KR20110015290A

KR20110015290A - Monoclonal antibody recognizing human muc1 and use thereof

Info

Publication number: KR20110015290A
Application number: KR1020090072930A
Authority: KR
Inventors: 윤강준; 박상규
Original assignee: 윤강준
Priority date: 2009-08-07
Filing date: 2009-08-07
Publication date: 2011-02-15

Abstract

PURPOSE: A monoclonal antibody which recognizes Muc1 protein and a diagnosis kit for human breast cancer or ovarian cancer containing the same are provided. CONSTITUTION: A monoclonal antibody which recognizes Muc1(mucin 1) recognizes 138-157th amino acid from amino terminal of human Muc1 antigen having an amino acid of seqeunce number 1. A diagnosis kit for human breast cancer or ovarian cancer contains the monoclonal antibody. The monoclonal antibody has a strip form. A method for diagnosing human breast cancer or ovarian cancer in a biological sample: a step of contacting the biological sample with Muc1 monoclonal antibody to obtain an immunological complex; a step of detecting the immunological complex. The biological sample is human urine.

Description

인간 Ｍｕｃ1을 인지하는 단클론 항체 및 이의 용도{Monoclonal antibody recognizing human Muc1 and use thereof}Monoclonal antibody recognizing human Muc1 and use thereof

본 발명은 인간 Muc1을 인지하는 단클론 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Muc1 단백질을 인지하는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 포함하는 인간 유방암 또는 난소암 진단 키트 및 상기 단클론 항체를 이용한 인간 유방암 또는 난소암 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes human Muc1 and its use, and more particularly to a monoclonal antibody that recognizes Muc1 protein, human breast cancer or ovarian cancer diagnostic kit comprising the monoclonal antibody, and human breast cancer using the monoclonal antibody or The present invention relates to a method for diagnosing ovarian cancer.

유방암은 전 세계적으로 2000년에 105만 건의 신규 발생이 추정된 두 번째로 많은 암이며 여성에게는 가장 흔한 암으로 신규 암 환자의 22%에 해당된다. 해마다 370,000명의 여성이 유방암으로 사망하는데 이것은 여성이 암 때문에 사망하는 전체 경우의 13.9%를 차지하는 가장 큰 이유이다.Breast cancer is the second most common cancer worldwide with an estimated 1,050,000 new cases in 2000, the most common among women, accounting for 22% of new cancer patients. Each year 370,000 women die of breast cancer, the largest reason for 13.9% of all cases where women die of cancer.

유방암은 전체 인구에서 볼 때 감수성 유전자들(BRCA1 및 BRCA2)의 보유율이 낮고 그것들의 집단 간 변이가 국가 간 또는 민족 간에 보이는 발병률 차이의 일부만 설명할 수 있다. 우리나라의 경우도 소득수준의 향상에 따라 국민들의 생활양식이 점차 서구화 되어가고 있으며 유방암 발생이 증가하고 있다.Breast cancer can explain only a small part of the difference in incidence of low susceptibility genes (BRCA1 and BRCA2) in the population as a whole and their intergroup variation. In Korea, as the income level improves, the lifestyle of the people is gradually becoming westernized, and the incidence of breast cancer is increasing.

유방암 사망률은 임상적, 병리학적 병기와 함께 증가한다. 진보 단 계(advanced stage)(3, 4기) 환자에서 재발과 사망은 대부분 3~5년 내에 일어나며 1, 2기로 진단받은 환자는 재발이나 사망 빈도가 낮으며 이런 현상들이 나중에 나타난다. 그래서 진보(advanced) 혹은 고위험 유방암 환자의 경우 초기 또는 저위험 유방암 환자에 비해 생존 곡선이 빨리 그리고 낮은 수준에서 일반 집단과 평행을 이루기 시작한다. 결과적으로 조기 진단은 보다 나은 예후와 연관되어 있으며 실제로 조기 진단된 유방암(0~1기)의 경우 국소 치료 후 20년 생존율이 90%에 이를 정도로 좋다.Breast cancer mortality increases with clinical and pathological stages. In patients with advanced stages (stages 3 and 4), relapses and deaths usually occur within 3 to 5 years. Patients diagnosed in stages 1 and 2 have a low incidence of relapses or mortality and these symptoms appear later. Thus, for advanced or high risk breast cancer patients, survival curves begin to parallel to the general population at a faster and lower level than those with early or low risk breast cancer. As a result, early diagnosis is associated with a better prognosis. In fact, early diagnosis of breast cancer (stages 0 to 1) has a 20-year survival rate of 90% after topical treatment.

현재 유방암의 일반적인 진단 방법은 1차로 전문가에 의한 임상진찰과 유방 촬영술이 있으며 이상이 있을 때에는 조직검사를 실시하고 있다. 그러나 젊은 여성에서는 유방에 섬유질에 많아 유방 촬영술만으로 완전한 진단을 하기에는 다소 무리가 있다. 최근 Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry(SELDI-TOF-MS) 기술을 이용한 단백질 프로파일링에 의해 바이오 마커를 발굴하고 바이오 마커 패널의 패턴을 비교함으로써 질병(암)을 진단하는 방법이 개발되고 있다. 그러나 유방암을 보다 쉽고 정확하게 진단하기 위한 새로운 마커 및 이를 이용한 방법이 필요한 상황이다.Currently, the most common method of diagnosing breast cancer is clinical examination by a specialist and mammography. In case of abnormalities, biopsy is performed. However, in young women, there is a lot of fiber in the breast to make a complete diagnosis only by mammography. Recently, the biomarker is discovered by protein profiling using Surface-Enhanced Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (SELDI-TOF-MS) technology, and the disease is diagnosed by comparing the patterns of biomarker panels. The method is being developed. However, there is a need for a new marker and method using the same to diagnose breast cancer more easily and accurately.

난소암은 자궁경부암과 유방암 다음으로 여성들에게 많이 발생하는 암으로서, 종양이 생겨도 초기에는 거의 아무런 자각증상이 없기 때문에 다른 장기로 전이가 된 후에야 발견되는 경우가 많다. 초기에는 거의 아무런 증상이 없으나, 다른 기관으로 암이 전이되면서 하복부에서 응어리가 만져지고 방광이 압박되어 자주 소변을 보게 되며, 복수가 차거나 흉수가 고여 숨이 차는 증세가 나타나는 경우가 대 부분이다. 따라서, 난소암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 조기진단의 필요성이 요구되는데, 일반적으로, 난소암의 진단은 산부인과에서 초음파, X선을 이용한 CT, MRI 등의 화상진단을 통해 이루어진다. 이들 방법에 의하여, 질병의 병변이 발견되는 경우, 정밀한 조직검사를 통해서 진단하여 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있으나, 상기 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 불편함이 있어서 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 보다 간편하고도 신속하게 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.Ovarian cancer is the second most common cancer in women after cervical cancer and breast cancer. Since ovarian cancer has almost no subjective symptoms at the outset, it is often found only after metastasis to other organs. In the early stages, there are almost no symptoms, but as the cancer spreads to other organs, the core of the lower abdomen is touched, the bladder is compressed, and often urinates. Therefore, in order to reduce mortality due to ovarian cancer, the necessity of early diagnosis is required, and in general, the diagnosis of ovarian cancer is performed by imaging, such as CT, MRI, etc. using ultrasound, X-ray, etc. in obstetrics and gynecology. By these methods, when a diseased lesion is found, it can be diagnosed through a precise biopsy to obtain a relatively accurate test result, but the diagnosis method is uncomfortable because the patient suffers from discomfort accompanied by pain. Therefore, there has been a demand for the development of a test method that can be diagnosed more simply and quickly.

한편, 암과 같이 유전적인 변이가 발생하는 질환에 대해서 유전자를 이용하여 진단하는 방법이 개발되었는데, 일반적으로 이들 진단방법은 암으로 의심이 되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행된다. 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정 암만을 진단할 수 있는 단점이 있고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암 진단 방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.On the other hand, methods for diagnosing diseases in which genetic mutations occur, such as cancer, have been developed. Generally, these diagnostic methods extract DNA from tissues suspected of cancer and undergo a PCR reaction. Alternatively, RNA may be extracted from the tissue and performed through gene expression analysis using a cDNA microarray. The former has the disadvantage that only certain cancers, such as chronic myelogenous leukemia (CML) or acute lymphocytic leukemia (ALL), mainly caused by chromosome translocation, can be diagnosed. Conventional cancer diagnosis methods such as histology, endoscopy or CT scan should be preceded.

상술한 종래의 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암 특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암 특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성 항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 CEA를 검출하는 방법을 통한 암진단 키트도 다수 개발되었다. 그러나, 전술한 바와 같이 CEA는 난소암은 물론 다른 암 조직에서도 발현되므로, 난소암 특이적 항원이라 할 수 없으므로, 난소암 특이적 항원을 검색하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 몇 종류의 항원 단백질이 검색되었으나, 이들은 정상적인 조직에서 일정수준을 유지하다가 난소암이 발병한 후에 발현수준이 급격히 향상되기 때문에, 이들을 사용할 경우, 난소암을 효과적으로 진단할 수 없다는 문제점이 있었다.In order to overcome the drawbacks of the conventional cancer diagnosis method described above, a method for detecting and diagnosing a cancer specific antigen has been developed. A representative example of the cancer specific antigen may include a carcinoembryogenic antigen (CEA). . CEA is known to increase in levels in patients with rectal-colon cancer, stomach cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, liver cancer and pancreatic cancer. Many cancer diagnostic kits have been developed through the method of detecting CEA. However, as described above, since CEA is expressed not only in ovarian cancer but also in other cancer tissues, it cannot be called an ovarian cancer specific antigen. Therefore, various studies have been conducted to search for ovarian cancer specific antigens. As a result, although several kinds of antigenic proteins were detected, they remained at a certain level in normal tissues, but since the expression level rapidly increased after the onset of ovarian cancer, there was a problem in that they could not effectively diagnose ovarian cancer. .

따라서, 난소암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 난소암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.Therefore, there is a constant need to develop a method for screening for ovarian cancer specific antigens and using the antibodies against them to diagnose ovarian cancer quickly and accurately.

한국특허공개 제1994-7001948호에는 모노클론 항체 OXA와 OXB를 이용한 난소암 및 자궁내막암 존재의 탐지 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2009-0079845호에는 유방암 모니터링，진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 이를 이용한 유방암 모니터링，진단 및 스크리닝 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2007-0049637호에는 난소 질환 검출 방법 및 조성물이 개시되어 있다.Korean Patent Publication No. 194-7001948 discloses a method for detecting the presence of ovarian cancer and endometrial cancer using the monoclonal antibodies OXA and OXB. Korean Patent Publication No. 2009-0079845 discloses protein markers for breast cancer monitoring, diagnosis and screening. And breast cancer monitoring, diagnosis and screening methods using the same, and Korean Patent Publication No. 2007-0049637 discloses a method and composition for detecting ovarian disease.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 유방암 또는 난소암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 유방암 또는 난소암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 유방암 또는 난소암 조직에서 특이적으로 발현되어 소변으로 분비되는 단백질을 선별하였으며, 상기 단백질을 피검자의 소변 시료에서 검출할 경우, 유방암 또는 난소암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.The present invention has been made in accordance with the above-described needs, and the present inventors have been eager to develop a method for screening breast cancer or ovarian cancer specific antigens and rapidly and accurately diagnosing breast cancer or ovarian cancer using antibodies thereto. As a result, we have selected proteins that are specifically expressed in breast or ovarian cancer tissue and secreted into the urine. When the protein is detected in the urine sample of the subject, it is confirmed that breast or ovarian cancer can be diagnosed quickly and accurately. The present invention has been completed.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 인간 Muc1 (mucin1) 항원의 특정 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체를 제공하는 것이다.In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that recognizes a specific amino acid region of the human Muc1 (mucin1) antigen.

본 발명의 또 다른 목적은 Muc1을 인지하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide hybridoma cells that produce monoclonal antibodies that recognize Muc1.

본 발명의 또 다른 목적은 Muc1을 인지하는 단클론 항체를 포함하는 인간 유방암 또는 난소암 진단 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a human breast cancer or ovarian cancer diagnostic kit comprising a monoclonal antibody that recognizes Muc1.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단클론 항체를 이용한 인간 유방암 또는 난소암 진단 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing human breast cancer or ovarian cancer using the monoclonal antibody.

본 발명에 따르면, Muc1 단백질을 인지하는 단클론 항체를 이용하여 소변 중의 Muc1을 검출함으로써 유방암 또는 난소암의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.According to the present invention, muc1 in urine is detected using a monoclonal antibody that recognizes Muc1 protein, which can be usefully used for the diagnosis of breast cancer or ovarian cancer.

하기 본 발명에 대한 설명에서, 재조합 DNA 및 면역학에서 사용되는 많은 용어들이 광범위하게 사용된다. 본원 명세서 및 특허청구범위에 대한 보다 더 명료하고 일관된 이해를 제공하기 위해서, 하기와 같은 정의를 제공한다.In the following description of the invention, many terms used in recombinant DNA and immunology are used extensively. In order to provide a clearer and more consistent understanding of the present specification and claims, the following definitions are provided.

용어 "항체"는 당해 분야에 공지된 용어이며 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 의미한다. 공지된 항원에 결합하는 활성 단편의 예는 Fab 및 F(ab)₂ 단편을 포함한다. 상기 활성 단편은 수 많은 기술에 의해서 본 발명의 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 정제된 단클론 항체는 펩신 같은 효소에 의해 절단되어 HPLC 겔 여과시킬 수 있다. Fab 단편을 함유하는 적합한 분획을 수집하여 막 여과 등에 의해 농축시킬 수 있다. 항체의 활성 단편 분리에 대한 일반적인 기술들에 대한 설명은 문헌[예를 들면, Khaw, B.A. et al., J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982)]을 참조한다. 용어 "항체"는 또한 이특이적(bispecific) 및 키메라(chimeric) 항체를 포함한다.The term "antibody" is a term known in the art and means a molecule or active fragment of a molecule that binds a known antigen. Examples of active fragments that bind known antigens include Fab and F (ab) ₂ fragments. Such active fragments can be derived from the antibodies of the invention by a number of techniques. For example, purified monoclonal antibodies can be cleaved by enzymes such as pepsin and filtered by HPLC gel. Suitable fractions containing Fab fragments can be collected and concentrated by membrane filtration and the like. A description of general techniques for active fragment separation of antibodies can be found in, for example, Khaw, BA et al., J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982). The term “antibody” also includes bispecific and chimeric antibodies.

용어 "단클론 항체" 는 당해 분야에 공지된 용어이며, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도로 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 본 발명의 단클론 항체는 통상적인 클로닝 및 세포 융합 기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원(항원)을 야생형이나 육종된 마우스(예를 들면, BALB/c)에 투여하여 천연 또 는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거나, 애주번트와 혼합하여 투여되거나, 벡터로부터 발현될 수 있으며 DNA 또는 융합 단백질로서 면역 반응을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반응에 의도된 펩티드와 커플링된 담체 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며, 담체 단백질은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩티드는 담체 단백질에 대해서 합텐(hapten)으로 작용한다. 단클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 제한 희석으로 클로닝하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 수득된 클론을 배양하는 것이다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 또 다른 장점을 갖는다.The term “monoclonal antibody” is a term known in the art and is a highly specific antibody directed against a single antigenic site. Unlike polyclonal antibodies, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), monoclonal antibodies are directed against a single determinant on an antigen. Monoclonal antibodies of the invention can be prepared using conventional cloning and cell fusion techniques. For example, an immunogen (antigen) of interest can be administered to wild type or breeding mice (eg BALB / c) to produce natural or human monoclonal antibodies. Such antigens can be administered alone, in admixture with an adjuvant, can be expressed from a vector and can elicit an immune response as a DNA or fusion protein. Fusion proteins include carrier proteins coupled with peptides intended for an immune response, such as β-galactosidase, glutathione S-transferase, keyhole limpet hemocyanin (KLH), and bovine serum albumin, Carrier proteins are not limited thereto. In this case the peptide acts as a hapten for the carrier protein. The method for producing monoclonal antibody is briefly described as follows. After boosting the animal, the spleen is removed and the spleen cells are extracted by methods known in the art [Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988). The hybrid cells obtained are cloned by conventional methods, for example by limiting dilution, and the resulting clones are cultured to produce the desired monoclonal antibody. Monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays using antigen-antibody binding, and because they are synthesized by hybridoma culture, they also have another advantage that they are not contaminated by other immunoglobulins. Have

용어 "에피토프" 는 당해 분야에 공지된 용어로서, 일반적으로 항체와 상호 작용하는 항원의 영역을 의미한다. 펩티드 또는 단백질 항원의 에피토프는 항원의 연속하는 또는 비연속하는 아미노산 서열로부터 형성될 수 있다. 많은 단백질이 많은 에피토프를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체에 의해서 인식되는 에피토프는 본 발명의 한 양태를 형성한다. 특정 에피토프를 인식하는 항체는 특정 에피토프를 정제하기 위한 면역친화도 컬럼에서 사용될 수 있다. 항원성 에피토프는 5개 정도의 적은 아미노산 잔기에 의해서 나타날 수 있는 것으로 보고되어져 있기 때문에, 특정 에피토프의 말단 절단형도 또한 가능할 수 있다.The term “epitope” is a term known in the art and generally refers to a region of an antigen that interacts with an antibody. Epitopes of peptide or protein antigens may be formed from consecutive or discontinuous amino acid sequences of the antigen. Many proteins can contain many epitopes. Epitopes recognized by the antibodies of the invention form an aspect of the invention. Antibodies that recognize specific epitopes can be used in immunoaffinity columns to purify specific epitopes. Since antigenic epitopes are reported to be exhibited by as few as five amino acid residues, terminal cleavage of certain epitopes may also be possible.

용어 "하이브리도마" 는 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미한다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다.The term “hybridoma” is known in the art and refers to a cell formed by fusion of antibody producing cells with immortal cells, such as myeloma cells. The hybrid cell can continuously supply the antibody.

본 발명에서 사용되는, 용어 "면역학적 복합체를 형성하는" 이란 시료 중에서 Muc1 항원의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 포함함을 의도한다. Muc1 항원의 존재 또는 부재는 면역분석법을 사용하여 검출할 수 있다. 항원을 검출하고/하거나 정량하는데 사용되는 수 많은 면역분석법들이 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지되어 있으며, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612]을 참조한다.As used herein, the term "forming an immunological complex" is intended to include identifying the presence or absence of a Muc1 antigen in a sample. The presence or absence of the Muc1 antigen can be detected using immunoassays. Numerous immunoassays used to detect and / or quantify antigens are known to those of ordinary skill in the art and are described in Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612. ].

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 표지제"는 면역복합체의 검출을 위한 표지를 의미하며, 구체적인 예로는 방사성 동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민 등과 같은 형광 물질, 효소 보조인자(enzyme cofactor), 바이오틴 등을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term "detection labeling agent" means a label for detection of an immunocomplex, and specific examples are radioisotope labels, enzymes, chemoluminescent compounds, fluorescein, picobili Fluorescent materials such as proteins, rare earth chelates, rhodamines, enzyme cofactors, biotin, and the like, but are not necessarily limited thereto.

용어 "(생물학적) 시료" 는 세포, 조직 또는 생물학적 유체를 포함하는 생물학적 물질을 포함하는 것으로 의도된다.The term "(biological) sample" is intended to include biological material, including cells, tissues or biological fluids.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인간 Muc1 (mucin1) 항원 단백질의 아미노 말단으로부터 138번째 ~ 157번째 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체에 관한 것이며, 상기 단클론 항체는 바람직하게는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제가 결합될 수 있으며, 상기 검출 표지제는 효소, 형광물질, 발광물질 또는 방사성 물질일 수 있다.The present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes the 138th to 157th amino acid region from the amino terminus of a human Muc1 (mucin1) antigen protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the monoclonal antibody preferably generates a detectable signal A detection label may be combined, and the detection label may be an enzyme, a fluorescent material, a luminescent material, or a radioactive material.

본 발명은 또한, 상기 단클론 항체를 포함하는 인간 유방암 또는 난소암 진단 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 단클론 항체를 인지하는 2차 항체를 추가로 포함하며, 검출 표지제가 2차 항체에 결합될 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 검출 표지제가 효소이고, 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트 내의 단클론 항체는 스트립(strip) 형태일 수 있다.The present invention also relates to a human breast or ovarian cancer diagnostic kit comprising the monoclonal antibody, wherein the kit further comprises a secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody, and the detection marker may be bound to the secondary antibody. . In addition, the kit may further include a substrate and a reaction terminator, wherein the detection labeling agent is an enzyme and can measure enzymatic activity. In addition, the monoclonal antibodies in the kit may be in the form of strips.

본 발명은 또한,The present invention also provides

생물학적 시료와 본 발명의 Muc1 단클론 항체를 접촉시켜 면역학적 복합체를 수득하는 단계;Contacting the biological sample with the Muc1 monoclonal antibody of the present invention to obtain an immunological complex;

상기 수득된 면역학적 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내의 인간 유방암 또는 난소암의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 상기 생물학적 시료는 바람직하게는 인체 소변(urine)이며, 상기 단클론 항체는 스트립(strip) 형태일 수 있으며, 상기 면역학적 복합체 검출은 웨스턴 블롯(western blot), ELISA, 면역조직화학법(immunohistochemistry) 또는 면역세포화학 법(immunocytochemistry)에 의해 수행될 수 있다.The present invention relates to a method for diagnosing human breast cancer or ovarian cancer in a biological sample comprising detecting the obtained immunological complex. In this method, the biological sample is preferably human urine, the monoclonal antibody may be in the form of a strip, and the immunological complex detection may be performed by western blot, ELISA, immunohistochemistry. (immunohistochemistry) or immunocytochemistry.

이후, 본 발명은 보다 상세히 기술된다.Hereinafter, the present invention is described in more detail.

본 발명은 Muc1 단백질 또는 이의 에피토프에 면역학적으로 반응성인 항체를 제공한다. 본원에서 제공되는 항체는 당해 분야에 공지된 방법으로 Muc1 단백질 또는 이의 에피토프를 발현하는 세포를 접종시켜 동물에서 생성시킬 수 있다. 상기 단백질은 통상적인 생화학적 방법으로 다양한 수준의 균질성으로 상기 세포로부터 분리될 수 있다. 시험관내에서 확립된 합성 방법으로 제조되고 이종성 아미노산 서열에 임의로 접합된 합성 펩티드가 또한 본 발명의 항체 제조 방법에 포함된다. 상기 접종에 사용되는 동물은 소, 양, 돼지, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 염소 및 영장류를 포함한다. 접종에 바람직한 동물은 설치류, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터를 포함한다. 가장 바람직한 동물은 마우스이다.The present invention provides antibodies that are immunologically reactive to Muc1 protein or epitope thereof. Antibodies provided herein can be generated in animals by inoculating cells expressing Muc1 protein or epitope thereof by methods known in the art. The protein can be isolated from the cells at various levels of homogeneity by conventional biochemical methods. Synthetic peptides prepared by synthetic methods established in vitro and optionally conjugated to heterologous amino acid sequences are also included in the antibody preparation methods of the invention. Animals used for the inoculation include cattle, sheep, pigs, mice, rats, rabbits, hamsters, goats and primates. Preferred animals for inoculation include rodents such as mice, rats, hamsters. The most preferred animal is a mouse.

본 발명에 의해 제공되는 단클론 항체는 또한, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 재조합 유전공학 방법에 의해 생산되며, 본 발명은 본 발명의 Muc1 단백질의 에피토프와 면역학적으로 반응성인, 상기 방법에 의한 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 항체의 단편들, 예를 들면, F(ab) 및 F(ab)₂를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 단편들을 포함한다. 상기 단편들은 단백질가수분해 절단, 화학적 합성 또는 유전공학적 방법에 의한 상기 단편들의 제조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 방법으로 제조된다. 본 발명은 또한 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방 법들에 의해 제조되는, Muc1 단백질과 면역학적으로 반응성인 일본쇄 항체를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명에 의한 Muc1 유도된 에피토프와 면역학적으로 반응성인 경쇄 및 중쇄 펩티드를 포함하는 키메라 항체를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 키메라 항체는 천연 항체 뿐만 아니라 당해 분야의 숙련자에게 공지된 유전공학적 기술들의 방법들로 제조된 키메라 항체를 포함한다.Monoclonal antibodies provided by the present invention are also produced by recombinant genetic engineering methods known to those skilled in the art, and the present invention relates to antibodies by said method, which are immunologically reactive with epitopes of the Muc1 protein of the present invention. Include. The invention also includes fragments of such antibodies, such as, but not limited to, F (ab) and F (ab) ₂ . The fragments are prepared by any method, including but not limited to the preparation of such fragments by proteolytic cleavage, chemical synthesis or genetic engineering methods. The present invention may also include single-chain antibodies immunologically reactive with Muc1 protein, prepared by methods known to those skilled in the art. The invention also includes chimeric antibodies comprising light and heavy chain peptides that are immunologically reactive with Muc1 induced epitopes according to the invention. Chimeric antibodies provided herein include natural antibodies as well as chimeric antibodies prepared by methods of genetic engineering techniques known to those skilled in the art.

본 발명에 따른 단클론 항체는 사람의 Muc1, 또는 재조합 Muc1을 항원으로 하여 제조된 항체로서 Muc1을 인지하는 항체를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용할 수 있는 세포는 본 발명에 의해 제공되는 천연 또는 유전공학적으로 조작된 Muc1 단백질을 발현할 수 있는 임의의 세포 또는 세포주이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 세포는 포유동물 세포인 HEK-293 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.It is to be understood that the monoclonal antibody according to the present invention includes all antibodies that recognize Muc1 as an antibody prepared from human Muc1 or recombinant Muc1 as an antigen. Cells that can be used herein are any cells or cell lines capable of expressing the natural or genetically engineered Muc1 protein provided by the present invention. Cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, mammalian cells, HEK-293 cells.

본 발명에서 제공되는 단클론 항체는 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 상기 하이브리도마 세포주는 또한 본 발명에 의해 제공되며 당해 분야에 공지된 방법으로 제조된다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)]. 하이브리도마 세포주는 골수종 세포주의 각각의 세포를 Muc1 단백질 그 자체 또는 이종성 또는 융합성 단백질 작제물을 포함하는, Muc1 단백질의 균질화 제제, 이를 포함하는 막, 상기 단백질을 암호화하는 세포, 상기 단백질로 면역화시킨 동물로부터 유도된 비장 세포와 융합시켜 제조된다. 본 발명에서 사용되는 골수종 세포주는 마우스, 랫트, 햄스터, 영장류 및 사람의 골수종으로부터 유도된 세포주를 포함한 다. 골수종 세포로는, 예를 들면 P3X63Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63Ag8. V653 및 S194 등의 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 또한, 랫트 유래 세포인 R-210 등의 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 골수종 세포주는 P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580)을 포함한다.Monoclonal antibodies provided in the present invention are produced by hybridoma cell lines, which are also provided by the present invention and prepared by methods known in the art. See Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory. Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988). Hybridoma cell lines immunize each cell of a myeloma cell line with a homogenizing agent of Muc1 protein, including the Muc1 protein itself or a heterologous or fusion protein construct, a membrane comprising the same, a cell encoding the protein, the protein Prepared by fusion with splenocytes derived from animals. Myeloma cell lines used in the present invention include cell lines derived from mice, rats, hamsters, primates, and human myeloma. As myeloma cells, for example, P3X63Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2 / 0, F0, P3x63Ag8. Mice derived from mice such as V653 and S194 can be used. In addition, cell lines such as R-210 which are rat-derived cells can be used. Preferred myeloma cell lines for use in the present invention include P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580).

면역화 후에 비장을 수득할 수 있는 바람직한 동물은 랫트, 마우스 및 햄스터를 포함하며, 바람직하게는 마우스이다. 비장 세포 및 골수종 세포는 당해 분야에 공지된 수 많은 방법들을 사용하여 융합시킬 수 있으며, 센다이 바이러스(Sendai virus)를 사용한 접종 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용한 접종 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하이브리도마 세포주에 의해서 생성된 단클론 항체는 시험관내 세포 성장을 통해 세포 배양 상등액으로부터 회수할 수 있거나, 하이브리도마 세포는 동물, 가장 바람직하게는 마우스의 피하 및/또는 복강내로 주입할 수 있으며, 단클론 항체는 혈액 또는 복수액(ascite)으로부터 수득된다.Preferred animals from which spleen can be obtained after immunization include rats, mice and hamsters, preferably mice. Splenocytes and myeloma cells can be fused using a number of methods known in the art, including, but not limited to, inoculation with Sendai virus and inoculation with polyethylene glycol (PEG), and the like. . Monoclonal antibodies produced by hybridoma cell lines can be recovered from cell culture supernatants via in vitro cell growth, or hybridoma cells can be injected subcutaneously and / or intraperitoneally in animals, most preferably mice, Monoclonal antibodies are obtained from blood or ascite.

본 발명에 따른 Muc1에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 골수종 세포 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC CRL-1580, USA)와 Muc1에 대한 항체를 생성하는 비장 세포를 융합한 세포이다.The hybridoma cells producing the monoclonal antibody against Muc1 according to the present invention are cells fused with myeloma cell P3X63Ag8.653 cells (ATCC CRL-1580, USA) and spleen cells producing antibodies to Muc1.

본 발명은 또한, 동물, 바람직하게는 사람, 더욱 바람직하게는 사람의 소변에서 Muc1 단백질의 발현을 검출함으로써, 인간 유방암 또는 난소암의 진단 방법을 제공한다. 상기 방법에서 사용하기 위한 진단 시약은 항체, 가장 바람직하게는 본 발명의 단클론 항체를 포함한다. 상기 항체는, 예를 들면, 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역 분석(RIA), 웨스턴 블롯 분석, 면역학적 역가 분석, 면역학 적 확산 분석, 및 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기타 방법들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 통상적인 면역학적 기술들에서 사용될 수 있다.The invention also provides a method for diagnosing human breast cancer or ovarian cancer by detecting the expression of Muc1 protein in the urine of an animal, preferably a human, more preferably a human. Diagnostic reagents for use in the methods include antibodies, most preferably monoclonal antibodies of the invention. The antibody can be, for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), western blot assay, immunological titer assay, immunological diffusion assay, and other methods known to those skilled in the art. It can be used in conventional immunological techniques, including but not limited to these.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.Reagents used in immunological assays include suitable carriers, detection labels capable of producing detectable signals, solubilizers, cleaning agents. In addition, when the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers (eg PBS) or insoluble carriers known in the art such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, polyacrylonitrile , Fluorine resins, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.

본 발명의 항체는 검출 가능한 물질, 즉 검출 표지제와 커플링시켜 검출을 용이하게 할 수 있다. 검출 표지제의 예는 다양한 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질 등을 포함한다. 검출 표지제는 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 Muc1 단클론 항체에 직접적으로 커플링 또는 결합되거나 중간체(예를 들면, 당해 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링되거나 결합될 수 있거나, Muc1 단백질을 인식하는 또 다른 다클론항체 또는 Muc1 항체를 인식하는 항체인 2차 항체에 커플링 또는 결합될 수 있다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 아세틸콜린 에스터라제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산 디하이드로게나아제, 인버타제 등을 포함하고; 적 합한 보결분자족 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 피코에리트린 또는 피코빌리프로테인 등을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀, 이소루시놀, 루시제닌을 포함하고; 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하며; 적합한 방사선 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ⁹⁹Tc ¹⁴C, ³H 등을 포함한다.Antibodies of the invention may be coupled with a detectable substance, ie a detection labeling agent, to facilitate detection. Examples of detection markers include various enzymes, prosthesis molecules, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, radioactive materials, and the like. Detection markers can be directly coupled or coupled to Muc1 monoclonal antibodies of the invention using techniques known in the art or indirectly coupled or bound through intermediates (eg, linkers known in the art). Or may be coupled or coupled to another polyclonal antibody that recognizes the Muc1 protein or to a secondary antibody that is an antibody that recognizes the Muc1 antibody. Examples of suitable enzymes are horseradish peroxidase, acetylcholine esterase, peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate Dehydrogenase, invertase, and the like; Examples of suitable submolecular complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin; Examples of suitable fluorescent materials include umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride, phycoerythrin or picobiliprotein, and the like; Examples of luminescent materials include luminol, isoleucinol, lucigenin; Examples of bioluminescent materials include luciferase, luciferin and aequorin; Examples of suitable radioactive materials include ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹¹¹ In, ⁹⁹ Tc ¹⁴ C, ³ H, and the like.

또한, 본 발명은 상기 Muc1에 대한 단클론 항체를 이용하여 단클론 항체와의 면역학적 복합체 형성을 검출하는, 면역분석법 또는 면역분석용 키트에 적용하여 시료내 Muc1의 탐지 또는 정량을 위한 분석방법 또는 분석 키트를 제공하는 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 단클론 항체를 이용한 면역분석법 및 면역분석용 키트, 예컨대 ELISA 분석 및 방사선 면역 분석 등은 모두 본 발명에 적용 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 Muc1 정량 분석에 사용되는 키트는 본 발명에 따른 Muc1 단클론 항체, 적합한 담체 용액, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제를 포함하는 용기 및 사용설명서를 포함할 수 있다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 추가로, 검출 표지제는 본 발명에 따른 Muc1 단클론 항체에 직접적으로 또는 링커를 통해 결합되어 있거나, 검출 표지제와 결합된 Muc1에 대한 다른 2차 항체를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the present invention is applied to an immunoassay or immunoassay kit for detecting the formation of an immunological complex with a monoclonal antibody using the monoclonal antibody against Muc1, an assay method or assay kit for detection or quantification of Muc1 in a sample To provide. As mentioned above, immunoassays and kits for immunoassays using monoclonal antibodies known in the art, such as ELISA assays and radioimmunoassays, are all applicable to the present invention. For example, a kit for use in the quantitative analysis of Muc1 of the present invention may comprise a Muc1 monoclonal antibody according to the present invention, a suitable carrier solution, a container containing a detection label capable of generating a detectable signal, a dissolving agent, a cleaning agent, and instructions for use. It may include. In addition, when the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator. In addition, the detection labeling agent may further comprise another secondary antibody against Muc1 bound directly or via a linker to the Muc1 monoclonal antibody according to the present invention.

본 발명의 바람직한 일례에서, 본 발명에 따른 단클론 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 생물학적 시료를 첨가하여 반응시키고, 효소-항체 결합체를 반응시킨 후 상기 효소의 기질을 처리하여 흡광도를 측정하고, 상기 흡광도를 표준곡선과 비교하여 생물학적 시료내에 존재하는 Muc1을 정량하는 Muc1의 정량 방법을 제공한다. 여기서, 상기 효소-항체 결합체 중 항체에 바이오틴을 결합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase, 이후 HRP로 인용됨)일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, ELISA 분석법에 사용되는 효소 및 기질을 모두 본 발명에 적용할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, by adding a biological sample to a microtiter plate coated with a monoclonal antibody according to the present invention, reacting the enzyme-antibody conjugate and then treating the substrate of the enzyme to measure the absorbance, A method of quantifying Muc1 is provided that quantifies Muc1 present in a biological sample by comparing absorbance with a standard curve. Herein, biotin may be combined with an antibody in the enzyme-antibody conjugate. In addition, the enzyme may be horse radish peroxidase (hereinafter referred to as HRP), but is not limited thereto, and all enzymes and substrates used in the ELISA assay may be applied to the present invention.

ELISA 분석은 항체, 항원반응을 이용하여 시료 중에 존재하는 항원의 존재 유무 및 정량을 할 수 있는 분석 방법이다. 하나의 ELISA 키트에 필요한 항체는 2 내지 3개 정도이다. Muc1을 인식하는 단클론 항체를 이용한 ELISA 키트에서는 상기 언급된 3개의 항체로 구성된다. 그 구성과 원리는 다음과 같다.ELISA analysis is an analysis method that can quantify the presence or absence of antigen present in a sample by using antibody and antigen reaction. There are about two or three antibodies required for one ELISA kit. ELISA kits using monoclonal antibodies that recognize Muc1 consist of the three antibodies mentioned above. The composition and principle are as follows.

먼저, 96-웰 플레이트(사람 소변에서 Muc1 정량 시)에 단클론 항체(1차 항체)를 코팅하고, Muc1을 포함하는 시료를 상기 웰에 첨가하여 반응시키고, 효소 표지된 다클론 항체(2차 항체)를 반응시키고, 상기 효소 표지와 반응가능한 기질을 처리한 후에, 효소-기질 반응을 탐지하고, 표준곡선과 비교하여 시료내에 존재하는 Muc1을 정량할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일례에서, 효소와 기질은 바이오틴과 스트렙타비딘 컨쥬게이트 HRP를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.First, a monoclonal antibody (primary antibody) is coated in a 96-well plate (when quantitating Muc1 in human urine), a sample containing Muc1 is added to the wells for reaction, and an enzyme-labeled polyclonal antibody (secondary antibody). ), The enzyme label and the substrate capable of reacting, the enzyme-substrate reaction can be detected and the Muc1 present in the sample can be quantified by comparison with the standard curve. In a specific example of the present invention, enzymes and substrates may use, but are not limited to, biotin and streptavidin conjugate HRP.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the present invention, the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1: 항원용 펩티드 합성 1: Peptide Synthesis for Antigen

인간 Muc1 (Gene ID: 4582)의 항원 제작을 위하여 muc1의 tandem repeat을 이루는 VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG (서열번호 1의 아미노산 서열의 138번째 ~ 157번째 아미노산 부위)를 합성하여 KLH에 컨쥬게이션(conjugation) 하였다.For antigen production of human Muc1 (Gene ID: 4582), VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG (138th to 157th amino acid site of amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), which forms a tandem repeat of muc1, was synthesized and conjugated to KLH.

실시예Example 2: 인간 2: human Muc1Muc1 특이적 Specific 단클론Monoclonal 항체 세포주 제작 Antibody Cell Line Construction

1) 항원 면역1) antigen immunity

KLH가 컨쥬게이션된 펩티드를 20 ㎍/마우스의 농도로 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant (Sigma, USA)가 섞인 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 생후 7 주령 암컷 Balb/c 마우스 (오리엔트) 3 마리에 복강 주사하였다. 1 마리당 20 ㎍의 항원을 주사하되 총 부피는 400 ㎕로 하였다. 2주 뒤에 Incomplete Freund's Adjuvant (Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀전을 상기 마우스의 복강에 주입한 후, 2주일 후 PBS에 녹인 항원을 (20 ㎍/마우스) 복강 내에 주사하여 항체 생성을 유도하였다. 항체 생성을 효소면역법 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 항체를 확인한 후, 세포 융합에 들어가기 3일 전에 쥐의 꼬리 정맥에 PBS에 녹인 항원으로 추가접종 하였다.An emulsion was prepared in which KLH conjugated peptide was mixed with the same volume of Complete Freund's Adjuvant (Sigma, USA) at a concentration of 20 μg / mouse. The emulsion was intraperitoneally injected into three 7-week-old female Balb / c mice (Orients). 20 μg of antigen was injected per animal, but the total volume was 400 μl. Two weeks later, an infusion mixture of Incomplete Freund's Adjuvant (Sigma, USA) and an antigen was injected into the abdominal cavity of the mice, and then, two weeks later, antigens dissolved in PBS (20 µg / mouse) were injected intraperitoneally to induce antibody production. . Antibodies were generated by enzyme-immunoassay and Western blot analysis to confirm the antibodies, and then further inoculated with antigen dissolved in PBS in the tail vein of rats 3 days before cell fusion.

2) 항체 생성 세포의 확인 및 선별 2) Identification and Screening of Antibody Producing Cells

상기 방법에 따라 면역화된 쥐의 안와 정맥 총 (eye ball)으로부터 혈액을 취득하여 1.5 ㎖ 원심분리 튜브에 담아 13,000 rpm, 10분 원심분리로 혈청을 분리하여 항체의 생성 여부를 실험하기까지 -20℃에서 보관하였다. 항원 단백질로 효소면역법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 항체의 생성을 확인한 후 항체 생성 쥐의 비장 세포에 대한 융합(fusion)에 착수하였다. Blood was obtained from the orbital vein gun (eye ball) of immunized rats in a 1.5 ml centrifuge tube, serum was separated by 13,000 rpm, 10 minutes centrifugation, and tested for antibody production. Stored at. After the production of the antibody was confirmed by enzyme-immunoassay and Western blot analysis with the antigenic protein, fusion to spleen cells of antibody-producing mice was started.

3) 융합 세포 제조 3) fusion cell manufacturing

항체 생성이 확인된 후 쥐를 희생시켜 항체생산 세포 (splenocyte)를 분리하고, 이와 골수종 세포 (myeloma cell) P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580, USA)를 융합하였다. 즉, 쥐의 P3X63Ag8.653 세포를 배양 접시에 10% 우 태아 혈청 (Biowhittaker, USA)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 최적 성장기에 이르도록 유지시켰다. 세포 융합을 위하여 P3X63Ag8.653 세포를 무 혈청 RPMI 1640 배지 (Biowhittaker, USA)로 2번을 세척한 후 1 x 10⁷세포 되게 농도를 맞추었다. 쥐를 경추이탈 (cervical dislocation)에 의해 희생시켜 비장을 취득하고 이것을 메쉬 (Sigma, USA) 용기에 넣고 세포를 하나씩 분리시켰다. 비장세포 부유액을 만든 후 원심 세척한 다음 비장세포액을 Tris-NH₄Cl 용액 (Tris 20.6 g/L, NH₄Cl 8.3 g/L)에 노출시켜 적혈구를 용해시킨 후, 완전히 분리된 항체 생산 세포를 5분간 400 g에서 원심분리한 후 무 혈청 배지로 2번 세척하고 10 ㎖의 배지에 현탁시켰다. 림프세포를 혈구계수판 (haemocytometer)으로 계수하여 1 x 10⁸의 림프구를 1 x 10⁷ P3X63Ag8.653 세포 (10:1)와 무 혈청 배지에 섞어 5분간 400g로 원심분리하였다. 37℃에서 전 처리된 50% (M/V) 폴리에틸렌 글리콜 1500 (Sigma, USA)을 이용하여 1 ㎖ 용액을 1분에 걸쳐 서서히 떨어뜨리면서 섞었다. 위에서 생성된 융합 혼합액을 무 혈청 RPMI 1640 배지로 희석하고 3분 동안 400 g에서 원심분리한 후 20% 우 태아 혈청과 HAT (100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine)가 포함된 RPMI 1640 선택 배지 35 ㎖에 세포를 현탁시켰다. 100 ㎕의 현탁액을 하루 전에 feeder cells (쥐의 복강에서 RPMI 1640 배지로 분리한 macrophage)를 코팅한 96 웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 에서 배양하였으며, 5일 후부터는 2-3일 간격으로 HAT 선택 배지를 번갈아 주면서 14 일간 배양하였다. 14일 이후부터는 20% 우 태아 혈청과 HT (HAT 선택 배지에서 0.4 μM aminopterin을 제거한 배지)가 포함된 RPMI 1640 배지로 교환하면서 계대 배양을 진행하였다. After antibody production was confirmed, mice were sacrificed to isolate antibody-producing cells (splenocytes), and myeloma cells P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580, USA) were fused. That is, the mouse P3X63Ag8.653 cells were maintained in an optimal growth phase using RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (Biowhittaker, USA) in a culture dish. P3X63Ag8.653 cells were washed twice with serum free RPMI 1640 medium (Biowhittaker, USA) for cell fusion and then adjusted to 1 × 10 ⁷ cells. Mice were sacrificed by cervical dislocation to obtain a spleen and placed in a mesh (Sigma, USA) container to separate cells one by one. After making the splenocyte suspension and centrifuging the cells, the splenocytes were exposed to Tris-NH ₄ Cl solution (Tris 20.6 g / L, NH ₄ Cl 8.3 g / L) to lyse red blood cells. After centrifugation at 400 g for 5 minutes, the cells were washed twice with serum free medium and suspended in 10 ml of medium. Lymphocytes were counted with a haemocytometer and 1 × 10 ⁸ lymphocytes were mixed with 1 × 10 ⁷ P3X63Ag8.653 cells (10: 1) in serum-free medium and centrifuged at 400g for 5 minutes. Mix 1 ml solution slowly dropping over 1 minute using 50% (M / V) polyethylene glycol 1500 (Sigma, USA) pretreated at 37 ° C. The fusion mixture produced above was diluted with serum free RPMI 1640 medium and centrifuged at 400 g for 3 minutes, followed by selection of RPMI 1640 containing 20% fetal bovine serum and HAT (100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine). The cells were suspended in 35 ml of medium. 100 μl of suspension was dispensed into 96 well plates coated with feeder cells (macrophage isolated from RPMI 1640 medium in rat abdominal cavity) one day before incubation at 37 ° C., 5% CO ₂ , followed by 2-3 days interval. Incubated for 14 days with alternating HAT selection medium. After 14 days, passage was performed with RPMI 1640 medium containing 20% fetal bovine serum and HT (medium 0.4 μM aminopterin removed from HAT selection medium).

4) 각 항체를 생산하는 융합세포의 선별 및 분리4) Screening and Isolation of Fusion Cells Producing Each Antibody

상기 3)의 방법에서 융합이 된 배양 상층액을 취득하여 제공된 항원에 대한 특이 항체 생성 여부를 조사하기 위하여 효소면역 측정법으로 검색하였으며, 융합 세포의 배양액을 음성대조군에 비해 4배 이상의 역가를 나타내는 웰의 세포만 선택하여 24 웰 배양 플레이트 및 25cm² 배양 플라스크로 옮겨 증식시켰다.In the method of 3), the culture supernatant obtained by the fusion was obtained and searched by enzyme-immunoassay to investigate whether the specific antibody to the provided antigen was generated, and the culture solution of the fusion cell was four times more titer than the negative control. Only cells were selected and transferred to 24-well culture plates and 25 cm ² culture flasks.

5) 면역 5) immunity 글로블린Globulin 분리 및 개별형 결정 Separate and Individual Decisions

단클론 항체의 개별형은 배양 상층액을 이용하여 효소면역측정법을 이용하는 Isotyping kit (Zymed Labomouseories Inc. USA)를 사용하여 결정하였다 (도 1). 그 결과, 인간 Muc1에 대한 항체는 IgG1인 것으로 판명되었다.Individual types of monoclonal antibodies were determined using an Isotyping kit (Zymed Labomouseories Inc. USA) using enzyme immunoassay using culture supernatants (FIG. 1). As a result, the antibody against human Muc1 was found to be IgG1.

또한, 제작된 인간 Muc1 단클론 항체 세포주의 배양액을 이용하여 제작된 세포주로부터 나온 항체가 인간 Muc1을 특이적으로 인식하는지 확인하기 위하여 유방암 세포주인 MCF7 세포 추출액을 이용한 웨스턴 블롯 결과에서 제작된 단클론 항체 세포주가 인간 Muc1 특이적임을 확인하였다 (도 2).In addition, the monoclonal antibody cell line produced from Western blot results using MCF7 cell extract, a breast cancer cell line, was used to confirm whether the antibody derived from the cell line prepared using the cultured human Muc1 monoclonal antibody cell line specifically recognized human Muc1. It was confirmed that it is human Muc1 specific (FIG. 2).

도 1은 본 발명의 단클론 항체의 개별형을 결정한 결과이다.1 shows the results of determining the individual types of the monoclonal antibodies of the present invention.

도 2는 유방암 세포인 MCF7 세포 추출물을 이용하여 본 발명의 단클론 항체가 인간 유방암 특이적임을 확인한 결과이다.Figure 2 shows the results confirming that the monoclonal antibody of the present invention is human breast cancer using MCF7 cell extracts, which are breast cancer cells.

<110> YOON, Kang Jun <120> Monoclonal antibody recognizing human Muc1 and use thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 483 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His 165 170 175 Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu 180 185 190 Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys 195 200 205 Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr 210 215 220 Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser 225 230 235 240 Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu 245 250 255 Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu 260 265 270 Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu 275 280 285 Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly 290 295 300 Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val 305 310 315 320 Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp 325 330 335 Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr 340 345 350 Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe 355 360 365 Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu 370 375 380 Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala 385 390 395 400 Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile 405 410 415 Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr 420 425 430 His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro 435 440 445 Tyr Glu Lys Val Arg Leu Gly Pro Thr Gly Gln Gly Lys Gln Arg Val 450 455 460 Trp Leu Gly Lys Asp Ser Glu Gly Gly Thr Trp Lys Thr Gln Arg Ala 465 470 475 480 Trp Lys Arg <110> YOON, Kang Jun <120> Monoclonal antibody recognizing human Muc1 and use <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 483 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His 165 170 175 Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu 180 185 190 Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys 195 200 205 Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr 210 215 220 Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser 225 230 235 240 Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu 245 250 255 Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu 260 265 270 Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu 275 280 285 Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly 290 295 300 Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val 305 310 315 320 Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp 325 330 335 Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr 340 345 350 Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe 355 360 365 Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu 370 375 380 Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala 385 390 395 400 Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile 405 410 415 Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr 420 425 430 His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro 435 440 445 Tyr Glu Lys Val Arg Leu Gly Pro Thr Gly Gln Gly Lys Gln Arg Val 450 455 460 Trp Leu Gly Lys Asp Ser Glu Gly Gly Thr Trp Lys Thr Gln Arg Ala 465 470 475 480 Trp Lys Arg

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인간 Muc1 (mucin1) 항원 단백질의 아미노 말단으로부터 138번째 ~ 157번째 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체.The monoclonal antibody which recognizes the 138th-157th amino acid site | part from the amino terminal of the human Muc1 (mucin1) antigen protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

제1항의 단클론 항체를 포함하는 인간 유방암 또는 난소암 진단 키트.Human breast cancer or ovarian cancer diagnostic kit comprising the monoclonal antibody of claim 1.

제2항에 있어서, 상기 단클론 항체는 스트립(strip) 형태인 것을 특징으로 하는 키트.The kit of claim 2, wherein the monoclonal antibody is in the form of a strip.

생물학적 시료와 제1항의 Muc1 단클론 항체를 접촉시켜 면역학적 복합체를 수득하는 단계;Contacting the biological sample with the Muc1 monoclonal antibody of claim 1 to obtain an immunological complex;

상기 수득된 면역학적 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내의 인간 유방암 또는 난소암의 진단 방법.A method for diagnosing human breast cancer or ovarian cancer in a biological sample comprising detecting the obtained immunological complex.

제4항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 인체 소변(urine)인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 4, wherein the biological sample is human urine.

제4항에 있어서, 상기 Muc1 단클론 항체는 스트립(strip) 형태인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 4, wherein the Muc1 monoclonal antibody is in the form of a strip.