C , protein delivery into each tissue stained with distinct FITC fluorescence (lime green) was observed in proportion to the relative cell permeability results of the flow cells. From the above results, it was confirmed that the JO-58 MTD and the JO-68 MTD used as the macromolecular delivery domain in the present invention are excellent in cell permeability to effectively deliver the desired protein into the tissue.

실시예 2: 세포투과성 p27 재조합 단백질 (CP-p27)의 제조Example 2: Preparation of Cell Permeable p27 Recombinant Protein (CP-p27)

JO-58 MTD (MTD1) 및 JO-68 MTD (MTD2)를 이용하여 세포투과성 p27 재조합 단백질을 제조하기 위하여 하기와 같이 각각의 MTD 에 대해 3 개의 전장 형태를 고안하였다.(도 2):Three full-length forms were devised for each MTD as follows to prepare cell-permeable p27 recombinant protein using JO-58 MTD (MTD 1 ) and JO-68 MTD (MTD 2 ) ( FIG. 2 ):

1) 전장의 p27 N-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 His-MTD1-p27 (HM1p27),1) His-MTD 1 -p27 (HM 1 p27) fused JO-58 MTD to the full length p27 N-terminus,

2) 그의 C-말단에 JO-58 MTD 가 융합된 His-p27-MTD1 (Hp27M1),2) His-p27-MTD 1 (Hp27M 1 ) fused JO-58 MTD at its C-terminus,

3) 그의 양 말단에 JO-58 MTD 가 융합된 His-MTD1-p27-MTD1 (HM1p27M1),3) His-MTD 1 -p27-MTD 1 (HM 1 p27M 1 ) with JO-58 MTD fused at both ends thereof,

4) 그의 N-말단에 JO-68 MTD 가 융합된 His-MTD2-p27 (HM2p27),4) His-MTD 2 -p27 (HM 2 p27) fused JO-68 MTD at its N-terminus,

5) 그의 C-말단에 JO-68 MTD 가 융합된 His-p27-MTD2 (Hp27M2), 및5) His-p27-MTD 2 (Hp27M 2 ) fused JO-68 MTD to its C-terminus, and

6) 그의 양 말단에 JO-68 MTD 가 융합된 His-MTD2-p27-MTD2 (HM2p27M2),6) His-MTD 2 -p27-MTD 2 (HM 2 p27M 2 ) with JO-68 MTD fused at both ends thereof,

상기 재조합 단백질의 유전자 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 각각에 대해 특이적으로 고안된 프라이머 쌍과 인간 p27 cDNA 를 주형으로 사용하는 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 이때 HM1p27 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 213 및 212 의 염기서열을 가지고; Hp27M1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 211 및 214 의 염기서열을 가지고; HM1p27M1 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 213 및 214 의 염기서열을 가지고; HM2p27 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 215 및 212 의 염기서열을 가지고; Hp27M2 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 211 및 216 의 염기서열을 가지고; HM2p27M2 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 215 및 216 의 염기서열을 갖는다.In order to prepare a gene construct of the recombinant protein, a polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair specifically designed for each and a human p27 cDNA as a template was performed. Wherein the forward and reverse primers for amplification of HM 1 p27 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 213 and 212 , respectively; Forward and reverse primers for amplification of Hp27M 1 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 211 and 214 , respectively; Forward and reverse primers for amplification of HM 1 p27M 1 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 213 and 214 , respectively; Forward and reverse primers for amplification of HM 2 p27 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 215 and 212 , respectively; Forward and reverse primers for amplification of Hp27M 2 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 211 and 216 , respectively; The forward and reverse primers for the amplification of HM 2 p27M 2 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 215 and 216 , respectively.

상기에서 각각의 재조합 단편의 증폭을 위해 사용된 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 하기 표 2 에 정리하였다.The forward and reverse primer pairs used for the amplification of each recombinant fragment above are summarized in Table 2 below.

Figure pct00010
Figure pct00010

PCR 반응은 주형 유전자로 인간 p27 cDNA 100 ng, 각 0.2 mM 의 최종 농도 dNTP 혼합물 (dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP, 각 2 mM), 0.5 μM 의 각 프라이머, 10× Taq 완충용액 10 ㎕, Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.5 ㎕를 포함하는 용액을 최종 부피 100 ㎕ 반응액으로 하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 2 분간 열 변성 (denaturing)시킨 후 95℃에서 45 초, 67℃에서 45 초 및 72℃에서 45 초의 반응을 30 회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 5 분간 증폭하였다. 반응이 끝난 후 0.8％ 아가로즈 겔에 전기영동 (electrophoresis)을 수행하여 증폭된 생성물을 확인하였다. 도 3 에 나타난 바와 같이, MTD 가 융합된 각각의 재조합 단편이 목적하는 크기로 증폭되었음을 확인하였다.The PCR reaction was a template gene with 100 ng of human p27 cDNA, a final concentration of dNTP mixture of 0.2 mM each (dGTP, dATP, dTTP and dCTP, 2 mM each), 0.5 μM of each primer, 10 μl of 10 × Taq buffer, Taq polymerization A solution containing 0.5 μl of enzyme (Takara, Japan) was performed with a final volume of 100 μl reaction solution. PCR reaction conditions were first denatured at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 45 seconds at 95 ° C., 45 seconds at 67 ° C. and 45 seconds at 72 ° C., and finally amplified at 72 ° C. for 5 minutes. . After the reaction, electrophoresis was performed on the 0.8% agarose gel to confirm the amplified product. As shown in Figure 3 , it was confirmed that each recombinant fragment fused MTD was amplified to the desired size.

아가로즈 겔에서 증폭된 재조합 단편을 회수한 후 이들 각각을 상용의 키트 (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 추출한 단편을 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, USA)에 삽입한 후 (도 4a), MTD 가 융합된 p27 재조합 단백질 유전자 단편이 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 대장균 DH5α 감응세포 (competent cell)에 형질전환시켰다. 이를 50 ㎍/㎖ 암피실린 (ampicillin)이 포함된 평판 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하고, 이를 다시 액체 LB 배지에서 배양한 후, 이로부터 각각의 p27 재조합 단백질 유전자가 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 다량으로 수득하였다.After recovering the recombinant fragments amplified on the agarose gel, each of them was extracted and purified using a commercially available kit (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA). After inserting the extracted fragment into the pGEM-T Easy vector (Promega, USA) ( Fig. 4a ), the pGEM-T Easy vector into which the pD recombinant protein gene fragment fused with MTD was inserted was transformed into E. coli DH5α-competent cells. Switched. This was inoculated in plate LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and cultured overnight at 37 ° C. to select transformed E. coli, which was incubated in liquid LB medium, and then from each p27 recombinant protein gene. A large amount of pGEM-T Easy vector was inserted.

도 4b 는 pGEM-T Easy 벡터에 삽입된 재조합 단편을 NdeI 제한효소 (Enzynomics, Korea)로 분리하여 0.8％ 아가로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 재조합 단편이 상기 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 4B shows that the recombinant fragment inserted into the pGEM-T Easy vector was separated by Nde I restriction enzyme (Enzynomics, Korea) and electrophoresed on 0.8% agarose gel, from which each recombinant fragment was correctly inserted into the vector. Confirmed.

상기에서 각각의 p27 재조합 단백질 유전자가 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 제한효소 NdeI 을 사용해 37℃에서 2 시간 동안 절단 (digestion)하여 각각의 재조합 단편을 얻었다. 아가로즈 겔에서 재조합 단편을 회수한 후 이들 각각을 상용의 키트 (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 한편, 히스티딘-표지 (histidine-tag)와 T7 프로모터를 가진 발현벡터 pET-28a(+) 벡터 (Novagen, USA)를 제한효소 NdeI 을 사용해 상기와 동일한 조건으로 절단하였다. 상기에서 추출된 각각의 재조합 단편과 절단된 pET-28a(+) 벡터를 혼합하고, 여기에 T4 DNA 연결효소 (ligase; Takara, 일본)를 첨가한 후 16℃에서 12 시간 동안 라이게이션 (ligation)시킨 다음 (도 5a), 대장균 DH5α 감응세포에 형질전환시켜 재조합 단백질 발현벡터를 수득하였다The pGEM-T Easy vector into which each p27 recombinant protein gene was inserted was digested at 37 ° C. for 2 hours using the restriction enzyme Nde I to obtain respective recombinant fragments. After recovering the recombinant fragments in the agarose gel, each of them was extracted and purified using a commercially available kit (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA). Meanwhile, the expression vector pET-28a (+) vector (Novagen, USA) having histidine-tag and T7 promoter was cut under the same conditions as above using restriction enzyme Nde I. Each of the recombinant fragments extracted above and the cleaved pET-28a (+) vector were mixed, followed by ligation at 16 ° C. for 12 hours after the addition of T4 DNA ligase (Takara, Japan). Then, ( FIG. 5A ), E. coli DH5α-sensitized cells were transformed to obtain a recombinant protein expression vector.

도 5b 는 pET-28a(+) 벡터에 삽입된 재조합 단편을 NdeI 제한효소로 분리하여 0.8％ 아가로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 재조합 단편이 상기 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 5B shows that the recombinant fragment inserted into the pET-28a (+) vector was separated by Nde I restriction enzyme and electrophoresed on 0.8% agarose gel, from which it was confirmed that each recombinant fragment was correctly inserted into the vector.

이렇게 수득된 재조합 단백질 발현벡터를 각각 pET28a(+)-HM1p27, pET28a(+)-Hp27M1, pET28a(+)-HM1p27M1, pET28a(+)-HM2p27, pET28a(+)-Hp27M2 및 pET28a(+)-HM2p27M2 으로 명명하였고, 이들 중에서 재조합 발현벡터 pET28a(+)-HM1p27 및 pET28a(+)-HM2p27M2 로 대장균 DH5α 를 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균 DH5α/HM1p27 과 DH5α/HM1p27M1 을 2009 년 5 월 6 일자로 한국생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내 생물자원센터 (Biological Resource Center)에 기탁번호 KCTC-11507BP 및 KCTC-11508BP 로 기탁하였다.The recombinant protein expression vectors thus obtained were pET28a (+)-HM 1 p27, pET28a (+)-Hp27M 1 , pET28a (+)-HM 1 p27M 1 , pET28a (+)-HM 2 p27, pET28a (+)-, respectively. Hp27M 2 and pET28a (+) - HM 2 p27M was named 2, the recombinant expression vector pET28a (+) among these - HM 1 p27 and pET28a (+) - a transformant obtained by transforming E. coli DH5α with HM 2 p27M 2 The bacterium DH5α / HM 1 p27 and DH5α / HM 1 p27M 1 were deposited in the Biological Resource Center of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on May 6, 2009. Deposited with KCTC-11508BP.

염기서열 분석 결과, 상기에서 JO-58 MTD 를 이용하여 제조된 전장 형태의 p27 재조합 단백질로서, His-MTD1-p27 (HM1p27)은 서열번호: 198 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 197 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; His-p27-MTD1 (Hp27M1)은 서열번호: 200 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 199 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코팅되고; His-MTD1-p27-MTD1 (HM1p27M1)은 서열번호: 202 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 201 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.As a result of sequencing, the full-length p27 recombinant protein prepared using JO-58 MTD, His-MTD 1 -p27 (HM 1 p27) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 198 , which is SEQ ID NO: Encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of 197 ; His-p27-MTD 1 (Hp27M 1 ) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 200 , which is coated by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 199 ; His-MTD 1 -p27-MTD 1 (HM 1 p27M 1 ) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 202 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 201 .

아울러, JO-68 MTD 를 이용하여 제조된 전장 형태의 p27 재조합 단백질로서, His-MTD2-p27 (HM2p27)은 서열번호: 204 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 203 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; His-p27-MTD2 (Hp27M2)은 서열번호: 206 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 205 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; His-MTD2-p27-MTD2 (HM2p27M2)은 서열번호: 208 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 207 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.In addition, the full-length p27 recombinant protein prepared using JO-68 MTD, His-MTD 2 -p27 (HM 2 p27) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 204 , which represents the base sequence of SEQ ID NO: 203 Encoded by a polynucleotide having; His-p27-MTD 2 (Hp27M 2 ) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 206 , which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 205 ; His-MTD 2 -p27-MTD 2 (HM 2 p27M 2 ) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 207 .

한편, 본 발명에서는 세포투과성 p27 재조합 단백질의 대조군으로서, 전장의 p27 에 히스티딘-표지만이 융합되어 있는 His-p27 (Hp27)을 제조하였다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 210 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 209 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.On the other hand, in the present invention, as a control of the cell-permeable p27 recombinant protein, His-p27 (Hp27) in which only histidine-label was fused to the full-length p27 was prepared. This control protein has an amino acid sequence of SEQ ID 210 , which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 209 .

실시예 3: 재조합 단백질의 발현Example 3: Expression of Recombinant Protein

＜3-1＞ 최적의 숙주균주 선발<3-1> Optimal host strain selection

세포투과성 p27 재조합 단백질의 발현유도에 가장 적합한 숙주균주를 선발하기 위하여, LacI 프로모터를 갖는 대장균 BL21 (DE3), BL21 Gold (DE3), BL21 CodonPlus (DE3) 및 BL21 Gold (DE3) pLysS (Stratagene, USA)를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.To selecting the most suitable host strain for the expression induction of cell permeable p27 recombinant proteins, E. coli BL21 (DE3) with the Lac I promoter, BL21 Gold (DE3), BL21 CodonPlus (DE3) and BL21 Gold (DE3) pLysS (Stratagene, USA) was performed the following experiment.

먼저, 상기 실시예 ＜2-1＞에서 제조된 재조합 발현벡터 각각을 상기 대장균 균주 BL21 (DE3), BL21 Gold (DE3), BL21 CodonPlus (DE3) 및 BL21 Gold (DE3) pLysS 각각에 열 충격 (heat shock) 방법으로 형질전환시킨 후 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 1 ㎖ LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 100 ㎖ LB 배지에 접종하고 37℃에서 OD600 이 0.6 내지 0.7 에 도달할 때까지 배양하였다. 이 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 1 mM 의 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가하고 37℃에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이 배양액을 4℃에서 7,000 ×g, 20 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 용해 완충액 (lysis buffer: 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아, pH 8.0)에 현탁한 후 초음파 처리를 수행하여 세포를 파쇄하였으며, 이를 14,000 ×g 로 15 분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용해성 분획을 얻었다. 이 용해성 분획과 불용해성 분획을 각각 SDS-PAGE 에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다.First, each of the recombinant expression vectors prepared in Example <2-1> was heat shocked to each of the E. coli strains BL21 (DE3), BL21 Gold (DE3), BL21 CodonPlus (DE3) and BL21 Gold (DE3) pLysS. After transformation by a shock method, the cells were cultured in LB medium containing 50 µg / ml kanamycin. E. coli with the recombinant protein gene was then inoculated in 1 ml LB medium and incubated overnight at 37 ° C., which was then inoculated in 100 ml LB medium and incubated at 37 ° C. until the OD 600. . 1 mM of isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) was added to the culture as an inducer of protein expression, and further cultured at 37 ° C for 3 hours. The culture solution was centrifuged at 7,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant and the cells were recovered. The recovered cells were suspended in lysis buffer (lysis buffer: 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8.0), and then subjected to sonication to disrupt cells. Centrifugation for a minute afforded a soluble fraction and an insoluble fraction. The soluble fraction and the insoluble fraction were respectively subjected to SDS-PAGE to analyze protein expression characteristics and expression levels.

다양한 숙주균주를 대상으로 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 조사한 결과, BL21 CodonPlus (DE3) 균주에서 가장 높은 발현량이 확인되어 이를 재조합 단백질의 발현을 위한 최적의 균주로 선택하였다.As a result of investigating the expression of the recombinant protein of the present invention in various host strains, the highest expression level was confirmed in the BL21 CodonPlus (DE3) strain was selected as the optimal strain for the expression of the recombinant protein.

＜3-2＞ 재조합 단백질의 발현<3-2> Expression of Recombinant Protein

상기 실시예 ＜3-1＞에서 최적의 균주로 확인된 대장균 BL21 CodonPlus (DE3)에 재조합 발현벡터 pET28a(+)-HM1p27, pET28a(+)-Hp27M1, pET28a(+)-HM1p27M1, pET28a(+)-HM2p27, pET28a(+)-Hp27M2 및 pET28a(+)-HM2p27M2 각각을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 상기 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 25 ㎖ LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 1 ℓ LB 배지에 접종하고 37℃에서 OD600 이 0.6 내지 0.7 에 도달할 때까지 배양하였다. 이 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 0.65 mM 의 IPTG 를 첨가하고 37℃에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이 배양액을 4℃에서 4,000 ×g, 20 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 용해 완충액 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아, pH 8.0)에 현탁한 후 초음파 처리를 수행하여 세포를 파쇄하였으며, 이를 14,000 ×g 로 15 분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용해성 분획을 얻었다. 이 용해성 분획과 불용해성 분획을 각각 SDS-PAGE 에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다.Recombinant expression vectors pET28a (+)-HM 1 p27, pET28a (+)-Hp27M 1 , pET28a (+)-HM 1 p27M in Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) identified as optimal strains in Example <3-1> 1 , pET28a (+)-HM 2 p27, pET28a (+)-Hp27M 2 and pET28a (+)-HM 2 p27M 2 were each transformed by heat shock method and then in LB medium containing 50 μg / ml of kanamycin Incubated. After inoculating E. coli into which the recombinant protein gene was introduced was inoculated in 25 ml LB medium and incubated at 37 ° C. overnight, and then inoculated in 1 L LB medium and cultured at 37 ° C. until OD 600 reached 0.6 to 0.7. It was. 0.65 mM IPTG was added to the culture as an inducer of protein expression, and further cultured at 37 ° C for 3 hours. The culture solution was centrifuged at 4,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant and the cells were recovered. The recovered cells were suspended in lysis buffer (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8.0) and sonicated to disrupt the cells, which were centrifuged at 14,000 × g for 15 minutes. To obtain a soluble fraction and an insoluble fraction. The soluble fraction and the insoluble fraction were respectively subjected to SDS-PAGE to analyze protein expression characteristics and expression levels.

도 6 에 나타난 바와 같이, 약 25 kDa 의 크기를 갖는 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질은 봉입체 형태로 대부분 불용해성 분획에 포함되어 있으며, IPTG 무처리 배양액 (-)에 비해 IPTG 처리 배양액(+)에서 목적 단백질의 발현이 현저히 증가되었음을 확인하였다.As shown in Figure 6 , the cell-permeable p27 recombinant protein of the present invention having a size of about 25 kDa is included in most insoluble fractions in the form of inclusion bodies, and compared with the IPTG untreated culture (-), the IPTG treated culture (+) It was confirmed that the expression of the protein of interest increased significantly.

실시예 4: 재조합 단백질의 정제Example 4: Purification of Recombinant Proteins

본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질은 봉입체 형태로 불용해성 분획에 존재하므로 이를 정제하기 위하여 강력한 변성제로서 8 M 우레아 (urea)를 이용하였다.Since the cell permeable p27 recombinant protein according to the present invention is present in the insoluble fraction in inclusion body form, 8 M urea was used as a potent denaturant to purify it.

먼저, 본 발명의 재조합 발현벡터 각각으로 형질전환된 BL21 CodonPlus (DE3) 균주를 상기 실시예 3 과 같이 1 ℓ 의 LB 배지에 배양하였다. 각각의 배양액을 원심분리하여 수득한 균체를 20 ㎖의 용해 완충액 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아, pH 8.0)에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 현탁하고, 이를 마이크로팁 (microtip)이 장착된 초음파 균질기를 이용하여 저온에서 균체를 파쇄하였다. 이때, 처리시간은 장치의 출력을 최대출력의 25％로 설정하고, 7 분간 45 초 처리 후 10 초 방치를 반복하였다. 충분히 용균된 봉입체를 4℃에서 4,000 ×g, 20 분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액을 나이트릴로트라이아세트산 아가로스 (nitrilotriacetic acid agarose)에 Ni 를 부여한 Ni-NTA 아가로스 레진에 로우딩하였다. 이때 Ni-NTA 아가로스는 미리 용해 완충액으로 수차례 세척하여 평형화시킨 후 사용하였다. 상층액을 4℃에서 8 시간 이상 진탕기로 천천히 교반하면서 레진에 흡착시켰다. 재조합 단백질이 포함된 봉입체가 흡착된 레진을 4℃의 분당 회전수 1,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여 반응액을 제거하였고, 비특이적 흡착 물질을 제거하기 위해 레진을 세척 완충액 (washing buffer: 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아, pH 6.3)을 이용하여 5 회 세척하였다. 세척된 레진에 pH 4.0 의 산성 조건에서 레진 용적 2 배의 용출 완충액 (elution buffer: 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아, pH 4.5)을 로우딩하고 진탕기에서 2 시간, 또는 8 시간 이상을 교반하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 12％ SDS-PAGE 겔에서 전기영동을 수행한 후 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R (coomassie brilliant blue R)로 가볍게 진탕하면서 염색하고, 목적 단백질의 밴드가 명확해질 때까지 탈색액을 이용하여 탈색하였다.First, the BL21 CodonPlus (DE3) strain transformed with each of the recombinant expression vectors of the present invention was cultured in 1 L LB medium as in Example 3. The cells obtained by centrifugation of each culture were suspended in 20 ml of lysis buffer (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8.0), taking care not to bubble up, and microtiping them. Cells were crushed at low temperature using an ultrasonic homogenizer equipped with a microtip. At this time, the processing time set the output of the apparatus to 25% of the maximum output, and it was left to stand for 10 seconds after 45 minutes of treatment for 7 minutes. The fully lysed inclusion body was centrifuged at 4,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to remove the precipitate and recover the supernatant. The recovered supernatant was loaded onto Ni-NTA agarose resin imparted with Nitrilotriacetic acid agarose. At this time, Ni-NTA agarose was used after equilibration by washing several times with lysis buffer. The supernatant was adsorbed onto the resin with slow stirring at 4 ° C. for at least 8 hours. The reaction solution was removed by centrifuging the resin containing the recombinant protein-adsorbed body at 1,000 rpm for 4 minutes at 4 ° C., and the resin was washed to remove the nonspecific adsorbent. Washing buffer: 100 mM NaH 2 5 washes with PO 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 6.3). The washed resin was loaded with 2 times the elution buffer (elution buffer: 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 4.5) in acidic conditions at pH 4.0 and 2 hours on a shaker. Alternatively, the protein was eluted by stirring for 8 hours or more. Electrophoresis was performed on a 12% SDS-PAGE gel to assay the purity of the eluted protein, and then the gel was gently shaken with Coomassie brilliant blue R and the band of the target protein was clear. Discoloration was carried out using the bleach solution.

그 결과, 도 7a 내지 7b 에 나타난 바와 같이, 마커 단백질의 영동위치와 비교하여 JO-58 MTD 및 JO-68 MTD 가 각각 융합된 모든 세포투과성 p27 재조합 단백질이 약 25 kDa 부위에서 검출되어 불용해성 분획으로부터 정제되었음을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 7A to 7B , all cell-permeable p27 recombinant proteins fused with JO-58 MTD and JO-68 MTD, respectively, were detected at the site of about 25 kDa as compared to the location of the marker protein. Confirmed from the purification.

실시예 5: 단백질의 활성 재생Example 5: Active Regeneration of Proteins

상기 실시예 4 에서와 같이 불용해성 분획으로부터 정제된 본 발명의 재조합 단백질은 강력한 변성제인 8 M 우레아에 의해 변성되었기 때문에 이를 활성 형태로 전환시키기 위하여 하기와 같이 원상화 과정을 수행하였다.Since the recombinant protein of the present invention purified from the insoluble fraction as in Example 4 was denatured by 8 M urea, which is a potent denaturant, the restitution process was performed as follows to convert it to the active form.

먼저, 정제된 재조합 단백질을 재중첩 완충액 (refolding buffer: 0.55 M 구아니딘 [Guanidine] HCl, 0.88 M L-아르기닌, 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NDSB, 1 mM 산화형 글루타치온 [glutathione oxidized] 및 1 mM 환원형 글루타치온 [glutathione reduced])을 이용하여 4℃에서 72 시간 이상 투석하여 변성제를 제거함으로써 재조합 단백질이 재활성, 즉 원상화되도록 하였다. 이때 24 시간 마다 용기 내 재중첩 완충액을 교환해주었다. 이후 활성화된 재조합 단백질을 세포 배양용 배지인 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 대해 투석막 (Snakeskin pleated, PIERCE)을 사용하여 4℃에서 9 시간 동안 교반하면서 투석하였다. 이때 3 시간 마다 용기 내 DMEM 을 교환해주었다. 상기 원상화 과정에 의해 활성 형태로 전환된 세포투과성 p27 재조합 단백질을 이후의 실험에 사용하였다.First, the purified recombinant protein was refolding buffer (0.55 M guanidine HCl, 0.88 M L-arginine, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NDSB, 1 mM oxidized). Glutathione oxidized and 1 mM reduced glutathione reduced) were dialyzed at 4 ° C. for at least 72 hours to remove the denaturant so that the recombinant protein was reactivated, i.e., reconstituted. At this time, the re overlapping buffer in the container was exchanged every 24 hours. The activated recombinant protein was then dialyzed while stirring at 4 ° C. for 9 hours using a dialysis membrane (Snakeskin pleated, PIERCE) against DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) with 1% penicillin / streptomycin, a medium for cell culture. At this time, DMEM was exchanged in the container every three hours. The cell-permeable p27 recombinant protein converted to the active form by the reprogramming process was used in subsequent experiments.

실시예 6: 세포투과성 실험Example 6: Cell Permeability Experiment

＜6-1＞ 유세포 분석 (flow cytometry)<6-1> flow cytometry

본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포투과성을 정량적으로 검증하기 위해, 하기와 같이 포유동물 세포에서 각각의 재조합 단백질의 세포내 유입을 FACS (fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다.In order to quantitatively verify the cell permeability of the cell-permeable p27 recombinant protein according to the present invention, the intracellular influx of each recombinant protein in mammalian cells was analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) as follows.

먼저, 상기에서 가용성 형태로 분리, 정제된 세포투과성 p27 재조합 단백질을 FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe)를 이용하여 형광표지하였다. 2 내지 20 mg의 재조합 단백질에 333 mg/㎖ 농도의 FITC 1 ㎕를 혼합한 후 빛을 피해 상온에서 2 시간 동안 진탕하면서 결합시켰다. 형광으로 표지된 세포투과성 p27 재조합 단백질은 4℃에서 1 일간 DMEM 배지에 대해 투석하여 표지되지 않은 FITC 를 제거하였고, 이로부터 회수된 재조합 단백질은 브래드포드 (Bradford) 단백질 정량법으로 그 농도를 분석하였다. 그 결과 각각의 재조합 단백질의 농도는 약 1 ㎍/㎕로 측정되었다.First, the cell-permeable p27 recombinant protein isolated and purified in soluble form was fluorescently labeled using FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe). 1 μl of FITC at a concentration of 333 mg / ml was mixed with 2 to 20 mg of the recombinant protein, followed by binding for 2 hours at room temperature, avoiding light. Fluorescently labeled cell permeable p27 recombinant protein was dialyzed against DMEM medium at 4 ° C. for 1 day to remove unlabeled FITC, and the recombinant protein recovered therefrom was analyzed for its concentration by Bradford protein quantitation. As a result, the concentration of each recombinant protein was measured at about 1 μg / μl.

한편, 마우스의 대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)를 10％ 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin, WelGENE) 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지 (WelGENE)에 접종하고 37℃, 5％ CO2 의 습윤 조건 하에서 배양하였다.Meanwhile, RAW 264.7 cells derived from macrophages of mice (Korea Cell Line Bank, Seoul, South Korea) were injected with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin (WelGENE) 500 mg. / MEM was inoculated in DMEM medium (WelGENE) and incubated under wet conditions of 37 ° C, 5% CO 2 .

배양 후, 상기에서 준비된 FITC-표지 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27, Hp27M1, HM1p27M1, HM2p27, Hp27M2 및 HM2p27M2) 각각을 10 μM 농도로 RAW 264.7 세포에 처리한 후 37℃에서 1 시간 더 배양하였다. 이어서, 재조합 단백질이 처리된 RAW 264.7 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 FITC 를 제거하기 위해 트립신/EDTA (T/E, Invitrogen)를 처리하고, 저온의 PBS (phosphate buffered saline)로 3 회 세척하였다. 준비된 세포에 대해 셀퀘스트 프로 세포측정 분석 소프트웨어 (CellQuest Pro cytometric analysis software)를 이용한 FACScan 유세포 분석기 (flow cytometry, Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 이때 각 시료의 세포 농도는 1×104 세포/㎕이었고, 분석 실험은 2 회 이상 수행하였다. 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포투과성은 MTD 를 포함하지 않는 대조군 단백질 (Hp27)의 세포투과성과 비교하여 결정하였다.After incubation, each of the FITC-labeled cell permeable p27 recombinant proteins (HM 1 p27, Hp27M 1 , HM 1 p27M 1 , HM 2 p27, Hp27M 2 and HM 2 p27M 2 ) prepared above was treated to RAW 264.7 cells at a concentration of 10 μM. After incubation for 1 hour at 37 ℃. Subsequently, trypsin / EDTA (T / E, Invitrogen) was treated to remove free FITC exposed to the cell membrane of recombinant 264.7 cells treated with recombinant protein, and washed three times with cold PBS (phosphate buffered saline). Prepared cells were analyzed by FACScan flow cytometry (Becton Dickinson, Calif.) Using CellQuest Pro cytometric analysis software. At this time, the cell concentration of each sample was 1 × 10 4 cells / μl, and the assay was performed two or more times. The cell permeability of the cell permeable p27 recombinant protein according to the present invention was determined in comparison with the cell permeability of the control protein (Hp27) not containing MTD.

그 결과, 도 8a 및 8b 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 모든 세포투과성 p27 재조합 단백질은 대조군에 비하여 높은 수준의 원형질막 투과 능력을 나타냄을 확인하였다. 도 8a 및 8b 에서 회색의 곡면은 세포 단독, 검은색 곡선은 FITC 단독, 파랑색 곡선은 MTD 가 융합되지 않은 대조군 (Hp27), 적색 곡선은 세포투과성 재조합 단백질 HM1p27, Hp27M1, HM1p27M1, HM2p27, Hp27M2 및 HM2p27M2 을 나타낸다.As a result, as shown in Figures 8a and 8b , it was confirmed that all cell permeable p27 recombinant protein according to the present invention exhibits a high level of plasma membrane permeability compared to the control. In FIGS. 8A and 8B , gray curved cells are cell alone, black curves are FITC alone, and blue curves are control groups without MTD fusion (Hp27), and red curves are cell permeable recombinant proteins HM 1 p27, Hp27M 1 , HM 1 p27M 1 , HM 2 p27, Hp27M 2 and HM 2 p27M 2 are shown.

＜6-2＞ 동초점 레이저 주사현미경 관찰 I<6-2> Confocal laser scanning microscope observation I

상기 실시예 ＜6-1＞에서 유세포 분석으로 1 차적으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포 내 위치를 시각적으로 확인하기 위하여, 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)에 FITC-표지된 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27, Hp27M1, HM1p27M1, HM2p27, Hp27M2 및 HM2p27M2)을 10 μM 의 농도로 처리하고 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사현미경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다. 사용된 NIH3T3 세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (8-well chamber slide, LabTek, Nalgen Nunc)에서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, NIH3T3 세포는 10％ FBS 및 5％ 페니실린/스트렙토마이신 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 무혈청 DMEM, FITC 함유 무혈청 DMEM, 또는 FITC-표지된 재조합 단백질 각각을 10 μM 로 함유하는 무혈청 DMEM 으로 37℃, 5％ CO2 하에서 1 시간 동안 처리하였다. 1 시간 경과 후, 세포를 4％ 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 실온에서 20 분간 처리하여 고정시켰다.In order to visually confirm the intracellular location of the cell permeable p27 recombinant protein of the present invention first confirmed cell permeability by flow cytometry in Example <6-1>, NIH3T3 cells derived from mouse fibroblasts (Korea Cell line bank, Seoul, South Korea) was treated with FITC-labeled cell permeable p27 recombinant protein (HM 1 p27, Hp27M 1 , HM 1 p27M 1 , HM 2 p27, Hp27M 2 and HM 2 p27M 2 ) at a concentration of 10 μM After incubation for 1 hour at 37 ℃ was observed by confocal laser scanning microscopy (confocal laser scanning microscopy). The NIH3T3 cells used were incubated for 24 hours in 8-well chamber slides (LabTek, Nalgen Nunc). At this time, NIH3T3 cells were cultured in DMEM medium containing 500 mg / ml of 10% FBS and 5% penicillin / streptomycin. It washed three times and the cultured cells with PBS then serum-free DMEM, FITC-containing serum-free DMEM, or FITC- 1 hour labeled recombinant proteins, respectively under the serum-free DMEM 37 ℃, 5% CO 2 containing by 10 μM Treated during. After 1 hour, cells were fixed by treating with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature.

상기에서 고정된 세포는 MTD 의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 형광 염색하는 PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) 대조염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 1 ㎍/㎖ 농도로 5 분간 PI 로 염색한 후, 세포를 PBS 로 3 회 세척하였다. 세포 내 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 10 ㎕의 DABCO (Fluca) 함유 폴리비닐 알코올 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후에 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다. 이때 동초점 레이저 주사현미경은 노르마스키 필터 (normaski filter)를 이용하여 세포의 원형, FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였고, FITC 는 488 nm에서 여기되고 530 nm 대역통과 필터 (bandpass filter)로 검출되었다.The fixed cells were confirmed to be delivered to the nucleus and permeable to the nucleus through PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) counterstaining to fluoresce the nucleus so as to easily distinguish the MTD intracellular delivery site. After staining with PI for 5 min at a concentration of 1 μg / ml, the cells were washed three times with PBS. In order to preserve the fluorescent label of the intracellular recombinant protein, 10 μl of DABCO (Fluca) -containing polyvinyl alcohol overlapping medium was added onto the slide and observed 15 minutes later by confocal laser scanning microscope. At this time, the confocal laser scanning microscope observed the prototype, FITC fluorescence and PI fluorescence of cells using a Normaski filter, and FITC was excited at 488 nm and detected with a 530 nm bandpass filter.

그 결과, 도 9a 내지 9b 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 FITC-표지된 세포투과성 p27 재조합 단백질은 세포 단독, FITC 단독 및 MTD 부재 대조군에 비하여 핵 내에 광범위하게 분포하고 있음을 알 수 있다. JO-58 MTD 또는 JO-68 MTD 에 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포내 핵 국소화는 상기 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과에 비례하는 것으로, 상기 결과는 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포투과성을 다시 한번 입증하는 것이다.As a result, as shown in Figures 9a to 9b , it can be seen that the FITC-labeled cell permeable p27 recombinant protein according to the present invention is more widely distributed in the nucleus than the cells alone, FITC alone and MTD-free control. Intracellular nuclear localization of cell permeable p27 recombinant protein fused to JO-58 MTD or JO-68 MTD is proportional to the relative cell permeability results of the flow cytometry, which results in cell permeability of the cell permeable p27 recombinant protein of the present invention. Will prove once again.

실시예 7: 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포 내 기능Example 7: Intracellular Function of Cell Permeable p27 Recombinant Protein

＜7-1＞ 웨스턴 블롯팅<7-1> Western blotting

세포투과성이 입증된 p27 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 두 종류의 암 세포주를 대상으로 하기와 같이 웨스턴 블롯팅 (western blotting) 분석을 수행하였다. 본 실험에 이용된 인간 결장암 세포주 HCT-116 및 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 은 한국세포주은행 (서울, 대한민국)에서 구입하였다. 상기 세포주들은 RPMI 1640 배지 (L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES 및 25 mM NaHCO3 89.3％, 열 불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.Western blotting analysis was performed on two types of cancer cell lines to confirm the intracellular function of the p27 recombinant protein demonstrated cell permeability. Human colon cancer cell line HCT-116 and human breast cancer cell line MDA-MB-231 used in this experiment were purchased from the Korea Cell Line Bank (Seoul, South Korea). The cell lines were 5% CO 2 titrated using RPMI 1640 medium (L-glutamine 300 mg / L, 25 mM HEPES and 25 mM NaHCO 3 89.3%, heat inactivated fetal bovine serum 9.8%, streptomycin / penicillin 0.9%). Cultured in a 37 ℃ incubator supplied.

6-웰 플레이트에 한 웰당 2 ㎖의 FBS 함유 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 HCT-116 및 MDA-MB-231 세포들을 각각 5×106 세포/㎖의 농도로 접종하였다. 상기 웰 플레이트를 37℃에서 1 일간 배양하여 세포들이 웰 플레이트에 부착하면서 성장하도록 하였다. 배지를 제거한 후 웰 플레이트에 부착된 세포를 저온의 PBS 로 세척하였다. 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 및 대조군으로서 MTD 가 융합되지 않은 p27 단백질 (Hp27)을 각각 20 μM 농도로 각 웰에 500 ㎕씩 처리한 후, 2 시간 동안 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 2 시간 처리 후, 세포를 PBS 로 2 회 세척하고 혈청 존재 하에서 동일한 조건으로 9 시간 동안 배양하였다.2 ml of FBS containing RPMI 1640 medium per well was added to a 6-well plate and the HCT-116 and MDA-MB-231 cells cultured above were inoculated at a concentration of 5 × 10 6 cells / ml, respectively. The well plate was incubated at 37 ° C. for 1 day to allow cells to grow while adhering to the well plate. After removing the medium, the cells attached to the well plate were washed with cold PBS. After treatment with the cell permeable p27 recombinant protein according to the present invention and 500 μl of MTD-unfused p27 protein (Hp27) as a control at 20 μM concentration, respectively, and then supplied with 5% CO 2 for 2 hours The reaction was carried out in the incubator. After 2 hours treatment, cells were washed twice with PBS and incubated for 9 hours under the same conditions in the presence of serum.

배양이 종결된 후, 세포를 100 ㎕의 용해 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.2, 1％ 트리톤-X, 10％ 글리세롤 및 단백분해효소 억제제 [proteinase inhibitor])을 이용하여 얼음에서 30 분간 분쇄하여 수집하고, 획득된 세포 용해물 (cell lysate)을 100℃에서 10 분간 가열한 후 상기 재조합 단백질을 20 μM 농도로 SDS-PAGE 로우딩 완충액 (loading buffer)에 첨가하여 세포 용해물 시료를 제조하고 이를 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.After incubation, cells were collected by grinding for 30 minutes on ice using 100 μl of lysis buffer (20 mM HEPES, pH 7.2, 1% Triton-X, 10% glycerol and proteinase inhibitor). The obtained cell lysate was heated at 100 ° C. for 10 minutes, and then the recombinant protein was added to the SDS-PAGE loading buffer at a concentration of 20 μM to prepare a cell lysate sample. Store at -20 ° C until now.

웨스턴 블롯팅 분석을 위하여, p21Wafl/Cipl (21 kDa, Cell Signaling Technology), 포스포-MEK1/2 (phospho-MEK1/2, Ser217/221, 45 kDa, Cell Signaling Technology), 포스포-Erk (Thr202/Tyr204, 42/44 kDa, Cell Signaling Technology) 및 절단된 캐스페이즈-3 (cleaved caspase-3, Asp175, 17 kDa, 19 kDa, Cell Signaling Technology)를 일차항체로 사용하였고, 항-마우스 IgG-HRP (goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) 및 항-토끼 IgG-HRP (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology)를 이차항체로 사용하였다. 상기에서 정량된 세포 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 100 V 로 1.5 시간 동안 전기영동을 수행한 후, PVDF 막으로 100 V 에서 1.5 시간 동안 전사시켰다. 전사시킨 막은 항체와의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 TBS/T 완충액 (10 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05％ 트윈 20)에 용해시킨 5％ (w/v) 분유 (powdered milk)에서 1 시간 동안 블로킹 (blocking) 처리를 한 후, 상기 일차항체 각각을 첨가하고 4℃에서 1 일간 반응시켰다. 이 후 막을 TBS/T 완충액으로 5 회 세척한 후 이차항체를 첨가하여 실온에서 1 시간 정도 반응시키고, TBS/T 완충액으로 5 회 세척을 반복하였고, 화학발광 검출용 ECL (enhanced chemiluminescence, GE Healthcare Amersham UK) 시약을 이용하여 항원을 검출하고 분석하였다.For western blotting analysis, p21Wafl / Cipl (21 kDa, Cell Signaling Technology), phospho-MEK1 / 2 (phospho-MEK1 / 2, Ser217 / 221, 45 kDa, Cell Signaling Technology), phospho-Erk (Thr202 / Tyr204, 42/44 kDa, Cell Signaling Technology) and cleaved caspase-3 (Asp175, 17 kDa, 19 kDa, Cell Signaling Technology) were used as primary antibodies and anti-mouse IgG-HRP (goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) and anti-rabbit IgG-HRP (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) were used as secondary antibodies. The cell lysates quantified above were subjected to electrophoresis for 1.5 hours at 100 V on an SDS-PAGE gel, and then transferred at 100 V for 1.5 hours with PVDF membrane. The transcribed membrane was a 5% (w / v) powdered milk dissolved in TBS / T buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) to prevent nonspecific adsorption with the antibody. After blocking for 1 hour at, each of the primary antibodies was added and reacted at 4 ° C. for 1 day. Thereafter, the membrane was washed five times with TBS / T buffer, and then the reaction was performed at room temperature for 1 hour with the addition of a secondary antibody. The washing was repeated five times with TBS / T buffer, followed by ECL (enhanced chemiluminescence, GE Healthcare Amersham for detecting chemiluminescence). UK) reagent was used to detect and analyze the antigen.

도 10a 및 10b 에 나타난 바와 같이, p27 로 인해 세포주기 정지 (cell cycle arrest)를 유발하는 p21 의 발현과 세포사멸의 마커인 절단된 캐스페이즈-3 의 발현은 증가한 반면, 종양의 세포주기를 활성화시키는 MEK 의 인산화 (P-MEK)와 Erk 의 인산화 (P-Erk)는 감소하였다. 특히, JO-58 MTD 가 융합된 HM1p27 와 HM1p27M1 재조합 단백질이 배양된 암 세포주의 세포주기를 저해하여 종양형성을 감소시킴으로써 월등한 항암활성을 나타냄을 확인하였다.As shown in FIGS. 10A and 10B , p27 increased the expression of p21 causing cell cycle arrest and the expression of cleaved Caspase-3, a marker of apoptosis, while activating the cell cycle of the tumor. The phosphorylation of MEK (P-MEK) and Erk phosphorylation (P-Erk) were decreased. In particular, it was confirmed that HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 recombinant protein fused with JO-58 MTD showed superior anticancer activity by inhibiting the cell cycle of the cultured cancer cell line and reducing tumor formation.

＜7-2＞ 세포증식 분석 I<7-2> Cell proliferation assay I

세포투과성이 입증된 본 발명의 p27 재조합 단백질이 암세포의 성장과 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이 세포증식 분석을 수행하였다.In order to confirm the effect of p27 recombinant protein of the present invention, which has demonstrated cell permeability, on the growth and proliferation of cancer cells, cell proliferation analysis was performed as follows.

인간 결장암 세포주 HCT-116 (한국세포주은행)을 RPMI 1640 배지 (L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 89.3％, 열불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종한 후 37℃에서 1 일간 배양하였다. 각 웰에 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27, Hp27M1, HM1p27M1, HM2p27, Hp27M2, 및 HM2p27M2)을 각각 10 μM 농도로 처리한 후, 혈청이 존재하는 RPMI 1640 배지로 교환하고 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 배양이 종결된 후 암세포를 포름알데하이드 (formaldehyde)로 고정시킨 후 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하였다.Human colon cancer cell line HCT-116 (Korea Cell Line Bank) was run on RPMI 1640 medium (L-glutamine 300 mg / L, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3 89.3%, heat-inactivated fetal bovine serum 9.8%, streptomycin / penicillin 0.9%). Incubated in a 37 ℃ incubator supplied with 5% CO 2 . 2 ml of RPMI 1640 medium per well was added to a 6-well plate and the cells cultured therein were inoculated and then incubated at 37 ° C. for 1 day. Each well was treated with a cell permeable p27 recombinant protein of the present invention (HM 1 p27, Hp27M 1 , HM 1 p27M 1 , HM 2 p27, Hp27M 2 , and HM 2 p27M 2 ), respectively, and then serum was present. Was replaced with RPMI 1640 medium and incubated at 37 ° C. for 16 hours. After the incubation was terminated, the cancer cells were fixed with formaldehyde and stained with crystal violet.

그 결과, 도 11a 및 11b 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질, 특히 JO-58 MTD 가 결합된 HM1p27, Hp27M1 및 HM1p27M1 로 처리된 경우에 대조군 단백질 (Hp27)에 비하여 암세포의 증식이 현저히 감소한 것으로 나타났다. 이로부터 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질에 의해 암세포의 증식능이 효과적으로 억제될 수 있음을 in vitro 에서 확인하였다.As a result, as shown in Figs. 11a and 11b , the control protein (Hp27) when treated with the cell-permeable p27 recombinant protein of the present invention, in particular HM 1 p27, Hp27M 1 and HM 1 p27M 1 bound to JO-58 MTD Compared to that, the proliferation of cancer cells was significantly reduced. From this, it was confirmed in vitro that the proliferative ability of cancer cells can be effectively inhibited by the cell permeable p27 recombinant protein of the present invention.

＜7-3＞ 세포증식 분석 II<7-3> Cell Proliferation Assay II

세포주와 배양시간을 달리한 것을 제외하고는, 상기 실시예 ＜7-2＞와 동일한 방법으로 세포증식 분석을 수행하였다.Cell proliferation analysis was performed in the same manner as in Example <7-2>, except that the cell line and the incubation time were different.

구체적으로, 인간 유방암 세포주 MCF7 (한국세포주은행)을 RPMI 1640 배지 (L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 89.3％, 열불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종한 후 37℃에서 1 일간 배양하였다. 각 웰에 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27, Hp27M1, HM1p27M1, HM2p27, Hp27M2, 및 HM2p27M2)을 각각 10 μM 농도로 3 일간 매일 처리하였다. 배양이 종결된 후 암세포를 포름알데하이드로 고정시킨 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.Specifically, human breast cancer cell line MCF7 (Korea Cell Line Bank) was prepared using RPMI 1640 medium (L-glutamine 300 mg / L, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3 89.3%, heat-inactivated fetal bovine serum 9.8%, streptomycin / penicillin 0.9% ) Was incubated in a 37 ° C. incubator fed with 5% CO 2 . 2 ml of RPMI 1640 medium per well was added to a 6-well plate and the cells cultured therein were inoculated and then incubated at 37 ° C. for 1 day. Each well was treated with cell permeable p27 recombinant protein (HM 1 p27, Hp27M 1 , HM 1 p27M 1 , HM 2 p27, Hp27M 2 , and HM 2 p27M 2 ) each at a concentration of 10 μM each for 3 days. After the incubation was terminated, the cancer cells were fixed with formaldehyde and stained with crystal violet.

그 결과, 도 12a 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질, 특히 JO-58 MTD 가 결합된 HM1p27, Hp27M1 및 HM1p27M1 로 처리된 경우에 대조군 단백질 (Hp27)에 비하여 암세포의 증식이 현저히 감소한 것으로 나타났다.As a result, as shown in Figure 12a , the cell-permeable p27 recombinant protein of the present invention, in particular compared to the control protein (Hp27) when treated with HM 1 p27, Hp27M 1 and HM 1 p27M 1 bound JO-58 MTD The proliferation of cancer cells was found to be markedly reduced.

또한, 상기와 같이 세포가 배양된 6-웰 플레이트의 각 웰에 JO-58 MTD 가 결합된 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27, Hp27M1 및 HM1p27M1 을 각각 10 μM 농도로 처리하고 37℃에서 1 일간 배양한 후, 이 세포를 PBS 로 2 회 세척하고 혈청 존재 하에서 동일한 조건으로 2 일간 배양하였다. 배양이 종결된 후 암세포를 포름알데하이드로 고정시킨 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.In addition, the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27, Hp27M 1 and HM 1 p27M 1 bound to the JO-58 MTD were treated to each well of the 6-well plate in which the cells were cultured, respectively, at a concentration of 10 μM, and 37 ° C. After 1 day of incubation, the cells were washed twice with PBS and incubated for 2 days under the same conditions in the presence of serum. After the incubation was terminated, the cancer cells were fixed with formaldehyde and stained with crystal violet.

그 결과, 도 12b 에 나타난 바와 같이, JO-58 MTD 가 결합된 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27, Hp27M1 및 HM1p27M1 로 처리된 경우에 대조군 단백질 (Hp27)에 비하여 암세포의 증식이 현저히 감소한 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG . 12B , the proliferation of cancer cells was significantly higher than that of the control protein (Hp27) when treated with the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27, Hp27M 1 and HM 1 p27M 1 bound to the JO-58 MTD. It was found to decrease.

상기 결과들로부터 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질에 의해 암세포의 증식능이 효과적으로 억제될 수 있음을 in vitro 에서 확인하였다.From the above results, it was confirmed in vitro that the proliferative ability of cancer cells can be effectively inhibited by the cell permeable p27 recombinant protein of the present invention.

＜7-4＞ 웨스턴 블롯팅을 통한 아폽토시스 유도효과 확인<7-4> Confirmation of Apoptosis Induction Effect by Western Blotting

세포투과성이 입증된 p27 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 웨스턴 블롯팅을 통하여 세포주기 억제 및 아폽토시스 (apoptosis) 유도효과를 조사하였다.In order to confirm the intracellular function of p27 recombinant protein demonstrated cell permeability, the effects of cell cycle inhibition and apoptosis were investigated through western blotting as follows.

인간 결장암 세포주 HCT-116 (한국세포주은행)는 RPMI 1640 배지 (L-글루타민 300 ㎎/ℓ, 25 mM HEPES 및 25 mM NaHCO3 89.3％, 열 불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.Human colon cancer cell line HCT-116 (Korea Cell Line Bank) was prepared using RPMI 1640 medium (L-glutamine 300 mg / L, 25 mM HEPES and 25 mM NaHCO 3 89.3%, heat inactivated fetal bovine serum 9.8%, streptomycin / penicillin 0.9% ) Was incubated in a 37 ° C. incubator fed with 5% CO 2 .

6-웰 플레이트에 한 웰당 2 ㎖의 FBS 함유 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포 HCT-116 을 각각 5×106 세포/㎖의 농도로 접종하였다. 상기 웰 플레이트를 37℃에서 1 일간 배양하여 세포들이 웰 플레이트에 부착하면서 성장하도록 하였다. 배지를 제거한 후 웰 플레이트에 부착된 세포를 저온의 PBS 로 세척하였다. 본 발명에 따른 JO-58 MTD 가 결합된 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27, Hp27M1 및 HM1p27M1)과 MTD 가 융합되지 않은 p27 단백질 (Hp27)을 각각 20 μM 농도로 각 웰에 처리한 후, 2 시간 동안 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 2 시간 처리 후, 세포를 PBS 로 2 회 세척하고 혈청 존재 하에서 동일한 조건으로 9 시간 동안 배양하였다.2 ml of FBS containing RPMI 1640 medium per well was added to a 6-well plate, and the cells HCT-116 cultured above were inoculated at a concentration of 5 × 10 6 cells / ml each. The well plate was incubated at 37 ° C. for 1 day to allow cells to grow while adhering to the well plate. After removing the medium, the cells attached to the well plate were washed with cold PBS. JO-58 MTD-coupled cell permeable p27 recombinant proteins (HM 1 p27, Hp27M 1 and HM 1 p27M 1 ) and MT27-unfused p27 protein (Hp27) were treated in each well at a concentration of 20 μM, respectively. The reaction was then carried out in a 37 ° C. incubator fed with 5% CO 2 for 2 hours. After 2 hours treatment, cells were washed twice with PBS and incubated for 9 hours under the same conditions in the presence of serum.

배양이 종결된 후, 세포를 100 ㎕의 용해 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.2, 1％ 트리톤-X, 10％ 글리세롤 및 단백분해효소 억제제 [proteinase inhibitor])을 이용하여 얼음에서 30 분간 분쇄하여 수집하고, 획득된 세포 용해물 (cell lysate)을 100℃에서 10 분간 가열한 후 상기 재조합 단백질을 20 μM 농도로 SDS-PAGE 로우딩 완충액 (loading buffer)에 첨가하여 세포 용해물 시료를 제조하고 이를 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.After incubation, cells were collected by grinding for 30 minutes on ice using 100 μl of lysis buffer (20 mM HEPES, pH 7.2, 1% Triton-X, 10% glycerol and proteinase inhibitor). The obtained cell lysate was heated at 100 ° C. for 10 minutes, and then the recombinant protein was added to the SDS-PAGE loading buffer at a concentration of 20 μM to prepare a cell lysate sample. Store at -20 ° C until now.

웨스턴 블롯팅 분석을 위하여, 캐스페이즈-7 (35 kDa, Cell Signaling Technology) 및 절단된 캐스페이즈-7 (Asp198, 20 kDa, Cell Signaling Technology)을 일차항체로 사용하였고, 항-마우스 IgG-HRP (goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) 및 항-토끼 IgG-HRP (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology)를 이차항체로 사용하였다. 상기에서 정량된 세포 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 100 V 로 1.5 시간 동안 전기영동을 수행한 후, PVDF 막으로 100 V 에서 1.5 시간 동안 전사시켰다. 전사시킨 막은 항체와의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 TBS/T 완충액 (10 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05％ 트윈 20)에 용해시킨 5％ (w/v) 분유 (powdered milk)에서 1 시간 동안 블로킹 (blocking) 처리를 한 후, 상기 일차항체 각각을 첨가하고 4℃에서 1 일간 반응시켰다. 이 후 막을 TBS/T 완충액으로 5 회 세척한 후 이차항체를 첨가하여 실온에서 1 시간 정도 반응시키고, TBS/T 완충액으로 5 회 세척을 반복하였고, 화학발광 검출용 ECL (enhanced chemiluminescence, GE Healthcare Amersham UK) 시약을 이용하여 항원을 검출하고 분석하였다.For western blotting analysis, caspase-7 (35 kDa, Cell Signaling Technology) and cleaved caspase-7 (Asp198, 20 kDa, Cell Signaling Technology) were used as primary antibodies and anti-mouse IgG-HRP ( Goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) and anti-rabbit IgG-HRP (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) were used as secondary antibodies. The cell lysates quantified above were subjected to electrophoresis for 1.5 hours at 100 V on an SDS-PAGE gel, and then transferred at 100 V for 1.5 hours with PVDF membrane. The transcribed membrane was a 5% (w / v) powdered milk dissolved in TBS / T buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) to prevent nonspecific adsorption with the antibody. After blocking for 1 hour at, each of the primary antibodies was added and reacted at 4 ° C. for 1 day. Thereafter, the membrane was washed five times with TBS / T buffer, and then the reaction was performed at room temperature for 1 hour with the addition of a secondary antibody. The washing was repeated five times with TBS / T buffer, followed by ECL for enhanced chemiluminescence (GE Healthcare Amersham) UK) reagent was used to detect and analyze the antigen.

도 13 에 나타난 바와 같이, JO-58 MTD 가 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 및 HM1p27M1 이 배양된 암세포에서 세포사멸의 마커인 캐스페이즈-7 을 활성화시켜 절단된 캐스페이즈-7 의 발현을 증가시킴으로써 효과적으로 세포주기를 억제하고 아폽토시스를 유도할 수 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 13 , caspase-7 cleaved by activating caspase-7, a marker of apoptosis in cancer cells cultured with the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 fused with JO-58 MTD It was confirmed that by increasing the expression of can effectively inhibit the cell cycle and induce apoptosis.

＜7-5＞ 아넥신-V 를 이용한 아폽토시스 유도효과<7-5> Apoptosis Induction Effect Using Annexin-V

세포투과성이 입증된 p27 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 아넥신-V (Annexin-V)를 이용하여 재조합 단백질의 아폽토시스 (apoptosis) 유도효과를 조사하였다.In order to confirm the intracellular function of p27 recombinant protein demonstrated cell permeability, the effect of inducing apoptosis of the recombinant protein was examined using Annexin-V as follows.

유방암 세포주 MDA-MB-231 (한국세포주은행)을 RPMI 1640 배지 (L-글루타민 300 mg/ℓ, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 89.3％, 열불활성화 우태아 혈청 9.8％, 스트렙토마이신/페니실린 0.9％)를 이용하여 5％ CO2 가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 ㎖의 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종한 후 37℃에서 1 일간 배양하였다. 각 웰에 재조합 단백질로서 JO-58 MTD 가 융합된 HM1p27 및 HM1p27M1 과, MTD 가 융합되지 않은 Hp27 을 각각 20 μM 농도로 처리한 후, 2 시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 배양 시간 경과 후 세포를 저온의 PBS 로 2 회 세척한 후 세포를 1× 결합 완충액 (binding buffer)에 1×106 세포/㎖ 농도로 부유시켰다. 세포 부유액 100 ㎖를 EP-튜브에 옮기고, 여기에 5 ㎖의 아넥신-V 와 5 ㎖의 PI 를 첨가한 후 15 분간 상온에서 배양하였다. 이어서 상기 EP-튜브에 400 ㎖의 1× 결합 완충액을 처리한 후 아폽토시스 정도를 유세포 분석기 (flow cytometry)를 이용하여 정량적으로 분석하였다.Breast cancer cell line MDA-MB-231 (Korea Cell Line Bank) was prepared using RPMI 1640 medium (L-glutamine 300 mg / L, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO 3 89.3%, heat-inactivated fetal bovine serum 9.8%, streptomycin / penicillin 0.9% ) Was incubated in a 37 ° C. incubator fed with 5% CO 2 . 2 ml of RPMI 1640 medium per well was added to a 6-well plate and the cells cultured therein were inoculated and then incubated at 37 ° C. for 1 day. Each well was treated with HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 fused with JO-58 MTD as a recombinant protein and Hp27 unfused with MTD at 20 μM concentration, and then cultured in serum-free medium for 2 hours. After the incubation time, the cells were washed twice with cold PBS, and the cells were suspended in a concentration of 1 × 10 6 cells / ml in 1 × binding buffer. 100 ml of the cell suspension was transferred to an EP-tube, and 5 ml of Annexin-V and 5 ml of PI were added thereto, followed by incubation at room temperature for 15 minutes. The EP-tubes were then treated with 400 ml of 1 × binding buffer and the degree of apoptosis was quantitatively analyzed using flow cytometry.

그 결과, 도 14 에 나타난 바와 같이, 무처리군 및 MTD 가 융합되지 않은 대조군 단백질 (Hp27) 처리군에 비해 MTD 가 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질 처리군 (HM3p18)에서 높은 비율로 아폽토시스가 유도됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG . 14 , apoptosis was increased at a high rate in the MTD-fused cell-permeable p27 recombinant protein-treated group (HM 3 p18) compared to the untreated group and the MTD-unfused control protein (Hp27). It was confirmed that induced.

실시예 8: 세포투과성 p27 재조합 단백질의 생체 내 기능-피하 주사Example 8: In Vivo Function-Subcutaneous Injection of Cell Permeable p27 Recombinant Protein

＜8-1＞ 투여 기간 중의 항암효과<8-1> Anticancer effect during the administration period

세포투과성이 입증된 p27 재조합 단백질의 생체 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 동물모델을 이용하여 항암효과를 검증하였다.In order to confirm the in vivo function of p27 recombinant protein demonstrated cell permeability, the anticancer effect was verified using the animal model as follows.

본 실험에서는 동물모델로 MHC (major histocompatibility complex)에 대한 돌연변이로 면역력이 결핍된 7 주령의 누드마우스 (Balb/c nu/nu mice, 중앙실험동물, 서울)를 사용하였다. 상기 마우스의 오른쪽 다리에 HCT-116 세포 (한국세포주은행)를 1×107 세포/㎖ 농도로 주사기 (omnican, Germany, B.BRAUN)를 사용하여 피하 주사 (subcutaneous injection)하였다. 버니어 캘리퍼 (vernier caliper)를 이용하여 종양 크기 (너비 2×길이/2)가 50 내지 60 ㎟으로 측정된 날부터 1 ㎍/㎕ 농도의 세포투과성 p27 재조합 단백질 HM1p27 (그룹 4) 및 HM1p27M1 (그룹 5)을 각각 300 ㎍씩 9 일간 피하주사하였다. 대조군으로 담체 (RPMI 1640 배지, 그룹 1), 형광단백질 EGFP 에 JO-58 MTD 가 융합된 JO-58 MTD-EGFP 단백질 (그룹 2), 그리고 MTD 가 융합되지 않은 Hp27 단백질 (그룹 3)을 각각 300 ㎕씩 9 일간 동일하게 피하 주사하였다. 단백질 처리 후 매일 각 그룹 마우스의 종양 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 15a 에 나타내었다.In this experiment, a 7-week-old nude mouse (Balb / c nu / nu mice, Central Experimental Animal, Seoul), which lacked immunity as a mutation for the MHC (major histocompatibility complex), was used as an animal model. HCT-116 cells (Korea Cell Line Bank) were subcutaneously injected into the right leg of the mouse using a syringe (omnican, Germany, B.BRAUN) at a concentration of 1 × 10 7 cells / ml. Cell permeable p27 recombinant protein HM 1 p27 (group 4) and HM 1 at a concentration of 1 μg / μl from the day when the tumor size (width 2 × length / 2) was measured from 50 to 60 mm 2 using a vernier caliper. p27M 1 (group 5) was injected subcutaneously for 9 days at 300 μg each. As a control, a carrier (RPMI 1640 medium, group 1), JO-58 MTD-EGFP protein (group 2) fused JO-58 MTD to fluorescent protein EGFP, and Hp27 protein (group 3) unfused MTD were 300 Μl was injected subcutaneously for 9 days. Tumor size of each group of mice was measured daily after protein treatment, and the results are shown in FIG. 15A .

도 15a 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질인 HM1p27 및 HM1p27M1 이 각각 처리된 마우스 (그룹 4 및 5)의 종양 크기는 대조군 (그룹 1, 2 및 3)에 비해 그 성장이 현저히 억제된 반면, 실험기간 동안 마우스의 몸무게는 대조군과 세포투과성 p27 재조합 단백질 처리군 모두에서 유의미한 변화를 나타내지 않았다.As shown in Figure 15a , the tumor size of mice (Groups 4 and 5) treated with the cell permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 according to the present invention was compared to the control group (Groups 1, 2 and 3) While the growth was significantly inhibited, the weight of the mice during the experiment did not show any significant changes in both the control group and the cell-permeable p27 recombinant protein treatment group.

＜8-2＞ 투여 기간 후의 항암효과<8-2> Anticancer effect after administration period

본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27, Hp27M1)의 투여 종료 후 체내 항암효과의 지속성을 확인하기 위하여, 상시 실시예 ＜8-1＞에서와 같이 9 일간의 단백질 투여 후에 각 그룹에서 2 마리의 마우스를 선정하여 담체와 모든 단백질 처리를 중지한 다음, 14 일간 종양 크기를 관찰하였다.In order to confirm the persistence of the anticancer effect in the body after the administration of the cell-permeable p27 recombinant protein (HM 1 p27, Hp27M 1 ) according to the present invention, each group was administered after 9 days of protein administration as in Example <8-1>. Two mice were selected from to stop the carrier and all protein treatment, and then tumor size was observed for 14 days.

그 결과, 도 15a 및 15b 에 나타난 바와 같이, 단백질 투여 종료 후 모든 그룹에서 종양 크기가 증가되는 양상을 보였는데, 단백질 처리기간 동안에 종양 크기가 상당히 억제되었던 HM1p27 처리군 (그룹 4)과 HM1p27M1 처리군 (그룹 5)에서는 종양 크기의 증가율이 다른 그룹에 비해 현저히 낮음을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 세포투과성 p27 재조합 단백질인 HM1p27 및 HM1p27M1 이 생체 내에서 안정적으로 그 유효성을 유지하며, 종양 형성 억제제로서 지속적으로 작용할 수 있음을 알 수 있다.As a result, as shown in Figures 15a and 15b , after the end of protein administration, the tumor size was increased in all groups, HM 1 p27 treatment group (Group 4) and HM which significantly suppressed the tumor size during the protein treatment period In the 1 p27M 1 treatment group (Group 5), it was confirmed that the increase rate of tumor size was significantly lower than that of other groups. From the above results, it can be seen that the cell-permeable p27 recombinant proteins HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 of the present invention can stably maintain their efficacy in vivo and continue to act as tumor formation inhibitors.

실시예 9: 세포투과성 p27 재조합 단백질의 생체 내 기능-정맥 주사Example 9: In Vivo Function-Intravenous Injection of Cell Permeable p27 Recombinant Protein

＜9-1＞ 투여 기간 중의 항암효과<9-1> Anticancer effect during the administration period

세포투과성이 입증된 p27 재조합 단백질의 생체 내 기능을 확인하기 위하여 상기 실시예 8 과 동일한 방법으로 MHC 에 대한 돌연변이로 면역력이 결핍된 7 주령의 누드마우스 (Balb/c nu/nu mice)의 오른쪽 다리에 인간 결장암 세포주인 HCT-116 세포를 1×107 세포/㎖ 농도로 주사기를 사용하여 피하 주사하였다. 4 마리를 한 그룹화하여 JO-58 MTD 가 융합된 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27 및 HM1p27M1, 200 ㎕) 및 대조군으로 담체 (RPMI 1640 배지, 200 ㎕)와 MTD 가 융합되지 않은 Hp27 단백질 (200 ㎍)을 투여하는 총 4 그룹으로 실험하였다. 버니어 캘리퍼를 이용해 종양 크기 (너비 2×길이/2)가 50 ㎣를 나타낼 때 1 ㎍/㎕의 농도로 각각의 단백질을 14 일간 정맥 주사하였다.Right leg of 7-week-old nude mouse (Balb / c nu / nu mice) deficient in immunity with a mutation for MHC in the same manner as in Example 8 above to confirm the in vivo function of p27 recombinant protein demonstrated cell permeability HCT-116 cells, a human colon cancer cell line, were injected subcutaneously using a syringe at a concentration of 1 × 10 7 cells / ml. Four groups were grouped into cell-permeable p27 recombinant protein (HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 , 200 μl) fused with JO-58 MTD and as a control, carrier (RPMI 1640 medium, 200 μl) and Hp27 without MTD fused Experiments were carried out with a total of four groups administered with protein (200 μg). Each protein was intravenously injected for 14 days using a vernier caliper at a concentration of 1 μg / μl when the tumor size (width 2 × length / 2) indicated 50 mm 3.

그 결과, 도 16a 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27 및 HM1p27M1)을 처리한 마우스 그룹에서 종양 크기의 성장이 대조군에 비해 현저히 억제되었다.As a result, as shown in Figure 16a , the growth of tumor size in the group of mice treated with the cell permeable p27 recombinant protein (HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 ) according to the present invention was significantly inhibited compared to the control group.

＜9-2＞ 투여 기간 후의 항암효과<9-2> Anticancer effect after administration period

세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM3p27)의 투여 종료 후 체내 항암효과의 지속성을 확인하기 위하여 상기 실시예 ＜9-1＞에서와 같이 14 일간의 단백질 투여 후 각 그룹에서 2 마리의 마우스를 선정하여 담체와 모든 단백질 처리를 중지한 다음, 14 일간 종양 크기를 관찰하였다.In order to confirm the persistence of the anticancer effect in the body after the administration of the cell permeable p27 recombinant protein (HM 3 p27), as shown in Example <9-1>, two mice were selected from each group after 14 days of protein administration. The carrier and all protein treatments were stopped and tumor size was observed for 14 days.

그 결과, 도 16a 에 나타난 바와 같이, 대조군 그룹 (담체)에서는 종양의 크기가 급격히 증가되는 양상을 보였으나, 세포투과성 p27 재조합 단백질 투여군 (HM1p27 및 HM1p27M1)에서는 종양 크기의 급격한 증가없이 비슷한 수준으로 유지되었다. 상기 결과는 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질이 생체 내로 투여되어 암세포의 세포주기를 완전히 재프로그래밍 (reprogramming)하고 암세포가 더 이상의 세포분열을 못하게 정상 세포화시키는 암의 세포주기 저해제로서 지속적으로 작용하고 있음을 나타내는 것이다.As a result, as shown in Figure 16a , the control group (carrier) showed a sharp increase in the size of the tumor, but in the cell-permeable p27 recombinant protein administration group (HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 ), the tumor size increased rapidly Was maintained at a similar level. The results indicate that the cell-permeable p27 recombinant protein according to the present invention is continuously administered as a cell cycle inhibitor of cancer which completely reprograms the cell cycle of cancer cells and normalizes the cancer cells to prevent further cell division. It is present.

실시예 10: 세포투과성 p27 재조합 단백질 투여 후 세포사멸 유도효과 분석Example 10 Analysis of Induction of Apoptosis After Administration of Cell Permeable p27 Recombinant Protein

세포투과성 p27 재조합 단백질의 투여 후 종양 조직 내에서 세포사멸 유도효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 9 의 마우스 동물 모델을 이용하여 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석을 수행하였다.Cell permeability p 27 was carried out after administration tumor tissue the embodiment in order to confirm the apoptosis inducing effect in Example 9 mouse animal model by TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) using the analysis of the recombinant protein.

구체적으로, 상기 실시예 9 에서와 같이 4 그룹의 마우스에 정맥주사로 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27 및 HM1p27M1)과 대조군으로 담체 및 Hp27 단백질을 14 일간 처리한 후 14 일간 무처리 관찰 기간을 거친 다음, 각 그룹의 마우스에서 유도된 종양 조직을 분리, 적출하였다. 적출된 종양 조직을 포르말린으로 고정하고 세척한 후 포매 센터 (embedding center)에서 62℃에 녹인 파라핀을 이용하여 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록을 마이크로톰을 이용하여 두께 4 ㎛로 박절하여 슬라이드에 부착시킨 후 자일렌 (xylene)을 5 분간 3 회 처리하여 파라핀을 제거하였다. 이어서 무수 에탄올로 5 분간 2 회, 90％, 80％ 및 70％ 에탄올로 각각 3 분간 처리하여 함수시키고 PBS 에서 5 분간 보관하였다. 이후 8 분간 0.1％ 구연산나트륨 (sodium citrate) 용액에 녹인 0.1％ 트리톤 (Trition®) X-100 용액으로 세포를 투과시킨 후 PBS 로 2 분간 2 회 세척하였다. TUNEL 반응 완충액 (50 ㎕, Roche, USA)을 상기 조직 슬라이드 위에 처리하고 1 시간 동안 37℃ 습윤 배양기에서 배양한 후, PBS 로 3 회 세척하고 형광 현미경 (fluorescence microscope)으로 관찰하였다.Specifically, as described in Example 9, four groups of mice were treated intravenously with cell permeable p27 recombinant proteins (HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 ) and the control and the carrier and Hp27 protein for 14 days, and then treated for 14 days. After the observation period, tumor tissues derived from each group of mice were isolated and extracted. The extracted tumor tissue was fixed with formalin and washed, and then paraffin blocks were prepared using paraffin dissolved at 62 ° C. in an embedding center. The prepared paraffin block was cut to 4 μm in thickness using a microtome and attached to a slide, and then treated with xylene three times for 5 minutes to remove paraffin. Subsequently, the mixture was treated with anhydrous ethanol twice for 5 minutes, 90 minutes, 80%, and 70% ethanol for 3 minutes, respectively, and stored in PBS for 5 minutes. Then, the cells were permeated with 0.1% Triton® X-100 solution dissolved in 0.1% sodium citrate solution for 8 minutes, and washed twice with PBS for 2 minutes. TUNEL reaction buffer (50 μl, Roche, USA) was treated on the tissue slide and incubated in a 37 ° C. wet incubator for 1 hour, then washed three times with PBS and observed with a fluorescence microscope.

그 결과, 도 17 에 나타난 바와 같이, 담체와 대조군 단백질 (Hp27)을 처리한 마우스의 종양 조직에서는 별다른 변화가 관찰되지 않은 반면, 세포투과성 p27 재조합 단백질 (HM1p27 및 HM1p27M1)을 처리한 마우스의 종양 조직에서는 세포사멸 시 붉게 염색되어 나타나는 변화가 관찰되었으며, 이로부터 본 발명에 따른 세포투과성 p27 재조합 단백질의 세포사멸 유도효과를 육안으로 확인할 수 있었다. 또한 세포투과성 p27 재조합 단백질을 처리한 마우스 그룹에서는 단백질의 투여를 중지한 2 주 후에도 여전히 암세포 내에서 세포사멸이 유도됨을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG . 17 , no significant changes were observed in tumor tissues of the mice treated with the carrier and the control protein (Hp27), whereas the cells were treated with the cell-permeable p27 recombinant proteins (HM 1 p27 and HM 1 p27M 1 ). In the tumor tissue of one mouse, a change in red staining was observed upon apoptosis. From this, the apoptosis inducing effect of the cell-permeable p27 recombinant protein according to the present invention was visually confirmed. In addition, in the mouse group treated with the cell-permeable p27 recombinant protein, apoptosis was still induced in cancer cells 2 weeks after the administration of the protein was stopped.

이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.The specific parts of the present invention have been described in detail, and it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

KCTC 한국 생물자원센터KCTC Korea Biological Resource Center KCTC11507BPKCTC11507BP 2009050620090506 KCTC 한국 생물자원센터KCTC Korea Biological Resource Center KCTC11508BPKCTC11508BP 2009050620090506

Claims (14)

서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 인간 종양 억제인자 p27 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 서열번호: 3 내지 196 으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 있는 세포투과성 p27 재조합 단백질.Macromolecular transduction domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3 to 196 at one or both ends of the human tumor suppressor p27 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 , MTD) cell permeable p27 recombinant protein. 제 1 항에 있어서,
상기 거대분자 전달 도메인이 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 갖는 JO-58 MTD 및 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 갖는 JO-68 MTD 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포투과성 p27 재조합 단백질.The method of claim 1,
The macromolecular delivery domain is a cell-penetrating p27 recombinant protein, characterized in that any one of JO-58 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 and JO-68 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 . 제 1 항에 있어서,
상기 재조합 단백질의 한쪽 말단에 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS) 및 히스티딘-표지 (histidine-tag) 친화성 도메인이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p27 재조합 단백질.The method of claim 1,
A cell permeable p27 recombinant protein characterized in that a nuclear localization sequence (NLS) and a histidine-tag affinity domain are fused to one end of the recombinant protein. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p27 재조합 단백질:
서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p27 N-말단에 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 갖는 JO-58 MTD 가 융합된 재조합 단백질;
서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p27 C-말단에 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 갖는 JO-58 MTD 가 융합된 재조합 단백질;
서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p27 양 말단에 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 갖는 JO-58 MTD 가 융합된 재조합 단백질;
서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p27 N-말단에 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 갖는 JO-68 MTD 가 융합된 재조합 단백질;
서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p27 C-말단에 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 갖는 JO-68 MTD 가 융합된 재조합 단백질; 및
서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p27 양 말단에 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 갖는 JO-68 MTD 가 융합된 재조합 단백질.The method according to any one of claims 1 to 3,
A cell permeable p27 recombinant protein, wherein said recombinant protein is selected from the group consisting of:
A recombinant protein in which a JO-58 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 is fused to a full-length p27 N-terminus having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ;
A recombinant protein in which JO-58 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 is fused to a full-length p27 C-terminus having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ;
A recombinant protein fused with JO-58 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 at both ends of a full length p27 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ;
A recombinant protein in which a JO-68 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 is fused to a full-length p27 N-terminus having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ;
A recombinant protein in which a JO-68 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 is fused to a full-length p27 C-terminus having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ; And
A recombinant protein in which JO-68 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 is fused to both ends of a full-length p27 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 . 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질이 서열번호: 198, 200, 202, 204, 206 및 208 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p27 재조합 단백질.The method according to any one of claims 1 to 4,
Cell recombinant p27 recombinant protein, characterized in that the recombinant protein has an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 198, 200, 202, 204, 206 and 208 . 제 1 항의 세포투과성 p27 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.A polynucleotide encoding the cell permeable p27 recombinant protein of claim 1. 제 6 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 197, 199, 201, 203, 205 및 207 의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.The method according to claim 6,
Wherein said polynucleotide has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 197, 199, 201, 203, 205 and 207 . 제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.Recombinant expression vector comprising a polynucleotide of claim 6. 제 8 항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터가 pET28a(+)-HM1p27, pET28a(+)-Hp27M1, pET28a(+)-HM1p27M1, pET28a(+)-HM2p27, pET28a(+)-Hp27M2 및 pET28a(+)-HM2p27M2 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.The method of claim 8,
The recombinant expression vector is pET28a (+)-HM 1 p27, pET28a (+)-Hp27M 1 , pET28a (+)-HM 1 p27M 1 , pET28a (+)-HM 2 p27, pET28a (+)-Hp27M 2 and pET28a (+)-HM 2 p27M 2 Recombinant expression vector, characterized in that it is selected from the group consisting of. 제 8 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균.A transformed bacterium transformed with the recombinant expression vector of claim 8. 제 10 항에 있어서,
형질전환 세균이 대장균 DH5α/HM1p27 (KCTC-11507BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.The method of claim 10,
The transforming bacterium characterized in that the transforming bacterium is Escherichia coli DH5α / HM 1 p27 (KCTC-11507BP). 제 10 항에 있어서,
형질전환 세균이 대장균 DH5α/HM1p27M1 (KCTC-11508BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.The method of claim 10,
The transforming bacterium characterized in that the transforming bacterium is E. coli DH5α / HM 1 p27M 1 (KCTC-11508BP). 하기 단계를 포함하는 제1항의 세포투과성 p27 재조합 단백질을 생산하는 방법:
1) 제10항의 형질전환 세균을 배양하여 세포투과성 p27 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
2) 발현된 세포투과성 p27 재조합 단백질을 배양액으로부터 회수하는 단계.A method of producing the cell permeable p27 recombinant protein of claim 1 comprising the following steps:
1) culturing the transgenic bacterium of claim 10 to express the cell permeable p27 recombinant protein; And
2) recovering the expressed cell permeable p27 recombinant protein from the culture. 제 1 항의 세포투과성 p27 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 p27 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for anticancer drugs for treating p27 defect or loss of function, comprising the cell-permeable p27 recombinant protein of claim 1 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.
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