KR20110003526A - Three-dimensional microfluidic platforms and methods of use thereof - Google Patents

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KR20110003526A
KR20110003526A KR1020107025091A KR20107025091A KR20110003526A KR 20110003526 A KR20110003526 A KR 20110003526A KR 1020107025091 A KR1020107025091 A KR 1020107025091A KR 20107025091 A KR20107025091 A KR 20107025091A KR 20110003526 A KR20110003526 A KR 20110003526A
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cells
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로저 디. 캄
석 정
버넬라 브이. 빅커맨-켈리
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은, 원핵 및 진핵 세포 이동, 증식, 및 분화를 포함하는, 3차원 생물학적 시스템의 연구 및 형성을 위한 방법 및 장치를 제공하는 것이다.The present invention provides methods and apparatus for the study and formation of three-dimensional biological systems, including prokaryotic and eukaryotic cell migration, proliferation, and differentiation.

Figure P1020107025091
Figure P1020107025091

Description

3차원 미세유체 플랫폼 및 이의 사용 방법{THREE-DIMENSIONAL MICROFLUIDIC PLATFORMS AND METHODS OF USE THEREOF}THREE-DIMENSIONAL MICROFLUIDIC PLATFORMS AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원Related application

본 출원은 2008년 4월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 제 61/123,344호의 우선권의 이익을 주장한다.This application claims the benefit of priority of US Provisional Patent Application 61 / 123,344, filed April 8, 2008.

정부 지원Government support

본 발명은, 내셔널 인스티튜츠 오브 헬쓰(National Institutes of Health)의 더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오메디칼 이미징 앤드 바이오엔지니어링(the National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)에 의해 수여된 보조금 번호(Grant No.) I-R01-EB-003805-01Al 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.The present invention relates to Grant No. I- awarded by the National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the National Institutes of Health. It was made with government support under R01-EB-003805-01Al. The government has certain rights in the invention.

세포 이동은 여러 생리학적 및 병리학적 과정, 예컨대 혈관신생, 암 전이, 상처 치유 및 염증을 위해 필수적이다. 혈관계에서, 모세관 형태형성과 관련된 세포 이동에 많은 노력이 집중되었다. 이 연구를 통해, 여러 기계적 그리고 생화학적 인자, 예를 들어 단일 또는 다수의 성장 인자1, 간질액(interstitial fluid) 흐름2 ,3 및 매트릭스 강성도(matrix stiffnes)4 ,5의 화학주성 또는 화학운동성(chemokinetic) 효과가 내피 세포 이동 및 관(tube) 형성을 조절함에 있어서 결정적인 것으로 확인되었다. 개별 성분들의 상세한 이해에도 불구하고, 어떻게 이러한 인자들이 특정 세포 반응을 생성시키도록 통합되는 지가 밝혀져야 하는데, 이는 이러한 환경 인자들이 제어된 방식으로 연구될 수 있는 다목적 시험관내 시스템에 대한 필요를 만들어낸다. 이를 달성하는 것은, 어떻게 생화학적 및 기계적 인자가 생리학적 및 병리생리학적 과정에서 함께 작용하여 궁극적으로 개선된 조직 공학(tissue engineering) 및 치료 전략에 기여하는 지를 보다 잘 이해하는 조사를 촉진시킬 것이다. Cell migration is essential for several physiological and pathological processes such as angiogenesis, cancer metastasis, wound healing and inflammation. In the vascular system, much effort has been focused on cell migration associated with capillary morphogenesis. Through this study, chemotaxis or chemotaxis of several mechanical and biochemical factors such as single or multiple growth factors 1 , interstitial fluid flows 2 , 3 and matrix stiffnes 4 , 5 ( The chemokinetic effect was found to be crucial for regulating endothelial cell migration and tube formation. Despite a detailed understanding of the individual components, it should be clear how these factors are integrated to generate specific cellular responses, which creates the need for a multipurpose in vitro system in which these environmental factors can be studied in a controlled manner. . Achieving this will facilitate investigations to better understand how biochemical and mechanical factors work together in physiological and pathophysiological processes and ultimately contribute to improved tissue engineering and treatment strategies.

모세관 형태형성에서의 세포 이동을 이해하는 것은, 인간 질병 및 발생 현상에 대한 이의 관련성6 때문에 치료학적으로 중요하다. 전형적 세포 이동 분석은, 복잡한 환경 인자들, 특히 3차원 환경내에서 세포 단층(monolayer) 또는 미리 형성된 모세관으로부터 신규한 관-유사(tube-like) 구조의 형성을 촉진하는 환경 인자들을 통합시킬 수 없다. 현재의 모세관 형태형성 분석 중 하나는 ECM-유사 기판7 -9상에 평면적 관형 네트워크를 생성시킨다. 그러나 이 기술로 형성된 모세관-유사 구조는 외측상의 배지 및 내측상의 골격 물질(scaffolding material)과 반대되는 세포 극성을 지닌다7. 다른 방법들은 두 층의 골격 물질의 두 단층 사이에 하나의 세포 단층을 샌드위칭하고8, 화학적 구배를 도입함에 의해 모세관 침입을 유도9하는 것을 포함한다. 이 실험들은 모세관 형태형성을 이해하는 기초를 제공하였지만, 세포 침입을 평면적(in-plane)으로 이미징할 수 없음에 의해 제한을 받으며, 이는, 이러한 생물학적 방법에 영향을 주는 인자들을 더욱 상세히 특성화하게 한다.Understanding cell migration in capillary morphogenesis is therapeutically important because of its relevance to human disease and developmental phenomena 6 . Typical cell migration assays cannot incorporate environmental factors that promote the formation of novel tube-like structures from complex monolayers or preformed capillaries within a three-dimensional environment, in particular . One of the current of a capillary type assay is to produce a two-dimensional tubular network ECM- on the carrier substrate 7-9. However, the capillary-like structure formed by this technique has a cell polarity opposite to the media on the outside and the scaffolding material on the inside 7 . Other methods include inducing the capillary 9 by breaking the sand as switching a cell monolayers between two single layer of the scaffold material of the two layers 8 and introducing the chemical gradient. These experiments provided the basis for understanding capillary morphology, but are limited by the inability to image cell invasion in-plane, which allows for further characterization of factors affecting these biological methods. .

역사적으로, 많은 분석이 세포 이동10을 연구하기 위해 사용되었으며, 예컨대, 상처 분석11 ,12, TEFLON® 펜스(fence) 분석13 및 Boyden 챔버14 ,15가 있다. 상처 분석 및 TEFLON® 펜스 분석 둘 모두는 2D로 세포 이동을 연구하는 것으로 제한된다. Boyden 챔버는 생리적 3D 환경을 가장 근접하게 흉내내지만, 세포 이동을 실시간으로 정량화하는데 도움이 되지 않는다. 콜라겐 젤내에 엠배드된(embeded) 내피 세포 코팅된 비드(bead) 또는 스페로이드(spheroid)를 사용하는 또 다른 분석은 3차원 환경으로 관-유사 구조를 생성시킬 수 있었다. 이 분석은 안정한 관-유사 구조의 생성 및 다른 세포 타입과의 공배양을 가능하게 하였지만16-18, 최초의 내피 세포 시딩 표면은 생체내에서 내피 세포가 겪게되는 유체-매트릭스 계면 및 유체 흐름과 같은 생리학적 인자를 고려하지 않은 경직성 비드이다. 더구나, 현재 분석으로, 화학운동성 및 화학주성 효과를 구별하기 어렵다. 세포 이동에 있어서, 화학주성(chemotaxis)은 화학주성물질을 향한 세포 이동을 나타내며, 한편, 화학운동성은 특정한 생화학적 인자의 존재하에서의 운동성(motility) 증가를 나타낸다. 제어된 구배를 유지함에 있어서의 기술적 어려움 때문에, 상기 두 개의 효과는 쉽게 구별되지 않는다. 현존하는 기술에 대한 도전은 (i) 생리학적으로 관련된 조건에서 기계적 그리고 생화학적 인자들의 정확한 제어를 제공하고; (ii) 우수한 광학적 해상도를 실시간으로 제공하고; (iii) 정량화를 위해 샘플 가변성을 최소화하고 민감도를 향상시키는 것이다.Historically, many assays have been used to study cell migration 10 , such as wound analysis 11 , 12 , TEFLON® fence analysis 13 and Boyden chamber 14 , 15 . Both wound analysis and TEFLON® fence analysis are limited to studying cell migration in 2D. Boyden chambers closely mimic the physiological 3D environment, but do not help to quantify cell migration in real time. Another analysis using endothelial cell coated beads or spheroids embedded in collagen gels could produce tube-like structures in a three-dimensional environment. This assay is a stable tube-but enables the generation and co-cultured with other cell types like structures 16-18, the first endothelial cell seeding surface fluid that endothelial cells undergo in vivo-like matrix interface, and fluid flow It is a rigid bead without considering physiological factors. Moreover, with current analysis, it is difficult to distinguish chemotaxis and chemotactic effects. In cell migration, chemotaxis refers to cell migration towards chemotaxis, while chemotaxis indicates increased motility in the presence of certain biochemical factors. Because of the technical difficulties in maintaining a controlled gradient, the two effects are not easily distinguished. The challenge to existing technologies is to (i) provide precise control of mechanical and biochemical factors under physiologically relevant conditions; (ii) provide good optical resolution in real time; (iii) Minimize sample variability and improve sensitivity for quantification.

미세제조 및 미세유체 기술은 다수의 환경 인자들의 정확한 제어를 가능하게 함에 의해 세포 이동을 연구함에 있어서 이 도전들을 극복하는 잠재성을 가진다. 그러나 이러한 영역에서의 현재의 노력은, 고립 인자(isolated factor)들을 계속 조사하는 것이었다. 예를 들어, 미세제조된 패턴은 증가된 강성도19 ,20의 방향으로의 우선적 이동의 증명을 가능하게 하였다. 미세유체 기술은 또한 생화학적 구배의 정확한 제어 및 일어난 세포 이동의 정량화를 가능하게 하였다21.Microfabrication and microfluidic technologies have the potential to overcome these challenges in studying cell migration by enabling precise control of many environmental factors. However, current efforts in this area have continued to investigate isolated factors. For example, the microfabricated pattern enabled the demonstration of preferential movement in the direction of increased stiffness 19 , 20 . Microfluidic technology has also enabled accurate control of biochemical gradients and quantification of cell migration 21 .

본 발명은, 원핵 및 진핵 세포 이동, 증식 및 분화를 포함하는 3차원 생물학적 반응의 형성 및 연구를 위한 그리고 중요한 생물학적 기능을 복제할 수 있는 시험관내 시스템의 개발을 위한 장치 및 방법을 제공하는 것이다.The present invention provides an apparatus and method for the formation and study of three-dimensional biological responses, including prokaryotic and eukaryotic cell migration, proliferation and differentiation, and for the development of in vitro systems capable of replicating important biological functions.

본 발명의 추가 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.Further objects and advantages of the invention will be apparent from the description and the claims.

도 1은 두 개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치(microfluidic device)의 개략적 도면이다.
도 2는 두 개의 유체-흐름을 가지는 미세유체 장치의 사진이다. 관심 세포는 상기 두 개의 흐름 경로의 어느 하나 또는 둘 모두에 도입(또는 "시딩(seeding)")되거나 또는 젤 골격에서 부유된다.
도 3은 세 개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사진이다. 관심있는 하나 또는 그 초과의 세포 타입은, 상기 세 흐름 경로 중 하나 이상의 경로의 임의의 조합으로 도입(또는 "시딩")되거나, 젤 골격에서 부유된다.
도 4a는, 3차원 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 개략도이다.
도 4b는 3개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사진이다. 진핵 세포가 상기 내부 흐름 경로내로 도입되었고, 외부 흐름 경로로 화학주성에 의해 이동되었다.
도 5는 3개의 유체-흐름 경로 및 2개의 횡단(transverse) 경로를 가지는 미세유체 장치의 개략도이며, 임의로 입구(예컨대 가압되거나 가압되지 않은 공기에 대한 입구) 및 흐름 경로들 중 하나 이상에서 유체 흐름을 제어하기 위한 밸브를 제공한다.
도 6은 박테리아를 위한 화학주성 분석에서 3개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사용을 보여주는 막대 그래프이다. 박테리아는 내부 흐름 경로내로 도입(또는 "시딩")되었고, 하나의 외부 흐름 경로에 배치된 자극 (또는 "조건(condition)") 쪽으로의 박테리아의 화학주성 이동이 다른 외부 흐름 경로에 배치된 대조군쪽으로의 박테리아 이동에 대해 측정되었다.
도 7a는 혈관신생 분석에서 미세유체 장치의 사용을 보여주는 그래프이다.
도 7b 및 7c는 관 형성이 계산되고 단순한 세포 이동과 구별되는 방식을 도시한다.
도 8은 세포 공-배양 분석에서 3개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사용의 개략도이다. U87MG 세포를 상기 내부 흐름 경로내로 도입되고, 인간 표피 성장 인자("hEGF")는 하나의 외부 흐름 경로내로 도입되고, 1차 피질 뉴런이 다른 외부 흐름 경로내로 도입된다.
도 9a는 세포 공-배양 분석에서 2개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사용의 개략도이다. 이 장치에서, 골격은 콜라겐을 포함하고, 광학적으로 투명한 물질은 현미경 커버 글래스이며, 기판 (폴리-디메틸 실록산 또는 "PDMS") 및 커버글래스는 다양한 물질, 예컨대 콜라겐 또는 폴리-D-리신("PDL")으로 코팅된다. 간세포가 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되어, 이들 세포가 콜라겐 골격의 표면에서 하나 이상의 세포층을 형성하도록 하는 조건 하에서 성장된다. 인간 미세혈관 내피 세포("MVEC")가 제 2 흐름 경로내로 도입되고 흐름 경로를 통한 유체 흐름이 있거나 유체 흐름이 없는("정적" 조건) 조건에서 성장된다. 간세포의 방향으로 상기 골격내로의 내피 세포 이동 및 세관(tubule)으로의 내피 세포 분화가 검출된다. 도 9b는 MVEC-간세포 공-배양 실험의 시간 경과(time-course)의 개략도이다. 세포 타입의 다양한 조합물이 본 발명의 다양한 구체예에서 상기 장치내로 도입된다.
도 10은 본 발명의 구체예의 사진으로서, 여기서 미세유체 장치가 멀티-웰(multi-well) 조직 배양 플레이트의 인접 웰들에 배치되고; 상기 장치의 고처리량 용도를 가능하게 하기 위해 추가의 변화가 이루어진다.
도 11a는 골격을 가로지르는 구배의 형성을 증명하는 선 그래프이다. 도 11b는 상기 미세유체 장치의 일부에서 세포 위치를 보여주는 개략도이다. 유체-흐름 경로내로 도입된 세포는 상기 골격의 표면에 부착될 수 있거나 상기 골격 물질에 침입할 수 있다. 대안적으로, 세포는 유체-흐름 경로와 접촉하고 있는 광학적으로 투명한 물질(여기서 유리 커버슬립)에 부착될 수 있다. 도 11c는 본 발명의 일 구체예를 나타내는 개략도로서, 여기서 상기 유체(배지 저장소로부터)는, 유체 출구에 진공을 적용함에 의해 (펌프 소스로부터) 또는 모세관 작용에 의해, 상기 장치에 도입된다.
도 12a는 어떻게 온도 및 습도가 장치에서 조절되는지를 증명하는 미세유체 장치의 일부의 개략적 단면도이다. 도 12b는 미세유체 장치 및 미세유체 장치 환경에서 생리학적 조건을 유지하기 위한 관련 시스템의 사진이다.
도 13는 도 12b에 어셈블링되어 도시된 미세유체 장치 및 관련 시스템의 사진이다.
도 14a는, 골격이 내부에 형성되어 있는, 스태거드(staggered) 마이크로-필라 어레이를 나타내는 미세유체 장치의 일부의 개략도이다. 도 14b는 상기 미세유체 장치의 골격 및 어셈블리의 형성을 보여주는 개략도이다. 도 14c는 미세유체 장치 및 관련된 시스템의 사진이다. 도 14d는 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색된 콜라겐을 함유하는 골격을 예시하는 미세유체 장치의 일부의 사진이다. 유체-흐름 경로는 상기 사진의 상부 및 하부에 도시되어 있다.
도 15는 미세유체 장치의 일련의 사진이며, 이 장치내에서 내피 세포가 MTLn3 래트 유방 선암 세포, U87MG 인간 교아종 세포 또는 평활근 세포(SMC)와 공배양된다.
도 16a-l은 미세유체 장치의 골격에서 세관을 형성한 내피 세포의 일련의 타입-랩스(time-lapse) 사진이다.
도 17a-k는 미세유체 장치의 골격에서 세관을 형성한 내피 세포의 일련의 타입-랩스 사진이다.
도 18a-c는 미세유체 장치의 골격에서 세관을 형성한 내피 세포의 일련의 사진이다.
도 19a는 다수의 (예를 들어, 3개의) 유체-흐름 경로 및 골격을 나타내는 미세유체 장치의 일부의 개략적 단면도이다. 도 19b는 미세유체 장치의 골격의 사진이다. 도 19c-d는 시간에 따른 골격을 통한 용질 확산을 보여주는 선 그래프이다.
도 20a-c는 다수의 유체-흐름 경로 및 골격을 나타내는 미세유체 장치의 일부를 보여주는 일련의 사진이다. 도 20d-g는 VEGF와 같은 자극에 반응한, 시간에 따른 골격을 통한 유도된 세포 이동을 보여주는 일련의 선 그래프이다.
도 21a-d는 루멘-함유 세관으로 분화되도록 0.2% 콜라겐 골격을 통해 이동하는 내피 세포를 보여주는 일련의 사진이다.
도 22a는 젤 "케이지(cage)"를 가로지르는 구배를 보여준다. 형광 덱스트란 (40 kDa)을 사용하여 μFD로 생성 구배의 능력을 나타내었다. 상기 젤 "케이지"를 가로지르는 (그러한 크기 범위내에서 비반응성 용질을 시뮬레이션하기 위해 사용된) 덱스트란의 형광 강도 및 농도의 시간-경과가 도시되어 있다. 상기 플롯은 40시간 초과 동안 플롯된 대표적 실험 곡선을 보여준다. 도 22b는 세포 배양 분석의 개략도이다. (상부) EC 스프라우팅(sprouting) 분석. 세포는, 생리학적 관련 극성을 가지는 3차원 젤 상에서 배양된다, (중간) 3D 캡슐화 분석. 세포는, 젤내에 부유되어 있고 처음에는 서로 분리되어 있다, (하부) 2D 이동 분석. 세포는 주로, ECM 물질 (피브로넥틴)로 코팅된 유리 기판 (넌-컴플라이언트(non-compliant))상에 단층을 형성한다. 도 22c는 다양한 배양 흐름 구성을 묘사한다. (1) 정지 배양을 위해, 배지의 점적(droplet)이 입구 및 출구 포트상에 배치된다. 장치는 인큐베이터내의 국소적 고습도 (수분 함유 페트리 디쉬) 2차 컨테이너에서 유지된다. (2) 액체 저장소의 높이 차이, 젤 케이지를 가로지르는 압력 구배를 부과하기 위한 셋업이 사용된다. (3) 미세유체 플랫폼. 마이크로 채널내 전단 스트레스의 생리학적 수준을 만들기 위해 사용되는 플랫폼의 개략도이다. 도 22d는 젤 영역내의 고정된 위치에서의 표준화된 강도의 값을 보여주는 플롯을 묘사하고, 실선은 이론적 예상치이고, 형태-마커(원 (백색(open)-중간, 흑색-싱크 채널 근처) 및 정사각형은 예시적 장치에 대한 것임)가 도시되어 있다. 도 22e는 DFD에서 3차원 골격을 통한 가질 흐름을 만들기 위한 표준화된 압력 차이(dP/dPmax)의 전개에 대한 실험 결과를 묘사하며, Pa의 값은 최초 압력 차이를 가리킨다.
도 23은 미세유체 분석 개발을 위한 실험 프로토콜을 묘사한다. 도 23a는 소프트 리소그래피(soft lithography) 및 표면 처리에 의해 만들어진 제조된 PDMS 장치를 보여준다. 도 23b는 채널 사이의 골격 채널내의 채워진 젤 골격(음영짐)을 묘사한다. 도 23c는 두 채널을 채우는 배지(왼쪽, 오른쪽 및 중심)을 묘사한다. 도 23d는 중심 세포 채널내의 세포 시딩(구체(sphere))을 묘사한다. 도 23e는 상기 조건 채널(condition channel)에 적용된 화학적 인자(오른쪽)를 묘사한다. 도 23f는 배지 및 화학적 인자가 채워진 후의 미세유체 장치를 묘사한다. 점적은 상기 채널로부터 배지의 증발을 피하기 위해 모든 입구 포트에 배치된다. 배지는 간단히 기존의 점적을 흡인하고 새로운 점적을 부가함에 의해 만들어진 모세관 힘에 의해, 대체될 수 있다. 도 23g는 조건 측면(condition side) 및 대조군 측면(control side) 사이의 세포 이동 거동의 직접 비교를 가능하게 하는 미세유체 세포 이동 분석을 위한 개략도이다.
도 24는 (a) pH 7.4에서 중합된 0.2%(2.0mg/mL) 콜라겐 젤 골격에서 이동된 세포의 표준화된 상대적 주계(perimeter)의 그래프를 묘사한다. 'No VEGF'는 VEGF 구배 없는 네거티브 대조군으로서 기능한다. 'n 일째에서의 VEGF'는 VEGF가 세포 시딩후 n일째에 처음 적용되어 상기 실험의 종료시까지 계속됨을 의미한다. (b) 콜라겐 젤 골격내의 이동된 세포의 표준화된 상대적 면적의 그래프이다. (c 및 d) 콜라겐 젤 골격내의 이동된 세포의 표준화된 상대적 주계 및 면적의 그래프이다. 각 포인트는 각 조건에 대해 n ¼ 8 (8개 골격; 4개 장치)을 사용한 평균을 나타낸다. 에러 바(error bar)는 표준 편차를 보여준다.
도 25는 VEGF 구배와 함께 다른 세포 타입(U87MG, MTLn3, 1OT 1/2)으로부터의 신호에 따른 HMVEC 세포의 이동을 묘사한다. 세포 채널 내 배양된 HMVEC의 표준화된 상대 면적의 변화가 도시되는데, 다양한 세포 타입이 조건 채널에서 사용되고 (U87MG 세포, 다양한 시딩 밀도의 MTLn3 세포 및 10T 1/2 세포), 세포가 없는 대조 배지 단독 (대조 배지), 및 20 ng/mL VEGF (VEGF, 20 ng/mL)를 지닌 대조 배지가 사용된다. 고밀도로 시딩된 MTLn3 세포 및 VEGF 함유 배지는 강하게 HMVEC를 유인하였고, 한편 저밀도 MTLn3 세포 및 U87MG 세포는 그렇제 못하였다. 조건 채널에서 1OT 1/2을 사용한 경우, HMVEC는 대조군 측면으로 이동하는 경향이 있었다. 각 지점은 각 조건을 위한 n ¼ 8(8개 골격; 4개 장치)을 사용한 평균을 보여준다. 에러 바는 표준 편차를 보여준다.
도 26은 조직-공학처리된 구조물의 혈관신생을 위한 미세유체 공배양 플랫폼을 묘사한다. A) PDMS로 만들어진 미세유체 장치의 개략도 및 치수. 두 평행한 미세유체 채널이 마이크로패턴화된 PDMS 장치와 커버슬립 사이에 형성된다. 젤 골격(예를 들어, 타입 I 콜라겐)은 PDMS 포스트(post)에 의해 기계적으로 지지되는 상기 미세유체 채널 사이에 위치된다. B) 정지(왼쪽) 및 흐름(오른쪽) 조건 하에서 배양된 상기 미세유체 장치의 사진. 배양 배지의 점적은 정지 배양을 위해 미세유체 채널의 각 출구상에 배치된다. 저장소는 흐름 배양을 위해 미세유체 채널에 연결되어 있다.
도 27은 두 미세유체 채널 사이의 5-mm H2O 압력 차이에 의해 발생된 젤 골격을 가로지르는 간질 흐름을 묘사한다. 간세포에 의한 콜라겐 젤의 침투율은, 저장소내 배지 수준의 변위를 측정함에 의해 결정되었고, 속도는 젤 침투율 및 분석 솔루션(analytical solution)에 기초하여 계산하였다. 상기 속도는 시간에 따라 감소되지만 상기 배양 배지를 변화시킴에 의해 복원된다.
도 28은 간세포에 의해 3D 조직-유사 구조의 형성에 대한 간질 흐름 방향의 효과를 묘사한다. A) 정방향 흐름(화살표, 0일째)에 이어 역방향 흐름(화살표, 1일째 초과)으로 배양된 간세포의 상응하는 상-컨트라스트(phase-contrast) 이미지. 간세포가 점차 3D 조직-유사 구조로 조직화됨이 주목된다. B) 역방향 흐름으로 배양된 간세포의 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 2일째에 미세유체 채널상에 세포가 퍼지기 시작하였다 (화살표 머리, 2일째). 상기 미세유체 채널상으로 세포가 이동함에 따라, 세포 구조가 얇게 되었다.
도 29는 C) 3일째의 간세포 형태형성의 정량화를 묘사한다. 상기 미세유체 채널상에 퍼져있는 간세포의 면적은, 상기 미세유체 채널의 면적에 의해 측정되었고 표준화되었다. 에러 바 = SEM (n=10, N=3). *정방향에 이은 역방향에 대해 P < 0.05. D) 액틴 필라멘트가 염색되었고, z-스택(stack) 이미지를 하부(커버슬립 근처), 10 ㎛, 및 40 ㎛ 높이의 z-면에서 공초점 레이저-스캐닝 현미경에 의해 촬영하였다. 화살표 머리는 간세포 조직-유사 구조의 가장자리를 가리킨다. 세포는 역방향 흐름 단독의 경우의 구조 보다 정방향 흐름에 이은 역방향 흐름의 경우에 더 두꺼운 구조를 형성하였다.
도 30은 상기 미세유체 플랫폼에서 만들어진 3D 혈관신생 모델을 묘사한다. A) 정지 조건 하에서 배양된 hMVECs의 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 세포들은 상기 콜라겐 젤 골격내로 침투하였고, 혈관 스프라우트를 형성하였다 (화살표 머리, 1일째). 스프라우트는 신장되었고 모세관-유사 구조를 형성하였다(화살표 머리, 2일째 및 3일째). B) 상응하는 상-컨트라스트 및 형광 이미지. hMVECs는 5일째에 고정되었고 액틴 필라멘트 및 핵을 위해 염색되었다. 단면 이미지는 hMVEC가 루멘을 가진 모세관-유사 구조를 형성하였고 (i,ii), 반면에 팁 세포는 루멘을 형성하지 못하였음 (iii)을 보여준다. C) 정지 조건 하에서 배양된 rMVEC의 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 세포들은 시트-유사 구조로서 젤 골격내로 이동되었다 (화살표 머리). D) 상응하는 상-컨트라스트 및 형광 이미지. rMVEC는 7일째에 고정되었고 액틴 필라멘트를 위해 염색되었다. 단면 이미지는, 세포들이 시트-유사 구조를 형성하였음을 보여주었다(i-iii).
도 31은 미세유체 플랫폼에서 간세포-rMVEC 공배양을 묘사한다. A) 공배양을 위한 실험 프로토콜. B) 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 간세포는 콜라겐 젤 골격의 측벽 상에 시딩되었고, 간질 흐름은 적용되었다(화살표, 0일째). 흐름 방향은 1일째에 거꾸로 되었다(화살표, 1일째). 간질 흐름은 정지되었고 rMVECs은 2일째 상기 젤 골격의 다른 측면에 더해졌다(2-0일째). 간세포는 3D 조직과 유사한 구조를 형성하였다(3-1일). 일부 rMVECs는 4-2일째 혈관 스프라우트를 형성하기 시작하였다(화살표 머리, 4-2일째). 혈관 스프라우트는 상기 젤 골격을 가로질러 신장되었고 간세포 조직-유사 구조(화살표 머리)에 도달되었다. 일부 간세포는 또한 rMVECs의 모세관과 같은 구조를 향하여 이동되었다(화살표, 7-5 및 8-6일째).
도 32는 rMVEC 형태형성의 양화를 묘사한다. 그래프는 n일째의 이동하는 rMVEC의 표준화된 영역 증가 A~n와 주계 증가 P~n 사이의 관계를 보여준다. 공배양에서, 상기 데이터는 대조 배양 보다 더 큰 P~n 및 더 작은 A~n를 보여준다. 각 플롯은 각 일째의 값을 보여준다. "3-1일째"는 간세포의 3일째 및 rMVEC의 1일째를 보여준다. 에러 바 = SEM (간세포-rMVEC 공배양의 경우, n=16, N=A; rMVEC 배양의 경우, n=15, N=3). 사진은 간세포 조직-유사 구조의 상응하는 상-컨트라스트 및 형광 이미지를 보여준다. 왼쪽 패널: 공배양의 13-11일째의 간세포에서 BC(화살표머리)내로 분비된 FD의 대사산물. 오른쪽 패널: 공배양의 10-8일째의 간세포의 EROD 활성.
도 33은 간세포-rMVEC 공배양에서 rMVEC의 튜브 형성 과정을 묘사한다. A) 공배양에서 rMVEC의 상-컨트라스트 이미지. B) 로다민-팔로이딘으로 염색된 모세관과 같은 구조의 z-프로젝션 이미지. 세포들은 정지 조건 하에서 배양되었고, 공배양의 12-10일째에 고정되었다. 이미지 필드는 A의 점선 프레임(dotted frame)에 상응한다. C) 구조의 방향을 따른 모세관-유사 구조의 단면 이미지. rMVEC가 루미날(luminal) 구조를 형성하였지만, 어떠한 루멘도 팁 영역에서 발견되지 않았음이 주목된다. D) B의 모세관-유사 구조의 수직 단면 이미지. 숫자들은 B에서 점선에 상응한다. 스케일 바(scale bar) = 50 ㎛ (B); 20 ㎛ (C).
도 34는 젤 골격에서의 확산 분석을 묘사한다. A) 0, 5 및 30분째에서의 미세유체 플랫폼내의 젤 골격을 가로지른 40-kDa 형광 덱스트란의 분포. B) 정상 상태(왼쪽) 및 상응하는 수치적 시뮬레이션(numerical simulation)(오른쪽으로) 표현된 실험 결과. 강도는 실험 결과를 시뮬레이션과 비교하기 위해 최대 값으로 표준화되었다. 표준화된 농도를 위해 이미지가 도시된다. 1 is a schematic representation of a microfluidic device having two fluid-flow paths.
2 is a photograph of a microfluidic device having two fluid-flows. The cells of interest are introduced (or “seeding”) in either or both of these two flow pathways or suspended in the gel backbone.
3 is a photograph of a microfluidic device having three fluid-flow paths. One or more cell types of interest are introduced (or “seed”) in any combination of one or more of the three flow pathways, or suspended in the gel backbone.
4A is a schematic diagram of a microfluidic device having a three-dimensional fluid-flow path.
4B is a photograph of a microfluidic device with three fluid-flow paths. Eukaryotic cells were introduced into the inner flow path and migrated chemotactically to the outer flow path.
5 is a schematic representation of a microfluidic device having three fluid-flow paths and two transverse paths, optionally with fluid flow at one or more of the inlet (eg, inlet to pressurized or unpressurized air) and flow paths; It provides a valve for controlling.
6 is a bar graph showing the use of a microfluidic device with three fluid-flow pathways in a chemotaxis assay for bacteria. The bacteria were introduced (or "seeded") into the inner flow path and the chemotactic migration of the bacteria towards the stimulus (or "condition") placed in one outer flow path towards the control placed in the other outer flow path. Was measured for bacterial migration.
7A is a graph showing the use of microfluidic devices in angiogenesis analysis.
7B and 7C show how tube formation is calculated and distinguished from simple cell migration.
8 is a schematic of the use of a microfluidic device with three fluid-flow pathways in cell co-culture assays. U87MG cells are introduced into the internal flow pathway, human epidermal growth factor (“hEGF”) is introduced into one external flow pathway, and primary cortical neurons are introduced into the other external flow pathway.
9A is a schematic of the use of a microfluidic device having two fluid-flow pathways in cell co-culture assays. In this device, the backbone comprises collagen, the optically clear material is a microscope cover glass, and the substrate (poly-dimethyl siloxane or "PDMS") and cover glass are various materials such as collagen or poly-D-lysine ("PDL"). Coated with "). Hepatocytes are introduced into the first fluid-flow pathway to grow under conditions such that these cells form one or more cell layers at the surface of the collagen backbone. Human microvascular endothelial cells (“MVECs”) are introduced into the second flow path and grown in conditions with or without fluid flow (“static” conditions) through the flow path. Endothelial cell migration into the framework in the direction of hepatocytes and endothelial cell differentiation into tubules is detected. 9B is a schematic of the time-course of MVEC-hepatocyte co-culture experiments. Various combinations of cell types are introduced into the device in various embodiments of the invention.
10 is a photograph of an embodiment of the present invention, wherein the microfluidic device is placed in adjacent wells of a multi-well tissue culture plate; Further changes are made to enable high throughput applications of the device.
11A is a line graph demonstrating the formation of a gradient across the skeleton. 11B is a schematic showing the cell location in a portion of the microfluidic device. Cells introduced into the fluid-flow pathway may attach to or invade the framework material. Alternatively, the cells can be attached to an optically transparent material (here glass coverslips) in contact with the fluid-flow path. 11C is a schematic representation of one embodiment of the present invention wherein the fluid (from the medium reservoir) is introduced into the device by applying a vacuum at the fluid outlet (from the pump source) or by capillary action.
12A is a schematic cross-sectional view of a portion of a microfluidic device demonstrating how temperature and humidity are regulated in the device. 12B is a photograph of a microfluidic device and associated system for maintaining physiological conditions in a microfluidic device environment.
Figure 13 is a photograph of the microfluidic device and associated system is shown assembled in Figure 12b.
14A is a schematic diagram of a portion of a microfluidic device showing a staggered micro-pillar array with a skeleton formed therein. 14B is a schematic diagram showing formation of a skeleton and an assembly of the microfluidic device. 14C is a photograph of a microfluidic device and associated system. FIG. 14D is a photograph of a portion of a microfluidic device illustrating a skeleton containing collagen stained with Coomassie Blue. FIG. Fluid-flow paths are shown at the top and bottom of the photograph.
FIG. 15 is a series of photographs of microfluidic devices in which endothelial cells are co-cultured with MTLn3 rat breast adenocarcinoma cells, U87MG human glioblastoma cells or smooth muscle cells (SMC).
16A-1 are a series of time-lapse photographs of endothelial cells that form tubules in the skeleton of a microfluidic device.
17A-K are a series of type-lapse photographs of endothelial cells that form tubules in the skeleton of a microfluidic device.
18A-C are a series of photographs of endothelial cells that form tubules in the skeleton of a microfluidic device.
19A is a schematic cross-sectional view of a portion of a microfluidic device showing a number of (eg, three) fluid-flow paths and skeletons. 19B is a photograph of a skeleton of a microfluidic device. 19C-D are line graphs showing solute diffusion through the skeleton over time.
20A-C are a series of photographs showing portions of microfluidic devices showing multiple fluid-flow pathways and backbones. 20D-G are a series of line graphs showing induced cell migration through the skeleton over time in response to stimuli such as VEGF.
21A-D are a series of photographs showing endothelial cells moving through a 0.2% collagen backbone to differentiate into lumen-containing tubules.
22A shows the gradient across the gel “cage”. Fluorescent dextran (40 kDa) was used to show the ability of the production gradient to μFD. The time-lapse of fluorescence intensity and concentration of dextran (used to simulate non-reactive solutes within such size ranges) across the gel “cage” is shown. The plot shows representative experimental curves plotted for over 40 hours. 22B is a schematic of the cell culture assay. (Top) EC Sprouting Assay. Cells are cultured on three-dimensional gels with physiologically related polarity, (middle) 3D encapsulation assay. The cells are suspended in the gel and initially separated from each other, (bottom) 2D migration assay. The cells mainly form a monolayer on a glass substrate (non-compliant) coated with ECM material (fibronectin). 22C depicts various culture flow configurations. (1) For stationary culture, droplets of media are placed on the inlet and outlet ports. The device is maintained in a local high humidity (moisture containing petri dish) secondary container in an incubator. (2) A setup is used to impose the height difference of the liquid reservoir, the pressure gradient across the gel cage. (3) microfluidic platforms. A schematic of the platform used to create the physiological level of shear stress in the microchannels. FIG. 22D depicts a plot showing values of standardized intensity at fixed locations within the gel region, solid line is theoretical estimate, shape-marker (circle (open-middle, near black-sink channel) and square) Is for an example device). 22E depicts the experimental results for the development of a standardized pressure difference (dP / dPmax) to make a flow to have through the three-dimensional framework in the DFD, with the value of Pa indicating the initial pressure difference.
23 depicts an experimental protocol for developing microfluidic assays. 23A shows a manufactured PDMS device made by soft lithography and surface treatment. FIG. 23B depicts the filled gel backbone (shaded) in the backbone channel between channels. 23C depicts the medium (left, right and center) filling two channels. 23D depicts cell seeding (spheres) in the central cell channel. FIG. 23E depicts the chemical factor (right) applied to the condition channel. 23F depicts the microfluidic device after the medium and chemical factors have been filled. Droplets are placed at all inlet ports to avoid evaporation of media from the channels. The medium can be replaced by capillary forces created by simply aspirating the existing drop and adding a new drop. FIG. 23G is a schematic diagram for microfluidic cell migration assays that enables a direct comparison of cell migration behavior between condition side and control side. FIG.
FIG. 24 depicts (a) a graph of normalized relative perimeter of cells migrated in 0.2% (2.0 mg / mL) collagen gel backbone polymerized at pH 7.4. 'No VEGF' functions as a negative control without VEGF gradient. 'VEGF on day n' means that VEGF is first applied on day n after cell seeding and continues until the end of the experiment. (b) is a graph of normalized relative area of migrated cells in collagen gel backbone. (c and d) is a graph of normalized relative lineage and area of migrated cells in the collagen gel backbone. Each point represents the mean using n 1/4 (8 skeletons; 4 devices) for each condition. Error bars show the standard deviation.
25 depicts migration of HMVEC cells with signals from other cell types (U87MG, MTLn3, 1OT 1/2) with VEGF gradients. Changes in the standardized relative area of HMVEC cultured in the cell channel are shown, where various cell types are used in the condition channel (U87MG cells, MTLn3 cells at various seeding densities and 10T 1/2 cells), and cell-free control medium alone ( Control medium), and control medium with 20 ng / mL VEGF (VEGF, 20 ng / mL) is used. High density seeded MTLn3 cells and VEGF containing medium strongly attracted HMVEC, while low density MTLn3 cells and U87MG cells did not. When 1OT 1/2 was used in the condition channel, HMVECs tended to migrate to the control side. Each point shows the mean using n¼8 (8 skeletons; 4 devices) for each condition. Error bars show standard deviation.
FIG. 26 depicts a microfluidic coculture platform for angiogenesis of tissue-engineered constructs. A) Schematic and dimensions of the microfluidic device made of PDMS. Two parallel microfluidic channels are formed between the micropatterned PDMS device and the coverslip. A gel backbone (eg type I collagen) is located between the microfluidic channels that are mechanically supported by a PDMS post. B) Picture of the microfluidic device incubated under stationary (left) and flow (right) conditions. Droplets of the culture medium are placed on each outlet of the microfluidic channel for stationary culture. The reservoir is connected to the microfluidic channel for flow culture.
FIG. 27 depicts the interstitial flow across the gel backbone generated by the 5-mm H 2 O pressure difference between the two microfluidic channels. Penetration of collagen gel by hepatocytes was determined by measuring displacement of media levels in the reservoir, and rates were calculated based on gel permeation rate and analytical solution. The rate decreases with time but is restored by changing the culture medium.
28 depicts the effect of interstitial flow direction on the formation of 3D tissue-like structures by hepatocytes. A) Corresponding phase-contrast image of hepatocytes cultured with forward flow (arrow, day 0) followed by reverse flow (arrow, day 1). It is noted that hepatocytes are gradually organized into 3D tissue-like structures. B) Corresponding phase-contrast image of hepatocytes cultured in reverse flow. On day 2, cells began to spread on the microfluidic channel (arrow head, day 2). As the cells migrated onto the microfluidic channel, the cell structure became thinner.
29 depicts quantification of hepatocyte morphogenesis on day 3). The area of hepatocytes spread on the microfluidic channel was measured and normalized by the area of the microfluidic channel. Error bar = SEM (n = 10, N = 3). * P <0.05 for forward followed by reverse. D) Actin filaments were stained and z-stack images were taken by confocal laser-scanning microscopes on the z-plane at the bottom (near the coverslip), 10 μm, and 40 μm high. The arrow head points to the edge of the hepatocyte tissue-like structure. The cells formed a thicker structure in the case of the reverse flow than in the case of the reverse flow alone.
30 depicts a 3D angiogenesis model made on the microfluidic platform. A) Corresponding phase-contrast images of hMVECs cultured under stationary conditions. Cells penetrated into the collagen gel backbone and formed vascular sprouts (arrow heads, day 1). Sprouts elongated and formed capillary-like structures (arrow heads, days 2 and 3). B) Corresponding phase-contrast and fluorescence images. hMVECs were fixed on day 5 and stained for actin filaments and nuclei. Cross-sectional images show that hMVECs formed capillary-like structures with lumens (i, ii), while tip cells failed to form lumens (iii). C) Corresponding phase-contrast image of rMVECs cultured under stationary conditions. Cells migrated into the gel backbone as a sheet-like structure (arrow head). D) corresponding phase-contrast and fluorescence images. rMVEC was fixed on day 7 and stained for actin filaments. Cross-sectional images showed that the cells formed a sheet-like structure (i-iii).
FIG. 31 depicts hepatocyte-rMVEC coculture on microfluidic platform. A) Experimental protocol for coculture. B) corresponding phase-contrast image. Hepatocytes were seeded on the sidewalls of the collagen gel backbone and interstitial flow was applied (arrow, day 0). The flow direction was reversed on day 1 (arrow, day 1). Interstitial flow was stopped and rMVECs were added to the other side of the gel backbone on day 2 (day 2-0). Hepatocytes formed a structure similar to 3D tissue (day 3-1). Some rMVECs began to form vascular sprouts on days 4-2 (arrow heads, days 4-2). Vascular sprouts were stretched across the gel backbone and reached a hepatocyte tissue-like structure (arrow head). Some hepatocytes also migrated towards capillary-like structures of rMVECs (arrows, days 7-5 and 8-6).
32 depicts positive of rMVEC morphogenesis. The graph shows the relationship between the normalized area increase A-n and the weekly increase P-n of the moving rMVEC on day n. In co-cultures, the data show larger P-n and smaller A-n than control cultures. Each plot shows the value of each day. “Day 3-1” shows Day 3 of Hepatocytes and Day 1 of rMVEC. Error bar = SEM (n = 16, N = A for hepatocyte-rMVEC coculture; n = 15, N = 3 for rMVEC culture). The picture shows the corresponding phase-contrast and fluorescence images of hepatocyte tissue-like structures. Left panel: Metabolite of FD secreted into BC (arrowhead) in hepatocytes on day 13-11 of coculture. Right panel: EROD activity of hepatocytes on day 10-8 of coculture.
33 depicts the tube formation process of rMVEC in hepatocyte-rMVEC coculture. A) Phase-contrast image of rMVEC in coculture. B) z-projection images of capillary-like structures stained with rhodamine-palloidine. Cells were cultured under stationary conditions and fixed on day 12-10 of coculture. The image field corresponds to the dotted frame of A. C) Cross-sectional image of capillary-like structure along the direction of the structure. Note that although rMVEC formed a luminal structure, no lumen was found in the tip region. D) Vertical cross-sectional image of capillary-like structure of B. The numbers correspond to the dotted lines in B. Scale bar = 50 μm (B); 20 μm (C).
34 depicts the diffusion analysis in the gel backbone. A) Distribution of 40-kDa fluorescent dextran across the gel backbone in the microfluidic platform at 0, 5 and 30 minutes. B) Experimental results expressed in steady state (left) and the corresponding numerical simulation (right). Intensities were normalized to maximum values to compare the experimental results with simulations. Images are shown for normalized density.

본원에 명백하게 정의되지 않았다면, 모든 기술적 및 과학적 용어는, 당업자에 의해 공통적으로 이해되어 지는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 용어가 단수로 제공된다면, 본 발명자는 또한 그 용어의 복수를 고려하고 있다.Unless expressly defined herein, all technical and scientific terms have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. If a term is provided in the singular, the inventors also contemplate the plural of the term.

본 발명의 한 측면은, 장치 또는 시스템에 관한 것이며, 특히 다중-경로 미세유체 장치에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "미세유체 장치"는, 10 또는 5 밀리미터(mm) 이하의 치수(예를 들어, 높이, 길이 또는 깊이)을 가지는 하나 이상의 유체-흐름 경로를 포함하는 장치, 기구 또는 시스템을 지칭한다. 일반적으로, 상기 유체-흐름 경로는 1mm 이하의 너비를 가질 것이다. 본원에서 사용된, "유체-흐름 경로", "유체 경로" 또는 "흐름 경로"는 액체 또는 가스를 포함하는 유체가 지나갈 수 있는 임의의 채널, 튜브, 영역, 공간 또는 경로 또는 이의 일부를 지칭한다. "유체 흐름 경로"는 유체-흐름 경로의 일부를 포함한다.One aspect of the invention relates to an apparatus or system, and more particularly to a multi-path microfluidic device. As used herein, a "microfluidic device" is a device, apparatus or apparatus comprising one or more fluid-flow paths having dimensions (eg, height, length or depth) of 10 or 5 millimeters (mm) or less. Refers to the system. In general, the fluid-flow path will have a width of 1 mm or less. As used herein, “fluid-flow path”, “fluid path” or “flow path” refers to any channel, tube, region, space or path or portion thereof through which a fluid, including a liquid or gas, can pass. . "Fluid flow path" includes a portion of a fluid-flow path.

일 구체예에서, 상기 미세유체 장치는 기판을 포함하며, 여기서, 상기 기판 상에 또는 기판 내에, 둘 이상의 유체-흐름 경로가 배치된다. 상기 장치는 또한 상기 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질을 포함한다. 상기 장치는, 일반적으로 상기 장치의 한정된 영역 내에서, 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는 (예를 들어, 이들 사이의 공간을 채움에 의해) 골격을 추가로 포함한다. 이 골격은 대체로 약 1 ㎛ 이상의 최소의 직교 높이, 길이 및 깊이 치수를 가진다. 본원에서 사용된 바와 같이, "3차원 공간에서"란 문구는, 이러한 치수들이 3차원 유클리드 기하구조(Euclidean geometry)로 존재하는 경우, 3차원인 특성을 가지는 것을 지칭한다. 그러나, 비-유클리드의 공간 및 모양은 또한 본 발명에 포함된다. 임의로, 상기 장치는, 각 유체-흐름 경로를 위해 상기 유체 경로에 대한 입구를 가지고, 상기 유체 경로로부터의 출구를 가진다.In one embodiment, the microfluidic device comprises a substrate, wherein two or more fluid-flow paths are disposed on or within the substrate. The apparatus also includes an optically transparent material coupled to the substrate. The device further comprises a skeleton, generally in contact with (eg, by filling a space therebetween) with the substrate and the optically transparent material within a limited area of the device. This framework has generally minimum orthogonal height, length and depth dimensions of at least about 1 μm. As used herein, the phrase "in three-dimensional space" refers to having these three-dimensional properties when such dimensions exist in three-dimensional Euclidean geometry. However, the space and shape of non- Euclidean are also included in the present invention. Optionally, the device has an inlet to the fluid path for each fluid-flow path and an outlet from the fluid path.

상기 기판은, 일반적으로, 소프트 리소그래피 방법에 의해 형성된, 폴리-디메틸 실록산(PDMS)과 같은 고체 물질이며, 여기서, 상기 유체-흐름 경로는 상기 기판내의 채널이다. 두 개의 유체-흐름 경로가 동일한 기판에 존재하는 경우, 이 유체-흐름 경로들은, 이들의 길이의 일부 또는 전부에 걸쳐 실질적으로 평행하다. 각 유체-흐름 경로는 유체 입구 및 유체 출구를 포함할 수 있다. 유체 입구는 홀(hole), 채널 또는, 상기 장치의 외부로부터 상기 유체-흐름 경로내로 세포 배양 배지와 같은 유체가 이동되도록 하는 다른 수단이다. 유체 출구는 또한 홀, 채널 또는, 컨디셔닝된(conditioned) 또는 폐기용 세포 배양 배지와 같은 유체가 상기 장치로부터 배출되도록 하는 다른 수단이다. 당업자는, 마이크로제조 또는 미세유체학 분야에서 사용되는 다른 물질들이 본 발명의 기판을 생산하는데 유용하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 기판은 실리콘, 유리, 석영, 또는 플라스틱(예를 들어, 기판으로서 기능하는데 필요한 구조적 속성을 가지는 임의의 합성 또는 반-합성 폴리머)으로부터 형성될 수 있거나 이를 함유할 수 있다. 유용한 플라스틱은, 당업자에 알려져 있다. The substrate is generally a solid material, such as poly-dimethyl siloxane (PDMS), formed by a soft lithography method, wherein the fluid-flow path is a channel in the substrate. If two fluid-flow paths exist on the same substrate, these fluid-flow paths are substantially parallel over some or all of their length. Each fluid-flow path may comprise a fluid inlet and a fluid outlet. The fluid inlet is a hole, channel, or other means by which fluid, such as cell culture medium, is transferred from the outside of the device into the fluid-flow path. The fluid outlet is also a hole, channel or other means by which fluid, such as conditioned or discarded cell culture medium, is discharged from the device. Those skilled in the art will appreciate that other materials used in the microfabrication or microfluidics field are useful for producing the substrates of the present invention. For example, the substrate may be formed from or contain silicon, glass, quartz, or plastic (eg, any synthetic or semi-synthetic polymer having the structural properties necessary to function as a substrate). Useful plastics are known to those skilled in the art.

상기 유체-흐름 경로는 요망되는 흐름 저항을 만들기 위해 임의의 치수(예를 들어, 길이, 너비 또는 깊이)로 다양할 수 있다. 예를 들어, 흐름 경로를 통과하는 흐름 속도는 입구 및 출구를 가로지르는 유체정역학적(hydrostatic) 압력 구배에 따라 조절될 수 있다. 하나 또는 그 초과의 유체-흐름 경로는 저항 채널로서 기능할 수 있으며, 이는 상기 유체-흐름 경로가 사실상 연속식 또는 불연속식(박동성)으로, 유체 흐름에 대해 증가된 저항을 지님을 의미한다. 저항 채널은, 예를 들어, 유체 저항성을 증가시키는 구불구불한 곡선(tortuous curve) 또는 다른 기하학적 형태를 함유할 수 있다.The fluid-flow path can vary in any dimension (eg, length, width or depth) to make the desired flow resistance. For example, the flow rate through the flow path can be adjusted according to the hydrostatic pressure gradient across the inlet and outlet. One or more fluid-flow paths can function as resistance channels, meaning that the fluid-flow paths are substantially continuous or discontinuous (pulsatile), with increased resistance to fluid flow. The resistance channel may contain, for example, a tortuous curve or other geometry that increases fluid resistance.

특정 구체예에서, 본 발명은 압력 조절장치를 함유하는 미세유체 장치를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 압력 조절장치는, 흐르는 유체의 하나 또는 그 초과의 특성(예를 들어, 압력 또는 부피)의 제어를 가능하게 하는 임의의 기계적, 화학적 또는 다른 시스템을 포함한다. 압력 조절장치는 둘 또는 그 초과의 유체-흐름 경로 사이에 압력 차이를 만드는 하나 또는 그 초과의 밸브를 포함할 수 있다.In certain embodiments, the present invention provides a microfluidic device containing a pressure regulator. As used herein, a pressure regulator includes any mechanical, chemical or other system that enables control of one or more properties (eg, pressure or volume) of the flowing fluid. The pressure regulator may include one or more valves that make a pressure difference between the two or more fluid-flow paths.

상기 장치 내 함유된 상기 골격은 상기 유체-흐름 경로를 분리시키고 다작용성 지지부를 제공하며, 상기 지지부 상에서 세포는 상기 장치에 제공된 생리학적 조건에 의존하여 이동, 증식 또는 분화할 수 있다. 박테리아를 포함하는 원핵 세포가 포함되며, 진핵 세포도 포함된다. 하나 초과의 세포 타입이 동시에 또는 연속적으로 상기 골격에 도입될 수 있다. 일반적으로, 상기 골격은 고체 또는 반-고체 생물학적 또는 생체적합성 물질(또는 바이오물질)을 함유하며, 종종 이는 폴리머의 형태이다. 유리한 폴리머는 콜라겐이며, 이는 모노머가 풍부한 용액으로 존재할 수 있고 상기 골격을 형성하도록 인 시튜(in situ) 중합될 수 있다. 콜라겐 또는 다른 폴리머 및 임의로 다른 성분을 함유하는 골격은, 생물학적 엔티티(biological entity)의 확산 뿐만 아니라 박테리아 및 동물 세포의 유도된 이동을 가능하게 한다. 예를 들어, 생물학적 엔티티는 세포 또는 세포소기관(subcellular) 성분, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 또는 효소이다. 성장 인자 또는 다른 생물학적 엔티티는 골격 내에서 균일하게 분포되거나 제어된 구배로 분포될 수 있거나, 상기 골격에 구속(tethered)될 수 있다. 골격은, 상기 유체-흐름 경로 내 함유된 세포와 상호작용할 수 있는 약물 및 다른 작은 분자를 확산시킬 수 있다. 본원에 기재된 상기 장치는, 약물 및 다른 화합물의 세포 단층 또는 골격 침투율을 측정하는 것에 더하여, 시험 화합물의 확산 계수를 계산하는데 유용하다.The backbone contained within the device separates the fluid-flow pathway and provides multifunctional support, on which cells can migrate, proliferate or differentiate depending on the physiological conditions provided to the device. Prokaryotic cells, including bacteria, are included, including eukaryotic cells. More than one cell type can be introduced into the scaffold simultaneously or sequentially. Generally, the backbone contains a solid or semi-solid biological or biocompatible material (or biomaterial), often in the form of a polymer. An advantageous polymer is collagen, which can be present in monomer-rich solutions and can be polymerized in situ to form the backbone. Skeletons containing collagen or other polymers and optionally other components allow for the diffusion of biological entities as well as the induced migration of bacterial and animal cells. For example, biological entities are cellular or subcellular components such as growth factors, cytokines, hormones, antibodies, or enzymes. Growth factors or other biological entities may be uniformly distributed within the framework or distributed in a controlled gradient, or may be tethered to the framework. The backbone can diffuse drugs and other small molecules that can interact with cells contained within the fluid-flow pathway. The devices described herein are useful for calculating diffusion coefficients of test compounds, in addition to measuring cellular monolayer or skeletal penetration of drugs and other compounds.

특정 구체예에서, 상기 골격은 골격 물질과 다양한 세포의 상호작용을 평가하는데 사용될 수 있다. 여러 골격 물질은 사용될 수 있다. 다양한 골격 물질에 대한 여러 생물학적 엔티티의 결합 친화도가 시험될 수 있다.In certain embodiments, the scaffold can be used to assess the interaction of various cells with skeletal material. Various framework materials can be used. The binding affinity of various biological entities for various backbone materials can be tested.

일부 구체예에서, 상기 골격은 Matrigel™ (BD Biosciences, San Jose, CA)를 함유한다. 특정 구체예에서, 상기 골격은 광경화성 폴리머, 예컨대 디메트아크릴레이트을 함유하거나 이로부터 형성된다. 참조 [Gerecht, et al, Biomaterials 28 (32): 4826-4835 (2007)]. 특정 구체예에서, 상기 골격은 펩티드를 함유하거나 이로부터 형성된다. 특정 구체예에서, 상기 골격은 PEG와 같은 합성 폴리머를 함유하거나 이로부터 형성된다.In some embodiments, the backbone contains Matrigel ™ (BD Biosciences, San Jose, CA). In certain embodiments, the backbone contains or is formed from a photocurable polymer such as dimethacrylate. See Gerecht, et al, Biomaterials 28 (32): 4826-4835 (2007). In certain embodiments, the backbone contains or is formed from peptides. In certain embodiments, the backbone contains or is formed from a synthetic polymer such as PEG.

따라서, 상기 미세유체 장치는 상기 골격이 삽입되기 전의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 유체-흐름 경로는 리소그래피에 의해 상기 기판에 생성되며, 이는 또한 횡단 경로를 제공하는데, 이러한 횡단 경로내로 상기 골격의 성분(들)이 배치되거나, 주입되거나, 채워지거나 다른 방식으로 삽입된다. 상기 장치가 3개 또는 그 초과의 유체-흐름 경로를 포함하고 이에 따라 둘 또는 가능하게는 그 초과의 개재(intervening) 골격을 포함하는 경우, 하나, 둘 또는 그 초과의 횡단 경로가 임의로 상기 장치 내에 제공된다. 횡단 경로는 유체 입구, 제 1 유체-흐름 경로로부터 제 2 유체-흐름 경로까지 이어져 있는 횡단 통로, 및 유체 출구를 포함할 수 있다. 상기 횡단 경로는 흐름 경로에서의 흐름을 제어하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 횡단 경로는 일체형 밸브 또는 펌프로서 기능할 수 있다. Thus, the microfluidic device may be provided in the form before the skeleton is inserted. For example, the fluid-flow path is generated in the substrate by lithography, which also provides a transverse path, into which the component (s) of the framework are placed, injected, filled or otherwise Is inserted. If the device comprises three or more fluid-flow paths and thus two or possibly more intervening skeletons, one, two or more transversal paths are optionally incorporated within the device. Is provided. The transversal path may comprise a fluid inlet, a transverse passage running from the first fluid-flow path to the second fluid-flow path, and a fluid outlet. The transversal path can be made to control the flow in the flow path. For example, the cross path can function as an integral valve or pump.

상기 기판의 내부 표면은 이러한 표면상에 또는 표면내에 상기 골격을 형성하기 전에 변화될 수 있다. 예를 들어, 폴리-D-리신 (PDL)의 코팅은 상기 골격과 상기 기판 사이의 결합의 강도를 증가시킨다. 상기 기판의 내부 표면에 대한 다른 변화는, 상기 기판의 소수성, 친수성, 골격 부착 특성, 또는 세포 친화성을 변경시킨다(즉, 증가시키거나 감소시킨다). 특정 구체예에서, 상기 기판의 내부 표면은, 플라즈마에 노출되어서, 이로써 기판의 내부 표면의 친수성을 증가시킨다. 특정 구체예에서, 상기 기판의 내부 표면은, 폴리-D-리신에 노출된다.The inner surface of the substrate can be varied before forming the framework on or within this surface. For example, coating of poly-D-lysine (PDL) increases the strength of the bond between the backbone and the substrate. Other changes to the inner surface of the substrate alter (ie, increase or decrease) the hydrophobicity, hydrophilicity, skeletal adhesion properties, or cell affinity of the substrate. In certain embodiments, the inner surface of the substrate is exposed to the plasma, thereby increasing the hydrophilicity of the inner surface of the substrate. In certain embodiments, the inner surface of the substrate is exposed to poly-D-lysine.

골격이 형성되는 장치내의 공간은, 또한 하나 또는 그 초과의 "마이크로-필라(micro-pillar)"를 함유할 수 있으며, 이는, 상기 골격의 기계 안정성을 개선시키는 리소그래피 방법에서 형성된 구조이다. 예를 들어, 상기 마이크로-필라는 상기 골격을 형성시키기 위해 사용된 물질의 표면 장력을 증가시키고, 따라서 상기 유체-흐름 경로내로의 상기 골격 물질의 흐름이 감소된다. 다수의 마이크로-필라가 패턴을 이루며 존재한다는 것은 상기 골격이 "젤 케이지(gel cage)"의 형태임을 시각적으로 제시한다 (도 1 참조). 마이크로-필라의 모양은, 더 우수한 골격 안정성을 제공하도록 변화될 수 있다. 예를 들어, 6각형 모양은 상기 골격 물질에 더 강한 표면 장력을 제공할 수 있다.The space in the device in which the skeleton is formed may also contain one or more "micro-pillar", which is a structure formed in a lithographic method that improves the mechanical stability of the skeleton. For example, the micro-pillar increases the surface tension of the material used to form the framework, thus reducing the flow of the framework material into the fluid-flow path. The presence of multiple micro-pillars in a pattern visually suggests that the skeleton is in the form of a "gel cage" (see FIG. 1). The shape of the micro-pillars can be changed to provide better skeletal stability. For example, the hexagonal shape can provide a stronger surface tension for the skeletal material.

본 발명은 또한 세포 거동의 분석에 유용한 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 미세유체 장치에서 세포의 유도된 이동을 측정하기 위한 방법이 제공된다. 일반적으로, 세포는 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되고, 상기 흐름 경로내의 표면들 중 하나 이상에 부착될 수 있다. 상기 세포는 또한 상기 골격에 부착될 수 있다. 상기 세포가 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 도입됨과 동시에 또는 상이한 시간에, 생물학적 엔티티가 제 2 유체-흐름 경로내로 도입된다. 이 생물학적 엔티티는 세포 또는 세포소기관 성분, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 및 효소, 뿐만 아니라 약물 및 다른 작은 분자일 수 있다. 주어진 시점에서, 세포가, 예를 들어 상기 골격로 그리고 임의로 상기 제 2 유체-흐름 경로내로, 이동한 정도가 측정된다. 특정 구체예에서, 내피 세포 또는 내피 세포 전구체가 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되고 세포 이동을 측정하는 대신에, 신생 혈관의 형성이 측정된다. 본 발명의 방법은, 변화된 면역 반응을 포함하는 질병의 진단 및 특성화뿐만 아니라 잠재적인 치료 화합물의 확인을 포함한다. 예를 들어 호중구가 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되고, 내피 세포의 단층이 상기 호중구의 도입과 동시에 또는 이에 연속하여 제 2 유체-흐름 경로 또는 상기 골격내로 도입된다. 상기 호중구는, 예를 들어 면역 질병 또는 장애를 지니거나 이를 발생시킬 위험이 있는 포유류 피검체(즉, 시험 피검체)로부터, 또는 면역 질병 또는 장애를 지니지 않거나 이를 발생시킬 위험이 없는 포유류 피검체(즉, 대조 피검체)로부터 수득된다. 호중구 이동 동역학의 측정이 시험 피검체 및 대조 피검체에 대해 상기 장치에서 측정되고, 잠재 치료 화합물이 효능에 대해 시험될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포는 당뇨병 피검체 및 비-당뇨병 피검체로부터 단리된다. 또한, 세포는, 주어진 피검체의 암의 전이 잠재성이 본 발명의 장치를 사용하여 측정될 수 있도록 하는 조건 하에서, 전이성 또는 비전이성인 암에 걸린 포유류 피검체로부터 얻을 수 있다. 암에 걸리지 않은 피검체로부터 단리된 세포는 대조 세포로서 기능한다.The invention also relates to methods useful for the analysis of cell behavior. In one embodiment, a method for measuring induced migration of cells in a microfluidic device is provided. Generally, cells are introduced into the first fluid-flow path and can be attached to one or more of the surfaces in the flow path. The cells may also be attached to the backbone. At the same time or at different times as the cells are introduced into the first fluid-flow pathway, a biological entity is introduced into the second fluid-flow pathway. This biological entity can be a cell or organelle component such as growth factors, cytokines, hormones, antibodies, and enzymes, as well as drugs and other small molecules. At a given time point, the extent to which cells have migrated, for example into the backbone and optionally into the second fluid-flow path, is measured. In certain embodiments, instead of introducing endothelial cells or endothelial cell precursors into the first fluid-flow pathway and measuring cell migration, the formation of neovascularization is measured. The methods of the present invention include the diagnosis and characterization of diseases involving altered immune responses as well as the identification of potential therapeutic compounds. For example, neutrophils are introduced into the first fluid-flow pathway, and a monolayer of endothelial cells is introduced into the second fluid-flow pathway or the backbone simultaneously with or following the introduction of the neutrophils. The neutrophils can be, for example, from a mammalian subject (ie, a test subject) having or at risk of developing an immune disease or disorder, or from a mammalian subject who does not have or are at risk of developing an immune disease or disorder ( Namely, a control subject). Measurement of neutrophil migration kinetics can be measured in the device for test subjects and control subjects, and potential therapeutic compounds can be tested for efficacy. In another embodiment, the cells are isolated from diabetic subjects and non-diabetic subjects. In addition, cells can be obtained from mammalian subjects with cancer that are metastatic or non-metastatic under conditions such that the metastasis potential of a given subject's cancer can be measured using the device of the present invention. Cells isolated from a subject not cancerous function as control cells.

특정 구체예에서, 내피 세포는 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 도입될 수 있다. 그 후, 종양 세포가 상기 제 1 유체-흐름 경로, 상기 제 2 유체-흐름 경로, 또는 상기 골격내로 도입될 수 있다. 상기 종양 세포 및 상기 내피 세포는 동일한 피검체 또는 상이한 피검체로부터 얻을 수 있다. 이 구체예들은, 내피를 통과하여 순환으로 들어가거나(침입(intravasate)) 또는 순환으로부터 배출되거나(침출(extravasate)) 또는 둘 모두를 수행하는 종양 세포의 능력을 감소시키는 화합물 또는 바이오분자의 능력을 시험할 수 있다.In certain embodiments, endothelial cells can be introduced into the first fluid-flow pathway. Tumor cells may then be introduced into the first fluid-flow pathway, the second fluid-flow pathway, or the backbone. The tumor cells and the endothelial cells can be obtained from the same subject or from different subjects. These embodiments provide for the ability of a compound or biomolecule to reduce the ability of tumor cells to enter the circulation through the endothelium (intravasate) or to exit from the circulation (extravasate) or both. Can be tested

본 발명의 장치는 또한 조직 공학처리와 같은 시험관내 및 생체내 시스템에서 유용한, 다중 세포 타입 바이오물질을 생성시키는 데에 또한 유용하다. 본원에 기재된 장치는 둘 또는 그 초과의 타입의 진핵 세포를 함유하는 생물학적 또는 생체적합성 물질을 제조하기 위해 사용된다. 하나 또는 그 초과의 세포 타입(예를 들어, 둘, 셋, 넷 또는 그 초과의 세포 타입)을 함유하는 이러한 장치가 진단 또는 치료 목적을 위해 살아 있는 동물내로 이식되거나 다른 방식으로 도입될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 시험관내 시스템은, 조직 또는 기관 시스템의 생리학적 기능을 복제하고, 따라서 예를 들어, 약물 시험 또는 시험 화합물의 독성 스크리닝에서 유용하다.The device of the present invention is also useful for producing multi-cell type biomaterials, which are useful in in vitro and in vivo systems such as tissue engineering. The devices described herein are used to make biological or biocompatible materials containing two or more types of eukaryotic cells. Such devices containing one or more cell types (eg, two, three, four or more cell types) may be implanted or otherwise introduced into living animals for diagnostic or therapeutic purposes. In addition, the in vitro systems described herein replicate the physiological function of tissue or organ systems and are therefore useful, for example, in drug testing or toxicity screening of test compounds.

예시적 장치Example device

특정 구체예에서, 본 발명은 In certain embodiments, the present invention

광학적으로 투명한 물질; Optically transparent materials;

상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및 A substrate coupled to the optically transparent material; And

3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는, 미세유체 장치에 관한 것이며, A microfluidic device comprising a skeleton having a dimension of 1 μm or more in a three-dimensional space,

여기서 here

상기 기판은 포스트를 포함하고; The substrate comprises a post;

상기 골격은 상기 기판, 상기 포스트 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하며; The framework is in contact with the substrate, the post and the optically transparent material;

상기 기판은 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하고; The substrate comprises a first fluid-flow path and a second fluid-flow path;

상기 제 1 유체-흐름 경로는 상기 제 2 유체-흐름 경로와 교차하지 않으며; The first fluid-flow path does not intersect the second fluid-flow path;

상기 골격은 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치되어 있다.The framework is disposed between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은, 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서, 상기 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로는 상기 기판내의 채널이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the first fluid-flow path and the second fluid-flow path are channels in the substrate.

특정 구체예에서, 본 발명은, 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로는 실질적으로 평행하다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the first fluid-flow path and the second fluid-flow path are substantially parallel.

특정 구체예에서, 본 발명은, 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 플라스틱을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 PDMS를 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate comprises plastic. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate comprises a PDMS.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 일시적으로 또는 영구적으로 변화된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 변화된 기판은 폴리-D-리신에의 기판의 노출, 플라즈마에의 기판의 노출, 또는 기판의 표면 패턴화의 결과이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 일시적으로 변화된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 영구적으로 변화된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판의 내부 표면은 일시적 또는 영구적으로 변화된다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate is temporarily or permanently changed. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the changed substrate is the result of exposure of the substrate to poly-D-lysine, exposure of the substrate to plasma, or surface patterning of the substrate. to be. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate is temporarily changed. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate is permanently changed. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the interior surface of the substrate is temporarily or permanently changed.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 고체 또는 반고체 생물학적 또는 생체적합성 폴리머를 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the backbone comprises a solid or semisolid biological or biocompatible polymer.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the backbone comprises collagen, agarose, gelatin, fibronectin, fibrin, laminin, or peptide.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 광경화성 폴리머를 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the backbone comprises a photocurable polymer.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 제 1 생물학적 엔티티를 포함한다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the framework comprises a first biological entity.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 상기 기판에 실질적으로 부착된다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the framework is substantially attached to the substrate.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 압력 조절장치를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 압력 조절장치는 유체가 상기 유체-흐름 경로내로 도입되는 경우에, 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체 흐름 경로 사이에 압력 차이를 만드는 밸브이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 압력 조절장치는 유체가 상기 유체 흐름 경로내로 도입되는 경우에, 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 흐름 속도의 차이를 만드는 밸브이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a pressure regulator. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the pressure regulator is configured to provide a first fluid-flow path and a second fluid flow path when a fluid is introduced into the fluid-flow path. Is a valve that makes a pressure difference between. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the pressure regulator is such that, when a fluid is introduced into the fluid flow path, the first fluid-flow path and the second fluid-flow. It is a valve that makes a difference in flow velocity between paths.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 제 1 유체-흐름 경로 또는 제 2 유체-흐름 경로는 저항 채널을 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the first fluid-flow path or the second fluid-flow path comprises a resistance channel.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 제 1 유체-흐름 경로는 상기 제 2 유체 흐름 경로와 상이한 치수를 가진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the first fluid-flow path has a different dimension than the second fluid flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 입구를 추가로 포함한다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a first fluid inlet operably connected to the first fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 출구를 추가로 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a first fluid outlet operably connected to the first fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 입구를 추가로 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a second fluid inlet operably connected to the second fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 출구를 추가로 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a second fluid outlet operably connected to the second fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 저장소를 추가로 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a first reservoir operably connected to the first fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 저장소를 추가로 포함한다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a second reservoir operably connected to the second fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은, 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머를 포함하며; 상기 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머는 제 2의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티는 진핵 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 콜라겐을 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티는 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택된다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the backbone comprises a solid or semisolid biocompatible polymer; The solid or semisolid biocompatible polymer may pass through a second biological entity. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the backbone comprises collagen, agarose, gelatin, fibronectin, fibrin, laminin, or peptides; The second biological entity comprises eukaryotic cells. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the backbone comprises collagen; The second biological entity is selected from the group consisting of growth factors, cytokines, hormones, antibodies, and enzymes.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 기판내에 구획을 추가로 포함하여, 이로써 제 3 생물학적 엔티티의 배치를 위한 영역을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 기판내에서 구획을 추가로 포함하여, 이로써 조직 또는 생체검사 표본의 배치를 위한 영역을 제공한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a compartment in the substrate, thereby providing a region for placement of a third biological entity. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a compartment within the substrate, thereby providing an area for placement of a tissue or biopsy specimen.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 광학적으로 투명한 물질은 유리를 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the optically clear material comprises glass.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 제 3 유체-흐름 경로, 제 3 유체 입구, 및 제 3 유체 출구를 추가로 포함하고; 여기서 상기 제 3 유체 입구 및 상기 제 3 유체 출구는 상기 제 3 유체-흐름 경로에 각각 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 상기 제 3 유체-흐름 경로의 실질적으로 전부를 차지한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the device further comprises a third fluid-flow path, a third fluid inlet, and a third fluid outlet; Wherein the third fluid inlet and the third fluid outlet are operably connected to the third fluid-flow path, respectively. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein said framework occupies substantially all of said third fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 미세유체 장치에 관한 것이며, 이러한 장치는,In certain embodiments, the present invention relates to a microfluidic device, wherein such a device

광학적으로 투명한 물질; Optically transparent materials;

상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및A substrate coupled to the optically transparent material; And

3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하고, A skeleton having dimensions of at least 1 μm in three-dimensional space,

여기서, here,

상기 기판은 포스트를 포함하고;The substrate comprises a post;

상기 골격은 상기 기판 또는 상기 광학적으로 투명한 물질 또는 둘 모두와 접촉하고; 상기 골격은 상기 포스트와 접촉하고; 상기 기판은 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 제 3 유체-흐름 경로를 포함하고;The framework is in contact with the substrate or the optically clear material or both; The skeleton is in contact with the post; The substrate comprises a first fluid-flow path, a second fluid-flow path, and a third fluid-flow path;

상기 골격은 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 1의 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머 및 상기 제 2 유체-흐름 경로와 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 2의 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머를 포함하고, The framework is a first solid or semisolid biocompatible polymer disposed between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path and a second agent disposed between the second fluid-flow path and the third fluid-flow path. 2, solid or semi-solid biocompatible polymers,

상기 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머는 하나 또는 그 초과의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있다.The solid or semi-solid biocompatible polymer can pass through one or more biological entities.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서, 상기 골격은 3차원 공간에서서 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상의 치수를 가진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the framework has a dimension of at least 2 μm, at least 3 μm, at least 4 μm, at least 5 μm, or at least 10 μm in three-dimensional space Has

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서, 상기 기판은 다수의 포스트를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 규칙적인 방식으로 배열된 다수의 포스트를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 무작위 패션으로 배열된 복수의 포스트를 포함한다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate comprises a plurality of posts. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate comprises a plurality of posts arranged in a regular manner. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the substrate comprises a plurality of posts arranged in a random fashion.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 포스트은 6각형, 원형, 정사각형, 직사각형 또는 불규칙 형태이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the posts are hexagonal, circular, square, rectangular, or irregularly shaped.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 포스트의 치수는 약 0.01 ㎛2 내지 약 1 mm2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 포스트의 치수는 약 0.01 ㎛2, 약 0.05 ㎛2, 약 0.1 ㎛2, 약 0.5 ㎛2, 약 1.0 ㎛2, 약 5.0 ㎛2, 약 10.0 ㎛2, 약 25.0 ㎛2, 약 50.0 ㎛2, 약 100 ㎛2, 약 250 ㎛2, 약 500 ㎛2, 약 1000 ㎛2, 약 2500 ㎛2, 약 5,000 ㎛2, 약 10,000 ㎛2, 약 20,000 ㎛2, 약 22,500 ㎛2, 약 25,000 ㎛2, 약 50,000 ㎛2, 약 62,500 ㎛2, 약 75,000 ㎛2, 약 0.1 mm2, 약 0.5 mm2, 내지 약 1 mm2이다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the dimension of the post is from about 0.01 μm 2 to about 1 mm 2 . In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned devices, wherein the dimensions of the post are about 0.01 μm 2 , about 0.05 μm 2 , about 0.1 μm 2 , about 0.5 μm 2 , about 1.0 μm 2 , About 5.0 μm 2 , about 10.0 μm 2 , about 25.0 μm 2 , about 50.0 μm 2 , about 100 μm 2 , about 250 μm 2 , about 500 μm 2 , about 1000 μm 2 , about 2500 μm 2 , about 5,000 μm 2 , About 10,000 μm 2 , about 20,000 μm 2 , about 22,500 μm 2 , about 25,000 μm 2 , about 50,000 μm 2 , about 62,500 μm 2 , about 75,000 μm 2 , about 0.1 mm 2 , about 0.5 mm 2 , to about 1 mm 2 to be.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나를 다수개로 포함하는, 고처리량 분석을 위한 시스템에 관한 것이다.In certain embodiments, the present invention relates to a system for high throughput analysis, comprising a plurality of any of the aforementioned devices.

특정 구체예에서, 본 발명은 세포의 유도된 이동을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,In certain embodiments, the invention relates to a method of measuring induced migration of a cell, wherein the method comprises

a) (i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및 a) (i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And

(ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;(ii) providing an apparatus comprising a skeleton having dimensions of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material;

b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포를 도입하는 단계;b) introducing a cell into said first fluid-flow pathway;

c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입하는 단계; 및c) introducing a biological entity into said second fluid-flow path; And

d) 상기 골격내로 상기 세포의 상기 유도된 이동을 측정하는 단계를 포함한다.d) measuring said induced migration of said cell into said backbone.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 생물학적 엔티티는 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택된다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the biological entity is selected from the group consisting of prokaryotic cells, eukaryotic cells, growth factors, cytokines, hormones, antibodies, drugs, and enzymes do.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 호중구이며, 상기 생물학적 엔티티는 내피 세포이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein said cells are neutrophils and said biological entity is an endothelial cell.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어진다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the cells are obtained from a human subject with diabetes and the biological entity is obtained from a human subject without diabetes.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein said cells are obtained from a human subject without diabetes and said biological entity is obtained from a human subject with diabetes.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the cells are obtained from a human subject with cancer and the biological entity is obtained from a human subject without cancer.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the cells are obtained from a human subject that does not have cancer and the biological entity is obtained from a human subject having cancer.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 내피 세포이고, 상기 생물학적 엔티티는 제 2 세포이며, 상기 제 2 세포는 종양 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포 및 제 2 세포는 동일한 피검체로부터 얻어진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the cells are endothelial cells, the biological entity is a second cell, and the second cell is a tumor cell. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein said cells and second cells are obtained from the same subject.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어진 상기 생물학적 엔티티는 단일 세포, 스페로이드 보디(spheroid body) 또는 종양 조직이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein said biological entity obtained from a human subject with cancer is a single cell, spheroid body, or tumor tissue.

특정 구체예에서, 본 발명은 혈관 형성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,In certain embodiments, the present invention relates to a method of measuring angiogenesis, wherein the method comprises

a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및 i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And

ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간의 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격로서, 상기 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된, 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;ii) a skeleton having a dimension of at least 1 μm of three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material, wherein the skeleton is disposed between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path, Providing a device comprising a skeleton;

b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 내피 세포 또는 내피 세포 전구체를 도입하는 단계; b) introducing an endothelial cell or endothelial cell precursor into said first fluid-flow pathway;

c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입시키는 단계; 및c) introducing a biological entity into said second fluid-flow path; And

d) 상기 골격내에서의 혈관의 형성을 측정하는 단계를 포함한다.d) measuring the formation of blood vessels in said skeleton.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 생물학적 엔티티는 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택된다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the biological entity is from a group consisting of prokaryotic cells, eukaryotic cells, growth factors, cytokines, hormones, antibodies, drugs, and enzymes Is selected.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 장치는 In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the apparatus

제 3 유체-흐름 경로; 및 Third fluid-flow path; And

상기 기판과 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 제 2 골격을 추가로 포함하고, Further comprising a second skeleton having dimensions of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material,

여기서 상기 제 2 골격은 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된다.Wherein the second framework is disposed between the first fluid-flow path and the third fluid-flow path.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 2의 생물학적 엔티티를 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the method further comprises introducing a second biological entity into said first fluid-flow pathway.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 내피 세포 또는 내피 세포 전구체는 공-배양물에 불균일 혼합물로서 도입된다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the endothelial cell or endothelial cell precursor is introduced into the co-culture as a heterogeneous mixture.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 혈관 단편(fragment)을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the method further comprises introducing a blood vessel fragment into the first fluid-flow pathway.

특정 구체예에서, 본 발명은 침투율을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,In certain embodiments, the present invention relates to a method of measuring penetration, wherein the method

a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및 i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And

ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;ii) providing a device comprising a skeleton having a dimension of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material;

b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 1 물질을 도입시키는 단계; 및 b) introducing a first material into said first fluid-flow path; And

c) 상기 골격내로의 상기 제 1 물질의 침투율을 측정하는 단계를 포함한다.c) measuring the penetration of the first substance into the framework.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 제 1 물질은 유체 또는 작은 분자이다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the first substance is a fluid or a small molecule.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 골격은 세포 단층을 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the backbone comprises a cell monolayer.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 제 1 물질은 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 세포는 내피 세포이다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the first substance comprises a cell. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the cell is an endothelial cell.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 골격은 제 2 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 2 세포는 종양 세포이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the scaffold comprises a second cell. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the second cell is a tumor cell.

특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 물질은 세포를 포함하고, 상기 세포가 내피 세포이며, 상기 골격은 제 2 세포를 포함하고; 상기 제 2 세포는 종양 세포이고; 상기 내피 세포 및 상기 종양 세포는 동일한 피검체로부터 얻는다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the first material comprises a cell, the cell is an endothelial cell, and the backbone comprises a second cell; Said second cell is a tumor cell; The endothelial cells and the tumor cells are obtained from the same subject.

특정 구체예에서, 본 발명은 침투율을 측정하는 방법으로서, In certain embodiments, the present invention provides a method of measuring penetration,

a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및 i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And

ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;ii) providing a device comprising a skeleton having a dimension of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material;

b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 1 물질을 도입시키는 단계; b) introducing a first material into said first fluid-flow path;

c) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 2 물질을 도입시키는 단계; 및c) introducing a second material into said first fluid-flow path; And

c) 상기 골격내로의 상기 제 2 물질의 침투율을 측정하는 단계를 포함한다.c) measuring the penetration of the second material into the framework.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 물질은 제 1 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 세포는 내피 세포이다. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the first substance is a first cell. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the first cell is an endothelial cell.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 2 물질은 제 2 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 2 세포는 종양 세포이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the second substance is a second cell. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the second cell is a tumor cell.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 세포와 상기 제 2 세포는 동일한 피검체로부터 얻어진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the first cell and the second cell are obtained from the same subject.

특정 구체예에서, 본 발명은 세포 추적제(cell tracking agent)를 평가하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,In certain embodiments, the invention relates to a method of evaluating a cell tracking agent, the method comprising:

a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And

ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;ii) providing a device comprising a skeleton having a dimension of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material;

b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포 추적제를 도입시키는 단계; 및 b) introducing a cell tracer into said first fluid-flow pathway; And

c) 상기 골격내로의 상기 세포 추적제의 확산을 측정하는 단계를 포함한다.c) measuring the diffusion of said cell tracer into said backbone.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 파라미터를 모니터하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 둘 이상의 파라미터를 모니터하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 파라미터는 표면 전단 스트레스, 상기 골격을 통한 간질 흐름, 비-반응성 용질에서의 구배, 세포-배양 골격의 특성, 또는 실시간 세포의 특성이다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the method further comprises the step of monitoring a parameter. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the method further comprises the step of monitoring two or more parameters. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the parameters are surface shear stress, interstitial flow through the scaffold, gradients in non-reactive solutes, properties of the cell-culture scaffold, Or real-time cell characteristics.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 장치는 상기 언급된 장치 중 어느 하나가다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein said device is any of the aforementioned devices.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 골격은 3차원 공간에서 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상의 치수를 가진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the framework has a dimension of at least 2 μm, at least 3 μm, at least 4 μm, at least 5 μm, or at least 10 μm in three-dimensional space. Have

특정 구체예에서, 본 발명은 장치를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,In certain embodiments, the present invention relates to a method of manufacturing a device, wherein the method

a) 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 포스트를 포함하는 기판과 액체 골격 물질을 접촉시키는 단계; 및 a) contacting the liquid skeletal material with a substrate comprising a first fluid-flow path, a second fluid-flow path, and a post; And

b) 상기 기판에 광학적으로 투명한 물질을 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함한다.b) operatively connecting an optically transparent material to said substrate.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 장치는 상기 언급된 장치 중 어느 하나가다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein said device is any of the aforementioned devices.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질은 단량체 콜라겐(monomeric collagen)을 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the liquid skeletal material comprises monomeric collagen.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 이러한 방법은, 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 상기 기판을 변화시켜서 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 변경시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판을 변경시키는 단계는 상기 기판을 폴리-D-리신에 노출시키거나, 상기 기판을 플라즈마에 노출시키거나, 상기 기판을 패턴화하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판은 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 일시적으로 또는 영구적으로 변화되어서, 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성 또는 골격 부착 특성을 일시적으로 또는 영구적으로 변경시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 기판은 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 일시적으로 변화되어서, 일시적으로 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 변경시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판은 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉하기 전에 영구적으로 변화되고, 이로써 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 영구적으로 변경시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판의 내부 표면이 변화된다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the method further comprises modifying the substrate prior to contacting the substrate with the liquid backbone material, thereby modifying the hydrophobicity, hydrophilicity, cell affinity, Or altering the skeletal adhesion properties. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the altering the substrate comprises exposing the substrate to poly-D-lysine, exposing the substrate to plasma, or Patterning the substrate. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the substrate is temporarily or permanently changed before contacting the substrate with the liquid backbone material such that the hydrophobicity, hydrophilicity, cells of the substrate Temporarily or permanently alters affinity or skeletal adhesion properties. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the substrate is temporarily changed before contacting the substrate with the liquid backbone material, thereby temporarily removing the hydrophobicity, hydrophilicity, cells of the substrate Modifying the affinity or skeletal adhesion properties. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the substrate is permanently changed before contacting the substrate with the liquid backbone material, thereby hydrophobicity, hydrophilicity, cell affinity of the substrate Or permanently alters skeletal adhesion properties. In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the inner surface of the substrate is varied.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉하는 단계는 상기 제 1 및 제 2 유체-흐름 경로와 실질적으로 불연속적인 상기 기판의 한정된 영역내로 압력하에서 상기 액체 골격 물질을 주입시키는 것을 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the step of contacting the liquid skeletal material with the substrate is substantially discontinuous with the first and second fluid-flow paths. Injecting said liquid skeletal material under pressure into a defined region of.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉시키는 단계는 상기 액체 골격 물질을 미세 주입하는 것을 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein contacting the liquid skeletal material with the substrate comprises microinjecting the liquid skeletal material.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉시키는 단계는 제 1 유체-흐름 경로 또는 제 2 유체-흐름 경로내로 상기 액체 골격 물질을 도입시키는 것을 포함한다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the step of contacting said liquid skeletal material with said substrate comprises said liquid framework into a first fluid-flow path or a second fluid-flow path. Introducing a substance.

특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 골격은 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상, 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상의 치수를 가진다.In certain embodiments, the invention relates to any one of the aforementioned methods, wherein the framework is at least 1 μm, at least 2 μm, at least 3 μm, at least 4 μm, at least 5 μm, or 10 in a three-dimensional space. Have a dimension of at least μm.

예증adduction

일반적으로 기재되어 있는, 본 발명은, 하기 예를 참조함에 의해 더욱 쉽게 이해될 수 있으며, 이 예들은, 본 발명의 특정 측면 및 예의 예시의 목적을 위해서만 포함되어 있고, 임의의 방법으로 본 발명을 제한하려는 의도는 없다. 모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이고, 달리 특정되지 않는다면, 상기 표제를 따르는 본문의 의미를 제한하려고 사용되어서는 아니된다.The invention, which is generally described, may be more readily understood by reference to the following examples, which are included for purposes of illustration of certain aspects and examples of the present invention, and in any way comprise the present invention. There is no intention to limit it. All headings are for the convenience of the reader and should not be used to limit the meaning of the text following the heading unless otherwise specified.

실시예 1: 미세유체 장치 제조 및 표면 변화Example 1: Microfluidic Device Fabrication and Surface Change

미세유체 네트워크의 디자인은, 표 1에 제공된, 미세유체 유체-흐름 경로 (또는 "채널"), 젤 "케이지" 및 마이크로-필라의 치수를 이용하여, AutoCAD® 소프트웨어(Autodesk, San Rafael, CA)로 이루어졌다.The design of the microfluidic network is AutoCAD® software (Autodesk, San Rafael, CA), using the dimensions of the microfluidic fluid-flow path (or "channel"), gel "cage" and micro-pillar, provided in Table 1. Was done.

Figure pct00001
Figure pct00001

당업자는, 상기 장치의 각 구성요소의 치수 및 모양이 주어진 용도를 위해 특정될 수 있음을 인식할 것이다. 상기 채널 너비 및 높이는 독립적으로 수 마이크론(㎛) 내지 수 mm일 수 있고, 직사각형, 원형 또는 제조될 수 있는 여러 다른 모양일 수 있다. 상기 젤 케이지의 치수는 포스트, 필라 또는 다른 구조에 더하거나 이를 포함하여, 수 ㎛ 또는 그 미만 내지 수 mm 또는 그 초과로 특정될 수 있다. 필라 크기는 수 ㎛ 또는 그 미만 내지 수 mm 또는 그 초과 (예컨대 100 ㎛, 150 ㎛, 또는 250 ㎛, 그리고, 직사각형, 원형 또는 다른 모양으로 제조됨)일 수 있다. 젤 케이지의 높이는, 주어진 채널의 높이와 동일하거나, 이를 초과하거나 그 미만일 수 있다. 상기 골격은 또한 하나 또는 그 초과의 미세유체 채널을 함유할 수 있다.Those skilled in the art will appreciate that the dimensions and shapes of each component of the device may be specified for a given application. The channel width and height can be independently several microns (μm) to several mm, and may be rectangular, circular, or any other shape that can be manufactured. The dimensions of the gel cage can be specified from several micrometers or less to several mm or more, in addition to or including posts, pillars or other structures. The pillar size can be from several micrometers or less to several mm or more (eg, 100 micrometers, 150 micrometers, or 250 micrometers, and are made in a rectangular, circular or other shape). The height of the gel cage can be equal to, above, or less than the height of a given channel. The framework may also contain one or more microfluidic channels.

투명 마스크(transparency mask)는 약 수 100 ㎛의 최소 기하학 피처(feature) 크기를 지니는 상기 CAD 파일로부터 만들어졌고, 고해상도 프린터(PageWorks, MA)로 인쇄되었다. 다른 타입의 마스크는 페이즈-시프트 마스크(phase-shift masks), 및 함침 포토리소그래피 함침(immersion photolithography immersion), 뿐만 아니라 MoSi 및 TaZSiO2 마스크이다. 이 투명 마스크는 실리콘 웨이퍼 마스터를 만들도록 SU-8 포토레지스트의 포토리소그래피에서 사용되었다. 미세유체 장치는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) (Dow Corning, USA)를 레플리카 몰딩(replica-molding)18하고 2시간 동안 80℃ 오븐에서 상기 실리콘 마스터에 대해 탈기된 엘라스토머 믹스(10:1, 베이스:경화제)를 경화시킴에 의해 제조되었다. PDMS 생체적합적이고, 훌륭한 광학 투명성을 가진다. 중합된 PDMS 기구들은 실리콘 마스터로부터 필링 오프(peel off)되었고, 개별 바이오리액터 기구들(35-mm 직경, 0.8-1 cm 높이)은 커팅 아웃(cut out)되었고 입구 및 출구는 뾰족한 플랫-마무리된(sharpened flat-ended) 16-게이지 바늘을 사용하여 개별 유체-흐름 경로로 코어 다운(core down)되었다. 세포 배양 전에, PDMS 기구들은 세척되었고, 20분 동안 120℃에서 습식 사이클에서 살균되었으며, 후속하여 35분 동안 120℃에서 건식 사이클을 거쳤다(20분 살균/15분 건조). 다음에, PDMS 표면은 골격 형성을 용이하게 하기 위해 공기 플라즈마에 노출시킴에 의해 친수성이 되도록 하였다. 살균된 장치는 플라즈마 클리너(plasma cleaner)(Harrick, CA) 챔버 (pattern side up) 내의 트레이상에 배치되었다. 펌프-다운 사이클(~2분)을 개시하였고, 후속하여, 핑크 플라즈마로 2분 동안 조사(irradiation)하였다. 표면 처리된 기구를 살균 컨테이너 내에서 저장하였고 플라즈마 처리 후 0.5 - 2 h 이내에 사용하였다. 중합 후, 플랫 PDMS 표면은 소수성이고 불량한 습윤성(wetability)을 나타낼 수 있고; 미처리된 PDMS 기구들내로의 골격 주입은 종종 유체-흐름 경로내로 삼출되는 젤을 생성시키며, 종종 젤 케이지를 채우지 못하여, 마이크로-필라에 인접한 위치에 작은 버블을 생성시켰다. PDMS의 소수성은 미세조정될 수 있고 PDMS 표면은 공기 플라즈마19에의 노출에 의해 일시적으로 친수성이 될 수 있다. 플라즈마 처리에 후속하여, 소수성 회복 시간은 제조 및 저장 방법에 의존한다. 예를 들어, 열 노화, 더 긴 산화 시간 및 질소내 저장은 소수성의 회복을 지체시키는데 효과적이다20. 여기서, PDMS는 유리로의 즉시 결합을 위해 전형적으로 요구되는 것보다 더 긴, 2분 동안 공기 플라즈마로 표면 처리되었다. 매크로-크기 플럼빙(plumbing)에 연결되는 경우에 밀봉(seal)을 유지하기 위해, 전형적 미세유체 장치는 누출을 방지하기 위해 유리 또는 PDMS 층에 영구적으로 결합되거나 진공 밀봉21되었다. 그러나 골격 퍼짐 및 충전을 봉쇄(contain)하도록 사용된 플라즈마 처리가 유리로의 결합을 촉진시키기에 충분하였고, 따라서 추가 접착 단계가 필요하지 않는 것으로 결정되었다.A transparency mask was made from the CAD file with a minimum geometric feature size of about several hundred micrometers and printed with a high resolution printer (PageWorks, MA). Other types of masks are phase-shift masks, and immersion photolithography immersion, as well as MoSi and TaZSiO 2 masks. This transparent mask was used in photolithography of the SU-8 photoresist to make a silicon wafer master. The microfluidic device was a replica-molding of polydimethyl siloxane (PDMS) (Dow Corning, USA) 18 and degassed elastomer mix (10: 1, base: curing agent) to the silicone master in an 80 ° C. oven for 2 hours. ) Was cured. PDMS is biocompatible and has excellent optical transparency. The polymerized PDMS instruments were peeled off from the silicon master, the individual bioreactor instruments (35-mm diameter, 0.8-1 cm high) were cut out and the inlet and outlet pointed flat-finished Core down to individual fluid-flow paths using sharpened flat-ended 16-gauge needles. Prior to cell culture, PDMS instruments were washed, sterilized in a wet cycle at 120 ° C. for 20 minutes, followed by a dry cycle at 120 ° C. for 35 minutes (20 minutes sterilization / 15 minutes drying). The PDMS surface was then made hydrophilic by exposing it to air plasma to facilitate skeletal formation. The sterilized device was placed on a tray in a plasma cleaner (Harrick, CA) pattern side up. A pump-down cycle (~ 2 minutes) was initiated and subsequently irradiated with pink plasma for 2 minutes. The surface treated instruments were stored in sterile containers and used within 0.5-2 h after plasma treatment. After polymerization, the flat PDMS surface is hydrophobic and can exhibit poor wettability; Skeletal injection into untreated PDMS instruments often results in gels that exuded into the fluid-flow path, often failing to fill the gel cage, creating small bubbles at locations adjacent to the micro-pillars. The hydrophobicity of the PDMS can be fine tuned and the PDMS surface can be temporarily hydrophilic by exposure to air plasma 19 . Following the plasma treatment, the hydrophobic recovery time depends on the manufacturing and storage method. For example, heat aging, longer oxidation times and storage in nitrogen are effective to retard hydrophobic recovery 20 . Here, PDMS was surface treated with air plasma for 2 minutes, longer than typically required for immediate bonding to glass. In order to maintain a seal when connected to macro-sized plumbing, a typical microfluidic device was permanently bonded or vacuum sealed 21 to a glass or PDMS layer to prevent leakage. However, it was determined that the plasma treatment used to contain skeletal spreading and filling was sufficient to promote bonding to the glass, and therefore no additional adhesion step was needed.

실시예 2: 미세유체 장치내에서의 골격의 형성Example 2: Formation of Skeletons in Microfluidic Devices

미세주입 스테이션을, 무균 조건 하에서 장치내로 세포 배양 골격(서브(sub) μL 부피)을 로딩하기 위해 만들었다. 이 시스템 구성요소는 매뉴얼 미세조작기(MN-151 Joystick Micromanipulator with H-7 Pipette Holder, NARISHIGE, NY), 마이크로리터 주사기(Hamilton, 62RNR, 2.5 μL SYR, 22s/2"/3, VWR), 디지털 현미경(Big Blue QX5, COMPUVISOR.COM, TX) (모두가 층류 후드(laminar flow hood) 내에 하우징되어 있음) 및 시각적 안내를 위한 모니터를 포함하였다. MN-151 조이스틱 피처는, XY 평면에서의 미세규모 조정의 제어를 제공하며, X, Y 및 Z 축을 따라 추가로 거친 조정(coarse adjustment)의 제어를 제공한다.Microinjection stations were made to load the cell culture backbone (sub μL volume) into the device under aseptic conditions. The system components include a manual micromanipulator (MN-151 Joystick Micromanipulator with H-7 Pipette Holder, NARISHIGE, NY), a microliter syringe (Hamilton, 62RNR, 2.5 μL SYR, 22s / 2 "/ 3, VWR), digital microscope (Big Blue QX5, COMPUVISOR.COM, TX) (all housed in a laminar flow hood) and a monitor for visual guidance. The MN-151 joystick feature is a microscale adjustment in the XY plane. It also provides control of coarse adjustment along the X, Y and Z axes.

골격 미세주입. 상기 기재된 친수성으로 된 이의 표면을 가진 살균된 PDMS 장치는 비디오 모니터 상의 클리어 뷰(clear view)로 "젤 케이지"를 가진 현미경 스테이지 상에 위치된다(패턴화된 표면이 위쪽을 향함). 미세조작기에 부착된, 마이크로리터 주사기의 팁(프리-폴리머 용액으로 사전 로딩됨)은 "젤 케이지" 위쪽으로 수 마이크론되는 곳에 위치되고, 상기 프리-폴리머 용액의 작은 점적이 수동으로 만들어져서, 상기 점적이 상기 마이크로-필라와 처음으로 접촉할 때까지 하강된다. 점적 크기는 점적의 직경이 상기 젤 케이지의 너비의 반과 이의 직경이 거의 동일하게 되도록 조절된다. 작은 점적이 상기 젤 케이지 바로 위에 만들어지고, 하강되고, 분배(dispensed)되며; 이 방법은 상기 젤 케이지가 채워질 때까지 반복되었다. Skeletal microinjection. A sterile PDMS device having its surface made hydrophilic as described above is placed on a microscope stage with a "gel cage" in a clear view on a video monitor (the patterned surface faces upwards). The tip of the microliter syringe (preloaded with pre-polymer solution), attached to the micromanipulator, is positioned several microns above the "gel cage" and a small drop of the pre-polymer solution is manually made to The drop is lowered until the first contact with the micro-pillar. Droplet size is adjusted such that the diameter of the drop is approximately equal to half the width of the gel cage and its diameter. Small droplets are made, dropped, and dispensed directly above the gel cage; This method was repeated until the gel cage was filled.

골격 로딩 및 장치 어셈블리. 젤 프리-폴리머 용액(콜라겐 타입 I, 이 실험의 경우 래트 꼬리)은 상기 젤 케이지내로 미세주입되고; 유체 채널은 깨끗한유리 커버 슬립으로 밀봉되고(35 mm, VWR) 기계 클램프로 고정된다. 이는 다수의 기구에 대해 따로 따로 반복된다. 골격 주입 후, 어셈블된 PDMS 기구는 제 2의 습윤된 컨테이너에 놓여서, 상기 젤이 건조되는 것을 막는다. 젤은 상기 습윤된 배양기에서 37℃에서 30분 동안 중합되었다. Skeletal loading and device assembly. Gel pre-polymer solution (collagen type I, rat tail in this experiment) is microinjected into the gel cage; The fluid channel is sealed with a clean glass cover slip (35 mm, VWR) and secured with a mechanical clamp. This is repeated separately for a number of instruments. After skeletal injection, the assembled PDMS instrument is placed in a second wet container to prevent the gel from drying. Gels were polymerized in the wet incubator at 37 ° C. for 30 minutes.

골격을 가로지르는 구배의 형성의 증명. 콜라겐을 함유하는 골격의 중합 후, 유체-흐름 경로는 세포 배양 배지(보충물 없이)로 채워졌다. 구배 연구는, 20 ㎍ mL-1의 초기 농도에서 형광 덱스트란(40 kDa, Invitrogen)의 희석 용액에 의해 하나의 흐름 경로내의 배지를 대체하며 정지 조건 하에서 수행하였다. 형광 강도는, Nikon TE300 현미경(Nikon Instruments Inc., NY)으로 가시화되었다. 젤 영역의 일련의 형광 이미지(4X 확대)는 Openlab(Improvision, MA) 데이터 획득 소프트웨어를 사용하는 Hamamatsu 카메라(Hamamatsu, Japan)로 얻었고, 추가 분석을 위해 저장하였다. 이미지는 각 시점에서 상기 젤을 가로지르는 형광 강도의 변화를 얻기 위해 가공되었다. 타입-랩스 형광 이미지의 이미지 프로세싱은 커스텀 리튼(written) MATLAB(Math Works, MA) 코드를 사용하여 수행하였다. 요약하면, 상기 젤 영역의 각 형광 이미지는 상기 PDMS 마이크로-필라를 배제시킨 직사각형 섹션으로 나눴다. 픽셀 강도 및 상기 "소스(source)" 채널로부터 상응하는 위치를 이 직사각형 섹션에 대해 기록하였다. 평균 형광 강도를, 상기 젤의 길이를 가로지르는 모든 픽셀들을 위한 덱스트란 채널로부터 동일한 거리에서 픽셀에 대해 계산하였다. 각 시점에서, 상기 젤을 가로지르는 표준화된 평균 강도 프로필의 플롯을 만들었다. 실험 확산 곡선을 FEMLAB(Comsol, USA)에서 만들어진 유한 요소 모델(finite element model)로부터 얻어진 이론적 곡선에 피팅(fitting)시켰다. Demonstration of the formation of a gradient across the skeleton . After polymerization of the skeleton containing collagen, the fluid-flow pathway was filled with cell culture medium (without supplement). Gradient studies were performed under stationary conditions, replacing the medium in one flow path with a dilute solution of fluorescent dextran (40 kDa, Invitrogen) at an initial concentration of 20 μg mL −1 . Fluorescence intensity was visualized with a Nikon TE300 microscope (Nikon Instruments Inc., NY). A series of fluorescence images (4X magnification) of the gel regions were obtained with a Hamamatsu camera (Hamamatsu, Japan) using Openlab (Improvision, MA) data acquisition software and stored for further analysis. The image was processed to obtain a change in fluorescence intensity across the gel at each time point. Image processing of the type-Labs fluorescence images was performed using custom written MATLAB (Math Works, MA) code. In summary, each fluorescence image of the gel region was divided into rectangular sections excluding the PDMS micro-pillars. Pixel intensity and corresponding position from the "source" channel was recorded for this rectangular section. Average fluorescence intensity was calculated for the pixels at the same distance from the dextran channel for all the pixels across the length of the gel. At each time point, a plot of the standardized mean intensity profile across the gel was made. Experimental diffusion curves were fitted to theoretical curves obtained from a finite element model made in FEMLAB (Comsol, USA).

일 채널로 형광 덱스트란의 도입 후 상기 젤 케이지 내 농도 프로필의 전형적 시간 경과는 도 11a에 도시되어 있다. 상기 젤의 표준화된 형광 강도

Figure pct00002
는 상기 덱스트란(40kDa) "소스" 유체 경로로부터 표준화된 거리(x/xmax)에 의해 플롯된다. 정상 상태 농도 프로필은 40분 내에 도달되었다. 이 연구에서, 40 kDa 덱스트란이 선택되었는데, 왜냐하면 이는 VEGF, bFGF 및 IGF22를 포함하는 관심있는 여러 성장 인자와 크기가 유사하기 때문이다.A typical time course of the concentration profile in the gel cage after introduction of fluorescent dextran into one channel is shown in FIG. 11A. Normalized fluorescence intensity of the gel
Figure pct00002
Is plotted by the normalized distance (x / x max ) from the dextran 40kDa “source” fluid path. Steady state concentration profiles were reached within 40 minutes. In this study, 40 kDa dextran was chosen because it is similar in size to several growth factors of interest, including VEGF, bFGF and IGF 22 .

상기 정상 상태 실험 데이터를 1 x 10-6cm2s-1의 확산 계수를 가정한 유한 요소 모델로부터의 결과와 비교하였다. 이 값은, 문헌23 , 24에 기록된 값의 범위와 잘 맞는다. 3차원 매트릭스를 가로지르는 가용성 인자의 구배를 만드는 능력은 스프라우팅 혈관신생(sprouting angiogenesis), 종양 전이 및 면역 반응을 포함하는 유도성(directional) 이동 중 생리학적으로 관련한 메커니즘을 자극하는 잠재성을 제공한다. 이주 세포의 동적 운동성은 제어된 미세환경에서 프로빙(probed)될 수 있고 실시간으로 모니터될 수 있다. 추가로, 이러한 인자들의 공간적 그리고 시간적 프리젠테이션은, 비록, 일 군은 미세유체 래더(ladder) 챔버25에서 농도 구배를 만드는 능력을 증명하였지만, 제어의 또 다른 수준으로서, 상기 제어가 생리학적으로 관련되지만 대부분의 현 시스템에서 가능하지 않은 수준을 제공한다. The steady state experimental data were compared with results from a finite element model assuming a diffusion coefficient of 1 × 10 −6 cm 2 s −1 . This value fits well with the range of values recorded in Documents 23 and 24 . The ability to create gradients of soluble factors across the three-dimensional matrix offers the potential to stimulate physiologically relevant mechanisms during directional movement, including sprouting angiogenesis, tumor metastasis, and immune responses. do. Dynamic motility of migrating cells can be probed in a controlled microenvironment and monitored in real time. In addition, the spatial and temporal presentation of these factors has demonstrated the ability to create concentration gradients in the microfluidic ladder chamber 25 , although as another group of controls, the control is physiologically relevant. However, it provides a level that is not possible in most current systems.

실시예 3: Example 3: 듀얼Dual 유체-흐름 경로 장치의 모세관 형태형성의 연구 Study of Capillary Morphology of Fluid-Flow Pathway Devices

장치 및 골격 형성의 설명. 듀얼 유체-흐름 경로 장치는 본원에 기재된 레플리카 몰딩 기술 및 표준 소프트 리소그래피를 사용하는 PDMS로부터 제조되었다. 상기 장치는, 두 개의 평행한 흐름 경로 및 중심 "젤 케이지" 횡단 경로를 함유하여, 세포 배양을 위해 주입가능한 생물학적으로-파생된 또는 합성 골격(여기서, 소프트 히드로젤)을 함유한다. 본원에 기재된 상기 장치를 사용하여, (1) 표면 전단 스트레스, (2) 상기 매트릭스를 통한 간질 흐름 (3) 화학주성물질 또는 화학반성(chemorepellants)의 구배 (4) 상기 골격의 특성, (5) 셀을 실시간으로 동시에 모니터링, 및 (6) 공동-배양 세포의 효과를 제어할 수 있다. Description of Device and Skeletal Formation. Dual fluid-flow path devices were made from PDMS using the replica molding techniques and standard soft lithography described herein. The device contains two parallel flow paths and a central “gel cage” transverse path, containing an injectable biologically-derived or synthetic backbone (here soft hydrogel). Using the device described herein, (1) surface shear stress, (2) interstitial flow through the matrix, (3) gradient of chemotactic or chemorepellants, (4) properties of the skeleton, (5) The cells can be monitored simultaneously in real time, and (6) control the effect of the co-cultured cells.

마이크로-필라의 스태거드 어레이를 상기 젤 케이지에 통합시켜서, 상기 골격을 위한 기계적 안정성을 제공하였으며, 이를 통해 상기 골격은 수 센티미터(cm)의 물의 과량의 압력 차이를 견딜 수 있었다. 제 위치의 상기 골격으로, 상기 두 개의 흐름 경로는 서로 실질적으로 분리되었고, 어떠한 액체도 상기 두 흐름 경로 사이에서 이동될 수 없었다; 그러나, 한 흐름 경로로부터 또 다른 흐름 경로로 상기 다공성 골격을 통해 가용성 인자의 확산 또는 대류는 제한되지 않는다. 모든 세포 배양을 5% CO2 및 37℃에서 습윤화된 인큐베이터에서 배양하였다. 인간 성인 피부 미세혈관의 내피 세포(HMVEC-ad, LONZA, USA)를 5% 우태아 혈청으로 EGM-2MV 배지 시스템에서 증식시켰다. 세포를 콜라겐-코팅된 플라스크에서 팽창시켰고, 계대 6-8에서 사용하였다. 세포는 2 mg mL-1의 최종 젤 농도로 빙냉 액체 타입 I 래트 꼬리 콜라겐에서 1 x 106 세포 mL-1에서 잘 현탁되었다. 액체 콜라겐은, 콜라겐 스톡 용액을 1OX PBS, 1 M NaOH 및 조직 배양 등급 물(water)의 혼합물에 첨가하여 2.5 mg mL-1 용액을 얻음에 의해 제조되었다. 고밀도 세포 현탁액의 미리 정해진 부피를 그 다음에, 상기 콜라겐 용액과 혼합시켜서 요구된 시딩 밀도를 얻었다. 상기 콜라겐/세포 혼합물을 본원에 기재된 바와 같이 마이크로리터 주사기 및 젤 캐스트에 로딩하였다. 상기 미세주입 프로토콜은, 직접 상기 디자인된 공간에, 세포를 가지고 또는 없이, 골격 물질의 미량의 부피를 로드하는 능력을 제공하였다. 대안적으로, 상기 골격의 살포 로딩은 제공되었다. 젤화 후, 유체-흐름 경로를 세포 배양 배지로 채웠고 24시간 동안 배양하였다. 생화학 인자의 효과를 증명하기 위해, 세포를, 완전한 배지(컨트롤) 또는 혈관생성 전구 인자(pro-angiogenic factors)(bFGF, VEGF 및 PMA 모두 50 ng mL-1)로 부화된(enriched) 배지로, 정지 조건 하에서 배양시켰다. 세포는 24시간 시점에서 보충된 bFGF/VEGF/PMA 칵테일로 보충된 배지 또는 완전한 배지에서 수일 동안 배양물에서 유지되었다. 샘플을 고정시켰고, 형광 마커로 태그 달았고 이미지화하였다.A staggered array of micro-pillars was incorporated into the gel cage to provide mechanical stability for the scaffold, allowing the scaffold to withstand excess pressure differences of several centimeters (cm) of water. With the framework in place, the two flow paths were substantially separated from each other and no liquid could be moved between the two flow paths; However, the diffusion or convection of soluble factors through the porous backbone from one flow path to another is not limited. All cell cultures were incubated in a humidified incubator at 5% CO 2 and 37 ° C. Human adult dermal microvascular endothelial cells (HMVEC-ad, LONZA, USA) were grown in EGM-2MV medium system with 5% fetal bovine serum. Cells were expanded in collagen-coated flasks and used at passages 6-8. The cells were well suspended in 1 × 10 6 cells mL −1 in ice cold liquid Type I rat tail collagen at a final gel concentration of 2 mg mL −1 . Liquid collagen was prepared by adding collagen stock solution to a mixture of 1OX PBS, 1 M NaOH and tissue culture grade water to obtain a 2.5 mg mL- 1 solution. A predetermined volume of high density cell suspension was then mixed with the collagen solution to obtain the required seeding density. The collagen / cell mixtures were loaded into microliter syringes and gel casts as described herein. The microinjection protocol provided the ability to load trace volumes of framework material, with or without cells, directly into the designed space. Alternatively, sparge loading of the scaffold was provided. After gelation, the fluid-flow pathway was filled with cell culture medium and incubated for 24 hours. To demonstrate the effect of biochemical factors, cells were enriched with either complete medium (control) or pro-angiogenic factors (50 ng mL- 1 in both bFGF, VEGF and PMA). Incubated under stationary conditions. Cells were maintained in culture for several days in medium or complete medium supplemented with bFGF / VEGF / PMA cocktail supplemented at the 24 hour time point. Samples were fixed, tagged with fluorescent markers and imaged.

3D 캡슐화된 세포 상의 표면 전단 스트레스. 생물 물리학 자극의 효과를 증명하기 위해, 세포에 작은 수준의 표면 전단 스트레스를 가하였다. 상기 골격의 상기 표면 상의 내피 세포를 가진 장치를 형성하였고, 압력 차이(50 Pa)를 상기 저장소 칼럼 내 배양 배지의 높이의 변화를 주면서 상기 차이를 가변시킴에 의해 상기 골격을 가로질러 부과하였다. Surface Shear Stress on 3D Encapsulated Cells . To demonstrate the effect of biophysical stimulation, cells were subjected to small levels of surface shear stress. A device with endothelial cells on the surface of the skeleton was formed and a pressure difference (50 Pa) was imposed across the skeleton by varying the difference while varying the height of the culture medium in the reservoir column.

내피 세포 단층 형성. 두 개의 상이한 세포 시딩 프로토콜은 기판을 제어하기 위해 사용하였고, 상기 기판 상의 내피 세포는 초기에 컨플루언트 단층, 즉 2D 및 3D 기판 단층 시딩을 형성하였다. 콜라겐 젤 골격을 이미 기재된 방식과 같이 형성하였다. 젤화 후, 유체-흐름 경로를 2 mg mL-1 피브로넥틴 코팅 용액으로 채웠고, 밤새 배양하였다. 세포 시딩 전에, 상기 코팅 용액을 완전한 배지로 대체하였고, 또 다른 2-4시간 동안 평형을 유지하였다. 2-3 x 106 세포 mL-1의 세포 현탁액을 하나의 유체-흐름 경로로 흐르도록 하였고, 상기 세포를 단단한 유리 또는 컴플라이언트 골격 표면에 부착되도록 하였는데, 이는 이들이 중력에 의해 현탁액으로부터 정착되기 때문이다. 내피 세포를 추가 처리 전에 상기 단단한(2D 단층 시딩) 또는 유순한(3D 시딩) 표면 상에 24-48 시간 동안 배양시켰다. 혈관 생성 전구 인자는 구배 또는 균일한 농도로서 제시되었다. 이 분석을 위해 VEGF(10-50 ng mL-1) 및 SlP (250 nM)를 형태형성을 증진시키기 위해 사용하였다. Endothelial Monolayer Formation . Two different cell seeding protocols were used to control the substrate, and endothelial cells on the substrate initially formed confluent monolayers, ie 2D and 3D substrate monolayer seeding. Collagen gel backbones were formed in the manner previously described. After gelation, the fluid-flow pathway was filled with 2 mg mL- 1 fibronectin coating solution and incubated overnight. Prior to cell seeding, the coating solution was replaced with complete medium and maintained in equilibrium for another 2-4 hours. Cell suspensions of 2-3 × 10 6 cells mL −1 were allowed to flow through one fluid-flow path and the cells were allowed to adhere to the rigid glass or compliant skeletal surface because they were settled from the suspension by gravity. to be. Endothelial cells were incubated for 24-48 hours on the hard (2D monolayer seeding) or docile (3D seeding) surface prior to further treatment. Angiogenesis progenitors are presented as gradients or uniform concentrations. VEGF (10-50 ng mL −1 ) and SlP (250 nM) were used to enhance morphogenesis for this analysis.

모세관 형태형성 및 튜브와 같은 구조의 특징. 주 메커니즘으로서 이에 의해 신 혈관 또는 모세혈관이 생체내에서 형성되는, 혈관신생26의 메커니즘은, 매트릭스 퇴보, 세포 이동, 증식 및 루멘 형성을 포함하는 일련의 잘-서술된 단계를 포함한다. 이는, 대사 스트레스27 ,28, 기계적 스트레스29 -31, 가용성 인자32 및 ECM 매트릭스 성분33 ,34에 의해 영향된 타이트하게 규정된 방법이다. 위상차 현미경, 형광현미경(epifluoresence) 및 공초점 현미경(confocal microscopy)을 내피 세포 구조의 3차원 형태 및 모세관 형태형성의 특징을 기술하기 위해 사용하였다. 형광 및 페이즈 컨트라스트 이미지를 Hamamatsu 카메라 및 Openlab 이미지 획득 소프트웨어가 장착된 Nikon TE300 현미경 상에 얻었다. 위상차 현미경으로, 매 12-24 시간의 살아있는 샘플의 타입-랩스 이미지를 취했다. 샘플을, 4.0% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시켰고, 액틴 세포골격 및 세포 핵을 위해 형광 마커로 태그하였다. 공초점 이미지를 Imaging Suite(PerkinsElmer Life Science) 습득 소프트웨어로 공급된 스피닝 디스크 공초점 현미경(Zeiss Axiovert 200M)를 사용하여 수집하였다. 일련의 100 광학 시리얼 섹션(1 ㎛ thick)을 얻었다. 정렬된 이미지를 스태킹하고 Imaris (Bitplane, MN)를 사용하여 3D 가시화를 위해 랜더링 되었다. EGM-2MV 완전한 배지에서 콜라겐 코팅된 플라스크 상의 서브-컨플루언스가 수득되고 후속하여 미세유체 장치에서 배양될 때까지 HMVEC-ad를 배양하였다. HMVEC-ad는 수 일의 기간 동안 가시적으로 남아 있다. 세포 시딩 후 수 시간 내 내피 세포는 콜라겐 젤 상 단층을 형성한다. Capillary morphology and tube features . The mechanism of angiogenesis 26 , in which renal vessels or capillaries are formed in vivo as the main mechanism, comprises a series of well-described steps, including matrix degeneration, cell migration, proliferation, and lumen formation. This is the way the tight regulation effect by metabolic stress 27, 28, mechanical stress 29-31, soluble factors and ECM 32 matrix component 33,34. Phase contrast microscopy, epifluoresence and confocal microscopy were used to characterize the three-dimensional and capillary morphogenesis of endothelial cell structures. Fluorescence and phase contrast images were obtained on a Nikon TE300 microscope equipped with a Hamamatsu camera and Openlab image acquisition software. With a phase contrast microscope, type-lapse images of live samples were taken every 12-24 hours. Samples were fixed with 4.0% paraformaldehyde (PFA) and tagged with fluorescent markers for actin cytoskeleton and cell nuclei. Confocal images were collected using a spinning disk confocal microscope (Zeiss Axiovert 200M) supplied with Imaging Suite (PerkinsElmer Life Science) acquisition software. A series of 100 optical cereal sections (1 μm thick) was obtained. The aligned images were stacked and rendered for 3D visualization using Imaris (Bitplane, MN). HMVEC-ad was incubated until sub-confluence on collagen coated flasks was obtained in EGM-2MV complete medium and subsequently cultured in a microfluidic device. HMVEC-ad remains visible for a period of several days. Within hours after cell seeding, endothelial cells form a monolayer on the collagen gel.

타입-랩스 무비(movie)를 스프라우트 형성 중 세포 메커니즘의 특징을 기술하고 연구하기 위해 상기 미세유체 장치의 능력을 증명하기 위해 만들었다. 전통적 스프라우팅 모델에서, 세포가 단층을 통해 보이기 때문에, 이 능력은 제한된다. 본 발명의 미세유체 장치를 사용하여, 유도성 스프라우팅 및 이동은 현미경 관측 평면에서 발생된다. 타입-랩스 이미징은 "리드-세포(lead-cell)"를 보여주며, 이는 아래 3D 콜라겐 매트릭스를 침입한다. 싱글 스프라우트 형성의 경우에; 상기 리드-세포는 필로포디아 돌출부를 상기 아래 매트릭스로 연장시켰으며, 한편, 상기 단층 상의 상기 이웃하는 내피 세포는 비-침습성으로 남아 있다. 세포 침습은 동적 돌출 및 필로포디아의 퇴축의 기간을 따르며, 한편, 상기 단층과 접촉을 유지하고 높은 극성으로 남아 있다. 초기 루트와 같은 구조는 더욱 동적 더 작은 연장으로 수 분동안 지속되는 이동 방향으로 형성된다. 후속 형태 변화는, 증가된 침투 깊이, 필로포디아 직경 및 단층으로부터의 세포 전위(핵의 이동에 의해 보임)를 포함하며, 후속하여, 원뿔형 구조(루멘 형성의 개시)를 포함한다. 상기 침습성 세포는 후속적으로 열린 루멘 구조로 스프라우트를 형성한다. 이 시스템으로, 생체내 스프라우팅 혈관 신생 중 발생되는 모든 순차적 세포 메커니즘을 관찰하였고 증명하였다. 수일 동안 배양되어 유지된 내피 세포는 다중-세포 모세관과 같은 구조를 형성한다. 단점(Endpoint) F-액틴 및 DAPI 라벨링은 이 구조들의 조직화 및 복잡성을 보여준다. 그러나, 정지 조건 하에서 유지된 모세관은 퇴행(regress)하고 상기 단층과의 이의 연결을 잃는다. 모세관 형성의 특징 중 하나는 루멘 구조의 발달이다. 열린 루멘의 존재를 증명하기 위해, 형광 미세구체를 상기 단층의 정점(apical) 표면 상에 상기 채널에 더하였다. Type-lab movies were made to demonstrate the ability of the microfluidic device to describe and study the characteristics of cellular mechanisms during sprouting. In traditional sprouting models, this ability is limited because cells are visible through monolayers. Using the microfluidic device of the present invention, inductive sprouting and movement occurs in the microscope viewing plane. Type-lab imaging shows a “lead-cell”, which invades the 3D collagen matrix below. In the case of single sprout formation; The lead-cells extended the filopodia overhang into the underlying matrix, while the neighboring endothelial cells on the monolayer remained non-invasive. Cell invasion follows a period of dynamic protrusion and degeneration of phylopodia, while maintaining contact with the monolayer and remaining of high polarity. The initial root-like structure is formed in a direction of movement that lasts for several minutes with more dynamic smaller extensions. Subsequent morphological changes include increased penetration depth, phylopodia diameter, and cell potential from the monolayer (shown by the migration of the nucleus), followed by the conical structure (initiation of lumen formation). The invasive cells subsequently form sprouts with an open lumen structure. With this system, all sequential cellular mechanisms occurring during in vivo sprouting angiogenesis were observed and demonstrated. Endothelial cells maintained in culture for several days form a multi-cell capillary-like structure. Endpoints F-actin and DAPI labeling show the organization and complexity of these structures. However, the capillaries maintained under stationary conditions regress and lose their connection with the fault. One of the features of capillary formation is the development of lumen structures. To demonstrate the presence of open lumens, fluorescent microspheres were added to the channel on the apical surface of the monolayer.

콜라겐 젤에서 군집을 이룬 내피 세포의 배양은 매크로-크기 시스템35에서 이전에 연구되었지만, 미세규모 장치에서는 아직 연구되지 않았다. 3차원 골격에서 배양된 단리된 세포는 다중-세포 코드(chord) 및 내피 세포 링을 형성했다. 생화학 자극의 효과를 증명하기 위해, 3차원 캡슐화된 내피 세포를 bFGF, VEGF 및 PMA로 보충된 배지에서 배양시켰다. 예상되는 바와 같이, 대조 샘플에 비해 형태의 극적인 차이가 있었다. 대조 샘플에서, 세포는 단리된 다중-세포 링-유사 구조를 형성하기 위해 이동되고 조직된다. 전혈관형성 인자와 자극된 세포는 컴플렉스 상호연결된 멀티-세포 모세관과 같은 구조를 형성하기 위해 리모델된다. 간질 흐름의 존재에서, 내피 세포는 생기 젤/액체 인터페이스에서 상기 젤 및 상기 단층 내 다중-세포 구조를 형성한다. Culture of colonized endothelial cells in collagen gels was previously studied in macro-sized systems 35 but has not yet been studied in microscale devices. Isolated cells cultured in three-dimensional backbone formed multi-cell chords and endothelial cell rings. To demonstrate the effect of biochemical stimulation, three-dimensional encapsulated endothelial cells were cultured in medium supplemented with bFGF, VEGF and PMA. As expected, there was a dramatic difference in morphology compared to the control sample. In the control sample, cells are migrated and organized to form an isolated multi-cell ring-like structure. Pro-angiogenic factors and stimulated cells are remodeled to form complex interconnected multi-cell capillary-like structures. In the presence of interstitial flow, endothelial cells form a multi-cell structure in the gel and the monolayer at the vital gel / liquid interface.

미세유체 장치에서 배양된 미세 혈관 내피 세포는 넓은 형태형성을 경험하였다. 피브로넥틴 코팅된 채널 상의 내피 세포는 이의 특징적 조약돌 표현형(cobblestone phenotype)을 계속 유지하며, 한편 형태의 주목할만한 차이는 상기 젤 표면에서 명백하였다. 시트 또는 튜브 형성 전에, 세포는 연속적(contiguous) 구조로서 상기 젤 영역에 공포(vacuole) 및 소포(bleb)의 현저한 증가로, 이동되었다. 이 구조들은, 매우 동적이지만, 더욱 안정한 시트 및 튜브로 점차 진화된다. 내피 세포 네트워크의 공초점 이미지 및 후속 3D 재구조로부터 얻어진 고정된 샘플의 시리얼 섹션은 상기 용기의 길이를 통해 연장되는 원형 또는 평평한 루멘과 같은 구조의 존재를 확인한다. 연속 루멘의 존재는 작은 압력 강하 하에서 상기 용기를 통해 베드를 흘림에 의해 추가로 증명된다. 일부는 상기 젤 케이지를 가로질러 모든 길에서 흐르는 것이 관찰되며, 다른 것은 혈관 구조에서 넥-다운(necked-down) 영역에서 수집된다.Microvascular endothelial cells cultured in microfluidic devices experienced broad morphogenesis. Endothelial cells on fibronectin coated channels continue to retain their characteristic cobblestone phenotype, while notable differences in morphology were evident at the gel surface. Prior to sheet or tube formation, cells were migrated as a contiguous structure, with a marked increase in vacuole and blebs in the gel region. These structures are gradually evolving into highly dynamic but more stable sheets and tubes. Confocal images of endothelial cell networks and serial sections of immobilized samples obtained from subsequent 3D reconstructions confirm the presence of structures such as circular or flat lumens extending through the length of the vessel. The presence of continuous lumen is further demonstrated by flowing the bed through the vessel under a small pressure drop. Some are observed flowing all the way across the gel cage and others are collected in the necked-down region of the vascular structure.

미세혈관 내피 세포 스프라우팅 비디오. 실시간 세포를 모니터하는 능력을 증명하기 위해, 스프라우팅 혈관신생 중 내피 세포의 타입-랩스 비디오 이미지를 기록했다. 본원에 기재된 콜라겐 젤 골격 상에 내피 단층을 형성했다. 상기 미세유체 장치를 37℃ 및 5% CO2에서 커스텀 빌트(custom built) 환경 대조 챔버에서 유지되었고, 세포는 Zeiss 인버트된 현미경으로 가시화되었다. 실험의 과정 중 증발을 최소화하기 위해, 배지 저장소(0 높이 차이로)를 각 입구 및 출구 포트에서 직접 연결시켰다. 그 다음에 상기 장치는 가시화를 위해 아래에 컷-아웃 유리 윈도우 및 습윤화된 로컬 환경을 가진 부 컨테이너에 배치되었다. 브라이트-필드 이미지를 Axio Vision 이미지 획득 소프트웨어로 2분 간격에서 AxioCam MRm(Carl Zeiss)(싱글 광학 플레인(single optical plane)에서)로 취했다. Microvascular Endothelial Cell Sprouting Video . To demonstrate the ability to monitor real time cells, type-lab video images of endothelial cells during sprouting angiogenesis were recorded. An endothelial monolayer was formed on the collagen gel backbone described herein. The microfluidic device was maintained in a custom built environmental control chamber at 37 ° C. and 5% CO 2 and the cells were visualized with a Zeiss inverted microscope. To minimize evaporation during the course of the experiment, a media reservoir (with zero height difference) was connected directly at each inlet and outlet port. The device was then placed in a secondary container with a cut-out glass window below and a wet local environment for visualization. Bright-field images were taken with AxioCam MRm (Carl Zeiss) (in single optical plane) at 2 minute intervals with Axio Vision image acquisition software.

세포 골격 및 핵 염색. "모세관-유사" 네트워크 또는 튜브 구조에 포함된 세포의 수 및 F-액틴 분배는 상기 장치 내 2-7일 배양 후 평가되었다. F-액틴 및 핵 염색을 4.0% PFA(30분)으로 고정 후 수행하였다. 상기 고정된 샘플을 IX 인산염 완충된 염수(PBS)로 두 번 세정하였고, 0.1% Triton-X(1-2 분)으로 처리하였고, IX PBS으로 세정하였고, 후속하여 DAPI 및 로다민 팔로이딘의 혼합물의 주입(30분)하였고, IX PBS으로 최종 세척하였다. Cytoskeleton and nuclear staining . The number and F-actin distribution of cells included in the "capillary-like" network or tube structure were evaluated after 2-7 days of culture in the device. F-actin and nuclear staining were performed after fixation with 4.0% PFA (30 min). The immobilized samples were washed twice with IX phosphate buffered saline (PBS), treated with 0.1% Triton-X (1-2 minutes), washed with IX PBS, and subsequently a mixture of DAPI and rhodamine paloidine. Was injected (30 min) and finally washed with IX PBS.

실시예 4: 다중 유체-흐름 경로 장치 내 세포 이동의 연구Example 4 Study of Cell Migration in a Multiple Fluid-Flow Pathway Apparatus

PDMS 미세유체 분석 준비. 미세유체 분석을, SU-8 패턴화된 웨이퍼로 일반적 소프트 리소그래피 방법에 의해 PDMS(폴리-디메틸 실록산, Silgard 184, Dow Chemical, MI)로 하였다. 4-인치 실리콘 웨이퍼를 5분 동안 200℃ 핫 플레이트에서 탈수시켰고, 그 다음에, SU-8 2050 광레지스트(MicroChem, MA)에 의해 코팅하였다. 상기 코팅된 웨이퍼를 핫 플레이트에서 소프트 베이크하였고, UV 얼라이너(aligner)(EVGroup, AZ)에 노출시켰고, 다시 베이크 하였다. 패턴을 PM 아세테이트에 의해 발달시켰고, 이소-프로필 알코올로 세정하였다. 상기 웨이퍼를 그 다음에 트리데카플루오로-1,1,2,2,-테트라히드로옥틸-1-트리클로로실란으로 코팅하여 상기 경화된 PDMS를 쉽게 상기 웨이퍼로부터 탈착 가능하도록 하였다. PDMS 경화 키트를 혼합하였고, 상기 웨이퍼 상에 부었으며, 이를 그 다음에 80℃에서 2시간 동안 오븐에서 경화하였다. 상기 경화된 PDMS를 상기 웨이퍼로부터 탈착하였고, 트리밍하였고 펀칭하여 미세유체 채널의 입구 및 출구를 형성하였다. 제조된 PDMS 장치 및 유리 커버슬립을 고압멸균(autoclave)하였고 밤새 80℃에서 오븐에서 건조하였다. 그 다음에 이들을 공기 환경에서 플라즈마 클리너(Harrick, CA)에 의해 40초 동안 플라즈마 처리하였고, 닫힌 미세유체 채널을 형성하기 위해 함께 결합시켰다. 상기 결합된 장치를 10분 동안 80℃의 오븐에 유지시켜서 상기 결합 강도를 높였고 그 다음에 코팅 용액을 상기 채널에 채워서 상기 채널이 세포 시딩에 적합하도록 하였다. 상기 장치를 그 다음에 흡입시켰고 살균수로 세척하였다. 그 다음에 상기 코팅된 장치를 24시간 동안 80℃의 오븐에서 건조시켜서, 상기 채널 표면을 소수성을 만들었다. 골격 물질을 그 다음에 상기 젤 영역에 채워서 젤 골격을 형성하였다. 상기 실험에서, 타입 I 콜라겐(BD Biosciences, MA)을 피펫으로 채웠고 인큐베이터에 30분 동안 유지시켰다. 젤 중합 후, 세포 배양 배지를 미세유체 채널에 채웠고 상기 장치를 셀 시딩을 위해 인큐베이터에 유지시켰다. PDMS Microfluidic Analysis Preparation . Microfluidic analysis was performed with SU-8 patterned wafers as PDMS (poly-dimethyl siloxane, Silgard 184, Dow Chemical, MI) by general soft lithography methods. The 4-inch silicon wafer was dehydrated in a 200 ° C. hot plate for 5 minutes and then coated with SU-8 2050 photoresist (MicroChem, MA). The coated wafers were soft baked on a hot plate, exposed to a UV aligner (EVGroup, AZ) and baked again. The pattern was developed with PM acetate and washed with iso-propyl alcohol. The wafer was then coated with tridecafluoro-1,1,2,2, -tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane to make the cured PDMS easily detachable from the wafer. The PDMS curing kit was mixed and poured onto the wafer, which was then cured in an oven at 80 ° C. for 2 hours. The cured PDMS was detached from the wafer, trimmed and punched to form the inlet and outlet of the microfluidic channel. The prepared PDMS device and glass coverslips were autoclave and dried in an oven at 80 ° C. overnight. They were then plasma treated for 40 seconds by a plasma cleaner (Harrick, CA) in an air environment and joined together to form a closed microfluidic channel. The bound device was held in an oven at 80 ° C. for 10 minutes to increase the bond strength and then a coating solution was filled into the channel to make the channel suitable for cell seeding. The device was then aspirated and washed with sterile water. The coated device was then dried in an oven at 80 ° C. for 24 hours to make the channel surface hydrophobic. The backbone material was then filled into the gel area to form a gel backbone. In this experiment, type I collagen (BD Biosciences, MA) was pipetted and held in an incubator for 30 minutes. After gel polymerization, the cell culture medium was filled into the microfluidic channel and the device was kept in an incubator for cell seeding.

배지 변화, 덱스트란 확산 실험 및 흐름 적용. 상기 채워진 배지는 상기 배지의 증발을 피하기 위해 입구 및 출구 상에 점적으로서 유지되어야 한다. 현존하는 점적을 흡입하고 일 측면 상의 배지의 새로운 점적을 더하는 것은, 모세관 힘에 의해 마이크로 흐름을 생성할 수 있어서, 상기 세포 상의 최소 전단 스트레스로 상기 채널 내 오래된 배지를 대체할 수 있다. 유체 전단 스트레스 또는 압력 구배와 같은 기계적 혈관 형성 인자를 적용하기 위해, 튜브 및 펌프를 구성하는 유체 서킷은 정확한 제어된 흐름을 적용하기 위해 상기 장치의 입구 및 출구에 연결될 수 있다. 조건 채널로부터 세포 채널로 생화학 인자의 확산을 가시화하기 위해, 40 kDa의 분자량을 가진 덱스트란을 최종 농도 0.5 ㎍/mL로 내피 성장 인자와 혼합하였고 조건 채널에 더해졌다. 상기 확산 프로필은, 형광 현미경(Nikon Instruments, NY)에 의해 취해졌고, Matlab에 의해 분석하여 이미지로부터 강도 그래프를 얻었다. 형광 덱스트란의 상기 콜라겐 젤 골격으로의 타입-랩스 확산을 측정하였다. 안정하고 선형 구배를 얻었고 수 시간 동안 유지하였다. 이미지를 상기 조건 채널로 덱스트란 혼합된 배지를 적용한 10시간 후에 얻었다. 덱스트란의 분자량은 VEGF의 40 kDa의 분자량이었다. 사용된 상기 콜라겐 골격은 pH 7.4에서 중합된 2.0 mg/mL 농도를 가졌다. 콜라겐 젤 골격으로 덱스트란의 일시 확산 곡선은 30분 내 일 유체-흐름 결로로부터 상기 골격을 통해 또 다른 유체-흐름 경로로 덱스트란 이동을 보여준다. Medium change, dextran diffusion experiments and flow application . The filled medium should be kept in droplets on the inlet and outlet to avoid evaporation of the medium. Inhaling an existing drop and adding a new drop of medium on one side may create micro flow by capillary force, replacing the old medium in the channel with minimal shear stress on the cells. In order to apply mechanical angiogenesis factors such as fluid shear stress or pressure gradient, the fluid circuits that make up the tubes and pumps can be connected to the inlet and outlet of the device to apply accurate controlled flow. To visualize the diffusion of biochemical factors from the condition channel to the cell channel, dextran with a molecular weight of 40 kDa was mixed with endothelial growth factor at a final concentration of 0.5 μg / mL and added to the condition channel. The diffusion profile was taken by a fluorescence microscope (Nikon Instruments, NY) and analyzed by Matlab to obtain an intensity graph from the image. Type-Lab diffusion of the fluorescent dextran into the collagen gel backbone was measured. A stable, linear gradient was obtained and maintained for several hours. Images were obtained 10 hours after application of dextran mixed media into the above condition channels. The molecular weight of dextran was the molecular weight of 40 kDa of VEGF. The collagen backbone used had a 2.0 mg / mL concentration polymerized at pH 7.4. The transient diffusion curve of dextran into the collagen gel backbone shows dextran migration from one fluid-flow condensation within 30 minutes to another fluid-flow path through the backbone.

내피세포 배양. 상기 세포 현탁 배지를 2x106 세포/mL로 제조하였고 상기 세포 배양 채널로 채웠다. 채움 후, 상기 장치를, 상기 배지가 대체되기 전에, 상기 세포가 정착되고 상기 기판 상에 부착되도록 30분 동안 인큐베이터에 유지시켰다. 상시 세포 부착 기간은 상기 세포 타입에 의존하여 30분 내지 수 시간이다. 인가 피부 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 상업적으로 입수 하였고(Lonza, NJ), 9이하의 경과(passage)를 위해 콜라겐 I (BD Biosciences, MA)로 미리 코팅된 규칙적 배양 플라스크 상의 내피 성장 배지(EGM -2MV; Lonza, NJ)로 팽창시켰다. 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF; R&D 시스템s, MN)를 작업 농도 20 ng/mL로 세포 배양 배지와 혼합시켰고, 그 다음에, 상기 조건 채널에 채워서 구배를 만들었다. Endothelial Cell Culture . The cell suspension medium was prepared at 2 × 10 6 cells / mL and filled with the cell culture channel. After filling, the device was held in an incubator for 30 minutes to allow the cells to settle and adhere onto the substrate before the medium was replaced. Normal cell adhesion period is from 30 minutes to several hours depending on the cell type. Applied skin microvascular endothelial cells (HMVEC) were obtained commercially (Lonza, NJ) and endothelial growth medium (EGM) on regular culture flasks precoated with collagen I (BD Biosciences, MA) for passage up to 9 -2 MV; Lonza, NJ). Recombinant human vascular endothelial growth factor (VEGF; R & D systems, MN) was mixed with the cell culture medium at a working concentration of 20 ng / mL, and then filled in the condition channel to create a gradient.

세포 이동의 측정 및 정량화. 상기 장치를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 인큐베이터에서 유지시켰고, 세포 이동을 위상차 현미경(Nikon Instruments, NY)에 의해 매일 모니터하였다. 이동된 세포 아웃라인의 상기 길이 및 영역을 ImageJ에 의해 측정하였다. 면역 형광법 염색을 수행하여 상기 최종 세포 이동 결과를 가시화하였다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin(Sigma-Aldrich, Switzerland) 및 DAPI(Sigma- Aldrich, Switzerland)로 각각 염색하였다. Measurement and Quantification of Cell Migration . The device was maintained in an incubator containing 5% CO 2 at 37 ° C. and cell migration was monitored daily by phase contrast microscope (Nikon Instruments, NY). The length and area of the migrated cell outline were measured by ImageJ. Immunofluorescence staining was performed to visualize the final cell migration results. Actin filaments and nuclei were stained with Rhodamine-Phalloidin (Sigma-Aldrich, Switzerland) and DAPI (Sigma- Aldrich, Switzerland), respectively.

공배양 실험. 1) MTLn3/U87MG 및 HMVEC 공배양; 래트 유방 선암 세포 라인(MTLn3)을 5% 우태아 혈청(FBS), ImM Na(HCO3)2, 4 mM L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 α-최소 실제 배지(α-MEM; Invitrogen, CA)에서 성장시켰다. 인간세포주(Human glioblastoma cell line)(U87MG)를 10% FBS, ImM Na(HCO3)2, 4 mM L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 성장시켰다. 상기 U87MG 세포 현탁물을 농도 1 x 106 세포/mL에서 제조하였고, 상기 조건 채널에 채웠다. 고밀도의 MTLn3 세포 현탁물은 농도 1 x 106 세포/mL였고, 저밀도는, 농도 0.5 x 106 세포/mL였다. HMVEC 현탁물을 상기 기재된 바와 같이 농도 2x106 세포/mL에서 제조하였고, MTLn3 또는 U87MG 세포 시딩 1일 후 세포 배양 채널에 채웠다. 상기 세포 배양 채널을 내피 성장 배지로 채웠고 대조/조건 채널을 상기 기재된 MTLn3 또는 U87MG 배지로 채웠다. 배지를 매일 바꿨다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI로 각각 염색하였고, GFP-발현 MTLn3 및 U87MG 세포를 HMVEC과 구별짓기 위해 사용하였다. 평활근세포(SMCs)를 상기 기재된 HMVEC 배지에서 성장시켰고, 현탁물을 농도 0.5 x 1O6 세포/mL에서 제조하였다. 상기 현탁물을, 상기 세포 채널로의 HMVEC 시딩 1일 전에 상기 조건 채널로 채웠다. 배지를 매일 바꿨다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI으로 염색하였다. 상기 기재된 동일한 세포 현탁물을 제조하였고 U87MG 세포의 화학주성 평가를 위해 상기 세포 채널로 채웠다. 상기 대조 채널을 세포 채널과 동일한 배지로 채웠고, 상기 조건 채널을 20 ng/mL 또는 200 ng/mL hEGF로 보충된 배지로 채웠다. hEGF 구배를 세포 시딩 하루 후에 적용하였고, 상기 채널 내 모든 배지를 매일 바꿨다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI으로 각각 염색하였다. 실험에서 사용된 모든 콜라겐 젤 골격을 pH 7.4 또는 11.0에서, 농도 2.0 mg/mL 또는 2.5 mg/mL에서 중합하였다. Co-culture experiment . 1) MTLn3 / U87MG and HMVEC cocultures; Rat breast adenocarcinoma cell line (MTLn3) was α-minimum medium (α-MEM supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS), ImM Na (HCO 3 ) 2 , 4 mM L-glutamine, and penicillin / streptomycin; Invitrogen, CA). Human glioblastoma cell line (U87MG) was grown in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% FBS, ImM Na (HCO 3 ) 2 , 4 mM L-glutamine, and penicillin / streptomycin. The U87MG cell suspension was prepared at a concentration of 1 × 10 6 cells / mL and filled in the condition channel. High density MTLn3 cell suspensions had a concentration of 1 × 10 6 cells / mL and low density had a concentration of 0.5 × 10 6 cells / mL. HMVEC suspension was prepared at a concentration of 2 × 10 6 cells / mL as described above and filled into the cell culture channel 1 day after MTLn3 or U87MG cell seeding. The cell culture channel was filled with endothelial growth medium and the control / condition channel was filled with MTLn3 or U87MG medium described above. I changed the badge every day. Actin filaments and nuclei were stained with Rhodamine-Phalloidin and DAPI, respectively, and GFP-expressing MTLn3 and U87MG cells were used to distinguish from HMVEC. Smooth muscle cells (SMCs) were grown in HMVEC medium as described above and suspensions were prepared at concentrations of 0.5 × 10 6 cells / mL. The suspension was filled with the condition channel one day before HMVEC seeding into the cell channel. I changed the badge every day. Actin filaments and nuclei were stained with Rhodamine-Phalloidin and DAPI. The same cell suspension described above was prepared and filled with the cell channel for chemotaxis evaluation of U87MG cells. The control channel was filled with the same medium as the cell channel and the condition channel was filled with medium supplemented with 20 ng / mL or 200 ng / mL hEGF. The hEGF gradient was applied one day after cell seeding and all media in the channel was changed daily. Actin filaments and nuclei were stained with Rhodamine-Phalloidin and DAPI, respectively. All collagen gel backbones used in the experiments were polymerized at pH 7.4 or 11.0, at a concentration of 2.0 mg / mL or 2.5 mg / mL.

세포 이동을 연구하기 위한 미세유체 바이오반응기를 하기 이점을 가지도록 고안하였고 제조하였다: 1) 실시간 가시적 검사 및 쉬운 정량화, 2) 세포 타입 및 배양 조건의 다기능성 및 3) 생화학 및 생역학적 자극에 대한 정확한 제어. 세포를 시딩 하였고 ECM-유사 물질로 만들어진 상기 골격과 직접 접촉한 일 미세유체 채널(세포 채널)에서 배양하였다. 상기 세포 채널 내 세포들은 생화학 및 기계적 인자의 영향 하에서 상기 골격을 통해 상기 대항하는 채널을 향해 이동된다. 기계적 인자 예컨대 압력 구배에 의해 만들어진 유체 전단 스트레스 및 간질 흐름은 적용될 수 있으며, 한편 생화학 큐(cue)는 세포 반응을 연구하기 위해 공간적으로 균일하게 또는 제어된 구배로 도입될 수 있다. 상기 골격은 또한 부동화된 리간드 또는 작용화된 ECM의 구배로 직접 이동을 위해 기능화될 수 있다. 마지막으로, 제 2 세포 타입은 상기 젤 영역 내에 정지될 수 있거나 대항하는 채널에서 배양되어 공배양물 의존적 세포 이동 및 상호작용을 평가할 수 있다.Microfluidic bioreactors for studying cell migration are designed and manufactured with the following advantages: 1) real-time visual inspection and easy quantification, 2) multifunctionality of cell types and culture conditions, and 3) biochemical and biomechanical stimuli. Precise control. Cells were seeded and cultured in one microfluidic channel (cell channel) in direct contact with the backbone made of ECM-like material. Cells in the cell channel migrate through the backbone toward the opposing channel under the influence of biochemical and mechanical factors. Fluid shear stress and interstitial flow created by mechanical factors such as pressure gradients can be applied, while biochemical cues can be introduced into spatially uniform or controlled gradients to study cellular responses. The backbone may also be functionalized for direct migration into immobilized ligand or gradient of functionalized ECM. Finally, the second cell type may be stationary in the gel region or cultured in opposing channels to assess coculture dependent cell migration and interaction.

상기 "세포 채널"은 두 측 상에 젤 골격을 가진 중심에 위치되어서, 세포들은 기계적 및 생화학적 인자((예를 들어, 화학주성물질 또는 성장 인자(VEGF, SlP)의 유체 전단 스트레스, 간질 흐름, 골격 단단함 및 고정된 구배)의 정확하게 제어된 조건 하에서 각 측면에 이동될 수 있다. 상기 3개의 채널 디자인은, 동일한 샘플에서 동시에 상기 대조 및 조건 실험이 수행되도록 하는 독특한 특징을 가진다. 상기 외부 채널 중 하나 ("조건 채널")은 시험 작용제를를 함유하고, 한편 다른 하나("대조 채널")는 대조 배지를 함유한다. 상기 조건 채널 또는 상기 대조 채널로의 세포 이동은 직접 비교될 수 있고, 세포 활성, 세포 시딩 밀도, 배지 조성물 및 다른 환경 조건의 적은 차이 때문에, 칩-투-칩(chip-to-chip) 에러를 최소화한다.The "cell channel" is located in the center with a gel backbone on both sides, so that the cells are in fluid shear stress, interstitial flow of mechanical and biochemical factors (e.g., chemotactic or growth factors (VEGF, SlP). Can be moved to each side under precisely controlled conditions of skeletal rigidity and fixed gradients) The three channel design has a unique feature that allows the control and condition experiments to be performed simultaneously on the same sample. One ("condition channel") contains the test agent, while the other ("control channel") contains the control medium, the cell migration to the condition channel or the control channel can be directly compared and the cells Due to small differences in activity, cell seeding density, media composition and other environmental conditions, chip-to-chip errors are minimized.

상기 생화학 확산 및 구배 생성의 특징은 형광 태그된 덱스트란을 사용하여 평가될 수 있다. 덱스트란 40 kDa 분자량을 사용하여 성장 인자 확산을 자극하였다. 덱스트란은 상기 조건 채널에 적용되었고, 3차원 골격 영역 내 그 결과의 형광 강도는, 상기 세포 채널로 확산된 덱스트란으로서 모니터되었다. 상기 중심 세포 채널로 덱스트란의 초기 확산은 30분 내에 발생되었다. 평형을 수 시간 후 얻었고, 선형 농도 프로필을 10시간 동안 유지시켰다. Characterization of the biochemical diffusion and gradient generation can be assessed using fluorescently tagged dextran. Dextran 40 kDa molecular weight was used to stimulate growth factor diffusion. Dextran was applied to the condition channel and the resulting fluorescence intensity in the three-dimensional framework region was monitored as dextran diffused into the cell channel. Initial diffusion of dextran into the central cell channel occurred within 30 minutes. Equilibration was obtained after several hours, and the linear concentration profile was maintained for 10 hours.

내피 세포로의 정량화 된 화학주성 실험. 모세관 형태형성의 분석에서 본원에 기재된 미세유체 장치의 기능성을 증명하기 위해, 인간 피부 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 상기 세포 채널에서 시딩하였고 컨플루언트 단층을 세포 시딩 1-2일 후 형성하였다. 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF), 내피 세포 이동의 알려진 자극제23 ,24를 상기 조건 채널에 적용하였고, 상기 세포 채널과 상기 조건 채널 사이의 젤 골격 내 VEGF 구배를 발생시켰다. 상기 대조 채널을 VEGF 없이 대조군으로서 정상 세포 배양 배지로 채웠다. 배지 점적(40μL)을 상기 채널 입구 및 출구 위에 배치하여 채널들 사이 및 이에 따른 압력 차이를 제어하고(즉, 배지 변화 및 세포 시딩 중 흐름을 발생 또는 상기 실험의 과정 중 흐름 조건을 유지하지 않음), Walker et al.25에 의해 이전에 보여진 기술은 배지를 보충하기에 충분히 강한 그리고 동시에 상기 골격 또는 세포에 임의의 손상을 피하기에 충분히 약한 안정적 흐름을 생성한다. 상이한 강성도(stiffness)(pH 7.4 및 pH 11)의 콜라겐 골격으로의 세포의 이동의 길이 및 영역 변화를 관찰하였고 수일에 거쳐 정량화하였다. 상기 조건 측면에서, 세포는 빠르게 상기 골격으로 이동하였고, 한편 훨씬 적은 이동을 대조군 측면 상에서 관찰되었다. Quantified Chemotaxis Experiments with Endothelial Cells . To demonstrate the functionality of the microfluidic device described herein in the analysis of capillary morphology, human skin microvascular endothelial cells (HMVECs) were seeded in these cell channels and confluent monolayers formed 1-2 days after cell seeding. Vascular endothelial growth factor -A (VEGF), was applied to a known irritant 23,24 of endothelial cell migration in the channel conditions, was generated in VEGF gradient gel skeleton of the cell between the channel and the channel conditions. The control channel was filled with normal cell culture medium as a control without VEGF. A medium drop (40 μL) is placed above the channel inlet and outlet to control the pressure difference between the channels and thus accordingly (i.e. not generate flow during medium change and cell seeding or maintain flow conditions during the course of the experiment). , Walker et al. The technique previously shown by 25 produces a stable flow that is strong enough to replenish the medium and at the same time weak enough to avoid any damage to the backbone or cells. Changes in the length and area of migration of cells to the collagen backbone of different stiffness (pH 7.4 and pH 11) were observed and quantified over several days. In terms of these conditions, cells migrated rapidly into the backbone, while much less migration was observed on the control side.

도 20a-g에 도시된 바와 같이, 내피 세포를 콜라겐 골격으로 이동하도록 자극하였다. 도 2Oa는 내피 세포 시딩 하루 후, 컨플루언트 단층을 상기 세포 채널에 형성하였고 성장 인자(20 ng/mL의 VEGF)는 그 다음에 상기 조건 채널에 적용되었음을 보여준다. 도 2Ob는 pH 7.4 및 (c) pH 11.0에서 중합된 콜라겐 젤 골격 내 미세혈관 세포의 이동 결과를 보여준다. 세포를 VEGF 구배 적용의 5일 그리고 배양의 6일 후 고정시켰고 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI로 염색하였다. 흰색 점선은 젤 골격의 아웃라인을 가리키고, 골격 내 작은 사각형은 150 ㎛ x 150 ㎛의 PDMS 포스트를 가리킨다. "0.2%"은 콜라겐 농도의 2.0 mg/mL을 가리킨다. 두 경우에, 세포들은 우선적으로 VEGF 구배를 향해 상기 조건 측면 상의 젤로 이동되었음을 인식될 수 있다. 도 2Od는 농도 2.0 mg/mL로 pH 7.4에서 중합된 콜라겐 젤 내 이동된 세포의 표준화된 상대적 길이의 그래프이다. 'No VEGF'는 VEGF 구배 없이 네거티브 대조군으로서 제공된다. VEGF를 여러 기간 동안 매일 적용하였다. 'VEGF 1일에'는 세포 시딩 1일 후 첫째로 적용하였음을 의미한다. 2일 또는 3일에 VEGF는 VEGF를 세포 시딩 후 2 또는 3일 후에 첫째로 적용하였음을 의미한다. 상대적 길이를 상기 대조군 측면과의 차이로서 계산하였다. 도 2Oe는 농도 2.0 mg/mL로 pH 7.4에서 중합된 상기 콜라겐 젤 골격에서 이동된 세포의 표준화된 상대적 영역의 그래프이다. 도 2Of 및 g는 농도 2.0 mg/mL로 pH 11에서 중합된 상기 콜라겐 젤 골격에서 이동된 세포의 표준화된 상대적 길이 및 영역의 그래프이다. 모든 그래프는 일 조건 하에서 n=8(총 8 골격)로 4 장치에서의 값의 평균에 의해 만들었다.As shown in FIGS. 20A-G, endothelial cells were stimulated to migrate into the collagen backbone. 2Oa shows that one day after endothelial cell seeding, a confluent monolayer was formed in the cell channel and growth factor (20 ng / mL VEGF) was then applied to the condition channel. Figure 20b shows the results of migration of microvascular cells in the collagen gel backbone polymerized at pH 7.4 and (c) pH 11.0. Cells were fixed 5 days after VEGF gradient application and 6 days of culture and stained with Rhodamine-Phalloidin and DAPI. White dotted lines indicate the outline of the gel backbone and small squares in the backbone indicate PDMS posts of 150 μm × 150 μm. "0.2%" refers to 2.0 mg / mL of collagen concentration. In both cases, it can be recognized that cells preferentially migrated to the gel on the condition side towards the VEGF gradient. FIG. 2Od is a graph of normalized relative lengths of cells migrated in collagen gels polymerized at pH 7.4 at a concentration of 2.0 mg / mL. 'No VEGF' served as a negative control without VEGF gradient. VEGF was applied daily for several periods of time. 'On day 1 of VEGF' means first application after day 1 of cell seeding. VEGF on day 2 or 3 means that VEGF was first applied 2 or 3 days after cell seeding. Relative length was calculated as the difference from the control side. 2Oe is a graph of normalized relative regions of cells migrated from the collagen gel backbone polymerized at pH 7.4 at a concentration of 2.0 mg / mL. 2Of and g are graphs of normalized relative lengths and regions of cells migrated from the collagen gel backbone polymerized at pH 11 at a concentration of 2.0 mg / mL. All graphs were made by the average of the values at 4 devices with n = 8 (8 skeletons total) under one condition.

이 분석의 민감도를 평가하기 위해, VEGF를 세포 시딩 1, 2 또는 3일 후 상기 조건 채널에 적용하였다. 결과를 2 방식으로 표현하였다: 상기 표준화된 값 및 상기 상대적 표준화된 값. 상기 표준화된 값에 대해서, 상기 측정된 데이터를 초기 시점에서 이들의 자신의 베이스라인 데이터로 표준화하였다. (Eq. 1). 상대적 표준화된 값을 상기 조건 측면과 상기 대조군 측면의 표준화된 데이터 사이의 차이로서 평가하였다. (Eq. 2).To assess the sensitivity of this assay, VEGF was applied to the condition channel 1, 2 or 3 days after cell seeding. The results were expressed in two ways: the normalized value and the relative normalized value. For the normalized values, the measured data were normalized to their own baseline data at an initial time point. (Eq. 1). Relative normalized values were evaluated as the difference between the normalized data of the condition side and the control side. (Eq. 2).

Figure pct00003
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여기서 F0는 초기 시점의 값이고, FB는 기초 값, Fn은 n 시점에서의 값, 및 [Fn]은 표준화된 값이다. F는 세포의 외부 외피(envelope)의 길이 L이거나, 돌출된 세포 영역, S이다. 어떠한 통계적으로 큰 차이도 단지 표준화된 값으로 관찰될 수 없었다. 그러나, 상대적 표준화된 값은 VEGF 적용의 상이한 기간을 위한 세포 이동의 길이 및 영역 변화를 비교할 때 통계적으로 큰 차이를 만들었다. 길이 및 면적 변화의 상기 상대적 표준화된 값은, pH 7.4에서 중합된 콜라겐 젤로, 세포 시딩 1일 및 2일에서 적용된 VEGF가 세포 이동을 유도하였고, 한편 3일 후에 VEGF는 그러하지 못하였음을 함축한다. pH 11.0에서 중합된 콜라겐 골격(강성 젤)에서, 상기 길이 변화의 상대적 표준화된 값은 여러 시점에서 세포 이동의 큰 변화를 보여주었다. 상기 영역의 상대적 표준화된 값은, 그러나, 너무 작아서 pH 11.0에서 중합된 콜라겐 골격에서 탐지되지 않는다. 상대적 표준화된 값은 표준화된 값만을 연구하는 경우에 명백하지 않았던 통찰을 제공한다. 높은 민간성은 동일한 장치 상의 대조 실험을 비교함에 의해 달성될 수 있었고 칩-투-칩 변화성을 제거하였다.Where F 0 is the value at the initial time point, FB is the base value, Fn is the value at n time point, and [Fn] is a normalized value. F is the length L of the outer envelope of the cell or the protruding cell region, S. No statistically significant difference could be observed with just standardized values. However, relative standardized values made statistically significant differences when comparing the length and area changes of cell migration for different periods of VEGF application. The relative normalized values of length and area change imply that with collagen gels polymerized at pH 7.4, VEGF applied on day 1 and 2 of cell seeding induced cell migration, while after 3 days VEGF did not. In the collagen backbone (rigid gel) polymerized at pH 11.0, the relative standardized value of this change in length showed a large change in cell migration at various time points. The relative normalized value of this region, however, is too small to be detected in the collagen backbone polymerized at pH 11.0. Relative standardized values provide insights that were not apparent when studying only standardized values. High civility could be achieved by comparing control experiments on the same device and eliminated chip-to-chip variability.

콜라겐 골격의 기계적 특성에 의해 유도된 혈관신생. 본원에서 증명된 상기 관찰된 내피 세포 이동 패턴은 상기 콜라겐 젤 강성도에 의존한다. 젤 강성도는 더 강한(stiffer) 젤5을 가져오는 더 높은 pH 값으로 중합 전에 콜라겐 용액의 pH를 조절함에 의해 제어될 수 있다. pH 7.4 및 pH 11 젤의 초기 젤화 조건을 비교하는 것은 더 강성인 콜라겐 젤(pH 11에서 중합)은 내피 세포 집단 이동을 제한하지만, 20-30 ㎛의 범위의 직경의 관-유사 구조의 생성을 증진시킴을 드러내었다. 형성된 구조는 생체내 분석 또는 3D 매크로 분석9 ,18에서 관찰된 관-유사 모세관을 닮았고, 루멘의 존재는 상대 배양 배지로 2-㎛ 마이크로베드를 도입하고 형광 현미경을 사용하여 상기 마이크로베드 이동을 추척함에 의해 후속적으로 확인되었다. 이 확인을 위해, 낮은 간질 흐름을 점적 크기 대조군을 통해 이들 사이의 압력 차이를 유지함에 의해 상기 조건 채널로 상기 세포 배양 채널로부터 적용하였다25. 마이크로베드의 시간 경과 입자 추적을 수행하였고 베드는 시간 경과에 상기 모세관 구조의 말단에 축적되는 관-유사 구조 내에만 흘렀다. Angiogenesis induced by the mechanical properties of the collagen skeleton . The observed endothelial cell migration pattern demonstrated herein depends on the collagen gel stiffness. Gel stiffness can be controlled by adjusting the pH of the collagen solution prior to polymerization to a higher pH value resulting in a stiffer gel 5 . Comparing the initial gelling conditions of pH 7.4 and pH 11 gels, the more rigid collagen gel (polymerized at pH 11) limits endothelial cell population migration, but promotes the production of tube-like structures with diameters in the range of 20-30 μm. Revealed Sikkim. Formed structure in vivo assays or 3D macro analysis. 9, the tube observed in 18 - resembles a similar capillary tube, the presence of the lumen is tracking the micro-bed moving introducing 2-㎛ micro bed to the external culture medium and by using a fluorescence microscope Subsequently confirmed. For this confirmation, low interstitial flow was applied from the cell culture channel to the condition channel by maintaining a pressure difference between them via a drop size control 25 . Time course particle tracing of the microbed was performed and the bed flowed only within the tube-like structure that accumulates at the ends of the capillary structure over time.

이동된 내피 세포의 구조 상의 젤 강성도의 역할은 또한 이동된 세포의 아웃라인 내 차이에 의해 예시될 수 있다. 더 유연한 골격에서, 상기 아웃라인은 상기 골격의 두 말단에 도달하도록 넓었고, 한편 더 강성 골격에서의 아웃라인은 매우 슬렌더(slender)하고, 관-유사 구조임을 보여주었다. 이 관찰은 상기 골격의 상이한 기계적 특성을 가진 이동된 세포 및 관-유사 구조의 구조를 제어하는 상이한 기계적 특성 및 능력을 가진 골격 내 세포 이동의 상이한 모드를 함축한다. 상기 골격의 기계적 특성이 핵의 위치에 영향을 주는 것은 알리는 것은 또한 의미 있다. 더 유연한 골격에서, 이동된 세포의 핵은 세포의 중심 근처에 위치하였다.The role of gel stiffness on the structure of migrated endothelial cells can also be exemplified by the differences in the outline of migrated cells. In the more flexible skeleton, the outline was wide enough to reach both ends of the skeleton, while the outline in the more rigid skeleton was very slender and tubular-like structure. This observation implies different modes of cell migration within the skeleton with different mechanical properties and the ability to control the structure of the migrated cells and tube-like structures with different mechanical properties of the skeleton. It is also important to note that the mechanical properties of the skeleton affect the position of the nucleus. In a more flexible framework, the nuclei of migrated cells were located near the center of the cells.

이동된 세포의 상이한 모드 또는 구조를 양적으로 묘사하는 시도에 있어서, 표준화된 영역은 표준화된 길이에 대항하여 플롯된다. 두 개의 새로운 파라미터가 정의된다, 공식 3에서 도시된 바와 같이, (이동된 세포 아웃라인의 가정된 길이) 및 K (이동된 세포 아웃라인의 너비의 가정된 합). 이러한 가정 하에서, 관-유사 구조는 3개의 바운더리, K = 50, K = 150 및 [Sn] = 8로의 실험 값에 의해 기술된다.In an attempt to quantitatively depict different modes or structures of migrated cells, normalized regions are plotted against normalized lengths. Two new parameters are defined, as shown in Equation 3 (the assumed length of the moved cell outline) and K (the assumed sum of the widths of the moved cell outline). Under this assumption, the tube-like structure is described by experimental values with three boundaries, K = 50, K = 150 and [S n ] = 8.

Figure pct00004
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신규한 미세유체 플랫폼의 여러 어플리케이션. 새로운 디자인의 주된 이점은 3D 매트릭스를 통해 그리고 내피 층을 가로지른 세포 이동을 연구하는 이의 능력이다. 암 세포 분출(extravagation)은 내피 세포와의 상호 작용에 의존함을 이전에 도시하였다26 ,27. 암세포 기질 세포는 세포 신생을 위해 내피 세포에 신호를 보냄을 충분히 인식된다. 암 치료에서, 세포 신생을 방해하는 것은, 화학요법 및 다른 치료와 함께 결정적이다28. 이러한 효과를 조사하기 위해, 암 세포 및 내피 세포의 상호작용은, 미세유체 장치 내 상기 두 세포 타입을 공배양 함에 의해 연구되었다. 래트 유방 선암 세포 라인(MTLn3) 또는 인간 중성 암 세포(U87MG)는 상기 조건 채널에서 배양되었고 HMVEC는 상기 셀 채널에서 배양되었다. 예비적 관찰에서, 고밀도 MTLn3은 상기 콜라겐 골격으로 HMVEC을 유인하였지만, 상기 이동 속도는 VEGF 구배(20 ng/mL) 유도된 HMVEC 이동에서와 비교하여 크게 느려졌고, MTLn3 세포에 의해 발생된 화학 주성 인자는 VEGF 구배보다 덜 자극성임을 제안한다. 이동의 정도는 상기 조건 채널 내 MTLn3 세포의 수에 포지트브하게 상호관련되어 있었다. 저밀도 MTLn3 세포는 HMVEC의 큰 이동을 유도하지 않았다. U87MG 세포는, 상기 조건 채널 내 높은 세포 밀도 및 상기 콜라겐 골격으로의 이동하는 능력에도 불구하고 HMVEC를 유인하지 못한 것 같다. MTLn3 세포에 비해, U87MG 세포는 더욱 활성이었고 상기 골격으로 쉽게 이동되었다. Many applications on the new microfluidic platform . The main advantage of the new design is its ability to study cell migration through the 3D matrix and across the endothelial layer. It has previously been shown that cancer cell extravagation relies on interactions with endothelial cells 26 , 27 . Cancer cell stromal cells are fully recognized to signal endothelial cells for cell angiogenesis. In cancer treatment, interfering with cell angiogenesis is crucial, along with chemotherapy and other therapies 28 . To investigate this effect, the interaction of cancer cells and endothelial cells was studied by coculture of the two cell types in the microfluidic device. Rat breast adenocarcinoma cell line (MTLn3) or human neutral cancer cells (U87MG) were cultured in the condition channel and HMVECs were cultured in the cell channel. In preliminary observations, high density MTLn3 induced HMVEC into the collagen backbone, but the migration rate was significantly slower compared to that of VEGF gradient (20 ng / mL) induced HMVEC migration, and chemotactic factor generated by MTLn3 cells Suggests less stimulation than the VEGF gradient. The degree of migration was positively correlated to the number of MTLn3 cells in the condition channel. Low density MTLn3 cells did not induce large migration of HMVEC. U87MG cells do not appear to attract HMVEC despite the high cell density in the condition channel and the ability to migrate to the collagen backbone. Compared to MTLn3 cells, U87MG cells were more active and migrated easily to the backbone.

내피 세포 상의 혈관 평활근 세포(SMC)의 화학 주성 효과는 또한 상기 조건 채널 내 인간 대동맥 SMC 및 상기 세포 채널 내 HMVEC를 시딩함에 의해 증명되었다. 상기 조건 및 대조 젤 영역에서 HMVEC 이동을 모니터하는 것은 HMVEC에 대한 SMC의 안정화 능력을 증명하였다. HMVEC의 이동은 조건 측면에서 억제되었다. HMVEC에 대한 SMC 또는 SMC에 대한 HMVEC의 반응은 추가 연구를 위해 조사되고 있다. 미래에, 이 공-배양 전략은 새롭게 형성된 모세관을 안정화시킴에 있어서 내피 세포에 대한 SMC 회복(recruitment)의 역할을 조사하기 위해 사용될 수 있다29 -32.The chemotactic effect of vascular smooth muscle cells (SMC) on endothelial cells has also been demonstrated by seeding human aortic SMC in the condition channel and HMVEC in the cell channel. Monitoring HMVEC migration in these conditions and control gel regions demonstrated the stabilizing ability of SMC against HMVEC. The movement of HMVEC was inhibited in terms of conditions. The response of SMC to HMVEC or HMVEC to SMC is being investigated for further study. In the future, this co-culture strategy may be used to investigate the role of SMC recruitment for endothelial cells in stabilizing newly formed capillaries 29 -32 .

U87MG 세포의 상기 이동 속도 및 전치(displacement)를 조사하기 위해, HMVEC를 상기 조건 채널에서 배양하였고, hEGF 구배를 만들었다. 우선, U87MG 세포의 제한된 이동은 HMVEC이 상기 조건 채널에 위치되는 경우에 관찰되었고, HMVEC은 U87MG 세포를 유인하지 못하였음을 제안한다. hEGF에서 구배가 상기 조건 채널 내 20 또는 200 ng/mL hEGF를 더함에 의해 만들어지는 경우에, 상기 조건 측면의 U87MG 세포의 이동 속도는 상기 대조군 측면의 것보다 더 높았고, 둘 모두, HMVEC 공배양의 속도보다 더 높았다. 이는 hEGF은 상기 매트릭스를 가로질러 확산되었고 상기 조건 측면과 상기 대조군 측면에 세포를 도달시켰음을 증명하고, 상기 관찰된 이동 속도 차이는 화학 주성에 대한 화학운동성에 기인한 것이었음을 증명한다. 또한 세포 이동에 대한 콜라겐 골격의 기계적 특성의 효과가 관찰되었다. 더 높은 농도 골격에서(0.25% 콜라겐), 상기 대조군 및 조건 측면 상의 이동 속도에서 큰 화학 주성 차이를 보이는 더 긴 시간을 요구하는, U87MG 세포의 이동 속도는 억제되었다. 이 결과들은 세포 이동에서의 ECM의 기계적 또는 화학적 특성의 효과를 조사하기 위해 본원에 기재된 상기 미세유체 장치의 능력을 증명한다. 암 세포를 위해, ECM 강성도는 암 세포 활성에 관련됨을 이전에 증명되었다.To investigate the migration rate and displacement of U87MG cells, HMVECs were incubated in the condition channel and hEGF gradients were made. First, limited migration of U87MG cells was observed when HMVEC was located in the condition channel, suggesting that HMVEC did not attract U87MG cells. When gradients in hEGF were made by adding 20 or 200 ng / mL hEGF in the condition channel, the rate of migration of U87MG cells on the condition side was higher than that on the control side, and both of the HMVEC cocultures Higher than speed. This demonstrates that hEGF diffused across the matrix and reached cells on both the condition side and the control side, and the observed migration rate difference was due to chemotaxis to chemotaxis. In addition, the effect of mechanical properties of the collagen backbone on cell migration was observed. In higher concentration scaffolds (0.25% collagen), the rate of migration of U87MG cells, which requires longer times with large chemotaxis differences in the rate of migration on the control and condition side, was suppressed. These results demonstrate the ability of the microfluidic device described herein to investigate the effect of mechanical or chemical properties of ECM on cell migration. For cancer cells, ECM stiffness was previously demonstrated to be involved in cancer cell activity.

상이한 시점, 상이한 밀도 및 상이한 시딩 배열에서 세포를 도입함에 의해, 혈관 신생, 혈관으로의 이동(intravasation) 및 분출의 일련의 단계를 통합하는, 암 진행의 모델 시스템이 개발될 수 있음은 예측될 수 있다34. 암의 혈관으로의 이동 분석(cancer intravasation assay)을 위한 예비적 실험에서, U87MG 세포는 상기 조건 채널에서 배양되었고, HMVEC은 상기 세포 채널에서 배양되었다. HMVEC 단층로의 GFP로의 녹색 채색된, U87MG 세포의 혈관으로의 이동(Intravasation)은, 관찰되었다. 여러 U87MG 세포는 단층을 통과하고, 후속하여 상기 세포 채널 내 배지 흐름에 의해 멀리 대류되거나 HMVEC 단층 상에 부착되어 남아 있고 성장된다. 이 증명은 생체내에서 보여줬던 내피 세포 단층의 내강(luminal side) 측면으로 암 세포의 이동을 연구하고 분석함에 있어서 이 분석의 능력을 증명한다35.By introducing cells at different time points, different densities and different seeding arrangements, it can be predicted that a model system of cancer progression can be developed that incorporates a series of stages of angiogenesis, intravasation and ejection. There is 34 . In preliminary experiments for cancer intravasation assay of cancer, U87MG cells were cultured in the condition channel and HMVECs were cultured in the cell channel. Intravasation of green pigmented U87MG cells into the GFP into the HMVEC monolayer into the blood vessels was observed. Several U87MG cells pass through the monolayer and are subsequently condensed away by the medium flow in the cell channel or remain attached to the HMVEC monolayer and grow. This proof demonstrates the ability of this assay to study and analyze the migration of cancer cells to the luminal side of endothelial cell monolayers shown in vivo 35 .

이 미세유체 플랫폼은 여러 생물학적 적용을 위해 세포 이동을 연구하기 위한 다재다능하고 파워풀한 도구임을 증명한다. 이는 실시간 증명될 수 있는 잘-제어된 세포 배양 환경을 제공한다. 더구나, 세포들은 지속적으로 이의 가용성 및 불용성 환경으로부터 신호를 수용하기 때문에, 생리학적 조건을 흉내에 필수적인 생물 물리학 및 생화학 인자의 통합은 가능하다. 이 장치는 생리학적 및 병리생리학적 현상 예컨대 혈관신생, 동맥 형성, 암 혈관으로의 이동(intravasation) 및 암 분출(extravasation)을 위한 모델 시스템으로서 활용될 수 있다.This microfluidic platform proves to be a versatile and powerful tool for studying cell migration for many biological applications. This provides a well-controlled cell culture environment that can be demonstrated in real time. Moreover, because cells constantly receive signals from their soluble and insoluble environment, integration of the biophysical and biochemical factors necessary for mimicking physiological conditions is possible. The device can be utilized as a model system for physiological and pathophysiological phenomena such as angiogenesis, artery formation, intravasation into cancer vessels and cancer extravasation.

등가물Equivalent

당업자는, 루틴한 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특이적 구체예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 이를 식별할 수 있다. 본 발명의 특이적 구체예가 논의되어 있지만, 상기 특이성은 예시적인 것이고 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변화들은 본 명세서를 살펴본 당업자에 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 등가물의 전체 범위와 함께 청구 범위 및 이러한 변형과 함께 명세서를 참조하여 결정되어야 한다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함되도록 의도되어 있다.One skilled in the art can, using routine experimentation, recognize or identify many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Although specific embodiments of the invention are discussed, the specificity is exemplary and not limiting. Many variations of the invention will be apparent to those skilled in the art upon reviewing this specification. The full scope of the invention should be determined with reference to the claims, along with the full scope of equivalents, along with such modifications. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

인용된 참조문헌Cited References

아래 열거된 참조들을 포함하여, 본원에 언급된 모든 공개 및 특허는, 각 개별 공개 또는 특허가 특이적으로 그리고 개별적으로 참조로서 통합되어 있는 것과 같이, 본원에 참조로서 그대로 통합되어 있다. 충돌의 경우에, 본원에 기재된 임의의 정의를 포함하는 본 출원은 제어될 것이다(control).All publications and patents mentioned herein, including the references listed below, are hereby incorporated by reference as if each individual publication or patent was specifically and individually incorporated by reference. In case of conflict, the present application, including any definitions described herein, will be controlled.

1. Gerhardt, H., Golding, M., Fruttiger, M., Ruhrberg, C, Lundkvist, A., Abramsson, A., Jeltsch, M., Mitchell, C, Alitalo, K., Shima, D. & Betsholtz, C, J. Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).Gerhardt, H., Golding, M., Fruttiger, M., Ruhrberg, C, Lundkvist, A., Abramsson, A., Jeltsch, M., Mitchell, C, Alitalo, K., Shima, D. & Betsholtz, C, J. Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).

2. Helm, C-L.E., Fleury, M.E., Zisch, A.H., Boschetti, F. & Swartz, M.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).2. Helm, C-L.E., Fleury, M.E., Zisch, A.H., Boschetti, F. & Swartz, M.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).

3. Rutkowski, J.M.& Swartz, M.A., Trends Cell Biol., 17, 44-50 (2007).Rutkowski, J. M. & Swartz, M. A., Trends Cell Biol., 17, 44-50 (2007).

4. Sieminski, A.L., Hebbel, R.P. & Gooch, K.J., Exp. Cell Res., 297, 574-584 (2004). 4. Sieminski, A.L., Hebbel, R.P. & Gooch, K.J., Exp. Cell Res., 297, 574-584 (2004).

5. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M. & Tanishita, K., Tissue Eng., 13, 1443-1453 (2007).5.Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M. & Tanishita, K., Tissue Eng., 13, 1443-1453 (2007).

6. Jain, R.K., Schlenger, K., Hockel, M. & Yuan, F., Nat. Med, 3, 1203-1208 (1997).6. Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M. & Yuan, F., Nat. Med, 3, 1203-1208 (1997).

7. Nakayasu, K., Hayashi, N., Okisaka, S. & Sato, N., Invest. Ophth. Vis. Sci., 33, 3050-3057 (1992).Nakayasu, K., Hayashi, N., Okisaka, S. & Sato, N., Invest. Ophth. Vis. Sci., 33, 3050-3057 (1992).

8. Shiu, Y.T., Weiss, J.A., Hoying, J.B., Iwamoto, M.N., Joung, LS. & Quam, C.T., Crit. Rev. Biomed. Eng. 33, 431-510 (2005). Shiu, Y.T., Weiss, J.A., Hoying, J.B., Iwamoto, M.N., Joung, LS. & Quam, C. T., Crit. Rev. Biomed. Eng. 33, 431-510 (2005).

9. Davis, G.E., Black, S.M. & Bayless, K.J., In Vitro Cell. Dev. Biol.-An., 36, 513-519 (2000).9. Davis, G.E., Black, S.M. & Bayless, K. J., In Vitro Cell. Dev. Biol.-An., 36, 513-519 (2000).

10. DiMiIIa, P.A., Quinn, J.A., Albeida, S.M. & Lauffenburger, D.A., AIChe J., 38, 1092-1104, (1992).10. DiMiIIa, P.A., Quinn, J.A., Albeida, S.M. & Lauffenburger, D. A., AIChe J., 38, 1092-1104, (1992).

11. Shizukuda, Y., Tang, S., Yokota, R. & Anthony Ware, J., Circ. Res., 84, 247-256 (1999). Shizukuda, Y., Tang, S., Yokota, R. & Anthony Ware, J., Circ. Res., 84, 247-256 (1999).

12. Rojas, J.D., Sennoune, S. R., Malti, D., Bakunts, K., Reuveni, M., Sanka, S. C, Martinez, G.M., Seftor, E.A., Meininger, C.J., Wu, G., Wesson, D.E., Hendrix, M.J.C. & Martinez- Zaguilan, R., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 291, Hl 147-H1157 (2006). 12.Rojas, JD, Sennoune, SR, Malti, D., Bakunts, K., Reuveni, M., Sanka, S. C, Martinez, GM, Seftor, EA, Meininger, CJ, Wu, G., Wesson, DE, Hendrix, MJC & Martinez- Zaguilan, R., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 291, Hl 147-H1157 (2006).

13. Sagnella, S. M., Kligman, F., Anderson, E.H., King, J.E., Murugesan, G., Marchant, R.E. & Kottke-Marchant, K., Bio물질s, 25, 1249-1259 (2004). 13. Sagnella, S. M., Kligman, F., Anderson, E. H., King, J. E., Murugesan, G., Marchant, R. E. & Kottke-Marchant, K., Biomaterials, 25, 1249-1259 (2004).

14. Hendrix, M.J.C, Seftor, E.A., Seftor, R.E.B. & Fidler, I.J., Cancer Lett., 38, 137-147 (1987).14.Hendrix, M.J.C, Seftor, E.A., Seftor, R.E.B. & Fidler, I. J., Cancer Lett., 38, 137-147 (1987).

15. Mace, K.A., Hansen, S.L., Myers, C, Young, D.M. & Boudreau, N., J. CeIl ScL, 118, 2567-2577 (2005).15. Mace, K.A., Hansen, S.L., Myers, C, Young, D.M. & Boudreau, N., J. CeIl ScL, 118, 2567-2577 (2005).

16. Bayless, K. J., Salazar, R. & Davis, G.E., Am. J. 경로ol, 156, 1673-1683 (2000). 16. Bayless, K. J., Salazar, R. & Davis, G.E., Am. J. Pathol, 156, 1673-1683 (2000).

17. Wenger, A., Stahl, A., Weber, H., Finkenzeller, G., Augustin, H.G., Stark, G.B. & Kneser, U., Tissue Eng., 10, 1536-1547 (2004). 17. Wenger, A., Stahl, A., Weber, H., Finkenzeller, G., Augustin, H.G., Stark, G.B. & Kneser, U., Tissue Eng., 10, 1536-1547 (2004).

18. Ghajar, CM., Blevins, K.S., Hughes, C.C.W., George, S.C & Putnam, A.J., Tissue Eng.,12. 2875-2888 (2006).18. Ghajar, CM., Blevins, K.S., Hughes, C.C.W., George, S.C & Putnam, A.J., Tissue Eng., 12. 2875-2888 (2006).

19. Chicurel, M., Science, 295, 606-609 (2002). 19. Chicurel, M., Science, 295, 606-609 (2002).

20. Selmeczi, D., Mosier, S., Hagedom, P.H., Larsen, N.B. & Flyvbjerg, H., Biophys. J., 89, 912-931 (2005).20. Selmeczi, D., Mosier, S., Hagedom, P.H., Larsen, N.B. & Flyvbjerg, H., Biophys. J., 89, 912-931 (2005).

21. Jeon, NX., Baskaran, H., Dertinger, S.K.W., Whitesides, G.M., Van De Water, L. & Toner, M., Nat. Biotechnol, 20, 826-830 (2002).21. Jeon, NX., Baskaran, H., Dertinger, S.K.W., Whitesides, G.M., Van De Water, L. & Toner, M., Nat. Biotechnol, 20, 826-830 (2002).

22. Lamalice, L., Le Boeuf, F. & Huot, J., Circ. Res., 100, 782-794 (2007). 22. Lamalice, L., Le Boeuf, F. & Huot, J., Circ. Res., 100, 782-794 (2007).

23. Yancopoulos, G.D., Davis, S., Gale, N.W., Rudge, J.S., Wiegand, S.J., J.Holash, Nature, 407, 242-248, 2000.23. Yancopoulos, G.D., Davis, S., Gale, N.W., Rudge, J.S., Wiegand, S.J., J.Holash, Nature, 407, 242-248, 2000.

24. Coultas, L., Chawengsaksophak, K. & Rossant, J., Nature, 438, 937-945 (2005).24. Coultas, L., Chawengsaksophak, K. & Rossant, J., Nature, 438, 937-945 (2005).

25. Walker, G.M. & Beebe, D.J., Lab Chip, 2, 131-134 (2002).25. Walker, G.M. & Beebe, D. J., Lab Chip, 2, 131-134 (2002).

26. Carmeliet, P. & Jain, R.K., Nature, 407, 249-257 (2000). 26. Carmeliet, P. & Jain, R. K., Nature, 407, 249-257 (2000).

27. Carmeliet, P., Nature, 438, 932-936 (2005). 27. Carmeliet, P., Nature, 438, 932-936 (2005).

28. Ferrara, N., Kerbel, R.S., Nature, 438, 967-974 (2005).28. Ferrara, N., Kerbel, R. S., Nature, 438, 967-974 (2005).

29. Montesano, R., Orci, L. & Vassalli, P., J. Cell Biol, 97, 1648-1652 (1983).29. Montesano, R., Orci, L. & Vassalli, P., J. Cell Biol, 97, 1648-1652 (1983).

30. Zhao, Y., Tan, Y.Z., Zhou, L.F., Wang, H.J., Mao, Y., Stroke, 38, 1313-1319 (2007).30. Zhao, Y., Tan, Y. Z., Zhou, L. F., Wang, H. J., Mao, Y., Stroke, 38, 1313-1319 (2007).

31. Carmeliet, P., Nat. Med., 6, 389-395 (2000). 31. Carmeliet, P., Nat. Med., 6, 389-395 (2000).

32. Gerthoffer, G.T., Circ. Res., 100, 607-621 (2007).32. Gerthoffer, G.T., Circ. Res., 100, 607-621 (2007).

33. Huang, S., Ingber, D.E., Cancer Cell. 8, 175-176 (2005).33. Huang, S., Ingber, D. E., Cancer Cell. 8, 175-176 (2005).

34. Suresh, S., Acta Biomater., 3, 413-38 (2007).34. Suresh, S., Acta Biomater., 3, 413-38 (2007).

35. Yamaguchi, H., Wyckoff, J. & Condeelis, J., Curr. Opin. Cell Biol, 17, 559-564 (2005). 35. Yamaguchi, H., Wyckoff, J. & Condeelis, J., Curr. Opin. Cell Biol, 17, 559-564 (2005).

36. Cavallaro, U., Liebner, S. & Dejana, E., Exp. Cell Res., 312, 659-667 (2006). 36. Cavallaro, U., Liebner, S. & Dejana, E., Exp. Cell Res., 312, 659-667 (2006).

37. Vickerman, V., Blundo, J., Chung, S., Kamm, R. D. Lab Chip, 8(9), 1468-1477 (2008).37. Vickerman, V., Blundo, J., Chung, S., Kamm, R. D. Lab Chip, 8 (9), 1468-1477 (2008).

38. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C-R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Lab Chip, 9, 269-275 (2009).38. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C-R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Lab Chip, 9, 269-275 (2009).

39. Sudo, R., Chung, S, Zervantonakis, I. K., Vickerman, V., Toshimitsu, Y., Griffith, L. G., Kamm, R. D. The FASEB Journal, fj.08-122820, published online February 26, 2009. 39. Sudo, R., Chung, S, Zervantonakis, I. K., Vickerman, V., Toshimitsu, Y., Griffith, L. G., Kamm, R. D. The FASEB Journal, fj.08-122820, published online February 26, 2009.

Claims (56)

광학적으로 투명한 물질;
상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및
3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격(scaffold)
를 포함하는, 미세유체 장치(microfluidic device)로서,
여기서, 상기 기판이 포스트(post)를 포함하고;
상기 골격이 상기 기판, 상기 포스트 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하며;
상기 기판이 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하고;
상기 제 1 유체-흐름 경로가 상기 제 2 유체-흐름 경로와 교차하지 않으며;
상기 골격이 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치되어 있는, 장치.Optically transparent materials;
A substrate coupled to the optically transparent material; And
Scaffolds with dimensions greater than 1 μm in three-dimensional space
As a microfluidic device comprising:
Wherein the substrate comprises a post;
The framework is in contact with the substrate, the post and the optically transparent material;
The substrate comprises a first fluid-flow path and a second fluid-flow path;
The first fluid-flow path does not intersect the second fluid-flow path;
And the framework is disposed between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로가 상기 기판내의 채널임을 특징으로 하는, 장치.The apparatus of claim 1, wherein the first fluid-flow path and the second fluid-flow path are channels in the substrate. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 기판이 플라스틱을 포함함을 특징으로 하는, 장치.The apparatus of claim 1 or 2, wherein the substrate comprises plastic. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 기판이 PDMS를 포함함을 특징으로 하는, 장치.The apparatus of claim 1 or 2, wherein the substrate comprises PDMS. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판이 변화됨을 특징으로 하는, 장치.5. The apparatus of claim 1, wherein the substrate is varied. 6. 제 5항에 있어서, 상기 변화된 기판이, 기판을 폴리-D-리신 또는 플라즈마에 노출시킨 결과임을 특징으로 하는, 장치.6. The apparatus of claim 5, wherein the changed substrate is the result of exposing the substrate to poly-D-lysine or plasma. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 고체 또는 반고체 생물학적 또는 생체적합성 폴리머를 포함함을 특징으로 하는, 장치.The device according to claim 1, wherein the backbone comprises a solid or semisolid biological or biocompatible polymer. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함함을 특징으로 하는, 장치.The device of claim 1, wherein the backbone comprises collagen, agarose, gelatin, fibronectin, fibrin, laminin, or peptides. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 광경화성 폴리머를 포함함을 특징으로 하는, 장치.The device of claim 1, wherein the backbone comprises a photocurable polymer. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 제 1 생물학적 엔티티(biological entity)를 포함함을 특징으로 하는, 장치.10. The device of claim 1, wherein the skeleton comprises a first biological entity. 11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 상기 기판에 실질적으로 부착되어 있음을 특징으로 하는, 장치.The apparatus according to any one of claims 1 to 10, wherein the framework is substantially attached to the substrate. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 조절장치를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.12. The device of any one of the preceding claims, further comprising a pressure regulator. 제 12항에 있어서, 상기 압력 조절장치는, 유체가 상기 유체-흐름 경로들내로 도입되는 경우에, 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체 흐름 경로 사이에 압력 차이를 만드는 밸브임을 특징으로 하는, 장치.13. The pressure regulator of claim 12, wherein the pressure regulator is a valve that creates a pressure difference between the first fluid flow path and the second fluid flow path when fluid is introduced into the fluid-flow paths. , Device. 제 12항에 있어서, 상기 압력 조절장치는, 유체가 상기 유체 흐름 경로내로 도입되는 경우에, 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 흐름 속도의 차이를 만드는 밸브임을 특징으로 하는, 장치.13. The pressure regulator of claim 12, wherein the pressure regulator is a valve that makes a difference in flow velocity between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path when fluid is introduced into the fluid flow path. Device. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로 또는 상기 제 2 유체-흐름 경로가 저항 채널을 포함함을 특징으로 하는, 장치.The apparatus of claim 1, wherein the first fluid-flow path or the second fluid-flow path comprises a resistance channel. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로가 상기 제 2 유체 흐름 경로와 상이한 치수를 가짐을 특징으로 하는, 장치.The apparatus of claim 1, wherein the first fluid-flow path has a different dimension than the second fluid flow path. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 입구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.The apparatus of claim 1, further comprising a first fluid inlet operably connected to the first fluid-flow path. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 출구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.18. The device of any one of the preceding claims, further comprising a first fluid outlet operably connected to the first fluid-flow path. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 입구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.19. The device of any one of the preceding claims, further comprising a second fluid inlet operably connected to the second fluid-flow path. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 출구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.20. The device of any one of the preceding claims, further comprising a second fluid outlet operably connected to the second fluid-flow path. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 저장소를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.21. The device of claim 1, further comprising a first reservoir operably connected to the first fluid-flow path. 21. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 저장소를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.22. The apparatus of any one of the preceding claims, further comprising a second reservoir operably connected to the second fluid-flow path. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이, 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머를 포함하며; 상기 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머는 제 2의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있음을 특징으로 하는, 장치.The method of claim 1, wherein the backbone comprises a solid or semisolid biocompatible polymer; Wherein said solid or semisolid biocompatible polymer is capable of passing a second biological entity. 제 23항에 있어서, 상기 골격이 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티가 진핵 세포를 포함함을 특징으로 하는, 장치.24. The method of claim 23, wherein the backbone comprises collagen, agarose, gelatin, fibronectin, fibrin, laminin, or peptides; Wherein said second biological entity comprises a eukaryotic cell. 제 23항에 있어서, 상기 골격이 콜라겐을 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티가 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 장치.The method of claim 23, wherein the backbone comprises collagen; Wherein said second biological entity is selected from the group consisting of growth factors, cytokines, hormones, antibodies, and enzymes. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광학적으로 투명한 물질이 유리를 포함함을 특징으로 하는, 장치.26. The device of any of claims 1 to 25, wherein the optically clear material comprises glass. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 유체-흐름 경로, 제 3 유체 입구, 및 제 3 유체 출구를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 3 유체 입구 및 상기 제 3 유체 출구 각각이 상기 제 3 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결되어 있음을 특징으로 하는, 장치.27. The system of any one of the preceding claims, further comprising a third fluid-flow path, a third fluid inlet, and a third fluid outlet, wherein each of the third fluid inlet and the third fluid outlet And operably connected to said third fluid-flow path. 제 27항에 있어서, 상기 골격이 상기 제 3 유체-흐름 경로의 실질적으로 전부를 차지함을 특징으로 하는, 장치.28. The device of claim 27, wherein the framework occupies substantially all of the third fluid-flow path. 광학적으로 투명한 물질;
상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및
3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
를 포함하는, 미세유체 장치로서,
여기서, 상기 골격이 상기 기판 또는 상기 광학적으로 투명한 물질 또는 둘 모두와 접촉하고,
상기 기판이 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 제 3 유체-흐름 경로를 포함하며;
상기 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 1의 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머 및 상기 제 2 유체-흐름 경로와 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 2의 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머를 포함하고,
상기 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머가 하나 또는 그 초과의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있는, 장치.Optically transparent materials;
A substrate coupled to the optically transparent material; And
Skeleton with dimensions greater than 1 μm in three-dimensional space
As a microfluidic device comprising:
Wherein the framework is in contact with the substrate or the optically transparent material or both,
The substrate comprises a first fluid-flow path, a second fluid-flow path, and a third fluid-flow path;
A first solid or semisolid biocompatible polymer disposed between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path and a second agent disposed between the second fluid-flow path and the third fluid-flow path 2, solid or semi-solid biocompatible polymers,
Wherein the solid or semi-solid biocompatible polymer can pass through one or more biological entities. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 장치를 여러 개로 포함하는, 고처리량 분석용 시스템.30. A system for high throughput analysis comprising a plurality of devices of any one of claims 1 to 29. 세포의 유도된 이동(directed migration)을 측정하는 방법으로서,
a) (i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
(ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포를 도입하는 단계;
c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입하는 단계; 및
d) 상기 골격내로 상기 세포의 유도된 이동을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.As a measure of directed migration of cells,
a) (i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And
(ii) a skeleton having a dimension of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material
Providing an apparatus comprising a;
b) introducing a cell into said first fluid-flow pathway;
c) introducing a biological entity into said second fluid-flow path; And
d) measuring the induced migration of said cells into said backbone. 제 31항에 있어서, 상기 생물학적 엔티티가 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein the biological entity is selected from the group consisting of prokaryotic cells, eukaryotic cells, growth factors, cytokines, hormones, antibodies, drugs, and enzymes. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 호중구이고, 상기 생물학적 엔티티가 내피 세포임을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein said cells are neutrophils and said biological entity is an endothelial cell. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein the cells are obtained from a human subject with diabetes and the biological entity is obtained from a human subject without diabetes. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein the cells are obtained from a human subject without diabetes and the biological entity is obtained from a human subject with diabetes. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein the cells are obtained from a human subject with cancer and the biological entity is obtained from a human subject without cancer. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein the cells are obtained from a human subject that does not have cancer and the biological entity is obtained from a human subject having cancer. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 내피 세포이고, 상기 생물학적 엔티티가 제 2 세포이며, 상기 제 2 세포가 종양 세포임을 특징으로 하는, 방법.32. The method of claim 31, wherein the cell is an endothelial cell, the biological entity is a second cell, and the second cell is a tumor cell. 제 38항에 있어서, 상기 세포와 상기 제 2 세포가 동일한 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 38, wherein the cell and the second cell are obtained from the same subject. a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간의 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격로서, 상기 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된, 골격
를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 내피 세포 또는 내피 세포 전구체를 도입하는 단계;
c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입시키는 단계; 및
d) 상기 골격내에서의 혈관의 형성을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 형성을 측정하는 방법.i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And
ii) a skeleton having a dimension of at least 1 μm of three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material, wherein the skeleton is disposed between the first fluid-flow path and the second fluid-flow path, skeleton
Providing an apparatus comprising a;
b) introducing an endothelial cell or endothelial cell precursor into said first fluid-flow pathway;
c) introducing a biological entity into said second fluid-flow path; And
d) measuring the formation of blood vessels in the skeleton. 제 40항에 있어서, 상기 생물학적 엔티티가 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 40, wherein the biological entity is selected from the group consisting of prokaryotic cells, eukaryotic cells, growth factors, cytokines, hormones, antibodies, drugs, and enzymes. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 장치가 제 3 유체-흐름 경로; 및 상기 기판과 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 제 2 골격을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제 2 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된, 방법.42. The device of claim 40 or 41, wherein the device further comprises: a third fluid-flow path; And a second skeleton having dimensions of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material, wherein the second skeleton is such that the first fluid-flow path and the third fluid are present. -Disposed between the flow paths. a) 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 포스트를 포함하는 기판과 액체 골격 물질을 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 기판에 광학적으로 투명한 물질을 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 장치를 제조하는 방법.a) contacting the liquid skeletal material with a substrate comprising a first fluid-flow path, a second fluid-flow path, and a post; And
b) operatively connecting an optically transparent material to said substrate. 제 43항에 있어서, 상기 액체 골격 물질이 단량체 콜라겐(monomeric collagen)을 포함함을 특징으로 하는, 방법.44. The method of claim 43, wherein the liquid backbone material comprises monomeric collagen. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 상기 기판을 변화시킴으로써 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 변경시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.45. The method of claim 43 or 44, further comprising altering the hydrophobicity, hydrophilicity, cell affinity, or skeletal adhesion properties of the substrate by altering the substrate prior to contacting the substrate with the liquid backbone material. Characterized by the above. 제 45항에 있어서, 상기 기판을 변화시키는 단계가, 상기 기판을 폴리-D-리신에 노출시키거나 상기 기판을 플라즈마에 노출시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법.46. The method of claim 45, wherein changing the substrate comprises exposing the substrate to poly-D-lysine or exposing the substrate to plasma. 제 43항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉시키는 단계가 상기 제 1 및 제 2 유체-흐름 경로와 실질적으로 불연속적(non-contiguous)인 기판의 한정된 영역내로 압력하에서 상기 액체 골격 물질을 주입시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법.47. The method of any one of claims 43 to 46, wherein contacting the liquid framework material with the substrate is substantially non-contiguous with the first and second fluid-flow paths. Injecting said liquid skeletal material under pressure into a zone. i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로로 제 1 물질을 도입시키는 단계; 및
c) 상기 골격으로 상기 제 1 물질의 침투율을 측정하는 단계를 포함하는 침투율을 측정하는 방법.i) an optically transparent material coupled to the substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And
ii) a skeleton having a dimension of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material
Providing an apparatus comprising a;
b) introducing a first material into said first fluid-flow path; And
c) measuring the penetration rate of the first material with the framework. 제 48항에 있어서, 상기 제 1 물질이 유체 또는 작은 분자임을 특징으로 하는, 방법.49. The method of claim 48, wherein the first substance is a fluid or small molecule. 제 48항 또는 제 49항에 있어서, 상기 골격이 세포 단층(monolayer)을 포함함을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 48 or 49, wherein the backbone comprises a cell monolayer. 제 48항에 있어서, 상기 제 1 물질이 세포를 포함함을 특징으로 하는, 방법.49. The method of claim 48, wherein said first substance comprises cells. 제 51항에 있어서, 상기 세포가 내피 세포임을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 51, wherein the cell is an endothelial cell. 제 48항, 제 51항 또는 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 제 2 세포를 포함함을 특징으로 하는, 방법.53. The method of any one of claims 48, 51 or 52, wherein the scaffold comprises a second cell. 제 53항에 있어서, 상기 제 2 세포가 종양 세포임을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 53, wherein the second cell is a tumor cell. 제 48항에 있어서, 상기 제 1 물질이 세포이고; 상기 세포가 내피 세포이며, 상기 골격이 제 2 세포를 포함하고; 상기 제 2 세포가 종양 세포이고; 상기 내피 세포 및 상기 종양 세포가 동일한 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.49. The method of claim 48, wherein said first substance is a cell; The cell is an endothelial cell and the backbone comprises a second cell; The second cell is a tumor cell; Wherein said endothelial cells and said tumor cells are obtained from the same subject. a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포 추적제(cell tracking agent)를 도입시키는 단계; 및
c) 상기 골격내로의 상기 세포 추적제의 확산을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 추적제를 평가하는 방법.i) an optically transparent material coupled to a substrate comprising a first fluid-flow path and a second fluid-flow path; And
ii) a skeleton having a dimension of at least 1 μm in three-dimensional space in contact with the substrate and the optically transparent material
Providing an apparatus comprising a;
b) introducing a cell tracking agent into said first fluid-flow pathway; And
c) measuring the diffusion of said cell tracer into said backbone.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013012127A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 Micro-device for culturing cells, method for manufacturing same, and method for culturing cells using the micro-device for culturing cells
WO2013062383A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 고려대학교 산학협력단 Cell culture assay
KR20180060967A (en) * 2016-11-29 2018-06-07 고려대학교 산학협력단 The microfluidic device
US20180165954A1 (en) * 2016-07-26 2018-06-14 Faraday&Future Inc. Dynamic traffic lane assignment
US10068324B2 (en) 2015-12-07 2018-09-04 Samsung Electronics Co., Ltd. 3D profiling system of semiconductor chip and method for operating the same
WO2018174464A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 재단법인대구경북과학기술원 Method for selectively bonding polymer substrate

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110244567A1 (en) * 2006-08-31 2011-10-06 Snu R&Db Foundation Device and Method of 3-Dimensionally Generating IN VITRO Blood Vessels
CA2727003C (en) * 2008-06-04 2018-09-18 Uwe Marx Organ-on-a-chip-device
US20110004304A1 (en) * 2009-03-20 2011-01-06 Tao Sarah L Culturing retinal cells and tissues
US20110186165A1 (en) * 2009-10-05 2011-08-04 Borenstein Jeffrey T Three-dimensional microfluidic platforms and methods of use and manufacture thereof
US8828332B2 (en) 2010-09-10 2014-09-09 Gradientech Ab Microfluidic capsule
US20130210049A1 (en) * 2010-09-16 2013-08-15 Melinda Larsen Polymeric Support With Nanofeatures for Cell Culture
CN103477222B (en) * 2010-09-29 2016-08-10 麻省理工学院 Device for high flux research cell interaction
EP2935567B1 (en) * 2012-12-18 2019-01-30 CNC - Centro de Neurociências E Biologia Molecular - Universidade de Coimbra Differentiated cell population of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells, composition, system, kit and uses thereof
US10487349B2 (en) 2013-07-10 2019-11-26 Gradientech Ab Use of a fluidic device
KR101554777B1 (en) 2013-07-29 2015-09-22 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 Cell culture device
JP2015116149A (en) * 2013-12-18 2015-06-25 国立大学法人 東京大学 Three-dimentional gel chip for observing interaction between microvasculature and tissue
US11060067B2 (en) 2014-09-30 2021-07-13 D. Lansing Taylor Human liver microphysiology platform and self assembly liver acinus model and methods of their use
US10017724B2 (en) * 2014-10-01 2018-07-10 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Engineering of a novel breast tumor microenvironment on a microfluidic chip
US10712339B2 (en) * 2014-10-01 2020-07-14 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Engineering of a novel breast tumor microenvironment on a microfluidic chip
US10533207B2 (en) * 2014-10-16 2020-01-14 Quantamatrix Inc. Bioactivity testing structure for single cell tracking using gelling agents
SG11201809990TA (en) 2014-11-11 2018-12-28 Aim Biotech Pte Ltd Microfluidic platform for investigating cell-based interactions
US20170370908A1 (en) * 2014-12-17 2017-12-28 President And Fellows Of Harvard College Brain in vitro models, devices, systems, and methods of use thereof
EP3242930A4 (en) 2015-01-07 2019-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Microfluidic cell culture of patient-derived tumor cell spheroids
CN104549587B (en) * 2015-01-20 2016-02-03 重庆科技学院 A kind of triple channel microballoon screening chip and using method
WO2016132182A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-25 Cells For Cells Devices for studying chemotaxis/adherence in cells wherein gradients and channels are formed using hydrogels
US10705012B2 (en) 2015-04-23 2020-07-07 Singapore University Of Technology And Design Device and method for analysing and controlling cell motility
US11130133B2 (en) * 2015-08-12 2021-09-28 Meon Medical Solutions Gmbh & Co. Kg Device and method for determining the migration ability of amoeboidally mobile cells
WO2017218581A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic device for three dimensional and compartmentalized coculture of neuronal and muscle cells, with functional force readout
EP3580333B1 (en) * 2017-02-07 2021-04-21 Corning Incorporated A high throughput 3d assay for immune cell and drug homing, migration and tumor cytotoxicity
US11884905B2 (en) * 2017-02-09 2024-01-30 University Public Corporation Osaka Fluidic chip for cell culture use, culture vessel, and culture method
EP3554990A4 (en) * 2017-02-15 2019-12-25 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic valve
AU2018243568A1 (en) 2017-03-31 2019-09-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for evaluating tumor cell spheroids using 3D microfluidic cell culture device
WO2018234163A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-27 İni̇ti̇o Biyomedikal Mühendislik Danişmanlik Sanayi Ve Ticaret Limited Şirketi Method for determining cell migration and invasion
CN107219360B (en) * 2017-07-03 2018-04-03 南京岚煜生物科技有限公司 Single channel chemiluminescence micro-fluidic chip and its detection method
CN107703111B (en) * 2017-09-22 2020-06-16 兰州大学 Gradient compactness fluorescent hydrogel and preparation method and application thereof
US11124763B2 (en) * 2017-10-27 2021-09-21 Georgia Tech Research Corporation Systems and methods for growing cell cultures
CA3133741A1 (en) * 2018-03-26 2019-10-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Systems and methods for multilane vasculature
CN110343655A (en) * 2018-04-02 2019-10-18 中国科学院大连化学物理研究所 A kind of chip of integrating cell capture, three-dimensional substrates culture and bioanalysis
WO2020231833A1 (en) * 2019-05-10 2020-11-19 Children's Hospital Los Angeles A glomerulus on a chip to recapitulate glomerular filtration barrier
WO2020242594A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 Xiling Shen Methods and apparatuses for patient-derived micro-organospheres
WO2020251884A1 (en) * 2019-06-10 2020-12-17 University Of Massachusetts Microgradient-based microfluidic devices and high-throughput analytical methods
WO2020252225A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 University Of Connecticut Multigel tumor-on-a-chip system
WO2021121447A1 (en) * 2019-12-17 2021-06-24 Fakultni Nemocnice U Sv. Anny V Brne System and method for axonal injury assays
KR102371825B1 (en) * 2020-02-12 2022-03-11 고려대학교 산학협력단 Selective isolation of cells from microfluidic chips
CN111467579B (en) * 2020-04-03 2021-10-26 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） Alloy-core-based stem cell stent for treating aneurysm and vascular stenosis and preparation method thereof
US20220373462A1 (en) * 2021-05-14 2022-11-24 MBD Co., Ltd. Measuring method of cell migration using the rate of cell invasion
IT202100025460A1 (en) 2021-10-07 2023-04-07 Univ Degli Studi Di Roma “Tor Vergata” LAB-ON-CHIP DEVICE TO STUDY CELLULAR MIGRATION IN THREE-DIMENSIONAL SYSTEMS AND RELATED METHOD OF USE
CN114350518B (en) * 2022-01-19 2023-01-13 广东乾晖生物科技有限公司 Bionic liver microfluidic cell culture-drug screening chip

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6632619B1 (en) * 1997-05-16 2003-10-14 The Governors Of The University Of Alberta Microfluidic system and methods of use
IL138374A (en) * 1998-03-11 2004-07-25 Nikon Corp Ultraviolet laser apparatus and exposure apparatus comprising the ultraviolet laser apparatus
ATE227338T1 (en) * 1998-03-18 2002-11-15 Massachusetts Inst Technology VASCULARIZED PERFUSED ARRANGEMENTS FOR MICRO TISSUES AND MICRO ORGANS
US6663602B2 (en) * 2000-06-16 2003-12-16 Novo Nordisk A/S Injection device
US7374906B2 (en) * 2000-11-08 2008-05-20 Surface Logix, Inc. Biological assays using gradients formed in microfluidic systems
CA2445458C (en) * 2001-04-25 2016-12-13 Cornell Research Foundation, Inc. Devices and methods for pharmacokinetic-based cell culture system
WO2003004254A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 The Regents Of The University Of California Microfabricated biopolymer scaffolds and method of making same
US20030049839A1 (en) * 2001-08-01 2003-03-13 The University Of Texas System Transparent multi-channel cell scaffold that creates a cellular and/or molecular gradient
WO2003061585A2 (en) * 2002-01-22 2003-07-31 The Penn State Research Foundation Drug candidate screening systems based on micropatterned hydrogels and microfluidic systems
JP2005523710A (en) * 2002-04-24 2005-08-11 サーフェイス ロジックス，インコーポレイティド Leukocyte migration monitoring device and method
WO2004006840A2 (en) * 2002-07-12 2004-01-22 The Regents Of The University Of California Three dimensional cell patterned bioploymer scaffolds and method of making the same
US7790443B2 (en) * 2002-08-27 2010-09-07 Vanderbilt University Bioreactors with substance injection capacity
AU2003275140A1 (en) * 2002-09-23 2004-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Theree-dimensional construct for the design and fabrication of physiological fluidic networks
ES2588905T3 (en) * 2002-10-04 2016-11-07 The Regents Of The University Of California Multi-compartment microfluidic device for neuroscience research
JP2006507815A (en) * 2002-10-22 2006-03-09 サーフェイス ロジックス，インコーポレイティド Biological assays using gradients formed in microfluidic systems
US20040084811A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-06 Beebe David J. Method of fabricating a three-dimensional microfluidic device
WO2004059299A1 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Cytodiscovery, Inc. Microfluidic system with integrated permeable membrane
CA2519230A1 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Arena Pharmaceuticals, Inc. Modulators of the g protein-coupled formyl peptide receptor-like 2 and their therapeutic use against cell death-related disorders
WO2004101743A2 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Bellbrook Labs, Llc Three dimensional cell cultures in a microscale fluid handling system
US20050079985A1 (en) * 2003-10-14 2005-04-14 Yocheved Shasho Method of preventing odors
WO2005079985A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Ibidi Gmbh Device for microfluidic analyses
US20070178582A1 (en) * 2004-02-17 2007-08-02 Hur Koser Microfabricated cellular traps based on three-dimensional micro-scale flow geometries
EP1576957A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-21 Universiteit Twente Tissue repair using pluripotent cells
PT1773978E (en) * 2004-05-19 2014-05-29 Massachusetts Inst Technology Perfused three-dimensional cell/tissue disease models
US20080233607A1 (en) * 2004-11-11 2008-09-25 Hanry Yu Cell Culture Device
US8168133B2 (en) * 2005-05-09 2012-05-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Device for performing a high throughput assay
EP3029135B1 (en) 2005-07-07 2021-03-17 The Regents of the University of California Apparatus for cell culture array
US7855070B2 (en) * 2005-07-08 2010-12-21 Georgia Tech Research Corporation Centimeter-scale, integrated diagnostics incubator for biological culturing
KR100733914B1 (en) 2005-09-22 2007-07-02 한국과학기술원 Microfluidic 3-dimensional cell culture system
US8603806B2 (en) * 2005-11-02 2013-12-10 The Ohio State Universtiy Research Foundation Materials and methods for cell-based assays
WO2007139511A1 (en) 2006-05-31 2007-12-06 Agency For Science, Technology And Research Transparent microfluidic device
EP2069068A2 (en) * 2006-09-28 2009-06-17 The University of Washington 3d micro-scale engineered tissue model systems
US20110186165A1 (en) * 2009-10-05 2011-08-04 Borenstein Jeffrey T Three-dimensional microfluidic platforms and methods of use and manufacture thereof

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013012127A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 Micro-device for culturing cells, method for manufacturing same, and method for culturing cells using the micro-device for culturing cells
WO2013062383A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 고려대학교 산학협력단 Cell culture assay
US10068324B2 (en) 2015-12-07 2018-09-04 Samsung Electronics Co., Ltd. 3D profiling system of semiconductor chip and method for operating the same
US20180165954A1 (en) * 2016-07-26 2018-06-14 Faraday&Future Inc. Dynamic traffic lane assignment
KR20180060967A (en) * 2016-11-29 2018-06-07 고려대학교 산학협력단 The microfluidic device
WO2018174464A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 재단법인대구경북과학기술원 Method for selectively bonding polymer substrate

Also Published As

Publication number Publication date
US20110159522A1 (en) 2011-06-30
US9121847B2 (en) 2015-09-01
CN103635587A (en) 2014-03-12
CA2720261A1 (en) 2009-10-15
JP2011516079A (en) 2011-05-26
EP2274438A2 (en) 2011-01-19
EP2274438A4 (en) 2013-09-11
WO2009126524A2 (en) 2009-10-15
JP5602718B2 (en) 2014-10-08
WO2009126524A3 (en) 2010-03-25
CA2720261C (en) 2020-09-22

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