KR20110003226A - Hapten, antibody for detecting epn and enzyme-linked immunosorbent assays using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 EPN 검출을 위한 헵텐, 항체 및 이를 이용한 효소 결합 면역 흡착 분석법에 관한 것으로, 구체적으로는 농약의 일종인 EPN을 검출할 수 있는 헵텐, 상기 헵텐에 단백질을 접합시킨 면역원으로부터 얻어지는 항체 및 이를 이용한 EPN에 대한 선택성 및 감도가 높고 적은 비용으로 신속하게 분석할 수 있어 농약분석의 효율을 향상시킬 수 있는 직, 간접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법에 관한 것이다. The present invention relates to heptene, an antibody for detecting EPN, and an enzyme-linked immunosorbent assay using the same, and specifically, heptene capable of detecting EPN, which is a kind of pesticide, an antibody obtained from an immunogen conjugated with a protein to the heptene, and The present invention relates to a direct and indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay that can improve the efficiency of pesticide analysis because of high selectivity and sensitivity for the used EPN and rapid analysis at low cost.
현재 주요 농약 분석법으로 기체크로마토그래피(gas chromatography, GC)와 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)가 있다. 유기인계 농약은 주로 GC를 사용하여 분석하는데, GC와 HPLC는 감도가 매우 높고 정확하며 다수성분을 동시에 분석할 수 있다는 장점은 있지만 식품시료 전처리 과정에서 장시간이 소요되며 전문적인 인력과 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 보다 효율적인 농약 분석법의 개발이 활발히 시도되고 있는데 그 중 가장 기대를 모으는 것이 항체의 높은 특이성을 분석화학에 접목시킨 면역분석법(immunoassay)에 의한 농약 검출법이다. 면역분석법은 항체의 항원에 대한 높은 친화도와 특이성으로 인하여 감도가 매우 높고 전처리 과정이 거의 불필요하며 신속하고 비용이 적게 든다는 장점을 가지고 있다. 면역분석법은 항원 또는 항체에 붙이는 라벨(label)의 종류에 따라 몇 가지로 분류할 수 있는데 라벨로서 방사능을 이용하는 radioimmunoassay(RIA)와 형광을 이용하는 fluoresence immunoassay(FIA), 효소를 이용하는 enzyme immunoassay(EIA)가 있다. 최근에 와서 EIA가 가장 선호되고 있는데, 그 중에서도 항원 또는 항체를 고체 표면에 고정시키고 항원-항체 반응을 효소반응으로 측정하여 정량하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)는 현재 가장 활발하게 개발이 이루어지고 있다. 1980년부터 농약과 같은 환경독성물질 분석을 위한 ELISA가 개발되었다. 지금까지 수십 종의 농약에 대한 ELISA가 개발되어 왔는데 사용된 항체들은 다클론 항체(polyclonal antibody, PAb), 단클론 항체(monoclonal antibody, MAb) 그리고 유전재 재조합 항체(recombinant antibody, RAb)등이 있다.Currently, pesticide analysis methods include gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Organophosphorus pesticides are mainly analyzed using GC. GC and HPLC are very sensitive, accurate, and capable of analyzing multiple components at the same time. The disadvantage is that it is necessary. In order to solve these shortcomings, the development of more efficient pesticide assays has been actively attempted. Among them, the most anticipated is pesticide detection by immunoassay (immunoassay) combining high specificity of the antibody with analytical chemistry. Immunoassays have the advantages of high sensitivity, almost no pretreatment, fast and low cost due to the high affinity and specificity of the antigen of the antibody. Immunoassays can be classified into several categories according to the type of label attached to the antigen or antibody. Radioimmunoassay (RIA) using radioactivity, fluoresence immunoassay (FIA) using fluorescence, and enzyme immunoassay (EIA) using enzyme. There is. In recent years, EIA has been the most preferred. Among them, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which immobilizes an antigen or antibody on a solid surface and quantifies the antigen-antibody reaction by enzymatic reaction, is currently being most actively developed. have. Since 1980, ELISA has been developed for the analysis of environmental toxic substances such as pesticides. ELISAs for dozens of pesticides have been developed to date. The antibodies used include polyclonal antibodies (PAbs), monoclonal antibodies (MAbs), and recombinant antibodies (RAbs).
EPN은“이피엔”이란 상품명으로 시판되고 있는 유기인계 농약으로서 벼의 이와명충, 멸강충, 벼굴파리류, 멸구, 매미충류, 채소류의 심식나방류, 풍뎅이류, 바구미류, 진딧물류, 응애류, 총채벌레류등의 방제에 사용된다. 이 농약은 접촉독, 식독 및 흡입독 작용에 의해 살충효과를 발휘하며 약효지속기간이 2 내지 3 주로 다른 유기인계 살충제에 비하여 비교적 긴 것이 특징이다. EPN은 포유동물에 대한독성이 비교적 높아 45 % 유제의 경우 고독성 농약으로 분류되어 취급제한 농약으로 지정되어 있으며 다른 유기인계 농약과 마찬가지로 인체 내에서 acetylcholinesterase의 활성을 저해하여 신경계를 손상시키므로 엄격히 그 사용이 규제되어야 한다. 그러나, 이 농약에 대한 면역분석법은 아직 개발되어 있지 않다. EPN is an organophosphorus pesticide marketed under the trade name of "PIEN". It is used for the control of the back. This pesticide exhibits insecticidal effects by the action of contact poisoning, food poisoning and inhalation poisoning, and is characterized by a relatively long drug duration compared to other organophosphorus insecticides. EPN has a relatively high toxicity to mammals and is classified as a highly toxic pesticide in the case of 45% emulsion, and, like other organophosphates, inhibits the activity of acetylcholinesterase in the body and damages the nervous system. It must be regulated. However, no immunoassay has been developed for this pesticide.
상기의 문제점을 해결하고자 본 발명의 목적은, EPN 을 검출할 수 있는 헵텐, 상기 헵텐에 단백질을 접합시킨 면역원으로부터 얻어지는 항체 및 이를 이용한 EPN에 대한 선택성 및 감도가 높고 적은 비용으로 신속하게 분석할 수 있어 농약분석의 효율을 향상시킬 수 있는 직, 간접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법을 제공하는 것이다. In order to solve the above problems, an object of the present invention is heptene, which can detect EPN, an antibody obtained from an immunogen conjugated with a protein to the heptene, and a high selectivity and sensitivity for EPN using the same. Therefore, to provide a direct or indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay that can improve the efficiency of pesticide analysis.
상기의 목적을 달성하고자 본 발명은,The present invention to achieve the above object,
하기 화학식 1 내지 5 중의 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐을 제공한다:Heptenes having the structure of any one of
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3](3)
[화학식 4][Formula 4]
[화학식 5][Chemical Formula 5]
본 발명의 다른 목적을 달성하고자 본 발명은,The present invention to achieve another object of the present invention,
상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐과 캐리어 단백질을 결합하여 제조한 면역원으로부터 얻어지는 단클론 항체를 제공한다. Provided is a monoclonal antibody obtained from an immunogen prepared by combining a heptene having a structure of any one of
또한, 상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐과 캐리어 단백질을 결합시켜 제조한 면역원으로부터 얻어지는 다클론 항체를 제공한다. The present invention also provides a polyclonal antibody obtained from an immunogen prepared by binding a heptene having a structure of any one of
본 발명의 또 다른 목적을 달성하고자 본 발명은, The present invention to achieve another object of the present invention,
상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐을 가지는 코팅 항원을 고체 지지체에 고정시키는 고정화 단계;Immobilizing the coating antigen having heptene having any one of
상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐과 캐리어 단백질을 결합하여 제조한 면역원으로부터 얻어지는 항체와 EPN이 포함된 분석시료를 상기 코팅 항원과 접촉시키는 경쟁 단계; 및 A competition step of contacting the analytical sample containing EPN with an antibody obtained from an immunogen prepared by combining heptene having a structure of any one of
상기 코팅 항원에 결합한 항체를 정량하여 EPN의 농도를 정량하는 정량 단계를 포함하는 EPN 검출용 간접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법을 제공한다. It provides an indirect competition enzyme-linked immune adsorption assay for EPN detection comprising a quantification step of quantifying the concentration of EPN by quantifying the antibody bound to the coating antigen.
상기 정량 단계는 효소 표지를 한 안티-마우스 2차 항체를 가하여 효소 표지에 의한 시그널을 측정하여 정량할 수 있다. The quantification step can be quantified by measuring the signal by the enzyme label by adding an anti-mouse secondary antibody labeled with the enzyme.
상기 항체는 상기 화학식 2 의 헵텐-KLH 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 얻은 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody obtained by using the heptene-KLH conjugate of
상기 코팅 항원은 다클론 항체를 사용하는 경우 상기 화학식 3 의 헵텐-OVA 컨쥬게이트일 수 있다. The coating antigen may be a heptene-OVA conjugate of Formula 3 when using a polyclonal antibody.
상기 코팅 항원은 단클론 항체를 사용하는 경우 상기 화학식 5 의 헵텐-OVA 컨쥬게이트일 수 있다. The coating antigen may be a heptene-OVA conjugate of Formula 5 when using a monoclonal antibody.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하고자 본 발명은,The present invention to achieve another object of the present invention,
상기 화학식 1 내지 5 중의 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐에 단백질을 붙인 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 얻은 단클론 항체 또는 다클론 항체를 고체 지지체에 고정화하는 고정화 단계;Immobilizing a monoclonal antibody or polyclonal antibody obtained by using a conjugate attached with a protein to heptene having any one of
상기 화학식 1 내지 5 중의 하나의 구조를 갖는 합텐에 단백질을 붙인 효소 트레이서와 EPN이 포함된 분석 시료를 상기 항체와 접촉시키는 경쟁 단계; 및 A competition step of contacting the antibody with an enzyme tracer having a protein attached to a hapten having a structure of
상기 항체에 결합한 효소 트레이서를 정량하여 EPN의 농도를 정량하는 정량 단계를 포함하는 EPN 검출용 직접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법을 제공한다. It provides a direct competition enzyme-linked immunosorbent assay for EPN detection comprising a quantification step of quantifying the concentration of EPN by quantifying the enzyme tracer bound to the antibody.
상기 항체는 상기 화학식 1 의 헵텐-KLH 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 수득한 것일 수 있다.The antibody may be obtained by using the heptene-KLH conjugate of
상기 효소 트레이서는 상기 화학식 1 의 헵텐에 HRP를 접합시킨 것일 수 있다.The enzyme tracer may be one in which HRP is conjugated to heptene of Chemical Formula 1.
본 발명의 헵텐은 EPN 효소 결합 면역 흡착 분석법에 이용가능한 코팅 항원 및 항체의 제조에 이용될 수 있다. Heptenes of the present invention can be used to prepare coated antigens and antibodies that are available for EPN enzyme linked immunosorbent assays.
본 발명의 헵텐을 이용하여 항원에 대한 친화도와 특이성이 높은 항체를 생산할 수 있다.Heptenes of the present invention can be used to produce antibodies with high affinity and specificity for antigens.
본 발명의 헵텐과 항체를 이용한 효소 면역 흡착 분석법은 EPN 에 대한 선택성과 감도가 높으며 별도의 전처리 과정이 필요없고 빠른 시간안에 저렴한 비용으로 EPN 을 검출할 수 있다. Enzyme immunosorbent assay using heptene and antibody of the present invention has high selectivity and sensitivity for EPN and does not require a separate pretreatment process and can detect EPN at a low cost in a short time.
따라서, 본 발명의 헵텐 및 항체를 이용하여 농약분석을 보다 효율적으로 수행할 수 있다. Therefore, the pesticide analysis can be performed more efficiently using the heptene and antibody of the present invention.
이하, 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명을 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail so that those skilled in the art can easily practice the present invention.
본 발명은 EPN에 대한 항체 및 면역원을 제조하는 데 이용될 수 있는 헵텐(hapten)을 제공한다. 본 발명에서 검출하고자 하는 대상인 EPN은 하기 화학식 A 의 구조를 가지며, 분자량이 작아서 그 자체로서 면역원이 될 수 없기 때문에 EPN 과 구조가 비슷하며 단백질에 공유결합시킬 수 있는 원자단을 가지는 물질, 즉 헵텐(hapten)을 이용한다:The present invention provides heptenes that can be used to make antibodies and immunogens against EPN. In the present invention, the EPN to be detected has a structure of Formula (A), and has a structure similar to that of EPN because it has a low molecular weight and thus cannot be an immunogen, and has a group of atoms capable of covalently binding to a protein, that is, heptene ( hapten):
[화학식 A][Formula A]
본 발명의 헵텐을 이용하여 EPN에 대한 적합한 특이성과 강한 친화력을 지닌 항체를 생산할 수 있다.Heptenes of the present invention can be used to produce antibodies with suitable specificity and strong affinity for EPN.
본 발명의 헵텐은 하기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조로 표현될 수 있다:Heptene of the present invention may be represented by the structure of any one of the following
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3](3)
[화학식 4][Formula 4]
[화학식 5][Chemical Formula 5]
상기 화학식 1 내지 5 의 구조를 갖는 헵텐의 합성 경로는 도 1 내지 도 5 에 나타내었으며 이들의 합성 과정은 실시예에서 상세히 설명한다. Synthesis route of heptene having the structure of
또한, 본 발명에서 헵텐 A는 상기 화학식 1 의 구조를 갖는 헵텐을, 헵텐 B 는 상기 화학식 2 의 구조를 갖는 헵텐을, 헵텐 C는 상기 화학식 3 의 구조를 갖는 헵텐을, 헵텐 D는 상기 화학식 4 의 구조를 갖는 헵텐을, 그리고 헵텐 E는 상기 화학식 5 의 구조를 갖는 헵텐을 나타낸다. In the present invention, heptene A is heptene having the structure of
본 발명은 상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐과 캐리어 단백질(carrier protein)을 결합하여 제조한 면역원으로부터 얻어지는 항체를 제공한다. The present invention provides an antibody obtained from an immunogen prepared by combining heptene having a structure of any one of
상기 본 발명의 헵텐과 캐리어 단백질이 결합된 것은 헵텐-단백질 컨쥬게이트(hapten-protein conjugate)로 항체 제조를 위한 면역원 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법의 코팅 항원으로 이용될 수 있다. The binding of the heptene and carrier protein of the present invention may be used as a coating antigen of an immunogen or an enzyme-linked immunosorbent assay for antibody production as a heptene-protein conjugate.
상기 캐리어 단백질은 당업계에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 ant keyhole limpet의 hemocyanin(KLH), ovalbumin(OVA) 또는 horseradish peroxidase(HRP)가 사용될 수 있다. 상기 헵텐과 단백질을 콘쥬게이션 시키는 방법은 당업계에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 화학식 1 내지 5 중의 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐을 N-hydroxysuccinimide와 carbodiimide를 사용하여 반응성이 큰 ester 형으로 만든 다음, 이것을 단백질과 결합시키는 active ester 방법을 사용할 수 있다. 상기 화학식 1 의 헵텐과 단백질을 콘쥬게이션시키는 과정은 도 6 에 나타내었다. The carrier protein may be used without limitation as is known in the art, preferably hemocyanin (KLH), ovalbumin (OVA) or horseradish peroxidase (HRP) of an ant keyhole limpet. The method for conjugating the heptene and the protein may be used without limitation to those known in the art. Preferably, heptene having a structure of any one of
상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다클론 항체(polyclonal antibody)일 수 있다. 상기 항체의 제조 방법은 당업계에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 상기 단클론 항체는 상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐-KLH 컨쥬게이트를 면역원으로 마우스를 면역화하고 면역화된 마우스의 비장을 적출하여 그 세포를 미엘로마(myeloma) 세포와 융합시켜 hybridoma 세포를 얻고 클로닝을 하여 수득할 수 있다. 상기 다클론 항체는 상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐-KLH 콘쥬게이터를 면역원으로 토끼를 면역화하고 이의 혈액에서 항혈청을 분리하여 수득할 수 있다. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Methods for preparing the antibody may be used without limitation, those known in the art, specifically, the monoclonal antibody is immunized and immunized mice with heptene-KLH conjugate having the structure of any one of
본 발명은 고정화 단계; 경쟁 단계; 및 정량 단계를 포함하는 EPN 검출용 간접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)을 제공한다. 상기 효소 결합 면역 흡착 분석법은 본 발명에서 제조한 헵텐과 이에 의한 항체를 사용하여 EPN에 대한 선택성과 감도가 높고, 간편한 방법으로 신속하게 농약을 효율적으로 분석할 수 있다. The present invention is an immobilization step; Competition phase; And indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for EPN detection, comprising a quantification step. In the enzyme-linked immunosorbent assay, heptene prepared in accordance with the present invention and the antibody thereof can be used to efficiently analyze pesticides quickly and easily by high efficiency and high sensitivity to EPN.
상기 고정화 단계는 상기 화학식 1 내지 5 중의 하나의 구조를 갖는 헵텐을 가지는 코팅 항원을 고체 지지체에 고정시키는 단계이다. 간접 경쟁 방식은 코팅 항원을 고정시킨 후 항체와 분석하고자 하는 시료를 넣어 코팅 항원과 분석 시료가 항체에 대해 서로 경쟁하게 하는 방식이다. The immobilization step is a step of immobilizing a coating antigen having a heptene having a structure of one of
상기 코팅 항원은 상기 화학식 1 내지 5 중의 하나의 구조를 갖는 헵텐과 캐리어 단백질을 결합시킨 헵텐-단백질 컨쥬게이트를 사용할 수 있다. 상기 캐리어 단백질로는 KLH, OVA 또는 HRP를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 OVA를 사용할 수 있다. 상기 OVA는 본 발명에서 사용하는 항체와 비특이적인 결합이 거의 없어 친화력이 낮으므로 본 발명의 분석법의 민감도를 떨어뜨리지 않는다. The coating antigen may be a heptene-protein conjugate in which a heptene having a structure of one of
상기 코팅 항원은 바람직하게는, 다클론 항체를 사용하여 분석을 수행하는 경우 상기 화학식 3 의 헵텐-OVA 컨쥬게이트를 사용할 수 있으며, 단클론 항체를 사용하여 분석을 수행하는 경우 상기 화학식 5 의 헵텐-OVA 컨쥬게이트를 사용할 수 있다. 상기 화학식 3 의 헵텐-OVA 컨쥬게이트 또는 상기 화학식 5 의 헵텐-OVA 컨쥬게이트는 각각의 분석법에서 본 발명에서 사용하는 항체와의 친화도가 크고 높은 특이성을 나타내므로 분석 효율을 향상시킬 수 있다. The coating antigen is preferably a heptene-OVA conjugate of
상기 코팅 항원의 농도는 20 내지 500 ng/well 일 수 있다. 상기 농도 범위내에서 항체와의 결합력이 우수하다. The concentration of the coating antigen may be 20 to 500 ng / well. The binding strength with the antibody is excellent within the concentration range.
상기 경쟁 단계는 항체와 EPN이 포함된 분석 시료를 상기 코팅 항원과 접촉시키는 단계이다. 상기 경쟁 단계에서 코팅 항원과 분석 시료는 항체에 대해 서로 경쟁하게 되고 코팅 항원에 결합하는 항체의 양은 분석 시료의 농도가 증가할수록 감소하게 된다. The competition step is the step of contacting the analyte sample containing the antibody and EPN with the coating antigen. In the competition step, the coating antigen and the assay sample compete with each other for the antibody, and the amount of the antibody binding to the coating antigen decreases as the concentration of the assay sample increases.
상기 항체는 상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐-단백질 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 수득한 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 면역원은 바람직하게는, 상기 화학식 1 의 헵텐-KLH 또는 상기 화학식 2 의 헵텐-KLH를 사용할 수 있으며, 다클론 항체는 이를 면역원으로 토끼를 면역화하여 수득된 항체를 사용할 수 있으며, 단클론 항체는 이를 면역원으로 마우스를 면역화하여 수득된 항체를 사용할 수 있다. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody obtained by using a heptene-protein conjugate having the structure of any one of
상기 분석시료는 반응 용액에 용해하여 코팅 항원과 접촉시킬 수 있다. EPN 은 소수성 물질이므로 이의 용해를 위해 상기 반응 용액에 유기 용매를 섞어 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유기 용매는 EPN 을 용해할 수 있는 것이라면 당업계에 공지된 것이 제한업이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 아세토니트릴 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 반응 용액에 대하여 5 내지 40 질량%로 사용할 수 있다. 상기 범위에서 코팅 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하며, 상기 범위를 벗어나는 경우 분석의 감도가 감소할 수 있다. 상기 반응 용액의 pH 는 7 내지 8 일 수 있으며, 바람직하게는 7.4 일 수 있 다. 생리적 pH 에 근접한 7 내지 8 의 범위내에 있을 때 항체의 구조적 안정성이 좋으며 발색 시간도 짧고 감도도 좋다. The assay sample may be dissolved in the reaction solution and contacted with the coating antigen. Since EPN is a hydrophobic material, it is preferable to use an organic solvent in the reaction solution for dissolution thereof. If the organic solvent can dissolve EPN, those known in the art can be used, and may be preferably used alone or a mixture thereof, preferably selected from the group consisting of methanol, acetonitrile and acetone. Methanol may be used. The organic solvent may be used at 5 to 40 mass% with respect to the reaction solution. In this range, the affinity of the antibody for the coating antigen is increased, and the sensitivity of the assay may be decreased when it is outside the range. The pH of the reaction solution may be 7 to 8, preferably 7.4. When in the range of 7 to 8 close to the physiological pH, the structural stability of the antibody is good, the color development time is short and the sensitivity is good.
상기 정량 단계는 상기 코팅 항원에 결합한 항체를 정량하여 EPN의 농도를 정량하는 단계이다. 코팅 항원에 결합한 항체는 효소, 형광성 원자단, 방사성 동위원소, 또는 콜로이드성 금등의 라벨(label)을 붙인 항체를 사용하거나 이러한 라벨을 붙인 안티-마우스 2차 항체를 가하여 라벨에 의한 시그널을 측정함으로써 정량할 수 있으며, 바람직하게는 효소 라벨을 붙인 항체를 사용하거나 효소 라벨을 붙인 안티-마우스 2차 항체를 가하여 정량할 수 있다. 효소 반응의 생성물을 정량하는 방법으로는 생성물의 광학적 성질에 따라 흡광, 형광, 발광등의 방법을 쓸 수 있다. The quantification step is to quantify the concentration of EPN by quantifying the antibody bound to the coating antigen. Antibodies bound to the coated antigens are quantified by using an antibody labeled with an enzyme, a fluorescent atom group, a radioisotope, or a colloidal gold, or by measuring a signal by labeling with an anti-mouse secondary antibody labeled with the label. It is possible to quantify, preferably by using an enzyme-labeled antibody or by adding an enzyme-labeled anti-mouse secondary antibody. As a method for quantifying the product of the enzymatic reaction can be used a method such as absorption, fluorescence, light emission according to the optical properties of the product.
본 발명은 또한, 고정화 단계; 경쟁 단계; 및 정량 단계를 포함하는 EPN 검출용 직접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)을 제공한다. 상기 직접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법에서는 항체를 고정시키고 이 항체에 대하여 분석 시료와 효소로 표지되어 있는 항원 즉, 효소 트레이서(enzyme tracer)가 서로 경쟁하게 된다. The present invention also provides an immobilization step; Competition phase; And direct competition enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for EPN detection, comprising a quantification step. In the direct competition enzyme-linked immunosorbent assay, the antibody is immobilized and the assay sample and the antigen-labeled enzyme, that is, the enzyme tracer, compete with each other.
상기 고정화 단계는 상기 화학식 1 내지 5 중의 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐에 단백질을 붙인 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 얻은 단클론 항체 또는 다클론 항체를 고체 지지체에 고정화하는 단계이다. The immobilizing step is a step of immobilizing a monoclonal antibody or polyclonal antibody obtained by using a conjugate attached with a protein to heptene having any one of
상기 항체의 제조 방법은 상기에서 기재한 것과 동일하므로 여기서는 자세한 설명을 생략한다. 상기 단백질은 당업계에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 KLH, OVA 또는 HRP를 사용할 수 있다.Since the manufacturing method of the said antibody is the same as what was described above, detailed description is abbreviate | omitted here. The protein may be used without limitation as is known in the art, preferably KLH, OVA or HRP may be used.
상기 항체는 바람직하게는 상기 화학식 1 의 헵텐-KLH 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 얻은 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 화학식 1 의 헵텐-KLH 컨쥬게이트를 면역원으로 하여 얻어진 항체는 효소 트레이서와의 친화력이 우수하다. The antibody may preferably be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody obtained by using the heptene-KLH conjugate of
상기 경쟁 단계는 효소 트레이서와 EPN 이 포함된 분석 시료를 상기 항체와 접촉시키는 단계이다. 상기 경쟁 단계에서 항체에 대하여 효소 트레이서와 분석 시료는 경쟁하고 항체에 결합하는 효소 트레이서의 양은 분석물의 농도가 증가할수록 감소하게 된다. The competition step is a step of contacting the assay sample containing the enzyme tracer and EPN with the antibody. In the competition step, the enzyme tracer and the analyte sample compete with the antibody, and the amount of the enzyme tracer that binds to the antibody decreases as the concentration of the analyte increases.
상기 효소 트레이서는 상기 화학식 1 내지 5 중 어느 하나의 구조를 갖는 헵텐에 단백질을 접합시켜 만들 수 있으며, 상기 단백질은 당업계에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 HRP를 사용할 수 있다. 상기 헵텐은 바람직하게는 상기 화학식 1 의 헵텐 또는 상기 화학식 2 의 헵텐을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 화학식 1 의 헵텐을 사용할 수 있다. 상기 화학식 1 또는 화학식 2 의 헵텐과 HRP를 접합시킨 효소 트레이서는 상기 화학식 3 내지 5 의 헵텐에 비하여 항체에 대한 친화력이 우수하다. The enzyme tracer may be made by conjugating a protein to heptene having any one of
상기 효소 트레이서에서 헵텐과 HRP의 몰비는 10:1 내지 50:1 일 수 있다. 상기 범위내에서 항체와의 친화도가 우수하여 분석법 수행시 흡광도가 높게 나올 수 있다. The molar ratio of heptene and HRP in the enzyme tracer may be 10: 1 to 50: 1. Within the above range, the affinity with the antibody may be excellent, and thus the absorbance may be high when the assay is performed.
상기 분석 시료는 반응 용액에 용해되어 사용될 수 있으며, 상기 반응 용액은 유기 용매를 포함할 수 있다. 상기 유기 용매는 당업계에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴이 사용될 수 있고, 보다 바람직하게는 메탄올이 사용될 수 있다. 상기 메탄올은 반응 용액에 대하여 5 내지 10 중량% 의 농도로 첨가될 수 있다. 10 중량% 를 초과하여 첨가되면 발색에 걸리는 시간이 길어질 수 있으며, 5 중량% 미만으로 포함되는 경우 감도가 낮아질 수 있다. 상기 반응 용액의 pH 는 7 내지 8 일 수 있으며, 바람직하게는 7.4 일 수 있다. 생리적 pH 에 근접한 7 내지 8 의 범위내에 있을 때 항체의 구조적 안정성이 좋으며, 발색 시간도 짧고 감도도 좋다. The assay sample may be used after being dissolved in the reaction solution, and the reaction solution may include an organic solvent. The organic solvent may be used without limitation, known in the art, preferably methanol, acetone or acetonitrile may be used, more preferably methanol may be used. The methanol may be added at a concentration of 5 to 10% by weight based on the reaction solution. When added in excess of 10% by weight may take a long time to develop a color, and when included in less than 5% by weight may be lowered in sensitivity. The pH of the reaction solution may be 7 to 8, preferably 7.4. When in the range of 7 to 8 close to the physiological pH, the structural stability of the antibody is good, the color development time is short and the sensitivity is good.
상기 정량 단계는 상기 항체에 결합한 효소 트레이서를 정량하여 EPN의 농도를 정량하는 단계이다. 상기 EPN 농도의 정량은 효소 트레이서를 기질과 반응시켜 흡광, 형광, 발광등의 방법으로 할 수 있다. 이는 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 상기 간접 경쟁 효소 결합 면역 흡착 분석법의 정량 단계와 동일하므로 여기서는 설명을 생략한다. The quantification step is to quantify the concentration of EPN by quantifying the enzyme tracer bound to the antibody. Quantification of the EPN concentration may be carried out by reaction of an enzyme tracer with a substrate by absorbance, fluorescence, or luminescence. This can be carried out by methods known in the art, and the description is omitted here as it is the same as the quantification step of the indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 설 명을 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. This is only for the description of the present invention, and thus the scope of the present invention is not limited.
하기 실시예에서 합성한 물질의 NMR 데이터는 각 물질의 구조에 부합하였다. NMR spectrum의 chemical shift(δ)값은 tetramethylsilane(TMS)을 internal standard로 한 것이며 ppm으로 나타내었다. Coupling constant(J)값들은 Hz로 나타내었다. d, t, q, qn, sp, m, ph, nph 는 각각 doublet, triplet, quartet, quintet, septet, multiplet, phenyl, nitrophenyl proton을 의미한다. The NMR data of the materials synthesized in the following examples corresponded to the structure of each material. The chemical shift (δ) of the NMR spectrum is based on tetramethylsilane (TMS) as an internal standard and is expressed in ppm. Coupling constant ( J ) values are expressed in Hz. d, t, q, qn, sp, m, ph and nph mean doublet, triplet, quartet, quintet, septet, multiplet, phenyl and nitrophenyl protons, respectively.
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실시예Example
1> 화학식 1>
(1) 화합물 1 (1)
50 ㎖ 둥근바닥 flask에 아세토니트릴(acetonitrile)(20 ㎖)에 용해시킨 phenylthiophosphonic dichloride(6.32 g, 29.95 mmol)와 K2CO3(30 g)를 넣은 후 교반하면서 아세토니트릴(20 ㎖)에 용해시킨 4-nitrophenol(2.77 g, 19.96 mmol)을 dropping funnel을 이용하여 실온에서 3분간 떨어뜨리고 15분 동안 더 교반하였다. 반응을 중지시켜 반응용액을 celite를 이용하여 여과하고 여액의 용매를 휘발시킨 후 column chromatography(silica gel, hexane/ethyl acetate 5:1)하여 노란색 oil 형태의 생성물 3.69 g(수득율 59 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate 5:1, Rf=0.46. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.31(2H, d, J=8.8, nph), 8.15(2H, d×d, J=17.2 & 7.7, ph), 7.73-7.58(3H, m, ph), 7.49(2H, d×d, J=9.1 & 1.9, nph).Phenylthiophosphonic dichloride (6.32 g, 29.95 mmol) and K 2 CO 3 (30 g) dissolved in acetonitrile (20 mL) were added to a 50 mL round bottom flask, and then dissolved in acetonitrile (20 mL) while stirring. 4-nitrophenol (2.77 g, 19.96 mmol) was dropped for 3 minutes at room temperature using a dropping funnel and further stirred for 15 minutes. The reaction was stopped and the reaction solution was filtered using celite, and the solvent was evaporated. The solvent was evaporated, and column chromatography (silica gel, hexane / ethyl acetate 5: 1) gave 3.69 g (yield 59%) of the product in the form of a yellow oil. TLC: hexane / ethyl acetate 5: 1, Rf = 0.46. 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ), δ 8.31 (2H, d, J = 8.8, nph), 8.15 (2H, d × d, J = 17.2 & 7.7, ph), 7.73-7.58 (3H, m , ph), 7.49 (2H, d × d, J = 9.1 & 1.9, nph).
(2) 화학식 1 의 헵텐(2) heptene of formula (1)
250 mg(0.8 mmol)의 화합물 1 을 메탄올(1 ㎖)에 녹인 용액을 얼음물(4 ℃)로 냉각시켜 교반하면서 KOH(122 mg, 2.2 mmol)와 6-aminocaproic acid(129 mg, 0.98 mmol)를 녹인 메탄올 용액(1 ㎖)을 3 ~ 5분 동안 떨어뜨리고 30분 동안 더 교반하였다. 반응용액을 여과하여 KCl을 제거하고 1N HCl과 에틸 아세테이트를 넣어 생성물을 추출한 다음 MgSO4 로 탈수시켰다. 용매를 휘발시킨 후, column chromatography(silica gel, hexane/ethyl acetate/acetic acid, 200:100:8)하여 노란색 oil 형태의 생성물 195 mg(수득율 60 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8, Rf=0.42. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.23 (2H, d, J=9.0, nph), 7.96(2H, d×d, J=14.3 & 7.4, ph), 7.65-7.43(3H, m, ph), 7.39(2H, d×d, J=9.1 & 1.3, nph), 3.42(1H, m, NH), 3.02(2H, m, NCH2), 2.30(2H, t, J=7.3, CH2CO), 1.56 (2H, qn, J=7.4, NHCH2CH2), 1.46(2H, qn, J=7.2, CH2CH2CO), 1.30(2H, qn, J=7.2, (CH2)2CH2(CH2)2)A solution of 250 mg (0.8 mmol) of
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실시예Example
2> 화학식 2>
(1) 화합물 2 (1)
γ-Butyrolactone(20 ㎖, 260 mmol)을 20 ㎖의 3차 증류수에 용해시킨 후, NaOH(11.5 g, 287 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 6시간 동안 reflux시켰다. 반응용액을 식혀 evaporator로 물을 제거하고 hot ethanol에 녹인 후, 용해되지 않은 물질은 거름종이로 걸러 제거하였다. 여액에 diethyl ether를 첨가하여 생성물을 결 정화 하였다. 결정화된 물질의 수분을 P2O5 로 제거해 16.8 g의 백색의 고체 생성물(수득률 48 %)을 얻었다. γ-Butyrolactone (20 mL, 260 mmol) was dissolved in 20 mL of tertiary distilled water, followed by addition of NaOH (11.5 g, 287 mmol). The mixture was refluxed for 6 hours. After cooling the reaction solution to remove water with an evaporator and dissolved in hot ethanol, the undissolved material was removed by filtration. The product was purified by adding diethyl ether to the filtrate. The moisture of the crystallized material was removed with P 2 O 5 to give 16.8 g of a white solid product (yield 48%).
(2) 화합물 3 (2)
Benzyl bromide(3.4 g, 20 mmol)를 50 ㎖ dicholoromethane에 용해시키고, 여기에 20 ㎖ 3차 증류수에 용해시킨 sodium-4-hydroxybutanoate (5.0 g, 40 mmol)와 600 mg의 tetrabutylammonium hydrogen sulfate를 가하였다. 4일 동안 실온에서 격렬하게 교반시킨 후 chloroform으로 추출하여 추출액을 Na2SO4로 탈수시켰다. 용매를 휘발시킨 다음, column chromatography(silica gel, hexane/ethyl acetate 1:1)하여 oil 형태의 화합물 780 mg(수득율 20 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate 1:1, Rf=0.37. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ7.27(5H, s, ph), 5.04(2H, s, C6H5CH2), 4.25(2H, t, J=7.0, CH2O), 2.53(2H, t, J=7.1, CH2CO2), 1.82(2H, qn, J=6.3, CH2CH2CH2).Benzyl bromide (3.4 g, 20 mmol) was dissolved in 50 mL dicholoromethane, and sodium-4-hydroxybutanoate (5.0 g, 40 mmol) and 600 mg tetrabutylammonium hydrogen sulfate dissolved in 20 mL tertiary distilled water were added thereto. After stirring vigorously at room temperature for 4 days, the mixture was extracted with chloroform and the extract was dehydrated with Na 2 SO 4 . After evaporating the solvent, column chromatography (silica gel, hexane / ethyl acetate 1: 1) yielded 780 mg (yield 20%) of an oil compound. TLC: hexane / ethyl acetate 1: 1, Rf = 0.37. 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ), δ 7.27 (5H, s, ph), 5.04 (2H, s, C 6 H 5 CH 2 ), 4.25 (2H, t, J = 7.0, CH 2 O) , 2.53 (2H, t, J = 7.1, CH 2 CO 2 ), 1.82 (2H, qn, J = 6.3, CH 2 CH 2 CH 2 ).
(3) 화합물 4 (3)
103 mg(0.33 mmol)의 화합물 1 을 아세토니트릴(500 ㎕)에 용해시키고, K2CO3(0.5 g)을 넣은 후, 아세토니트릴(500 ㎕)에 용해시킨 74 mg(0.38 mmol)의 화합물 3 을 떨어뜨리면서 혼합하였다. 실온에서 2일 동안 교반시킨 후, 반응용액의 용매를 휘발시키고 prep. TLC로 분리, 정제하여 노란색 oil 형태의 생성물 31 mg(수득율 20 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate 5:1, Rf=0.27. 1H NMR(300 MHz, CDCl3),δ8.10 (2H, d, J=9.1, nph), 7.92(2H, d×d, J=15.0 & 7.8, ph), 7.63-7.44(3H, m, ph), 7.28(5H, m, ph), 7.12(2H, d, J=9.1 & 1.5, nph), 5.04(2H, s, C6H5CH2), 4.20(2H, m, CH2O), 2.44(2H, t, J=7.1, CH2CO2), 2.02(2H, m, CH2CH2CH2).103 mg (0.33 mmol) of
(4) 화학식 2 의 헵텐(4) heptene of formula (2)
화합물 4 의 가수분해물은 다음 과정에 의하여 얻었다. 26 mg(0.055 mmol)의 화합물 4 에 HBr-acetic acid 250 ㎕을 첨가하여 실온에서 2시간 교반하였다. 용매를 휘발시킨 후 prep. TLC로 노란색 oil 형태의 생성물 18 mg(수득율 88 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate/acetic acid 70:40:1, Rf=0.52. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.18 (2H, d, J=9.0, nph), 7.97(2H, d×d, J=15.0 & 7.7, ph), 7.66-7.46 (3H, m, ph), 7.19 (2H, d×d, J=9.1 &1.5, nph), 4.28(4H, m, CH2O), 2.51(2H, t, J=7.1, CH2CO2), 2.07(2H, qn, J=6.6, CH2CH2CH2).The hydrolyzate of
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실시예Example
3> 화학식 3>
화합물 1 75 mg(0.24 mmol)을 용해시킨 메탄올 용액(1 ㎖)을 얼음물(4 ℃)로 냉각시키면서 KOH(63 mg, 1.16 mmol)와 4-(methylamino)butyric acid(47 mg, 0.31 mmol)를 포함한 methanol 용액(1 ㎖)을 떨어뜨리고 10분간 교반한 다음 실온에서 1시간 동안 더 교반하였다. 반응용액에 1 N HCl과 ethyl acetate를 넣어 생성물을 추출하였다. 추출액을 MgSO4로 탈수시킨 후, 용매를 휘발시키고 잔류물을 prep. TLC 하여 노란색 oil 생성물 39 mg(수득률 44 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8, Rf=0.54. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.23 (2H, d, J=9.1, nph), 7.88(2H, d×d, J=14.1 & 7.8,ph), 7.60-7.47(3H, m, ph), 7.34(2H, d×d, J=9.1 & 1.2, nph), 3.34(2H, m, NCH2), 2.76(3H, d, J=11.6, CH3N), 2.31(2H, t, J=7.3, CH2CO), 1.83(2H, m, CH2CH2CH2).KOH (63 mg, 1.16 mmol) and 4- (methylamino) butyric acid (47 mg, 0.31 mmol) were cooled in a methanol solution (1 mL) in which 75 mg (0.24 mmol) of
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실시예Example
4> 화학식 4>
화합물 1 210 mg(0.67 mmol)을 용해시킨 메탄올 용액(1 ㎖)을 얼음물(4 ℃)로 냉각시키면서 KOH(102 mg, 1.82 mmol)와 β-alanine(73.5 mg, 0.82 mmol)을 녹인 methanol(1 ㎖) 용액을 떨어뜨리면서 15분간 교반하였다. 반응용액에 1 N HCl과 ethyl acetate를 넣어 생성물을 추출하였다. 추출액을 MgSO4로 탈수시킨 후, column chromatography(silica gel, hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8) 하여 oil 형태의 생성물 98 mg(수득률 38 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8, Rf=0.47. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.22 (2H, d, J=8.9, nph), 7.98(2H, d×d, J=14.4 & 7.8, ph), 7.64-7.42(3H, m, ph), 7.36(2H, d×d, J=9.2 & 1.4, nph), 3.34(2H, sp, J=6.6, NCH2), 3.18(1H, qn, J=5.7, NH), 2.50(2H, t, J=7.4, CH2CO).Methanol (1 mL) dissolved in 210 mg (0.67 mmol) of
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실시예Example
5> 화학식 5>
(1) 화합물 5 (1)
Phenylthiophosphate dichloride(2.37 g, 11.3 mmol)에 10배 몰의 ethanol(5.2 ㎖)을 10 분간 떨어뜨리면서 냉각(4 ℃) 교반하고 그 후 20분간 더 교반하였다. 반응용액에 증류수와 ethyl acetate를 넣어 생성물을 추출한 후 MgSO4로 탈수시켰다. 용매를 휘발시킨 후, column chromatography (silica gel, hexane/ethyl acetate 40:1)로 분리하여 oil 형태의 생성물 800 mg(수득률 29 %)을 얻었다: 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.05 (2H, d×d, J=16.6 & 7.7,ph), 7.66-7.49(3H, m, ph), 4.58-4.32(2H, m, CH3CH2), 1.48(2H, t, J=7.1, CH3CH2).Phenylthiophosphate dichloride (2.37 g, 11.3 mmol) was added with 10 times mole of ethanol (5.2 mL) for 10 minutes while cooling (4 ° C) was stirred, followed by further 20 minutes. Distilled water and ethyl acetate were added to the reaction solution to extract the product, followed by dehydration with MgSO 4 . The solvent was volatilized and separated by column chromatography (silica gel, hexane / ethyl acetate 40: 1) to give 800 mg (yield 29%) of the oily product: 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ), δ8. 05 (2H, d × d, J = 16.6 & 7.7, ph), 7.66-7.49 (3H, m, ph), 4.58-4.32 (2H, m, CH 3 CH 2 ), 1.48 (2H, t, J = 7.1, CH 3 CH 2 ).
(2) 화합물 6 (2) compound 6
800 mg(5.0 mmol)의 2-amino-4-nitrophenol과 368 mg(3.1 mmol)의 화합물 5를 butanone(75 ㎖)에 용해시킨 다음, 857 mg의 Na2CO3를 첨가하고 20시간 동안 환류 교반하였다. 반응용액을 식힌 후 ethyl acetate와 증류수를 넣어 유기 용매층을 분리한 다음, 이것을 1% Na2CO3용액 (100 ㎖)으로 5회, 증류수(100 ㎖)로 3회 씻었다. 추출물을 Na2SO4로 탈수시킨 후, 용매를 휘발시키고, 잔류물을 column chromatography(silica gel, hexane/ethyl acetate 5:1)하여 주홍색 액상의 생성물 507 mg(수득률 69 %)을 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate/acetic acid 5:1, Rf=0.38. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ7.94 (2H, d×d, J=14.9 & 7.7, ph), 7.57-7.42(5H, m, ph & nph), 7.05(1H, d×d, J=8.8 & 1.7,nph), 4.30-4.11(3H, m, CH3CH2), 1.29(2H, t, J=7.1, CH3CH2).Dissolve 800 mg (5.0 mmol) of 2-amino-4-nitrophenol and 368 mg (3.1 mmol) of
(3) 화합물 7 (3)
350 mg(0.91 mmol)의 화합물 6 을 toluene(5 ㎖)에 용해시킨 후, toluene(5 ㎖)에 용해시킨 adipoyl chloride(1.0 g, 0.54 mmol) 용액과 1 M Na2CO3용액(0.07 ㎖)을 첨가하여 90 ℃에서 3시간 반응시켰다. 반응용액을 식힌 후, 1 N HCl과 ethyl acetate로 추출하여 유기층을 Na2SO4로 탈수시켰다. 용매를 휘발시켜 주홍색의 oil 생성물 200 mg(수득률 57 %)을 얻었다. 350 mg (0.91 mmol) of Compound 6 in toluene (5 mL), followed by adipoyl chloride (1.0 g, 0.54 mmol) solution and 1 M Na 2 CO 3 solution (0.07 mL) dissolved in toluene (5 mL) Was added and reacted at 90 ° C for 3 hours. The reaction solution was cooled, extracted with 1 N HCl and ethyl acetate, and the organic layer was dehydrated with Na 2 SO 4 . The solvent was volatilized to obtain 200 mg of a scarlet oil product (yield 57%).
(4) 화학식 5 의 헵텐(4) heptene of
100 mg(0.26 mmol)의 화합물 7 을 THF(10 ㎖)에 용해시킨 후, 1 N HCl(2.5 ㎖)를 첨가하여 60 ℃에서 3시간 반응시켰다. 이것에 포화 NaCl(3 ㎖)를 가하여 유기용매층을 분리하여 Na2SO4로 탈수시켰다. 용매를 휘발시킨 후 prep. TLC(hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8)로 분리하여 노란색 oil 형태의 생성물 30 mg(수득률 33 %)를 얻었다. TLC: hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8, Rf=0.37. 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ9.15 (1H, d, J=2.4, NH), 7.99-7.84(3H, m, ph & nph), 7.82(1H, d×d, J=8.9 & 2.7, nph), 7.64-7.46(3H, m, ph), 7.11 (1H, d×d, J=9.0 & 1.8, nph), 4.21 (2H, d×q×d, J=10.1,7.1 & 1.6, CH2CH3), 2.33(2H, t, J=6.9, NHCOCH2), 2.28(2H, t, J=7.0, CH2CO2), 1.74-1.57(4H, m, CH2(CH2)2CH2), 1.30(2H, t, J=7.1, CH3CH2).After dissolving 100 mg (0.26 mmol) of
<< 실시예Example 6> 6> 헵텐Heptene -단백질 -protein 컨쥬게이터의Of conjugator 합성 synthesis
(1) 화학식 (1)
Dichloromethane(5 ㎖)에 N-hydroxysuccinimide(NHS, 36 mg, 0.3 mmol)를 용해시킨 후 소량의 dichloromethane에 녹인 실시예 1 에서 합성한 화학식 1 의 헵텐(115 mg, 0.28 mmol), 4-dimethylaminopyridine(DMAP, 3.4 mg, 0.028 mmol), N,N-dicyclohexylcarbodiimide를 차례로 첨가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반시킨 다음, 여과하여 dicyclohexylurea를 제거하였다. 용매를 휘발시킨 후 생성물을 column chromatography(silica gel, hexane/ethyl acetate/acetic acid 200:100:8)로 분리하고, prep. TLC로 다시 한번 정제하여 생성물 105 mg(수득률 74 %)을 얻었다. TLC : hexane/ethyl acetate/acetic acid dicyclohexylcarbodiimide(DCC, 63.75 mg, 0.30 mmol) 200:100:8, Rf=0.39). 1H NMR(300 MHz, CDCl3), δ8.23 (2H, d, J=9.1, nph), 7.97(2H, d×d, J=14.3 & 7.4, ph), 7.62-7.48(3H, m, ph), 7.39(2H, d×d, J=9.0 & 1.0, nph), 3.44(1H, m, NH), 3.01(2H, m, NCH2), 2.84 (4H, s, succinyl), 2.55 (2H, t, J=7.1, CH2CO), 1.67(2H, qn, J=7.2, NHCH2CH2), 1.53-1.34(4H, m, (CH2)2CH2CO).Heptene (115 mg, 0.28 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (DMAP) synthesized in Example 1, dissolved in dichloromethane (5 mL) and dissolved in N-hydroxysuccinimide (NHS, 36 mg, 0.3 mmol) in a small amount of dichloromethane. , 3.4 mg, 0.028 mmol), and N, N-dicyclohexylcarbodiimide were added sequentially. The reaction solution was stirred at room temperature for 6 hours and then filtered to remove dicyclohexylurea. After evaporating the solvent, the product was separated by column chromatography (silica gel, hexane / ethyl acetate / acetic acid 200: 100: 8), and prep. Purification once again by TLC gave 105 mg (74% yield) of product. TLC: hexane / ethyl acetate / acetic acid dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 63.75 mg, 0.30 mmol) 200: 100: 8, Rf = 0.39). 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ), δ 8.23 (2H, d, J = 9.1, nph), 7.97 (2H, d × d, J = 14.3 & 7.4, ph), 7.62-7.48 (3H, m , ph), 7.39 (2H, d × d, J = 9.0 & 1.0, nph), 3.44 (1H, m, NH), 3.01 (2H, m, NCH 2 ), 2.84 (4H, s, succinyl), 2.55 (2H, t, J = 7.1, CH 2 CO), 1.67 (2H, qn, J = 7.2, NHCH 2 CH 2 ), 1.53-1.34 (4H, m, (CH 2 ) 2 CH 2 CO).
(2) 화학식 2 내지 5 (2)
상기 (1) 과 동일한 방법으로 수행하였으며 1H NMR(300 MHz, CDCl3)데이터는 다음과 같았다. 모든 데이터는 각 ester의 구조에 부합하였다. δ 2.86의 singlet proton peak는 succinyl 기의 4개의 수소를 나타내며, N-succinimidyl ester 구조에 부합한다. It was carried out in the same manner as in (1) and the 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ) data was as follows. All data corresponded to the structure of each ester. The singlet proton peak of δ 2.86 represents the four hydrogens of the succinyl group, corresponding to the N-succinimidyl ester structure.
* 화학식
δ8.28 (2H, d, J=9.0, nph), 8.00 (2H, d×d, J=15.0 & 7.7, ph), 7.67-7.48 (3H, m, ph), 7.23 (2H, d×d, J=9.1 & 1.5, nph), 4.32 (2H, m, CH2O), 2.85 (4H, s, succinyl), 2.77 (2H, t×d, J=7.4&1.8, CH2CO2), 2.16 (2H, qn, J=6.7, CH2CH2CH2). δ8.28 (2H, d, J = 9.0, nph), 8.00 (2H, d × d, J = 15.0 & 7.7, ph), 7.67-7.48 (3H, m, ph), 7.23 (2H, d × d , J = 9.1 & 1.5, nph), 4.32 (2H, m, CH 2 O), 2.85 (4H, s, succinyl), 2.77 (2H, t × d, J = 7.4 & 1.8, CH 2 CO 2 ) , 2.16 (2H, qn, J = 6.7, CH 2 CH 2 CH 2 ).
* 화학식
δ8.25 (2H, d, J=9.1, nph), 7.89 (2H, d×d, J=14.1 & 7.1, ph), 7.62-7.48 (3H, m, ph), 7.36 (2H, d×d, J=8.8 & 1.2, nph), 3.40 (2H, m, NCH2), 2.85 (4H, s, succinyl), 2.76 (3H, d, J=11.4, CH3N), 2.56 (2H, t, J=7.4, CH2CO), 1.93 (2H, m, CH2CH2CH2).δ 8.25 (2H, d, J = 9.1, nph), 7.89 (2H, d × d, J = 14.1 & 7.1, ph), 7.62-7.48 (3H, m, ph), 7.36 (2H, d × d , J = 8.8 & 1.2, nph), 3.40 (2H, m, NCH 2 ), 2.85 (4H, s, succinyl), 2.76 (3H, d, J = 11.4, CH 3 N), 2.56 (2H, t, J = 7.4, CH 2 CO), 1.93 (2H, m, CH 2 CH 2 CH 2 ).
* 화학식
δ8.25 (2H, d, J=8.7, nph), 8.14 (2H, d×d, J=14.5 & 7.6, ph), 7.67-7.46 (3H, m, ph), 7.43 (2H, d×d, J=9.0 & 1.1, nph), 3.42 (2H, sp, J=6.8, NCH2), 3.25 (1H, qn, J=5.9, NH), 2.80 (4H, s, succinyl), 2.48 (2H, t, J=7.2, CH2CO).δ 8.25 (2H, d, J = 8.7, nph), 8.14 (2H, d × d, J = 14.5 & 7.6, ph), 7.67-7.46 (3H, m, ph), 7.43 (2H, d × d , J = 9.0 & 1.1, nph), 3.42 (2H, sp, J = 6.8, NCH 2 ), 3.25 (1H, qn, J = 5.9, NH), 2.80 (4H, s, succinyl), 2.48 (2H, t, J = 7.2, CH 2 CO).
* 화학식
δ9.22 (1H, d, J=2.7, NH), 8.02 (1H, s, nph), 8.01 (2H, d×d, J=15.0 & 7.7, ph), 7.90 (1H, d×d, J=9.0 & 2.8, nph), 7.69-7.52 (3H, m, ph), 7.20 (1H, d×d, J=9.0 & 1.7, nph), 4.29 (2H, d×q×d, J=10.0, 7.1 & 1.1, CH2CH3), 2.84 (4H, s, succinyl), 2.66 (2H, t, J=6.8, NHCOCH2), 2.35(2H, t, J=6.7, CH2CO2), 1.86-1.56 (4H, m, CH2(CH2)2CH2), 1.37 (3H, t, J=7.1, CH3CH2).δ 9.22 (1H, d, J = 2.7, NH), 8.02 (1H, s, nph), 8.01 (2H, d × d, J = 15.0 & 7.7, ph), 7.90 (1H, d × d, J = 9.0 & 2.8, nph), 7.69-7.52 (3H, m, ph), 7.20 (1H, d × d, J = 9.0 & 1.7, nph), 4.29 (2H, d × q × d, J = 10.0, 7.1 & 1.1, CH 2 CH 3 ), 2.84 (4H, s, succinyl), 2.66 (2H, t, J = 6.8, NHCOCH 2 ), 2.35 (2H, t, J = 6.7, CH 2 CO 2 ), 1.86 -1.56 (4H, m, CH 2 (CH 2 ) 2 CH 2 ), 1.37 (3H, t, J = 7.1, CH 3 CH 2 ).
(3) (3) 헵텐Heptene -단백질 -protein 컨쥬게이션Conjugation
0.2 M borate buffer(pH 8.7) 2 ㎖에 각 protein(KLH, OVA 혹은 HRP) 20 mg을 용해시켜 준비한 단백질 용액에 N,N-dimethylformamide(DMF,400 ㎕)를 떨어뜨리면서 세게 교반하였다. 상기에서 제조한 헵텐의 ester형을 DMF 100 ㎕에 녹인 후, 이 용액을 단백질 용액에 20분에 걸쳐 천천히 떨어뜨리면서 교반하였다. 그 후 실온에서 1시간, 4 ℃에서 하루밤 교반하였다. 단백질에 결합되지 않은 hapten은 PBS(10mM, pH 7.4)를 eluant로 한 gel filteration(sephadex G-25, 2g)에 의해 제거하였다. Column으로부터 얻은 용액을 278 nm에서 흡광도를 측정하여 0.1 이상의 수치를 나타내는 용액에 대해 hapten-단백질 conjugate가 존재하는 것으로 간주하고 투석(3차 증류수, 4 ℃, overnight)한 다음 동결 건조시켜 -70 ℃에 보관하였다.The protein solution prepared by dissolving 20 mg of each protein (KLH, OVA or HRP) in 2 ml of 0.2 M borate buffer (pH 8.7) was stirred vigorously while dropping N, N-dimethylformamide (400 μl). The ester form of heptene prepared above was dissolved in 100 μl of DMF, and the solution was stirred while slowly dropping the solution into the protein solution over 20 minutes. Then, it stirred at room temperature for 1 hour and overnight at 4 degreeC. The hapten that was not bound to protein was removed by gel filtration (sephadex G-25, 2g) using PBS (10 mM, pH 7.4) as eluant. The solution obtained from the column was measured by absorbance at 278 nm, and the hapten-protein conjugate was considered to be present in the solution having a value of 0.1 or more, and dialyzed (tertiary distilled water, 4 ℃, overnight), and then lyophilized to Stored.
<< 실시예Example 7> 7> EPNEPN 에 대한 For 다클론Polyclonal 항체의 생산 Production of antibodies
면역화를 위한 동물로서는 무게 2~2.5 kg의 New Zealand white 종 암컷 토끼를 사 용하였다. 면역화는 면역원으로 화학식 1 의 헵텐-KLH 및 화학식 2 의 헵텐-KLH 에 대해 각 3마리의 토끼를 사용하여 수행하였다. 토끼를 구입하여 한 주간 안정화시킨 후 control 채혈을 실시하였으며, 3일 후 토끼에게 PBS(10 mM, pH 7.4, 0.5 mL)에 녹인 500 ㎍의 면역원을 Freund's complete adjuvant와 부피비 1:1로 유화시켜 토끼 등(back)의 여러 부위(20~25 site)에 피내주사(intradermal injection) 하였다. 그 후 Freund's incomplete adjuvant를 사용하여 같은 방법으로 2, 6, 10, 14 주에 면역촉진 주사(booster injection)를 실시하였다. 매 주사 7~10일 후에 토끼의 귀 동맥으로부터 혈액을 채취하여 4 ℃에서 12시간 정치시킨 후 원심분리(3000 rpm, 20 분)에 의해 항혈청을 분리하고 사용 시까지 -70 ℃에서 냉동 보관하였다. As animals for immunization, New Zealand white female rabbits weighing 2 to 2.5 kg were used. Immunization was performed using three rabbits each for heptene-KLH of
<< 실시예Example 8> 8> EPNEPN 에 대한 For 단클론Monoclonal 항체의 생산 Production of antibodies
(1) 마우스 면역화(1) mouse immunization
면역화한 마우스의 항혈청을 스크리닝하기 위한 control로서 생후 8주된 BALB/C 암컷 마우스 3마리의 꼬리 정맥으로부터 소량의 혈액을 얻은 다음 4 ℃에서 2시간 정치 후 원심분리(10000 rpm, 10min, 2회)하여 항혈청을 분리하였다. As a control for screening antiserum of immunized mice, small amounts of blood were obtained from the tail veins of three BALB / C female mice, 8 weeks old, and then centrifuged (10000 rpm, 10 min, 2 times) after standing for 2 hours at 4 ° C. Antiserum was isolated.
면역원(화학식 1 의 헵텐-KLH, 화학식 2 의 헵텐-KLH) 100 ㎍을 PBS 100 ㎕에 녹인 다음 1:1 비율로 Freund' complete adjuvant와 섞어 유화시킨 후 각 면역원 당 각 2 마리의 생후 8주된 BALB/C 암컷 마우스 등(back)에 피하주사 하였다. 1 차 주사 후 마우스의 복강에 PBS에 녹인 면역원(500 ㎍)을 2주 간격으로 boost주사하였다. 3차 주사 3일 후 마우스의 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 항혈청을 분리하였다. 실험에 사용하기 전까지 80 ℃에 보관하였다. 100 μg of the immunogen (Heptene-KLH of
(2) 미엘로마(myeloma) 세포의 준비(2) Preparation of myeloma cells
세포 융합 2주전 질소 탱크에 저장되어 있는 미엘로마 세포를 꺼내 RPMI 1640 media [20 % FBS(fetal bovine serum) + 1 % penicillinstreptomycin]를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2에서 계대 배양하였다. 세포 융합 당일 noncomplete media로 2회 세척 후 2×107cell을 준비하였다. Two weeks before cell fusion, myeloma cells stored in a nitrogen tank were removed and passaged at 37 ° C., 5% CO 2 using RPMI 1640 media [20% FBS (fetal bovine serum) + 1% penicillinstreptomycin]. After washing twice with noncomplete media on the day of cell fusion, 2 × 10 7 cells were prepared.
(3) spleen cell 준비 (3) spleen cell preparation
면역화시킨 마우스중 최고의 역가를 나타내는 마우스를 3차 주사 3일 후 경추 탈구법을 이용하여 희생시킨 다음 비장(spleen)을 꺼냈다. 비장주위의 연결조직이나 지방을 최대한 제거하고 mesh에 비장을 얹어 plunger를 이용하여 비장을 잘 으깬 다음 noncomplete media 20 ㎖와 함께 원심분리(1000 rpm, 5분) 하였다. 상등액을 버리고 noncomplete media로 한번 더 세척한 후 1×108cell을 세포 융합에 사용하였다. Mice showing the highest titers among the immunized mice were sacrificed using
(4) 세포 융합 (4) cell fusion
준비된 미엘로마 세포와 비장세포를 사용하여 Kohler(1975)의 방법에 따라 다음과 같이 세포융합을 수행하였다. 미엘로마 세포와 비장세포를 1:5의 비율로 혼합하여 원심분리(1000 rpm, 7분) 한 후 상등액을 최대한 제거하여 PEG(polyethylene glycol 1500)의 희석을 최소화하였다. 튜브의 아랫 부분을 두드려 침전물이 유동성이 있도록 한 다음 미리 37 ℃에 넣어 둔 PEG 1 ㎖을 1분간에 걸쳐 천천히 첨가한 후 2분간 pipet으로 천천히 저어주면서 세포를 융합시켰다. 37 ℃에 넣어둔 noncomplete media 1 ㎖를 1분 동안 천천히 첨가한 다음 다시 3 ㎖을 3분 동안 천천히 첨가하였다. 다시 10 ㎖을 5분 동안 천천히 첨가한 후 37 ℃에서 5분간 배양하였다. 원심분리(800 rpm, 5분) 하여 상등액을 제거한 후 37 ℃에 넣어둔 HAT media 10 ㎖로 현탁하였다. feeder cell이 깔려 있는 96 well plate에 100 ㎕/well씩 분주하여 37 ℃, 5 % CO2의 배양기에서 배양하면서 2일 간격으로 HAT media를 교체하였다. Using the prepared myeloma cells and splenocytes, cell fusion was performed according to the method of Kohler (1975) as follows. Myeloma cells and splenocytes were mixed at a ratio of 1: 5 and centrifuged (1000 rpm, 7 minutes), and then the supernatant was removed as much as possible to minimize dilution of PEG (polyethylene glycol 1500). Tap the lower part of the tube to make the precipitate fluid, and then slowly add 1 ml of PEG, previously placed at 37 ° C., over 1 minute, and then stir the cells slowly with a pipet for 2 minutes to fuse the cells. 1 ml of noncomplete media placed at 37 ℃ was slowly added for 1 minute, and then 3 ml was added slowly for 3 minutes. Again 10 ml was slowly added for 5 minutes and then incubated at 37 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed by centrifugation (800 rpm, 5 minutes) and suspended in 10 ml of HAT media stored at 37 ° C. 100 μl / well was dispensed into 96 well plates on which feeder cells were laid, and HAT media were replaced at 2 days intervals while incubating in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
(5) Hybridoma의 선택과 cloning (5) Selection and cloning of Hybridoma
면역원의 carrier protein으로 사용한 KLH에 대한 항체를 분비하는 hybridoma와 면역원 hapten에 대한 항체를 분비하는 hybridoma를 선별하기 위해 세포융합 5일 후 간접 비경쟁 ELISA를 수행하였다. 실험 결과 면역원 단백질에 대한 결합은 없고 면역원 hapten에 대한 결합만을 나타내는, 즉 양성으로 판단되는 hybridoma에 대해 세포융합 14일 후 4종류의 코팅항원에 대해 간접 경쟁 ELISA를 수행하였다. Methanol을 이용하여 10 ㎎/㎖ EPN stock 용액을 만든 후 10 % methanol-PBS로 단계별로 희석하여 10과 1 ㎍/㎖ 농도의 용액을 만들어 사용하였으며 실험과정은 다음과 같다. 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)에 녹인 코팅 항원(5 ㎍/ml)을 96 well immunoplate에 100 ㎕씩 첨가하여 4 ℃에서 14시간 동안 incubation한 다음 PBST로 4회 세척하였다. 단계별로 희석한 표준용액 50 ㎕ 와 배양 상등액 50 ㎕를 동시에 well에 첨가하고 25 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 4회 세척 후 HRP가 결합된 goat anti-mouse IgG를 PBST로 희석하여 (1:3000) 100 ㎕/well씩 첨가한 후 25 ℃에서 1시간 반응시켰다. PBST로 5회 세척 후 TMB용액을 100 ㎕/well씩 첨가하여 25 ℃에서 반응시켰다. 적절한 시기에 2 M H2SO4를 50 ㎕/well를 가하여 반응을 중단시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 간접 경쟁 ELISA 결과 EPN에 의해 최대흡광도가 50% 이상 저해된다고 판단되는 hybridoma cell을 적당량 배양하여 limiting dilution 방법에 의해 cloning 하였다. Hemocytometer를 이용하여 세포 수를 50 cells/㎖, 10 cells/㎖, 5 cells/㎖ 농도로 조절하여 feeder cell이 깔려 있는 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하여 배양하였다. Cloning 4일 후부터 현미경으로 관찰하여 단클론이 형성된 well을 찾고 클로닝 5일 후 간접 비경쟁 ELISA를 통하여 항체 생산여부를 확인하였다. cloning 7일 후 101, 100, 10-1, 10-2 ㎍/ml 농도의 EPN 표준용액을 만들어 간접 경쟁 ELISA로 분석물에 의한 저해 정도를 확인하였다. ELISA에 가장 적합하다고 판단되는 hybridoma cell을 선택하여 2차와 3차 cloning을 수행하였다. 최종적으로 선택된 hybridoma는 96 well plate에서 24 well과 6 well plate로 옮겨가며 증식 배양하여 충분한 양의 배양 상등액을 얻어 -20℃에 보관하였으며 배양이 끝난 hybridoma는 액체 질소 탱크에 저장하였다. Indirect non-competitive ELISA was performed 5 days after cell fusion to select hybridomas that secrete antibodies against KLH and hybridomas that secrete antibodies to hapten. As a result, indirect competitive ELISA was performed on four kinds of coated antigens after 14 days of cell fusion for hybridomas that showed no binding to immunogen protein but only binding to immunogen hapten. Methanol was used to prepare 10 mg / ml EPN stock solution, and then diluted 10% methanol-PBS step by step to make 10 and 1 ㎍ / ml solutions. The experimental procedure was as follows. 100 μl of the coating antigen (5 ㎍ / ml) dissolved in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to 96 well immunoplate, incubated at 4 ° C for 14 hours, and washed 4 times with PBST. 50 μl of the diluted standard solution and 50 μl of the culture supernatant were added to the wells at the same time and reacted at 25 ° C. for 1 hour. After washing four times with PBST, goat anti-mouse IgG conjugated with HRP was diluted with PBST (1: 3000), and added to 100 μl / well, followed by reaction at 25 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with PBST, 100 μl / well of TMB solution was added and reacted at 25 ° C. At an appropriate time, 50 μl / well of 2 MH 2 SO 4 was added to stop the reaction, and the absorbance was measured at 450 nm. Indirect competitive ELISA showed that the maximum absorbance was inhibited by more than 50% by EPN, and the appropriate amount of hybridoma cells was cultured and cloned by limiting dilution method. Hemocytometer was used to adjust the cell number to 50 cells / ml, 10 cells / ml, 5 cells / ml and incubated 100 μl into 96 well plates with feeder cells. After 4 days of cloning, microscopic observation was performed to find wells with monoclonal formation, and 5 days after cloning, antibody production was confirmed by indirect non-competitive ELISA. After 7 days of cloning, EPN standard solutions were prepared at concentrations of 101, 100, 10-1, and 10-2 ㎍ / ml, and the degree of inhibition by the analyte was confirmed by indirect competition ELISA. Second and third cloning were performed by selecting hybridoma cells that were considered most suitable for ELISA. Finally, the selected hybridomas were transferred from 96 well plates to 24 wells and 6 well plates, proliferated and cultured to obtain sufficient culture supernatant and stored at -20 ℃. The hybridomas were stored in liquid nitrogen tank.
(6) 복 수(ascites) (6) ascites
단클론항체를 대량으로 생산하기 위해 위의 방법으로 얻은 hybridoma중 ELISA에 가장 적합한 hybridoma를 마우스의 복강에 이식하여 복수를 생산하였다. Hybridoma cell을 주입하기 7일전에 mouse의 복강에 0.5 ㎖의 pristine(2, 6, 10, 14- tetramethylpentadecane)을 주입하였다. 그 후 T-75 flask에서 대량 증식시킨 hybridoma cell을 수거하여 마우스의 복강에 주입하였다 (5×106 cells/0.2 ㎖ noncompletemedia). 8~10일 후 마우스의 복강으로부터 복수를 채취하여 상온에서 2시간 정치시킨 후 원심분리(3000 rpm, 4 ℃, 10 min, 2회)하였다. 상등액을 취하여 ammonium sulfate 방법으로 정제하였다. 그 과정은 다음과 같다. 상등액에 동량의 PBS를 넣고 30분 동안 천천히 교반한 후 2배량의 포화 ammonium sulfate 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후 30분간 천천히 교반하였다. 원심분리(10000 g, 4 ℃, 20 min)한 후 상등액을 제거하고 침전물을 상등액과 동량의 PBS로 현탁하였다. 2배량의 31% ammonium sulfate 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후 30분간 교반하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이 과정을 상등액이 완전히 맑아질 때까지 반복하였다. 침전물을 PBS에 현탁한 후 10 mM PBS 용액에서 3일간 투석하였다. 투석액은 Bradford assay 방법을 통하여 단백질을 정량한 후 동결 건조하여 -80 ℃에 보관하였다.In order to produce a large amount of monoclonal antibodies, ascites were produced by implanting the hybridomas most suitable for ELISA among the hybridomas obtained by the above method into the abdominal cavity of mice. Seven days before the hybridoma cell injection, 0.5 ml of pristine (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane) was injected into the abdominal cavity of mouse. Then, hybridoma cells grown in large numbers in a T-75 flask were collected and injected into the abdominal cavity of mice (5 × 10 6 cells / 0.2 ml noncompletemedia). After 8 to 10 days, the ascites was taken from the abdominal cavity of the mouse and allowed to stand at room temperature for 2 hours, followed by centrifugation (3000 rpm, 4 ° C., 10 min, twice). The supernatant was taken and purified by ammonium sulfate method. The process is as follows. The same amount of PBS was added to the supernatant, and the mixture was slowly stirred for 30 minutes, and then twice the saturated ammonium sulfate solution was dropped dropwise, followed by stirring slowly for 30 minutes. After centrifugation (10000 g, 4 ° C., 20 min), the supernatant was removed and the precipitate suspended in the same amount of PBS as the supernatant. Two times 31% ammonium sulfate solution was dropped dropwise, followed by stirring for 30 minutes and centrifugation to remove the supernatant. This process was repeated until the supernatant was completely clear. The precipitate was suspended in PBS and dialyzed in 10 mM PBS solution for 3 days. Dialysis solution was quantitated by Bradford assay method and freeze-dried and stored at -80 ℃.
<< 실시예Example 9> 9> 다클론Polyclonal 항체를 사용한 간접 경쟁 Indirect competition with antibodies ELISAELISA
코팅 항원으로는 화학식 3 의 헵텐-OVA를 사용하였고, 세척 용액으로는 0.05 질량% Tween 20 이 첨가된 10 mM PBS 용액을 사용하였다. 먼저 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)에 녹인 코팅 항원을 50 ng/well 의 농도로 microtiter plate의 well에 넣어 incubation(4 ℃, overnight)시킨 후, 세척 용액으로 well을 4회 세척한다. 상기 well에 PBS(10 mM, pH 7.4)로 만든 1% gelatin 용액을 200 ㎕를 넣고 1시간 blocking 한 후 세척한다. 5% methanol-PBS(50 mM, pH 7.4)를 사용 한 EPN 표준용액 50 ㎕와 PBST로 1:1000으로 희석된 화학식 2 의 헵텐-KLH 로부터 수득된 항혈청 50 ㎕를 넣어 60분간 incubation시킨다. 세척 후 PBST로 1:4000으로 희석한 peroxidase가 결합된 goat anti-rabbit IgG 100 ㎕를 넣고 1시간 incubation시킨다. 세척한 다음 TMB 기질 용액 100 ㎕를 넣고 10분간 incubation 시킨 후 2 M H2SO4 용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 코팅항원을 incubation하는 과정(4 ℃)을 제외한 모든 과정은 22 ℃에서 행해졌다. 상기 다클론 항체를 사용하여 시행한 간접 경쟁 ELISA의 최적 조건을 정리하면 하기 표 1 과 같으며, 이는 최적화 실험을 통하여 확립된 조건이다. Heptene-OVA of
상기와 같이 다클론 항체를 사용한 간접경쟁 ELISA 를 시행하여 EPN 에 대한 검량 곡선을 수립하였다. 검량 곡선은 다음의 4-parameter logistic 식으로부터 얻어졌므며, 구한 검량곡선은 도 7 에 나타내었다. As described above, an indirect competitive ELISA using a polyclonal antibody was performed to establish a calibration curve for EPN. The calibration curve was obtained from the following 4-parameter logistic equation, and the obtained calibration curve is shown in FIG.
*y=(A-D)/1+(x/C)B+D * y = (A-D) / 1 + (x / C) B + D
여기서 A 는 최대흡광도, B 는 직선의 기울기, C 는 IC50값 그리고 D 는 최소흡광도를 나타낸다. Where A is the maximum absorbance, B is the slope of the straight line, C is the IC 50 value, and D is the minimum absorbance.
IC50 값은 5.6 ng/㎖ 이었으며 검량곡선의 직선 범위는 10-1~103 ng/㎖이었다. 그리고 ELISA의 검출한계를 최대흡광도를 10% 저해시키는 분석물질의 농도로 보면 본 실험에서 개발한 ELISA의 검출한계는 0.2 ng/㎖ 라고 볼 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발한 간접경쟁 ELISA는 우리나라에서 설정한 EPN에 대한 허용기준 0.05~0.2 ㎍/㎖(식품의약품안전청, 2008)을 충분히 정량할 수 있는 감도를 가진다고 판단된다. The IC 50 value was 5.6 ng / ml and the linear curve ranged from 10 −1 to 10 3 ng / ml. The ELISA detection limit is 0.2 ng / ml for the ELISA developed in this experiment. Therefore, the indirect competition ELISA developed in this study is considered to have sufficient sensitivity to quantify the limit of 0.05 ~ 0.2 ㎍ / mL (2008).
<< 실시예Example 10> 10> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 간접 경쟁 Indirect competition with antibodies ELISAELISA
화학식 2 의 헵텐-KLH 로부터 수득된 항체를 사용하고, 코팅 항원으로 화학식 5 의 헵텐-OVA를 500 ng/well의 농도로 microtiter plate의 well에 넣었으며, 반응 용액으로 20% methanol-PBS 200 mM 을 사용하였고, peroxidase가 결합된 goat anti-rabbit IgG를 1/5000 으로 희석한 점을 제외하고는 상기 실시예 9 와 동일한 방법으로 간접 경쟁 ELISA를 실시하였다. 상기 단클론 항체를 사용한 간접 경쟁 ELISA의 실험을 통해 얻어진 최적 조건을 정리하면 하기 표 2 와 같다.Using an antibody obtained from heptene-KLH of formula (2), heptene-OVA of formula (5) was added to the wells of a microtiter plate at a concentration of 500 ng / well as a coating antigen, and 200 mM of 20% methanol-PBS was added as a reaction solution. Indirect competition ELISA was performed in the same manner as in Example 9 except that the goat anti-rabbit IgG conjugated with peroxidase was diluted to 1/5000. Table 2 shows the optimal conditions obtained through the experiment of indirect competition ELISA using the monoclonal antibody.
상기와 같이 다클론 항체를 사용한 간접경쟁 ELISA 를 8회 반복시행하여 얻어진 검량 곡선은 도 8 과 같다. 검량 곡선으로부터 얻어진 IC50값은 2.9 ng/㎖이며, 직선상의 범위(linear range)는 100～102 ng/㎖ 이다. 그리고 최대 흡광도를 10% 저해하는 분석물의 농도인 검출 한계(LOD, limit of detection)는 0.3 ng/㎖ 이다. 따라서 상기 간접 경쟁 ELISA는 우리나라에서 설정한 EPN에 대한 허용기준인 0.05~0.2 ㎍/㎖(식품의약품안전청, 2005)를 충분히 정량할 수 있는 감도를 가진다고 판단된다. As shown in FIG. 8, the calibration curve obtained by repeatedly performing indirect competition ELISA using the polyclonal antibody as described above is shown in FIG. 8. The IC 5 0 value obtained from the calibration curve is 2.9 ng / ml, and the linear range is 10 0 to 10 2 ng / ml. The limit of detection (LOD), which is the concentration of the analyte that inhibits the maximum absorbance by 10%, is 0.3 ng / ml. Therefore, the indirect competitive ELISA is judged to have a sensitivity that can sufficiently quantify the 0.05 ~ 0.2 ㎍ / ㎖ (2005, Korea Food and Drug Administration, 2005) for the EPN set in Korea.
<< 실시예Example 11> 11> 다클론Polyclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA
EPN의 표준용액은 methanol로 1 mg/㎖ stock용액을 만든 후 104 ng/㎖ 용액을 만들The standard solution of EPN is 1 mg / ml stock solution with methanol and 10 4 ng / ml solution.
고 이를 5% methanol-PBS 용액으로 10배씩 희석하여 10-3 ng/㎖ 까지 희석하여 제조하였다. 먼저 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)에 녹인 5 ㎍/㎖ protein A 를 각 well에 500 ng/well의 농도로 첨가하여 incubation(4 ℃, 16시간)시킨 후 10 mM PBST로 4회 세척하였다. PBS(10 mM, pH 7.4)로 만든 1% gelatin 용액 200 ㎕를 넣고 1시간 blocking 한 후 세척하였다. 화학식 1 의 헵텐-KLH를 면역원으로 하여 수득된 항혈청을 PBS로 1:5000으로 희석시킨 후 50 ㎕를 넣어 22 ℃에서 8 분동안 incubation 시켰다. 세척 후 화학식 1 의 헵텐과 HRP를 10:1의 몰비로 반응시켜 얻은 화학식 1 의 헵텐-HRP 효소 트레이서 50 ㎕와 EPN 표준용액 50 ㎕를 넣어 1시간 동안 항체와 반응시키고 세척한 다음 TMB-1% H2O2 기질 용액을 well 당 100 ㎕를 넣고 일정시간 동안 발색시킨 후 2 M H2SO4용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 다클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA 의 조건을 하기 표 3 에 정리하였다. 이는 실험을 통하여 최적화된 조건이다. And it was prepared by diluting 10 times with 5% methanol-PBS solution to 10 -3 ng / ㎖. First, 5 μg / ml protein A dissolved in 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to each well at a concentration of 500 ng / well, followed by incubation (4 ° C., 16 hours), followed by washing 4 times with 10 mM PBST. . 200 μl of a 1% gelatin solution made with PBS (10 mM, pH 7.4) was added and blocked for 1 hour, followed by washing. Antisera obtained by using heptene-KLH as an immunogen of
상기와 같은 방법으로 8 회 반복하여 직접 경쟁 ELISA 를 시행하여 도 9 와 같은 검량 곡선을 얻었다. 검량 곡선으로부터 얻어진 IC50값은 8.4 ng/㎖이며, 최대흡광도를 10% 저해하는 분석물의 농도를 검출한계로 보면 그 값은 0.9 ng/㎖이다. 따라서, 본 발명의 직접 경쟁 ELISA는 우리나라에서 설정한 EPN에 대한 허용 기준인 0.05~0.2 ㎍/㎖(식품의약품안전청, 2007)를 충분히 정량할 수 있는 감도를 가진다고 판단된다. The calibration curve as shown in FIG. 9 was obtained by direct competition ELISA repeated 8 times in the same manner as described above. The IC 50 value obtained from the calibration curve is 8.4 ng / ml, and the limit of detection of the concentration of the analyte that inhibits the maximum absorbance by 10% is 0.9 ng / ml. Therefore, it is judged that the direct competitive ELISA of the present invention has a sensitivity capable of sufficiently quantitating 0.05 to 0.2 μg / ml (the Korea Food and Drug Administration, 2007), which is an acceptance criteria for EPN set in Korea.
<< 실시예Example 12> 12> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA
0.1 M carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)에 녹인 goat anti-mouse IgG(500 ng/well)를 96 well microtiter plate에 100 ㎕씩 첨가하여 4 ℃에서 14시간 동안 incubation한 다음 PBST로 4회 세척하였다. 상기 화학식 1 의 헵텐-KLH 로부터 수득된 항체를 PBS로 1:7500 으로 희석하여 100 ㎕/well씩 첨가하고 25 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST(+0.05% Tween 20)로 4회 세척 후 20% methanol-PBS(50 mM, pH 7.4)에 녹인 EPN 표준용액(104, 103, 102, 101, 100, 10-1, 10-2 ng/㎖) 50 ㎕와 PBST로 희석한 상기 화학식 1 의 헵텐에 HRP를 접합한 enzyme tracer 50 ㎕를 동시에 well에 첨가한 후 25 ℃에서 1시간 반응시켰다. PBST로 5회 세척 후 TMB-1% H2O2 용액을 100 ㎕/well 첨가하여 25 ℃에서 반응시켰다. 적절한 시간 후 2 M H2SO4를 50 ㎕/well를 가하여 반응을 중단시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA 의 조건을 하기 표 4 에 정리하였다. 이는 실험을통하여 최적화된 조건이다. 100 μl of goat anti-mouse IgG (500 ng / well) dissolved in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96 well microtiter plate, incubated at 4 ° C. for 14 hours, and washed four times with PBST. The antibody obtained from heptene-KLH of
상기와 같이 단클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA 를 시행하여 도 10 과 같은 검량 곡선을 얻었다. 검량 곡선으로부터 얻어진 IC50값은 0.6 ng/㎖ 이며, 최대 흡광도를 10% 저해하는 분석물의 농도인 검출 한계(LOD, limit of detection)는 0.09 ng/㎖이다. 따라서 본 연구에서 개발된 간접 경쟁 ELISA는 우리나라에서 설정한 EPN에 대한 허용기준인 0.05~0.2 ㎍/㎖ (식품의약품안전청, 2008)를 충분히 정량할 수 있는 감도를 가진다고 판단된다. As described above, a direct competition ELISA using monoclonal antibodies was performed to obtain a calibration curve as shown in FIG. 10. The IC 50 value obtained from the calibration curve is 0.6 ng / mL and the limit of detection (LOD), which is the concentration of the analyte that inhibits the maximum absorbance by 10%, is 0.09 ng / mL. Therefore, the indirect competitive ELISA developed in this study is considered to have sufficient sensitivity to quantify the 0.05 ~ 0.2 ㎍ / ml (2008), the acceptance criteria for EPN established in Korea.
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 다클론Polyclonal 항체를 사용하는 경우 When to use antibodies EPNEPN 에 대한 항혈청의 간접 경쟁 스크리닝 Indirect competitive screening of antiserum against
(1) 코팅 항원의 단백질에 대해서는 친화력을 나타내지 않고 코팅 항원에 대한 친화력이 우수하며, EPN 에 대한 특이성이 높은 코팅 항원, 항체 및 코팅 항원의 농도, 항체의 희석 배율을 결정하기 위하여, 항체와 코팅 단백질과의 친화성을 측정실험, 코팅 항원에 대한 항혈청의 2차원 스크리닝 과정을 통해 결정된 코팅 항원의 양과 항혈청 희석배수를 조합하여 간접 경쟁 ELISA 를 실시하였다. 그 결과는 하기 표 5 에 나타내었다. (1) In order to determine the concentration of the coating antigen, the antibody and the coating antigen, and the dilution ratio of the antibody which are excellent in the affinity for the coating antigen without showing affinity for the protein of the coating antigen and having a high specificity for the EPN, the antibody and the coating Indirect competitive ELISA was performed by combining the amount of the coating antigen and the antiserum dilution factor determined through the two-dimensional screening process of the antisera against the coating antigen. The results are shown in Table 5 below.
상기 표 5 에서 항혈청 A-1 은 헵텐 A-KLH를 면역원으로 하여 토끼를 면역화시켜 수득한 것이며, 항혈청 B-1 은 헵텐 B-KLH를 면역원으로 하여 토끼를 면역화시켜 수득한 것이다. 또한, A(maximal absorbance), B(slope), C(IC50) 및 D(minimal absorbance) 값은 y = (A-D)/[1+(x/C)B]+D 식에 의해 주어지는 4-파라미터 곡선으로부터 얻어진다. In Table 5, antiserum A-1 was obtained by immunizing rabbits with heptene A-KLH as an immunogen, and antiserum B-1 was obtained by immunizing rabbits with heptene B-KLH as an immunogen. In addition, the values of A (maximal absorbance), B (slope), C (IC 50 ) and D (minimal absorbance) are given by the equation y = (AD) / [1+ (x / C) B] + D. From a parametric curve.
상기 표 5 에 의하면, IC50값은 항혈청 B-1의 조합에서 더 낮게 나타났으며 코팅항원 Hapten C-OVA에 대해 가장 낮았다. Hapten D-OVA와 Hapten E-OVA에 대해서는 발색시간 30분 이상에서도 흡광도가 0.2이하로 나타났다. According to Table 5, the IC 50 value was lower in the combination of antiserum B-1 and the lowest for the coated antigen Hapten C-OVA. The absorbance of Hapten D-OVA and Hapten E-OVA was less than 0.2 even after 30 minutes of color development time.
(2) 상기 실시예 1-(2)의 결과를 바탕으로 항혈청 B-1과 Hapten C-OVA의 희석배수를 달리하여 간접 경쟁 ELISA를 실시하였고 그 결과는 표 6 에 나타내었다. (2) Based on the results of Example 1- (2), indirect competition ELISA was performed by varying the dilution factor of antiserum B-1 and Hapten C-OVA, and the results are shown in Table 6.
상기 표 6 에 의하면, IC50값이 가장 낮은 항혈청 B-1, 희석배수 1:1,000, HaptenC-OVA, 50 ng/well이 가장 좋은 조합인 것으로 나타났다. According to Table 6, the best combination of antiserum B-1, dilution factor 1: 1,000, HaptenC-OVA, and 50 ng / well was the lowest IC 50 value.
<< 실험예Experimental Example 2> 2> 다클론Polyclonal 항체를 사용한 간접 경쟁 Indirect competition with antibodies ELISAELISA 의 교차반응성 조사Cross-reactivity of
EPN에 대한 항체의 특이성을 알아보기 위해 EPN과 유사한 구조를 가진 다른 유기인계 농약들에 대한 항체의 교차반응성을 조사하였다. 교차반응의 정도는 다음 식에 의해서 %로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 7 에 나타내었다.In order to determine the specificity of the antibody against EPN, the cross-reactivity of the antibody against other organophosphorus pesticides having a structure similar to EPN was investigated. The degree of cross reaction was expressed in% by the following equation. The results are shown in Table 7 below.
Cross-reactivity(%) = (IC50 of EPN / IC50 of other compound)× 100 Cross-reactivity (%) = (IC 50 of EPN / IC 50 of other compound) × 100
상기 표 7 에 의하면, EPN과 구조가 유사한 유기인계 농약들에 대해 교차반응성이 매우 낮으므로 사용한 항체가 EPN에 대하여 특이성이 매우 높음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 간접 경쟁 ELISA는 EPN에 대한 선택성이 매우 높다고 할 수 있다. According to Table 7, since the cross-reactivity of the organophosphorus pesticides having a similar structure to the EPN is very low, it can be seen that the antibody used is very specific for the EPN. Therefore, the indirect competitive ELISA of the present invention can be said to have a very high selectivity for EPN.
<< 실험예Experimental Example 3> 3> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 간접 경쟁 Indirect competition with antibodies ELISAELISA 의 항체의 희석배수, 코팅 항원의 종류 및 양의 결정Dilution factor, type and amount of coated antigen
선택된 3 종류의 단클론 항체(6A, 4A, 8B)에 대한 5종의 코팅 항원(헵텐 A-OVA ~ 헵텐 E-OVA)의 조합을 달리한 2차원 스크리닝을 함으로써 항체의 희석배수와 코팅 항원의 종류 및 양의 적정치에 대한 예비적인 평가를 하였고, 이를 바탕으로 간접경쟁 ELISA를 수행하여 가장 적절한 코팅 항원의 종류와 양 및 항체의 희석배수를 결정하였다. 그 결과는 하기 표 8 과 같다.Dilution factor of antibody and type of coating antigen by two-dimensional screening with different combinations of five coating antigens (heptene A-OVA to heptene E-OVA) for three selected monoclonal antibodies (6A, 4A, 8B) And preliminary evaluation of the titration of the amount, based on this indirect competition ELISA was performed to determine the type and amount of the most appropriate coating antigen and dilution factor of the antibody. The results are shown in Table 8 below.
상기 표 8 에 의하면, 항체 6A, 8B와 각 코팅항원의 조합은 비교적 낮은 IC50수치와 짧은 발색시간을 보였으며 이들 조합 중 감도와 기울기가 가장 높으며 발색시간이 비교적 짧은 항체 8B(1:1000), 코팅항원 hapten E-OVA (500ng/well)을 가장 적합한 조합으로 선택하였다.According to Table 8, the combination of antibody 6A, 8B and each coated antigen showed a relatively low IC 50 value and short color development time. Among these combinations, antibody 8B (1: 1000) having the highest sensitivity and slope, and a relatively short color development time. Coated antigen hapten E-OVA (500 ng / well) was selected as the most suitable combination.
<< 실험예Experimental Example 4> 4> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 간접 경쟁 Indirect competition with antibodies ELISAELISA 의 교차 반응성 조사Cross-reactivity of
상기 실험예 2 와 동일한 방법으로 EPN에 대한 항체의 특이성을 알아보기 위해 EPN 과 유사한 구조를 가진 다른 유기인계 농약들에 대한 항체의 교차반응성을 조사하였고 그 결과는 하기 표 9 에 나타내었다.In order to determine the specificity of the antibody to EPN in the same manner as in Experimental Example 2, the cross-reactivity of the antibody against other organophosphorus pesticides having a structure similar to EPN was investigated and the results are shown in Table 9 below.
상기 표 9 에 의하면, 모든 유기인계 농약들에 대한 교차반응성이 매우 낮으므로 상기에서 사용한 본 발명의 단클론 항체는 EPN에 대한 특이성이 매우 높음을 알 수 있으며 따라서, 상기 단클론 항체를 사용한 본 발명의 간접 경쟁 ELISA는 EPN에 대한 선택성이 매우 높다고 할 수 있다. According to Table 9, since the cross-reactivity of all organophosphorus pesticides is very low, it can be seen that the monoclonal antibody of the present invention used above has a very high specificity for EPN, and thus, the indirect of the present invention using the monoclonal antibody Competitive ELISA can be said to have a very high selectivity for EPN.
<< 실험예Experimental Example 5> 5> 단클론Monoclonal 항체를 이용한 간접 경쟁 Indirect competition with antibodies ELISAELISA 를 이용한 식품 Food using 시료중에In the sample 첨가된 EPN 의 회수율 측정 Measurement of recovery of added EPN
단클론 항체를 사용한 간접 경쟁 ELISA를 이용한 농산물 중의 잔류농약 분석에 적용할 수 있는지를 검증하기 위해 청정 재배한 상치, 쌀, 케일에 10-4ppb~103ppb의 농도로 EPN을 첨가하여 최적화된 ELISA 조건에서 정량하였다. 그 회수율은 하기 표 10 에 나타내었다. Optimized ELISA by adding EPN at a concentration of 10 -4 ppb to 10 3 ppb to freshly grown lettuce, rice, and kale to verify whether it can be applied to residual pesticide analysis in agricultural products using indirect competitive ELISA using monoclonal antibodies Quantification under conditions. The recovery rate is shown in Table 10 below.
상기 표 10 에 의하면, 상치, 쌀, 케일에 첨가된 EPN의 회수율은 상치 80~138%, 쌀 67~137%, 케일 73~122%로 나타났으며 시료 전처리 후 시료의 희석배수에 따라 큰 차이는 없었으나 10배 희석하여 ELISA의 시료로 사용한 경우보다 100배 희석하여 사용한 경우가 회수율이 대체로 높게 나타났다. 100배 희석하여 사용한 경우가 10배 희석하여 사용한 경우보다 회수율이 양호하므로 시료추출액을 희석함으로써 matrix effect를 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. 쌀을 제외하고 회수율은 80% 이상으로 나타났으므로 면역분석법의 농산물의 잔류농약 분석에 이용 가능함을 보여주었다. According to Table 10, the recovery rate of EPN added to lettuce, rice, and kale was found to be 80-138% of lettuce, 67-137% of rice, and 73-122% of kale. However, the recovery rate was higher in the case of 10-fold dilution and 100-fold dilution than the ELISA sample. Since the recovery rate is better than that of 100-fold dilution, the matrix effect can be reduced by diluting the sample extract. With the exception of rice, the recovery rate was over 80%, which showed that it can be used for the analysis of residual pesticides of agricultural products by immunoassay.
<< 실험예Experimental Example 6> 6> 다클론Polyclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA 를 위한 효소 트레이서의 종류, 양 및 항체의 희석배수Type, amount and dilution factor of the antibody
헵텐 A~E 에 HRP 를 몰비를 달리하면서 접합시켜 효소 트레이서를 제조하였으며 이들 효소 트레이서의 효소 활성을 알아보기 위하여 직접 비경쟁 ELISA를 수행하였으며, 이를 바탕으로 발색이 양호한 항체와 효소 트레이서 조합을 선정하여 경쟁 스크리닝을 수행하였다. 그 결과는 하기 표 11 과 같다. Enzyme tracers were prepared by conjugating HRP to heptenes A to E at different molar ratios. Direct noncompetitive ELISA was performed to determine the enzyme activity of these enzyme tracers. Screening was performed. The results are shown in Table 11 below.
상기 표 11 에 의하면, 최대흡광도, 기울기, IC50값을 고려해 볼 때 가장 적절한 조합으로 항체는 1:5000으로 희석한 A-1 과 효소 트레이서로 1:10000로 희석한 Hapten A-HRP(hapten/HRP molar ratio 10:1)의 조합을 선택하였다. According to Table 11, in consideration of the maximum absorbance, the slope, and the IC 50 value, the most suitable combination of antibodies was A-1 diluted 1: 5000 and Hapten A-HRP diluted 1: 10000 with enzyme tracer (hapten / The combination of HRP molar ratio 10: 1) was chosen.
<< 실험예Experimental Example 7> 7> 다클론Polyclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA 의 교차반응성 조사Cross-reactivity of
EPN에 대한 항체의 특이성을 알아보기 위해 EPN과 유사한 구조를 가진 다른 유기인계 농약들에 대한 항체의 교차반응성을 조사하였고 그 결과는 하기 표 12 에 나타내었다. In order to determine the specificity of the antibody to EPN, the cross-reactivity of the antibody against other organophosphorus pesticides having a structure similar to EPN was investigated and the results are shown in Table 12 below.
상기 표 12 에 의하면, EPN과 구조가 유사한 유기인계농약들에 대해 교차반응성이 매우 낮으므로 사용한 항체가 EPN에 대하여 특이성이 매우 높음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 다클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA는 EPN에 대한 선택성이 높다고 할 수 있다. According to Table 12, since the cross-reactivity with respect to organophosphorus pesticides similar in structure to the EPN is very low, it can be seen that the antibody used is very specific for the EPN. Therefore, direct competition ELISA using the polyclonal antibody of the present invention can be said to have high selectivity for EPN.
<< 실험예Experimental Example 8> 8> 다클론Polyclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA 를 이용하여 식품 시료 중에 첨가된 Added to food samples using EPNEPN 의 회수율 측정Recovery rate
다클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA를 농산물 중의 잔류농약 분석에 적용할 수 있는지를 검증하기 위해 청정 재배한 상치, 쌀, 케일에 100, 200, 500, 1000 ppb의 농도로 EPN을 첨가하여 ELISA로 분석하였다. 직접경쟁 ELISA의 경우 재현성이 낮아 회수율 측정이 어려웠다. 회수율 결과는 하기 표 13 과 같다. To test whether direct competitive ELISA using polyclonal antibody can be applied to residual pesticide analysis in agricultural products, it was analyzed by ELISA by adding EPN to clean grown lettuce, rice, and kale at concentrations of 100, 200, 500, and 1000 ppb. It was. In the case of direct competitive ELISA, the reproducibility was difficult to measure the recovery rate. Recovery results are shown in Table 13 below.
2 최종 추출물의 부피 2 volume of final extract
시료 전처리 후 10배 희석하여 ELISA의 시료로 사용한 경우 회수율은 상추 54~70%, 쌀 58~118%, 케일 37~103%로 나타났으며 100배 희석하여 사용한 경우는, 상추 62~117%, 쌀 77~164%, 케일 78~114%로 10배 희석한 경우보다 회수율이 대체로 높게 나타났다. 100배 희석하여 사용한 경우가 10배 희석하여 사용한 경우보다 회수율이 양호하므로 시료 추출액을 희석함으로써 matrix effect를 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. ELISA의 회수율과 GC 측정시의 회수율을 비교해 볼 때, GC에 비해 회수율에서 정확도는 낮았으나, ELISA는 GC를 이용한 잔류농약 분석법에 비해 전처리과정이 훨씬 신속하다는 데에 그 장점이 있다.After diluting the sample 10 times and using it as an ELISA sample, the recovery rate was 54 ~ 70% lettuce, 58 ~ 118% rice, 37 ~ 103% kale, and when diluted 100 times, lettuce 62 ~ 117%, Recovery rates were generally higher than those diluted 10-fold with 77-164% of rice and 78-114% of kale. Since the recovery rate is better than that of 100-fold dilution, the matrix effect can be reduced by diluting the sample extract. Compared with GC, the recovery rate of ELISA and the recovery rate of GC were lower in accuracy than that of GC. However, ELISA has the advantage that the pretreatment process is much faster than the residual pesticide analysis method using GC.
<< 실험예Experimental Example 9> 9> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISA 의ELISA 항체의 희석배수, 효소 트레이서의 종류 및 양 결정 Dilution factor of antibody, type and amount of enzyme tracer
효소 트레이서의 합성에 있어서 hapten과 HRP 사이의 conjugation 반응시 hapten과 HRP 사이의 몰비에 따라 enzyme tracer의 성능이 달라지므로 10:1 과 50:1 로 달리하여 각 hapten에 대해 두가지의 enzyme tracer를 얻었다. 합성한 enzyme tracer 의 효소활성을 알아보기 위해 5가지 enzyme tracer와 3가지 항체의 모든 조합에 대해 직접 비경쟁 ELISA를 수행하였다. 3가지 항체(4A, 6A, 8B)에 대해 hapten A-HRP는 발색시간 3분 만에 높은 흡광도 수치를 나태내었으므로 3가지 항체와 hapten A-HRP의 조합에서만 2차원 스크리닝을 수행하였으며 그 중 발색이 양호한 조합을 선택하여 직접경쟁 ELISA를 수행하였다. 그 결과는 하기 표 14 에 나타내었다.In the synthesis of enzyme tracer, the enzyme tracer performance varies depending on the molar ratio between hapten and HRP during the conjugation reaction between hapten and HRP. Thus, two enzyme tracers were obtained for each hapten by 10: 1 and 50: 1. In order to investigate the enzymatic activity of the synthesized enzyme tracer, direct non-competitive ELISA was performed for all combinations of five enzyme tracers and three antibodies. For three antibodies (4A, 6A, 8B), hapten A-HRP showed high absorbance values within 3 minutes of color development, so two-dimensional screening was performed only with the combination of three antibodies and hapten A-HRP. This good combination was selected to perform direct competitive ELISA. The results are shown in Table 14 below.
상기 표 14 에 의하면, 이들 조합들은 감도의 차이가 거의 없었으나, 6A(1:7500), hapten A(50:1, 1:2500)의 조합의 경우, 기울기가 가장 높았으므로 이 조합을 최적의 조합으로 선택하였다.According to Table 14, these combinations showed little difference in sensitivity, but the combination of 6A (1: 7500) and hapten A (50: 1, 1: 2500) had the highest slope, so this combination was optimal. Selected in combination.
<< 실험예Experimental Example 10> 10> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA 의 교차 반응성 조사Cross-reactivity of
상기 실험예 7 과 동일한 방법으로 EPN에 대한 항체의 특이성을 알아보기 위해 EPN과 유사한 구조를 가진 다른 유기인계 농약들에 대한 항체의 교차반응성을 조사하였고 그 결과는 하기 표 15 에 나타내었다. In order to determine the specificity of the antibody to EPN in the same manner as in Experimental Example 7, the cross-reactivity of the antibody against other organophosphorus pesticides having a structure similar to EPN was investigated and the results are shown in Table 15 below.
상기 표 15 에 의하면, 이들 유기인계농약들에 대해 교차반응성이 매우 낮으므로 사용한 항체가 EPN에 대하여 특이성이 매우 높음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 단클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA는 EPN에 대한 선택성이 매우 높다고 할 수 있다. According to Table 15, since the cross-reactivity to these organophosphorus pesticides is very low, it can be seen that the antibody used has a very high specificity for EPN. Therefore, direct competition ELISA using the monoclonal antibody of the present invention can be said to have a very high selectivity for EPN.
<< 실험예Experimental Example 11> 11> 단클론Monoclonal 항체를 사용한 직접 경쟁 Direct competition with antibodies ELISAELISA 를 이용한 식품 Food using 시료중의In the sample EPNEPN 의 회수율 측정Recovery rate
단클론 항체를 사용한 직접 경쟁 ELISA를 농산물 중의 잔류농약분석에 적용할 수 있는지를 검증하기 위해 청정 재배한 상추, 쌀, 케일에 10-4ppb~103ppb의 농도로 EPN을 첨가하여 정량하였다. 그 결과는 하기 표 16 과 같다.In order to verify whether direct competition ELISA using monoclonal antibody can be applied to residual pesticide analysis in agricultural products, EPN was quantified by adding 10 −4 ppb˜10 3 ppb to freshly grown lettuce, rice and kale. The results are shown in Table 16 below.
상기 표 16 에 의하면, 상추, 쌀, 케일에 첨가된 EPN의 회수율은 상치 75~117%, 쌀 76~136%, 케일 73~136%로 나타났으며 시료 전처리 후 시료의 희석배수에 따라 큰 차이는 없었으나 10배 희석하여 ELISA의 시료로 사용한 경우보다 100배 희석하여 사용한 경우가 회수율이 약간 높게 나타났다. 100배 희석하여 사용한 경우가 10배 희석하여 사용한 경우보다 회수율이 양호하므로 시료추출액을 희석함으로써 matrix effect를 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한 전반적 회수율은 70-130% 정도로 나타났으므로 면역분석법의 농산물의 잔류농약 분석에 이용 가능함을 보여주었다.According to Table 16, the recovery of EPN added to lettuce, rice, and kale was found to be 75-117% lettuce, 76-136% rice, 73-136% kale, and the difference was large depending on the dilution factor of the sample after sample pretreatment. However, the recovery rate was slightly higher when diluted 10-fold and 100-fold dilutions were used. Since the recovery rate is better than that of 100-fold dilution, the matrix effect can be reduced by diluting the sample extract. In addition, the overall recovery was about 70-130%, indicating that it can be used for the analysis of residual pesticides of agricultural products by immunoassay.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 합성한 헵텐을 이용하여 생산한 단클로 또는 다클론 항체는 EPN에 대한 특이성이 높다. 또한, 상기 항체를 사용하는 간접 경쟁 또는 직접 경쟁 ELISA 는 EPN 에 대한 감도와 선택성이 높고 저렴한 비용으로 신속하게 분석할 수 있어 유통되는 농산물에 존재하는 EPN 의 검출에 적합하다.As described above, monoclonal or polyclonal antibodies produced using heptene synthesized in the present invention have high specificity for EPN. In addition, indirect competition or direct competition ELISA using the antibody is high in sensitivity and selectivity to EPN and can be quickly analyzed at low cost, which is suitable for detection of EPN present in circulated agricultural products.
도 1 은 본 발명의 화학식 1 의 구조를 갖는 헵텐의 합성 과정을 나타낸 모식도이다. 1 is a schematic diagram showing the synthesis of heptene having a structure of
도 2 는 본 발명의 화학식 2 의 구조를 갖는 헵텐의 합성 과정을 나타낸 모식도이다. Figure 2 is a schematic diagram showing the synthesis of heptene having a structure of formula (2) of the present invention.
도 3 은 본 발명의 화학식 3 의 구조를 갖는 헵텐의 합성 과정을 나타낸 모식도이다. 3 is a schematic diagram showing the synthesis of heptene having the structure of
도 4 는 본 발명의 화학식 4 의 구조를 갖는 헵텐의 합성 과정을 나타낸 모식도이다. Figure 4 is a schematic diagram showing the synthesis process of heptene having the structure of formula (4) of the present invention.
도 5 는 본 발명의 화학식 5 의 구조를 갖는 헵텐의 합성 과정을 나타낸 모식도이다. 5 is a schematic diagram showing the synthesis of heptene having a structure of
도 6 은 본 발명의 화학식 1 의 구조를 갖는 헵텐과 단백질을 콘쥬게이션시키는 과정을 나타낸 것이다. 6 shows a process for conjugating heptene and a protein having the structure of
도 7 은 본 발명의 다클론 항체를 사용하는 간접 경쟁 ELISA의 검량 곡선을 나타낸다.7 shows a calibration curve of indirect competitive ELISA using polyclonal antibodies of the invention.
도 8 은 본 발명의 단클론 항체를 사용하는 간접 경쟁 ELISA의 검량 곡선을 나타낸다. 8 shows a calibration curve of indirect competition ELISA using monoclonal antibodies of the invention.
도 9 는 본 발명의 다클론 항체를 사용하는 직접 경쟁 ELISA의 검량 곡선을 나타낸다. 9 shows a calibration curve of direct competition ELISA using polyclonal antibodies of the invention.
도 10 은 본 발명의 단클론 항체를 사용하는 직접 경쟁 ELISA의 검량 곡선을 나타낸다. 10 shows a calibration curve of direct competition ELISA using monoclonal antibodies of the invention.
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|---|---|---|---|---|
| US10247739B2 (en) | 2013-11-13 | 2019-04-02 | Sk Telecom Co., Ltd. | Method for immunological measurement using a hapten and antibody binding to the hapten as reference antibody and device for immunological measurement using the reference antibody |
| CN115322089A (en) * | 2022-07-18 | 2022-11-11 | 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) | Raspberry ketone hapten, artificial antigen, preparation method of raspberry ketone hapten, antibody and application of raspberry ketone hapten and artificial antigen |
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2009
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