KR20110011598A

KR20110011598A - 시험 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 배지

Info

Publication number: KR20110011598A
Application number: KR1020107018571A
Authority: KR
Inventors: 스테펜 씨. 에드베르그
Original assignee: 파일럿 포인트 엘엘씨
Priority date: 2008-01-24
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2011-02-08
Also published as: US8268579B2; US20090191577A1; US20110269160A1; BRPI0905781A2; US8268580B2; WO2010011358A2; US20110269163A1; KR20140015512A; US8765395B2; ES2431171T3; JP2011510628A; EP2245179A2; KR101548513B1; EP2245179B1; US20140147871A1; US8420347B2; JP5535942B2; WO2010011358A3

Abstract

황색포도상구균에 대한 존재/부재 시험은 황색포도상구균의 존재하에서 응괴하는 용액 중에 제1 세대 시험 샘플을 넣는 것을 포함한다. 상기 용액은 황색포도상구균을 선택적으로 성장시키는 성분을 함유하며, 또한 용액을 응괴시키기 위해 황색포도상구균이 샘플에 존재하면 황색포도상구균과 반응하여 상기 용액을 응괴시키는 응괴 인자를 함유한다. 시험할 수 있는 시료 샘플의 예에는 기타 여러 가지 중에서 비강 면봉 및 병변 면봉을 포함한다. 또, 상기 시험은 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 변경될 수도 있다.

Description

시험 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 배지{METHOD AND MEDIUM FOR DETECTING THE PRESENCE OR ABSENCE OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN A TEST SAMPLE}

본 발명은 시험샘플(test sample)에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)("S.aureus")의 존재 또는 부재를 검출하는 방법, 그 황색포도상구군의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 시험 혼합물 및 제 1세대 생체 시료에서 메티실린 내성 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용하기 위한 액체 시험 혼합물에 관한 것이다.

이 출원은 미국 특허출원 12/356,847(2009.1.21출원), 미국 가특허출원 61/062,144(2008.1.24출원) 및 미국 가특허출원 61/108,772(2008.10.27출원)에 대하여 우선권을 주장한 출원으로, 이들 특허 출원의 전체에 대하여 편집한 것이다.

1. 기술 정보

본 발명의 방법 및 시험 혼합물은 생물학적, 환경적 또는 식품 샘플에 있는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 검출에 관한 것으로서, 특히 표적 미생물(들)을 응괴로 전환시킬 수 있는 반응 인자들을 이용하는 방법 및 시험 혼합물에 관한 것이다.

2. 배경 정보

황색포도상구균은 동물 및 사람에 대한 유독 병원체이다. 또한, 황색포도상구균은 독소를 생성함으로써 심각한 식중독을 일으킬 수 있다. 황색포도상구균에 의해 야기되는 질환은 단순한 피부 감염부터 골, 심장 및 기관에 대한 생명 위협적인 감염까지 다양한 임상 스펙트럼을 갖는다. 황색포도상구균 감염이 수술 후 흔히 일어나는 일이라는 인식이 특히 중요하다. 이는 또한 정맥내 튜빙 및 기타 이식물과도 관련된다.

황색포도상구균 세균은 피부 대 피부 접촉에 의해 또는 공유되는 물품 또는 표면 (예: 일광욕용 침대, 운동 기구, 식품 취급 기구 등) (이때 황색포도상구균은 공유 물품을 사용하거나 표면을 만지는 후속 사람에게 전달될 수 있다)으로부터 건강한 개체 사이에서 전달될 수 있다. 병원에 오는 건강한 사람이 어떠한 징후나 증상이 없이 (예를 들어, 그들의 피부에 또는 코 등에) 황색포도상구균을 "옮길 수 있다"는 인식이 의학적으로 크게 중요하다. (종종 병원 (이로 제한되지 않음)에서 발견되는) 유리한 조건의 존재 하에서, 황색포도상구균이 활성화되고 심각한 감염을 일으킬 수 있다. 또한, 황색포도상구균은 식중독의 공급원일 수 있으며, 이러한 식중독은 종종 음식물 (예: 고기 (meat, poultry), 달걀, 마요네즈를 포함하는 샐러드, 빵제품, 유제품 등)을 오염시키는 식품 취급자에 의해 야기될 수 있다.

메티실린으로 시작하는 항생제 부류에 대한 각각의 클론의 감수성에 기초한 2가지 카테고리의 황색포도상구균이 있다. 이는 메티실린 감수성 황색포도상구균 (MSSA) 및 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)이다. 단지 수년 전까지, MRSA는 병원에서 가장 일반적으로 발견되었다. 지금은, 비-병원 단체 사람들의 코, 피부 등에서도 많이 존재한다. MRSA는 단지 소수의 항생제 (예: 반코마이신)만이 이에 대해 일률적으로 효과적인 것으로 밝혀졌기 때문에 특히 심각하다.

질병 통제 및 예방 센터(The Center for Disease Control and Prevention)가 메티실린 내성 황색포도상구균의 진행에 대해 적극적으로 조사하고 있다. 2000년, 미국 건강관리 역학회 (The Society for Healthcare Epidemiology of America)의 지침은 MRSA를 갖는 환자와의 접촉 격리를 권장한다. MRSA에 의해 야기되는 이환률 및 사망률에 추가하여, 각각의 감염 사례에 대해 적어도 $23,000의 비용이 드는 것으로 평가되었다. 따라서, 많은 병원 및 사설 요양원들은 사전대책을 강구하여 MRSA에 대해 환자들을 시험한다[참조: Clany, M., Active Screening in High-Risk units is an effective and cost-avoidant method to reduce the rate of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in the hospital., Infection Control and Hospital Epidemiology 27:1009-1017, 2006].

미국 특허 제4,035,238호 (Meyer 등)는 탄소원으로서 만니톨을 사용하고 지시자로서 DNA 메틸 그린을 사용하는 황색포도상구균의 검출을 위한 브로스의 사용을 기술한다. 이들 화학물질들 중 어느 것도 응고효소 반응성 기질이 아니다.

미국 특허 제6,548,268호 (Rambach)는 한천 배지 중 적어도 2개의 발색제: 데페록사민 존재 하의 5-브로모-6-클로로-인독실-포스페이트 및 5-브로모-4-클로로-3-인독실 글루코즈를 사용한다. 이들 기질을 가수분해시키는 각각의 콜로니는 서로 섞이고 서로 독립적이지 않은 색상을 생성할 것이다.

많은 종래의 배양 절차가 사람, 동물, 식품 등의 샘플로부터 MSSA 및 MRSA를 검출하는데 이용된다. 이들은 공통적으로 6 내지 8%의 염화나트륨, 아텔루루산칼륨 및 다양한 항생제와 같은 화학적 억제제를 갖는 기본 배지를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [참조: Stevens, DL and Jones, C. Use of trehalose-mannitol- phosphatase agar to differentiate Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus from other coagulase-negative staphylococci, J. of Clin . Microbiology 20:977-980, 1984]은 트레할로즈-만니톨-포스페이트 한천의 사용을 기술하였다. 탄소원으로서 만니톨 및 선별제로서의 염을 만니톨-염 한천으로 공지된 한천에 사용하는 것이 임상 실험실에서 통상적으로 사용되어 왔다[참조: Baird, R.M. and W.H. Lee., Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus., Int . J. Food Microbiology . 26:209-211, 1995]. 종래의 배양에서는, 순수 배양물로 분리되는 황색포도상구균 샘플을 사용하여 응고효소 시험을 수행하는 것이 일반적으로 수용되는 절차이다.

절차 "황색포도상구균 ID" [Bio Merieux, La Balme Les Grottes, France]는 황색포도상구균을 검출하기 위해 한천 중의 알파-글루코시다제 기질을 사용한다. 단일 기질이 사용된다 [참조: Perry, J.D. et al., Evaluation of S. aureus ID, a new chromogenic agar medium for detection of Staphylococcus aureus, J. Clin . Microbiology 41:5695-5698, 2003]. 추가된 항생제 및 염화나트륨을 포함하는 다양한 배지가 MRSA를 검출하도록 고안된다[참조: Perry et al., Development and evaluation of a chromogenic agar medium for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J. of Clin . Micro . 42:4519-4523, 2004].

셀레팍 (Selepak) 및 위텝스키 (Witebsky)는 황색포도상구균에 대한 튜브 응고효소 시험의 접종물 크기 및 로트-대-로트(lot-to-lot) 다양성을 평가하는 연구를 기술한다. 시료를 수집하고 한천 플레이트 상의 세균 콜로니로부터 분리물을 생성하였다. 항응고처리된 토끼 응고효소 혈장을 포함하는 튜브를 분리물로부터의 포도상구균(staphylococcal) 콜로니 일부 또는 하나 초과로 접종하였다. 튜브를 배양한 후, 응괴의 존재에 대해 조사하였다. 셀레팍 및 위텝스키에 따르면, "일부 분리물 및 일부 로트의 응고효소 혈장을 사용하여서는, 심지어 [분리물로부터의] 단일 콜로니라 하더라도 양성 응고효소 시험에 대해 충분한 접종물을 제공할 수 없다". 또한, 셀레팍 및 윕텝스키는 "보다 양적으로 표현하여, 각각의 응고효소 튜브 시험에 대해 언제든지 가능하기 위해서는 적어도 10⁸개 유기체/ml이 사용되어야 한다"고 기술한다. 또한, 이들의 자료는 황색포도상구균이 응고효소 혈장에서는 성장하지 않으며, 따라서 18 내지 24시간 동안의 응고효소 혈장의 배양이 소량의 접종물의 사용을 보충하지 못한다고 제시한다. 따라서, 셀레팍 및 위텝스키는, 직접적 응고효소 시험을 이용하여 제1 세대의 생물학적 시료 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하는 것은, 불가능하지는 않지만, 실용적이지 않다고 지적하고 있다[참조: Selepak, S.T et al, "Inoculum Size and Lot-to-Lot Variation as Significant Variables in the Tube Coagulase Test for Staphylococcus aureus ", Journal of Clin . Microbiology , Nov . 1985, p. 835-837].

따라서, 샘플로부터 직접적으로 황색포도상구균을 신속히 검출할 수 있고, 방법을 수행하는데 전문적인 기술을 필요로 하지 않으며, 시료(즉, "제1 세대" 샘플 상에서 수행될 수 있는 것)로부터 분리물을 만들 필요 없이 수행할 수 있으며, 정확하게 하기 위해 높은 농도의 황색포도상구균 유기체를 필요로 하지 않는 시험 혼합물 및 방법을 제공하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명은 생물학적, 환경적 또는 식품 샘플에 있는 황색포도상구균의 특이적인 검출을 위한 방법 및 시험 혼합물에 관한 것이다. 황색포도상구균의 검출시, 황색포도상구균의 증식을 촉진시키는 성분 (또한 "성장 촉진 성분"으로도 언급됨)과 혼합된, 응괴를 형성하기 위해 황색포도상구균에 의해 생성되는 응고효소와 특이적으로 반응하는 응고효소 기질 (때때로 "응고효소 반응 인자"로 언급됨)을 포함하는 시험 혼합물 (또한 "배지"로도 언급될 수 있다)이 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법 및 시험 혼합물은 황색포도상구균에 의해 생성되는 응고효소에 의해 활성화되는 응고효소 기질을 사용하며, 응고효소인 효소는, 문헌[참조: the Code of The Federal Register, Title 21, Chapter 1, Sub Part C, Sec. 866.2160 "Coagulase Plasma"]에 기술되는 바와 같이, 병원성인 포도상구균에 대해 특이적이다. 억제제 및 항생제가 경쟁적인 세균 성장을 억제하거나 달리는 부정적으로 영향을 끼치게 하기 위해 포함될 수 있으나, 요구되지 않는다. 비처리된 샘플 (예를 들어, 사람으로부터의 비강 면봉 또는 표면으로부터 떨어진 것 등으로부터 수집된 샘플)이 시험 혼합물에 가해지고, 접종된 시험 샘플이 배양된다. 황색포도상구균이 샘플에 존재하는 경우, 황색포도상구균은 시험 혼합물 내에서 증식할 것이고 응고효소 기질과 반응하는 응고효소를 생성할 것이다. 황색포도상구균에 의해 생성되는 응고효소와 시험 혼합물 내의 응고효소 기질 사이의 반응은 전형적으로 2 내지 24시간의 기간 동안 시험 혼합물 내에 검출가능한 응괴를 생성할 것이며, 이는 황색포도상구균의 존재를 양성으로 나타낸다.

본 발명의 방법에서, 응괴를 용해시켜 생존 황색포도상구균을 액체에 방출시킬 수 있으며, 이어서 액체에 대해 항생제 감수성 시험, 분자적 핑거프린팅, 유전적 분석 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 추가의 분석이 수행될 수 있다. 하기에서 상술되는 바와 같이, 제1 세대 샘플에서의 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 특이적 시험을 가능하게 하도록 항생제인 세폭시틴 또는 mecA 유전자의 유도제가 시험 혼합물에 포함되거나, MRSA의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 용해된 응괴 혼합물을 시험할 수 있다.

시험 혼합물은 바람직하게는 시험 혼합물의 취급, 포장, 저장 등을 용이하게 하는 형태로 제조된다. 액체 형태로 수화될 수 있는 건조 분말이 시험 혼합물에 대해 특히 바람직하나, 본 발명은 분말 형태로만 제한되지 않는다. 시험 혼합물은 액체 형태 또는 임의의 다른 형태 (예: 페이스트, 겔 등), 바람직하게는 사용을 위해 수화될 수 있는 형태를 취할 수 있다.

시험 혼합물 내의 응고효소 기질은 혈장내 제공되거나 황색포도상구균에 의해 생성되는 응고효소와 반응하여 응괴를 형성하도록 작용하는 또 다른 물질에 의해 제공될 수 있다. 본 시험은 토끼 혈장이 응고효소 기질의 유리한 공급원임을 나타낸다. 선택적으로, 다른 혈장 (예: 돼지 혈장)이 사용될 수 있다. 피브리노겐은 응고효소 기질의 공급원에 대한 또 다른 예이다. 응고효소 기질의 공급원으로서 혈장을 사용하는 이들 양태에서, 시험 혼합물 내의 응고효소 기질의 적합한 공급원을 확실하게 하기 위해 시험 혼합물에 응고효소 기질의 비-혈장 공급원을 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 시험은 피브리노겐을 시험 혼합물 내의 토끼 혈장과 혼합하는 것이 응고효소 기질의 일정하고 적합한 공급원의 제공을 보장하는 효과적인 수단이라는 것을 나타낸다. 시험 혼합물에 피브리노겐과 같은 물질을 첨가하는 것의 이점은 시험 혼합물의 실시 일관성을 증가시키고 본 방법을 혈장과 함께 발생할 수 있는 다양성에 대해 덜 민감하게 하는 것이다.

황색포도상구균의 증식을 촉진시키고 지탱하는 시험 혼합물 내의 성장 촉진 성분은 적용에 맞도록 변화될 수 있다. 당업자라면 성분들의 다양한 조합 및 동일 성분의 다양한 상대량이 동일한 작용성을 제공하는데 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 성장 촉진 성분은 질산염 및 단백질의 공급원, 핵산 합성을 돕도록 작용하는 물질, 황색포도상구균에 대한 에너지 공급원, 아미노산 성장 인자 공급원 및 일부 양태에서 손상된 표적 유기체의 회복을 돕도록 작용하는 물질을 포함한다. 이러한 성장 촉진 성분의 열거가 시험 혼합물에서 유리할 수 있는 모든 물질을 나타내지는 않으나 허용가능한 물질 (예: 비타민, 염, 광물, 무기물 등)을 설명한다. 시험 혼합물은 이의 실시를 유리하게 하는 다른 성분들을 포함할 수 있다.

본 발명의 대부분의 적용에서, a) 유효량의 아미노산; b) 유효량의 질소 공급원; c) 유효량의 염; d) 유효량의 비타민; 및 e) 유효량의 칼슘을 포함하는 시험 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 당업자라면 순수한 공급원보다는 오히려 이러한 아미노산의 천연 공급원을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 천연 공급원(예: 효모와 같은 전체 유기체의 추출물)은 혼합물 형태로 또는 정제된 형태일 수 있다. 천연 혼합물은 다양한 양의 이러한 아미노산 및 비타민을 포함할 수 있다. 또한, 당업자는 아미노산 및 비타민의 많은 상이한 조합이 본 발명의 시험 혼합물에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

또한, 당업자는 탄소, 질소, 미량 원소, 비타민, 아미노산 및 선별제가 많은 형태로 제공될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 예정된 범위 내의 비타민 및 아미노산의 양을 갖는 것이 바람직하나, 당업자라면 각각의 성분의 실제 특성이 다양하여 하나의 성분의 양의 감소가 또 다른 성분의 양의 증가에 의해 보상될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이는 검출될 미생물의 필수 아미노산, 미량 원소 또는 비타민이 알려진 경우에 특별히 관련된다. 일부 성분들은 감소된 양으로 제공되거나, 존재를 측정하려고 하는 미생물에 의해 내생적으로 합성될 수 있는 경우에는 생략될 수 있다. 염은 용해시 이온의 공급원으로 제공될 수 있다.

시험 혼합물은 시험 과정을 용이하게 하는 용기(예: 시험관, 편평한 바닥 벽을 갖는 용기 등)에 포장될 수 있다. 배지가 수화될 수 있는 형태로 제조되는 경우, 혼합물은 멸균수 또는 비-멸균수로 수화될 수 있다.

샘플에 있는 MSSA 또는 MRSA의 존재를 검출하기 위해서, 샘플은 생물학적, 환경적 또는 식품 시료로부터 수득된다. 비강 면봉을 이용하여 수집된 샘플이 본 발명을 이용하여 수집하고 시험하기에 특히 편리한 제1 세대 샘플의 예이다. 일단 수집되면, 샘플은 시험 혼합물에 접종된다.

접종된 샘플은 이에 존재할 수 있는 임의의 황색포도상구균의 증식을 촉진시키기에 유리한 조건 하에서 배양된다. 물로 수화되는 분말 시험 혼합물의 경우, 배양은 약 20℃ 내지 42℃의 온도에서 수행될 수 있다. 후속적인 효소 특이성, 황색포도상구균 촉진 성장 인자 및 항생제 선별성의 조합이 시험 기간(예: 24시간 이하) 중에 경쟁하는 비-표적 세균이 검출되는 것을 막는 다중 장애를 선택적으로 제공한다.

본 발명의 시험 및 방법은 병원 입원, 통상적으로 집중 관리 유니트, 사설 요양원, 투석 환자, 요양소 면역억제 치료를 받는 사람 등에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 시험 및 방법은 황색포도상구균 세균이 사람 캐리어로부터 전달되는 환경적 집적 장소(예: 체육관, 일광욕 살롱, 레스토랑 등)에서 이용될 수 있으며, 또한 황색포도상구균 오염에 대해 다양한 상이한 식품을 시험하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 혼합물의 실질적 이점은 이들을 고가의 장비 또는 전문적인 의료 기술 없이 수행/이용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 방법 및 혼합물의 또 다른 실질적 이점은 시험 샘플에 있는 비교적 소량의 황색포도상구균으로 작업할 수 있다는 것이다; 예를 들어, 본 발명의 방법/혼합물은 100 CFU/ml와 같이 낮은 황색포도상구균의 농도를 갖는 샘플에서 황색포도상구균을 검출하였다.

일부 구현예에서, 본 방법/혼합물은 MSSA 및 MRSA 를 구별하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 농도 약 10-100 mg/ml 의 세폭시틴 또는 다른 MecA 유전자 억제제는 상기 시험 혼합물에 포함될 수 있다. 시험 샘플 내에 존재하는 어떤 MSSA 는 죽겠지만, MRSA 는 그렇지 않을 것이다. 따라서, 응괴가 형성되면, 시험 샘플 중의 황색포도상구균은 MRSA 인 것으로 보일 것이다. 응괴가 형성되고 MRSA 의 존재를 확인하면, 그 다음, 응괴는 검출된 황색포도상구균 박테리아의 추가 분석을 수행하기 위해 용해될 수 있다.

본 발명의 시험은, Remel Products, Thermo Fisher Scientific, Lenexa, Kansas, U.S.A. 에 의해 제안된 응고효소 혈장 절차에 의해 대표되는 바와 같이, 현재 사용중인 표준 시험보다 수행하기에 상당히 간단한 것으로 인식될 것이다. FDA 에 의해 승인되고 면제 시험으로서 Code of the Federal Register 에 나타나 있는 상기 Remel 절차는 황색포도상구균에 대해 2단계 시험을 필요로 하고, 여기서, 시료로부터의 미생물 콜로니를 먼저 한천 배지에서 성장시키고, 두 번째 응고효소 시험 단계를 진행하기 전에, 그람 염색 및 카탈라제 평판(catalase slide) 시험을 사용하여, 의심되는 황색포도상구균 콜로니에 대해 스크리닝한다. 이러한 타입의 응고효소 시험에 관한 하기와 같은 성가신 문제가 있다: 즉, 1) 응고효소 시험을 위한 콜로니는, 거짓 양성이 일어날 수 있기 때문에, 고농도의 염을 함유하는 배지로부터 채집될 수 없고; 2) 상기 첫 번째 단계 평판(slide) 시험 절차에서, 유기체/염수 서스펜션은 거짓 양성 시험 리딩(reading)을 방지하기 위해 응고효소 혈장의 첨가 전에 자발응집에 대해 관찰되어야 하고; 및 3) 시험 배양이 18 내지 24시간보다 더 걸리면, 즉 불충분한 성장이 있으면, 거짓 음성 응고효소 반응이 일어날 수 있다.

본 발명은 바람직한 구현예에 대해 기재되었지만, 당업자는, 다양한 변화 및/또는 변형이 부가되는 특허청구범위에 한정된 바와 같이 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 대해 행해질 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.

본 발명에 대한 자세한 사항은 첨부된 도면과 함께 본 발명에 대한 수개의 양태에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 보다 쉽게 분명해질 것이다.
도 1은 비강 면봉의 제1 세대 생체 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 제형된 분말 배양 혼합물을 포함하는 시험관의 측면도이고;
도 2는 배양 혼합물이 물로 수화된 것을 보여주는 도 1의 시험관의 측면도이며;
도 3은 제1 세대 생물학적 시료 비강 면봉을 배지에 위치시키기 위해 면봉을 시험관에 삽입한 도 2의 시험관의 측면도이고;
도 4는 시료를 위치시키고 일정 기간 동안 배지에서 배양한 후의 도 3의 심험관의 측면도이며, 시료 중 황색포도상구균의 부재를 나타내며;
도 5는 배양기간 후의 시험관 배지를 나타내는 도 4의 측면도이며, 시료 중 황색포도상구균의 존재를 나타낸다.

도 1 은, 바람직하게는 편평 바닥부(4) 및 상부 덮개부(3) 를 가지며, 샘플, 예를 들어, 제1 세대 생체 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명에 따라 형성된 건조 분말상 시험 혼합물(1) 을 갖는 번호(2) 로 표시한 시험관의 측면도이다. 상기 시험관(2) 에는, 시료 샘플 시험을 위한 분말상 혼합물(1) 을 적당히 수화시키기 위해 시험관(2) 에 첨가될 물의 양을 나타내는 기준선(5)이 또한 제공된다.

허용가능한 수화된 시험 혼합물을, 지시된 범위로 하기 성분을 사용하여 만들어서, 15 ml 의 시험 혼합물이 제조될 수 있다:

상기에서 제공된 15 ml 의 시험 혼합물 당 성분 양의 특정 예는, 시험되고 만족하게 수행되는 것으로 밝혀진 특정 시험 혼합물을 나타낸다. 이러한 구체적인 예가 모든 시험 혼합물 제형을 나타내는 것은 아니고, 본 발명은 그것으로 한정되지 않는다. 상기에서 언급한 바와 같이, 당업자는, 많은 상이한 성분 조합 및 이들의 변화가능한 상대적인 양을 사용하여 동일한 기능을 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 방법 및 혼합물은, 수많은 상이한 성분 제형을 상기 범위 내에서 만들 수 있다는 것을 고려한다.

도 2 에서 나타낸 바와 같이, 분말상 혼합물(1)을, 물, 바람직하게는 증류수의 첨가로 적당히 수화시키고, (예, 비강 면봉 상에 옮겨진) 샘플이 놓여진 수화된 시험 혼합물 (6)을 형성한다.

제1 세대 시험 샘플을 다양한 상이한 기술로 수집할 수 있고; 예를 들어, 인간 샘플을 대상체의 코 내에서 면봉으로 비벼서 수집할 수 있다. 비강 면봉은 시험 샘플을 수집하기에 특히 편리한 수단이지만, 유일한 수집 방법이 아니고; 예를 들어, 시험 샘플은 인후 스왑(swab), 피부 손상, 손상되지 않은 피부 등으로부터 수집될 수 있다. 제1 세대 환경 샘플은 다양한 공지 방법으로 수집될 수 있고; 그 예는 건식 또는 습식 와이프(wipe)/면봉을 사용하여 표면을 닦고 또는 훔치는 것이다. 마찬가지로, 제1 세대 음식 샘플은 음식 자체로부터 수집될 수 있거나, 닦은 음식 잔류물은 음식 등과 접촉한 표면으로부터 수집될 수 있다. 샘플이 일단 수집되면, 예를 들어 공급원으로부터 상기 제1 세대 샘플을 모으기 위해 사용된 동일한 면봉(8)을 사용하여 수화된 시험 혼합물(6) 에 위치시킬 수 있다. 시료 샘플이 일단 상기 시험 혼합물(6) 에 놓여 지면, 전형적으로 24시간 미만 동안 상기 시험 혼합물 내에서 배양된다. 배양은 환경 하에서 허용가능한 어떤 온도에서 일어날 수 있다. 접종 기간 후, 접종된 시험 혼합물을 보유하고 있는 용기 (예, 시험관(2)) 은 응괴(clot)의 존재에 대해 살필 수 있고; 예를 들어, 시험관(2)는, 시험 혼합물의 메니스커스(meniscus, 10)가 움직일 것인지, 또는 응괴가 기준선(5) 아래로 상기 시험 혼합물을 유지하는지를 알기 위해 도 4 및 5 에서 보여진 바와 같이 한 면으로 기울어질 수 있다. 응괴의 존재는, 황색포도상구균이 시험 샘플에 존재한다는 것을 나타내고, 접종된 시험 혼합물 중 응괴의 부재는, 황색포도상구균이 도 4와 같이 상기 시험 혼합물(6)에 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 일부 예에서, 전체 접종된 시험 혼합물은 응괴할 것이고, 다른 예에서, 액체는 응괴와 함께 용기에 남아 있을 것이다. 황색포도상구균이 상기 제1 세대 시험 샘플에 존재하는 경우 6시간 내에 응괴된 제1 세대 비강 샘플을 사용하여 본 시험의 약 80% 수행했다.

본 방법 및 혼합물의 유효성을 측정하기 위해, 각기 다른 양의 MSSA를 함유하도록 적정된 6개의 대조 샘플, 및 각기 다른 양의 MRSA를 함유하는 6개의 대조 샘플을 수반하는 대조 연구를 수행했다. MSSA 및 MRSA 의 표준 클론을 트립티케이스 소이 브로스 (trypticase soy broth; TSB)에서 성장시키고, 로그 10 인크레멘트(increment)까지 희석했다. 본 발명 시험 혼합물을 각 대조 샘플의 설정량(0.1 ml)으로 접종했다. 첫 번째 설정의 접종된 시험 혼합물을 35℃에서 배양하고, 두 번째 설정의 접종된 시험 혼합물을 23℃에서 배양했다. 60개의 대조 시험 샘플 중에서, 모두는 5시간 내에 황색포도상구균에 대해 양성이고, 49개는 4시간 내에 양성이고; 36개는 3시간 내에 양성이고, 24개는 2시간 내에 양성이었다. 접종물의 농도, 및 접종 온도 사이의 관계를 상술한 데이터는 하기와 같다:

응괴 내의 황색포도상구균의 농도는 모두 적어도 5 log 10이었다.

상기 기재된 대조 연구에 추가하여, 임상 연구를, 50개의 샘플을 사용하여 수행했다. 상기 샘플을, 환자 비공을 배양하여 내과중환자실로부터 취했다. 환자는 확인되지 않았고, 임의 "표준" 배양 이용가능 (FDA 프로토콜)의 결과도 아니었다. 샘플을, 면봉을 사용하여 만니톨 식염한천배지 (MSA) 상에 평판배양했다. MSA 상에서 샘플을 평판배양한 후, 면봉을 사용하여 상기 시험 혼합물을 접종했다. 매 24시간 동안 응괴를 관찰했다. 거짓 양성은 없었다.

응괴를 관찰했을 때, 약간의 응괴를 제거하고 용해시켰다. 정량적인 수의 CFU/ml 를 용해된 응괴 물질로부터 수행했다.

Claims

a) 황색포도상구균에 의해 생성된 응고효소와 반응하여 응괴를 생성하도록 작용하는 응고효소 기질을 포함하는 시험 혼합물을 제공하는 단계;
b) 상기 시험 혼합물을 수화시키는 단계;
c) 상기 수화된 시험 혼합물을 상기 제1 세대 샘플로 접종하는 단계;
d) 약 20℃ 내지 약 42℃ 범위의 온도에서 상기 접종된 시험 혼합물을 배양하는 단계; 및
e) 상기 혼합물을 관찰하여 상기 수화된 혼합물 중 응괴의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는, 제1 세대 시험 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 혈장을 포함하는, 방법.
제 2항에 있어서,
상기 혈장이 토끼 혈장인, 방법.
제 3항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는, 방법.
제 2항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 황색포도상구균의 증식을 용이하게 하는 성장 촉진 성분을 추가로 포함하는, 방법.
제 5항에 있어서,
상기 성장 촉진 성분이 질산염 공급원, 단백질 공급원, 핵산 합성의 생성을 돕도록 작용하는 물질, 황색포도상구균을 위한 에너지원 및 아미노산 성장 인자 공급원 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제 5항에 있어서,
상기 시험 혼합물이
a) 유효량의 아미노산;
b) 유효량의 질소 공급원;
c) 유효량의 염;
d) 유효량의 비타민 및
e) 유효량의 칼슘을 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 피브리노겐을 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 혈장을 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 시험 샘플에서 메티실린 감수성 황색포도상구균("MSSA")을 죽이는데 유효한 세폭시틴(cefoxitin)으로서 유효량의 MecA 유전자의 인듀서(inducer)를 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
인간 대상체의 비공을 면봉으로 훔쳐서(swabbing) 상기 제1 세대 샘플을 모으는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
환경 표면(environmental surface)을 면봉으로 훔쳐서 상기 제1 세대 샘플을 모으는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
식품의 샘플로부터 상기 제1 세대 샘플을 모으는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
생존 황색포도상구균 박테리아를 방출하기 위해 응괴를 액화시키는 단계; 및 액체 응괴 물질에 대해 하나 이상의 분석을 실시하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 분석이 항생제 감수성 시험, 분자 핑거프린팅(molecular fingerprinting) 및 유전자 분석을 포함하는, 방법.
제 14항에 있어서,
상기 액체 응괴 물질에 대한 하나 이상의 분석을 실시하는 단계가 시험 샘플에서 메티실린 내성 황색포도상구균("MRSA")의 존재를 검출하는데 유효량으로 MecA 유전자의 인듀서(inducer)로서 세폭시틴을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
a) 유효량의 아미노산;
b) 유효량의 질소 공급원;
c) 유효량의 염(salts);
d) 유효량의 비타민;
e) 유효량의 칼슘; 및
f) 시험 샘플에서 황색포도상구균의 존재하에 약 20℃ 내지 약 42℃ 범위의 온도에서 액체 배지 내에 응괴를 생성하는 유효량의 응고효소 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 세대 시험 샘플에서 황색포도상구균의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 시험 혼합물.
제 16항에 있어서,
상기 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 혈장을 포함하는, 시험 혼합물.
제 17항에 있어서,
상기 혈장이 토끼 혈장인, 시험 혼합물.
제 18항에 있어서,
상기 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 피브리노겐을 포함하는, 시험 혼합물.
제 16항에 있어서,
상기 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 피브리노겐을 포함하는, 시험 혼합물.
제 16항에 있어서,
상기 시험 샘플에서 메티실린 내성 황색포도상구균("MRSA")의 존재를 검출하는 유효량으로 MecA 유전자의 인듀서로서 세폭시틴을 추가로 포함하는, 시험 혼합물.
제 16항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 액체인, 시험 혼합물.
제 16항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 수화(hydration)될 수 있는 건조 혼합물인, 시험 혼합물.
a) 분말상 응고효소 기질의 공급원을 함유하는 시험 혼합물, 및 시험 샘플에서 임의의 메티실린 감수성 황색포도상구균 ("MSSA")을 죽이는 데 유효한 양의 세폭시틴을 제공하는 단계;
b) 용기 내에서 상기 시험 혼합물을 수화하는 단계;
c) 상기 용기 내에서, 제1 세대 생체 샘플을 수화된 시험 혼합물과 혼합하는 단계;
d) 상기 용기에서 혼합된 제1 세대 생체 샘플과 상기 시험 혼합물을 약 20℃ 내지 약 42℃ 범위의 온도에서 배양하는 단계; 및
e) 상기 샘플과 수화된 시험 혼합물의 혼합물을 관찰하여 상기 용기 내에서 응괴의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시험 샘플에서 메티실린 내성 황색포도상구균 ("MRSA")의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
제 24항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 토끼 혈장을 포함하는, 방법.
제 25항에 있어서,
상기 시험 혼합물이 응고효소 기질의 공급원으로서 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는, 방법.
제 26항에 있어서,
상기 시험 혼합물이
a) 유효량의 아미노산;
b) 유효량의 질소 공급원;
c) 유효량의 염(salts);
d) 유효량의 비타민; 및
e) 유효량의 칼슘을 추가로 포함하는, 방법.
제 24항에 있어서,
인간 대상체의 비공을 면봉으로 훔쳐서 상기 제1 세대 샘플을 모으는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 24항에 있어서,
환경 표면을 면봉으로 훔쳐서 상기 제1 세대 샘플을 모으는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
a) 유효량의 아미노산;
b) 유효량의 질소 공급원;
c) 유효량의 염;
d) 유효량의 비타민;
e) 유효량의 칼슘;
f) 시험 샘플에서 황색포도상구균의 존재하에 상기 시험 혼합물을 응괴하는 유효량의 응고효소 기질; 및
h) 시료에서 임의의 메티실린 감수성 황색포도상구균("MSSA")을 죽이는 유효량의 MecA 유전자 인듀서(gene inducer)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 세대 생체 시료에서 메티실린 내성 황색포도상구균("MRSA")의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용하기 위한 액체 시험 혼합물.
제 30항에 있어서,
상기 MecA 유전자 인듀서가 세폭시틴인, 액체 시험 혼합물.